PENUNTUN PRAKTIKUM
BIOKIMIA DASAR (Prodi Kimia)
OLEH:
TIM BIOKIMIA
LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG 2019
PEDOMAN UMUM PRAKTIKUM A. Peraturan dasar di laboratorium 1. Sebelum memasuki ruangan laboratorium, anda harus memakai jas praktikum / lab coat 2. Praktikan dilarang memakai sandal dan sejenisnya 3. Tidak diperbolehkan makan, minum dan meludah di laboratorium 4. Bagi yang tidak berkepentingan, dilarang masuk ke laboratorium 5. Buanglah sampah pada tempat yang sudah disediakan 6. Dilarang membuang sampah di saluran air 7. Pahami semua aturan penggunaan alat dan bahan sebelum digunakan 8. Bicara seperlunya 9. Setelah bekerja, ruangan dan alat harus dibersihkan 10. Hati-hati menggunakan zat 11. Selalu berhati-hati ketika membawa dan bekerja dengan zat 12. Tidak dibenarkan bekerja sendirian di laboratorium 13. Tidak masuk praktikum 3 kali berturut-turut, dianggap mengundurkan diri 14. Datang 15 menit sebelum praktikum dimulai
B. Kewajiban praktikan 1. Mempelajari penuntun praktikum dan bersiap untuk di tes 2. Tidak diperkenankan masuk laboratorium sebelum ada izin dari pembimbing praktikum atau asisten praktikum 3. Membuat jurnal setiap kali praktikum dengan urutan sebagai berikut: Judul praktikum Tujuan praktikum Teori dasar Alat dan bahan yang diperlukan Prosedur praktikum dalam bentuk skema atau diagram alir Pengamatan dalam bentuk tabel Jawaban pertanyaan (jika ada) Daftar pustaka 4. Membawa lap atau tisu 5. Mengganti alat yang hilang atau rusak 6. Melaporkan setiap terjadi kecelakaan di laboratorium pada asisten atau pembimbing praktikum 7. Menyerahkan surat keterangan dari dokter jika sakit
i
8. Menyerahkan laporan lengkap pada waktu praktikum berikutnya pada asisten atau pembimbing praktikum dengan isi laporan praktikum sebagai berikut: Judul praktikum Tujuan praktikum Teori dasar Alat dan bahan Prosedur kerja dalam bentuk diagram alir atau skema Pengamatan Pembahasan Kesimpulan Daftar pustaka Jawaban pertanyaan
ii
DAFTAR ISI 1.
Pedoman Umum Praktikum Biokimia………………………………….
2.
Daftar Isi………………………………………………………………... iii
3.
Pengenalan Teknik Dasar Mikrobiologi (Metoda Aseptik)…………….
4.
Penentuan Kadar Protein Secara Lowry………………………………... 9
5.
Penentuan Kadar Vitamin C……………………………………………. 13
6.
Pengujian Sifat Fisika dan Kimia Lemak………………………………
7.
Estraksi DNA dari Buah………………………………………………... 20
8.
Penentuan Aktivitas Enzim Lipase……………………………………... 24
i
1
16
iii
Praktikum Biokimia Percobaan 01 dan 02
PENGENALAN TEKNIK DASAR MIKROBIOLOGI (METODA ASEPTIK)
A. Standar Kompetensi Mahasiswa
dapat
membuat
media
pertumbuhan
mikroorganisme
dan
membiakkan mikroorgansime secara aseptik
B. Tujuan Mahasiswa dapat 1. Menggunakan autoclave yang benar 2. Bekerja aseptik 3. Menyiapkan media padat pada cawan petri dan tabung reaksi 4. Menanam mikroorganisme pada media padat menggunakan teknik streak-plate 5. Menanam mikroorganisme pada media cair
C. Teori Sekarang banyak vitamin dan protein penting telah diproduksi di dalam sel mikroorganisme. Dengan kata lain, mikroorganisme telah dijadikan “pabrik hidup� untuk memproduksi vitamin dan senyawa-senyawa yang penting bagi manusia. Protein penting yang pertama diproduksi pada mikroorganisme adalah insulin manusia. Tahukan anda apakah fungi insulin bagi tubuh kita? Oleh sebab itu, pengetahuan teknik dasar mikrobiologi adalah bagian penting pula pada pelajaran biokimia. Metoda aseptik merupakan suatu keharusan jika bekerja dengan mikroorganisme. Tujuan aseptik adalah agar mikroorganisme tersebut tidak terkontaminasi oleh jenis mikroorganisme lain. Mikroorganisme merupakan kontaminan tertinggi yang hanya dapat dicegah dengan teknik aseptik yang benar. Pada prinsipnya bekerja aseptik adalah bekerja dengan teknik steril. Setiap langkah pekerjaan diusahakan tidak membawa mikroorganisme jenis lain selain mikroorganisme yang diinginkan. Untuk mencapai 1
tujuan ini semua peralatan, bahan-bahan, termasuk media pertumbuhan dan air, meja kerja dan tangan kita harus disuci-hamakan terlebih dahulu. Beberapa metoda untuk mensuci-hamakan antara lain adalah sterilisasi. Pada percobaan ini, semua peralatan dan bahan-bahan yang tidak rusak sampai suhu 121ÂşC disucihamakan dengan pengukusan pada suhu 121ÂşC selama 15-20 menit menggunakan autoclave. Sterilisasi dapat juga dilakukan secara kering yang dinamakan dry-heat sterilized yang dilakukan dalam oven pada suhu 160-170ÂşC. Meja kerja, tangan dan beberapa peralatan tertentu disucihamakan dengan alkohol teknis 70%. Selama bekerja aseptik, pekerjaan selalu dilakukan di dekat api (jarak sekitar 10 cm). Jika harus memindahkan suatu media kultur dari satu wadah ke wadah lain, diusakan agar penutup masing-masing wadah dibuka dalam waktu sesingkat mungkin di dekat api. Penutup wadah tersebut tetap dipegang dan tidak ditaruh di meja. Media untuk tumbuhnya mikroorgansime dinamakan media kultur. Media kultur dapat dibuat padat atau cair. Keduanya hanya dibedakan oleh agar yang ditambahkan pada media tersebut. Media kultur dapat ditempatkan pada tabung reaksi (tube) atau petri plate (petri disk). Berdasarkan wadah dan wujud media dikenal broth tube, agar miring, agar dalam dan agar plate (Gambar 1).
Gambar 1. Media Kultur
Teknik yang dapat digunakan untuk memperoleh kultur murni suatu bakteri adalah gabungan streak-plate technique dan spread-plate technique. Spread-plate technique digunakan juga untuk menghitung jumlah bakteri pada volume tertentu kultur 2
murni. Penyediaan kultur murni suatu bakteri/mikroorganisme, tanpa terkontaminasi dengan mikroba lain dengan streak-plate technique. Streak-plate technique adalah langkah awal yang sangat penting dalam pekerjaan molekuler seperti perbanyakan fragmen DNA tertentu secara in vitro (secara PCR) dengan template DNA genom mikroorganisme. Kedua teknik ini akan menghasikan koloni bakteri pada permukaan media padat. Koloni bakteri merupakan onggokan bakteri yang pada awalnya berasal dari satu sel bakteri. Onggokan bakteri tersebut demikian besarnya sehingga dengan mata telanjang (tanpa alat bantu penglihatan) kita dapat melihatnya. Satu koloni dapat mengandung lebih dari 10 juta (107) sel bakteri. Setiap koloni bakteri menunjukkan karakteristik tertentu. D. Alat dan Bahan 1. Alat Cawan petri
2 (satu telah berisi media padat steril)
Gelas Kimia 100 ml
1 buah
Pemanas (lampu spiritus)
1 set
Autoklav
1 set
Tabung reaksi
6 buah
Kapas
secukupnya
Kain kasa, plastik wrap
secukupnya
Jarum Ose
1 buah
Shacker
1 set
Botol semprot
1 buah
Erlenmeyer 50 mL
4 buah
2. Bahan Glukosa
2,0 %
Yeast ekstrak
0,5 – 1,0 % 3
Agar bakto
3,0 – 4,0 %
Pepton
1,0 %
Alkohol teknis 70%
100 mL
Aquades Kultur Acetobacter xylinum disingkat A.xylinum Saccharomyces cerevisiae disingkat S.cerevisiae
E. Prosedur Kerja Membuat media cair steril S.cerevisiae dan A. xylinum 1. Timbang bahan media cair (tanpa agar) untuk 10 mL air masing-masing untuk S.cerevisiae (glukosa, yeast ekstrak), dan A.xylinum (glukosa, yeast ekstrak, pepton) 2. Larutkan masing-masing media di dalam 10 mL air dalam tabung reaksi atau Erlenmeyer (boleh dipanaskan agar cepat larut) 3. Label tabung reaksi dengan nama kultur 4. Media sebanyak 5 mL dituang ke dalam tabung reaksi sesuai label. Dengan demikian anda mempunyai 4 buah media cair (2 untuk S.cerevisiae atau 2 untuk A.xylinum). 5. Tabung reaksi ditutup dan disterilkan dalam autoklav pada 15 lb selama 15 menit (dalam pengawasan asisten!) Satu media steril S.cerevisiae digunakan untuk pertumbuhan S.cerevisiae satu untuk ‘kontrol’nya (tidak ditambahkan S.cerevisiae). Begitu juga untuk media cair A.xylinum.
Membiakkan S.cerevisiae dan A. xylinum pada media cair steril 1. Siapkan meja kerja dalam keadaan bersih, lampu spiritus, tabung reaksi berisi 2 mL alkohol teknis 70% serta alkohol teknis 70% di dalam botol semprot. 2. Semprot meja kerja dengan alkohol teknis. Rendam jarum ose dalam alkohol teknis 70%. Nyalakan lampu spiritus. 4
3. Ambil jarum ose dan segera panaskan hingga membara, dinginkan ujung ose pada tepi media padat steril. Setelah yakin ose dingin ambil biakan S.cerevisiae dengan ujung ose pada stock biakan S.cerevisiae (pada tabung reaksi atau petri). Segera panaskan mulut tabung reaksi atau tepi petri dan tutup kembali. 4. Ambil tabung reaksi berisi media cair steril buka tutupnya (tutup tetap dipegang) panaskan mulut tabung dan segera celupkan dan goyang-goyang ujung ose pada media cair. Segera panaskan mulut tabung dan tutup kembali. Ujung ose dipanaskan kembali sampai nyala dan dinginkan, kemudian celupkan pada alkohol 70%. 5. Ulangi pekerjaan untuk media cair steril A.xylinum. 6. Letakkan tabung reaksi pada shaker posisi setimbang dan digoyang 150 rpm suhu ruang selama sekitar 16-24 jam (dalam pengawasan asisten!). Amati media cair pada tabung reaksi tersebut dan bandingkan dengan ‘kontrol’.
Menyiapkan media padat dalam cawan petri dan tabung reaksi 1. Buat penutup tabung reaksi dari kapas yang dibungkus kain kasa 2. Timbang bahan media padat untuk 15 mL air masing-masing untuk Saccharomyces cerevisiae (glukosa, yeast ekstrak, agar bakto) dan Acetobacter xylinum (glukosa, yeast ekstrak, pepton, agar bakto) 3. Larutkan media di dalam 15 mL air di Erlenmeyer (boleh dipanaskan agar cepat larut). Tutup Erlenmeyer dengan kapas yang dibungkus kain kasa. 4. Masukkan cawan petri dan tabung reaksi bertutup ke plastik tahan panas, tutup. Petri boleh dibungkus kertas HVS bekas bersih. 5. Sterilkan memakai autoclave (dalam pengawasan asisten) 6. Setelah sterilasi selesai didinginkan sampai sekitar suhu 45-50ºC ”suam kuku” (Erlenmeyer dapat dipegang dengan tangan) 7. Dekatkan mulut Erlenmeyer ke api dan tuang media ke dalam cawan petri (+ 15-20 mL) dan ke tabung reaksi (+ 5-10 mL). Bisakan anda menuang media selagi memegang petri/tabung reaksi dan penutupnya di tangan kiri dan media di kanan ? Cara seperti ini sebaiknya dilakukan. 8. Tabung reaksi dibiarkan miring dekat api sampai media memadat, kemudian ditutup. Setelah media memadat pada petri, tutup sisi kedua petri dengan plastik wrab. Simpan petri dalam keadaan terbalik. 5
Membuat koloni tunggal dengan Streak-plate technique 1. Pada prinsipnya streak-plate technique menggunakan jarum ose. Siapkan agar miring, agar plate dan jarum ose, Tabung reaksi berisi 2 mL alkohol teknis 70% serta botol semprot berisi alkohol teknis 70%. 2. Atur meja kerja supaya agar miring, agar plate dan biakan berada di sebelah kiri api, sedangkan jarum ose dan alkohol teknis 70%
di sebelah kanan api. Pastikan
permukaan media padat pada petri dan tabung reaksi bebas uap air. 3. Pastikan tutup petri bebas uap air. 4. Ambil tabung yang berisi biakan murni dengan tangan kiri. Buka tutup tabung dengan menjepitnya di antara kelingking dan jari manis tangan kiri, segera panaskan mulut tabung. 5. Dengan tangan kanan ambil jarum ose dan segera panaskan hingga membara, dinginkan sesaat pada tepi media padat. Setelah yakin ose dingin ambil biakan dengan jarum ose, segera panaskan mulut tabung dan tutup. Letakkan tabung pada rak. 6. Ambil tabung agar miring buka tutupnya (tutup tetap dipegang) panaskan mulut tabung dan segera gesekkan ujung ose pelan pada permukaan media padat dimulai dari arah bagian dasar tabung ke arah mulut tabung. Segera panaskan mulut tabung dan tutup kembali. 7. Ulangi pekerjaan untuk media padat di dalam petri (agar plate). Pola goresan dapat dilihat pada Gambar 2. Tutup sisi kedua petri dengan plastik wrab 8. Letakkan petri dalam keadaan terbalik pada suhu ruang, 16-24 jam. Amati permukaan petri. Apakah terbentuk koloni tunggal S.cerevisiae dan A.xylinum .
Gambar 2. Pola goresan ose pada media agar plate (b) dan agar miring (d)
6
Perhatian Jangan lupa memberi nama. tanggal percobaan dan keterangan sampel sebelum menyimpan di dalam inkubator. Setelah selesai bekerja dengan mikroba, jangan lupa sterilkan kembali meja kerja dan semua peralatan. Buang sampah mikrobiologi pada tempat khusus (yang mengandung desinfektan).
Alkohol mudah terbakar, dijauhkan dari api. Cuci tangan sebelum dan setelah bekerja.
Tugas pengamatan 1. Amati koloni yang tumbuh pada biakan yang telah anda tanam. Kalau perlu gunakan lup 2. Apakah terdapat kontaminan ? Kalau ya, jelaskan. Kalau tidak, jelaskan. 3. Jika terjadi kontaminasi pada tugas praktikum yang anda kerjakan. Pada bagian mana kemungkinan besar yang ‘tidak steril’ yang telah anda lakukan? Mengapa demikian ? Bagaimana cara mengatasinya ? 4. Apa perbedaan media cair dan media padat ? 5. Jejak apakah yang anda lihat pada permukaan agar streak plate ? 6. Bagaimana anda yakin bahwa bakteri yang anda biakan telah tumbuh pada streak plate dan bakteri tersebut bukan kontaminan ? 7. Mengapa menyimpan media padat pada petri, dan menumbuhkan mikroorganisme pada petri, petri diletakkan pada posisi terbalik? 8. Apa tujuan meletakkan tabung reaksi ‘miring’ ketika proses pemadatan media pada tabung reaksi ? 9. Jelaskan langkah menggunakan autoclave untuk sterilisasi. 10. Untuk membuat ‘koloni tunggal’
pada permukaan media padat di petri sebaiknya
permukaan media dan tutup petri bebas dari uap air. Jelaskan mengapa demikian? 11. Perhatikan koloni bakteri ini. Manakah yang merupakan kultur murni?
7
Tugas pendahuluan 1. Jelaskan kegunakan Acetobacter xylinum dan Saccharomyces cerevisiae 2. Jelaskan tujuan dan metoda sterilisasi ? 3. Bagaiman mensterilkan zat yang rusak karena panas ? 4. Apakah yang dimaksud kultur murni dan kultur campuran ? 5. Jelaskan kegunaan streak-plate technique 6. Telusuri gambar karakteristik koloni bakteri yang meliputi bentuk koloni, elepasi koloni, margin koloni.
Referensi 1. Laboratory exercises in microbiology fifth edition by Harley and Prescott. MC Grow Hill 2002 2. Brock Biology of Microorganisms by Madikan et al. Benjamin Cummings, 2012.
8
Praktikum Biokimia Percobaan 03
PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA LOWRY A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat menentukan kadar protein bahan makanan secara Lowry. B. Kompetensi dasar 1. Mahasiswa dapat menjelaskan konsep dasar tentang protein 2. Mahasiswa dapat membuat reagen yang berkaitan dengan percobaan penentuan kadar protein secara Lowry. 3. Mahasiswa dapat mengoperasikan alat spektrofotometer. 4. Mahasiswa dapat melakukan percobaan penentuan kadar protein secara Lowry terhadap beberapa bahan (sampel). 5. Mahasiswa dapat mengumpulkan data dan menganalisanya dengan benar. 6. Mahasiswa dapat mengambil kesimpulan dari hasil percobaan. 7. Mahasiswa dapat menginformasikan hasil percobaan. C. Dasar Teori Protein adalah senyawa biomolekul yang terdapat pada tumbuhan dan hewan. Komponen penyusun protein adalah asam-asam amino, yang berikatan satu sama lain dengan ikatan peptida. Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan dua cara yaitu secara Lowry dan Biuret. Dengan metode Lowry dapat ditentukan kadar protein yang lebih kecil (5 – 100 ď g protein). Prinsip penentuan kadar protein secara Lowry adalah berdasarkan pengukuran serapan cahaya oleh senyawa kompleks berwarna ungu. Warna ungu ini timbul akibat reaksi antara larutan protein dengan larutan Cu dalam suasana alkalis yang terdapat dalam reagen
dan reduksi fosfomolibdat dan
fosfotungstat oleh tirosin dan triptopan yang terdapat dalam protein. Intensitas warna 9
menunjukkan konsentrasi protein dalam suatu larutan protein tersebut. Oleh sebab itu kadar protein dapat ditentukan dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. D. Bahan dan Alat 1. Alat Tabung reaksi besar
10 buah
Pipet takar 2 ml
1 buah
Pipet takat 10 ml
1 buah
Pipet tetes
2 buah
Labu ukur 10 ml
6 buah
Batang pengaduk
1 buah
Rak tabung reaksi
1 buah
Gelas kimia 250 ml
2 buah
Spektrofotometer spektronik 21
1 set
Kuvet
2 buah
Botol semprot
1 buah
2. Bahan Reagen A; 2% Na2CO3 dalam 0,1N NaOH 100 mL Reagen B; 0,5% CuSO4.5H2O dalam 1% Na-K tartrat 100 mL Reagen C; Campuran larutan 50 mL reagen A dengan 1 mL reagen B, buang setelah 1 hari. Reagen E; Encerkan reagen Folin – Ciocalteu (dalam botol 2N) menjadi 1 N dengan air. Larutan serum albumin (larutan standar ) 1.000 ď g/mL 10
Aquades
E. Prosedur Kerja 1. Pembuatan larutan standar protein dan Macing kuvet. a. Buatlah larutan serum albumin dengan konsentarsi berturut-turut 50, 100, 150, 200, 250, dan 300. ď g/mL dalam labu takar 100 mL. b. Ambil beberapa kuvet dan pilihlah kuvet yang mempunyai sifat optik yang sama (macing kuvet). Gunakan aqudes untuk macing kuvet. Dalam pengukuran gunakan 2 buah kuvet yang macing (satu untuk larutan standar, satu untuk blanko). 2. Pembuatan kurva kalibrasi standar larutan protein a. Pipet masing-masing 2 mL larutan standar, tambahkan 10 mL reagen C dan biarkan pada suhu kamar selama paling kurang 10 menit. Tambahkan 1 mL Reagen E dan kocok dengan segera. Biarkan selama 30 menit atau lebih sampai terbentuk warna ungu. Simpan larutan tersebut untuk digunakan pada pembuatan kurva standar. b. Tentukan Îťmaks dari larutan yang akan digunakan dengan menggunakan konsentrasi yang mewakili larutan standar. Atur panjang gelombang mulai dari 500 nm sampai 750 nm. c. Ukur absorbansi masing-masing larutan standar pada Îťmaks.Alurkan ke dalam grafik Absorbansi vs Konsentrasi.(sumbu X konsentrasi, sumbu Y absorbansi). d. Cari persamaan regresi linier,dan tentukan besar koeffisien regresi (r). e. Dengan cara yang sama pipet masing-masing 2 mL larutan sampel, tambahkan 10 mL reagen C dan
biarkan pada suhu kamar selama paling kurang 10
menit. Tambahkan 1 mL Reagen E dan kocok dengan segera. Biarkan
11
selama 30 menit atau lebih sampai terbentuk warna ungu. Ukur serapan pada panjang gelombang Îťmaks Catatan Untuk protein padat perlu dilarutkan misalnya dengan alkohol encer (etanol). Protein yang sukar larut seringkali dilarutkan dengan alkali 1N, bahkan dipanaskan selama 10 menit atau lebih pada suhu 100 0C.
F. Pertanyaan Larutan protein setelah ditambah dengan reagen C dan E terbentuk larutan berwarna ungu. Senyawa apakah yang berwarna tersebut dan tulis persamaan reaksinya! G. Tugas Pendahuluan 1. Jelaskan pengertian larutan blanko 2. Jelaskan perbedaan penentuan kadar protein secara Lowry dan Biuret ! 3. Berapakah volume larutan albumin 1.000 ď g/mL yang dibutuhkan untuk masing-masing larutan standar ? Tuliskan perhitungannya. 4. Kenapa pada pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer spektronik 21 harus diukur pada Îťmaks H. Daftar Pustaka Plummer, David T (1977), An Introduction to Practical Biochemistry, second edition. New Delhi.: Tata Mc. Graw-Hill Publishing Company Ltd.pp.145. Soedigdo P, dkk. (1980). Penuntun Praktikum Biokimia Dasar. Bandung. Jurusan Kimia FMIPA ITB.
12
Praktikum Biokimia Percobaan 4
PENENTUAN KADAR VITAMIN C
A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat menentukan kadar vitamin C dari berbagai jenis bahan makanan/buah-buahan.
B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat membuat reagen yang terkait dengan percobaan di atas. 2. Mahasiswa dapat mengunakan alat titrasi 3. Mahasiswa dapat melakukan percobaan penentuan kadar vitamin C secara titrasi. 4. Mahasiswa dapat mengumpulkan dan menganalisa data 5. Mahasiswa dapat menuliskan kesimpulan. 6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan.
C. Dasar Teori Vitamin dapat digolongkan atas kelarutannya yaitu vitamin yang larut dalan air, dan vitamin yang larut dalam lemak/minyak. Vitamin yang larut dalam air adalah vitamin B dan C, sedangkan vitamin yang larut dalam lemak adalah A, D, E, dan K. Vitamin yang larut dalam air bila dikonsumsi berlebihan akan dibuang keluar tubuh bersama urine dan keringat. Penentuan kadar vitamin C dapat dilakukan dengan dua cara yaitu cara titrasi dan spektrofotometri. Vitamin C sangat mudah teroksidasi sehingga vitamin ini mudah rusak.
D. Alat dan Bahan 1. Alat 13
Erlenmeyer 100 ml
3 buah
Pipet takar 10 ml
1 buah
Labu ukur 100 ml
1 buah
Corong kaca
1 buah
Buret 50 ml
1 set
Botol semprot
1 buah
Timbangan analitik
1 set
Lumpang
1 set
Kertas saring
secukupnya
Kapas
secukupnya
2. Bahan Sampel ( buah pisang, jeruk, papaya, dll) disediakan sendiri. Larutan kanji 1% Larutan yodium 0,01 N Aquades
E. Prosedur Kerja. 1. Bahan dihancurkan sampai diperoleh slury. 2. Timbang 10 gram slury, masukkan ke dalam labu takar 100 mL, dan encerkan sampai tanda batas. 3. Saring dengan menggunakan kapas, filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam erlenmeyer sebanyak 10 mL. 4. Tambahkan larutan kanji 1% titrasi dengan cepat dengan menggunakan larutan Yodium 0,01 N sampai timbul perubahan warna (warna biru kehitaman). 14
Perhitungan: A = mL Iod 0,01 N x 0,88 x p gram sampel
Keterangan : A = mg vitamin C per gram bahan p = jumlah pengenceran Catatan: Gunakan vitamin C IPI sebagai pembanding F. Pertanyaan 1. Apa tujuan penambahan larutan kanji pada percobaan ini ? 2. Apa kegunaan larutan Yodium pada percobaan ini ? 3. Apakah larutan Yodium dapat diganti dengan zat lain?. Jelaskan jawaban anda ?. 4. Bagaimana tingkat ketelitian penentuan kadar vitamin C antara metoda titrasi dengan spektrofotometri ? Jelaskan jawaban anda !
G. Tugas Pendahuluan 1. Tuliskan rumus molekul dan struktur dari vitamin C ?. 2. Tuliskan reaksi oksidasi dari vitamin C? 3. Tuliskan sifat fisika dan sifat kimia dari vitamin C ? 4. Berapa kebutuhan vitamin C normal setiap hari bagi manusia dewasa ?
H. Daftar Pustaka Less, R. 1975. Food Analysis: Analytical and Qualitative Control Methode for the Food Manufactore and Buyer. London: Leonard Hill Book.
15
Praktikum
Biokimia Percobaan 5
PENGUJIAN SIFAT FISIKA DAN KIMIA LEMAK
A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat menentukan sifat fisika dan kimia lemak B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat membuat reagen yang berkaitan dengan percobaan pengujian sifat fisika dan kimia lemak 2. Mahasiswa dapat mengoperasikan peralatan yang digunakan pada percobaan di atas dengan benar dan tepat. 3. Mahasiswa dapat melakukan percobaan pengujian sifat fisika dan kimia lemak 4. Mahasiswa dapat menganalisa hasil percobaan 5. Mahasiswa dapat mengambil kesimpulan dari hasil percobaan 6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan
C. Dasar Teori Lemak dan minyak adalah suatu senyawa trigliserida yang merupakan hasil reaksi esterifikasi antara 1 molekul gliserol dengan 3 molekul asam lemak. Lemak dan minyak tergolong ke dalam senyawa lipid sederhana yang banyak terdapat di alam. Perbedaan antara lemak dan minyak terletak pada susunan asam lemak penyusunnya, wujudnya pada suhu kamar dan sumbernya. Mutu lemak dan minyak dapat ditentukan dari sifat fisika dan kimianya. Sifat fisika lemak dan minyak antara lain adalah ; berat jenis, warna, kelarutan, bau dab rasa. Sedangkan sifat kimianya meliputi : bilangan asam, bilangan peroksida, bilangan iod, bilangan penyabunandan bilangan ester. 16
D. Alat dan Bahan Alat : Tabung reaksi
6 buah
Rak tabung reaksi
1 buah
Pipet tetes
2 buah
Gelas ukur 25 mL
1 buah
Erlenmeyer 100 mL
2 buah
Corong kaca
1 buah
Batang pengaduk
1 buah
Buret 50 mL
1 set
Alat refluks
1 set
Botol semprot
1 buah
Bahan: Etanol Etil Asetat p.a n-Heksana p.a HCl p.a KOH 0,1 N Kloroform p.a KI jenuh Na2 S2O3 0,2 N Amilum 1% 17
Minyak goreng baru dan minyak goreng bekas Mentega Aquades E. Prosedur Kerja 1. Uji Kelarutan Minyak Ke dalam 3 buah tabung reaksi dimasukkan minyak goreng (baru) sebanyak 1 mL atau 1 g. Kemudian tabung 1, 2 dan 3 masing-masing ditambahkan pelarut etanol, etil asetat dan n-heksana sebanyak 3 mL. Kocok dan bandingkan kelarutannya. Hal yang sama juga dilakukan untuk mentega. 2. Penentuan Bilangan Asam Timbang 5 g minyak (baru), masukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 25 mL Alkohol 95%, refluks selama 10 menit. Larutan dititrasi dengan KOH 0,1N dengan indikator pp, sampai timbul warna pink . Lakukan juga untuk minyak bekas (jelantah). Hitung bilangan asam
Bilangan asam = ml KOH x N KOH x 56,1 Berat sampel 3. Bilangan Peroksida Timbang 5 g minyak (baru), masukkan ke dalam erlenmeyer bertutup, tambahkan 30 ml HCl dan 20 mL khloroform ( 3 : 2 ), kocok sampai bahan larut sempurna. Tambahkan 0,5 mL KI jenuh, diamkan selama 1 menit, kemudian digoyang. Tambahkan 30 mL air suling. Kelebihan Iod dititrasi dengan Na 2S2O3 sampai warna kuning hilang, tambahkan 3 tetes larutan amilum 1%. Larutan dititrasi sampai warna biru hilang. Hitung bilangan peroksida. Lakukan percobaan pada minyak jelantah Bilangan peroksida = mL Na2S2O3 x N Na2S2O3 x 1000 Berat sampel 18
F. Pertanyaan: 1. Jelaskan urutan kelarutan dari percobaan diatas. 2.
Apa yang dimaksud dengan bilangan asam, bilangan peroksida.
3. Berapakah nilai bilangan peroksida dan bilangan asam dalam minyak goreng yang memenuhi SNI G. Tugas Pendahuluan. 1. Tulis struktur kimia trigliserida. 2.
Jelaskan perbedaan lemak dan minyak
3.
Tuliskan komposisi kimia asam lemak penyusun minyak kelapa sawit dan minyak kelapa.
H. Daftar Pustaka. Harrow, Benyamin. Et.al., 1960, Laboratory Manual of Biochemistry,Firth edition, USA., Saunders Company. Ketaren. S., 1986. Minyak dan Lemak Pangan.Jakarta UI.
Press.
19
Praktikum Biokimia Percobaan 06
ESTRAKSI DNA DARI BUAH
A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat mengektraksi DNA dan menentukan komposisi nukleotida pada asam nukleat. B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat mendiskripsikan tentang DNA 2. Mahasiswa dapat membuat reagen yang terkait dengan percobaan di atas. 3. Mahasiswa dapat memakai alat dalam percobaan ini . 4. Mahasiswa dapat mengumpulkan data dan menganalisanya. 5. Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan. 6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan. C. Dasar Teori Asam nukleat adalah suatu polinukleotida yang berfungsi sebagai pembawa, penyimpan dan pentransfer informasi genetika pada makhluk hidup. Monomer asam nukleat adalah nukleotida. Komponen penyusun nukleotida adalah basa nitrogen, monosakarida dengan lima atom C dan gugus fosfat. Asam nukleat ada dua yaitu DNA dan RNA. Untuk memperoleh DNA dapat dilakukan dengan mengekstraknya dari suatu bahan dengan menggunakan beberapa reagen. Komponen DNA adalah basa nitrogen (Adenin, Timin, Guanin, dan Sitosin), deoksiribosa ( monosakarida dengan lima atom C), dan gugus fosfat. Sedangkan komponen RNA adalah basa nitrogen (Adenin, Urasil, Guanin , dan sitosin), ribosa (monosakarida dengan lima atom C), dan gugus fosfat. 20
D. Alat dan Bahan 1. Alat Gelas kimia 250 ml
2 buah
Tabung reaksi
5 buah
Erlenmeyer 250 ml
2 buah
Corong kaca
1 buah
Lumpang porselen
1 set
Pipet tetes panjang
2 buah
Batang pengaduk
1 buah
Waterbatch
1 set
Gelas ukur 10 ml
1 buah
Penjepit tabung
1 buah
Botol semprot Kain kasa/kapas
1 buah secukupnya
2. Bahan Buah kiwi (boleh diganti dengan buah lain) Garam NaCl Detergen (gunakan sabun cuci piring) secukupnya. Etanol 95% (dingin/disimpan dalam freezer) HNO3 pekat Larutan amonium molibdat 5% Larutan asam asetat 5% 21
Larutan CuSO4 5% Larutan NaHSO4 jenuh Reagen Bennedict Batu es Aquades E. Prosedur Kerja 1. Ekstraksi DNA dari buah Kiwi (boleh diganti dengan buah-buahan yang lunak). Kuliti buah kiwi dan potong empat, hancurkan buah kiwi tersebut di dalam gelas kimia 250 ml. Tambahkan 3 gram NaCl, aduk, kemudian tambahkan 10 mL detergen sambil diaduk dan tambahkan aquades sampai volumenya 100 mL. Hancurkan kiwi kembali dengan lumpang. Saring dengan kain kasa dan filtratnya dikumpulkan. Apakah filtratnya terdapat DNA ?. Lakukan pengujian sebagai berikut. Biarkan filtratnya beberapa menit, kemudian pindahkan 6 mL sampel yang jernih ke tabung reaksi. Dinginkan filtrat pada tabung reaksi dengan cara membenamkan tabung reaksi tersebut ke dalam bongkahan es kira-kira 5 menit. Tambahkan 9 mL etanol 95% dingin dengan perlahan-lahan pada sisi tabung. Tunggu beberapa menit agar DNA memasuki lapisan etanol sebagai kabut atau benang halus yang putih. Ambil DNA dengan menggunakan batang pengaduk secara perlahan-lahan. Jika filtrat mengandung DNA lakukan uji komponen penyusun DNA untuk percobaan berikut ini. 2. Pengujian ekstrak Asam Nukleat (DNA). 1) Ambil ekstrak asam nukleat lakukan pengujian sebagai berikut. a. Ribosa. Ambil 5 mL ekstrak asam nukleat, tambahkan 4 mL reagen Bennedict, kocok dan panaskan pada penangas air. Amati apa yang terjadi!
22
b. Fosfat Ambil 2 mL ekstrak asam nukleat, tambahkan 1 mL HNO 3, panaskan pada penangas air. Kemudian tambahkan 2 mL larutan amonium molibdat 5 %. Amati apa yang terjadi !. c. Basa Nitrogen Ambil 2 mL ekstrak asam nukleat, tambahkan beberapa tetes asam asetat 5%, panaskan pada panangas air. Selanjutnya tambahkan 1 mL larutan CuSO 4 , dan 1 mL larutan NaHSO3. 2). Dengan cara yang sama uji lilitan DNA terhadap komponen yang dikandungnya F. Pertanyaan 1. Apa guna penambahan NaCl dan detergen pada percobaan di atas? 2. Apa yang terjadi jika ke dalam filtrat yang mengandung DNA ditambahkan reagen Benedict. 3. Tulis reaksi jika posfat pada ekstrak asam nukleat direaksikan dengan HNO 3. G. Tugas Pendahuluan 1. Gambarkan struktur primer dh-DNA dan tujukkan ikatan hidrogen yang terjadi. 2. Jelaskan perbedaan antara DNA dengan RNA ! 3. Tuliskan kembali penemuan oleh Watson – Crick tentang DNA H. Daftar Pustaka Lehininger, A.L (1982). Principle of Biochemistry. New York: Worth Publisher. Pp. 793-837. Plummer, David T. (1977). An Introduction to Practical Biochemistry.Second edition. New Delhi: Tata Mc.Graw-Hill Publishing Company Ltd. pp. 231
23
Praktikum Biokimia Percobaan 07
PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LIPASE
A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat melakukan penentuan aktivitas enzim lipase B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat membuat reagen yang berkaitan dengan percobaan di atas. 2. Mahasiswa dapat mengoperasikan peralatan penentuan aktivitas enzim lipase 3. Mahasiswa dapat melakukan percobaan 4. Mahasiswa dapat menganalisa hasil percobaan 5. Mahasiswa dapat mengambil kesimpulan dari hasil percobaan 6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan
C. Dasar Teori Lipid sederhana merupakan ester antara asam lemak dengan gliserol yang disebut juga dengan trigliserida. Minyak dan lemak merupakan salah satu senyawa tri gliserida. Minyak dapat dihidrolisa secara kimiawi dan enzimatik. Secara kimiawi dapat digunakan asam atau basa, sedangkan secara enzimatik menggunakan enzim lipase. Aktivitas enzim sangat ditentukan oleh beberapa faktor seperti suhu, pH. Enzim akan bekerja maksimum pada suhu dan pH optimum. Hidrolisa minyak oleh enzim lipase akan menghasilkan asam lemak dan gliserol. Enzim lipase merupakan salah satu enzim yang sangat besar peranannya dalam pencernaan dan juga salah satu penyebab rusaknya minyak. Aktivitas lipase ini dihitung berdasarkan kemampuan 24
enzim ini untuk menghidrolisa minyak menjadi asam lemak dan gliserol yang setara dengan jumlah mmol KOH 0,5 N pada kondisi reaksi tertentu.
D. Alat dan Bahan 1. Alat Erlenmeyer 100 ml
2 buah
Buret 50 ml lengkap
1 set
Tabung reaksi
12 buah
Rak tabung reaksi
1 buah
Water batch
1 set
Blender
1 set
Batang pengaduk
1 buah
Lumpang
1 set
Gelas kimia 50 mL
1 buah
Gelas piala 250 mL
1 buah
Pipet takar 10 mL
1 buah
Pipet tetes
1 buah
Penjepit tabung reaksi
1 buah
Botol semprot
1 buah
Gelas ukur 25 mL
1 buah
2. Bahan Enzim pencernaan (tablet enzimplek) 10% Minyak 25
Sampel jenuh gum arab Buffer fosfat pH 6,8 Larutan KOH 0,5 N Indikator phenol ptalein Aquades E. Prosedur Kerja 1.Pembuatan emulsi minyak. Sebanyak 25 mL minyak ditambahkan 25 mL gum arab, ditambahkan aquades sebanyak 50 mL. Kemudian diblender sampai diperoleh emulsi yang stabil (kirakira 15 menit). 2. Penentuan aktivitas enzim lipase terhadap waktu. Sediakan 6 buah tabung reaksi besar (masing-masing diberi nomor 1 sampai 6) dimasukkan 1 mL enzim lipase, ditambahkan 1 mL buffer pH 6,8. Masingmasing tabung reaksi dimasukkan 10 mL emulsi minyak. Kemudian tabung 1 dipanaskan selama 15 menit sampai mendidih, tabung 2 sampai tabung 6 diinkubasi selama masing-masing 5, 10, 15, 20, dan 25 menit pada temperatur 370C. Tiap-tiap tabung ditambah 3 tetes indikator pp, titrasi dengan KOH 0,5 N. Hitung aktivitas lipase pada masing-masing waktu inkubasi. Buat grafik waktu vs aktivitas enzim. F. Pertanyaan 1. Pada percobaan ini mana yang merupakan substrat enzim lipase ?. Jelaskan jawaban anda!. Berapakah konsentrasi substrat yang saudara gunakan? 2. Jelaskan kenapa substrat harus dibuat dalam bentuk emulsi ? 3. Jelaskan grafik yang diperoleh dari hasil percobaan ! 4. Apa guna penambahan buffer fosfat 6,8 pada percobaan ini ?. 26
5. Apa guna indikator pp ?. 6. Pada percobaan yang saudara lakukan factor apakah yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase, jelaskan jawaban saudara G. Tugas Pendahuluan 1. Enzim adalah protein. Jelaskan mengapa suatu enzim digolongkan ke dalam protein 2. Jelaskan perbedaan katalis enzim dengan katalis anorganik ? 3. Jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim ?. 4. Jelaskan klasifikasi enzim berdasarkan reaksi yang dikatalisnya, dan enzim lipase yang saudara gunakan termasuk golongan yang mana ? 5. Berapakah pH dan suhu optimum dari enzim lipase ? H. Daftar pustaka Wakil, S.J. (1970). Lipid Metabolisme. New York; Academic Pree. pp. 281-282.
27