Manual Bioquimica aplicada a la Biotecnología by Alfredo Benitez

BIOQUÍMICA APLICADA A LA BIOTECNOLOGÍA I

DIRECTORIO

DR. JOSÉ ALFREDO MIRANDA LÓPEZ RECTOR

MTRO. RICARDO LÓPEZ FABRE VICE-RECTOR ACADÉMICO

M. en C. MARIANO SÁNCHEZ CUEVAS DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

M. en C. MARÍA CRISTINA MIRANDA VERGARA COORDINADORA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

M. en C. ALFREDO CESAR BENÍTEZ ROJAS AUTOR

INDICE

PAG

INTRODUCCION………………………………………………………………………..

NORMAS DE SEGURIDAD DE LOS LABORATORIOS …………………………..

REGLAS DE LABORATORIOS DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS….....…….

CRITERIOS DE EVALUACIÓN………………………………………………………

PROPÓSITO DEL LABORATORIO………………………………………………….

Práctica 1: Principios Básicos de laboratorio; uso de micropipetas y cálculos de utilidad en Bioquímica…………………………………………………………………. 10 Practica 2: El agua como solvente polar……………………………………...…….

Practica 3: Identificación de carbohidratos.………………………………………..

Práctica 4: Identificación de aminoácidos..………..……………..…………….….

Práctica 5: Cuantificación de proteínas I……………………………………………

Practica 6: Cuantificación de proteínas II.………..…………………………………

Práctica 8: Cinética enzimática………………………………………………..…........

INTRODUCCION La biotecnología consiste en la manipulación de organismos vivos o de productos de organismos vivos con el fin de obtener productos deseables para el uso humano. Desde esta perspectiva, la ganadería y el cultivo de abejas se consideran prácticas biotecnológicas. El término se utiliza también para expresar la interacción de la biología con la tecnología humana. A pesar de que en el uso común se asocie el término a las partes de la industria que crean, desarrollan, o comercian productos generados a través de la manipulación intencional, en un nivel molecular, de formas de vida (DNA recombinante, por ejemplo), limitar el término a estos aspectos se considera un error. De hecho, la biotecnología ha sido usada por el hombre desde el comienzo de la historia en actividades como la producción de bebidas alcohólicas, la elaboración de pan y el mejoramiento de cultivos domésticos. Si bien no se ha dejado de elaborar pan, cerveza, cultivar papas y producir quesos, en la actualidad ha sido la introducción de técnicas como la de DNA recombinante, las que han hecho que las posibilidades de manipulación de especies que tenía el hombre se amplíen enormemente. Por ejemplo, la capacidad de introducir en cultivos como manzanas o maíz, ciertos genes que los hagan más grandes o más coloridos, o incluso que permitan que los cultivos produzcan por sí mismos los plaguicidas que comúnmente se rociaban, sin duda representa una revolución en la agricultura. Se habla también de la introducción a los alimentos de gran consumo en países en vías de desarrollo (como el arroz o el fríjol), vitaminas en las que la población sea deficiente, para evitar problemas de salud. Resulta evidente que para comprender todas las posibilidades que ofrece la biotecnología es necesario un profundo conocimiento de las ciencias básicas que se encuentran en ella implicadas, de todas ellas, la Bioquímica juega un papel central ya que la comprensión de esta disciplina abre todas las puertas a tan variadas y por momentos inimaginables aplicaciones de la biotecnología. Entre estas aplicaciones encontramos el uso de microrganismos como “fabricas” de metabolitos (proteínas, enzimas, vitaminas, etc), el diseño y aplicación de herramientas diagnósticas (anticuerpos monoclonales, electroforesis de proteínas y DNA, western blot, etc.) e inclusive la agricultura y la ganadería se están beneficiando a través de la Ingeniería Genética o Tecnología de DNA recombinante que ya se ha mencionado, pues todos estos procesos son esencialmente procesos bioquímicos.

NORMAS DE SEGURIDAD DE LOS LABORATORIOS DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Localizar los dispositivos de seguridad más próximos. Estos dispositivos son elementos tales como extintores, lavaojos, ducha de seguridad, mantas antifuego, salida de emergencia. etc. Infórmate sobre su funcionamiento. En caso de accidente. Considerar la seguridad de sus compañeros, por ello el laboratorio es un lugar para trabajar con seriedad. En caso de cualquier accidente personal o del material de trabajo, notifíquese inmediatamente al maestro. Manejo de reactivos Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la característica de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por lo tanto siempre se deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un contacto directo o accidental con ellos. Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y proteínas deben tener grado "biología molecular" para asegurar el éxito del procedimiento. El uso combinado de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento. El revelado de geles La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8W de potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deberá contar con una lámina de policarbonato transparente ubicada entre la lámpara y el punto de observación. Además, deberá usar lentes de protección contra rayos UV del mismo material. Corriente eléctrica El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga eléctrica. Aunque la mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar el contacto directo con la electricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada al momento de manipular el equipo. Desnaturalización de proteínas y DNA El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse con extremo cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales. Uso de guantes Se deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con ADN y proteínas. Este paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por acción de las nucleasas o proteasas presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitará que el laboratorista se exponga ante algún posible riesgo de intoxicación por material infeccioso. 5

Material biológico El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genómico y los productos de amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el ADN plasmídico a 20°C. Las proteínas deben ser conservadas a -80°C o en su defecto a -20°C. Todas las muestras biológicas deben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes pequeños para evitar etapas de descongelamiento o congelamiento drásticos que ocasionarían un eventual deterioro de las moléculas. Micropipetas Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de electroforesis, se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000 μl, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio, cuenten con un certificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650). Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con las moléculas de DNA sean nuevas y estériles, a fin de evitar una posible contaminación de la muestra con nucleasas. Es importante señalar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre y cuando estén libres de restos orgánicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121°C a 1,5 psi). Con respecto a la manipulación de las proteínas, no se exige el uso de puntas nuevas pero sí se recomienda esterilizarlas previamente. Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten con un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN 12650).

REGLAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA 6

1. Todos los estudiantes deberán usar bata blanca del laboratorio, guantes, gafas de seguridad y mascarilla (cuando aplique). 2. Está prohibido fumar, comer, beber o introducir alimentos al laboratorio aún fuera de la hora de práctica. 3. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, después no se permitirá el acceso al laboratorio. 4. Colocar los objetos personales en el lugar que te indique tu profesor, esto es para evitar que el acumulo de cosas en el área de trabajo 5. Mantener el orden durante el transcurso de la práctica y respeto a la clase y a los compañeros. 6. Se formarán equipos permanentes de trabajo y las faltas de asistencia a alguna práctica no podrán ser repuestas con otro grupo. 7. Por cada práctica que se realice los alumnos tendrán que entregar un reporte por equipo de la misma, que entregarán cada 8 días. 8. Cada material que se rompa o extravíe, deberá ser repuesto con material nuevo (amparado con la nota de compra). 9. Todos y cada uno de los alumnos deberán llevar la práctica impresa a la sesión de laboratorio 10. Antes de iniciar la práctica se realizará un examen pre-laboratorio que será calificado en la misma sesión. 11. Cada equipo deberá responsabilizarse por la limpieza inmediata del material y área de trabajo, no podrá retirarse ningún miembro del equipo hasta que la zona de trabajo esté completamente limpia y ordenada 12. Al destapar cualquier frasco de sustancias, tapar de inmediato después de utilizarlo y evitar cambiar los tapones. 13. No arrojar sólidos al lavadero o canales de desagüe. 14. Queda estrictamente prohibido sacar cualquier instrumento o equipo del laboratorio. 15. Al final de la práctica entregar todo el material o equipo al maestro, entregar las notas y practica impresa para firma y calificación y colocar los bancos en su lugar y lavarse las manos con agua y jabón.

CRITERIOS DE EVALUACIÓN

Código de conducta 

Tolerancia de 10 minutos para entrar al laboratorio. Después de este tiempo no se permitirá el acceso de los alumnos.



No se permite el uso de celulares durante las sesiones de laboratorio.



Asistencia a todas las prácticas con uso de bata blanca, y elementos de seguridad descritos en el apartado correspondiente. Los alumnos que no cumplan con alguna de estas reglas no podrán realizar la práctica.



El alumno se compromete a leer previamente las prácticas del laboratorio y contestar su examen pre-laboratorio



Las inasistencias se justifican solamente con la carta expedida por los Directivos de su Facultad.



El alumno que falte a la práctica de laboratorio pierde derecho a sus evaluaciones

Requisitos para hacer el reporte



PROPOSITO: Conoce los propositos (propios del equipo) de la práctica



RESULTADOS: Obtiene los resultados esperados (dibujos o valores)



DISCUSIÓN FUNDAMENTADA: Discute los resultados y/o cambios que se obtuvieron en la práctica y fundamenta con los conocimientos teóricos, bibliográficos y de artículos correspondientes al tema de la práctica, explica con excelente redacción sobre si se alcanzaron o no los propósitos de la misma.



CONCLUSIÓN: Concluye con un comentario o idea final que resuma los aspectos más importantes tanto del tema que se trabajo como de los resultados de la actividad que se realizó en la práctica, explica con excelente redacción porque se alcanzaron o no los propósitos de la misma y propone soluciones o alternativas cuando los propósitos no se alcanzaron

PROPÓSITO DEL LABORATORIO

FACILITAR AL ALUMNO DE BIOTECNOLOGÍA LA COMPRENSIÓN DE ALGUNOS PRINCIPIOS BIOQUIMICOS; REACCIONES, PROCESOS Y TECNICAS ANALITICAS DE USO COMUN EN LOS LABORATORIOS DE BIOINGENIERIA ALREDEDOR DEL MUNDO.

Práctica 1: Principios básicos de laboratorio, uso de micropipetas y cálculos de utilidad en Bioquímica. Introducción En el año de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de Pesas y Medidas con sede en París, Francia acordaron crear el Sistema Internacional de Pesas y Medidas (SIU o SI) con el objetivo de facilitar el intercambio de información cuantificable y universalizar su uso. El SI es básicamente una versión ampliada del sistema métrico decimal y consta de siete unidades básicas independientes para cuantificar diferentes magnitudes físicas. En el Cuadro 1 se describen estas unidades, además de los símbolos que se deben utilizar cuando se hace mención a éstas.

Dos o más unidades básicas pueden ser combinadas mediante multiplicación o división para generar unidades SI derivadas. Algunas de estas unidades poseen nombres particulares en honor a científicos que contribuyeron al conocimiento de un tema en particular. En el Cuadro 2 se presentan algunos ejemplos de unidades SI derivadas.

Muchas veces las unidades básicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy pequeñas para representar una cantidad en particular. Para esos casos, el SI admite el uso de una serie de prefijos que permiten formar múltiplos o submúltiplos decimales de las unidades del SI. Estos prefijos se muestran en el Cuadro 3.

Los prefijos se anteponen directamente al nombre o símbolo de la unidad en cuestión, por ejemplo nanogramo o ng y no nano-gramo o n-g. Si bien es cierto, el uso del SI es la regla hoy en día, existen excepciones que la Oficina Internacional de Pesas y Medidas debió adoptar debido a su uso generalizado. Algunas de estas excepciones de uso en ciencias médicas se muestran en el Cuadro 4.

Debido a su uso rutinario en la bioquímica experimental, vale la pena mencionar algunas normas sobre la expresión de concentraciones de sustancias. La concentración de sustancias cuya masa molecular se conoce, se expresa como cantidad de sustancia (moles o submúltiplos como mmol, nmol) por litro (l). Ejemplo: concentración de glucosa en suero humano: 3.6 mmol/l a 6.1 mmol/l. Los términos concentración molar, molaridad o M, normalidad o N son obsoletos y en su lugar debe usarse el término “cantidad de sustancia concentración de X” o más comúnmente, “concentración de X”. El término molal y su símbolo m no deben ser más utilizados y en su lugar se utiliza el término “cantidad molalidad del soluto X” con las unidades SI mol/kg. La Conferencia General de Pesas y Medidas no recomienda el uso de la escala de pH y en su lugar, la concentración de iones hidronio en una solución debe ser reportada como nmol/l. Sin embargo, la eliminación de la escala de pH no ha sido aceptada por la mayoría de la comunidad científica. En el año 2002, la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) elaboró una propuesta para que dicha medida cumpliera con los requisitos solicitados por la Conferencia. A la fecha, esta propuesta se encuentra en discusión. 11

A continuación se enumeran algunas reglas para la consignación de símbolos y cifras del SI:               



Los símbolos se escriben siempre en singular. Ejemplo: 2 mm y no 2 mms. El nombre completo de una unidad se pluraliza si es necesario. Ejemplo: 35 kilogramos. Los prefijos no deben usarse solos, sino siempre acompañados de una unidad. Ejemplo: 14 gigawatts y no 14 gigas. El punto no debe usarse después de un símbolo, a menos que éste se encuentre al final de una frase. Ejemplo: 55 kg de masa y no 55 kg. de masa. Siempre se deja un espacio entre el número que denota la cantidad y el símbolo de la unidad. Ejemplo: 15 s y no 15s. Números muy grandes pueden ser separados en grupos de tres para facilitar su lectura, sin puntos o comas. Los puntos o comas se utilizan para las notaciones decimales. Ejemplo: 1 000 257, 35 y no 1.000.257,35. Siempre se coloca un cero a la izquierda de la coma o el punto decimal para los números menores de uno. Ejemplo: 0.38 o 0,38 y no .38 o ,38. Los símbolos de las unidades o sus nombres no deben ser modificados mediante adición de subíndices. Ejemplo: Vmax= 1000 V y no V= 1000 Vmax. La redacción de la información no debe ser mezclada con los símbolos de las unidades o sus nombres. Ejemplo: “el contenido de agua es de 20 ml/kg” y no “20 ml H 2O/kg” o “20 ml de agua/kg”. Debe quedar explícito cuál símbolo pertenece a cuál valor numérico y qué operación matemática debe ser aplicada a cada valor numérico. Ejemplos: 45 cm X 46 cm y no 45 X 46 cm 20 °C a 30 °C o (20 a 30) °C y no 20 °C-30 °C o 20 a 30 °C Los símbolos de las unidades o sus nombres no pueden ser mezclados y las operaciones matemáticas no son aplicadas a los nombres de las unidades sino a los valores numéricos. Ejemplos: pueden ser usadas formas como: kg/l, kg • l o kilogramo por litro y no formas como: kilogramo/l, kg/litro, kilogramo/litro o kg por l. Los valores de cantidades son expresados en forma numérica y con los símbolos de las unidades. Ejemplos: m= 5 kg y no m= cinco kilogramos o m= cinco kg, o “la corriente fue de 15 A” y no “la corriente fue de 15 amperios”.

Uso correcto de las micropipetas. Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volúmenes pequeños que van desde 1 μl hasta 1 ml o más. Al igual que las pipetas éstas pueden ser para contener o para verter volúmenes. Durante el curso utilizaremos micropipetas para verter, ya sea un volumen fijo o un volumen variable. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. La micropipeta más comúnmente usada en los laboratorios de análisis fue introducida por la compañía Eppendorf y este nombre se adoptó de forma genérica para estos dispositivos, aunque hoy en día existen una gran cantidad de compañías y modelos similares que funcionan bajo un mismo principio de pistones para operar. Por lo tanto, es aconsejable consultar las instrucciones del fabricante sobre el empleo correcto de cada modelo. Sin embargo, todas ellas utilizan puntas o “tips” descartables plásticos que se ajustan al extremo de la micropipeta. En estas puntas de plástico es donde se deposita el líquido a medir.

Para absorber el líquido, el pistón es presionado hasta una primera posición, el tip es puesto en contacto con el líquido y luego, lentamente, se permite que el pistón vuelva a su posición original. Este paso permite el llenado del tip con el volumen correspondiente. El tip de plástico generalmente no se seca por fuera ya que se considera que su superficie no absorbe líquido. A continuación se describen las instrucciones específicas para los modelos de micropipetas que se utilizarán durante el curso.

1. Selección de la micropipeta a utilizar según el volumen a dispensar. Para este paso, se aplican las mismas reglas que se utilizan para el manejo de las pipetas. El Cuadro 5 muestra los rangos de volúmenes que se pueden pipetear con cada modelo de micropipeta de la marca Biorad, además de los usos más comunes. La mayoría de la micropipetas indican en el botón pulsador el rango o volumen máximo que pueden pipetear. Para prevenir un daño en el mecanismo interno de la micropipeta recuerde nunca sobrepasar los volúmenes máximos permitidos para cada micropipeta. 1. Debido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable, es necesario seleccionar el volumen a medir. Para ello se debe localizar el indicador de volumen, compuesto de tres dígitos que se deben leer de arriba hacia abajo. En la parte más baja del indicador hay una escala que permite el ajuste del volumen al último dígito o decimal permitido según el caso. 2. Ajustar el volumen de la pipeta con el tornillo del botón pulsador (Figura 3, A2) o la rueda de graduación del volumen (Figura 3, B), hasta llegar a 1/3 por encima del valor deseado. Luego, lentamente, girando el tornillo o la rueda, disminuir el ajuste hasta el valor deseado prestando atención para no excederlo. Si se excede, es aconsejable repetir el procedimiento de ajuste. Siempre se debe ajustar el volumen deseado desde un volumen más alto disminuyendo las indicaciones del indicador. 3. Seleccionar la punta o tip plástico apropiado para la micropipeta: la punta debe ajustarse al cono de la micropipeta. Al insertar la punta en el cuerpo de la pipeta hay que aplicar una fuerte presión con movimiento giratorio para asegurar la hermeticidad. Nunca usar la pipeta con líquidos sin la punta colocada. Es posible que la punta plástica se encuentre en una caja también plástica que facilita su uso. Si la punta no queda bien ajustada o no está en caja, deberá ajustarse con la mano sin tocar la superficie que estará en contacto con la solución a extraer. 4. Aspiración: apretar el botón pulsador hasta el primer tope. 5. Con la pipeta en posición vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en la muestra. 6. Lentamente se aspira el líquido al relajar la presión del dedo sobre el botón pulsador. Si este paso no se realiza con atención, puede entrar aire en la punta y la cantidad de muestra aspirada no es la adecuada. 7. Esperar un segundo y retirar la punta del líquido. 8. Dosificación: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente donde se depositará el líquido, con un ángulo entre 10° y 40°. 9. Apretar el botón pulsador suavemente hasta el primer tope y esperar un segundo. 10. Apretar el botón pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del líquido. 13

11. Manteniendo apretado el botón pulsador en el segundo tope, retirar la pipeta deslizando la punta por la pared del recipiente. Soltar luego el botón pulsador. 12. Expulsar la punta apretando el botón del expulsor. Para no dañar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta:    

El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta Nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta

Cálculo y expresión de diluciones. Una dilución consiste en preparar una solución menos concentrada a partir de una más concentrada. Esta práctica es muy común en los laboratorios y de ella depende en gran parte el resultado final analítico que se obtenga. Por lo tanto es imperativo el manejo de este tipo de cálculos para cualquier persona que trabaje dentro de un laboratorio. Las diluciones generalmente se expresan como una razón matemática, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10 (o 1/10), etc. En el caso de una dilución 1:5, ésta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una sustancia en un volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un volumen (o peso) total de 5 volúmenes. Nótese que el volumen total o final estará compuesto de 1 volumen de la sustancia a diluir y 4 volúmenes del disolvente. Para calcular la concentración final de una solución diluida, se multiplica la concentración de la solución original por la dilución expresada como fracción. Ejemplo: una solución de urea cuya concentración es de 5 mg/ml es diluída 1/10. La concentración final de la solución diluida es 5 X 1/10= 0.5 mg/ml. La ecuación más comúnmente utilizada para preparar soluciones es: V1C1=V2C2 Donde V1 es el volumen de la solución concentrada que se debe añadir para preparar la solución diluida, C1 es la concentración de la solución concentrada V2 es el volumen de la solución diluida C2 es la concentración de la solución diluida. Al utilizar esta ecuación debe tomarse en cuenta que tanto las unidades de V 1 y V2 así como las de C1 y C2 deben ser las mismas, preferiblemente ml y mol/l respectivamente. Ejemplo: prepare 500 ml de una solución de glucosa 5 mol/l a partir de una solución de glucosa a 45 mol/l. Aplicando la ecuación antes presentada tenemos: x(45 mol/l)= 500 ml(5 mol/l) x= 55.56 ml de glucosa 45 mol/l Entonces, para preparar 500 ml de una solución de glucosa 5 mol/l, se requieren 55.56 ml de glucosa 45 mol/l y llevar a 500 ml con agua. Nótese que la solución original fue diluida 1/9 o en otras palabras, se utilizó un factor de dilución de 9: 45(1/x)= 5 x= 9 14

El factor de dilución representa el número de veces que fue diluida la solución concentrada. Si se hace no una sino una serie de diluciones, la concentración de la solución final se obtiene al multiplicar la concentración original por el producto de los factores de dilución. Ejemplo: si la solución de glucosa a 45 mol/l del ejemplo anterior es primero diluida 1/9 y luego 1/100, la concentración final de la solución será 45(1/9)(1/100)= 0.05 mol/l, con un factor de dilución de 900. Las diluciones seriadas son también muy útiles. Estas diluciones son aquellas en las cuales todas las diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera poseen el mismo factor de dilución. Ejemplo: para determinar la concentración de proteínas en un suero animal, la muestra es diluida 1:5 o 1/5 mediante la adición de 0.02 ml de suero a 0.08 ml de solución salina en el tubo número 1. Los tubos 2 al 8 contienen 0.5 ml de solución salina como diluyente. La dilución seriada se realiza al transferir 0.5 ml del tubo 1 al tubo 2, mezclar y transferir 0.5 ml del tubo 2 al tubo 3 y así sucesivamente hasta el tubo 8. La concentración de suero en los tubos 2 al 8 decrece por un factor de 2, siendo cada dilución: tubo 1: 1/5, tubo 2: 1/10, tubo 3: 1/20, tubo 4: 1/40, tubo 5: 1/80, tubo 6: 1/160, tubo 7: 1/360 y tubo 8: 1/640.

Propósito 1. Que el estudiante se familiarice con la metodología, equipo y forma de trabajo dentro del laboratorio de Bioquímica.

Materiales y equipo Reactivos  Bolsa de 100 tubos eppendor de  Agua destilada 3 mL  KMnO4  Pinzas de disección  Micropipetas de volumen variable  2-200 ul, 100-1000 ul  Puntas para micropipeta  Balanza analitica  Estufa de incubación Procedimiento 1.

Colocar 24 horas antes 25 tubos eppendorf por persona a peso constante (en estufa a 100° C durante las 24 hpras).

Identificar 5 series con 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla: Tubo/volumen 1 2 3 4 5

150

925

Registrar el peso de cada tubo vacío a peso constante con una sensibilidad de hasta tres decimales

Pipetear con la técnica descrita en el apartado de teoría el volumen indicado en la tabla (5 replicas por volumen)

Pesar nuevamente los tubos eppendorf con el liquido

Por diferencia calcular el peso y volumen del liquido

Preparar por todo el grupo 50 ml de KMnO4 0.1 M A partir de esta solución preparar una serie de diluciones 1:5 de 5 ml. Tomar fotografías de los tubos con las diluciones. Cuestionario 1. ¿Por qué es importante contar con un sistema estandarizado de unidades? Fundamenta tu respuesta. 2. Investiga quien es en México la institución encargada de difundir, vigilar y aplicar el SIU y cual es la Norma Oficial Mexicana que establece el uso del SIU en nuestro país. 3. En tu reporte incluye las fotografías de las diluciones seriadas. 4. Con los volúmenes medidos calcula la desviación estándar, volumen promedio y coeficiente de variación, reporta estos datos. 5. Calcula el volumen necesario para preparar las siguientes soluciones a partir de las propuestas Concentración final:  Glucosa 0.1 M  Fenilalanina 0.5 M  KMnO4 0.2 M  Sacarosa 0.25 M  Albumina 0.1M

EXAMEN PRELAB

A partir de:  0.5 M  1M  0.5 M  0.8 M  2M

DESEMPEÑO

FIRMAS

FECHA

ALUMNO

DOCENTE

REFERENCIAS



Angulo Ugalde, Y. (1999) Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica, San José de Costa Rica.



Switzer, R. y L. Garrity. (1999). Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York

Práctica 2: El agua como solvente polar Introducción El agua, el líquido más común de la superficie terrestre, el componente principal en peso de todos los seres vivos, tiene un número de propiedades destacables. Estas propiedades son consecuencia de su estructura molecular y son responsables de la "aptitud" del agua para desempeñar su papel en los sistemas vivos. La estructura de la molécula de agua está dada por dos átomos de hidrógeno y un átomo de oxígeno que se mantienen unidos por enlaces covalentes, la geometría molecular corresponde a un tetraedro deformado originando un efecto dipolar (2 polos) en la molécula (Figura 1 a). Como una consecuencia del fenómeno anteriormente explicado, forma enlaces -llamados puentes de hidrógeno- con otras moléculas. Aunque los enlaces individuales son débiles -se rompen y se vuelven a formar continuamente- la fuerza total de los enlaces que mantienen a las moléculas juntas es muy grande. Los puentes de hidrógeno determinan muchas de las extraordinarias propiedades del agua. Entre ellas están su gran cohesión, su alta tensión superficial y su alto calor específico, de vaporización y de fusión. Los fenómenos de capilaridad e imbibición están también relacionados con la presencia de puentes de hidrógeno (Figura 1 b).

Figura 1 (a) Estructura molecular del agua

Figura 1 (b) Formación de puentes de hidrógeno

La polaridad de la molécula de agua es, además, responsable de su adhesión a otras sustancias polares, de ahí, su tendencia al movimiento capilar. También debido a su polaridad el agua es un buen solvente para iones y moléculas polares. Las moléculas que se disuelven fácilmente en agua se conocen como hidrofílicas. Las moléculas de agua, a raíz de su polaridad, excluyen activamente de la solución a las moléculas no polares. Las moléculas excluidas de la solución acuosa se conocen como hidrofóbicas. El agua tiene una ligera tendencia a ionizarse, o sea, a separarse en iones H+ (en realidad iones hidronio H3O+) y en iones OH-. En el agua pura, el número de iones H+ y el número de iones OH- es igual a 10-7 mol por litro (M). Una solución que contiene más iones H+ que iones OHes ácida; una solución que contiene más iones OH- que iones H+ es básica o alcalina. La escala de pH refleja la proporción de iones H+ a iones OH- (Figura 2).

Figura 2. Fenómeno de ionización del agua. En el agua pura [H3O+] = [OH-] =10-7 M Una solución ácida tiene un pH inferior a 7; una solución básica tiene un pH superior a 7. Casi todas las reacciones químicas de los sistemas vivos tienen lugar en un estrecho intervalo de pH alrededor de la neutralidad. Los organismos mantienen este estrecho intervalo de pH por medio de buffers, que son combinaciones de formas de ácidos débiles o bases débiles; dadores y aceptores de H+. Materiales y equipo

Reactivos

5 Vasos de precipitados de 100 ml 2 matraces aforados de 50 ml 1 foco de lámpara de 9 v 1 probeta graduada de 100 ml 1 socket para el foco 1 m de cable para bocina 1 pila de 9 v 1 Cutter 1 Potenciometro con medidor conductividad.

Agua destilada Sacarosa NaCl Aceite común de cocina Hexano

Propósitos 1. Analizar la importancia que el agua tiene para los seres vivos y explicar los fundamentos fisicoquímicos que le confieren tal importancia. 2. Comprender la las propiedades fisicoquímicas del agua como solvente polar. 3. Explicar la relación entre la estructura química del agua y sus propiedades fisicoquímicas. 18

Cortar el cable y conectarlo al socket de tal forma que se cree un circuito como lo muestra la Figura 3. Verter 50 ml de cada una de las siguientes substancias en un vaso de precipitados (1 vaso para cada substancia):           

Agua destilada Agua de llave Aceite de cocina Hexano Solución 0.01 M de NaCl Solución de 0.1 M de NaCl Solución 0.5 M de NaCl Solución 1 M de NaCl Solución 0.01 M de Sacarosa Solución 0.1 M de Sacarosa Solución 1 M de sacarosa

Figura 3. Esquema del circuito eléctrico para prueba de conducción eléctrica en disoluciones Registrar los resultados en la siguiente tabla Substancia Agua destilada Agua de llave Aceite de cocina Hexano NaCl 0.01 M NaCl 0.1 M NaCl 0.5 M NaCl 1 M Sacarosa 0.01 M Sacarosa 0.1 M Sacarosa 1 M

Intensidad luminosa

Conductividad (µS)

Cuestionario 1. ¿Por qué si el agua destilada pura no logro encender el foco, la conductividad no es 0? 2. ¿Por qué el aceite y el hexano que tampoco encendieron el foco presentan conductividades cercanas a 0? 3. ¿Que tipos de enlace presentan las moléculas de esta práctica y como se relaciona el tipo de enlace con las observaciones experimentales? 4. Grafica la concentración de NaCl vs conductividad y obtén la ecuación que describe esta relación. 5. Con base a la ecuación del punto anterior calcula cual sería la conductividad de una solución de NaCl 1.5 M 6. ¿Porque se dice que “lo polar disuelve a lo polar y lo no polar disuelve a lo no polar”? Fundamenta tu respuesta 7. ¿Que importancia biológica tiene que el agua sea un solvente polar? 8. ¿Porque es indispensable el agua para los seres vivos? (Razón bioquímica) 9. Si las membranas celulares están constituidas por substancias lipídicas, ¿Puede el agua atravesar estas membranas? Fundamenta tu respuesta 10. En base a la respuesta de la pregunta 8 ¿Qué implicaciones habría para la vida si el agua fuese un compuesto no polar? EXAMEN PRELAB

DESEMPEÑO

FIRMAS

FECHA

ALUMNO

DOCENTE

Referencias 1. Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica. 1999 

Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999

Notas al estudiante:

Practica 3: Identificación de carbohidratos Introducción Los carbohidratos son compuestos de carbono que contienen oxígeno e hidrógeno en relación 2 a 1 con una fórmula general (CH2O)n, aunque el término también se emplea para compuestos derivados de los carbohidratos que no cumplen esta definición estrictamente. Pueden clasificarse según su estructura en: monosacáridos o azúcares simples, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos son polihidroxialdehídos (aldosas) o polihidroxicetonas (cetosas).

Figura 1. Estructura de los carbohidratos Se nombran de acuerdo al número de carbonos en la cadena, de forma que las tetrosas contienen cuatro, las pentosas cinco y las hexosas seis átomos de carbono. La forma abierta de estas moléculas está en equilibrio con las formas cíclicas formadas al reaccionar un grupo alcohol con el aldehído o cetona de la misma molécula para formar un enlace hemiacetal. Esta forma cíclica para el caso de la glucosa se llama forma piranosica (del pirano).

Figura 2. Estructura cíclica de la glucosa (2 isomeros) 21

Los monosacáridos pueden unirse entre sí por medio de enlaces glucosídicos que se forman cuando el grupo hidroxi del carbono 1 reacciona con el OH de otra molécula con la eliminación de agua. El enlace cetal se llama también enlace glucosídico (Figura 3). De esta forma se forman oligosacáridos (2-10 monosacáridos) y moléculas de alto peso molecular o polisacáridos. Son ejemplos de este tipo de macromoléculas: el almidón, el glucógeno y la celulosa, todos ellos formados por glucosa.

Figura 3. Disacaridos de importancia biológica Los polisacáridos también pueden estar formados por dos o más diferentes monosacáridos o derivados de ellos, como la N-acetilglucosamina, el ácido glucurónico o el ácido Nacetilmurámico que forman parte, respectivamente, del ácido hialurónico, en la heparina y en la mureina (Figura 4). Muchos de estos heteropolisacáridos se encuentran asociados a proteínas formando los proteoglicanos y las glicoproteínas. Uno de los monosacáridos más abundantes en la naturaleza es la glucosa que se forma en las plantas y algas a partir de agua y CO2 usando la energía de la luz del sol en el proceso llamado fotosíntesis. Muchas plantas contienen grandes cantidades de carbohidratos como reservas de energía, que después sirven de alimento a otros organismos como los animales. Después de su ingestión, los carbohidratos de las plantas se hidrolizan para formar glucosa a partir de la cual se forma glucógeno. En los animales, los carbohidratos almacenados se convierten en glucosa que se transporta a las células donde se oxida a CO2 y O2 en la respiración celular. La energía liberada es “capturada” y utilizada para llevar a cabo las actividades metabólicas. En el caso del hombre, más del 60% de sus requerimientos de energía se obtienen de la oxidación de los carbohidratos. De esta 22

manera la energía luminosa del sol se hace accesible al reino animal, que no lleva a cabo el proceso de fotosíntesis. Se han desarrollado un gran número de pruebas químicas que se utilizan comúnmente para la identificación cualitativa de diversos azúcares o grupos de ellos.

Figura 4. Monosacaridos derivados

En la práctica se trabajará con las siguientes: La reacción de Molisch es la prueba más general para carbohidratos. Los compuestos que se deshidratan con ácido sulfúrico para formar furfural o hidroximetilfurfurtal, reaccionan con (αnaftol) para dar un producto de condensación de color púrpura (Figura 5). El grupo más numeroso de reacciones generales de los carbohidratos es el constituido por las que detectan la presencia de materiales relativamente reductores, como son los monosacáridos y muchos disacáridos. Algunas de estas pruebas se basan en la capacidad de los hemiacetales y aldehídos de reducir las sales cúpricas a óxido cuproso, generalmente en medio alcalino, en el que los compuestos se encuentran disueltos o complejados con tartrato, citrato, etc. La adición de una base diluída cataliza el tautomerismo ceto-enol, de forma que aldohexosas en solución, como la glucosa, resultan en la formación de una mezcla de glucosa, fructosa y manosa:

Figura 5. Reaccion de Molisch Entre las pruebas que identifican azúcares reductores, se encuentra la prueba de Benedict. Esta prueba se lleva a cabo en condiciones levemente alcalinas y es una prueba muy sensible. La formación de un precipitado de óxido de cobre es el criterio para que la prueba sea positiva. Esta prueba no es específica para azúcares, pues los aldehídos en general pueden oxidarse en las condiciones de la reacción.

Figura 6. Reacción de Benedict La prueba de Barfoed, aunque utiliza básicamente el mismo procedimiento, sirve un fin distinto; aquí el cobre está en una disolución débilmente ácida, de forma que en el tiempo de la reacción (10 minutos) sólo los monosacáridos reducirán los iones cúpricos del reactivo pues, pues por ser moléculas más pequeñas, tienen mayor reactividad. Si el tiempo de calentamiento se prolonga, los disacáridos pueden hidrolizarse y los monosacáridos resultantes pueden ya dar la prueba positiva. La sacarosa, que no es reductora, puede dar resultados equívocos debido a la labilidad de su molécula, que en parte se hidroliza a fructosa y glucosa. Las reacciones de Bial y Seliwanoff se basan, al igual que la de Molisch, en la formación de furfural o sus derivados en caliente. En la prueba de Bial este furfural reacciona con orcinol dando compuestos coloridos cuando el monosacárido es una pentosa. En la reacción de Seliwanoff, es el resorcinol el que se combina con los derivados del furfural, lo que permite identificar cetohexosas. 24

La prueba de yodo se basa en que una solución de yodo-yoduro forma complejos coloridos con los polisacáridos, de diferente color según su estructura química: azul para almidón, rojizo para glucógeno. La correcta identificación de un azúcar desconocido, tanto en disolución como en una muestra sólida es un problema que puede ser banal o muy complejo, dependiendo del tipo de muestra, de su supuesta composición aproximada y de si es una muestra pura o compleja. En este experimento, se identificarán muestras puras de modo que las dificultades se minimicen. Materiales y equipo

Reactivos

Tubos de ensaye Micropipeta 1000 uL Puntas Parrilla Guantes de latex

α-naftol Carbonato de sodio Citrato de sodio Sulfato de cobre II Acetato cúprico Acido acético glacial Orcinol HCl concentrado Cloruro ferrico Resorcinol Yoduro de potasio Yodo sublimado H2SO4 concentrado NaCl

Propósitos 

Identificar diversos carbohidratos en base a reacciones específicas de carbohidratos azúcares reductores, pentosas, cetohexosas, etc.

Procedimiento Prueba de Molisch 1. En un tubo de ensaye se agrega 1 ml de la solución problema 2. En otro tubo de ensaye, se agrega 1 ml de agua. (este tubo será el blanco) 3. Adicionar, a ambos tubos, 0.5 ml del reactivo de Molisch y agitar perfectamente 4. Añadir unas gotas de H2SO4 concentrado, resbalando por las paredes del tubo y observar la coloración. 5. Si aparece un anillo color violeta en la interfase de los líquidos la prueba es positiva. Prueba de Benedict 1. 2. 3. 4. 5.

En un tubo de ensaye se agrega 1 ml de la solución problema En otro tubo de ensaye, se agrega 1 ml de agua (este tubo será el blanco) Añadir, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Benedict y agitar perfectamente Dejar en baño de agua hirviendo por unos minutos. La reacción es positiva si aparece un precipitado rojo-amarillo.

Prueba de Barfoed 1. En un tubo de ensaye se agrega 1 ml de la solución problema 25

2. 3. 4. 5.

En otro tubo de ensaye, se agrega 1 ml de agua. (este tubo será el blanco) Agregar, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Barfoed y agitar perfectamente Dejar en baño de agua hirviendo por unos minutos. La reacción es positiva si aparece un precipitado rojo-amarillo.

Prueba de Bial 1. 2. 3. 4. 5.

En un tubo de ensaye se agrega 1 ml de la solución problema En otro tubo de ensaye, se agrega 1 ml de agua. (este tubo será el blanco) Añadir, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Bial y agitar perfectamente Dejar en baño de agua hirviendo por unos minutos. La reacción es positiva si aparece una coloración verde-azul.

Prueba de Seliwanoff 1. 2. 3. 4. 5.

En un tubo de ensaye se agrega 1 ml de la solución problema En otro tubo de ensaye, se agrega 1 ml de agua. (este tubo será el blanco) Agregar, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Seliwanoff y agitar perfectamente Dejar en baño de agua hirviendo por unos minutos. La reacción es positiva si hay precipitación de color rojo.

Prueba de Yodo 1. Colocar 0.25 ml de solución de carbohidrato. 2. Añadir 2 ml de solución de NaCl al 1% y dos gotas de solución de 3. Yodo-yoduro. Observar la coloración; si es azul obscuro la prueba es positiva. Si es rojiza, es glucógeno. Cuestionario 1. Escribe las estructuras de 2 aldohexosas y 2 aldopentosas. Dos cetohexosas y 2 cetopentosas. 2. Represente la formación del hemiacetal de la glucosa (abierta) y en su forma piranosica. 3. Escribe el nombre IUPAC de los siguientes disacáridos a. Sacarosa b. Lactosa c. Maltosa 4. Explica que es un azúcar reductor y cómo actúa el reactivo de Benedict. 5. Investiga cual es la reacción de enolización que se lleva a cabo en los azúcares como la glucosa. 6. Elabora un cuadro con los resultados de las reacciones realizadas. 7. Reporta que sustancia (s) encontraste en el problema dado.

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FIRMAS

FECHA

ALUMNO

DOCENTE

Referencias     

Horton, H.R. et al. 1995. BIOQUÍMICA. México: Prentice Hall Hernández M., L. R. 1979. BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL. México: Limusa. Ortega D., M.L.; Hernández U., H.Y. 1986. MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA. México: Colegio de Postgraduados. Santos M. A.; Esparza T., F. 1995. MANUAL DE PRÁCTICAS DE QUÍMICA Y BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS. México: U.A.CH. Alemany L., M.; Fonts., S. 1983. PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA. España: Alhambra.

Notas al estudiante:

Practica 4: Identificación de aminoácidos; Cromatografía de capa delgada Introducción El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases). Todas las técnicas intentan explotar las diferencias físicas, químicas y biológicas de las distintas biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento. Entre dichas propiedades podríamos citar: i) ii) iii) iv)

Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgánicos como acuosos. Diferencias en tamaño y forma. Diferencias en carga. Diferencias en afinidad por otras biomoléculas.

Todas estas propiedades y, por tanto, la separación de diferentes compuestos están influenciadas por las condiciones del medio de separación, pH, temperatura, fuerza iónica e hidrofobicidad. De forma general, en las técnicas cromatográficas existe una distribución de las moléculas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase móvil que circula sobre la fase estacionaria en íntimo contacto con ésta. Cromatografía de reparto En la cromatografía de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribución diferente entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorción. La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas. Dicho fenómeno se denomina reparto y viene determinado por el coeficiente de reparto, que es la relación entre las concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases. En la cromatografía de reparto tenemos un soporte inerte al que está unida la fase estacionaria líquida. La mezcla a separar junto con la fase móvil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase móvil arrastrará consigo un porcentaje de moléculas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra dependerá de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si éstos son diferentes aquélla también lo será, siendo posible la separación si se utiliza el volumen de 28

eluyente apropiado. En su desplazamiento, las moléculas de soluto se distribuirán no puntualmente, sino formando un área debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fenómenos tales como la difusión. En la cromatografía de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidón, celulosa, gel de sílice, óxido de aluminio, etc. Aunque en teoría se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirá también, en parte, debido a la interacción entre las moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría como fuerza de frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado; éste recubre las partículas del soporte y es retenido por adsorción y/o capilaridad. El espacio entre las partículas del soporte será utilizado por la fase móvil para su desplazamiento. Debemos de tener en cuenta que como fase móvil se suelen utilizar solventes hidrófobos cuando haya que separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la móvil, suele ser por lo general hidrofílica, aunque también pueden utilizarse compuestos hidrófobos. Cromatografía en capa fina En la cromatografía en capa delgada, CCD o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminología inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la CCD, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilización. Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar a la resolución (separación de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentración del compuesto o compuestos de interés en la muestra. Para soluciones concentradas bastará una cantidad muy pequeña (rango de µl) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica. Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de interés. En este caso conviene hacer la aplicación en pequeños volúmenes fraccionarios, no procediéndose a una nueva adición hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicación se haría muy grande, distando mucho de la situación ideal de concentración de la muestra en un solo punto de aplicación). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque cromatográfico) y uno de los extremos (el más próximo a la línea de aplicación) se sumerge en un disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la 29

línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada compuesto, si no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de Rf. La detección de los compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con reactivos específicos, radioisotópicamente, etc. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado. Uno de los factores más críticos en este tipo de cromatografías es la elección de la fase móvil, que, básicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgánico con agua y algunas sustancias adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Además de en una sola dirección, la CCD puede también realizarse bidimensionalmente. En este caso sólo se aplica una única muestra, que se dispone en uno de los vértices de la placa y se eluye dos veces, normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares. La CCD presenta una serie de ventajas respecto a cromatografías alternativas, como es la de papel, tales como las siguientes: i) Una mayor resolución, obteniéndose por lo general manchas más pequeñas. ii) Una mayor velocidad de separación. iii) Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes. iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy simple. La mayor resolución obtenida por CCD se debe a que pueden formarse partículas muy finas del soporte, por lo que la relación superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran área superficial por unidad de longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra que se puede aplicar es mayor y la difusión es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografía en papel es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende a aumentar la difusión de las moléculas. Reacciones coloreadas de aminoácidos Los métodos colorimétricos de determinación de aminoácidos se basan en la reacción específica de éstos con determinados compuestos, dando derivados coloreados. La formación de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no está presente. Para cada prueba se utilizará un control negativo, también denominado blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o solvente adecuado). Aunque en la presente práctica se llevará a cabo la determinación cualitativa de aminoácidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden también ser utilizadas para la determinación cuantitativa de dichas biomoléculas. Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali- y cuantitativa de aminoácidos. Aunque son métodos muy generales, algunos de ellos permiten 30

discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. Así, hay métodos de determinación de aminoácidos con el grupo amino libre (método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos aromáticos (reacción xantoproteica), de los que poseen un grupo indólico (triptófano; reacción con el ácido glioxílico), un anillo fenólico (tirosina; reacción de Millon), de aminoácidos azufrados (cisteina; reacción con nitroprusiato sódico). En todos los métodos, el aminoácido reacciona con otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por espectroscopía visible. De todos los métodos reseñados, el más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina (Figura 1).

Figura 1. Reacción de aminoácidos con la ninhidrina.

La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino está sustituido). El derivado coloreado presenta máximo de absorción en torno a 570 nm. La reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R-CH2-NH2) dan también positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se libera CO2. La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones procedentes de otras técnicas de separación. La presencia de aldehídos resultantes de la degradación de la ninhidrina por reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminoácido.

Materiales y equipo

Reactivos

Gradillas con tubos de ensayo. Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 y 25,0 ml). Propipetas. Micropipetas 1000 uL Puntas

Glutamato. Glicina. Lisina. Prolina. Leucina. Solución problema de aminoácidos.

Probetas (100 y 250 ml). Vasos de precipitado (100 y 500 ml). Frasco lavador con agua destilada (piseta) Recipientes de muestras biológicas de 50 ml. Papel de filtro. Capilares para aplicar muestras. Papel de parafilm.. Pipetas Pasteur de plástico. Guantes de látex. Frascos pulverizadores. Tijeras. Secadora de pelo. Caja de portaobjetos (usados) Agitador de tubos (vórtex) Cámara cromatográfica Frasco atomizador

Etanol. Hidróxido amónico. Silica gel en polvo Ninhidrina

Propósitos 1. 2. 3. 4. 5.

Separar diferentes aminoácidos por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice. Revelar las corridas de aminoácidos mediante la reacción coloreada con la ninhidrina. Calcular el valor de Rf para cada uno de los aminoácidos. Justificar las diferencias en Rf de los distintos aminoácidos. Identificar la naturaleza de aminoácidos desconocidos.

Procedimiento Paso primero Sobre una placa de silicagel de 20 x 20 cm se traza con un lápiz una recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de éste de 2 cm. Sobre esta línea se pone 6 puntos equidistantes entre si y sobre los bordes. ADVERTENCIAS: No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las manos, ya que la contaminaríamos con aminoácidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolígrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marques. Paso segundo En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminoácidos) se aplicarán tres gotas de la solución de aminoácidos y solución problema (un aminoácido en cada punto y en el último la solución problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con mucho cuidado). Se seca con un secador de pelo después de haber aplicado cada gota. Se marca con lápiz, y en el extremo opuesto de la placa, algún indicativo del grupo que realiza la cromatografía. Paso tercero Se añade a la cámara cromatográfica eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que éste alcance la zona de aplicación de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se deja desarrollar la cromatografía hasta que el eluyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (2-3 h aproximadamente). 32

ADVERTENCIA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es tóxico. Paso cuarto Terminada la cromatografía se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se rocía con un atomizador que contiene la solución reveladora (en la campana de gases). La placa se secará haciéndole llegar aire caliente con el secador. ADVERTENCIA: Esta operación debe de hacerse en la campana extractora de gases. Cuestionario 1. Explica la diferencia entre cromatografía de partición (de reparto) y cromatografía de adsorción 2. Explica la importancia que tiene la polaridad del eluyente con respecto a los compuestos que se desean separar 3. ¿Cuales son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa delgada? 4. ¿Qué otros agentes reveladores a parte de la ninhidrina son de uso común en la cromatografía de capa fina? 5. Describe a detalle el principio de funcionamiento de las siguientes cromatografías: a. Cromatografía en columna b. Cromatografía de gases c. HPLC

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FIRMAS

FECHA

ALUMNO

DOCENTE

Referencias •

Smith I, Feinberg JG (1965) “Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis”. Shandon Scientific Company Ltd. Desarrollo histórico de la técnica y aplicaciones.

•

Bermúdez A, Bernal J, Espinosa E, Cornejo W, Briceño I, Prieto JC, Arrieta L Propuesta para un protocolo de diagnóstico de homocistinuria.

Notas al estudiante:

ANEXO 1: SOLUCIONES 33

1. Soluciones de los distintos aminoácidos (glutamato, glicina, lisina, prolina y leucina) al 1% Solución de aminoácido al 1 % 100 ml Aminoácido 1g n-Propanol 10 ml Agua destilada Hasta 100 ml

2. Solución eluyente 2.1. Solución de hidróxido amónico al 34 % Solución de hidróxido amónico 100 ml Hidróxido amónico 34 g Agua destilada Hasta 100 ml

2.2. Solución eluyente (etanol: hidróxido amónico, en una proporción 7:3) Solución de eluyente 200 mL 210 mL 90 mL

Etanol Solución de hidróxido amónico

3. Solución reveladora (se prepara el día de uso) Solución de ninhidrina Ninhidrina Agua destilada

100 ml 0,2 g Hasta 100 ml

Practica 5: Cuantificación de Proteínas I: Elaboración de curva patrón Introducción La luz es una forma energética que presenta un comportamiento tanto de partícula como de onda. En éste último comportamiento, puede ser clasificada de acuerdo a su longitud de onda dentro del espectro electromagnético (Fig. 1).

Fig. 1. Clasificación de la luz dentro del espectro electromagnético.

La luz con una longitud de onda corta, entre 200 nm y 400 nm se conoce como ultravioleta, mientras que aquella que posee una longitud de onda más larga, entre 700 nm y 900 nm se conoce como luz infrarroja cercana. La luz con longitudes de onda de entre los 400 nm a los 700 nm contempla el rango de luz de diferentes colores visible al ojo humano. ¿Qué ocurre cuando una radiación electromagnética atraviesa la materia? Si la radiación tiene energía adecuada con la estructura de la materia, ésta última podrá absorberla. La medición de la cantidad de luz absorbida puede ser usada para detectar, identificar moléculas y medir su concentración en solución. Esta medición se basa en la Ley de LambertBeer o simplemente Ley de Beer. Esta ley establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida por la sustancia, o inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida por la sustancia. Considérese un rayo de energía radiante con una intensidad inicial Io que se hace pasar a través de una celda de vidrio cuadrada contiendo una solución homogénea de una sustancia que absorbe luz de cierta longitud de onda (Fig. 2).

Fig 2. Transmisión de energía radiante a través de una celda de vidrio, donde Io representa la intensidad de la luz incidente e l1 representa la intensidad de luz transmitida

La intensidad de la energía radiante transmitida I1 es menor a la intensidad inicial lo debido precisamente a que la solución fue capaz de absorber cierta cantidad de energía radiante. La transmitancia para un compuesto en solución es definida como la proporción de luz incidente que es transmitida (T):

Esta proporción generalmente es expresada como un porcentaje de la siguiente forma:

El concepto de transmitancia es importante porque solo la luz transmitida, absorbida, puede ser medida directamente en el laboratorio.

no la

Conforme la concentración del compuesto en solución aumenta, más luz será absorbida por el mismo y por lo tanto menos luz será transmitida. El porcentaje de transmitancia (%T) varía de forma inversa y logarítmica con respecto a la concentración (Fig. 3B). A esta relación se le llama absorbancia o A. La relación entre absorbancia (A) y Transmitancia (T) es la siguiente:

( ) ( ) Para convertir T en %T, tanto el denominador como el numerador deben ser multiplicados por 36

100:

(

)

(

) (

( )

)

Ec. (1)

Mediante esta transformación matemática se obtiene entonces una relación entre la absorbancia y el porcentaje de transmitancia. En el laboratorio, una vez determinado el porcentaje de transmitancia, éste se transforma a absorbancia, la cual, según la ley de Beer es directamente proporcional a la concentración de una sustancia, como se observa en la Figura 3A. La mayoría de los instrumentos utilizados hoy en día para estas determinaciones, llamados espectrofotómetros, realizan esta conversión automáticamente, de forma tal que el valor reportado es la absorbancia, no la transmitancia.

Fig. 3. A) Representación gráfica de la relación que existe entre la absorbancia (A) y la concentración de un analito, según lo establece la ley de Lambert-Beer. B) Representación grafica de la relación que existe entre la concentración de un analito y el porcentaje de transmitancia (%T).

La mayoría de las sustancias a cuantificar en bioquímica no poseen color. Por lo tanto es necesario acoplar algún tipo de reacción química que involucre la aparición o desaparición de un cromógeno con la sustancia a cuantificar. Generalmente se escogen cromógenos cuyo coeficiente de absortividad molar sea alto ya que mayor será la absorbancia a medir y por tanto la técnica tendrá mayor sensibilidad. El siguiente paso es corroborar bajo qué condiciones se cumple la ley de Beer, es decir cuál es la longitud de onda apropiada para realizar las mediciones y qué concentraciones son las adecuadas. Para ello se determina la absorbancia de la sustancia en cuestión a diferentes concentraciones. Las soluciones de concentración conocida que se preparan para este propósito se conocen como patrones o estándares. La relación absorbancia versus concentración debe generar un gráfico que demuestre una línea recta cuyo intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas es cero (Figura 3A). Una vez que se ha realizado este paso se puede entonces determinar la concentración de una solución midiendo su absorbancia y despejando dicho valor en la ecuación de la recta. 37

La ley de Beer es una relación matemática ideal que contiene ciertas limitaciones. Desviaciones de la misma, es decir circunstancias en las cuales la relación entre la absorbancia y la concentración de una muestra no es lineal pueden ocurrir cuando: 1. La concentración de la solución a medir es muy elevada. 2. La luz incidente no es monocromática. 3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a la sustancia en solución que se desea medir. 4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar. 5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos. 6. Mezcla de varias especies químicas que absorben luz de la misma longitud de onda: las especies “competirán” entre sí por la luz, cada una con diferente absortividad. Cada uno de los puntos mencionados anteriormente puede evitarse haciendo un uso correcto del espectrofotómetro como se enseñará en la práctica de laboratorio de hoy, además de una buena aplicación de la teoría de la ley de Beer en la práctica. En el caso del punto uno, la mejor forma de evitar esta situación es diluyendo la muestra a cuantificar. En el caso del punto dos, es necesario tener una buena fuente de energía radiante. La mayoría de los instrumentos de buena calidad la poseen hoy en día. Para el punto tres, es necesario corroborar que la cantidad de luz absorbida por el solvente no es significativa. Para ello, se debe utilizar cada vez que se hace una determinación espectrofotométrica el blanco reactivo. El blanco reactivo es una muestra más que contiene todos los componentes utilizados para la determinación (por ejemplo agua, reactivo, etc) excepto el compuesto a medir (ver sección de procedimiento). La cantidad de luz transmitida por este blanco no debe ser detectada por el aparato. Para ello, el espectrofotómetro se ajusta manualmente de forma tal que esta cantidad de luz no sea medida. Este procedimiento se conoce comúnmente como “calibración del cero”, es decir, la cantidad de absorbancia del blanco es reconocida o cuantificada como cero por el aparato. En el caso del punto cuatro, es necesario asegurarse de que no existan otras fuentes de luz cercanas cuando se hace la medición. Para evitar la situación expuesta en el punto cinco, se deben utilizar celdas certificadas, las cuales son hoy en día fáciles de conseguir a un precio razonable. Por último, para evitar el aspecto mencionado en el punto seis, es necesario asegurarse de que el compuesto a medir se encuentre en solución de forma pura o en presencia de otros compuestos que no absorben a la misma longitud de onda. Es también imprescindible recordar que si se hacen mediciones en el rango de luz ultravioleta es necesario utilizar celdas de cuarzo, ya que el vidrio absorbe luz a esas longitudes de onda. Las proteínas son una clase importante e insustituible de macromoléculas celulares presentes en todos los organismos vivos. En consecuencia, la importancia para medir sus concentraciones es vital para la biotecnología. Son las macromoléculas más versátiles de los sistemas vivos y desempeñan funciones cruciales en prácticamente todos los procesos biológicos. Funcionan como catalizadores, que transportan y almacenan otras moléculas como el oxígeno, proporcionan apoyo mecánico y 38

protección inmunológica, generan el movimiento, transmiten impulsos nerviosos, y controlan el crecimiento y diferenciación celular. Varias propiedades clave de las proteínas les permiten participar en esta tan amplia gama de funciones: 1. Las proteínas son polímeros lineales construidos de unidades monoméricas llamadas aminoácidos. Notablemente, las proteínas se pliegan en forma espontánea en estructuras tridimensionales que son determinadas por la secuencia de aminoácidos en la proteína polimérica. 2. Las proteínas contienen una amplia gama de grupos funcionales. Estos grupos funcionales incluyen alcoholes, tioles, tioéteres, ácidos carboxílicos, carboxamidas, y una variedad de grupos de base. Cuando se combinan en varias secuencias, este conjunto de grupos funcionales determina el amplio espectro de la función de la proteína. Por ejemplo, la reactividad química asociada con estos grupos es esencial para el funcionamiento de las enzimas (las proteínas que catalizan reacciones químicas). 3. Las proteínas pueden interactuar entre sí y con otras macromoléculas biológicas para formar conjuntos complejos. Estos complejos son las máquinas macro-moleculares que llevan a cabo la réplica exacta de DNA, la transmisión de señales dentro de las células, y muchos otros procesos esenciales. 4. Algunas proteínas son muy rígidas, mientras que otras muestran una flexibilidad limitada, pueden funcionar como elementos estructurales en el citoesqueleto (el andamiaje interno dentro de las células) o en el tejido conectivo. Las partes de las proteínas con una flexibilidad limitada puede actuar como bisagras, resortes o palancas que son cruciales para la función de la proteína. Un método para cuantificar proteínas es el desarrollado por Biuret y colaboradores. La reacción de Biuret involucra un agente que contiene iones de cobre (Cu ++) en solución alcalina. Las moléculas que contienen 2 o más enlaces peptídicos se pueden asociar a los iones de cobre para formar un complejo de coordinación organometálico que imparte un color púrpura azulado a la solución (Fig. 4). Tal complejo absorbe a 540 nm y puede ser cuantificado con un espectrofotómetro.

Fig. 4. Complejo de coordinación tetravalente formado por las proteínas en presencia del reactivo de Biuret.

Materiales y equipo

Reactivos

2 Matraces erlenmeyer de 100 ml. 2 Vasos de precipitados de 100 ml. 5 Matraces volumétricos de 10 ml. 2 Pipetas volumétricas de 2 ml. 1 Perilla. 1 Espectrofotómetro. 2 Celdas para espectrofotómetro.

Reactivo de Biuret Albunima de suero de bovino

Propósitos 1. Aprender el método espectrofotométrico (Biuret) para la cuantificación de proteína total en muestras biológicas. 2. Cuantificar el contenido de proteínas en diferentes muestras biológicas 3. Desarrollar habilidad en el manejo de muestras biológicas Procedimiento Preparar 100 ml de una solución de albumina al 2% (solución concentrada)   

Pesar 2 g de albumina en la balanza analítica y agregar a un matraz a forado de 100 ml Agregar 50 ml de agua destilada y agitar hasta disolver completamente Aforar

Preparación de las diluciones seriadas Preparar 5 diluciones seriadas 1:2 a partir de la solución concentrada Primera dilución (1:2) 

Tomar 5 ml de la solución concentrada y transvasar a un matraz de 10 ml, aforar.

Segunda dilución (1:4) 

Tomar 5 ml de la solución 1:2 y transvasar a un matraz de 10 ml, aforar.

Tercera dilución (1:8) 

Tomar 5 ml de la solución 1:4 y transvasar a un matraz de 10 ml, aforar.

Cuarta dilución (1:16) 

Tomar 5 ml de la solución 1:8 y transvasar a un matraz de 10 ml, aforar.

Quinta dilución (1:32) 

Tomar 2 ml de la solución 1:625 y transvasar a un matraz de 10 ml, aforar.

Calcular la concentración de las diluciones y llenar la siguiente tabla 40

Dilución Sol concentrada 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32

[proteina] (%) 2

[proteína] (mg/ml) 20

[proteína] (g/L) 0.2

Lectura en el espectrofotómetro Preparación del blanco 

En un tubo de ensaye mezclar 2 ml de reactivo de biuret más 1 ml de agua destilada



Agitar con el vortex y esperar 5 minutos



Ajustar la absorbancia a cero en 540 nm con este blanco

Preparación de los estándares •

En 6 tubos diferentes (del 1 al 6), agregar 2 ml de reactivo de biuret y 1 ml de la solución concentrada y de cada dilución.

•

Agitar con el vortex y esperar 5 minutos

•

Leer a 540 nm

•

Realizar por triplicado # tubo 1 2 3 4 5 6

Dil. Conc 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32

Abs 1

Abs 2

Abs 3

Abs prom

[proteína] (mg/ml)

Graficar [proteína] vs. Abs (Abs x) y realizar la regresión lineal. Cuestionario 1. Escribir la ecuación de regresión, compárala a la de los otros equipos. 2. ¿Qué representa la variable y? 3. ¿Qué representa la variable x? 4. ¿Cuál sería la absorbancia de un solución cuya concentración de proteína fuera 1.5 mg/ml? 5. Investiga cual es la linealidad y sensiblilidad del método.

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Referencias 窶｢

Stryer L. Biochemistry. Protein Structure and function. Edit. W.H. Edit. Freeman and Company, 5a Ediciﾃｳn.

窶｢

Walker J.M. The Protein Protocols Handbook. The Lowry Method for Protein Quantitation. Edit. Humana Press 2002.

Notas al estudiante:

Practica 6: Cuantificación de Proteínas II; Muestras problema Introducción Las proteínas son una clase importante e insustituible de macromoléculas celulares presentes en todos los organismos vivos. En consecuencia, la importancia para medir sus concentraciones es vital para la biotecnología. Son las macromoléculas más versátiles de los sistemas vivos y desempeñan funciones cruciales en prácticamente todos los procesos biológicos. Funcionan como catalizadores, que transportan y almacenan otras moléculas como el oxígeno, proporcionan apoyo mecánico y protección inmunológica, generan el movimiento, transmiten impulsos nerviosos, y controlan el crecimiento y diferenciación celular. Varias propiedades clave de las proteínas les permiten participar en esta tan amplia gama de funciones:

1. Las proteínas son polímeros lineales construidos de unidades monoméricas llamadas aminoácidos. Notablemente, las proteínas se pliegan en forma espontánea en estructuras tridimensionales que son determinadas por la secuencia de aminoácidos en la proteína polimérica. 2. Las proteínas contienen una amplia gama de grupos funcionales. Estos grupos funcionales incluyen alcoholes, tioles, tioéteres, ácidos carboxílicos, carboxamidas, y una variedad de grupos de base. Cuando se combinan en varias secuencias, este conjunto de grupos funcionales determina el amplio espectro de la función de la proteína. Por ejemplo, la reactividad química asociada con estos grupos es esencial para el funcionamiento de las enzimas (las proteínas que catalizan reacciones químicas). 3. Las proteínas pueden interactuar entre sí y con otras macromoléculas biológicas para formar conjuntos complejos. Estos complejos son las máquinas macro-moleculares que llevan a cabo la réplica exacta de DNA, la transmisión de señales dentro de las células, y muchos otros procesos esenciales. 4. Algunas proteínas son muy rígidas, mientras que otras muestran una flexibilidad limitada, éstas pueden funcionar como elementos estructurales en el citoesqueleto o en el tejido conectivo. Las partes de las proteínas con una flexibilidad limitada pueden actuar como bisagras, resortes o palancas que son cruciales para la función de la proteína. Un método para cuantificar proteínas es el desarrollado por Biuret y colaboradores. La reacción de Biuret involucra un agente que contiene iones de cobre (Cu ++) en solución alcalina. Las moléculas que contienen 2 o más enlaces peptídicos se pueden asociar a los iones de cobre para formar un complejo de coordinación organometálico que imparte un color púrpura azulado a la solución (Fig. 1). Tal complejo absorbe a 540 nm y puede ser cuantificado con un espectrofotómetro.

Fig. 1. Complejo de coordinación tetravalente formado por las proteínas en presencia del reactivo de Biuret.

Materiales y equipo

Reactivos

1 Micropipeta de 1 ml Puntas de para micropipeta de 1 ml 10 tubos de ensayo de 5 ml 1 gradilla 1 tubo para extracción de sangre humana sin anticoagulante (rojo) 1 tubo para extracción de sangre humana con anticoagulante (morado o azul) 1 equipo de extraccion vacutainer Papel filtro watman # 40 Estufa de incubación 1 Embudo Buchner 1 Matraz kitazato 1 Soporte universal 1 pinzas de tres dedos 1 Bomba de vacio 1 Centrifuga con velocidad de 3500 rpm 1 Piseta con agua destilada

Reactivo de Biuret Leche Suero humano Plasma humano Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 20% NaOH 1M HCl 1 M Cultivo de E.coli en caldo Cultivo de S. cerevisiae en caldo Cultivo de Penicillium sp en caldo

Propósitos 

Aprender el método espectrofotométrico proteína total en muestras biológicas.



Cuantificar el contenido de proteínas en diferentes muestras biológicas



Desarrollar habilidad en el manejo de muestras biológicas

Procedimiento •

Extracción del suero y plasma humano

(Biuret)

para la cuantificación

•



Solicitar al instructor realice la punción necesaria para la extracción de sangre total de un voluntario en el equipo, las muestras se deben recolectar en los tubos con y sin anticoagulante (rojo y morado).



Esperar a que la muestra sin anticoagulante (rojo), coagule durante 15 min.



Centrifugar ambos tubos a 3500 rpm



Separar el plasma (sobrenadante del tubo morado) y el suero (sobrenadante del tubo rojo) del paquete celular en dos diferentes tubos y rotular.

Extracción de proteína de cultivos celulares 

24 horas antes de la practica  Pesar un disco de papel watman # 40 y registrar el peso.  Montar un sistema de filtración al vacío como se muestra en la Fig. 2  Filtrar todo el contenido del tubo de cultivo.  Lavar 3 veces con agua destilada.  Recuperar el filtrado y secar durante 24 horas a 100° C  Pesar la muestra.  Con ayuda del peso del papel calcular el peso seco de la muestra.

Fig.2 Aparato para filtración al vacío

El día de la práctica         •

Lectura en el espectrofotómetro  

A la masa seca obtenida en el punto anterior, agregarla en un tubo de 5 ml y adicionar 1 ml de HCl 1 M e incubar por 5 minutos a 100°C Agregar 1 ml de NaOH 1 M y agitar en el vortex Agregar 1 ml de SDS (Dodecil sulfato de sodio) al 20% y agitar con el vortex Llevar a ebullición por 5 min Centrifugar a 13,000 rpm Recolectar el sobrenadante en otro tubo de 5 ml Filtrar si el sobrenadante no es transparente Recolectar el filtrado o sobrenadante y rotular

Prepara el blanco con 2 ml de reactivo de Biuret y 1 ml de agua destilada Calibrar a cero el equipo con el blanco

 

En un tubo para cada muestra, tomar 2 ml de Rectivo de Biuret y mezclarlo con 1 ml de muestra (plasma, suero o extracto celular) agitar con el vortex y esperar 5 min. Leer la absorbancia de cada muestra y registrar.

Cuestionario 1.

Con ayuda de la ecuación de regresión de la práctica anterior, calcula la concentración de proteína presente en cada muestra.

¿Existe diferencia entre la cantidad humano? Explica tu respuesta.

Expresa el contenido de proteína en las siguientes unidades: a. mg/ml b. mg/L c. g/L d. %

4. ¿Existe diferencia entre el contenido filamentosos? Explica tu respuesta. 5. Con estos resultados calcula microorganismos en peso seco.

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de proteína presente en el suero y plasma

de proteína entre bacterias, levaduras y hongos

el porcentaje

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de proteína

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Stryer L. Biochemistry. Protein Structure and function. Edit. W.H. Edit. Freeman and Company, 5a Edición.

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Notas al estudiante:

Practica 8: Cinética Enzimática Introducción La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad de la enzima. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad. Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que rige la acción enzimática. Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Para cada una de las curvas de avance de reacción así obtenidas se calcula la v0 (la pendiente de la curva). Posteriormente, se representa la velocidad inicial frente a la concentración inicial de sustrato (v0 frente a [S]0). Se observa que cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden con respecto al sustrato. A altas [S]0, la enzima se encuentra saturada por el sustrato, es decir, todos los centros activos están ocupados, y un incremento en [S]0 no se traduce en un incremento de la velocidad. En este punto, la reacción es de orden cero con respecto al sustrato, y la velocidad es máxima (Vmax). Materiales y equipo

Reactivos

6 Erlenmeyer 250 mL 2 Vasos de precipitados altos de 100 mL Pipeta graduada de 25 mL

Urea Soluciones para calibración de pHmetro; pH 4.0 y pH 7.0

Pipeta automática de 200 µL (0.2 mL) Probeta de 100ml Conductímetro Termómetro de -2 a 50 °C pHmetro Parrilla con agitación Agitador magnético

Disolución de Ureasa en Glicerol 50%, 1000 U/ml 500 ml de NaOH 0.2 M 500 ml de HCl 0.2 M 2 pisetas

Propósitos 1. Construir la gráfica típica de una cinética enzimática a partir de datos experimentales 2. Obtener las velocidades catalíticas de la ureasa con a diferentes concentraciones 3. Obtener las constates cinéticas Km y V max de la ureasa a 50°C y pH 7.2 Procedimiento 1.

Preparar disoluciones de urea con arreglo al siguiente esquema: Erlenmeyer 1 2 3 4 5 6

Disolución 1 2 3 4 5 6

[S] = Concentración (%) 0.4 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125

Preparació 0.4 g urea n+ 100 ml H2O 50 ml Disolución 1 + 50 ml H2O 50 ml Disolución 2 + 50 ml H2O 50 ml Disolución 3 + 50 ml H2O 50 ml Disolución 4 + 50 ml H2O 50 ml Disolución 5 + 50 ml H2O

2. Colocar 40 ml de la disolución 1 en un vaso de precipitados, ajustar el pH a 7.2 y la temperatura a 50°C. 3.

Añadir una barra magnética, colocar el vaso en el agitador e introducir el electrodo del conductímetro.

Añadir 0.2 ml de disolución de ureasa.

Medir la conductividad de la disolución a los tiempos marcados en la tabla.

Repetir la operación con todas las disoluciones.

Ejercicio 1.- Rellenar todas las casillas de la siguiente tabla: tiempo (s) 0 15 30 45 60 90

C = Conductividad (u. a.)

120 150 180 210 240 Para calcular V (Velocidad inicial de la reacción), representar C frente a t, trazar una tangente en el origen y calcular su pendiente. Hacer esto para todas las concentraciones y anotar los valores en las casillas correspondientes

[S]

0.4

0.2

0.1

0.05

0.025

0.0125

V 1/[S] 1/V

Cuestionario 1. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de catálisis (reacción) de una enzima? 2. ¿Como afectan estos factores la velocidad de catálisis de una enzima? 3. Explica que es el sitio activo de una enzima 4. ¿Que es una enzima alostérica y como se regula? 5. Menciona y explica al menos 3 estrategias catalíticas que utilizan las enzimas

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Stryer L. Biochemistry. Protein Structure and function. Edit. W.H. Edit. Freeman and Company, 5a Edición.

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Notas al estudiante:

Nuestra Ciencia comparada con la realidad sigue siendo primitiva e infantil, y sin embargo, es lo mejor que tenemos. Albert Einstein