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TÉCNICA IN VITRO PARA EL ESTUDIO DE PROTOZOARIOS RUMINALES Ley de Coss Alejandro*, Cobos, P. M. A. RESUMEN La dificultad de mantener vivos a los protozoarios ciliados, en ambientes fuera del rumen, llevan al estudió de; un medio de cultivo base (MCB), diferentes sustratos y una mezcla de antibióticos para mantener viabilidad in vitro de ciliados ruminales. Los tratamientos MCB más la adición de avena, alfalfa, kikuyo o leche, con una mezcla de antibióticos, fueron preparados usando la técnica anaeróbica de Hungate, e inoculados con un precipitado de fluido ruminal fresco de ovino. Los conteos a las 0, 24, 48 y 72 horas sin solución para conteo de protozoarios, permitió cuantificar la concentración y viabilidad de ciliados en los tratamientos durante la incubación. No existen diferencias (P<0.05) en concentraciones y viabilidad al iniciar las inoculaciones para los diferentes sustratos. En la prueba 1, durante la incubación, no hubo diferencias en concentraciones, pero si en viabilidad de ciliados. En la prueba 2, no hubo diferencia (P<0.05) en concentraciones y viabilidad para los tratamientos y tiempos de incubación, identificando la posible adaptación de los protozoarios al medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado y los sustratos a base de avena y alfalfa mantuvieron una alta proporción de protozoarios viables, por lo menos durante 72 horas de evaluación. INTRODUCCIÓN En el rumen encontramos una población de microorganismos, que comprende bacterias, hongos y protozoarios, quienes proporcionan características al rumiante, de utilizar la celulosa y hemicelulosa mediante procesos de fermentación (Chaudhary et al., 1993). Aunque existen protozoarios flagelados, de quienes se conoce poco acerca de su metabolismo, los protozoarios de mayor concentración e importancia son los ciliados (Dehority, 1993; Williams y Coleman, 1992). El cultivo de ciliados ruminales, es dividido en dos tipos: el sistema en tubos de ensayo y los cultivos continuos (rumen artificial), en los cuales se pueden mantener concentraciones de 104 y 105 ciliados por mL de medio respectivamente, siendo el cultivo en tubo, el más sencillo de utilizar (Ogimoto e Imai, 1981). Primeras investigaciones, indican un medio de cultivo anaerobio, basado principalmente en: solución mineral, pasto seco (5% Peso/Vol.), almidón y una mezcla de gases (CO2 y N2); en tubos de 100 mL. con 2 mL. de liquido ruminal fresco a 39 ºC., en el cual, Hungate (1942, 1950) reportó problemas en los tiempo de generación, debido aparentemente a su largo periodo e identificó la dificultad de mantener protozoarios ciliados vivos fuera del rumen. Dehority, (1998) al evaluar los tiempos de generación de protozoarios entodinomorfos y usando la técnica anaeróbica de Hungate (1950), preparó un medio a base de una mezcla mineral, fluido ruminal, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, agua destilada, cisteina-HCl y flujo de CO2 , e indicó que el tiempo de generación es influenciada por una fase Lag, productos finales del metabolismo; con reducción de pH, falta de sustrato y la deficiencia de nutrientes como algunos factores de crecimiento. Fondevila y Dehority, (2001) evaluaron la adición de antibióticos (estreptomicina y penicilina) en medios de cultivo (Dehority,1998), además la adición de almidón de arroz, maíz y heno de orchard, sobre la concentración de entodinomorfos, sugiriendo algún tipo de sinergismo entre protozoarios y bacterias ruminales, reportando que la concentración de
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protozoarios no fue afectada por la ausencia de bacterias hasta las 48 h., pero después de 72 h. la concentración y digestibilidad del almidón fue mayor en medio con bacterias vivas, indicando una posible dependencia de las bacterias, por parte de los protozoarios. Williams y Coleman, (1992) indican que la ingestión de grandes cantidades de bacterias por parte de los protozoarios, afecta su concentración y contribución a la digestibilidad de las fuentes de energía. Fondevila y Dehority, (2001) reportan crecimiento y sobrevivencia de protozoarios de las 0 a las 96 horas, presentando mayores concentraciones en los medios de bacterias vivas, seguido por los de bacterias muertas y por último los medios con antibióticos. Williams y Coleman, (1992) reportaron diversos estudios, donde medios de cultivo con mezclas de antibióticos; penicilina, ampicilina, neomicina, cloranfenicol, estreptomicina, indican disminución marcada en la concentración de bacterias, sin efectos sobre la población de protozoarios, mientras que en otros estudios, donde se utilizo altas concentraciones de antibióticos, se limito la sobrevivencia de los protozoarios. Fondevila y Dehority, (2001) reportan tiempo de sobrevivencia de 90 a 120 horas en medios de cultivo, y donde las muestras para conteos fueron fijadas en una solución con formaldehído, efectuando el conteo de acuerdo a la técnica de Dehority, (1984). El presente estudio fue realizado para evaluar la efectividad de diferentes medios de cultivo para mantener viabilidad de protozoarios durante 72 horas. MATERIAL Y MÉTODOS Protozoarios. Liquido ruminal de borregos alimentados con alfalfa y un concentrado, fue diluido en un medio anaeróbico para obtener un inóculo concentrado. Cuadro 1. Composición del medio para crecimiento y supervivencia de los protozoarios. Compuesto Agua destilada Líquido ruminal clarificado (1) Solución mineral 1 (2) Solución mineral 2 (3) Carbonato de sodio, solución 8% (4) Acetato de sodio, 1.5 % Solución sulfido-cisteína (5) Solución rezarsurin al 0.1% (6) Tripticasa-peptona Extracto de levadura Glucosa Celobiosa Almidón
Cantidad por cada 100 mL de medio 52.46 mL 30.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 2.0 mL 0.1 mL 0.2 g 0.1 g 0.06 g 0.06 g 0.06 g
(1) Líquido ruminal clarificado previamente filtrado en una gasa triple y centrifugado a 23, 000 rpm, por 15 minutos a 4 °C, esterilizado 20 minutos a 15 psi, 121°C.
(2) Conteniendo (por 1000 mL) 6 g de K2HPO4.
(3) Conteniendo (por 1000 mL) 6 g de KH2PO4; 6 g (NH4)2SO4; 12 g NaCl; 2.45 g MgSO4 y 1.6 g de CaCl2*H2O (Bryant y Robinson, 1962).
(4) 8 g de carbonato de sodio en 100 mL de agua destilada.
(5) 2.5 g de L"cisteína (disuelta en 15 mL de 2N NaOH) + 2.5 g de Na2S-9H2O (en 100 mL de H2O)
(6) 0.1 mL de resazurina en un volumen final de 100 mL, calentado hasta que el indicador pierde su coloración y esterilizado.
Medio. La solución de cultivo base (MCB) fue preparado, usando la técnica anaeróbica descrita por Hungate (1950), los compuestos son presentados en el Cuadro 1. Los sustratos para cultivo, fue una suspensión de 2 g. de MS de avena, alfalfa, kikuyo (P. clandestinum) y leche en polvo en 10 mL. de agua destilada, la fracción soluble (FS) fue sometida a flujo de CO2 por 5 min. Procedimiento. Fluido ruminal fresco fue inoculado bajo flujo de CO2, en tubos cultivo de 16 x 150 mm con 10 mL del medio base, adicionando 0.15 mL. de FS, además de 20 000 UI de penicilina y 25 mg de estreptomicina, con o sin agar en el medio base. Los tubos fueron cerrados anaeróbicamente e incubados a 39 ºC. Conteo. A los tiempos 0, 24, 48 y 72 horas, se efectuaron los conteos de acuerdo a la técnica de Dehority, (1984), pero, sin solución fijadora (formaldehído). Mediante la cámara Neubauer, se observó en el microscopio a una magnificación de 40X, haciendo los conteos de la proporción de protozoarios vivos y muertos. Análisis estadístico. Los datos fueron analizados, mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon y
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las medias fueron comparadas con una prueba de Tukey (SAS, 1996). RESULTADOS Los parámetros de crecimiento de protozoarios ruminales se presentan en los Cuadro 2 y 3, respectivamente. En concentración inicial y proporción de protozoarios viables no existió diferencia (P<0.05) entre los tratamientos, al medir sobre el tiempo se observaron reducciones desde las 24 h, con más efecto en leche, a partir de las 48 horas en kikuyo, alfalfa y avena (Cuadro 1). Mayores reducciones al final de la prueba, donde a pesar de no existir diferencias (P<0.05) en la concentración total de protozoarios, hubo diferencias sobre la proporción de viabilidad en kikuyo, alfalfa y avena. Cuadro 2. Evaluación de sustratos sobre viabilidad de protozoarios ruminales (Prueba 1). Tiempo
Avena
Alfalfa
Kikuyo
Leche
(h) O
Conc.
%Viabilidad
Conc.
%Viabilidad
Conc.
%Viabilidad
Conc.
%Viabilidad
8.9 X 103
97
7.2 X 103
93
7.0 X 103
95
1.0 X 104
93
24
4.4 X 103
85
3.8 X 103
62
2.5 X 103
66
2.2 X 103
48
48
1.9 X
103
65
1.3 X
103
44
7.4 X
102
21
103
25
8.2 X
102
40
8.5 X
102
59
9.7 X
102
24
72
8.8 X 0
0
No existieron diferencias (P<0.05) en las concentraciones y proporción de viabilidad en los tratamientos, y tiempos de conteo (Cuadro 2), indicando un buen desarrollo de protozoarios ruminales tanto en el medio base como por el tipo de sustrato utilizado, confirmando dicho efecto la producción de gas, concentración de protozoarios flagelados, división celular (reproducción); indicando buena adaptación de los protozoarios al medio utilizado. Las proporciones de viabilidad en esta prueba no mostraron diferencias (P<0.05) en los tratamientos, los medios mantienen buena viabilidad de ciliados por lo menos durante 72 horas de muestreo. Cuadro 3. Evaluación de sustratos sobre viabilidad de protozoarios ruminales (Prueba 2). Tiempo
Avena * Conc.
Alfalfa *
%Viabilidad
Conc.
Avena **
%Viabilidad
Conc.
Alfalfa **
%Viabilidad
Conc.
%Viabilidad
(h) O
8.3 X
103
98
1.5 X
104
97
1.4 X
104
97
1.1 X
104
96
24
5.1 X 103
92
5.3 X 103
88
3.8 X 103
96
4.4 X 103
94
48
5.8 X 103
93
4.7 X 103
95
8.4 X 103
96
6.1 X 103
92
72
103
89
103
96
103
94
103
92
3.2 X
3.5 X
6.3 X
5.6 X
* Medio con agar; ** medio sin agar.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES La respuesta de protozoarios Entodonomorfos en medios de cultivo in vitro, indican cambios durante el periodo de incubación y en las condiciones de cultivo, a las 48 horas, la adición de una mezcla de antibióticos, mantuvo crecimiento de Entodinium spp., a las 72 horas de cultivo reportan sinergismo entre protozoarios y bacterias; aumentando su concentración en los medios sin antibióticos (Fondevila y Dehority, 2001). Investigaciones sobre requerimientos en los medios de cultivo para protozoarios, consideran especies aisladas de cierta clase de ciliados (Entodinium sp), determinando medios específicos para dichos protozoarios. Los medios evaluados en esta investigación, permiten mantener poblaciones múltiples de ciliados. Dehority, (1998) indica la técnica de conteo para protozoarios, con el uso de soluciones fijadoras de formaldehído, la cuál impide determinar la proporción de organismo vivos en el medio al momento del muestreo. El conteo sin solución fijadora proporciona la concentración de protozoarios que sobreviven en el medio de cultivo, durante los tiempos de evaluación. El medio de cultivo base con adición de una mezcla de antibióticos, más avena o alfalfa como sustrato alimenticio, permiten mantener las concentraciones adecuadas de protozoarios ciliados con alta sobrevivencia, permitiendo efectuar trabajos sobre metabolismo e identificación de protozoarios. LITERATURA CITADA 1.
SAS Institute. 1996. User s guide: statistics, versión 6 editions. SAS Institute, Inc., cary, N. C.
Dehority, A. B. 1998. Generation times of Epidinium caudatum and Entodinium caudatum determined in vitro by transferring at varius time intervals. J. Anim. Sci. 76:1189-1196.
2.
3. Fondevila, M. and B. A. Dehority. 2001. In vitro growth and digestion by Entodinium exiguum as influenced by the presence or absence of live bacteria. J. Anim. Sci. 79:2465-2471.
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4. Fondevila, M. and B. A. Dehority. 2001. Preliminary study on the requirement of Entodinium exiguum and Entodinium caudatum for live or dead bacteria when cultured in vitro. Reprod. Nutr. Dev. 41:41-45.
Dehority, B. A. 1993. Laboratory manual for classification and morphology of rumen ciliate protozoa. CRC Press. Boca Ratón. pp: 1 " 22.
5.
Williams, A.G. and G.S. Coleman. 1992. The rumen protozoa. Brock springer serie in Conteporary Bioscience. Springer-Verlag, New York inc. pp:133-164.
6.
Chaudhary, L. C., A. Srivastava, and B. N. Paul. 1993. Inter relationship between protozoa and dietary carbohydrates in ruminants. Indian. J. Dairy Sci. 47:444-454
7.
8. Ogimoto, K., and S. Imai. 1981. Atlas of rumen microbiology. Japan Scientific Societies Press. Tokio, Japan. Pp 157-168.
1 Programa de Ganadería. Colegio de Postgraduados, Km. 36.5 carr. México - Texcoco, Montecillos, Estado de México 56230. e-mail: aley@colpos.colpos.mx 01 (595) 9-52-02-00. Ext. 1298 y 1713. Preferencia de presentación: oral. Area: Nutrición.
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