PENUNTUN PRAKTIKUM
Biokimia Metabolisme (PS Kimia)
Oleh : Tim Biokimia
Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FAKULTAS MIPA
UNIVERSITAS NEGERI PADANG 2020
PEDOMAN UMUM PRAKTIKUM BIOKIMIA A. Peraturan dasar di laboratorium 1. Sebelum memasuki ruangan laboratorium, anda harus memakai jas praktikum / lab coat 2. Letakkan tas dan barang bawaan di loker yang telah disediakan 3. Praktikan dilarang memakai sandal dan sejenisnya 4. Tidak diperbolehkan makan, minum dan meludah di laboratorium 5. Bagi yang tidak berkepentingan, dilarang masuk ke laboratorium 6. Buanglah sampah pada tempat yang sudah disediakan 7. Dilarang membuang sampah di saluran air 8. Pahami semua aturan penggunaan alat dan bahan sebelum digunakan 9. Bicara seperlunya 10. Setelah bekerja, ruangan dan alat harus dibersihkan 11. Hati-hati menggunakan zat 12. Tidak dibenarkan bekerja sendirian di laboratorium 13. Tidak masuk praktikum 3 kali berturut-turut, dianggap mengundurkan diri 14. Datang 15 menit sebelum praktikum dimulai 15. Jika praktikan sakit (ada keterangan sakit dari dokter), praktikum dapat diganti di kelas lain seizin dosen yang bersangkutan B. Kewajiban praktikan 1. Setiap praktikan harus membawa penuntun praktikum 2. Mempelajari penuntun praktikum dan bersiap untuk di pretes 3. Tidak diperkenankan masuk laboratorium sebelum ada izin dari pembimbing praktikum atau asisten praktikum 4. Membuat logbook praktikum pada buku ukuran A4 setiap kali praktikum dengan urutan sebagai berikut: Judul praktikum Tujuan praktikum Teori dasar
i
5. 6. 7. 8. 9.
Alat dan bahan yang diperlukan Prosedur praktikum dalam bentuk skema atau diagram alir Perhitungan (jika ada) Pengamatan dalam bentuk tabel Jawaban tugas pendahuluan (pada kertas terpisah) Daftar pustaka Membawa lap atau tisu Mengganti alat yang hilang atau rusak Melaporkan setiap terjadi kecelakaan di laboratorium pada asisten atau pembimbing praktikum Menyerahkan surat keterangan dari dokter jika sakit Menyerahkan laporan lengkap (tulisan tangan) pada waktu praktikum berikutnya pada asisten atau pembimbing praktikum dengan isi laporan praktikum sebagai berikut: Judul praktikum Tujuan praktikum Teori dasar Pengamatan Pengolahan data (jika ada) Pembahasan Kesimpulan Daftar pustaka Jawaban pertanyaan
ii
DAFTAR ISI
Pedoman Umum Praktikum Biokimia ………………….. Daftar Isi …………………………………………………….... 1. Penentuan Kadar Glukosa secara Spektrofotometri 2. Analisa Kualitatif Kandungan Urin…....……………. 3. Analisa Kualitatif Kandungan Empedu…………….. 4. Penentuan Total Kolesterol dalam Serum Darah.... 5. Praktikum mandiri................................................ Lampiran................................................................... 1. Jadwal Praktikum Biokimia Metabolisme ............. 2. Penilaian praktikum.............................................. ..............................................................................
iii
Hal i iii 1 7 12 17 21 22 22 24
Praktikum Biokimia Percobaan 01
PENENTUAN KADAR GLUKOSA DARAH SECARA SPEKTROFOTOMETRI A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat menentukan kadar glukosa darah secara spektrofotometri. B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip penentuan kadar glukosa darah secara spektrofotometri. 2. Mahasiswa dapat membuat reagen untuk penentuan kadar glukosa darah secara spektrofotometri. 3. Mahasiswa dapat mengoperasikan spektrofometer dengan benar. 4. Mahasiswa dapat melakukan percobaan penentuan kadar glukosa darah secara spektrofotometri. 5. Mahasiswa dapat mengumpulkan data dan menganalisis data. 6. Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan. 7. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan. C. Dasar Teori Darah selain mengandung glukosa juga mengandung biomolekul lain seperti protein. Penentuan kadar glukosa darah akan dipengaruhi oleh adanya protein dalam darah. Oleh sebab itu, protein harus diendapkan terlebih dahulu. Protein darah dapat diendapkan dengan menambahkan Seng sulfat (ZnSO4) dan Barium hidroksida (Ba(OH)2). Hasil reaksi reduksi ion kupri oleh glukosa dalam suasana basa dengan reagen arsenomolibdat memberikan warna biru yang kekuatan intensitasnya sesuai dengan konsentrasi glukosa dalam darah tersebut. Pengukuran absorbansi dari sampel berwarna ini dilakukan pada Îť maksimum 660 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Berdasarkan hukum Lambert-Beer dapat dihitung kadar glukosa dalam darah. 1
D. Alat dan Bahan . 1. Alat Tabung reaksi kecil 2 buah Tabung sentrifuga 2 buah Tabung reaksi besar 10 buah Pipet takar 2 mL 1 buah Pipet takat 10 mL 1 buah Pipet tetes 2 buah Labu ukur 10 mL 6 buah Batang pengaduk 1 buah Rak tabung reaksi 1 buah Penjepit tabung reaksi 7 buah Gelas kimia 250 mL 2 buah Alat sentrifuga 1 set Spektrofotometer spektronik 21 1 set Kuvet 2 buah Penangas air 1 buah Botol semprot 1 buah 2. Bahan Darah merah segar (non diabetes dan diabetes) masing-masing 1 mL Larutan standar glukosa 1,0 mg/mL Larutan Ba(OH)2 0,3 N Larutan Zn SO4 5 % Reagen Arsenomolibdat Larutan Nelson A Larutan Nelson B Larutan Cu alkalis Aquades Catatan Pembuatan reagen Arsenomolibdat Sebanyak 2,5 gram kristal amonium molibdat dilarutkan dalam 50 mL aquades, ditambah dengan 4,2 mL H2SO4 pekat sambil diaduk, dinginkan. Sebanyak 0,6 gram kristal Na2HasO4.7H2O dilarutkan dalam 5 mL aquades. Larutan ini dicampur dengan larutan yang pertama dan aduk. Larutan 2
berwarna kuning bening ini disimpan dalam botol berwarna coklat dan diinkubasi selama 24- 48 jam, suhu 37ÂşC. Setelah itu, larutan tersebut disimpan dalam lemari es. Larutan Nelson A. Sebanyak 1,5 gram garam Rochlle, 3 gram Na2CO3 anhidrat, 2 gram NaHCO3 dan 18 gram Na2SO4 anhidrat dilarutkan dalam aquades sambil diaduk dan diencerkan hingga volume total 100 mL. Larutan Nelson B Sebanyak 2 gram CuSO4.5H2O dilarutkan dalam aqudes lalu ditambahkan 18 gram Na2SO4 anhidrat, aduk hingga larut semuanya. Tambahkan 1-2 tetes H2SO4 pekat dan encerkan hingga volume 100 mL. Larutan Cu Alkali Campurkan 4 volume sampel Nelson A dengan 1 volume Larutan Nelson B aduk. Larutan ini harus dibuat saat akan digunakan (segar). E. Prosedur Kerja 1. Pembuatan filtrat darah bebas protein Ambil dengan teliti 0,1 mL darah segar atau yang “oxalated“ (darah yang telah diberi natrium oksalat) masukkan ke dalam tabung sentrifuga, tambahkan 1,90 mL aquades, aduk sampai homogen, kemudian tambahkan 1,50 mL Ba(OH) 2 0,3N aduk. Tambahkan lagi 1,50 mL larutan ZnSO4 5%, aduk sampai homogen, biarkan selama 5 menit. Setelah itu sentrifuga selama 20 menit. Pisahkan supernatan dari endapan. Supernatan yang bening itu digunakan untuk percobaan selanjutnya (Berapa kali pengenceran pada percobaan ini ?). 2. Pembuatan larutan standard dan Macing kuvet. a. Buat larutan standar glukosa dari larutan induk (1,0 mg/mL), masing-masing dengan konsentrasi 0,01, 3
0,02, 0,04, 0,06, 0,08, dan 0,1 mg/mL dalam labu takar 10 mL b. Ambil beberapa kuvet dan pilihlah kuvet yang mempunyai sifat optik yang sama (macing kuvet). Gunakan aqudes untuk macing kuvet. Dalam pengukuran gunakan 2 buah kuvet yang macing (satu untuk larutan standar, satu untuk blanko). 3. Pembuatan Kurva Standar. a. Sediakan 7 buah tabung reaksi, ke dalam tabung reaksi 1-6 masing-masing diisi dengan 1 mL larutan standar sesuai konsentrasi yang telah disediakan, dan tabung reaksi ke 7 diisi dengan blangko. Tambahkan masingmasing dengan 1,0 mL larutan Cu-alkalis, panaskan tabung reaksi pada air mendidih dalam penangas air selama 20 menit. Dinginkan dalam air (sebaiknya pakai batu es). Setelah dingin pada setiap tabung reaksi tambahkan 1,0 mL reagen Arsenomolibdat, aduk sampai homogen. Tambahkan lagi aquades 7,0 mL, kocok sampai gas C02-nya habis. Simpan larutan tersebut untuk penentuan 位maks dan kurva standar (kurva kalibrasi) b. Tentukan 位maks dari larutan yang akan digunakan dengan menggunakan konsentrasi yang mewakili larutan standar. Atur 位 mulai dari 600 nm sampai 750 nm dengan range 10 nm. c. Ukur absorbansi masing-masing larutan standar pada 位maks. Alurkan ke dalam grafik Absorbansi vs Konsentrasi, sebagai sumbu X konsentrasi, dan sumbu Y absorbansi. d. Cari persamaan regresi linier, dan tentukan besar koefisien regresinya (r). 4. Penentuan Kadar Glukosa Darah. a. Sediakan 2 buah tabung reaksi, ke dalam tabung reaksi ke-1 masukkan 1 mL darah bebas protein (sampel diabetes), dan ke dalam tabung reaksi ke-2 1mL darah bebas protein (darah normal). 4
b. Ke dalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 1,0 mL larutan Cu alkalis, panaskan tabung reaksi pada air mendidih dalam penangas air selama 20 menit. Dinginkan dalam air (sebaiknya pakai batu es). c. Setelah dingin pada setiap tabung reaksi tambahkan 1,0 mL reagen arsenomolibdat, aduk sampai homogen. Tambahkan lagi aquades 7,0 mL, kocok sampai gas CO2-nya habis. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan dengan spektronik pada Îťmaks.(Pada langkah ini darah telah diencerkan berapa kali ?). Hitung kadar glukosa darah dalam setiap 100 mL darah. F. Pertanyaan 1. Apa yang dimaksud dengan larutan standar dan apa fungsinya ? 2. Apa yang dimaksud dengan Îťmaks, dan mengapa sebaiknya pengukuran absorbansi dilakukan pada Îťmaks ? 3. Apa fungsi penambahan natrium oksalat pada sampel darah ? 4. Pada percobaan ini, berapkah kalikah pengenceran sampel darah telah dilakukan? Pada tahap mana saja? 5. Apa guna sentrifugasi pada percobaan ini 6. Pada percobaan ini mengapa protein harus diendapkan dan dipisahkan dari darah ? 7. Setelah penambahan reagen arsenomolibdat terbentuk gas CO2. Tuliskan reaksi yang terjadi ? 8. Apa fungsi hormon insulin dalam tubuh manusia ? 9. Apa pula fungsi hormon adrenalin dalam tubuh manusia? G. Tugas Pendahuluan 1. Selain glukosa dan protein, zat-zat apa saja yang terdapat di dalam darah ? 2. Berapa kadar glukosa darah normal orang dewasa ? 3. Berapakah volume larutan glukosa 1,0 mg/mL yang dibutuhkan untuk masing-masing larutan standar? Tuliskan perhitungannya. 4. Mengapa seseorang dapat terkena penyakit diabetes mellitus? Jelaskan penyebabnya? Usaha apa yang harus 5
dilakukan untuk mencegah agar penyakit tersebut dapat diatasi. H. Daftar Pustaka Dotti, Louis B; Orten, JM (1997), Laboratorium Instructions in Biochemistry, S Louir: Mosby Company. Harrow, Benjamin, et.al, Laboratorium Manual of Biochemistry fifth edition, London: Saunder Company. Somogy, M, (1952), “ Notes on sugar Determination�, Journal of Biochemistry, 195, pp. 19-23.
6
Praktikum Biokimia Percobaan 02
ANALISA KUALITATIF KANDUNGAN URIN A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat melakukan analisa kualitatif kandungan urin. B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat menentukan kandungan kimia urin. 2. Mahasiswa dapat membuat reagen yang berkaitan dengan percobaan. 3. Mahasiswa dapat menganalisis data hasil percobaan. 4. Mahasiswa dapat menyimpulkan hasil percobaan. 5. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan. C. Dasar Teori Urine diproduksi oleh ginjal. Sifat dan susunan urine dipengaruhi oleh beberapa faktor fisiologis (seperti masukan diet, suhu lingkungan, proses dalam tubuh, stress mental dan fisik), dan faktor patologis (seperti adanya gangguan metabolisme, penyakit ginjal. Oleh karena itu pemeriksaan urine berguna untuk menunjang diagnosis suatu penyakit. Dalam keadaan normal pada orang dewasa dibentuk 1.200– 1.500 mL urin tiap hari. Pembentukan urin dipengaruhi oleh cairan yang masuk dan jenis makanan. Diet protein tinggi akan meningkatkan pembentu-kan urin, sebab urea yang terbentuk pada proses metabolisme protein mempunyai efek diuretik. Pada suhu lingkungan tinggi , volume urin berkurang. Poliuria (volume urin meningkat) ditemukan pada berbagai keadaan. Pada diabetes insipidus, akibat tidak adanya hormon antidiuretik, volume urin tiap hari mencapai 10–20 L. Pada diabetes melitus, volume urin dapat mencapai 5–6 L dalam 1 hari. Oligourea (volume urin berkurang), ditemukan pada keadaan demam, diare, gagal jantung, dll. Anuri (tidak terbentuk urin), terjadi pada saat syok, keracunan air raksa atau batu ginjal. 7
Pada keadaan normal, urine yang terbentuk berwarna kuning muda dan jernih dengan bau khas. Berat jenis urin 1,003–1,030, pH bersifat asam (pH = 6) dan sangat berpariasi antara 4,9 sampai 8,0. Kandunga zat padat dalam urin 24 jam adalah klorida sebagai NaCl, ion Ca2+, Mg2+, Iodium, Urea, Kreatini, amonia, asam urat, sulfat, fosfat, oksalat, asam amino, vitamin, hormon, dan enzim. Pada keadaan abnormal dapat ditemukan glukosa, keton, protein, dan berbagai senyawa lain seperti pigmen empedu, darah, forfirin. Pada wanita hamil dalam urin ditemukan hGG (human Chorionic Gonadotropin) yang dihasilkan oleh plasenta. Hormon ini memberi hasil positif pada uji kehamilan. D. Alat dan Bahan Alat: Tabung reaksi besar Rak tabung reaksi Pipet takar 10 mL Penjepit kayu Batang pengaduk Pipet tetes Sendok plastik Penangas air Botol semprot
10 buah 1 buah 1 buah 5 buah 1 buah 2 buah 1 buah 1 set 1 buah
Bahan Urin normal 24 jam dan urin patologis Kristal amonium sulfat Larutan natrium nitroprusida 5% Larutan ammonium hidroksida pekat Asam nitrat pekat Larutan Benedict Larutan Glukosa 0,5 %, 1,0 %, 2,0 %, dan 5,0 % Aquades Larutan albumin 1%
8
E. Prosedur Kerja 1. Uji Glukosa dalam Urin (Uji Bennedict) a. Sediakan 5 buah tabung reaksi, ke dalam masingmasing tabung reaksi masukkan 2,5 mL larutan Benedict dan 10 tetes urin normal. Ke dalam tabung reaksi 2-5 tambahkan berturut-turut larutan glukosa 0,5%, 1%, 2% dan 5% masing-masing 5 tetes b. Panaskan tabung reaksi tersebut selama 5 menit dalam penangas air mendidih. c. Dinginkan perlahan-lahan. d. Perhatikan endapan atau warna yang terbentuk Warna endapan Warna Biru/ hijau keruh Hijau/ hijau kekuningan Kuning kehijauan/kuning Jingga Merah Hasil percobaan Uji Benedict Urin normal
Penilaian +1 +2
Konsentrasi Kurang 0,5% 0,5 – 1,0 %
+3 +4
1,0 – 2,0 % Lebih dari 2 %
Warna
Penilaian
Konsentrasi
Urin mengandung glukosa 0,5% Urin mengandung glukosa 1,0% Urin mengandung glukosa 2,0% Urin mengandung glukosa 5,0%
9
2. Uji Protein dalam Urin (Uji Heller). a. Sediakan 2 buah tabung reaksi, isi dengan 3 mL urin normal. Pada tabunh reaksi 2 tambahkan larutan albumin sebanyak 10 tetes b. Dengan perlahan-lahan (dengan pipet tetes) masukkan 3 mL asam Nitrat pekat ke dalam tabung di atas melalui dinding reaksi (hati-hati). c. Perhatikan cincin putih yang terbentuk pada perbatasan Catatan. Urea, asam urat dan garamnya dapat menghasilkan cincin putih, tetapi dapat dibedakan dengan memakai urin yang telah diencerkan 3-4 kali, sehingga pengaruh ini dapat dihilangkan. Hasil Percobaan Sampel Pengamatan Urin normal
Kesimpulan
Urin patologis 3. Uji Senyawa keton dalam Urin ( Uji Rother) a. Sediakan 2 buah tabung reaksi, masing diisi dengan 5 mL urin. Ke dalam tabung reksi 2 tambahkan 10 tetes aseton. Tambahkan kristal ammonium sulfat ke dalam urin normal atau urin patologis hingga jenuh. b. Tambahkan 2–3 tetes larutan natrium nitroprusida 5 % (dalam keadaan segar) dan 1 mL ammonium hidroksida pekat. Aduk dan biarkan minimal 30 menit. c. Perhatikan perubahan warna yang terjadi. Hasil Percobaan Sampel Pengamatan Urin normal
Kesimpulan
Urin patologis 10
F. Pertanyaan 1. Tuliskan reaksi yang terjadi antara glukosa dengan Benedict 2. Berdasarkan percobaan, apakah kadar glukosa yang terdapat dalam sampel yang dianalisis termasuk dalam keadaan normal atau tidak ? 3. Mengapa kadar glukosa dalam urin bervariasi 4. Apakah uji Heller spesifik terhadap protein? Tuliskan reaksi yang terjadi . 5. Dalam kondisi bagaimanakah kadar protein tinggi dalam urin ? 6. Berdasarkan percobaan, jenis urin manakah yang mengandung senyawa keton tertinggi ? dan pada keadaan bagaimana senyawa keton ditemukan dalam urin ? G. Tugas Pendahuluan: 1. Apakah yang dimaksud dengan urin normal dan patologis 2. Tuliskan komposisi urin normal manusia 3. Tuliskan deretan reaksi pembentukan urea di dalam tubuh manusia 4. Dari hasil analisa urin seorang pasien, ternyata mengandung senyawa keton. Jelaskan mengapa demikian? Sertai penjelasan anda dengan metabolisme yang terlibat H. Daftar Pustaka Dotti, Louis B; Orten, JM (1997), Laboratorium Instructions in Biochemistry, S Louir: Mosby Company. Harrow, Benjamin, et.al, Laboratorium Manual of Biochemistry fifth edition, London: Saunder Company. Somogy, M, (1952), “ Notes on sugar Determination�, Journal of Biochemistry, 195, pp. 19-23.
11
Praktikum Biokimia Percobaan 03
ANALISA KUALITATIF KANDUNGAN EMPEDU A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat melakukan analisa kualitatif kandungan empedu. B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat mendeskripsikan keadaan fisik empedu meliputi warna, bau, keadaan wujudnya, derajat keasaman dan berat jenisnya. 2. Mahasiswa dapat menentukan zat warna empedu melalui test Gmelin. 3. Mahasiswa dapat membuktikan peranan empedu sebagai emulgator 4. Mahasiswa dapat menganalisis data hasil percobaan. 5. Mahasiswa dapat menyimpulkan hasil percobaan. 6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan. C. Dasar Teori Kandungan empedu merupakan kantong otot kecil yang berfungsi untuk menyimpan empedu (cairan pencernaan berwarna kuning kehijauan yang dihasilkan oleh hati). Empedu mengalir dari hati melalui duktus hepatikus kiri dan kanan, lalu keduanya bergabung membentuk duktus hepatikus utama bergabung dengan saluran yang berassal dari kantung empedu (duktus sistikus) membentuk saluran empedu utama. Saluran empedu utama masuk ke usus bagian atas pada sfingter Oddi, yang terletak beberapa centimeter di bawah lambung. Cairan empedu terdiri dari asam empedu, protein, garam empedu, kalsium dan lemak. Fungsi dari cairan empedu adalah untuk membentuk penyerapan lemak, dan vitamin A,D,E dan K. Cairan empedu merupakan cairan jernih, berwarna kuning, agak kental dan mempunyai rasa pahit. Caoran empedu mengandung zat-zat anorganik, yaitu HCO3, Cl-, Na+ dan K+ serta zat-zat organic, yaitu asam-asam 12
empedu, bilirubin dan kolesterol. Asam-asam empedu yang penting ialah asam kolat dan asam deoksikolat. Beberapa fungsi asam empedu antara lain: sebagai emulgator dalam proses pencernaan lemak dalam usus; dapat mengaktifkan lipase dalam cairan pancreas; membantu mengadsorbsi asam-asam lemak, kolesterol, vitamin D dan K serta karoten; sebagai perangsang aliran cairan empedu dari hati; dan menjaga agar kolesterol tetap larut dalam cairan empedu. Bila perbandingan asam empedu dengan kolesterol rendah, akan menyebabkan terjadinya beberapa endapan kolesterol. D. Alat dan Bahan Alat: Gelas ukur 10 mL dan 25 mL Gelas kimia 50 mL dan 100 mL Tabung reaksi Rak tabung reaksi Corong biasa Picnometer 50 mL Neraca analitik Oven Penjepit tabung Botol semprot Pipet tetes Gunting
1 1 8 1 1
buah buah buah buah buah
Bahan Empedu ayam Asam asetat 10 % Perak nitrat Barium klorida Ammonium molibdat Asam nitrat pekat Iodida 5 % Sukrosa Asam sulfat pekat Aquadest Indikator universal 13
E. Cara Kerja 1. Tes Keadaan Fisik Empedu Memperhatikan dan memeriksa warna, bau, keadaan wujud, derajat keasaman (dengan indikator universal). Tabel Pengamatan Gelas kimia berisi empedu Warna empedu Bau/Aroma pH Tingkat kekentalan Encer/agak kental/kental 2. Tes Sifat Asam / Basa dari Empedu a. Tambahkan 5 mL larutan empedu yang telah diencerkan ke dalam tagung reaksi. b. Tambahkan 5 tetes larutan sukrosa 5% ke dalam tabung reaksi. c. Miringkan tabung reaksi, alirkan dengan hati-hati 3 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung reaksi, sehingga terbentuk 2 lapisan. Perhatikan cincin yang terbentuk pada perbatasan antara kedua lapisan. d. Catat hasilnya. Tabel pengamatan Tabung reaksi Jumlah zat Larutan empedu 5 mL Larutan sukrosa
5 tetes
Asam sulfat
3 mL
Hasil Pengamatan
3. Tes Zat Warna Empedu (Uji Gmelin) a. Masukkan 3 mL HNO3 pekat ke dalam tabung reaksi b. Miringkan tabung reaksi, dengan menggunakan pipet tetes, secara hati-hati alirkan 3 mL larutan empedu encer melalui dinding tabung reaksi, sehingga kedua larutan tersebut tidak tercampur (jangan digoyang) 14
c. Perhatikan warna yang terbentuk pada perbatasan antara kedua cairan. d. Tulis hasil pengamatan anda. Tabel pengamatan Tabung reaksi HNO3 pekat
Jumlah zat 3 mL
Larutan empedu encer
3 mL
Hasil Pengamatan
Perbatasan antara kedua cairan. 4. Empedu sebagai emulgator. a. Sediakan 2 buah tabung reaksi, masing-masing diisi dengan air suling 3 mL. b. Kedua tabung tambahkan 1 tetes minyak goreng, c. Pada tabung ke-2 tambahkan 3 mL larutan cairan empedu encer. Kecok kedua tabung, perhatikan apa yang terjadi pada masing-masing tabung. Tabel Pengamatan. Tabung Air suling Minyak goring Larutan empedu cair Hasil
1 3 mL 1 tetes -
2 3 mL 1 tetes 3 mL
F. Pertanyaan. 1. Apa yang menyebabkan uji Gmelin dapat menghasilkn warna ? Tulis persamaan reaksinya. 2. Apa guna penambahan sukrosa pada percobaan uji asam empedu? 15
G. Tugas Pendahuluan. 1. Hasil analisis labor seorang pasien, ternyata menderita penyakit batu empedu. Jelaskan apa penyebabnya seseorang terkena penyakit batu empedu? 2. Apa fungsi cairan empedu bagi manusia ? H. Daftar Pustaka Dotti, Louis B; Orten, JM (1997), Laboratorium Instructions in Biochemistry, S Louir: Mosby Company. Harrow, Benjamin, et.al, Laboratorium Manual of Biochemistry fifth edition, London: Saunder Company. Somogy, M, (1952), “Notes on sugar Determination�, Journal of Biochemistry, 195, pp. 19-23.
16
Praktikum Biokimia Percobaan 04
PENENTUAN TOTAL KOLESTEROL DALAM SERUM DARAH (METODE LIEBERMANN-BURCHARD) A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat menentukan kadar kolesterol dalam serum darah secara spektrofotometri menggunakan metoda Liebermann-Burchard B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip penentuan kadar kolesterol menggunakan metoda Liebermann-Burchard 2. Mahasiswa dapat mengoperasikan alat spektrofometer dengan benar. 3. Mahasiswa dapat melakukan percobaan penentuan kadar koloesterol mengguna-kan metoda Liebermann-Burchard. 4. Mahasiswa dapat menganalisis data 5. Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan. 6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan. C. Dasar Teori Kolesterol merupakan molekul lipid yang penting dalam membran sel dan lipoprotein. Kolesterol juga merupakan prekursor hormon steroid, asam empedu dan votamin D. Level abnormal kolesterol atau prekursornya telah diamati pada berbagai penyakit manusia seperti penyakit jantung, stroke, dan diabetes tipe II. Oleh sebab itu, keakuratan pengukuran kadar kolesterol adalah penting. Untuk mengukur kadar kolesterol dapat digunakan metoda Liebermann-Burchard atau reaksi dengan reagen ferric chloride-sulfuric acid. Kadar kolestrol dapat juga ditentukan dengan reagen perchloric acid-phosphoric acid-ferric chloride
17
D. Alat dan Bahan Alat: Tabung reaksi 10 buah Sumbat gabus dengan pipa kapiler 1 set Batang pengaduk 5 buah Spektrofotometer vis 1 buah Kuvet kaca/kuarsa 2 buah Rak tabung reaksi 1 buah Bahan : Serum atau darah Anhidrida asam asetat H2SO4 pekat Kolesterol standar E. Prosedur 1. Sebanyak 0,2 mL serum ditempatkan di dalam tabung reaksi kering (selanjutnya disebut sebagai tabung sampel). 2. Tambahkan 10 mL asam asetat anhidrida dari buret ke dalam tabung reaksi yang telah berisi serum tadi lalu segera tutup tabung reaksi tersebut dengan sumbat gabus yang diberi lobang dengan kapiler dan biarkan selama 5 menit. 3. Kocok tabung reaksi tersebut dan panaskan di dalam penangas air selama 30 menit untuk mengekstraksi kolesterol. Setelah tabung-tabung tersebut dingin hingga suhu kamar, dekantasi dengan hati-hati cairannya ke dalam tabung reaksi yang kering. 4. Siapkan larutan standar kolesterol (sesuai dengan tabel di bawah ini). Sebagai blanko digunakan air destilasi. 5. Tambahkan 0,36 mL H2SO4 pekat pada tiap-tiap tabung reaksi dan kocok keras. 6. Simpan di tempat gelap, setelah 15 menit, semua larutan (kolesterol standar dan sampel) diukur absorbansinya pada Îť = 660 nm
18
Larutan standar kolesterol 2,5 mg kolesterol kering dilarutkan sampai 25 mL dengan asam asetat anhidrida (larutan kolesterol induk) No. Tabung
mL larutan standar
mL asam asetat anhidrida
mg kolesterol /10 mL larutan standar
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
9 8 7 6 5 4
0,1 ? ? ? ? ?
F. Pertanyaan 1. Buat kurva kalibrasi. Sebagai sumbu x adalah konsentrasi larutan standar, sebagai sumbu y adalah Absorbansi. 2. Cari persamaan regresi linier, dan tentukan besar koefisien regresinya (r). 3. Tentukan kadar kolesterol total pada 0,2 mL serum darah 4. Tentukan kadar kolesterol total pada tiap 100 mL serum darah 5. Tentukan kadar kolesterol total pada tiap 1 dL serum darah. 6. Apakah satuan kadar kolesterol yang biasa digunakan pada bidang kesehatan? 7. Pada percobaan ini, tabung reaksi yang digunakan harus kering (bebas air). Jelaskan mengapa demikian? 8. Jelaskan metoda lain untuk menentunkan kadar kolesterol darah. G. Tugas Pendahuluan 1. Lengkapilah tabel di atas 2. Berapakah konsentrasi kolesterol induk (mg/mL)? 3. Untuk percobaan ini, jelaskan mengapa volume larutan induk dibuat 25 mL? 19
4. Gambarkan struktur kolesterol 5. Tulislah sifat kolesterol 6. Berapakah kadar kolesterol yang diperbolehkan dalam
darah orang sehat? 7. Apakah guna kolesterol pada tubuh manusia 8. Dalam bentuk apa sistem trasportasi kolesterol dalam darah?. Mengapa demikian? 9. Pada uji kolesterol dalam darah, biasanya yang terhitung adalah kolesterol total. Kandungan yang dominan dalam kolesterol total adalah kolesterol pada Low Density Lipoprotein (LDL) dan High Density Lipoprotein (HDL). Apakah yang dimaksud dengan LDL dan HDL? Gambarkan kedua lipoprotein tersebut. 10. Jelaskan reaksi Liebermann-Burchard H. Daftar Pustaka Pandey,A.,Benjamin,S., Soccol,CR.,Nigam,P.,Krieger,N and Socco,V.T (1999). The Realm of Microbial Lipases in Biotechnology. Biotech .Appl Biochem 29:119-131 Edward Kim* and Morris Goldberg (1969) Serum Cholesterol Assay Using a Stable Liebermann-Burchard Reagent. Clinical Chemistry .Vol. IS, No. 12,
20
Praktikum Biokimia Percobaan 05
PRAKTIKUM MANDIRI A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat merancang praktikum sederhana yang berkaitan dengan biokimia metabolisme secara kelompok di bawah bimbingan dosen dan asisten B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip praktikum yang dirancang 2. Mahasiswa dapat melakukan percobaan yang telah dirancang. 3. Mahasiswa dapat menganalisis data 4. Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan. 5. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan dalam kelompok dan antar kelompok.
21
Lampiran 1 Jadwal Praktikum Biokimia Metabolisme (SKS 4(1)) (Semester Januari –Juni 2020) Minggu ke/ Kegiatan Tanggal 1 Mahasiswa Magang 20-24 Januari’20 Revisi penuntun praktikum oleh tim Biokimia 2 a. Mahasiswa Magang 27 Jan-01 Feb’20 b. Coaching praktikum asisten i. Latihan pemakaian alat praktikum (30 -01-2020) ii. Peningkatan penguasan konsep judul yang dipraktikumkan (31-01-2020) dan (04-02-2020) c. Perbanyakan penuntun 6 buah 3 a. Pengenalan judul praktikum 03-08 Februari’20 b. Pembagian kelompok menjadi 8 kelompok tiap kelas c. Informasi pembuatan tugas pendahuluan, logbook praktikum, laporan praktikum, dan penilaian praktikum d. Peminjaman alat praktikum e. Pelatihan pemakaian alat praktikum (dua kelompok setiap asisten/dosen) f. Pembuatan reagen (dapat dilakukan diluar jam kuliah) 4 Judul 1 Judul 2 10-15 Februari’20 Judul 3 Judul 4 5 Judul 1 Judul 2 17-22 Februari’20 Judul 3 Judul 4 6 Judul 1 Judul 2 24-29 Februari’20 Judul 3 Judul 4 7 Judul 1 Judul 2 02-07 Maret’20 Judul 3 Judul 4 22
8 09-14 Maret’20 9 16-21 Maret’20 10 23-28 Maret’20 11 30 Maret-4 April’20
12 06-11 April’20 13 13-18 April’20 14 20-25 April’20 15 27 April-02 Mei’20
Diskusi Diskusi Ujian Praktikum Judul 1 sampai 4 Sabtu, 28 Maret 2020 Praktikum mandiri (pengajuan rancangan praktikum dan persetujuan oleh Dosen/Asisten Pelaksanaan praktikum mandiri Pelaksanaan praktikum mandiri Ujian Akhir (Presentasi praktikum Mandiri) Ujian Akhir (Presentasi praktikum Mandiri)
23
Lampiran 2 Penilaian Praktikum Biokimia Metabolisme Persentase item penilaian pada praktikum metabolisme seperti dimuat pada tabel berikut: Item penilaian Tugas pendahuluan Pretes Logbook praktikum Laporan praktikum Kerja/Aktivitas praktikum UTS praktikum UAS praktikum
biokimia
Persentase 10% 10% 15% 15% 20% 15% 15%
24