Marcadores moleculares Ing. Alejandro Sรกnchez
Lee, investiga, y busca información en fuentes diversas. No te quedes solo con la versión oficial. Contrasta ante la más mínima duda. Crea tu propio criterio. Que no nos den nuestra opinión ya formada. Manten vivo el pensamiento crítico y constructivo. Que no uniformen también nuestros pensamientos. Sean Librepensadores.
Propiedades del DNA A-T = 2 puentes de H
G-C = 3 puentes de H
Las hebras son antiparalelas y complementarias
GENOMA • ADN total presente en las células de un individuo. • Regiones dentro de los genes que codifican. (Exones): Es una peqeña parte del genoma. (Humanos 1.3%) • Regiones dentro de los genes y entre genes que no codifican proteínas. (Intrones, espaciadores entre genes, secuencias repetitivas y pseudogenes. (En humanos el 98.7 %) Los marcadores de ADN pueden estar localizados en cualquiera de estas regiones.
Genoma
Alelos dominantes y recesivos • Un alelo recesivo es aquel que no es funcional. El alelo ha perdido su función debido a algún tipo de mutación. • Un alelo dominante es aquel que conserva su función.
Relaciones entre los alelos de un gen (relaciones de dominancia) • Dominancia: en un individuo heterocigoto que contenga un alelo funcional y otro no funcional, el alelo funcional puede producir la cadena polipeptídica (o ARN) suficiente y no alterarse el fenotipo. Allí se presenta dominancia del alelo funcional sobre el recesivo. • Codominancia: es un término relativo a nuestra capacidad de detectar el “producto” en un individuo heterocigoto de dos alelos diferentes y funcionales
Marcador genético Un marcador genético es un rasgo o característica que es controlado por un locus simple para el cual se presentan al menos dos variantes (alélos) en una población de individuos con capacidad de intercambiar material genético. Genotipo
Marcadores basados en DNA
Fenotipo
Marcador fenotípico
Ambiente
Qué son los marcadores moleculares? Los marcadores genéticos moleculares son fragmentos o porciones de ADN, que pueden asociarse con características (deseables o indeseables) en individuos. A estos fragmentos se les pueden hacer seguimiento por generaciones sucesivas. TIPOS DE MARCADORES Marcadores anónimos (no se necesita información de la secuencia) Marcadores dependientes de la secuencia ( se emplean cebadores específicos que se diseñan a partir de la secuencia total o parcial del fragmento amplificado.
Qué son los marcadores moleculares? • Un marcador genético es cualquier diferencia que exista en la secuencia de ADN entre individuos y se puede detectar de diversas maneras. Análisis del producto del gen (proteínas) Analisís de la secuencia de ADN.
• Los marcadores de ADN son aquellos que se detectan por medio de análisis del ADN directamente. Secuenciamiento.
Variación fenotípica
• Los individuos de un especie se diferencian morfológicamente y esto es un reflejo en alguna medida de diferencias a nivel genético. • Dificultades del estudio basado en caracteres morfológicos. Herencia poligénica. Más de un gen controla un rasgo en particular. Pleiotropía. Un gen puede controlar más de un rasgo. Influencia de factores medioambientales. • La variación genética entre individuos es detectada más fácilmente estudiando los genes directamente antes que los genotipos
Fenotipos morfológicos y moleculares • A nivel morfológico W es dominante sobre w • A nivel molecular los dos son codominantes
Marcadores genéticos 1. Morfológicos (clásicos o visibles): son marcadores que en si mismos son rasgos fenotípicos o caracteres, como color de flor, forma de la semilla, hábito de crecimiento.
2. Marcadores bioquímicos: incluyen variantes alélicas de enzimas llamadas isoenzimas, que son detectadas por electroforesis en coloraciones específicas.
3. Marcadores moleculares o basados en ADN: un marcador molecular es cualquier fenotipo molecular originado de la expresión de un gen o de segmentos específicos de ADN. Marcadores genéticos.
TIPOS DE MARCADORES ANÓNIMOS
INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA
RAPD (random amplified polymorphic DNA)
SCAR (sequence characterized amplified region)
ISSR (intersimple sequence repeats)
CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence)
AFLP (amplified fragment long polymorfism)
SSCP (single stranded conformational polymorphism)
SAMPL (selective amplification of microsatellite polymorphic loci)
SNP (single nucleotide polymorphysm) o microsatélites SSR
SSAP (sequence specific amplification polymorphism)
Reacci贸n en cadena de la polimerasa PCR
ACORDARSE DEL VIDEO DE PCR • PCR : polymerase chain reaction Método in vitro para producir grandes cantidades de fragmentos específicos de ADN o ARN de longitud y secuencia definidas a partir de pequeñas cantidades de ADN y de secuencias de secuencia flanqueantes del oligonucleótido (primers). • El ADN puede ser inclusive de baja calidad. • Amplifica fragmentos de ADN a partir de cantidades pequeñas de ADN patrón. • Cualquiera sea la fuente de DNA molde la PCR puede ser solo aplicada si se conoce alguna información de la secuencia de modo que se puedan diseñar los cebadores (primers)
Procedimiento de la PCR • Preparación de la muestra de ADN. • Preparación de una mezlca de cebadores (primers) • Detección de los productos de la reacción. FASES • Desnaturalización: La reacción se calienta a altas temperaturas para reducir la doble hélice del ADN a cadenas simples. Estas cadenas se tornan accesibles a los cebadores. (primers)
• Hibridación: Se enfría la mezcla de reacción. Los cebadores (primers) hibridan con las regiones complementarias de las cadenas del ADN patrón, y se forman nuevamente cadenas dobles entre los cebadores y las secuencias complementarias. • Extensión: La Taq polimerasa sintetiza una cadena complementaria. La enzima lee la secuencia de la cadena opuesta y extiende los cebadores agregando nucleótidos en el orden en que pueden emparejarse. El proceso entero se repite una y otra vez. Lo usual es que los ciclos se repitan de 25 a 45 veces.
Pasos de la PCR 1. Desnaturalizaci贸n
2. Anillamiento 贸 hibridizaci贸n Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C) 3. Extensi贸n 1 min = sintesis de 2 kb 1 Kb 100 pb
TERMOCICLADOR
Componentes de la reacción de PCR • • • • • • •
Agua desionizada estéril Solución tampón de PCR 10X Mezcla de dNTP Cebador (primers) Taq polimerasa MgCl2 ADN patrón (ó molde template)
Preparaci贸n de la mezcla para la PCR
La mezcla para la PCR se prepara sobre hielo. No se requiere ropa de seguridad.
Componentes de la reacción de PCR PRIMERS Deben contener entre 18 a 30 bases de largo y un contenido de G + C similar de modo que se unan a su secuencia complementaria a temperaturas similares. Se diseñan de modo que se ubiquen en los extremos opuestos de la secuencia de interés. (Forward and reverse)
Cómo se prepara una reacción de PCR La PCR se puede diseñar en un buffer de 15 μL (Invitro gen Technologies, Karlsruhe, Germany), 0.2 mM dNTPs, 2.7 mM MgCl2, 0.7 μM de cada primer, 50 ng de DNA molde y una unidad de Taq polimerasa (Invitrogen). Reactivo
1X
105 X
2,0 μL
210 μL
dNTPs
2,0
210
Mg Cl2
0,6
63
Pirmer forward
1,0
105
Pirmer reverse
1,0
105
Agua
7,7
808,5
Taq
1,0
105
DNA (50 ng/μL)
1,0
-
Buffer 10 x
14,69 μL
Componentes de la reacci贸n de PCR
ELECTROFORESIS
Movimiento del ADN en el Gel • Cada región discreta de ADN se denomina banda. • Se visualizan al teñir con bromuro de etidio que se une al ADN y brilla con luz ultravioleta. • Una banda representa una colección de fragmentos de ADN de la misma región del genoma (o diferentes), de un tamaño definido.