PC1
VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil Araxá, 22-25/08
Caracterização molecular da interação cafeeiro bicho-mineiro.
Martinati, J.C.; Cardoso, D.C.; Guerreiro Filho,O.; Vidal, R.O.; Carazzolle, M.F.; Maluf, M.P..
Slide 1 PC1
Guerreiro; 12/08/2009
Justificativa
Identificação e validação de genes associados à
resposta
de
defesa
ao
bicho-mineiro
(Leucoptera coffeella), a fim de incorporar recursos genômicos para auxiliar a seleção precoce de cultivares com a característica de resistência a essa praga.
Objetivos Identificar genes com expressão diferencial, durante a infestação do bicho-mineiro em plantas de cafeeiros suscetíveis e resistentes, utilizando microarranjos de cDNA; Comparar os padrões de expressão nos diferentes genótipos de cafeeiros. Selecionar genes que potencialmente podem distinguir uma interação compatível de uma incompatível .
Materiais e métodos Montagem do experimento: Plantas resistentes X Plantas susceptíveis
Tempo 0h
Infestação em gaiolas de criação
Infestação
ovoposição
Eclosão
Materiais e métodos Montagem da lâmina: “screenig de reads e contigs” Seleção de 21.296 das 33.000 ESTs presentes no banco de dados gerado pelo Projeto Genoma do café. Exclusão de singlets provenientes de bibliotecas não relacionadas a nossa área de estudo. Arranjo final: 127.176 sondas representativas (6 sondas/oligonucleotídeos por gene). 12x 135 k
Materiais e métodos: Bibliotecas do CAFEST selecionadas para a montagem da lâmina Biblioteca
Especie
AR1, LP1 CB1
C. arabica C. arabica
Condição fisiológica
Plântulas e folhas tratadas com ácido aracdônico Suspensão de células tratadas com acibenzolar-S-methyl e brassinoesteróides C. arabica Hipocotilédones tratados com acibenzolar-S-methyl C. arabica Embrião zigótico C. canephora Calos embriogênicos de Coffea canephora C. arabica Calos não embriogênicos com e sem 2,4D
CL2 EB1 EC1 CA1, IC1, PC1 LV4, LV5 LV8, LV9 NS1 PA1 RM1 RT3 RT5 RT8 RX1 SH1
C. arabica C. arabica C. arabica C. arabica C. arabica C. arabica C. arabica C. arabica C. arabica C. canephora
SH2 SS1
C. arabica C. arabica
Folhas jovens de ramos ortotropicos Folhas maduras de ramos plagiotrópicos Raízes infestados com nematóides Calos embriogênicos primários Folhas infectadas com bicho-mineiro e ferrugem Raízes Raizes tratadas com acibenzolar-S-methyl Suspensão de células estressadas com alumínio Caules infectados com Xylella spp. Folhas de plantas tolerantes (seca) – estresse hídrico (Coffea canephora) Plantas de campo com estresse hidrico (pool de tecidos) Plantas de campo em condições normais (pool de tecidos)
Números de singlets válidas 5664 10311 11615 192 8050 13135 15067 11864 569 2483 5567 560 2311 9119 9563 7368 6824 960
Materiais e métodos Validação de alguns genes diferenciais. Desenho de primers: “Primer express” AB. Real time PCR: • Sistema de detecção de sequências: Sybr Green - (Power SYBR Green Master Mix – ABI) • Quantificação relativa: Método do CT Comparativo • Controle endógeno: Gene GAPDH e 4 genes constitutivos não diferenciais detectados no Microarray. • Genes validados: 20 up, 20 down e 5 não diferenciais
Resultados e discussão Interações Estudadas: T0S_T0R, T1S_T1R e T2S_T2R
Resultados e discussão: Análise da interação T0S_T0R: Valores de “Fold change”. Valor absoluto
Porcentagem
1 1 1 4 7 4 1 5 2 4 16 22 35 103 1062 858 8 1 1 1 1 1 1 1 Total 2141
0,0467 0,0467 0,0467 0,1868 0,3269 0,1868 0,0467 0,2335 0,0934 0,1868 0,7473 1,0275 1,6347 4,8108 49,6029 40,747 0,3736 0,0467 0,0467 0,0467 0,0467 0,0467 0,0467 0,0467
Valores aproximados de “fold change” 1000 600-999 400-499 200-299 100-199 90-99 80-89 70-79 60-69 50-59 40-49 30-39 20-29 10-19 2-9 (-)2- (-)9 (-)10- (-)19 (-)20- (-)29 (-)30- (-)39 (-)40- (-)49 (-)60- (-)69 (-)100- (-)199 (-)200- (-)299 (-)400- (-)499
Resultados e discussão Correlação dos níveis de transcritos superexpressos observados por qRT-PCR e Microarray na intereção T0S_T0R. Gene
Valor do “fold change”
Valor do ∆∆Ct
Coef.*
Proporção****
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
94 236 115 642 280 6,56 1000 43 -35 -16 -235 -445 -8 -126 -62 -17 -16 -24
39 15 36 179 8,45 3 186,9 8,16 -4,3 -1,8 -120 -200 -6 -17 -36 -2,3 -2,2 -5,8
0,914206
2,410256 15,73333 3,194444 3,586592 33,13609 2,186667 5,350455 5,269608 8,139535 8,888889 1,958333 2,225 1,333333 7,411765 1,722222 7,391304 7,272727 4,137931
* Valor do coeficiente de correlação de Pearson
Resultados e discussão: Análise funcional Função molecular dos transcritos superexpressos na interação R0_S0. Ligação a ácidos nucleicos (89) e
Atividade de transferase (189)
Ligação a proteínas (126)
Atividade de hidrolase (191)
Atividade de oxidoredutase (180)
Ligação a nucleotídeos (130) Ligação a ions (181)
Resultados e discussão: Análise funcional Função molecular dos transcritos reprimidos na interação R0_S0. Transporte trans membrana (14)
Atividade de Hidrolase (34)
Ligação a nucleosídeos (24)
Ligação a íons(24)
Atividade de transferase (29)
Ligação a nucleotídeos (33) Ligação a ácidos nucleicos (24)
Ligação a proteínas (26) Atividade de oxirredutase (29)
Conclusões: Plantas susceptíveis e resistentes exibem perfis de expressão gênica distintos mesmo antes da exposição ao inseto; Para cada fase de desenvolvimento dos sintomas causados pelo bicho mineiro (eclosão, ovoposição) há um padrão de expressão gênica peculiar; Os genes responsaveis pela característica de resistência ao inseto são estrategicamente balanceados e coordenados com outras funções celulares; A ação de outros genes menos evidentes nos processos de defesa, como os de manutenção celular, deve ser considerada para a obtenção da resistência em cafeeiros. s