CAPITULO V
NUTRICIÓN ANIMAL
XLIV Reunión Científica AMPA 2017, Clima y Ganadería: Productividad Sustentable
EVALUACIÓN DEL LÍQUIDO RUMINAL CONSERVADO POR LIOFILIZACIÓN USANDO DOS LIOPROTECTORES, DIMETILSULFOXIDO Y CARBÓN ACTIVADO [EVALUATION OF RUMINAL FLUID PRESERVED BY LYOPHILIZATION USING TWO LYOPROTECTANTS, DIMETHYLSULFOXIDE AND ACTIVATED CARBON] Escobar-España, J. C.1, M. A. Cobos-Peralta2, R. Bárcena-Gama2, D. Hernández-Sánchez2, R. Pinto-Ruiz3, A. Ley-de Coss4* 1
Estudiante del Programa de Doctorado en Ciencias en Ganadería, Colegio de Postgraduados. Programa de Ganadería, Colegio de Postgraduados, Km 36.5, Carretera México-Texcoco, Montecillo, Texcoco, Estado de México. 3 Facultad de Ciencias Agronómicas Campus V de la Universidad Autónoma de Chiapas (UNACH), carretera Ocozocoautla-Villaflores km 80, Villaflores, Chiapas, México. 4 Facultad de Ciencias Agrícolas, Campus IV de la UNACH, entronque carretera costera S/N, Huehuetán, Chiapas, México. *correspondencia: aleycoss@gmail.com 2
RESUMEN La conservación de bacterias por liofilización es un método que mantiene viables a los cultivos por largos periodos de tiempo; este puede ser usado como inoculo en pruebas de degradación. Se utilizó liquido ruminal centrifugado con bacterias ruminales totales como inoculo a conservar por liofilización con dos lioprotectores el dimetilsulfoxido (DMSO) y el carbón activado (CA), posteriormente se reactivaron para evaluar su actividad y viabilidad por medio de una prueba de degradación (% DEGMS) de pasto Bermuda, los resultados indicaron que % DEGMS fue mayor para el Testigo 54.98 (T) sin lioprotector (p≤0.05), 42.13 el CA y 33.97 el DMSO. El pH no presento cambios utilizando lioprotectores con respecto al T, los resultados son evidencia de que la conservación por liofilización es viable con y sin lioprotectores. Palabras claves: Liofilización, Líquido ruminal, Lioprotectores, Dimetilsulfoxido, Carbón Activado, in vitro.
SUMMARY The conservation of bacteria by lyophilization is a method that keeps cultures viable for long periods of time; this can be used as an inoculum in degradation tests. Centrifuged ruminal liquid was used as an inoculum to preserve lyophilization with two lyoprotectants, dimethyl sulfoxide (DMSO) and activated carbon (CA). Were subsequently reactivated to evaluate their activity and viability by trial of a degradation test (% DEGMS) of Bermuda grass. The results indicated that % DEGMS was higher for Control 54.98 (T) without lyoprotectant (p≤0.05), 42.13 the CA and 33.97 the DMSO. The pH did not show changes using lyoprotectants with respect to T; results are evidence that lyophilization conservation is viable with and without lyoprotectants. Keywords: Lyophilization, Ruminal fluid, Lyoprotectants, Dimethyl sulfoxide, Activated carbon, in vitro.
INTRODUCCIÓN El determinar la degradabilidad in vivo de los compuestos de una dieta en laboratorios dedicados a la investigación en nutrición animal, es necesario tener animales canulados en rumen, sin embargo estos animales requieren de mantenimiento y encarecen las investigaciones, el uso de fluido ruminal fresco, enzimas y fluido ruminal conservado han sido evaluados como alternativas para ser usado en el método in vitro (Denek et al.,2010), es importante determinar la viabilidad de los microorganismos en los cultivos in vitro (Arcos et al., 2004). La liofilización es un método de conservación de microorganismos, que preserva por largos periodos de tiempo la viabilidad de los cultivos se puede mantener por más de 20 años si se alcanza una concentración celular de 106 a 1010 célula mL-1, (Miyamoto-Shinohara et al., 2000; Morgan et al., 2006). El tipo de cultivo, especie, tamaño del microorganismo, fase de crecimiento, temperatura de incubación, composición del medio de cultivo, pH afectan la conservación (Hubálek 2003). Existen compuestos que pueden ser usados como crioprotectores, el glicerol, el Dimetilsulfoxido (DMSO) la leche descremada, y algunos carbohidratos como la glucosa, lactosa, sacarosa, inositol (García y Urubúru, 2000). El objetivo de este estudio fue evaluar el líquido ruminal 156
XLIV Reunión Científica AMPA 2017, Clima y Ganadería: Productividad Sustentable
conservado por liofilización utilizando dos lioprotectores el DMSO y el Carbón Activado (CA) por medio de una prueba de degradación de pasto Bermuda. MATERIAL Y MÉTODO Preparación de medios de cultivo anaerobio para rehidratación y degradación Para realizar las evaluaciones se prepararon medios de cultivo fluido ruminal (FR) esterilizado (15 min en autoclave Tuttnauver® 2540F, Israel) a 121° C y 15 psi. el contenido de los medios fue: 30 mL de FR clarificado, 5.0 mL de solución mineral I [6 g K2HPO4 (Meyer) en 1000 mL de H2O], 5.0 mL de solución mineral II [6 g KH2PO4, + 6 g (NH4)2SO4 (Meyer) + 12 g NaCl (Meyer) + 2.45 g MgSO4 (Meyer) + 1.6 g CaCl-2H2O (Fermont) en 1000 mL de H2O], 0.1 mL de solución al 0.1% de resazurina (Sigma-Aldrich), 0.2 g de peptona de soya (Merck), 0.1 g de extracto levadura (Sigma), 2.0 mL de solución al 8 % de Na2CO3 (Meyer), 2.0 mL de solución sulfido-cisteína [3.125 g L-cisteína (Sigma) disuelta en 2N NaOH (Meyer) hasta pH 10 + 3.125 g Na2S.9H2O aforado a 250 mL de H2O] y 52.6 mL de H2O destilada; más la variante de cada uno de los medios, Glucosa-Celobiosa-fluido ruminal (H-FR); 0.09 g de glucosa y celobiosa y Bermuda-fluido ruminal (B-FR); 0.05 g de pasto Bermuda. Obtención del inoculo y variables microbiológicas antes de liofilizar Se obtuvo líquido ruminal (LR) de una vaca Holstein canulada en rumen, se centrifugo a 1157 g por 3 min en una centrifuga (Eppendorf® 5804 Alemania) a 25° C, el sobrenadante líquido ruminal centrifugado (LRC) se depositó en matraces Erlenmeyer de 500 mL colocados en baño maría a 39° C bajo flujo de CO2. Se obtuvo 5 mL de muestra por triplicado a la cual se le midió pH y Redox. Se estimó la concentración de bacterias ruminales totales mediante recuento directo en cámara Petroff-Hausser (Hausser #39000, Electron Microscopy Science, EE.UU.) por triplicado, con la fórmula de concentración de bacterias = (promedio) (factor de dilución) (2x107). Identificación de los tratamientos Los tratamientos fueron los siguientes: Tratamiento 1: el testigo sin lioprotector (T) contenía 10 mL de LRC los cuales se colocaron en viales serológicos. Tratamiento 2: contenía (1000 µL) de DMSO C2H6OS, (Sigma), más 9.0 mL de LRC (10% de inclusión relación v/v). Tratamiento 3: este último consintió de 10 mg de CA, (HYCEL), consecutivamente se agregó 10 mL de LRC. Liofilización de los tratamientos Los viales serológicos con cada uno de los tratamientos, se colocaron en un congelador de rodillo (Labconco Shell Freezer EE.UU.) durante 40 min para alcanzar una temperatura de -35° C. Inmediatamente el vial se almacenó en un ultracongelador marca Refri Med, posteriormente los viales se liofilizaron durante 8 h en una liofilizadora marca Labconco Freezone 6L en modo automático bajo las siguientes condiciones (temperatura de -50° C y una presión de -0.135 mBar). Reactivación de los tratamientos liofilizados Hidratación de los tratamientos liofilizados Se utilizaron 3 repeticiones por tratamiento liofilizado, se hidrató agregando 10 mL de medio HFR, con flujo de CO2, se realizó en una campana de bioseguridad, se colocaron en incubación a 39 °C por 5 h, cada hora se homogenizó, se midió pH y Redox, se determinó la concentración de bacterias totales mediante recuento directo en cámara Petroff-Hausser.
157
XLIV Reunión Científica AMPA 2017, Clima y Ganadería: Productividad Sustentable
Prueba de degradación in vitro del pasto Bermuda (Cynodon dactylon L. Pers.) Se inocularon 7 tubos (18 x 50 mm) con medio de cultivo B-FR se inocularon con 1 mL de T, DMSO y CA se colocó en incubación a 39 °C por 72 h. Para medir la capacidad de degradación in vitro de la materia seca (% DEGMS) las muestras se filtraron en papel filtro Whatman No. 541 con ayuda de una bomba de vacío (Siemens, FE-1500L vacío de 500 mmHg) el pasto Bermuda no degradado, se secó a 60° C por 72 h en una estufa (Riosa H8-62) y se pesó para estimar por diferencia de peso la cantidad de sustrato degradado, el cálculo se hiso con la fórmula % DEGMS = (muestra inicial-muestra no degradada/muestra inicial) x 100. Diseño experimental y análisis de datos Para el análisis estadístico se utilizó un diseño completamente al azar, usando el procedimiento GLM de SAS® (2011) y la comparación múltiple de medias fue con el método de Tukey (α=0.05). El modelo estadístico fue: Yij = μ + τi + Ԑij Dónde: Yij = Variable de respuesta en el i-esimo lioprotector y j-esima repetición. μ = Media general. τi =Efecto del i-esimo tratamiento. Ԑij = Error aleatorio, el cual se supone normalmente distribuido con media 0 y varianza σ2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados avalan el uso de lioprotectores en la conservación por liofilización de bacterias ruminales totales, el tratamiento DMSO fue diferente (p<0.05) al T y CA. El DMSO incremento la concentración en 3.5x1010 bacterias mL-1 de cultivo con respecto al testigo, los resultados son superiores a los reportados por (Sánchez-Santillán et al., 2016) donde obtuvo 7.21x108 en el tratamiento sin lioprotector y 9.58x108 con CA como lioprotector, el pH es similar en ambos estudios. El DMSO y CA usados como lioprotectores tienen funciones de acción diferentes. Hubálek (2003) describe los sulfóxidos como muy efectivos, penetran rápidamente la membrana, y es más efectivo que el glicerol. El CA es usado como un absorbente natural de oxigeno asegurando aún más la anaerobiosis antes de liofilizar (Malik, 1990), debido a esto, por su estructura, superficie, tamaño de los poros y su capacidad higroscópica (Matsui et al., 2015) permite absorber bacterias (Xu et al., 2015), por estas características su área de absorción es mayor, las bacterias se pueden meter en los poros y así asegurar el crecimiento. El pH para DMSO fue diferente (p<0.05) con respecto al T y CA, pero el Redox no tuvo diferencias entre tratamiento (p>0.05). El pH se mantuvo en un rango neutro a ligeramente ácido (cuadro 1), esto permitió el desarrollo y crecimiento de bacterias (Galindo et al., 2004). Cuadro 1. Concentración de bacterias totales, pH y Redox de los tratamientos liofilizados con y sin lioprotectores reactivados hidratados. Tratamiento Testigo DMSO CA EEM
[BT] 1.8x1010b 5.3x1010a 0.09x1010c 0.76
pH 6.95b 7.05a 6.94b 0.02
a, b, c
Redox -33.37a -28.47a -35.27a 1.43
; Medias en una columna con distinta literal son diferentes (p≤0.05), EEM, error estándar del valor promedio. DMSO, dimetilsulfoxido; CA, carbón activado; [BT] concentración de bacterias ruminales totales.
158
XLIV Reunión Científica AMPA 2017, Clima y Ganadería: Productividad Sustentable
La degradabilidad de la materia seca puede estar en función al contenido de lignina, dada la actividad microbiana en las paredes celulares se pueden degradar los componentes de la fibra, (Gomes et al., 2011) el % DEGMS fue mayor (p≤0.05) para el T comparado con DMSO y CA, el uso de lioprotectores no modifica el % DEGMS ya que no hubo diferencias entre ellos (p≥0.05). Mata et al. (2011) utilizaron líquido ruminal fresco para ver la degradabilidad de tres variedades de Agaves sus resultados fueron superiores, de 75 a 82 % con un pH promedio de (6.33). El pH del medio cambia con la utilización de los lioprotectores utilizados para la conservación; lo anterior se concluye porque los tratamientos con lioprotectores no presentaron diferencias entre ellos (p≥0.05), pero ambos son diferentes (p≤0.05) al T. Bach y Calsamiglia. (2006) mencionan que hay una relación entre el contenido de FDN de una dieta y el pH, pero es mayor la relación entre el pH y el contenido de carbohidratos no fibrosos de una dieta dada. Sánchez-Santillán (2016) obtuvo pH ligeramente altos con respecto a los obtenidos en este ensayo, el Redox fue diferente entre los lioprotectores (p≤0.05), sin embargo, cada lioprotector no fue diferente al testigo (p≥0.05). Los niveles Redox y pH se reflejaron en el % DEGMS ya que el testigo presentó el mayor nivel de degradación 54.98 % y fue diferente (p≤0.05) al resto de los tratamientos. El uso de los lioprotectores DMSO o CA no cambia el nivel de % DEGMS al no haber diferencias entre tratamientos (p>0.05). Cuadro 2. Efecto de los lioprotectores en el inóculo fluido ruminal sobre las variables de degradación in vitro Variable %DEGMS pH Redox
Testigo 54.98ª 6.54b -196.10ab
DMSO 33.97b 6.62ª -147.42ª
CA 42.13b 6.58ª -214.52b
EEM 2.66 0.01 10.69
a, b, valores promedio con distinta letra en una misma hilera son estadísticamente diferentes (p < 0.05); EEM, error estándar del valor promedio; DMSO, dimetilsulfoxido, CA, carbón activado; %DEGMS, porcentaje de degradación de la materia seca a 72 h de incubación; pH, potencial de hidrogeno medido a las 72 h de incubación; Redox, Potencial de óxidoreducción (mVRel).
CONCLUSIÓN Las bacterias ruminales totales después de liofilizar mantienen su actividad y viabilidad de degradar MS, el uso de lioprotectores como el Dimetilsulfoxido asegura un mayor crecimiento de bacterias ruminales totales, el uso de lioprotectores puede disminuir la capacidad de degradar MS. Se recomienda realizar pruebas con otros agentes lioprotectores y el uso de crioprotectores para conservar por el método de congelación. REFERENCIAS Arcos M., L., F. Ossa., y T. Díaz E. 2004. Criopreservación de aislados nativos de la bacteria ruminal Fibrobacter succinogenes. Rev. Corpoica. Cienc y Tecnol. Agropecu. 5: 60–63. Bach, A y S. Calsamiglia. 2006. La fibra en los rumiantes: ¿Química o Física? XXII curso de especialización FEDNA. Barcelona. P. 99-103 Denek, N. A. Can and M. Avci. (2010). Frozen rumen fluid as microbial inoculum in the twostage in vitro digestibility assay of ruminant feeds. South African Journal of Animal Science. 40(3):251-256.
159
XLIV Reunión Científica AMPA 2017, Clima y Ganadería: Productividad Sustentable
Galindo, J. Y. Marrero, N. González, A. I. Aldama. (2004). Caracterización de la actividad celulolítica en el liquido de rumen filtrado. Revista Cubana de Ciencia Agricola. Vol. 38, 3:259-263. García L., M., D., y F. Uruburu F. 2000. La conservación de cepas microbianas. Temas de actualidad. SEM Actual. 30: 12–16. Gomes, D. I. E. Detmann, S. de C. V. Filho, R. S. Fukushima, M. A. de Souza, T.N.P. Valente, M. F. Paulino and A. C de Queiroz. (2011). Evaluation of lignin contens in tropical forage using different analytical methods and their correlations with degradation of insoluble fiber. Animal Feed Science and Tecnology. 168:206-222. Hubálek, Z. 2003. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 46: 205–229. Malik, K. A. 1990. Use of activated charcoal for the preservation of anaerobic phototrophic and other sensitive bacteria by freeze-drying. Journal of Microbiological Methods. 12: 117124. Mata-E, M.A. M.G. Torres-C, G. Hernández-I, M.A. Cobos-P, G. Rodríguez-S, A. Luevano-L, D.R. Guzmán-G y M.M. Gámez-A. (2011). Degradación in vitro de Agave mapisaga, Agave salmiana, var. salmiana y Agave salmiana var. ferox. Revista Chapingo Serie Zonas Áridas. 10:123-129. Matsui, Y. S. Nakao, A. Sakamoto, T. Taniguchi, L. Pan, T. Matsushita and N. Shirasaki. (2015). Adsortion capacities of activated carbons for geosmin and 2-methylisoborneol vary whit activated carbon particle size: Effects of adsorbent and adsobate characteristics. Water Research, 85:95-102. Miyamoto-Shinohara, Y., T. Imaizumi, J. Sukenobe, Y. Murakami, S. Kawamura, and Y. Komatsu. 2000. Survival rate of microbes after freeze-drying and long-term storage. Cryobiology 41: 251–255. Morgan, C. A., N. Herman, P. A. White, and G. Vesey. 2006. Preservation of micro-organisms by drying; A review. J. Microbiol. Methods 66: 183–193. Sánchez-Santillán, P., M.A. Cobos-Peralta, D. Hernández-Sánchez, A. Álvarado-Iglesias, D. Espinosa-Victoria y J. G. Herrera-Haro. (2016). Uso de carbón activado para conservar bacterias celulolíticas liofilizadas. NOTA en Agrociencia 50:575-582. Xu, S. C. He, L. Luo, F. Lü, P. He and L. Cui. (2015). Comparing activated carbon of different particle sizes on enhancing methane generation in upflow anaerobic digester. Bioresource Technology. 196:606-612.
160