Livro fitoquimica experimental0001 by Alice Fischer

F.J.Abreu Matos

Universidade Federal do Ceará

Reitor Raimundo Hélio Leite

Introdução à Fitoquímica Experimental

EDIÇÕES UFC Editor Ivonete Maia Chefe/Divisão editorial SJ1vioJesuino Costa Revisão Escolástico Pereira Limão Leonora Vale de AIbuquerque Roberto Cunha Lima Capa

AIberon Soares Composição, Impressão e Acabamento Imprensa Universitária Fortaleza - Ceará

1988 Impresso no Brasil Printed in Brazil

~~ \}fg(fJf?(Ç Fortaleza

1988

INTRODUÇÃO

À FITOQUI'MICA

EXPERIMENTAL

F. J. ABREU

MATOS

Texto preparado para a disciplina Isolamento e Purificação de Substâncias Orgânicas Naturais do Curso de Pós-Graduação em Química do Departamento de Química Orgânica e Inbrgânica do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará.

FORTALEZA

M 425i Matos, F.J. Abreu I ntrodução a F itoqu(mica Edições UFC 1988

128p. -IJust. 1 - Fitoquímica. I. Título. CDO: 514.192

Experimental.

Fortaleza

Introdução

A parte da química orgânica que trata do estudo das estruturas moleculares e da química dos compostos produzidos pela atividade celular dos seres vivos é. extremamente ampla e diversificada. Os compostos resultantes do metabolismo primário, glicídios, protídios e lipídios, são estudados, principalmente, no âmbito da bioqUl'mica. Os produtos do metabolismo secundário, compostos terpênicos, alcalóides, glicosídios etc, são estudados no âmbito do que se convencionou denominar química de produtos naturais. A química de produtos naturais tem por objetivo imediato o esclarecimento e registro dos constituintes resultantes do metabolismo secundário dos seres vivos, através de seu isolamento e elucidação de suas estruturas moleculares. Embora compreenda, assim, o estudo de composição química de animais e v~getais, é no campo da fitoquímica que se encontra o maior número de trabalhos experimentais publicados. A importância científica das pesquisas desenvolvidas nesta área se traduz tanto pelos resultados obtidos com a consecução de seus objetivos imediatos (são conhecidos hoje milhares de compostos naturais) como pela aplicação imediata ou mediata destes resultados a outras áreas científicas correlatas. O crescente desenvolvimento de novas técnicas analíticas, como a cromatografia, e o constante aperfeiçoamento dos instrumentos de análise espectrométrica têm na química de produtos naturais, ao lado da bioquímica, sua principal força motora. Uma das principais aplicações destes estudos se encontra no âmbito das ciências farmacêuticas, responsáveis pela criação e produção de novos medicamentos. Embora a importância dos medicamentos de origem vegetal seja freqüentemente subestimada, numerosas substâncias deste tipo fazem parte

do arsenal terapêutico d;] Ilwdicillol do ~,(!cLJloXX, Ilutina, papaínil, morfina, code ína, pi local'pi na, ;IIIOplllil, Il!SI!I'Ilna, el~Jonovi 11<1, d-tubocurarina, digitoxina, vincaleLJcohla:;lilla, vlnCII',IJJla, vlllcamina, atropina etc, são apenas algumas delas enlll' nllJi Ias, Grande nt'tr""I" di: slIbsl'lnc;as de origem vegetal entra na composição da maiOl ia das I (!CI,j Ias Inl~dicas, Na década de setenta, 41 % das receitas médicas nos [slados Unidos continham uma ou mais destas substâncias (1). Numerosos oulros compostos naturais se constituem em precursores de síntese de valiosas suhstÜncias, como é o caso de sapogeninas extraídas dos carás (Diosr:olm spp) ou do sisal (Agave spp) que são usadas como matéria-prima para síntese de hormônios e anticoncepcionais.

o isolamento e a caracterização de todas estas substâncias podem se constituir em tarefas relativamente simples mas, muitas vezes, exigem do pesquisador, além dos conhecimentos específicos, boa dose de imaginação, raciocínio e paciente esforço. Embora isto tenha sido por um lado, o est(mulo propulsor das idéias criativas neste campo, pode, por outro lado, tornar o trabalho experimental muito complicado e enfadonho, especialmente para o principiante que não disponha de um roteiro que lhe possa servir de guia geral. A metodologia de isolamento, purificação e caracterização de substâncias naturais micromoleculares de plantas, está distribuída nas cinco partes que à fitoquímica experimental. Na primeira parte é formam esta introdução apresentado um roteiro geral para orientação do estudo qu (mico de plantas, desde o trabalho de seleção, coleta e identificação das plantas, até a determinação das estruturas dos constituintes isolados, contendo, ainda, uma lista das principais fontes de consulta bibliográfica. Na segunda parte é discutido, minuciosamente, um processo de prospecção qualitativa para vinte e oito tipos de constituintes qu(micos que podem ser encontrados nos extratos de plantas, denominado abordagem fitoqu(mica. Na terceira parte é feita uma introdução ao conhecimento e à aplicação da cromatografia no estudo qu(mico de plantas e a descrição da técnica de fracionamento de misturas conhecida pela denominação de marcha qUl'mica. Na quarta parte se descreve um roteiro apresentado como guia das operações de isolamento dos principais constituintes qu(micos dos extratos de plantas. Na quinta parte, foram reunidas as descrições de quatorze técnicas selecionadas dentre as mais empregadas no estudo qu(mico de plantas. Um apêndice contendo instruções sobre a técnica de preparação de exsicatas das plantas e uma relação dos reagentes e soluções mais freqüentemente usados; na execução da técnica de abordagem fitoquímica encerra., o texto apresentado.

Sumário

ROTEI RO GERAL

PARA O ESTUDO QUI'MICO DAS PLANTAS

...

A escolha A identificação botânica A prospecção preliminar O isolamento e a purificação de substâncias naturais A determinação estrutural de constituintes naturais A pesquisa bibliográfica Referências ABORDAGEM FITOQUI'MICA ROTEIRO QU(MICOS Operações

SEQUENCIAL DE EXTRATOS

DE PROSPECÇÃO DE PLANTAS -

1~ 16 18 21 23 24 27 29 DE

CONSTITUINTES

preliminares

35 .

Prospecção de constituintes do extrato hidroalcoólico

Testes para fenois e taninos Testes para antocianinas e antocianidinas Teste para flavonóides Teste para esteróides e triterpenóides Teste para saponinas Teste para ácidos fixos fortes Teste para resinas Teste para alcaloides Teste para bases quaternárias Metilação de ácidos (BF3) Teste para quinonas Teste para antranóis Teste para comarina Teste para agliconas esteróides e terpenóides

. . . ; . . . . .

. . . . .

Prospecção dos constituintes do extrato em solvente lipofílico

Teste para alcalóides

37 39 39 39 39

45 45 47 47 47 50 50 51 51 53

53 55 55

Teste para ácidos fixos fortes Teste para ácidos fixos fracos e IUIlÓi~ Prospecção dos consliluinll!s d" extraIu lipulílico Obtenção dos ésteres mel (Iiem Teste para glicerinil Figura 1 __ Figura 2

Ir II I

ilpÓ5

hidrólise "

57 57 58 61 61 62

Fi!lura J F i!J1lI a ti

63 64 65

H(dori\l1ela~

""*NOÇOLS GEHAIS DE CROMATOGRAFIA Tipm de eromatografia F:lJlleionarnentos do sistema cromatográfico . Clomatografia de adsorção Diagramas de isotermas de adsorção Adsorventes e eluentes - Gráfico para seleção de sistemas Parâmetros para seleção de sistemas cromatográficos Referências

" ,

67 70 71 74 76 77 79 80

ISOLAMENTO DE CONSTITUINTES QUIMICOS DE EXTRATOS DE PLANTAS ,

Operações de fracionamento - Coluna filtrante Marcha qu ímica para substâncias orgânicas contidas em misturas

84 87

.~ TÉCNICAS USADAS NAS OPERAÇÕES DE FRACIONAMENTO

. Técnica 2 - Cromatografla analltlca (Técnica normal) Anexo a Técnica 2 - Série eluotrópica . Técnica 3 - Cromatoplana preparativa (Técnica normal) .\ •.' Técnica Técn~ca 41 - Cromatografia Desadsorção .seletiv? .(Coluna de adsorção em~iltrante) coluna '-éTécnica 5 - Cromatografia em coluna com gradiente de eluição Técnica 6 - Cromatografia de adsorção em coluna a média pressão Técnica 7 - Filtração em gel para solventes orgânicos hidrofílicos Técnica 8 - Cromatograma - Diagrama concentração/volume dos eluatos Técnica 9 - Determinação do volume morto da coluna cromatográfica. Técnica 10 - Acetilação com anidrido acético - acetato de sódio (para !".•. ..Polihidroxilados) Técnica 11 - Acetilação com anidrido acético - piridina Técnica 12 - Análise de óleos fixos de sementes Técnica 13 - Metilação de ácidos graxos com BF3 - metanol , Técnica 14 - Metilação com diazometano Técnica 15 - Preparação de N·nitroso-N-metil-uréia Técnica extra - Herborização de plantas REAGENTES MAIS UTIÜZADOS NA ABORDAGEM FITOQUIMICA

94 98 99

(NDICE REMISSIVO

93 101 102 104 107

107 108 109 110 110 111 112 113 117

119

123

Roteiro Geral para o Estudo Químico das Plantas

o estudo químico das plantas pode ser desenvolvidO,de modo geral, em seis etapas principais e complementares. São elas: 1. 2. 3. 4. 5.

a escolha da planta a ser estudada; a identificação botânica da planta escolhida; a prospecção preliminar de sua composição química; o isolamento e a purificação dos constituintes principais; o esclarecimento da estrutura molecular dos compostos puros e isolados (determinação estrutural); 6. o levantamento das referências bibliográficas sobre a espécie identificada e suas congêneres.

A execução de cada uma destas etapas envolve técnicas adequadas e apresenta dificuldades que precisam ser cuidadosamente superadas para que se alcance, com êxito, o objetivo final. "A ESCOLHA

A escolha do material a ser estudado sofre a natural dificuldade de se eleger algo dentro de. um conjunto muito grande. Em fitoquímica, isto pode significar escolher um em oitocentos e cinqüenta mil, isto é, o número de espécies vegetais estimado por Farnsworth (1) há uma década. Este número abrange as espécies distribuídas nas classes compreendidas no quadro que se segue: 13

QUADRO

1\ tl1lcuira em importância é a Mata Temperada encontrada na região Sul

Distribuição Quantitativa das Espécies nas Diversas Classes do Reino Vegetal. -------.-----.--.,.-----------------------------------

dll pul\ I\brange os estados de São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio lil Ul1dn do Sul e sua área de 1 200 000 Km2 se estende por toda a Serra do

ESPERMATOFITAS

TALOFITAS

MÓI

HlCa

1'"111<1\101110

em pteridófitas e monocotiledôneas, pinheiro brasileiro.

tem como planta típica de sua

700

Bactérias Fungos Algas Liquens Briófitas Pteridófitas

1500 100000 19000 20000 14000 10000

Gimnospermas Angiospermas Monocoti ledôneas Dicotiledôneas

200000 500000

Sub total

154000

Sub total

700700

Total de espécies

855200

Sugue-se em ordem decrescente de área a Caatinga, vegetação típica da parte do Nordeste. A grande maioria de suas árvores, geralmente de pllquono porte, e a totalidade de arbustos e ervas perdem suas folhas no pm (ouo de estiagem. Desoladora, inóspita e hostil paisagem, que se transmuda «11I1 ospetáculo verde multiflorido logo após o início da estação chuvosa. (h:upa cerca de 1 000 000 Km2 e é muito rica em espécies medicinais e IIIát icas. IIIUtor

11 I ()

FONTE: Farnsworth, N. R. - J. Pharm. Sci., 55 (3), 225-275, 1986.

A região da Mata Atlântica vem a seguir. E formada por densa floresta de ('spécies variadas que ocupa cerca de 500 000 Km2 I formando uma faixa vorde paralela à costa brasileira, desde o estado do Rio Grande do Sul até a Paraíba, no Nordeste do Brasil.

Considerando-se que cada espécie é formada de um conjunto de milhões de indivíduos cujas naturais variações biológicas atingem, em maior ou menor grau, tanto sua morfologia quanto a composição química, o problema da escolha de um critério de prioridade de estudo apresenta difícil solução. Grande número destas espécies está disperso pelas diferentes regiões florísticas, em todo o território nacional, formando sua cobertura vegetal. Progressivamente, no entanto, esta cobertura vem cedendo lugar às crescentes formações urbanas, campos agrícolas e áreas devastadas pela exploração irracional destes recursos naturais, muitas delas, hoje já em franco processo de desertificação.

Além destas cinco regiões principais, há ainda cerca de 300 000 Km2 do território brasileiro cobertos de outros tipos especiais e menos extensos de vegetação. Os Cocais, principalmente nos estados do Maranhão, Piau í, Ceará e Bahia, onde se destacam o babaçu, a carnaúba e o uricuri, entre outras_ palmeiras, por suas grandes formações. A região dos Manguesais ao longo do litoral, a região dos Campos Rupestres de Minas Gerais e Goiás, das Campinas (Pampa) do Rio Grande do Sul, o Pantanal de Mato Grosso, os Charcos e Brejos de vegetação própria e característica e, finalmente, a vegetação das praias arenosas e das dunas do litoral (2).

Segundo Jolly (2) a principal região florística é, por sua exuberância, a Hiléia Amazônica, que ocupa no Brasil cerca de 3 400 000 Km2, abrangendo os estados do Acre, Amazonas, Pará, parte do Mato Grosso (parte norte) e os territórios do Amapá, Roraima e Rondônia. Nela predominam as grandes árvores características da floresta tropical úmida. E considerada o grande repositório das plantas medicinais. A seguir, em extensão, vem a região dos Campos Cerrados ou simplesmente o Cerrado, forma de vegetação típica do planalto central do CentroOeste brasileiro. Ocupa grande parte do Nordeste, estendendo-se por Goiás, Minas Gerais e parte do estado de Mato Grosso, São Paulo e Paraná, e cobre uma área aproximada de 2 000 000 Km2. Árvores de troncos tortuosos, arbustos de formas bizarras, dispostas isoladamente sobre um extrato de gramíneas, caracterizam esta região de paisagem monótona. 14

Muitas vezes, a mesma espécie botânica ocorre em diferentes regiões e sua composIção quimica pode também apresentar diferenças. Este tipo de variação deve ser levado em conta no estudo qu ímico das plantas desde a escolha do material até a etapa final do registro e divulgação dos resultados. Isto ressalta a importância do uso de um processo de seleção para que se possa escolher quais espécies devem ser estudadas prioritariamente. Vários processos de seleção têm sido desenvolvidos ao longo da história da fitoqu(mica, todos eles condicionados a objetivos específicos e a técnicas postas à disposição do pesquisador. No século XVI, quando o objetivo era descobrir empiricamente novas plantas curativas, chegou a assumir grande importância e respeito um processo de seleção baseado na cabalística doutrina da assinatura, advogada por Giambaptista Porta em sua célebre obra Phytognomonica (3). De acordo com esta doutrina, selecionavam-se partes do vegetal conforme sua semelhança com forma de órgãos humanos ou aspectos externos de certas doenças, sobre os quais o material "assinalado" deveria ter 15

rí

.....

providencial ação curativa. Modcrnan1()llll,- o pl~~qlli~;.J(I(J11.lIIt,:d111[10 de novos e sofisticados processos de ~(dl~IJío l'a~ead():; elll pl opriedilde~ determináveis experimentalmente. Dependendo do obj(~tiv() l~~peclfico do estudo, a seleção pode ser feita através da aplicação de testes farmacológicos em pequenos animais ou órgãos isolados e mantidos vivos durante a experiência (B/in(j Screening) (4) ou através da verificação da ocorrência de determinado tipo de constituinte (alcalóides, por exemplo), ou de um conjunto maior ou menor de constituintes julgados de interesse para o estudo desenvolvido. Pode ser feito ainda baseado na posição filogenética da planta, selecionando-se um grupo de plantas (gênero ou fam ília) por causa da ocorrência de compostos interessantes em um ou mais dos membros do grupo selecionado. Outro aspecto de grande importância para a seleção de plantas para o da flora da região a ser pesquisada, isto é, o estudo qu ímico é o conhecimento levantamento preliminar da vegetação e de sua composição florística. Assim é possível desCObrir quais espécies são predominantes e principalmente sobre elas concentrar os estudos químicos. Os resultados dos estudos, neste caso, podem conduzir a trabalhos complementares, com vista à explor<Jção econômica destas plantas de larga ocorrência, com maior probabilidade de sucesso. Complementada pela informação botânica, a informação popular sobre o uso das plantas se constitui no mais importante critério de seleção de material para estudo químico, visando a sua aplicação medicinal. Numerosas plantas vêm sendo usadas, muitas vezes com êxito, principalmente no meio rural. Remédios, repelentes de insetos, venenos para peixes usados na pesca, podem fornecer excelentes pistas para o qu ímico de produtos naturais, ao lado de plantas conhecidas como tóxicas para o homem e animais. Lamentavelmente este tipo de informação tende a desaparecer por influência das comunidades mais evolu ídas, cujos costumes, levados ao meio rural com o constante progresso dos meios de comunicação de massa, substituem progressivamente os velhos hábitos.

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• "I.' ,.,1,11"".11,.1" '1I111Cilpode ser subestimada. A falta de identificação cientfti." "" "",,' Idl~III"Í<:açiío errada, anulará todo o trabalho do qufmico, 1'111,,,,••1,,,, IlIdlICdllwnlc inÚtil e, portanto, impublicável .. 1III'"ld" .I I'Iill1ta estudada se inclui entre aquelas de fácil determinação 1;"'"'''""", "" lleltence ao grupo compreendido na especialidade do botâllli " 011"1"'11IVl'1no local de trabalho, sua identificação é quase sempre rápida ""'111101N"IIIIO~ casos pode ser demorada e trabalhosa, reqaerendo a colabo1.1', :1" di' ,,"IIOS botânicos sediados em centros distantes, mesmo fora do país. /\ Itldlll;} colhida para estudo qu fmico deve, portanto, ter garantida sua 101",;I; 1!C,,,)ío através da coleta de material botânico. Quando suas condições '1','.1111" 11l'llllitirem, pequenos ramos (20 a 30 em) com folhas, flores e frutos •.111V,'IIIOSI~stágios de desenvofvimento, provenientes de diversos espécimes, d"VI'111:;In colhidos, adequadamente preparados, ou seja, herborizados e depo',11.1110:.no herbário mais próximo. Estas exsicatas devidamente numeradas e ',II.i1ogadas são a garantia de que o trabalho do químico não se perderá por ,i1lvldas que possam ocorrer acerca da origem correta das substâncias isoladas ,. Idt~lltificadas. Mesmo que pareça difícil ao iniciante conseguir a coleta do 1II0I11nialbotânico da planta a ser estudada quimicamente, todo esforço deve ',I~rdedicado ao atendimento desta etapa do trabalho. ~ preferível não estudar 01planta do que fazê-Ia baseado numa duvidosa identificação, obtida através IIt~ consulta a dicionários botânicos de nomes vulgares por mais famosos que sejam. Embora em algumas regiões, como ocorre no Nordeste, os nomes vulgares ~ejam relativamente constantes e mereçam certo grau de confiança, de modo geral há grande variação de região para região e às vezes, até mesmo de município para município. Além disto, é comum encontrar-se o mesmo nome vulgar assinalado para diferentes espécies vegetais, como diferentes nomes comuns dados a uma mesma espécie botânica. Em muitas ocasiões, quando a identificação imediata pode ser apenas parcial, isto é, o botânico consegue determinar de imediato apenas o seu gênero e só posteriormente a espécie, o trabalho químico poderá prosseguir,

2. A IDENTIFICAÇÃO

BOTÂNICA

Qualquer planta escolhida para estudo qu ímico deve ser seguramente identificada. Identificar uma planta significa reconhecer um determinado espécime integrante de um conjunto como sendo semelhante a uma descrição existente, ou a outra planta já identificada, respectivamente, em publicações e coleções especializadas em taxonomia botânica (5). Para atender a e.sta exigência, o químico depende de outro especialista, o botânico taxonomista,

contanto que a planta seja seguramente marcada , Pode ser utilizada durante o trabalho uma numeração ou denominação provisória, de preferência o próprio número de herbário, até que se consiga a determinação correta. Na parte final deste capítulo é apresentada uma descrição da técnica de herbQrização usual que poderá ser executada pelo qu ímico ou pelo coletor de material botânico para estudo qufmico. Paralelamente à coleta para herborização, devem ser anotados dados informativos sobre o local de coleta, nome vulgar e usos populares da planta, seu porte, freqüência, tipo de vegetação associada etc. As fichas anexas mostram o conjunto de informações consideà necesradas necessárias para o registro da planta no herbário. Atendendo

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entre com

Os serviços de coleta, armazenagem de material bruto e triturado, abordagem fitoquímica, extração e guarda dos extratos devem ser sistematizados e organizados de modo a permitir um rigoroso controle e fornecimento ininterrupto de informações a um ou vários laboratórios responsáveis pela análise de extratos.

3. A PROSPECÇÃO

PRE:LlMINAR

A multiplicidade pequenas quantidades

dos constituintes de compostos

..~

químicos das plantas, a ocorrência de interessantes concomitantemente com

!l' H'" h," •li "111IloI,ltI,.., ti" 11111'"II1Iillles jÚ COllllUCidos e rnui 10 comuns, ao lado d., ."\.1,,,. ,,"1, "'. 1.'1••"", ""," rl~ll~ntes, dificultam o trabalho de isolamento e ""' 'ti. "', '1 •• ti ••" 1>"IIL1Plll" imediatos desejados. Algumas destas dificuldades liI••• "',, li' 1111'.1'1.",,I 1'1ÚPI ia natureza da planta como ser vivo em constante .1'"""'1""" '1'/11111111,Ill1lias ao grau de precisão das técnicas utilizadas pelo 1"""1"1.""1,,, 1\1111'11I1H!1I0caso, estão as variações de composição devidas a ,"11'1"'" 1"'.01.1', IIllldanças estacionais, do clima, do solo e, algumas vezes, até· "" di li ''', ;,•• 01,11IIIIIIIIhlç50 solar. Neste último caso estão a maioria dos glicosíli", '"1,1"",,""11;\(,:;10 nas folhas aumenta durante o dia com a fotossíntese e .!I,"I,,," <1'",11111'a noite, como ocorre com a digitoxina e outros glicíoios das 1.. 11,,,.. d,',l.rI"lIo1 (Oigitalis purpurea). Constituintes hidrossolúveis podem ser .111 ••', ti .•·. folhas pela chuva, fato que poderá falsear resultados de material ,,,11,1.1•• ',111) l<lis condições. A presença de compostos que apresentam 1""I,,,,·d.III,,,, físicas muito próximas, homólogos e isômeros, como muitas "","', 1111)1I1~ com as misturas de triterpenóides e seus derivados, exige o "lill'l"'!" d/~ IÔcnicas anal íticas muito sofisticadas. Tudo isto torna pratica111""1,,IIl,possível o estabelecimento da composição química completa de uma 1.1,11'1., Lstas dificuldades podem ser minifllizadas quando se definem obje"VII', ,,:,pecíficos para o estudo químico das plantas e se aplicam técnicas de I'i1I',pl~Cç50 preliminar adequadas aos objetivos escolhidos. ,,"

Muitas vezes se busca o isolamento e a caracterização de compostos de ",Il~1esse acadêmico, como sejam, novos compostos não registrados na litera11110'l!specializada, ou intermediários de processos de biossíntese de importân"a quimiotaxonômica. Outras vezes se intenta encontrar e isolar substâncias ,It~ interesse econômico, principalmente novos agentes medicamentosos, ou lIovas fontes de compostos raros já utilizados, ou ainda compostos que possam ser utilizados como precursores de síntese destas substâncias. Várias técnicas, algumas muito simples, outras mais sofisticadas, têm sido desenvolvidas para a prospecção destas substâncias. Denominamos Abordagem ao conjunto destas técnicas de prospecção, elaboradas de tal modo que possam fornecer resultados rápidos, ao mesmo tempo que permitam ao pesquisador certo grau de familiarização com o material trabalhado. Seu planejamento deve ser feito de acordo com objetivos específicos, seja qu(mico, farmacológico ou ainda dirigido para um determinado tipo de ação (quando se procura inseticidas naturais, por exemplo) ou um determinado tipo de constituinte como alcalóides, ou ainda classes especiais de substâncias de interesse tecnológico como os óleos essenciais e os óleos fixos. Seu grau de complexidade varia, portanto, em função do número e da precisão das informações dese· jadas. O planejamento da abordagem deve obedecer em qualquer caso a dois princípios em oposição, cuja influência é constante nas técnicas de prospecção. São eles:

1. simplicidade

necessária

à rapidez de execução;

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2. complexidade neceSS{lrliI;"1p"·U,.do do'. I'·'olillddo·. ,.. llIldlOI .11111'1111111" de informações.

,;i.1I li q "I""". ( I !) '0111 p!.t1II.1"do Brasil. Sobressai·se entre os trabalhos mais " ui"/"'/I •. ,1 dI/i! I'IIV((J(:lIumicill screening of plants, de Farnsworth

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'p;dli

toma u IH(,H;eSSo mais rápido, porém Respeito ilO prinwilO principio pouco preciso. Obediência ao segundo, aumenta a precisão em preju ízo da rapidez. A definição dos limites da influência destes dois princípios só poderá ser feita pelo próprio pesquisador, em função de seus objetivos e das condições de trabalho dispon íveis. Em alguns casos, por exemplo, no estudo dos óleos voláteis, ou essenciais, é poss ível aliar os dois princípios através de sofisO cromatógrafo de ticada aparelhagem posta à disposição do pesquisador. gás acoplado ao espectrômetro de massa torna possível a análise de grande número de plantas odoríferas, em curto espaço de tempo, apenas procedendo-se urna microdestilação por arraste de vapor de pequenas quantidades de planta e injetando-se no aparelho quantidades da ordem de microlitro da essência obtida. A parte mais demorada do trabalho será a interpretação dos espectros de massa obtidos. A prospecção, além de permitir ao químico o conhecimento preliminar do comportamento qu ímico dos extratos com o qual se deverá trabalhar, é também valioso instrumento utilizado na seleção de plantas para estudo. Embora não definida com este nome, a abordagem tem sido utilizada tanto como processo de seleção de plantas como de exame preliminar de seus extratos, desde muito tempo, assumindo diferentes roupagens, em épocas e locais diversos, ora mais simples ou mais complexa, aparecendo mais específica ou mais geral. Não é, portanto, um processo novo. Os químicos e farma(7) cêuticos da década de 30 tiveram os testes preliminares de Rosenthaler corno processo de prospecção obrigatório nos estudos fitoqu ímicos que obedeciam, àquela época, aos esquemas anal íticos de Allen, Dragendorff ou Stas Otto, orientados quase sempre para o isolamento de todos os constituintes das plantas. O processo desenvolvido por Wall e colaboradores (8,9) para triagem de plantas portadoras de sapogeninas esterólicas, complementado por outras técnicas informativas e o conjunto de técnicas simples e de fácil execução organizadas por Geissman (10) para' detectar a presença de compostos flavonóides em extratos vegetais são, também processo de abordagem. O mesmo se poderia dizer de vários ensaios dos spot tests de Fritz Feigl (11). Mais recentemente Trevor Robinson (12) divulga processo idealizado por Cheronis para estudo dos complicados extratos aquosos, e Gottlieb (13) sugere uma bem esquematizada "marcha qu ímica" para fracionamento de extratos, que podem ser adaptados ao processo de abordagem fitoquímica. Com objetivo farmacológicc assume também aspecto de abordagem o pharmacological blind screening divulgado por Turner (4) e Laurellce

& Bacharach

(14). O mesmo ocorre com os trabalhos de Feng e colaboradores (15) e de Hooper & Leonard (16), com plantas da Jamaica, e de Barros e

'''II1<'1i1 I/llld "'vi:;:io do assunto

com mais de 800 referências

biblio-

:1-,

.d .. "d.l'l'·llI Illoquímica, além de facilitar a escolha do material a ser , ;",1.,01", /"'111111"ao pesquisador a possibilidade de adaptar as técnicas de I,,, "'''.11' 11'"1,, dI' extratos e isolamento e caraêterização de substâncias puras, previamente detectados, facili01,' d' 01.1" ""111 ;1 natureza dos constituintes 111,01" .I.••" 111o ';IJ!>seqüente trabalho de isolamento e purificação dos consti111111"",Illd!:; IIlleressantes. Outro aspecto, além destes, confere ao processo de .d,,,,.I.1<I'·1I1 11111,1utilidade adicional. Trata-se de sua aplicação como meio 1""I"'d"lIllco il investigação fitoquímica. A facilidade com que o principiante .101""",, ""lll1ecimento relativamente amplo, embora superficial, da qu ímica 01.,'. ,,!.lIl1a,; e das técnicas defracionamento mais usuais, age como estímulo III"tIVOIdol da curiosidade, dando-lhe, provavelmente, o suficiente impulso dos estudos. 1I11l"Idlpala ü prosseguimento I\presentamos na segunda parte deste trabalho, sob o título de Aborda'1"111Filoquímica, um conjunto de técnicas de prospecção selecionadas que """l1item determinar a presença de vários compostos de importância fitoquí1I11(;a,adaptado de trabalhos anteriores sobre prospecção química de plantas dll Nordeste do Brasi I, por Matos e colaboradores (18).

4. O ISOLAMENTO

E A PURIFICAÇÃO

DE SUBSTÂNCIAS

NATURAIS

A preparação dos extratos brutos das plantas é o ponto de partida desta etapa do isolamento e purificação dos constituintes químicos fixos das plantas. A escolha do solvente para extração deve ser feita tendo-se em vista os objetivos do estudo e os resultados da abordagem. Deve ..se ter em conta que solventes pouco polares (éter de petróleo, hexano, benzeno, clorofórmio) extraem da planta, mais facilmente, mistura de compostos de baixa polaridade e compostos polares, porém pouco hidrófilos. Compostos mais polares e hidrófilos são também com mais facilidade, extraídos com etanol ou metanol. Compostos que se comportam como .ácidos ou bases lipossolúveis são extraídos de preferência utilizando-se suas propriedades de formarem sais hidrossolúveis, com bases inorgânicas no caso os ácidos e, com ácidos inorgâ' nicos, no caso das bases orgânicas. Especial cuidado deve ser observado para extração de compostos polares quando a planta é rica em taninos. Este grupo

20 21

de substâncias é muito solúvel nos solventes hidrofílicos. Neste caso, é ÚI iI proceder-se uma extração preliminar com hexano para desengordurar " material, isto é, para retirar os constituintes lipossolúveis e facilitar o contato do solvente mais polar com os constituintes mais polares na planta triturada e, em seguida, usar éter, ao invés de álcool, para extração dos compostos polares desejados. Os taninos são muito pouco solúveis em éter. Uma terceira extração, desta feita com álcool, retiraria os taninos e outros compostos mais polares deixados pelo éter, que poderiam ser trabalhados separadamente . Outro problema extrativo comum ocorre com uso de solventes pouco polares na extração de plantas ricas em látex com elevado conteúdo de borracha ou substâncias análogas. A borracha presente no extrato complica seu fracionamento posterior quando se aplicam processos cromatográficos ou se emprega a marcha qu ímica com partição em solventes. Neste caso, é preferível fazer-se a primeira extração com acetona, que quase não retira a borracha, mas extrai a maioria dos constituintes Iipossolúveis e, em seguida, extrair a torta com solvente menos polar, como o hexano ou o clorofórmio, de onde se pode isolar e identificar este composto poliisoprênico (12). Outro aspecto importante a ser considerado é o processo utilizado na extração que pode influenciar consideravelmente os resultados do estudo experimental. De preferência deve-se utilizar a extração a frio por percolação. Embora o volume de solvente deva ser muito grande com este processo, diminui-se o risco de reações provocadas pela ação combinada do calor, luz e solvente na formação de artefatos. A concentração dos extratos, pela mesma razão, deve ser feita sob pressão reduzida, o que também diminui o tempo consumido no processo de recuperação do solvente, embora requeira, no caso de grandes volumes, equipamento especial. Opcionalmente, apesar destes riscos, são utilizados extratores modelo Sohxlet do tipo industrial ou semi-industrial. Para preparação dos extratos são utilizados, geralmente 1-20 quilos de planta triturada. Comumente são obtidos três extratos, usando-se como principais solventes hexano, éter etílico e álcool etílico a 95%. Algumas vezes, obtém-se inicialmente o extrato alcoólico exaustivo, e este, depois de à extração com hexano, retirado todo o sol vente, é submetido sucessivamente clorofórmio, éter etílico e acetona. Opcionalmenrt!, estes extratos podem ser submetidos à técnica de fracionamento químico resumida no fluxograma 1 Marcha Química, elaborada por Gottlieb (13). Na maioria das vezes, pode-se partir diretamente para o fracionamento cromatográfico. Para separação das misturas mais simples, obtidas através do processo de fracionamento químico, deve também ser empregada a cromatografia, Dependendo da natureza da mistura a fracionar e das propriedades do extrato obtido podem ser utilizados diversos tipos de fracionamento cromatográfico, baseados nas propriedades separativas mais adequadas (ver capítulo sobre cromatografia). O tipo de cromatografia mais utilizado no fracionamento é, no entanto, a

"""'011"'11.11'01 ''''"1.'''''11011'01,

I'" ,1(1';orç{ío, sendo o adsorvente "'llilola

se percam

neste processo

mais comum a sílica-gel para os constituintes fortemente

t""illft'. (li 1.lI,eI" ',/' deslda estudar os constituintes voláteis, sua extração é iniciada I"d,1 eI,",lll.u'::io Jlor arraste de vapor, recolhendo-se todo o líquido destilado i 1111 I ',LllleI" pll~sente na planta óleo essencial, este é separado da fase aquosa I' Ildl <>1011(1) (' i1S duas partes podem ser trabalhadas separadamente. As técnicas ,li. ,1I.,tI,',e dl~ ÚII~OS essenciais hoje são, provavelmente, as mais avançadas e •,11'''Li';, I"'IIllÍlindo, pelo uso do cromatógrafo de gás acoplado ao espectrõ1111'1". de IIlassa, a separação e identificação de constituintes presentes em 1"''1IU~Il,ssilTlas quantidades de óleo essencial. A análise do hidrolato pode ser '.Ill1p'i1icada por separação de seus constituintes por partição em solvente de Il.llxo ponto de ebulição, imiscível com a água, seguido de aplicação ao II dto orgânico, concentrado a frio, do mesmo tratamento dado ao óleo ,''.';o~!lcial. I"

fJETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE CONSTITUINTES NA TURAIS

A determinação da estrutura molecular dos constituintes isoladoS"' se co!lstitui em campo especializado da química orgânica e é feita principall!lente pela interpretação de vários espectros obtidos em aparelhagem especial, principalmente espectrômetros de absorção das radiações ultravioleta, vis ível I: infravermelho, espectrômetro de ressonância magnética protônica e de carbono 13 e espectrõmetro de massa. Existem numerosas publicações facilmente acessíveis onde se descrevem os princípios e aplicações da análise espectrométrica. Nos restringiremos aqui a sugerir as condições rotineiras a que devem estar sujeitas as amostras sólidas destinadas a obtenção de seus espectros, e que são:

PUREZA: A pureza do material deverá ser a maior possível, avaliada através da determinação do ponto de fusão e do comportamento da substância em cromatografia de camada delgada. Para a determinação do ponto de fusão deve ser feito aquecimento controlado, mantendo-se a velocidade entre 1 e 2 graus por minuto. Consideram-se apropriadas para obtenção de espectros amostras em que se registram diferenças menores que 2 graus entre o in ício e o fim da fusão (ver técnicá anexa). Para que a amostra seja considerada suficientemente pura pelo exame cromatográfico em camada delgada, deve mostrar a formação de apenas uma mancha, quando submetida ao desenvolvimento pelo menos com três diferentes eluentes (ver técnica anexa). UMIDADE: A presença de água no material pode provocar alterações desvantajosas nos espectros de uma substância. Faz-se, então, necessária sua retirada completa das amostras. Isto se pode conseguir de maneira simples, por aquecimento do material em estufa cuja temperatura seja regulada para 5-10°C abaixo do ponto de fusão da substância, deixando-se, em seguida, o material esfriar dentro de dessecado r a vácuo, sobre sílica-gel desidratante, bem azul. Normalmente emprega-se para retirada da umidade das amostras a 23

'lI, ••.

EM QUIMICA

II."••••I.. II,lI!,

I!!""~-

1/IIIII:n

ORGÂNICA:

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EM BOTÂNICA:

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3. 4. 5 6 7.

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10. 11 12. 13 14.

COM GRUPOS AFINS

() d,'sl'llvolvimento das pesquisas químicas de plantas no Brasil requer, 1'''1 '0111';01 da extensão geográfica do país e da grande variedade de sua flora, 1"'lllloIlwllle intercomunicação entre os grupos de trabalho neste setor. Assim "" dllllllllli o risco de repetir, acidentalmente, estudos que vêm sendo realii,lIlm, (~se contribuirá para atender a necessidade de sistematização do estudo d,' Ilossa flora. Na ausência de órgão de coordenação geral destes estudos, (,li,,' aos diversos grupos, tradicionais ou incipientes, a iniciativa da interco1IIIIIllcação, através da participação em reuniões científicas periódicas que II ,i1{~m do assunto, bem como por meio do intercâmbio de pessoal entre Illstituições congêneres, mesmo por períodos curtos. Além disto, deve-se promover o maior inter-relacionamento possível entre grupos .Iocais ou II~gionais de especialistas em Ou ímica de Produtos Naturais, Farmacologia, Farmacognosia e Botânica Sistemática, em torno do objetivo comum: o (~studo das plantas regionais nativ§ls ou exóticas aclimatadas.

BRAGA, R. A. Plantas do Nordeste especialmente do Ceará. 3.a edição (Reimpressão). Coleção Mossoroense, Mossoró, RN, E.S.A.M., 1976. CORREA, M. PIO. Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e ,das Exóticas Cultivadas, Vol. l-VII, Brasília, Ministério da Agricultura, I.B.D.F., reimpressão, 1984. LE COINT, Paul. Amazônia Brasileira 111 - Árvores e Plantas Úteis, 2.a ed., Rio de Janeiro, Biblioteca Pedagógica Brasileira, Imprensa Nacional, 1947.

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drug

activitiBS:

2:1

"'"

15. 16. 17. 18. 19.

.,~

.."

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Abordagem

FitoquĂmica

A técnica de prospecção descrita neste capítulo foi organizada a partir da série de artigos publicados pelo autor e seus colaboradores sob o título de Abordagem Fitoquímica de Plantas do Nordeste Brasileiro, Revista Brasileira de Farmácia (1, 2, 3, 4, 5) e, posteriormente, divulgada por Costa (6). Trata-se de um roteiro analítico seqüencial elaborado com o objetivo de detectar a ocorrência de quantidade apreciáveis de diversos constituintes químicos em extratos de plantas com exceção dos protídios, glicidios e outras substâncias macromoleculares. As técnicas de caracterização foram adaptadas, de tópicos especiais' contidos em textos de fitoqu ímica, farmacognosia e análise orgânica de Rosenthaler (7), Robinson (8), Trease (9), Feigl (10) e do manual de laboratório AOAC (11). São uti lizados nos testes um extrato hidrofílico (álcool-água), para a prospecção de constituintes mais polares e outro lipofílico (éter etílico, clorofórmio ou benzeno), para prospecção dos compostos menos polares. Em ambos os casos a análise é complementada pela aplicação de fracionamento dos extratos em seus constituintes alcalinos, ácidos e neutros, diretamente, numa primeira etapa e, numa segunda etapa, nos constituintes lipossolúveis, separados dos produtos de hidrólise ácida do extrato hidrofílico e de hidrÓlise alcalina do extrato lipofílico. O roteiro anal ítico compreende ainda determinações quantitativas de extrativos, verificação das propriedades organolépticas e exame visual de possíveis resíduos cristal íferos com aux ílio de lupa. Estas determinações permitem obter informações úteis para escolha do solvente mais adequado para extração .e fornecem indicações sobre a ocorrência de constituintes de sabor e odor característicos, bem como sobre a presença de materiais facilmente cristalizáveis. Embora o sabor amargo não possa ser vinculado a um determinado grupo químico, pode indicar a presença de alcalóides, heterosídios e diterpenos, muitos dos quais teem este sabor. O teor elevado de hexitóis e açúcares simples confere ao extrato hidrofílico um sabor adocicado. Quando este

sabor é muito intenso, pode-se suspeitar da poss ível presença de agentes adoçantes naturais como é o caso das folhas de Stevia rebaudiana e da raíz de Periandra mediterrânea. O odor também pode fazer suspeitar a presença de muitos compostos. Assim se reconhece, mesmo na própria planta, o anetol (odor de anis ou erva-doce - Pimpinela anisum) o eugenol (odor de cravo-daíndia - Eugenia cariophyllata), o cineol (odor de eucalipto medicinal _ Eucaliptus globulus), a cumarina (odor de cumaru - Dipteryx odorata e Torresea cearensis), além de muitos outros.

Os principais grupos de constituintes químicos micromoleculares, de origem vegetal, que podem ser detectados com a aplicação desta marcha analítica prospectiva são discriminados a seguir: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Ácidos fixos fortes Ácidos fixos fracos Ácidos graxos Alcàlóides Antoéianidinas Antocianinas Antranóis Auronas Bases quaternárias Catequinas Chalconas Cumarina Esteróides Fenóis si mples

Flavonas Flavonóis Flavanonas Flavanonóis Glicerina Heterosídios cianogênicos Le~coantocianidinas Quinonas Resinas Saponinas Taninos catéquicos Taninos pirogálicos T riterpenóides Xantonas

Os testes recomendados são suficientemente sensíveis para detectar a presença destas substâncias em extratos feitos com pequena quantidade de material. Geralmente são suficientes 100 éÍ 300g de planta seca e rasurada, sendo conveniente examinar várias partes da mesma planta separadamente, folhas, ramos, casca e lenho do caule e da raiz. Os resultados observados devem ser anotados, analisados e comparados com os dados da literatura sobre as plantas do mesmo gênero, com vista à continuação do trabalho, isto é, a aplicação dos processos adequados de fracionamento, isolamento e purificação dos constituintes evidenciados na abordagem.

ADICIONAIS

Algumas operações exigidas neste roteiro requerem esclarecimentos .ldicionais dirigidos especialmente aqueles que se iniciam em fitoquímica. Neste caso estão as técnicas de separação de ácidos e bases orgânicas por partição em solventes imiscíveis e a técnica de retirada de água das soluções em solventes orgânicos menos polares (hexano, benzeno, clorofórmio e éter etílico), pelo Na2S04 anidro.

SEPARAÇÃO 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

Valiosas informações adicionais podem ainda ser obtidas complementando-se o exame das diversas frações preparadas para os testes qu ímicos com aplicação da cromatografia em camada fina e obtenção de seus espectros de infravermelho e de ressonância magnética protônica cujos picos cracterísticos de vário~ qruoamentos funcionais podem ser úteis como indicadores de várias substâncias naturais tais como neolignanas, compostos furânicos, ácidos orgânicos etc.

I ~;CLARECIMENTOS

DE ÁCIDOS E BASES ORGÂNICAS:

Constituintes orgânicos de natureza ácida ou básica mudam de solubilidade frente aos dois solventes imisc(veis, de acordo com o pH do meio aquoso, por causa da reação de salificação que se processa na mistura. Quando livres, estas substâncias são solúveis no solvente orgânico; se salificadas, dissolvem-se na água embora quando suas moléculas são relativamente grandes, o volume de água necessária para dissolvê-Ios pode ser três a cinco vezes maior que o habitua.!. Mesmo assim, a primeira extração não retira todo material, havendo necessidade de ser repetida. As repetições devem ser feitas com quantidades progressivamente menores para se evitar o acúmulo de grandes volumes Iíquidos. O inverso ocorre quando se tenta retirar do meio aquoso estes mesmos tipOS de compostos insolubilizados por adição de ácido ou base inorgânicos que deslocam seus equivalentes orgânicos. Após a separação, as soluções em solventes orgânicos devem ser lavadas uma a duas vezes com água destilada e tratada em Na2S04 anidro.

EMULSÕES:

Freqüentemente se formam emulsões persistentes no processo de separação por solventes imiscíveis dos extratos de plantas, principalmente quando se usa clorofórmio em meio alcalino. As vezes estas emulsões se separam espontaneamente após várias horas de espera. Pode-se também tentar quebrar a emulsão por centrifugação da mistura. Fazer girar o próprio funil ou o seu conteúdo pode ser suficiente. Outros processos que se podem utilizar são a filtração da mistura através de gaze hidrófila à pressão ambiente ou de terra silícea (Kieselguhr) a pressão reduzida ou ainda pela adição de solução saturada de cloreto de sódio seguida de agitação suave e filtração comum. A separação pode também ser conseguida resfriando-se a mistura em congelador durante uma ou mais horas.

USO DO SULFA TO DE SODlO OU DE MAGNtSIO

ANIDRO

Para a retirada de gotículas de água dispersas nas soluções de solventes orgânicos imiscíveis, pode-se utilizar pequenas quantidades de sulfato de sódio anidro, cerca de um décimo ou menos do volume total do I(quido. Deve-se adicioná-Io pouco a pouco, intercalando-se vigorosa agitação. A operação está terminada quando os cristais de sulfato de sódio hidratado se descolam do fundo do recipiente e a solução torna-se Iímpida. A filtração pode ser feita após 15 min, num funil de tamanho adequado provido de uma pequena bola de algodão comprimida em sua saída, de modo a permitir uma I velocidade de filtração de 60 a 100 gotas por minuto.

INSTRUÇÕES GERAIS

Roteiro Seqüencial de Prospecção de Constituintes Químicos

Siga cuidadosamente o roteiro de prospecção dos constituintes químicos que se encontra nas páginas seguintes. Para facilitar o acompanhamento seqüencial das várias etapas devem ser usados os três fluxogramas encontrados no fim deste capítulo juntamente com a ficha de registro de resultados. Tire cópias da ficha para anotar os resultados de seu trabalho.

de Extratos de Plantas

1. OPERAÇÕES

PRELIMINARES:

1.1 PREPARAÇÃO

DOS EXTRATOS:

Material: 100 - 300g (duas porções) Solvente Hidrofílico: etanol com 30% de água Solvente Lipofílico: éter etílico ou clorofórmio. Pode-se empregar também o benzeno. Por sua toxicidade, seu uso requer cuidados especiais para evitar o contato com a pele e a aspiração de seus vapores. Extrair o material agitando-o freqüentemente (se possível em liquidificador blindado), aquecer a mistura em banho-milria e fazer a filtração do extrato a quente. Primeiro grosseiramente, através de um pano fino, e depois em papel de filtro ou mesmo algodão. Opcionalmente pode ser utilizado o aparelho de Soxhlet para a extração com éter - clorofórmio. Ajustar a concentração do extrato, por concentração ou de modo a obter a relação de uma parte da planta para mais do volume final no caso de solvente hidrofílico, partes da planta para uma do volume final no caso do lipofílico. Após a concentração faça nova filtração se precipitação.

1.2 PROSPECÇÃO 1.2.1

TESTE

DE CONSTITUINTES PARA HETEROS(OIOS

diluição, duas ou ou duas solvente aparecer

NA PLANTA CIANOGÊNICOS:

Misture 10g do material com 50 ml de água e juntar 1 ml de solvente H2S04N, em um erlemeyer de 250 ml com tampa. Prenda à tampa uma fita de papel de picrato de sódio sem deixar tocar no Iíquido. Mantenha a mistura aquecida a 50-60° durante duas horas.

Aparecimento de cor vermelho-castanha presença de heteroskJios cianogênícos.

no papel indica a

O/CH3

PROSPECÇÃO DE CONSTITUINTES H ID ROALCOÓLlCO 2 1 OPERAÇÕES

banho-maria até obter a metade do volume. Leve-o a pH 4 e filtre o I(quido acidulado. Reserve tanto a solução como o res(duo insolúvel e os tubos de ensaios para testes posteriores (2.2 e seguintes). Submeta o conteúdo dos tubos de ensaio aos seguintes testes:

01-1

2.2 TESTE PARA FENÓIS f-j

- Coloração variável entre o azul e o vermelho é indicativo da presença de Fenóis, quando o teste "branco" for negativo. Precipitado escuro de tonalidade azul indica a presença de taninos pirogálicos (taninos hidrolisáveis) e verde, a presença de taninos flobafênicos (taninos condensados ou catéquicos).

/~OH

O--(OH

açúcar

2.3 TESTE PARA NÓIDES

CH20H

OH TREHALOSE

,/~

ANTOCIANINAS,

ANTOCIANIDINAS

E FLAVO-

Tome os tubos de números 2, 3 e 4, acidule um deles a pH 3, alcalinize outro a pH 8,5 e o terceiro a pH 11. Observe qualquer mudança da coloração do material.

em Selaginela convoluta.

abundante

E TANINOS

Tome o tubo número "1" e junte três gotas de solução alcoólica de FeCI3. Agite bem e observe qualquer variação de sua cor ou formação de precipitado abundante, escuro. Compare com um teste em branco, Isto é, usando apenas água e o cloreto férrico.

20 H

CH20H

Ho~C-fH2~H

PRELIMINARES

Separe sete porções de ::l-4 ml em tubos de ensaio numerados e duas porções de 10 ml em bécheres rotulados, um deles tarado. Deixe os bécheres em banho-maria até sua secura e mantenha-os em dessecador até a ocasião de serem usados. Concentre o restante do extrato em

QUEBRACHITOL hexitol c(clico, abundante nos frutos de Aspidosperma pyrifolium.

DULCITOL hexitol ac(clico abundante nas cascas de Tocoyema guianensis.

DO EXTRATO

Aparecimento de cores diversas indica a presença de vários constituintes, de acordo com a tabela seguinte:

C I--! OH

- Púrpura Amarela Vermo Laranja - (8,5)(11) Vermelha Vermo Lilás Alcalino Azul-Púrpura Alcalino Ácido (3)

CH3 Flavanonóis Chalconas e Auronas Flavonas, FlavonóisConstituintes e Xantonas I Antocianinas e antocianidinas

Cor em Meio

/C-C:=N

~\"

HO~

O OH

L1NAMARINA

glicos(dio lunatus.

cianogênico

CH3 de Manihot esculenta e Phaseolus

Obs.:

A presença de um constituinte presença de outro.

pode

mascarar

a cor indicativa

38 39

HH o

/,0-

HOOC++-COOH H

(

(J) (D

}-O-CH3

o ÁCIDO OXÁLlCO comum em Oxalis spp.

ÁCIDO D(+) TARTÁRICO comum nos frutos de 'Tamarindus ind/ca e Vitis sp.

HESPERIDINA (bioflavonóide)

glicosídio da flavanona abundante na casca de Citrus sinensis (laranja).

OH OH

H ÁCIDO CLOROGÊNICO Dépsido dos ácidos cafêico e quínico em Coffea arabica.

HO o RUTINA

(bíoflavonoidel

- glicosídio abundante nos frutos de Dimorphandra gardneriana e D. molis.

O-CH3

ÁCIDO DIMETILELÁGICO depsiso abundante em Laguncularia racemosa. H3C-O

CART AMINA

ÁCIDO SALlCIUCO como salicilato de meti Ia, comum nas ra ízes de Polvgala spp.

- glicosídio de chalcona de Helianthus annuus.

o 4-0-METIL-ISO-L1QUERETINA

J-OCH3

- isoflavona de Myroxylon

balsamum. 41

2.4. TESTES PARA FLAVANONAS

LEUCOANTOCIANIDINAS,

CATEOUINAS

t -::7

Tome os tubos numerados "5" e "6", acidule o primeiro por adição de HCI até pH '-3 e alcalinize o outro com NaOH até pH 11. Aqueçaos com auxílio de uma lâmpada de álcool durante 2-3 minutos, cuidadosamente. Observe qualquer modificação na cor, por comparação com os tubos correspondentes usados no teste anterior.

~I~

"'"

CARDOL um dos fenois do LCC, I íquido da castanha do caju,

- Aparecimento ou intensificação de cor indica a presença de cons tituintes especificados na tabela seguinte:

Anacardium occídentale.

~ Cor em Meio Constituintes

Ácido

FLAVONOIS,

pode mascarar a cor indicativa

FLAVANONAS,

FLAVANONOIS

Adicione ao tubo de número "7" alguns centigramas demagnésio granulado ou em fita e O,5ml de HCI cone. Aguarde o término da reação indicada pelo fim da efervescência e observe por comparação pH HO mudança na cor da mistura da reação nos tubos "5" e "7" OH (acidifiO cados). (azul-violeta)

- Aparecimentu ou intensificação de cor vermelha é indicativo da presença de flavonóis, f1avanonas, flavanonóis e/ou xantonas, livres ou seus heteros/dios. 2.6 TESTE PARA CONFIRMAÇÃO

DE CATEOUINAS

Umedeça bem a madeira de um palito de fósforo no extrato hidroalcoólico. Faça evaporar o solvente e reumedeça uma face do palito com HCI concentrado, com auxílio de um bastão de vidro. Aqueça o palito por 2-3 minutos ao calor de uma chama de álcool, evitando que ele fique tostado. Observe se houve aparecimento de coloração no lado acidulado do palito.

Cor vermelha ou pardo-avermelhada confirma a presença de catequinas indicada no teste 2.6. Nota Explicativa: No caso de extratos escuros, as modificações de cor nestes testes não podem ser bem observadas. Aplique os mesmos testes, portanto, no extrato diluído com etanol ou parcialmente descorado pelo carvão ativo.

COOH ÁCIDO GÁLlCO ocorre em Schinus terebínthífolíus.

PI ROGALOL ocorre em Anacardium occidentale.

O ~ pl-fcr

Ho'Ç(0~

OH 10 (violeta) (vermelho) HO Alterações pH (púrpura) 01-1 de cores da CIANIDINA

~ 4~12

~OH

Of-l

HOYilOH

Vermo Laranja

A presença de um constituinte outro.

2.5 TESTE PARA XANTONAS

Alcalino

Vermelha Pardo-Amarelada

Leucoantocianidi nas Catequinas (Taninos Catéquicos) Flavanonas Obs.:

OH I

/-\

HOyr

y~'

\)-üH

2.7 DETERMINAÇÃO DOS EXTRATIVOS

< ~

AUREOSIDINA - aurona de Antirhinus majus.

Pese o becher com o extrato hidroalcoólico seco após permanência de pelo menos 24 horas no dessecado r, sob vácuo. Calcule o teor percentual de extrativos (solúveis em álcool-água) com relação ao peso de planta seca. Observe, com auxílio de lupa, a presença de cristais. Nota Explicativa: Alguns açúcares e hexitóis, além de outras substâncias, cristalizam, às vezes, sob estas condições. Neste caso seu isolamento é fácil. ~ comum, também, a cristalização de sais, geralmente de c1oreto de potássio, freqüentemente presente em extratos aquosos e alcoólicos de plantas. 2.8 TESTE PARA ESTERÓIDES E TRITERPENÓIDES BURCHARD)

o MANGI FER1NA - C-glicosídio de xantona das folhas de Mangifera indica.

HO~O

8-HIDROXI-5-DEOXI-CATEQUINA

Extraia o resíduo seco do becher 2-3 vezes com 1-2ml de clorofórmio, tendo o cuidado de triturar bem o resíduo com o solvente. Filtre a solução c1orofórmica gota a gota em um pequeno funil fechado com uma bolinha de algodão, coberta com alguns decigramas de Na2S04 anidro, para um tubo de ensaio bem seco. Adicione 1ml anidrido acético, agite suavemente, e junte' cuidadosamente três gotas de H2S04 concentrado. Torne a agitar suavemente e observe se há rápido desenvolvimento de cores. Cuidado: Pode ocorrer projeção do líquido. -

(L1EBERMAN-

Coloração azul evanescente seguida de verde permanente é indicativa da presença de esteróides livres. Coloração parda até vermelha indica triterpenóides pentaciclicos livres.

2.9 TESTE PARA SAPONINAS

- do tegumento da amêndoa de Anacardium occidentale.

Tome o resíduo insolúvel em clorofórmio, separado na operação anterior "8", redissolva-o com 5-10ml de água destilada e filtre a solução para um tubo de ensaio. Agite o tubo com a solução, fortemente, por 2-3 minutos e observe a formação da espuma. - Espuma persistente e abundante (colarinho) indica a presença de saponina (heterósides sapon(nicos).

2.10 Adicione 2ml de HCI concentrado ao conteúdo do tubo preparado no teste anterior (2.9) e deixe-o durante pelo menos uma hora imerso em banho-maria. Deixe-o esfriar, neutralize-o e agite novamente. - A presença de precipitado e a não formação de espuma confirma a presença de saponinas. Obs.: O tratamento hidrolisa as saponinas, precipitando as agliconas, que podem ser extra ídas com HCCI3 e então submetidas ao teste de Lieberman - Burchard (2.8). ,

LEUCOCIANIDINA - precursor de antociano das flores de Gossypium spp.

rD ../"

HECOGENINA Saponina esterólica de

2.11 TESTE PARA ACIDOS FIXOS FORTES Adicione ao resíduo do outro becher (preparado conforme o item 2.1) 0,5ml de etanol. Misture bem e junte 1ml do NH40H concentrado. Torne a misturar bem, aqueça e filtre. Mantenha o recipiente com o filtrado em banho-maria até secar e não haver mais indícios de vapores de amônia. Deixe o becher seco na estufa a 100-105° durante 10 minutos e redissolva em água e filtre. Transfira a solução filtrada para dois pequenos frascos (tipo penicilina), adicione a um deles 1ml de NaOH N e, rapidamente, feche os frascos, de modo a deixar suspensa na tampa uma pequena tira de papel umedecida com reagente de Nesler. Observe o desenvolvimento de cor no papel-reagente. -

Agavespp.

Coloração marrom no frasco que contém NaOH indica a presença de ácidos fixos fortes no extrato.

Obs.: A reação positiva no outro frasco indica erro na operação e anula o teste. Repita. 2.12 TESTE PARA RESINAS Extraia o resíduo sólido resultante da concentração do extrato hidroalcoólico, de acordo com o item 2.1, com o menor volume possível de etanol. Filtre a solução etanólica, tome 3ml em um tubo de ensaio e adicione água até triplicar seu volume. Observe a formação de precipitado. Precipitado floculoso que se aglomera por agitação ou aquecimento indica a presença de resinas.

OSE-O GLlCOS(DIO DA GIPSOGENINA Saponina triterpenóide dos frutos de Luffa operculata.

OHC

HO OLEANDROGENINA - aglicona de um dos glicosídios esterólicos cardiotóxicos das folhas de Nerium oleander.

2.13 TESTE PARA ALCALÓIDES Tome 1/3 da solução aquosa obtida no item 2.1, junte NH40H até pH 11 e extraia as bases orgânicas com três porções sucessivas de 30, 20 e lOml da mistura éter-c1orofórmio (3 + 1), em um funil de separação (reserve a fase aquosa para outro teste). Retire a solução éter-c1orofórmica, trate-a com Na2S04 anidro para eliminar o excesso de água. Separe o filtrado em duas porções. Deixe secar uma delas para testes em cromatoplaca e re-extraia as bases orgânicas da outra, com três pequenas porções sucessivas de HCI diluído (0,1 H). Rejeite a solução éter-c1orofórmica e reparta a solução aquosa aéida obtida, em três tubos de ensaio (evite a presença de solvente orgânico). Adicione a cada tubo, respectivamente, três gotas dos reagentes de precipitação de alcalóides, "Hager", "Mayer", e "Dragendorff". Observe a formação de precipitado característico. -

Precipitado floculoso, pesado em pelo menos dois tubos é indicativo de alcalóides.

Obs.: Os alcalóides que precipitam facilmente com o reagente de Hager podem ser separados sob a forma de picratos, a partir de extrato aquoso ácido. 47

~"~

H CH20H

~ür1[~ PILOCARPINA

alcalóide jaborandi.

imidazólico

"3CN~0~/

o~j

de Pilocarpus

microphyllus

e P.

ESCOPOLAMI NA>---

alcalóide me teI.

tropânico

00 de Scopolia

li NICOTINA

l,)

carniolica

e Datura

CH20H

H3CNro~0

alcalóide piridínico de Nicotiana tabacum_

ATROPINA

(dl-HIOSCIAMINA)

Q)'

alcalóide tropânico de Atropa beladona e Datura stramonium.

PELETIERINA-

alcalóide plrlmldímico de Puni· ca granatum.

----------------.-----------------.-----------.

------

".---'-"

N/ H H3CO

----..

EPI-HEYNEANINA

- alcalóide indólico abundante nas raízes de Peschiera affinis.

CH30

CH~m

O-CH3

....•.... O-CH3

CH:f) EMETINA

alcalóide bisbenziltetrahidro-quinole ínico de Cephaelis ipecacuanha.

c~ PIRIFOLlNA

alcalóide dihidroindólico pyrifolium.

abundante

em Aspidosperma

,.-----

2.14

TESTE PARA BASES QUATERNARIAS faça a metilação com a solução reagente 8F3-MeOH (Técnica 13). Repita a extração com éter etílico. As soluções em hexano e em éter etílico devem ser tratadas demoradamente com Na2S04 anidro, filtradas e mantidas em geladeira, em recipiente bem fechado, até a ocasião da análise. Para outros tipos de ácido faça a metilação com diazometano (Técnica 14). Compare por cromatografia de camada fina o material original com seus ésteres metílicos separados em hexano e em éter etílico.

Acidule novamente a solução aquosa (privada dos alcalóides por lavagem com mistura éter-clorofórmio). Filtre três amostras de 5ml para três tubos de ensaio e repita a reação para prospecção de alcalóides.

- Precipitado floculoso indica a presença de bases quaternárias. 2.15

PROSPECÇÃO DOS CONSTITUINTES APÓS H IDRÓLlSE (2.16 a 2.24) -- Hidrólise do extrato Tome o restante

ACIDOS

E NEUTROS

do extrato

aquoso

(2/3) reservado

no item anterior

(2.13) e junte-o com a solução alcoólica do teste para resinas do item "2.12". Adicione HCI concentrado em excesso de modo a obter uma solução, aproximadamente, 6 M. Aqueça a mistura sob refluxo durante 2-6 horas ou mais, observando a formação de precipitado indicativo de hidrólise. Deixe esfriar e extraia a mistura com três porções sucessivas de 40, 30, 20ml de éter, mediante forte e cuidadosa agitação em funil de separação.' Proceda de modo a fazer a primeira extração após uma noite de contato. Despreze a solução aquosa ácida, retire a solução etérea e elimine o excesso de água com Na2S04 anidro. Submeta a solução etérea que contém os compostos ácidos e neutros aos segu intes testes: 2.16

TESTE PARA ACIDOS Extraia

os ácidos

fortes

Obs.: O método do BF3·MeOH não é adequado ácidos que contenham grupos epoxi, hidroperoxi, ciclo propil e hidroxila (10).

hidroalcoólico

etérea

por agitação

2.18

Reserve o outro becher para teste em cromatoplacas, observação cristais, obtenção de espectros IV e RMP e eventual obtenção ésteres met (Iicos. METlLAÇÃO

FRACOS

E FENOIS

TESTE PARA QUINONAS

Cor vermelha na camada aquosa alcalina indica a presença de quinona, especialmente antraquinonas hidroxiladas na solução e seus heteros(dios no extrato hidroalcoólico. 2.21

TESTE PARA ANTRANÓIS No caso de reação mistura obtida no de peridrol. Agite o desenvolvimento

Resultado positivo indica a presença de ácidos fortes na solução e de seus derivados no extrato hidroalcoÓlico. 2.17

DOS ACIDOS

Separe 5ml de solução etérea em um tubo de ensaio. Adicione ao tubo 2ml de solução de NH40H 6 N, agite bem a mistura e deixe separar as duas fases. Observe o aparecimento de coloração na fase aquosa.

com três

porções sucessivas de 30, 20 e lOml de solução a 2,5% de NaHC03. Proceda de modo a fazer a primeira extração permitindo 12-24 horas de contato da mistura. Observe, com auxílio de uma lupa, se há efervescência indicativa de reação com evolução de CO2. (Reserve a solução etérea). Acidule a solução alcalina que deve conter os sais e reextraia os ácidos com três porções sucessivas de 10, 6 e 3ml de éter, demoradamente. Deixe separar bem as duas fases em cada operação. Despreze a solução aquosa ácida e separe a solução etérea em três bécheres. Repita em um deles o. teste para ácidos com reagente de Nesler descrito no item 2.11.

SEPARAÇÃO

Tome a solução etérea privada dos ácidos fortes reservada no item anterior e extraia os ácidos fracos e fenóis com três porções sucessivas de 30, 20 e 1Oml de solução de NaOH a 2%. (Reserve a solução etérea que contém os constituintes neutros). Acidule a solulf.í1o aquosa alcalina com HCI concentrado até pH 3·4 e extraia os ácidos fracos e fenóis com três porções sucessivas de 15, 10 e 5ml de éter. Despreze a fase aquosa ácida. Retire com Na2S04 anidro o excesso de água da fase orgânica que contém os ácidos fracos e fenóis, filtre-a e aplique no filtrado os testes 2.20 a 2.24. 2.20

FIXOS FORTES da solução

2.19

à metilação de ciclopropenil,

de de

negativa, adicione ao mesmo tubo que contém a item anterior 1 ml de água oxigenada ou 1-2 gotas e deixe separar as fases. Observe após 10 minutos de coloração na fase aquosa.

Cor vermelha, progressivamente mais intensa na fase aquosa, indica a presença de antranóis na solução ou seus heterosídlos no extrato alcoólico.

DOS ACIDOS (BF3)

No caso de reação positiva muito intensa para ácidos fortes prepare seus ésteres metílicos para análise por CGL-EM. Para ácidos graxos

2.22

Separe o restante do extrato etéreo que contém os ácidos fracos e fenóis (obtido no item 2.20) em duas porções (1/4 e 3/4); concentre'as até a secura. Reserve a menor para os testes de cromatoplaca,

50 51

observação de cristais e obtenção espectros dedeetanol, IV e RMP. solva o resíduo da fração maior emde 12-15ml filtre aRedi~solução alcoól ica obtida e submeta-a aos festes 2.23 e 2.24.

2.23

Com auxílio de um capilar, faça duas fortes manchas de aproximadamente 1,5cm de diâmetro, em um pedaço de papel de filtro não fluorescente. Aplique sobre uma das manchas uma gota de solução alcoólica de KOH N. Cubra parcialmente as manchas com um cartão opaco não fluorescente e exponha o conjunto à ação da luz U. V. por cerca de 2-3 minutos. Descubra a parte encoberta, ainda sob luz U. V., e observe se há modificação na fluorescência da mancha alcalinizada (11).

LAPACHOL naftoquinona, abundante n;; madeira de Tabebuia sp (pau d'arco).

~ \I

--------.---

BIFLORINA naftoquinona das raízes de Capraria biflora (antibiótico).

TESTE PARA CUMARINA

Desenvolvimento de fluorescência azulada, forte, bem vis(vel na metade não encoberta da mancha alcalinizada indica a presença de cumarina. 2.24

TESTE PARA AGLlCONAS

Distribua o restante da solução etanólica obtida no item 2.22 em' sete tubos de ensaio e repita os testes descritos nos itens 2.3 a 2.5.

- Resultado positivo indica a presença de agliconas flavonóides na solução e seus heterosfdios no extrato hidroalcoólico.

--------------

~".

CRISOFANOL antraquinona abundante na madeira de Vatairea macrocarpa,

2.25

PROSPECÇÃO

PICROVATAIREINA glicosídio antrônico, princípio amargo de

NEUTROS

PARA AGLlCONAS

ESTERÚIDES

E TRITERPENÚIDES

Redissolva o resíduo obtido em uma das frações do item anterior com 2-3ml de clorofórmio, filtre a solução através de Na2S04 e repita o teste de Lieberman - Burchard descrito no item 2.8.

-- Resposta fortemente positiva indica a presença de agliconas esteróides ou triterpenóides na solução problema e de seus heterostCIiosno extrato hidroalcoólico.

Vatairea macrocarpa,

Ou ~~~H

DOS CONSTITUINTES

Tome a solução que contém os neutros reservada no item 2.20, retire o excesso de água com Na2S04' filtre-a e separe-a em três porções. Concentre-as até a secura. Reserve duas para observação de cristais, cromatoplacas e espectros IV e RMP e preparação de acetato. 2.26 TESTE

FLAVONÚIDES

2.27 (OPCIONAL) No caso de reação fortemente positiva para agliconas esterólicas, acetile o material contido no becher reservado no item anterior (ver técnica de acetilação). Extraia os acetatos com clorofórmio e deixe-os em dessecador para observar poss ível cristalização. Compare em cromatoplacas os acetatos com a amostra material original contido no terceiro becher, para verificar se houve ou não acetilação do material.

Aparecimento de mancha com Rf mais alto correspondente ao material acetilado indica a presença de compostos hidroxilados nos neutros. CUMARINA

- Princípio

aromático

de Torresea cearensis e Dipteryx odorata.

I~ ~o~o

Aplique, paralelamente, os testes descritos em extratos de plantas conhecidas como ricas nos constituintes pesquisados na marcha de prospecção ou, opcionalmente, em soluções de substâncias puras análogas, para facilitar o reconhecimento das reações positivas.

3. PROSPECÇÃO DOS CONSTITUINTES DO EXTRATO EM SOLVENTE LIPOFltlCO (~TER ETltICO, CLOROFÓRMIO OU BENZENO)

BERGAPTOL furanocumarina fotossensibilizante do óleo de Citrus aurantium varo bergamia e da casca de Brosimum

gaudichaudii.

3.1

DETERMINAÇÃO

3.2 SEPARAÇÃO

CH3

NEPETIONA - (2-hidroxi-3,4,6tri metoxiacetofenona), cetona aromática abundante em Croton nepetifolius.

ACETATO DE VINHATICI LA diterpeno furânico da madeira de

Platymenia reticulata.

DOS EXTRATIVOS

Concentre até a secura cerca de 1/5 a 1/10 (aproximadamente 50ml) do extrato em recipiente tarado, placa de petri, por exemplo, Pese e calcule o rendimento percentual de extrativos em função da corr~spondente quantidade de planta seca. Mantenha o. resíduo em dessecador sob vácuo para posterior observação de cristais e estudo de seu comportamento em cromatografia de camada fina. DAS BASES ORGÂNICAS

Retire as bases orgânicas do extrato, aplicando a técnica de extração líquido-I íquido, com aux ílio de funil de separação, usando três porções sucessivas de 30m I de HCI 0,1 N e uma de 50ml de água para lavagem final. Reúna as soluções aquosas. Reserve o extrato original, privado das bases para estudo posterior. Alcalinize a fase aquosa adicionando NH40H gota a gota extraia o precipitado de bases orgânicas agitando a mistura com três porções sucessivas de 15, 10 e 5ml de solução éter-clorofórmio (3 + 1). Reserve a fase aquosa. Separe a solução "éter-clorofórmio", filtre-a e separe em duas porções iguais. Retome as bases contidas na metade da solução "éter-clorofórmio", por meio de agitação com três porções sucessivas de 5ml. de HCI-N em um pequeno funil de separação. Faça retomar a fase orgânica para o recipiente do extrato original. Retire a fase aquosa ácida que deve conter os alcalóides e filtre-a para outro recipiente e submeta-a aos testes descritos a segu ir. 3.3 TESTE PARA ALCAL61DES Separe a solução ácida obtida no item anterior em três tubos de ensaio. Para verificar a presença de alcalÓides adicione a cada um dos tubos três gotas dos reagentes de Hager, Dragendorff e Mayer, respectivamente.

Formação de precipitado floculoso caractedstico indica a presença de alcalóides. 64

Obs.: No caso de reação positiva, concentre a outra metade da solução "éter-clorofórmio" e reserve-a para posterior estudo em cromatoplacas, observação de cristais e obtenção de aspectos IV e RMP. Em caso contrário, junte-a ao extrato:

o li

yH3

O~./--N; I

CAFEIÍ\lA alcalóide de núcleo purinico de Coffea arabica e Paulinia cupana.

3.4 TESTE PARA BASES QUATERNÁRIAS Tome a fase aquosa reservada no item 3.2, acidule-a com ácido acético até pH 4-5 e adicione 0,5ml de reagente de Hager. Havendo formação de precipitado, continue adicionando reagente até cessar a precipitação.

H~~~

CH3

Formação de precipitado de alcalóides anfóteros. 3.5 SEPARAÇÃO

DOS ÁCIDOS

3.6 OLlVACINA alcalóide indólico, antitumoral Peschiera affinis.

TESTE PARA ÁCIDOS

Obs.: No caso conforme 3.7 SEPARAÇÃO

H.,c

FIXOS FORTES

Separe a solução dos ácidos em dois bécheres e concentre-os até a secura. Reserve um deles para observação de cristais, cromatoplaca e obtenção de espectros IV e RMP. Aplique ao outro os mesmos testes descritos no item 2.11. ~ Resultado positivo extrato da planta.

FORTES

Retome o extrato privado das bases e trate-o, em funil de separação, com três porções sucessivas de 30, 20 e 10ml de solução de NaHC03 a 2% e um de 20ml de água destilada. (Reserve o restante da solução que ficou no solvente orgânico para submetê-Ia a outros testes). Acidule as soluções aquosas reunidas até pH 1, por adição cuidadosa de HCI e retome os ácidos livres procedendo três lavagens sucessivas com 20, 10 e 5ml de éter etílico, em um pequeno funil de separação. Lave a solução etérea dos ácidos com 20ml de água, trate,a com Na2S04 anidro, filtre-a e aplique os seguintes testes:

THEOBROMINA alcalóide purínico de Theobroma cacao.

ESQUIMIANINA (skimianina) - alcalóide quinoleínico dos frutos de Zanthoxylon rhoyfolium.

indica a presença de bases quaternárias ou

indica a presença de ácidos fortes livres no

de resultado positivo, faça se descreve no teste 2.18. DOS ÁCIDOS

FIXOS FRACOS

a metilação

dos

ácidos

E FENOIS

Retome novamente o extrato em solvente orgânico privado das bases e dos ácidos fortes. Extraia, em um funil de separação, os ácidos fracos e fenóis agitando o extrato com três porções sucessivas de 40, 30 e 20ml de NaCH a 2% e uma de 50ml de água destilada (Reserve a solu: ção original em solvente orgânico, que contém os constituintes neutros, para testes posteriores). Filtre as soluções aquosas reunidas e acidule a mistura até pH .2-3 por adição de HCI concentrado, gota a gota. Cuidado: vapores corrosivos. Extraia os ácidos e fenóis livres por meio de três lavagens sucessivas de 20, 15 e 10ml de éter etílico, inter· 57

fração insaponificável utilizando um funil de separação e agitando a mistura com três porções sucessivas de 20ml de éter (Reserve a fase aquosa alcalina). Lave a solução etérea recém-obtida com 30ml de água, separe a fase aquosa e retire o excesso de água da solução etérea com Na2S04 anidro. Filtre-a a divida o filtrado em três porções iguais, uma delas em becher tarado. Concentre as três porções em banho-maria até a secura e determine seu rendimento percentual. Reserve um dos resíduos para estudo cromatográfico, observaçã0 de cristais e obtenção de espectros IV e RMP. Compare com dados equivalentes do material da amostra não saponificada.

caladas por vigorosa agitação durante cinco minutos seguida de 5-10 minutos de repouso. Despreze a fase aquosa. Lave a fase orgânica com 20ml de água, trate-a com Na2S04 anidro, filtre-a e aplique ao fi Itrado os segu intes testes: 3.8

TESTE LICO)

PARA

CONSTITUINTES

FENOLlCOS

(EM MEIO ALCOÓ-

Concentre metade da solução etérea já obtida até a secura e redissolva o resíduo em 10 a 20ml de álcool. Aplique à solução alcoólica os mesmos testes descritos nos itens 2.2 a 2.5.

- Resultado positivo pode indicar a presença de um ou mais dos seguintes constituintes:fenóis simples, catéquinas, e flavonóides. Obs.: Taninos portanto, 3.9

são quase insolúveis em éter não aparecem neste teste.

etérea

os mesmos

testes descritos

nos

TESTE PARA CONSTITUINTES

NEUTROS

PROSPECÇÃO DOS CONSTITUINTES L1CO APOS HIDROLlSE ALCALINA NEUTROS - SAPONIFICAÇÃO.

3.14

3.12

SEPARAÇÃO

Adicione ao extrato saponificado 100ml mistura até conseguir sua homogeneização.

de água, aqueça e agite a Deixe esfriar e extraia a

DOS ÁCIDOS

DO MATERIAL

SAPONIFICADO

3.15

TESTE PARA FENOIS Dissolva uma das três frações com 2-3ml de etanol 70% e filtre a solução para um tubo de ensaio. Repita no filtrado etanólico os testes descritos nos itens 2.2 a 2.5.

". Resultado positivo pode indicar a presença de um ou mais dos seguintes constituintes: fenóis simples, catequinas e flavonóides. 3.16

DO INSAPONIFICÁVEL

SEPARAÇÃO

Retome a solução aquosa filtrada, acidule-a até pH 2-3, deixe esfriar e adicione cerca de 1/5 de seu volume de éter etílico. Agite bem e deixe separar as fases. Retire a solução etérea que contém os ácidos, lave-a com 20-30ml de água, trate-a com Na2S04 e filtre-a (Deixe a solução aquosa concentrar em banho-maria para posterior estudo do resíduo). Separe o éter filtrado em quatro porções iguais e concentre-as até retirar todo solvente. Reserve um dos resíduos para observação de cristais, estudo em cromatoplacas e obtenção de espectros V e RMN. Aplique nas outras três frações os seguintes testes:

DO EXTRATO L1POFI~ DOS CONSTITUINTES

Pese o resíduo da fração maior, adicione 10ml de metanol e quantidade equivalente (ml/g) de solução de NaOH-70%. Aqueça a mistura sob constante agitação até quase a secura a fim de assegurar saponificação completa. Observe a formação de material pastoso que se desprega do fundo do recipiente, quando há muito material saponificado.

E TRITERPENOIDES

Aparecimento de mancha com rf mais alto no spot correspondente ao material acetilado indica que houve acetilação e que há, no material insaponificável, compostos hidroxilados. A mesma conclusão pode ser tirada pelo exame dos espectros.

Resultado positivo poderá indicar a presença de um ou mais dos constituintes listados a seguir: antranóis, hidroxiantraquinonas e cumarina.

Retome a solução em solvente orgânico reservada no item 3.5, trate-a com Na2S04 anidro, filtre-a e separe-a em duas porções de 1/4 e 3/4. Concentre-as à secura em banho-maria em bécheres tarados (Reserve a fração menor para observação de cristais, cromatoplacas e obtenção de espectros IV e RMP).

3.11

TESTE PARA ESTEROIDES

Redissolva em clorofórmio anidro o resíduo insaponificável de um dos recipientes e proceda, na solução recém-preparada, a reação de Lieberman-Burchard, como se descreve no item 2.8. No caso de reação positiva, acetile o terceiro resíduo, extraia os acetatos e deixe sua solução evaporar até a secura para observação de cristais, estudo em cromatoplacas e obtenção de espectros IV e RMP. Analise comparativamente a fração insaponificável original e o material acetilado.

TESTE PARA CONSTITUINTES FENOLlCOS (EM MEIO IMISCIVEL COM ÁGUA) Aplique ao restante da solução itens 2.20, 2.21 e 2.23.

3.10

ou em clorofórmio

3.13

TESTE PARA ÁCIDOS

FIXOS FORTES

Umedeça ores íduo de otltra fração com 0,5ml de álcool, junte 1 ml de NH40H concentrado e prossiga como está descrito no item 2.11.

BETA-AMIRINA Triterpenóide com núcleo do oleanano, abundante em

3.17

Resultado positivo indica a presença de ácidos fortes no material hidrolisado ou e de seus ésteres no extrato original.

OBTENÇÃO

DOS ~STERES

METltlCOS

No caso de reação positiva no teste anterior faça a metilação dos ácidos conforme se descreve no item 2.19. Separe os ésteres metílicos para obtenção de espectros de IV e RMN e comparação cOfTl o material original (quarta fração do item 3.14).

Byrsonima sericea.

----------

Os resultados obtidos poderão indicar a presença de ácidos fixos, inclusive ácidos graxas, e a possibilidade de 'isolamento e identificação de seus és teres metl'licos por meio de técnicas adequadas, CGL/EM, por exemplo.

Obs.: As técnicas descritas nos itens 3.11 a 3.17 são aplicáveis ao estudo dos insaponificáveis e ácidos graxos obtidos de óleos fixos (glicerídios) vegetais e animais.

LUPEOL triterpenóide com núcleo lupano, abundante em Crateva tapia.

3.18

SEPARAÇÃO

DA GLlCERINA

Tome o resíduo da solução aquosa reservada no item 3.14, junt? 10ml de etanol, misture bem e filtre. Lave o resíduo sólido com mais duas porções de etanol. Concentre a solução etanólica em banhomaria até a retirada de todo o álcool. Dissolva o resíduo em 1·2ml de água destilada e aplique o seguinte teste: 3.19

TESTE PARA GLlCERINA Coloque misture fato de de filtro porcelana

BETA-SITOSTEROL esteróide muito comum.

duas gotas de solução aquosa em tubo' de ensaio curto e 2-3 centigramas de hidrogênio-sulfato de potássio (bissulpotássio). Cubra a sa ída do tubo com um pedaço de papel umedecido com o reagente, proteja·ocom uma cápsula de e aqueça a mistura em chama de álcool até secar a mistura

(11) .

- Coloração roxa azulada (genciana) no papel, que muda para pardo-alaranjado quando trata,,'a no NaOH/2N, indica a presença de glicerina na solução-problema.

Reagente: mistura recente de solução a 5% de nitroprussiato sódio e solução a 20% de piperidina (uma) gota de cada.

Obs.: De modo geral, as frações oleosas dos extratos, a não ser os de sementes, são esterídios e não glicerídios. Neste caso, o rendimento de insaponificáveis (item 3.12) deve ser muito alto e o teste para glicerina negativo.

o /-ia ISO-CUCURBITACINA

triterpenoidediosfenól ico frutos de Luffia operculata.

abundante

nos

ABORDAGEM

FITOQUIMICA

FLUXOGRAMA

I-

EXTRATO

ALCOOLlCO

1.a PARTE

N TESTE PARA LEUCOANTOCIA.

NIDINAS.

CATEaUINAS

FLAVONAS VER CORES (T·2.4)

TABELA

EXTRATO

UMEDeçA PA· LITO E TESTE PARA CATEQUINAS. (T-2.6)

CONCENTRA, eXTRAIA COM NH40H E TESTE PARA ACI· DOS FIXOS (T-2.1)

CLOROFORMIO,

4-5,

CONCENTRA

1/3

2/3

HCL (6 NJ CALOR (EXTRATO ALCOÓLICO HIDROLI· SADO)

NH OH (pH 11) ETE R-C LORO FÓRMIO(E-C)

ABORDAGEM

FITOQUfMICA MISTURA (VER

- FLUXOGRAMA

2 - 2.a PARTE - EXTRATO

COM

éTER

HCL DlLUfoo,

DILUIDO

HCL

I REJEITA

ÉTER

(3-5ml)

13/4 CONCENTRA,

ETANOl,

EXTRA!

COM

FILTRA

NAS E ANTRA· NOrS.

(T-2.20 e 2.21)

DI LUIDO

NaOH

TESTE PARA ANTRAQUINo-

HIDROLlSADO

HNaC93 REJEITA

ALCOÓLICO

HI DROLlSADA

FLUXOGRAMA

EXTRAI

FILTRA

SEPARA 7 TU· BOS DE ENSAIO E REPETE TESTES 2.2 a 2.5

MANCHA

PAPEL FILTRO. TESTE f/ CUMARINA. (T·2.23)

DILUIDO,

ÉTER

ABORDAGEM

FITOQUIMICA

- FLUXOGRAMA

3 - EXTRATO

EM SOLVENTE

L1POFfLlCO (ETER)

HClDIi.U(OO

NH40H,

HCl

DlLUI"oO, ÉTER

ONCENTRA

NaOH

HCCI3

DlLU1"oA

CRa.

MATQPLACAS, IV. R.M.N.

METILACÃO IV.

R.M.M.,

C.O.L

COMPARAÇÃO

I CONCENTRA ETANOL SEPA-

CONCENTRA CRISTAIS CRa·

RA 7 FRAÇÓES TESTe FENÓIS

MATOPLACAS, IV.A.M.N. ACE· TILACÃO CRD· MATOPLACAS,

CA TEQU

INAS,

FLAVONÓIDES (1-2.02 a 2.OS)

IV/R.M.N

REJEITA

ÉTER, ÂGUA

TUBO DE EN· SAIO. TESTE PARA ANTRA· aUINONAS E

HCL

ETER

ANTRANOIS.

(T·2.2092.21)

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REFERÊNCIAS

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Noções Gerais de Cromatografia

Explicações Preliminares

o método cromatográfico distingue-se entre os diversos métodos de análise como um dos mais frutíferos em resultados satisfatórios e mais rico em número de variadas técnicas. Como processo de análise imediata, tem permitido o fracionamento de misturas em seus componentes, com maior precisão e com menor consumo de tempo e trabalho, à medida que vêm sendo desenvolvidos novos materiais e novas técnicas. Em sua expressão mais simples, podemos definir a cromatografia como um processo de análise imediata por migração diferencial de uma mistura, dentro do sistema cromatográfico (1).

dos componentes

Sistema cromatográfico é o conjunto formado pela mistura a ser analisada (M), pela fase fixa (FF) e pela fase móvel (FM). A fase fixa, também chamada fase estacionária, é o meio constituído ou suportado por um sólido poroso, cuja função é reter os solutos. Chama-se sorção ao fenômeno responsável por esta atividade. A fase móvel é o solvente, neste caso chamado de eluente, que flui através da fase fixa, e tem como função deslocar os solutos. Este fenômeno é denominado dessorção. Neste sistema, a mistura de solutQS é levada a migrar através da fase fixa, por meio de fluxo constante da fase móvel, sendo a diferença de velocidade de migração provocada por processo de competição pelo/sõtuto, entre as duas fases, em função de uma dada propriedade. Em p~inc(pio, ql!alquer propriedade que permita o estabelecimento de equilíbrio de concentração dos componentes da mistura (M) nas 69

duas fases (FF/FMl. em grau distinto para cada um deles, pode ser utilizada componentes da mistura migrarão com velocidades diferentes através da fase .. como cromatográfica separativa, é, em função dela os vários ~..., diferencial. fixa dopropriedade sistema. A este fenômeno da-se o nome isto de migração

11\j(I(

I) 1 "1111.1

IN/\MENTO DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO IIl1lCionamento adequado do sistema cromatográfico

exige a concor-

dp determinadas condições, sendo necessárias as seguintes (2):

-"".~./.-""

()III~ as quantidades

relativas de seus componentes sejam adequadas. A I'lOporção da mistura, fase fixa (suporte), varia muito em função de 1" opriedades, mas pode-se usar a relação 1 : 100 : 3000, sujeita a ajustes posteriores em função da experiência;

~~~~ TIPOS DE CROMATOGRAFIA

As principais inter-relações competitivas entre os componentes do sistema cromatográfico em que se têm baseado os diversos processos desta classe de análise podem ser resumidos no seguinte quadro explicativo dos diversos tipos de cromatografia.

/ que o material a ser separado seja bastante solúvel na fase móvel a fim de ljlle possa migrar forçado pelo seu fluxo; :l. que o material seja sorvível, isto é, que possa ser ligado, reversivelmente,

FF, paraq~e põSSã··ha~er·fef~r<:lamE!fll'?.DéJJ))igrªçãodo soi úiõ Tpor ãdsõr~ ção, pordisSõfução, por reação ácido-base, pelo tamanho molecular etc.); Ij. que a mistura seja distribu ída no ponto de partida em faixa tão estreita

Prop. da Substância a ser Separada

Fenômeno Físico Correlato

Tipo de Cromatografia

Polaridade

Adsorção/desadsorção

De adsorção

Solubilidade

Partição

Dissociação iônica Acidez e basicidade

Diferença de potencial

De partição Eletroforese

Dimensão molecular

Reação com ácidos ou bases insolúveis da F F

De troca iônica

Sorção nos meandros da Peneiramento molecular ou exclusão estérica fase fixa porosa

As diferenças de intensidade dos fenômenos de "sorção" na fase fixa e de "dessorção", pela fase móvel de cada componente da mistura a ser analisada, ou seja, os diferentes desvios do equillbrio em favor de uma das fases, é o fator responsável pela migração diferencial e, portanto, pela separação dos componentes da mistura. Considerando-se o processo de um modo geral, podemos verificar que, no sistema cromatográfico, a fase fixa está sempre ligada, de algum modo, a um suporte permeável, imóvel, por onde flui a fase móvel líquida ou gasosa. Dependendo da natureza do suporte e da fase móvel, definem-se subclasses de cromatografia ditas, em papel, em coluna, gás líquido etc. Na cromatografia em papel, um exemplo de cromatografia de partição, o suporte é formado pelas fibras celulósicas do próprio papel, e a fase fixa é, quase sempre, a água, ou seja, a umidade impregnada no papel. O sentido do fluxo permite classificar também a cromatografia em ascendente, descendente, radial etc. 70

quanto possível. O ideal seria obter espessura igual ao diâmetro médio das partículas do suporte poroso; 5. que as velocidades de migração dos solutos sejam diferentes; 6. que a velocidade de fluxo seja adequada à velocidade de troca do soluto entre a FM e a FF; 7. que o percurso seja suficientemente longo para permitir a separação das faixas por diferença de velocidade. Durante a migração diferencial formam-se, no processo de separação cromatográfica, faixas ou zonas separadas correspondentes a cada um dos componentes da mistura. Cada faixa tem um centro de maior concentração e os bordos frontal e caudal de menor concentração. A maior ou menor distância entre os dois bordos define sua compactação, isto é, se a faixa é larga ou estreita. Para haver separação dos componentes da mistura cromatografada as faixas devem ser bem separadas e estreitas, o que caracteriza a separabilidade do processo cromatográfico. Esta separabilidade depende, essencialmente, de fatores que possam intervir no comportamento das faixas, (2) distinguindo-se entre eles os seguintes: 1. Aqueles que interferem na compactação das faixas (quanto mais estreitas mais viável a separação e vice-versa); 2. aqueles que interferem na diferença de velocidade de deslocamento dos centros das faixas (quanto maior a diferença mais separadas ficam ·as faixas). Estudos da primeira condição de separabilidade, considerada mais importante, permitiram verificar que três fenômenos principais contribuem para o grau de compactação das faixas. São eles: 71

ou seja, a propriedade que têm os solutos de migrarem, mesmo na ausência de fluxo, das regiões de maior concentração para as de menor concentração, o que provoca o progressivo alargamento das faixas. Sua influência é diretamente proporcional ao tempo da experiência. A.ssim, quanto maior o tempo de duração do processo cromatográfico, maior será a influência deste fator. Uma velocidade de fluxo muito baixa prolonga o processo, contribuindo, portanto, também para aumentar o alargamento por difusão ordinária dos solutos.

1. Difusão ordinária,

2. Difusão de Eddy, resulta das diferenças de trajeto da FM (eluente) através

de um meio poroso onde, aleatoriamente, moléculas diferentes seguem caminhos mais longos ou mais curtos durante a migração. Como as velocidades são as mesmas, as diferenças de curso provocam, também, o alargamento das faixas. A influência deste fenômeno pode ser atenuada com o uso de FF ou suporte constituído de partículas de maior uniformidade possível. 3. O fenômeno denominado nonequilibrium, que ocorre pela ação do fluxo sobre o equilíbrio de concentração do soluto entre a fase fixa e a fase móvel. O controle da ação destes três fenômenos pode ser obtido graças à escolha cuidadosa dos componentes do sistema cromatográfico, de uma velocidade de fluxo adequada à velocidade de troca, da seleção da propriedade separativa e, também, da preparação de uma faixa de partida (ponto de origem, no caso de cromatoplaca ou topo, tratando-se de coluna) o mais estreita possível. O efeito da difusão simples pode ser minimizado reduzindo-se o tempo de desenvolvimento do processo cromatográfico. Deve-se, portanto, evitar suspender o processo planejando-se previamente sua execução de modo a se co~seguir uma operação contínua no menor tempo possível. As interferências dos dois fenômenos citados em primeiro lugar são facilmente compreensíveis, dada sua natureza mais geral. A difusão de Eddy será atenuada pelo uso de meio poroso formado de partículas uniformes em suas dimensões. Para compreensão melhor do terceiro fenômeno, o nonequilibrium, vejamos inicialmente como se desloca uma faixa, Consideremos de início uma porção da faixa localizada entre seu centro e seu bordo caudal. Durante o fluxo, a FM carreia mais soluto em direção do centro. Como no centro da faixa a FF está satu'rada ,dosoluto; assim, o material dissolvido na FM passará sobre o centro, sendo cedido gradativamente para a porção seguinte da FF ainda não saturada, formando, conseqüentemente, novo centro e novo bordo frontal, enquanto as novas porções da FM retiram o material do centro anterior, transformando-o progressivamente em bordo caudal. Como o processo de troca das moléculas do soluto entre a FM e a FF 72

11",1)

I~Iflstantâneo, isto é, requer algum tempo para ser atingido e, durante este

I"IIIPO o fluxo não pára, o equillbrio não pode ser atingido. Esta impossibili-

d,J(le de ser"alcançado o equillbrio é a condição especial que se tem denomir \;H!O

nonequilibrium.

A influência deste fenômeno se faz sentir sobre a velocidade de migração d",s moléculas do soluto em função de sua posição na faixa. Aquelas que se I~ncontram no eluente (R) migram com a mesma velocidade do fluxo (V) enquanto que as que se encontram na F F (1 - R) não migram, tendo portanto velocidade zero. A vel'JCidade média (RV) corresponde à velocidade do centro da faixa. No bordo frontal a velocidade de R é maior do que RV e no bordo caudal a velocidade de R é menor do que RV. Em outras palavras, o bordo frontal migra mais rapidamente do que o centro, enquanto o bordo caudal migra mais lentamente, o que provoca o progressivo e contínuo alargamento da faixa. Assim, uma velocidade de fluxo maior que a velocidade de troca favorece o nonequilibrium, aumentando o alargamento das faixas, enquanto que o inverso favorece o equilíbrio, diminuindo, portanto, o alargamento. Pode-se observar que ao diminuirmos a velocidade de fluxo para controestaremos favorecendo o efeito da difusão e iar o efeito do nonequilibrium, vice-versa. O controle judicioso dos três fenômenos pode ser feito através da o efeito do nonequilibrium, estaremos favorecendo o efeito da difusão e vice-versa. O controle judicioso dos três fenômenos pode ser feito através da escolha de F F e de FM apropriadas à separação da mistura, da preparação cuidadosa da coluna ou da placa, da velocidade permitida ao fluxo da FM e, em certos casos, da se leção da curva de gradiente de polaridade (3). O quadro seguinte "guia para seleção dos tipos de cromatografia líquida em coluna" adaptado de publicação técnica sobre o assunto (5) simplifica o processo de escolha do sistema cromatografico mais adequado à mistura a sér separada. Em função do peso molecular e das propriedades dos solutos, são oferecidos sete tipos de cromatografia em coluna, troca iônica, par iônico, fase ligada (normal), fase reversa, adsorção, filtração em gel hidrofl'lico e permeação em gellipof/lico.

A denominação fase normal refere-se ao sistema cromatográfico com fase fixa polar e fase móvel apoiar em contraposição com o tipo fase reversa, quando se usa fase fixa apoiar e fase móvel polar. A denominação fase ligada (bounded phase) aplica-se ao tipo de cromatografia na qual a fase fixa está formada pelo revestimento das micropartículas de sílica e é constituido de substância orgânica apoiar ou de média polaridade quimicamente' ligada ao material do suporte. São mais conhecidos os tipos fenil, C,8, CN e NH2, nos quais o material de revestimento encontra-se quimicamente ligado às part(culas de s ílica, formando a fase ·fixa quê tém como material ativo ou alifático a própria cadeia de hidrocarboneto aromático ou os grupamentos funcionais cianopropil ou aminopropil respectivamente. 73

GUIA PARA SELEÇÃO U-QUIDA EM COLUNA

DOS TIPOS DE CROMATOGRAFIA

sendo, portanto, também diretamente proporcional ao seu grau de pulverifação. A maior ou menor força com que são retidas as moléculas na interfase depende das propriedades do adsorvente, do soluto e do solvente. No adsorvente, depende das intensidades das forças de ligação do retículo próprio do estado sólido que conferem ao adsorvente a capacidade de polarizar as moléculas do soluto e atrair as moléculas polares ou polarizadas mais ou menos fortemente. No saluta, depende da polaridade e d~ polarizabilidade de suas moléculas. Quanto mais intensas forem estas propriedades elas serão mais fortemente retidas. No solvente, depende também da polaridade de suas moléculas que assim entram em competição com as do soluto pelos "sitos" do adsorvente, ao mesmo tempo que as mantém em solução por meio de ligações intermoleculares. Através da competição entre estas forças de atração é estabelecido um equil íbrio de concentração soluto-adsorbato, respectivamente no solvente e no adsorvente. As forças que entram em jogo são de natureza eletrostática, tipo Van der Vaals e ligações por ponte de hidrogênio, ambas características dos fenômenos da adsorção e de dissolução.

TROCA IONICA

PAR 'ÚNICO

FASE LIGADA (NORMAL)

FASE REVERSA

FASE L)GADA (NORMAL)

PARTIÇÃO FASE REVERSA

Cads

ADSORÇÃO EM SILlCA OU ALUMINA

Este equil íbrio representado na equação acima, onde Cads é a concentração do soluto no adsorvente e Csolv a concentração no solvente, depende da temperatura, da concentração e, no caso de gases, também da pressão. Para um dado sistema mantido a temperatura constante e variando-se a concentração, é possível construir-se curvas denominadas isatermas de adsorção. Tais curvas são geralmente parabólicas com tendência para linearidade nas baixas concentrações (fig. 1) (4).

Fll TRAÇÃO EM GEl HIDRÓFlLlCO

PERMEAÇi\.O EM GEL UPOFfLICO ADAPT

ADO

DE RON

Csolv

MAJORS

VARIAN INSTRUMENTS GRQUP, 1981

Existem dois casos limites de isotermas: aquela coincidente com o eixo das ordenadas (adsorção completa) (e-li) e a coincidente com o eixo das abscissas (ausência de adsorção) (f-II). No primeiro caso, todas as moléculas do soluto estão retidas na superflcie do adsorvente. No segundo, todas as moléculas estão dissolvidas no solvente. CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO

~...", I

A cromatografia de adsorção é o processo de separação dos componentes de uma mistura, por migração diferencial, no qual a propriedade do soluto responsável pela competição é a polaridade; o fenômeno físico responsável pela retenção é a adsorção e pelo desloca,mento, a desadsorção. É o tipo de cromatografia mais empregado no fracionamento de extratos de plantas, principalmente os extratos obt'idos com solventes pouco polares.

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Fig 1 ~

Tratando-se será de diretamente um fenômeno de superfície, a quantidade de adsorvente, moléculas ~~' adsorvidas proporcional à área das partículas do

0'-/

111

Isotermas Cads Cs01

" ",.. _h /' / " / " /'

,..,b

o/-''''' ,:.-::.- - - - -C -

ad,

Adsorção é um fenômeno resultante do acúmulo de moléculas do soluto na interfase sólido-líquido, ou seja, na superUcie de separação das duas fases.

esol

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(11)

de adsorção,

E~plicação

___

".,..-'

C sol (111)

no texto.

concentração

da substância

problema

no adsorvente.

concentração

da substância

problema

no solvente,

Exemplo:

Com solutos de baixa polaridade eluente (2) e o adsorvente (4). EXECUÇÃO

(li) usa-se o sistema composto

as principais instruções para seleção sistema cromatográfico "11'1"""IHllmdo o seu modo, o tipo de fase fixa ou estacionária adequada a I .111.1 ':<1:;0 c al(Julnas observações úteis a execução da cromatografia Iíquida de .111" t'ticiencia· e que podem ser adaptadas à cromatografia sob pressão .llllbwlI te cornurnente utilizada.

.11'.1'" .•1;1:.

DA CROMATOGRAFIA

Considerando-se as idéias expostas anteriormente, poder-se-ia ju 19ar que o desenvolvimento da cromatografia de adsorção de misturas complexas poderia ser feito simplesmente com um único eluente capaz de deslocar diferentemente todos os componentes da mistura. A escolha de tal eluente é no entanto difícil. Quando sua polaridade é suficiente para deslocar, em velocidade adequada, substâncias de isoterma baixa, provavelmente deslocará as substâncias de isoterma mais alta muito lentamente. A presença de componentes de isotermas muito diferentes exige, assim, um volume de eluente excessivamente grande para deslocar todos os componentes, tornando o processo trabalhoso, excessivamente lento e de má separabilidade, principalmente quando se deseja empregar a técnica preparativa. Este obstáculo pode ser superado fazendo-se uso de vários el uentes de polaridade crescente. Isto pode ser feito em etapas sucessivas. A técnica introduz, no entanto, uma variável prejudicial à migração ordenada das faixas, pelos saltos de polaridade com a mudança do eluente. É preferível a utilização de técnica ajustada ao aumento progressivo e contínuo da polaridade do eluente (cromatografia com gradiente de eluição) escolhendo-se dois eluentes limites, isto é, um menos polar, capaz de deslocar adequadamente os componentes da isoterma baixa, e outro mais polar, capaz de fazer migrar os componentes de isoterma alta em velocidade adequada, que são misturados de modo progressivo (ver técnica na segunda parte). Pode-se também optar pela utilização de um único eluente e um adsorvente com partículas menores que as habituais para separação de constituintes de mistura menos complexas (cromatografia Iíquida de pressão) obtidas por tratamento preliminar dos extratos (desadsorção seletiva). O uso judicioso destes dados aliado à paciência e a um bom treinamento certamente resultará em sucesso na aplicação deste excelente método de análise imediata que é a cromatografia. OUTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA

I'I\RÃMETROS PARA INCLUSIVE

M(IIlO 'é

~~j

/\.1-,011.:50

,l';n

(C/Fase ligadal

Fase normal (C/fase ligadal

Fase normal (c/fase ligada)

águil metanol. água acetona_com com Água,

resume

várias

informações

diversos

Recentemente foram desenvolvidos equipamentos que tornaram a cromatografia Iíquida em coluna um processo de separação ainda mais rápido e eficiente, pela utilização de colunas especiais e passagem rápida da fase móvel sob alta pressão, tanto em escala anal ítica quanto em escala preparativa. O registro dos picos é obtido através de detetores especiais, por absorção no ultravioleta ou pelo índice de refração. Este tipo de cromatografia é designado como HPLC (high performance liquid chromatography) ou CLÀE (cromatografia líquida de alta eficiência), Na tabela apresentada a seguir estão

(hexanol

até

Separação de substâncias neutras ou acfdicas de peso molecular inferior a 2000.

OBSERVAÇÃO

Evitar presença de água nas separações de substâncias apoiares (séries homólogas).

adição

d~.QU~01!~pJ:lnico (até 0,5%) tende a dimi-

nÚir'-"a-tendêhcia 'para formação de cauda.

Idem

Separação de substâncias neutras ou alcalinas de peso molecular inferior a 2000.

Idem

Grupamento Octadecil

Soivente de polaridade alta: Etanol, Acetona, Acetonitrila, Metanol, água ete.

Separação de substâncias de baixa ou alta populari" dade, especialmente ácidos graxas, triglicerídios, nucleos(dios, etc.

Útil na cromatografia de emparelhamento iônico e de supressão iônica, eluição com gradiente de polaridade inverso.

Grupamento Nitril::l

Qualquer solvente desde hexano até água.

Separação de esteróides, lipídios, aminas e fenóis.

Fase fixa de polaridade média, regeneração mais rápida do que a s(lica.

GrupsHI'c:nto Amino

kh-.:m

Separação de compostos polihidroxilados, especial" mente açúcares.

Fase fixa de polaridade alta.

Grupamento Amônia Quaternário

Grupamento Octadecil

Idem

misturas de miliequivalentel na etc. aminoácidos, ou alcalóides egrama. acetona box rlicos, bases da miliequivalentesl amlnaS, em de Vmetanol erificar aouricapacidade grama. maçúcares. Observar ou Separação pu Separação de ácidos car-a capacidade

Água,

Sol uções aquosas tamponadas

Separação de compostos sulfônicos, derivados tetraalquil-amônio, ácidos carboxílicos e carantes cationicQs.

O pH do tampão. Deve garantir equili'brio deslocado para forma iônica.

Depende da natureza da coluna, nas de gel de poliestireno: THF~ benze

Separação pela peso molecular > 2000. Útil no fracionamento preliminar de extratos para cromatografia por outros processos.

Fase de poliestirenoincompati'vel com água alcoóis, acetona e ácidos carbox í1icos.

reversa).

Exclusão estérica Gel Lipofílico (permeação em gel)

USUAL

Alumina

Troca iônlca

Emparelhamento mnico (fase

Solvente único de baixa polaridade.

CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA. DE ALTA EFICI~NCIA. EMPREGO

FASE MOVEL

didorometano, sendo tolerável a adição de 0,1 a 0,5 de solvente mais polar (um álcool ou água) gradiente de eluição típico: (hexano + 1propanol 0,1% a hexano + 1-propanol 1%). As vezes misturas mais polares: clorofórmio + metanol (8 + 21.

Grupélrnetl:D Ácido sll~f'ôf'1ico

(Permutado,"

úteis sobre

Sflica

Troca iônica (permutadora de cátions)

de anions)

O quadro que se segue tipos de cromatografia.

TIPO DE FASE ESTACIONÁRIA

normal)

Fase reversa

SELEÇÃO DE SISTEMAS PARA CROMATOGRAFIA

no, DMSO, mida.

dimetilfor-

-------

-----

79 78

REFERÊNCIAS 1. GOTTLlEB, O. R. Anotações de aulas, inédito, 1970. HEFTMAN, E., (Ed.), Chromatography. New York, Reinhold Publ., 1961 I 3. SMITH, Ivor, Chromatographíc technícs. New York, Interscience Publ., Inc. 1958 \ 4. RANDERATH, Kurt. Thín-Iayer chromatography, 2nd. édition, New York, Sprlngp,·· Verlag, 1967.

('2.

5. MAJORS, R. Colum selection in high performance ínstrumentes aplícatíons, 13 (3), 6 (1979).

liquid

chromatography.

Varian

Isolamento de Constituintes

Químicos

de Extratos de Plantas

Explicações Preliminares

São apr':!sentados nas páginas que se seguem alguns esquemas de fracionamento e separação de constituintes qu (micos de extratos de plantas. As diversas técnicas de separação foram agrupadas numa seqüência lógica e idealizada como um plano de trabalho de fracionamento de extrato. N'Jma tentativa de simplificar o esquema proposto, utilizou-se como principal instrumento de trabalho a cromatografia de adsorção. A matéria está distribu (da em três partes. Na primeira, descrevem-se as operações sucessivas, apresentando-se, em cada caso, justificativa de seu uso. A segunda parte trata dos roteiros das técnicas referidas na seqüência de operações anal íticas. Na terceira parte é apresentado um fluxograma de operações de separação de constituintes qu ímicos de extratos, baseado na solubilidade dos diversos tipos de compostos, cuja ocorrência é provável em extratos obtidos com o uso de solventes lipófilos. Esta técnica separativa é conhecida, de modo geral, pela denominação de "marcha química" e, em muitos casos, sua utilização se faz necessária antes do fracionamento por meios cromatográficos, como uma maneira de simplificação de misturas complexas. 83

ROTEIRO GERAL PARA O ESTUDO QUfMICO DE PLANTAS

PLANO DE TRABALHO PARA ESTUDO DE EXTRATO BRUTO DE PLANTA USANDO COMO INSTRUMENTO PRINCIPAL A T~CNICA CROMATOGRÁFICA

OPERAÇÕES DE FRACIONAMENTO Etapa 1:

Fracionar o extrato por meio do emprego de coluna filtrante usando srlica gel cromatográfica como adsorvente (ver técnica 1) e 4 a 5 solventes de diferentes polaridades (por exemplo: hexano, clorofórmio, éter, acetona, metanol) ou misturas equivalentes apl icadas sucessivamente.

Os extratos brutos de plantas, mesmo quando se utilizam solventes pouco polares, podem ser muito complexos e ricos em diversos componentes, de modo geral, dificilmente separáveis. Sua análise cromatográfica direta, via de regra, torna-se extremamente trabalhosa. Quando o extrato total é feito utilizando-se solventes polares, maior ainda é a sua complexidade, cuja separação é complicada pela presença de resinas e outros polímeros. O uso prévio de coluna filtrante ou outro meio adequado, permite conseguir, com relativa facilidade, seu fracionamento em misturas menos complexas e mais facilmente trabalháveis. Neste processo, as lavagens com solventes de polaridades diferentes, de forças de eluição crescentes, retiram da mistura, em etapas sucessivas, grupos de substâncias cujas propriedades So~ relativamente próximas e, por isso, mais facilmente separáveis por cromatografia.

Justificativa:

A retirada total dos solventes que impregnam cada fração deve ser feita com especial cuidado, principalmente quando foram usados solventes polares, para que o processo analítico seguinte, a cromatografia, não seja perturbado, vez que seu inicio se dá, comumente, com o uso de solventes pouco polares. Uma pequena contaminação com solvente de forte polaridade resultaria em alteração prejudicial do processo cromatográfico. Etapa 2:

Analisar cromatograficamente, em placa, cada uma das frações obtidas na coluna fi/trante. Preliminarmente, proceder o exame de pequenas amostras de cada fração, em cromatografia de camada fina, usando diversos sistemas de solventes (ver técnica 2). De acordo com os resultados obtidos, continuar o fracionamento, pelo uso de técnicas adequadas, opcionalmente as seguintes :a~!cromato-

grafia em coluna com gradiente de eluição (ver técnica 5); b) cromatografia preparativa em camada fina (ver técnica 3); c) cromatografia média de pressão (ver técnica 6). As frações obtidas da coluna fi Itrante com solventes muito polares, as duas últimas sugeri das, poderão conter material de peso molecular elevado e polaridade alta, o que torna necessária sua análise através de cromatografia de peneiramento molecular em gel de Sephadex de grau apropriado (ver técnica 7) ou, opcionalmente, sua transformação em derivados menos polares, através de reações qurmicas. A seleção de um dos processos indicados pode ser feita em obediência ao seguinte esquema, a partir dos resultados obtidos no estudo preliminar em placa: a) resolução regular em placa, quantidades até 0,5g

usar cromatografia preparativa;

em placa

b) ótima resolução em placa, 2-4 constituintes, quantidades entre 0,1 a 1,0

usar cromatografia de pressão simplificada;

c) boa resolução em placa, vários constituintes, quantidade maior que 6,5g

usar cromatografia em coluna (de preferência com gradiente de eluição);

d) má resolução em placa (o material não migra ou não separa).

1. cromatografia em coluna filtrante de gel Sephadex apropriado (LH-2Q.). 2. acetilar e/ou meti lar o material e repetir o exame em cromatoplaca.

O emprego de s ílica gel como adsorvente tem vantagem sobre o uso de outros adsorventes pela melhor uniformidade do material encontrado no comércio, além de provocar, em muito menor escala, reações secundárias nos componentes da mistura. O processo de gradiente de eluição é recomendável por sua melhor resolução, aproveitando-se ainda a vantagem da automatização do processo de adição do eluente e da variação contínua de polaridade. Evita-se assim a enfadonha tarefa de preparação de numerosas misturas de solventes para obtenção escalonada de polaridades, e diminui-se o risco de erro do operador. A escolha do tipo de montagem e da relação 1-4 dos diâmetros dos recipientes de solvente atendem, de modo geral, as recomendações técnicas para este tipo de cromatografia (1). Os desenhos esquemáticos da figura 1 esclarecem as razões da escolha.

Justificativa:

Ltapil 3: 100 TIPO DE CURVA

C, C2

DIÂMETROS RELATIVOS (D):

1M)

1:1 2:1

C3'

C. Cs

4: 1 1:2

1: 4 MAIS COMUM

100

Fig. 1 - Diâmetros reíativGS dos recipientes doador (O) e misturador curvas dos gradiente, de polaridade (Adaptado de Ivor Smith _ Technícs)

1M) e respectivas Chromarographic

o emprego da cromatografia em camada delgada em escala preparativa é, quando se trata de pequenas amostras, mais vantajoso do que a cromatografia em coluna (2). O menor diâmetro das partículas de sílica (cerca de O,08mm) resu Ita em maior área de interface e maior número de sitos ativos comparado com o mesmo peso de sílica para coluna. Suas principais vantagens são (2):

Examinar em cromatografia de camada delgada cada ulTla das frações cromatográficas obtidas na etapa anterior. Evaporar os solventes, cuidadosamente, em banho-maria ou, de preferência, em evaporador rotativo a vácuo (rota - vapor). Pesar as frações cromatográficas obtidas depois de concentrá-Ias à secura. Com os dados encontrados, fazer o diagrama concentração-volume (ver técnica 8). Em função dos resultados dos exames em cromatoplaca e da análise do cromatograma (diagrama concentração-volume) deve-se reunir as frações semelhantes. A purificação das frações que se mostrarem impuras pode ser feita por cromatografia preparativa em camada fina ou por recristalização. As frações devem ser protegidas contra a ação daluz, do ar e de resíduos de solventes.

Justificativa: O E!xame das frações cromatográficas se faz necessário para comprovação da pureza, imprescindível para o prosseguimento do trabalho de identificação e determinação estrutural dos compostos isolados. O diagrama concentração-volume mostra o perfil dos picos obtidos e seu grau de separação, permitindo decidir sobre o sucesso da cromatografia e sobre quais frações podem ser reunidas. Nesta etapa do processo, a quantidade de material das diversas frações pode ser adequada para a aplicação da técnica de cromatografia preparativa em camada fina. O maior conhecimento das propriedades. cromatográficas da substância permite um trabalho mais rápido e mais preciso. O uso de cromatografia em camada fina é vantajoso também no exame da composição dos eluatos (4).

2 MARCHA QU(MICA PARA SEPARAÇÃO ORGÂNICAS CONTIDAS EM MISTURAS

DE SUBSTÂNCIAS

rapidez de execução; facilidade de escolha do eluente apropriado graças aos ensaios preliminares habituais em camada fina; faixas bem delimitadas e facilmente detectáveis; isolamento simplificado de substâncias.

A aplicação de técnicas de múltiplo desenvolvimento dá, segundo o autor da técnica, separações muita mais nítidas. O emprego de cromatografia por peneiramento molecular (Sephadex LH-20l se justifica como método de escolha no estudo ana! ítico das frações da coluna fiitrante com solvente muito polares, por causa da provável existência de componentes macromolecu/ares que, por este método, são mais facilmente separáveis do resto da mistura (3). O Sephadex LH-20 é próprio para trabalhos com solventes orgânicos hidlrofílicos e retém, através do processo de migração diferencial, as moléculas menores, deixando passar com a mesma velocidade do solvente as moléculas maiores do que as malhas do pol ímflro.

A marcha qu ímica é um processo de separação bem mais antigo do que as técnicas de fracionamento cromatográfico. Seu uso é, no entanto, necessário no caso de análise de misturas muito complexas como costumam ser, muitas vezes, os extratos de plantas. i: também útil no exame preliminar destes extratos como método de prospecção dos constituintes mais abundantes ou mais facilmente caracterizáveis (abordagem fitoquímical. A separação dos constituintes em grupos de substâncias análogas ou homólogas é baseada nas propriedades destes compostos relacionadas com suas funções qu ímicas. O esquema de separação apresentado foi organizado por Gottiieb (6) e é aplicável ao fracionamento de extrato feito com solvente lipófilo (hexano, benzeno, tolueno, clorofórmio, éter etílico, etc) em sete grupos de substâncias semelhantes. Com alguma engenhosidade pode ser aplicado também a extratos feitos com solventes mais polares. O sucesso de sua aplicação depende dos cuidados adotados em cada uma das suas dívérsas etapas no sentido de se obter uma boa separação dos vários grupos com o mínimo de impurezas. Às vezes isto se consegue através da repetição do processo ~;eparativo nas próprias frações resultantes do fracionamento geral 87

(bases, ácidos fortes, ácidos fracos e fenóis fortes, fenóis fracos e lactonas, aldeídos e cetonas, alcoóis primários e secundários, diversos). Cada uma destas frações deve ser, em seguida, submetida a processo de fracionamento cromatográfico adequado ou, no caso em que há um componente principal predominante, por recristalização. As operações de fracionamento estão sumarizadas no seguinte fluxograma autoexplicativo.

nEFER~NCIAS I. SMITH, Ivor, Chromatographic technics, New York, Interscience Publ., 1958, p.252-57. 2. RANDERATH, Kurt. Chromatographysurcouches minces. Trad. Ngyyefi Dãng-Têm. Paris, Gauthier-Villars, 1964. 3. HEFTMANN, Eríc (Ed). Chromatography. New York, Reinhold Publ., 1961. 4. TRUTER, E. Y. Thin film chromatography. London, Cleaver Hume Press, 1963. 5. CLARK STILL, W., Kahn, M.

/6)

(?-,.

CLARK GOTTLlEB, STILL,O. W., R. Kahn, Problemas M. &relacionados Niltra, A. J. com Org. Chem. o isolamento 43 (14):e 2923-5,1978. caracterização de princípios ativos de plantas. Arquivos do Instituto Biológico (S. Paulo); Suplemento, 35 (2): 15-22, 1968.

MARCHA QU!1VIICA PARA FRACIONAMENTO DE EXTRATOS DE PLANTAS (SEG. O.R. GOTTLlEB).

CONSTITUINTES POLARES DIVERSOS

secagem

extração

1 r---~' I I

o ..•• ap.

CHCI3

solução

planta morda

I ---.. oxt

bendnica

B.",.~

NaZS04

secagem

extraçiio HCI

e..•.ap. CHCI3

CHCI3 -+

extraçoo

''''_

HCI •.. ~ão benzônica

O.nriln;c. ]

destilação, crom6:tografia,ote.)

An'd,;do

L EP lavagom

cibonzono

"~,

1 ..

..•

H NaS03

NaOH1

~ ••":.~u~:,~ I 4

soluçOCl

benzônlC8

I<wagem c/benzeno

+ ~x~~a~~oN~~~~;

-!. AlCOÓIS PRIMARIOS e SECUNDARias

Extr

lavagem c/bonzeno

NaOH c/aquocimento extração CHCI3

secagem NalS04

secagem Na2S04 evap. CHCl3

DIVERSOS·

6;1l;tração CHCl3 Hei

"~OO,

Extr

solução banzânica

r rolu"!"

Na1S04

I••"""m C/o.n'·1

ACIDOS FRACOS FENOIS FORTES

FORTES

~:F~l ~~:'I I J "'l~ Ly L~ I roL !uo~

"'-- •.---1

NH40H

CHCI3

secagem

N<l2S04

r (Ext. Álcool)

torta

CHCI3

evap.

T~CNICAS DE FRACIO· NAMENTO DE SUBS· T ANelAS pOLAReS

•I

ACIDOS

BASES

evap. CHCI3

AlDEIDO~ . CETONAS

secagem Na2S04 9Vtlp. CHC/3

+ e

FENÓIS FRACOS lACTONAS (COUMARINAS)

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T~CNICA

DESADSORÇÃO SELETIVA (COLUNA FILTRANTE)

1. Misture cinco partes do extrato seco com 1-5 partes de sílica para coluna (grânulos de 0,05 - 0,2mm) e faça uma pasta usando quantidade suficiente de solvente no qual o extrato seja bastante solúvel. - Evapore o solvente sob pressão reduzida ou, na impossibi lidade, em corrente de ar quente com agitação constante até quase o fim; termine a evaporação colocando alternadamente o material na estufa e no descador a vácuo, com silica desidratante, até não sentir mais odor do solvente no pó obtido. Repita as etapas de aquecimento e vácuo tantas vezes forem necessárias, mas nunca deixe o material na estufa por mais de cinco minutos. 2. Coloque a sílica para a cromatografia em um funil de separação cônico, na proporção de uma parte de extrato para 5-10 partes de sílica (técnica úmida).

Fig. 1 - Seqüência da preparação de coluna filtrante.

3. Elua a "coluna" com hexano-clorofórmio até que uma gota do eluato obtido dê mancha pouco visível quando colocada em cromatoplaca e revelada com vapores de iodo, durante cinco minutos. Evapore o solvente após o término da operação de eluição, até obter consistência de xarope e termine a evaporação com auxílio de vácuo, em dessecador com desidratante, tendo o cuidado de reaquecer o recipiente com a fração extraída, com a freqüência necessária. Pese o resíduo seco obtido. 4. Após a lavagem de coluna filtrante com o primeiro eluente, reinicie a eluição de coluna com mistura de clorofórmico-metanol (95 + 5). Após o término da operação, pese ores íduo seco obtido. 5. Repita o processo, usando, desta vez, mistura clorofórmio-metanol (90 + 10). Após o término da operação completa, pese ores íduo obtido.

-..

Obs.: As lâminas devem estar perfeitamente desengorduradas, isto é, quando molhadas a água deve formar um filme contínuo sobre as superfícies da lâmina. As dimensões ideais são 5 x 10. Recomenda-se no entanto lâminas de microscopia pela facilidade de aquisição. 1.1 Disponha todo o material sobre a mesa limpa e nivelada. 1.2 Prepare a suspensão de s ílicagel H em água na proporção de 5g em 15ml. Agite com o bastão procurando evitar a formação de bolhas de ar até obter uma suspensão uniforme. 1.3 Use a suspensão obtida em 10-12 lâminas, uma a uma, distribuindo a mistura, cuidadosamente, com um bastão, de modo a obter uma camada uniforme. Use cerca de 1ml em cada lâmina do tipo recémindicado.

6. Proceda nova lavagem da coluna filtrante, usando porém outra mistura de maior polaridade ou maior força de eluição: clorofórmio-metanol (90 + 20).

1.4 Deixe as lâminas em repouso, em posição horizontal, até solidificação da mistura. (~ preferível deixar à noite em ambiente protegido contra poeira):

7. Lave, finalmente, a coluna filtrante com metanol puro, obedecendo as mesmas determinações contidas no item "3".

1.5 Ative o adsorvente colocando as placas em estufa a 1050, durante 30 minutos (obtém-se grau de ativação semelhante ao de alumina neutra estandartizada Merck tipo 11-111). Para obtenção de placa mais ativada aqueça a 1200 durante 1/2 hora ou mais.

8. Separe as frações obtidas na coluna filtrante para posterior análise cromatográfica e conserve-a em dessecador com desidratante ("sílica azul", por exemplo). 9. No caso do uso de funis com torneira de teflon, a colocação do adsorvente deve ser feita após retirada da torneira, que somente será recolocada quando observada a ausência de sílica sob o algodão. Este cuidado diminui o perigo de desgaste do teflon e subseqüente perda da eficiência da torneira. 10. Eventualmente a coluna poderá ser lavada, no final da operação, também com etanol-ácido fórrr:ico 5% e depois com etanol-amônia 5%. 11. O processo todo pode ser feito também em coluna especial, tipo extrato r de Soxhlet com refrigeração do recipiente que contém a mistura material-sílica, ou mesmo em coluna cromatográfica comum.

T~CNICA 2 CROMATOPLACA ANALlTICA (T~CNICA MANUAL)

1.6 Conserve as placas ativadas em dessecador com desidratante até a ocasião de usar. Obs.: As placas devem ser utilizadas dentro do prazo máximo de quatro dias. 1.7 Placas bem preparadas são homogêneas quando observadas tanto por transparência como por luz refletida. Resistência ao toque leve com o dedo indica boa aderência. 1.8 Antes de usar a placa, retire, de maneira adequada, uma faixa de 1mm ao longo de cada bordo longitudinal, para evitar efeito de maior velocidade de fluxo nos bordos que são mais delgados, e 3mm no bordo superior, para facilitar seu manuseio.

2. Utilização Estudo do comportamento extratos.

cromatográfico de extratos e frações de

2.1 Dissolva alguns miligramas do material a ser testado em 2ml de solvente e mantenha a solução em recipiente coberto para evitar evaporação. 1. Preparação Material: Lâminas de microscopia, bastão de vidro, becker de 50ml, proveta de 25ml, suporte para dispor as lâminas em posição horizontal.

2.2 Separe quatro cromatoplacas e ponha em cada uma delas dois spots à distância de 1,5cm do bordo inferior e 0,7 dos bordos laterais, conforme o desenho seguinte. Use um conjunto de cromatoplacas para cada um dos extratos obtidos na filtração em sílica.

....•

2.3

2.4

2.5

2.6

Prepare as câmaras de cromatografia em frascos de Borel, ou outro recipiente adequado, colocando cada mistura eluente de modo d deixar 0,5cm de profundidade (4-5ml em frascos de Sorel). Use tantos recipientes quantos sejam necessários. Coloque uma tira de papel de filtro aderida com o eluente à parede do recipiente de modo a cobrir 1/2 de sua área, para provocar a saturação da câmara com os vapores do eluente. Deixe o eluente correr até que a frente atinja o bordo superior. Retire a placa, observe-a sob luz ultravioleta em câmara escura, anote graficamente os resultados, seque-a e ponha para revelar em câmara com vapores de iodo. Observe e anote graficamente os resultados. Eluentes

básicos usados no processo

seriado

recém-descrito

L1uente

I: Hexano

Eluente

111: Clorofórmio + Metanol (95 + 2)

Eluente

11: Clorofórmio

Eluente

IV:

+ Clorofórmio Metanol (90 + 10)

7.7 Caso nenhum

dos eluentes I, 11, 111 e IV dê boa resolução, repita o processo com eluentes de polaridade intermediária escolhidos na série eluotrópica entre os dois que provocaram, respectivamente, pequena e grande migração.

2.8 Para verificar se as substâncias reveladas em placa podem ser separadas em coluna, verifique se a condição expressa na figura 3 é aplicável ao caso (2): manchas vizinhas AeB RfA 1 RfA R Rf de substância mais rápida RfB + 0,1. RfA Rf de substância mais lenta RfB

Exemplo: A

Front

= 60mm

r---+ I

Valores de Rf

RiS ~ 38/60 ~ 0,63

= =

I I I I

Espaço sem sílica

, mm

Papel de liltro

B B

c= Camada de sílica

40mml

38mm 36mm

P--- ...• I

r-+ I I

I I I

Placa

I I I

-L

12mm

I I I L-...l...L_

'8 ••

G) . "(DII •...' I

<:::>

RIC lA/slR

34/60 ~ 0,57 ._~----'_~~~ 0,63 + 0,07

I I I

IA/CIR

~.~º"IE 0,57 + 0,07

I I LJ

Eluente

Fig. 2 (A) lâmina de microscopia preparada com sílica-gel para cromatografia camada fina. (b) Frasco de borel preparado para desenvolvimento da cromatografia câmara saturada.

RIA ~ 40/60 = 0,67

de em

Fig. 3 - Avaliação da resolução da coluna por meio da relação dos valores de Rf em cromatoplaca. No exemplo A e B não são separáveis, enquanto D e C podem ~1r separados por cromatografia em coluna.

-r~"

ANEXO À TÉCNICA

TÉCNICA

Série eluotrópica de sistemas de um e de dois solventes camada delgada (os números indicam os volumes) .••.....

CROMATOPLACA (TÉCNICA

ELUENTE Villars.1964, Randerath Chromatographie

para cromatografia

95 50+50 100 BAc CP 530 20 50 90 85 95 40 99 90 80 +(Eluente ++50 510 540 60 20 15 10 105 30 70 AcBn AcBuM 100 110 EM C B cHAce BC 100 50 20 cH cHB 100 50 BP CM CP15 BM BE 60 20 5140 10 20 80 60 30 50 20 CE E BAce CE100 90 50 70 80 20 1100 00+ 01 90 50 80 70 (Eluente 5* 550 SIGLA I) (Eluente 11) 95 111)* 99 PROPORÇÃO

PREPARATIVA MANUAL)

f'reparação

sur couches minces. Paris Gauthier-

Material: Placa de vidro plano, 20/20cm, bastão de vidro, becker de 125ml, proveta de 50ml (suporte-moldura para placa, feito em acrílico), sílica-gel 11e sílica-gel HF (fluorescente) para camada fina (140-160 mesh). Obs.: As placas devem estar perfeitamente limpas e desengorduradas. Assegure-se disso fazendo o teste do fi Ime de água: a placa molhada e em posição vertical deve ficar uniformente revesti da por um filme líquido contínuo e transparente. 1.1 Coloque a placa sobre uma superfície plana e verta sobre ela, com cuidado para minimizar a formação de bolhas, a mistura de sílica-gel e água preparada da seguinte maneira: 1.2 Para preparar cada placa, misture, cuidadosa e uniformente, 15g de sílica-gel H e 5g de HF com 34ml de água (1: 1,7). Logo depois de obter a mistura uniforme derrame-a sobre a placa. Alguma bolha de ar que aparecer poderá ser eliminada com auxílio de uma agulha. Movimente a placa cautelosamente de modo a conseguir uma distribuição bem uniforme. Deixe-a em repouso, durante a noite, em posição horizontal bem nivelada, em ambiente sem poeira. A operação pode ser facilitada pelo uso da fôrma de acrílico mostrada no desenho a seguir.

20,1 em

O 20mm

20,1

C ,

1 mm

FORMA DE ACRfLlCO PARA PRE· PARAÇÃO DE PLACA CROMATO· GRAF1CA PREPARATIVA

Obs.:

Todos ossolventes misturas.

devem

ser purificados

antes

da preparação

~-i ;

APLlCADOR PARA CROMATOGRAFIA PREPARATIVA

das Fig. 4 - Modelo de fôrma para preparação de placa cromatográfica dispositivo para aplicação do material na placa,

preparativa e de

98 99

1.3 Para ativar as placas coloque-as em estufa a 110° durante minutos.

30-60

2. Utilização

2.1 As placas preparadas da maneira anteriormente descrita devem ter uma espessura de cerca de 0,5 a 1mm e podem ser usadas para análise de 5-70mg de substância. Use tantas placas quantas forem necessárias para distribuição de todo o material. 2.2 Preparar a solução a ser aplicada com a quantidade adequada de material, em 5-10ml de solvente. Para aplicar a solução, marque levemente uma linha a 2,5cm de distância de um dos bordos e use aplicador capilar (ver figura 4) tendo o cuidado de deixar evaporar o solvente após cada aplicação em leve corrente de ar quente, ou mantendo a placa sobre superfície aquecida a 40-50°C. Cada aplicação deve ser feita de uma vez, com movimento em velocidade uniforme, de modo a colocar o material em uma linha contínua de um lado ao outro e guardando a distância de 2cm para o bordo inferior da placa. 2.3 Desenvolver a cromatografia com eluente selecionado previamente de acordo com a técnica número "2". Deve-se usar desenvolvimento em câmara saturada mergulhando-se o bordo inferior das placas em cerca de 1cm do líquido eluente. O uso da técnica de cromatografia de repetição, em câmara saturada, às vezes é necessária para melhorar a separação das faixas (2). 2.4 Para técnica de repetição, deixar a cromatografia desenvolver-se até que a frente do solvente atinja cerca de 1cm do bordo superior. Retirar a placa, evaporar o solvente e repetir o desenvolvimento. Repetir o processo, até três vezes, se houver componentes de Rf acima de 0,6, ou mais vezes, quando o maior Rf for menor do que 0,6. 2.5 Observar as placas sob luz UV 254 nm (Deixe apagada a lâmpada UV-366). As substâncias separadas devem aparecer com o aspecto de faixas escuras sob um fundo fluorescente. Marque as posições observadas e faça um desenho para registro e controle do trabalho. 2.6 No caso em que o componente a ser separado apresenta fluorescência, marcar a posição da faixa fluorescente com auxílio de observação sob luz ultravioleta de À = 366 nm (deixe apagada a lâmpada UV-254 nm). 2.7 Quando a revelação em luz UV não for satisfatória, isolar, com auxílio de um esti lete, duas faixas laterais de 1cm de largura, no sentido longitudinal, de ambos os lados da placa e cobrir a parte limitada com lâmina de vidro ou de matéria plástica. Revelar as duas faixas laterais com revelador adequado. (Cuidado para não contaminar a placa com o revelador). Marcar com um estilete as faixas cromatográficas ligando as manchas reveladas. Retirar a parte da sílica tratada pelo revelador. 100

)lt Iiaspar a sílica das faixas marcadas, com auxílio de espátula e um pincel, reunindo as porções de sílica das faixas equivalElPtes das várias placas. Extrair das porções de sílica correspondentes a cada faixa, com solvente mais polar do que o eluente usado na cromatografia, filtrando à mistura aquecida através de funil de placa porosa G-4 ou outro dispositivo apropriado. L~ Concentrar as soluções obtidas e testar a pureza em cromatografia de camada delgada anal ítica (placas de O,25mm de espessura) (Técnica 2). Obs.: Prote.ger as frações contra a ação da luz, do oxigênio do ar e do res íduo do solvente usado que deI/e ser retirado com aplicação de alto vácuo. T~CNICA 4 CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO EM COLUNA Explicação preliminar

Podem ser uti lizadas como colunas cromatográficas buretas de 50, 100, 250 e 500ml escolhidas em função da quantidade de adsorvente a ser utilizada (30 a 100 vezes o peso do material a ser cromatografado). Para escolha do sistema cromatográfico seguir as instruções contidas no capítulo Noções gerais de cromatografia. ROTEIRO 1. Prender a coluna em posição rigorosamente vertical em um suporte firme, retirar a torneira e colocar um chumaço de algodão que permita o fluxo do eluente e impeça a sa ída das partículas do adsorvente. 2. Misturar à parte o adsorvente com quantidade suficiente do eluente usado no início do desenvolvimento da cromatografia, de modo a formar uma mistura espessa porém fluida e livre de bolhas de ar. 3. Colocar sob a coluna um becher com capacidade duas vezes maior que a coluna e verter a mistura adsorvente-eluente no seu interior através de um funil, de modo a evitar a formação de bolhas de ar e manter sempre o adsorvente coberto pelo eluente. 4. Transferir para a coluna, sucessivamente, o restante da mistura adsorventeeluente utilizando para isto parte do Iíquido recolhido durante a operação de enchimento. 5. Lavar piceta retidas deixar

o orifício da torneira com o mesmo solvente colocado em uma a fim de retirar as partículas de adsorvente que tenham ficado na parte inferior da coluna e, em seguida, colocar a torneira e escoar o eluente até quase descobri r o adsorvente. 101

6. Preparar o topo da coluna (zona de partida) de modo a formar uma faixa da menor espessura poss ível, obedecendo a técnicas seca ou úmida, a segui r descritas:

7.1 Técnica

úmida - colocar sobre toda a superfície do topo da colun<l com aux ílio de uma longa pipeta Pasteur, a solução saturada do material a ser cromatografado feita no mesmo solvente em que foi preparada a coluna. Alternadamente, colocar pequenas porções do eluente (0,5cm de espessura) e fazê-Ias escoar até que o líquido sobrenadante permaneça incolor.

7.2

Técnica seca - preparar uma mistura material-adsorvente na proporção de 1:1 ou, no máximo, 1 :3, da maneira indicada no item 1 da técnica 1, e colocá-Ia no topo da coluna, procedendo em seguida da maneira descrita na etapa final do item anterior.

8. Desenvolver a cromatbgrafia iniciando o processo com o c1uente menos polar, aumentando em seguida, progressivamente, a polaridade da fase móvel por adição de solvente mais polar, a cada etapa equivalente ao escoamento de volume aproximadamente igual ao dobro ou ao triplo do volume morto da coluna. 9.

Recolher o eluente fracionadamente. Cada fração deve ter um volume igualou menor que a metade do volume morto da coluna.

10. Examinar

as frações recolhidas quanto às analogias e diferenças de composição, com auxílio da técnica de cromatografia em camada delgada (cromatoplacas).

ROTEIRO I. Selecionar os dois recipientes pi;lra montagem do sistema de tal modo que possam conter um volume total de solvente correspondente a 20-50 vezes o peso de adsorvente utilizado e que a área da secção transversal de um (recipiente misturador-B) seja quatro vezes maior que a do outro (recipiente-A). Ambos os recipientes deverão ser cil índricos e conter os dois solventes no mesmo nível. /. Montar a coluna figura 5.

(veja Técnica

3) e adaptá-Ia

ao sistema

mostrado

3. Montado o sistema, ligar o agitador (mecânico ou magnético) e encher os tubos comunicantes entre os três recipientes; abrir a torneira da coluna e colher frações equivalentes a 50% do volume morto da coluna (técnica 8). 4. No caso de misturas pouco complexas, pode-se usar um único gradiente (por exemplo: benzeno - acetona). Nos casos mais complexos, é conveniente o emprego de gradientes intermediários em duas ou mais etapas (por exemplo, hexano - acetato de etila e depois acetato de etila-metanol). Sempre o solvente mais polar é colocado no recipiente doador, e o menos polar, no recipiente misturador. Obs.: O uso do clorofórmio é dificultado por sua densidade elevada, o que provoca repetidas interrupções causadas por quebra da coluna Iíquida nos tubos comunicantes.

11. Reuni r as frações iguais, desti lar o solvente vácuo e protegê-Ias

contra

até à secura, secá-Ias em alto a ação da luz, do ar e do calor.

"k-

NIVEL INICIAL

T~CNICA

RECIPIENTE DOADOR COM SOLVENTE MAIS POLAR

5 COM

AGITADOR

Explicação

+;:m-:& ~ .~

MAGNnlCO

Preliminar

Para melhor desempenho do processo cromatográfico escolha como eluente os solventes ou misturas de solventes capazes de dissolverem completamente o material a ser cromatografado, na proporção de 1 parte do material para 2-5 partes do solvente. Obs.: Quanto maior a solubilidàde mais estreitas são as faixas cromatográficas, podendo-se usar maior velocidade de eluição. Substâncias pouco solúveis tendem a formar grande alargarmento "das faixas. 102

RECIPIENTE MISTUAADOA COM SOLVENTE MENOS POLAR

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇAo EM COLUNA GRADIENTE DE ELUIÇÃO

//Fig. 5 _ Montagem de sistema cromatográfica com gradiente de eluição. Os recipientes escolhidos permitem usar a relação 1:50 - 100:1000 - 3000. de material: adsorvente: mistura eluente. 103

T~CNICA

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO EM COLUNA A M~DIA PRESSÃO (5)

!JESENVOLVIMENTO

DA COLUNA:

1. Escolha todo material de trabalho de acordo rior e monte o sistema. Numere os recipientes

com os dados da tabela ante· coletores.

(TE;CNICA RÁPIDA)

---l

Material: 1. Colunas cromatográficas 2. Sílica-geI40-60

(modelo na figura seguinte) de vários diâmetros.

m,u (E, Merck n.o 9385 ou equivalente),

3. Bomba de vácuo - ar comprimido, (pressão e vácuo):

com regulador de fluxo e manômetros

I I

4. Recipientes de coleta e eluente de baixa viscosidade.

+--

DISPOSITIVO DE ENTRADA

PARA ADAPTAÇÃO DE AR COMPRIMIDO

Procedimento: Operações preliminares:

1. Escolha do Eluente. Separe uma amostra da mistura a ser cromatografada e analise-a em cromatografia de camada fina, empregando vários tipos de eluentes (ver técnica 3) em que a mistura seja bem solúvel. O eluente que separar melhor a mistura, deixando o constituinte desejado (ou o de menor Rf), aproximadamente na posição de Rf 0,35, deve ser escolhido como eluente da coluna.

2. Escolha da coluna e do volume do eluente. Escolha a coluna de diâmetro adequado à quantidade de amostra dispon ível e prepare o volume de eluente conforme está indicado na tabela a seguir, que indica também o número e volume das frações a serem colhidas. PARÂMETROS DO ELUENTE

PARA ESCOLHA DA COLUNA E DO VOLUME EM CROMATOGRAFIA DE M~DIA PRESSÃO

ml (a) 20 1000 5 40 30 16 das Número emml40 10 -de 40 160 8 30 20 100 -do 400 50 10 30 35 50 31000 60 ;;;;. Volume Volume 20 18-20 600 eluente 45600 coluna em em 200 30 f:.Rf 01 frações frações

a) volume normalmente

+--BOMBA

DE VACUO·AR

COMPRIMIDO

Diâmetro da

necessário para preparação e eluição da coluna.

Fig. 6 ~ Conjunto de materiais necessiÍrios a execução da cromatografia pressão (flash chromatography).

I (quida de média

105 104

"""'<

2. Coloque na salda da coluna uma pequena porção de lã de vidro ou algodão, com auxnio de uma vara de vidro (6-8 mm de q;) e cubra-a 3-4mm de areia (50-100 mesh).

T~CNICA 7 COIII

3. Coloque de uma vez a quantidade adequada de s(lica (sem solvente) de modo a formar um leito com 15-18cm de altura. Mantendo a torneira aberta, dê rápidas e leves pancadas na ponta inferior da coluna para acamar a sílica usando para isto um pequeno martelo de borracha e, em seguida, superponha uma camada de 3-4mm de areia (50-100 mesh) para proteção do topo. 4. Encha a coluna com o eluente escolhido e aplique a pressão de ar, uniformemente, de modo a escoar quase todo eluente e eliminar as bolhas de ar. Aproveite para regular a pressão de modo a provocar uma descida do eluente numa velocidade de fluxo de 5cm por minuto, tendo o cuidado de deixar um delgado filme de eluente sobre o topo. Alivie a pressão. 5. Aplique a amostra (dissolvida no mesmo eluente em concentração de 20-25%), deixe-a penetrar naturalmente na sllica do topo da coluna, tendo o cuidado de lavar as paredes com o menor volume posslvel do eluente e não deixar secar o topo. 6. 8ecoloque em seguida todo o eluente na coluna, prepare os recipientes de coleta e aplique a pressão cuidadosamente, reajustando, se necessário, a torneira de pressão para garantir o fluxo correspondente a uma descida de liquido de 5cm por minuto. 7. Mantendo o fluxo constante, coleta as frações com o volume indicado na tabela, nos recipientes previamente numerados reservando-as para posterior exame. 8. Lave a coluna com o mesmo tipo de eluente adicionado de 20% de metanol. Recupere o solvente e verifique se o reSiduo ainda é útil. 9. Desmonte o sistema e retire a sllica ainda úmida, aplicando a pressão de ar comprimido na coluna em sentido contrário ao do fluxo normal e reserve a sllica para posterior recuperação. 10. Verifique, com aux(ljo de cromatografia em camada fina, o grau de pureza das frações coletadas e, se necessário, repita o processo de separação com as frações maiores ou com a fração desejada em uma nova coluna ou em placas preparativas.

Obs.:

<----------.

A pressão necessária para o desenvolvimento da eluição pode ser conseguida pelo uso de garrafões de ar comprimido ou, preferencialmente, de nitrogênio.

FILTRAÇÃO EM GEL PARA SOLVENTES ORGÂNICOS HIDROFltlCOS (Sephadex LH. 20)

1. Lavar o gel com solução de HCI 0,1 N, depois com solução de NaOH na mesma concentração e, em seguida, com bastante água, e, finalmente, com o solvente a ser usado. As separações são feitas por centrifugação. 2. Deixar uma quantidade apropriada de Sephadex entumescer durante pelo menos 24 horas, com volume suficiente do solvente a ser usado como eluente. 3. Montar a coluna pelo processo úmido transferindo de modo ininterrupto toda a mistura para o interior da coluna. Aguardar que se processe a sedimentação antes de iniciar a cromatografia. 4. Para simples filtração, quando se deseja apenas eliminar resinas e compostos parecidos de peso moiecular elevado, é suficiente filtrar a solução da amostra através da coluna, em seguida lavar a coluna com o mesmo solvente (pequeno volume) e finalmente eluir o material desejado e privado da "resina". 5. Para fracionamento por migração diferencial, usar colunas maiores (cerca de 1m/3cm) e regular o fluxo para 3-6 ml por hora. 6. O gel é conservado entumescido, isto é, em contato com grande volume de solvente hidrofílico e protegido contra ataque de fungos por adição de azida sódica em quantidade apropriada. T~CNICA 8 CROMATOGRAMA (Diagrama Concentração/Volume

dos Eluatos)

1. Colher frações do mesmo volume, cuidadosamente medidas e determinar a concentração de cada fração. Isto pode ser feito por evaporação do solvente e determinação do peso da fração. 2. O volume das frações nunca deve ser superior ao volume morto da coluna (técnica 9). 3. Lançar no eixo das abscissas os valores correspondentes ao volume acumulado de cada fração. 4. Lançar no eixo das ordenadas os valores de concentração encontrados em cada uma das frações. 5. Traçar o perfil da curva obtida pela interligação dos dados numéricos.

106

107

--.oIIl

EXEMPLO:

EXEMPLO

15i A

141

volume real do solvente

13 121

li,

101

B:=

volume aparente do solvente

volume real do adsorvente

volume aparente

(sílica-gell

9 ~10mg[

8: '1

do adsorvente

c= B-A

6i 51

D - C

. i.

Volume Morto do Adsorvente:= VM

p ,;;: peso do adsorvente

Fator VM

= __VM

-P

Fig. par 7 -separado Cromatograma um C

indicando a separação de três substâncias puras IA, B e DI e

TÉCNICA

Fig. 8·- Determinação indireta do volume plique o fator encontrado experimentalmente ração da coluna.

TÉCNICA DETERMINAÇÃO DO VOLUME MORTO EM COLUNA CROMATOGRÁFICA

ACETILAÇÃO

COM ANIDRIDO

1Og de adsorvente

ou de suporte

a mistura

e deixar em repouso

durante

e o nível

5. No caso de materiais que sofrem entumescimento, o volume de solvente deve ser elevado para 30ml e a proveta deve ter capacidade para 50ml. Valores mais elevados poderão ser utilizados no caso, se necessário. 6. O aumento de volume do solvente é equivalente ao volume real do adsorvente (C). O volume lido ao nível ocupado pelo adsorvente equivalente (D). ao volume aparente de sllica ou outro adsorvente em experiência

8. Os valores devem ser calculados nações.

entre o volume aparente

(O) e

sobre a média de pelo menos três determi-

9. Multiplicando-se o fator VM pela quantidade de adsorvente o volume da coluna para o sistema solvente-adsorvente usado. 108

morto da coluna cromatogrâfica. MultIpelo peso do adsorvente usado na prepa-

10 - ACETATO

DE SODIO

LADOS)

1. Misture 300mg do composto a ser acetilado com sódio fundido em pó e 1 ,5ml de anidrido acético. 2. Aqueça a mistura

meia hora.

4. Ler os volumes correspondentes ao nível dado pelo adsorvente alcançado pelo solvente, como está indicado no desenho seguinte.

7. O volume morto (VM) é dado pela diferença o volume real (C).

inerte.

2. Colocar em proveta de 25m I um volume de 20ml (A) de solvente e, cuidadosamente, por sobre o solvente, a quantidade de adsorvente pesado. 3. Homogeneizar

ACÉTICO

(POLIHIDROXI 1. Pesar rigorosamente

determina-se

em BM, com agitação

ocasional,

150mg

de acetato

por duas horas.

3. Deixe esfriar e misture, sob vigorosa agitação, com 10ml de água com gelo e aguarde pelo menos meia hora para que se complete a hidrólise do anidrido. 4. Remova os cristais por filtração, por recristalização em etanol.

lave-os com água destilada,

e purifique-os

5. No caso dos cristais não se formarem, extraia os acetatos com clorofórmio, em um funil de separação, fazendo pelo menos três extrações com 5-15ml. 6. Lave o extrato c1orofórmico com solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5% até retirar todo ácido acético e, em seguida, com três porções de 10ml de água destilada. "7. Separe a solução clorofórmica (que deve conter os acetatos) trate-a com sulfato de sódio anidro para retirada completa da água, filtre, concentre e deixe cristalizar. Obs.:

Pode ser usada para acetilação

de alcalóides

* Adaptado de Shriner et alii, Systematic identification New York, Willey & Sons, 1979.

hidroxilados. of organic compounds,

6th,

109

TÉCNICA 11 1000 150 100 300 500mg. 200 50 ACETILAÇÃO COM ANIDRIDO ACÉTICO - PIRIDINA'

ÓLEO

ml. mg. 1000 100 250 MEOH 300 500 250 500 50 200 150 50 100 126 50 ml. BALÃO 129 KOH

1. Dissolva 200mg da amostra em 2ml de piridina anidra e junte 1ml de anidrido acético, feche bem o recipiente e agite a mistura. 2. Logo que a reação seja iniciada (elevação da temperatura) aqueça a mistura sob refluxo por 2-3 minutos. 3. Coloque a mistura em 2-10ml de água com gelo. O acetato pode ser removido por filtração, se cristalizar. 4. Não havendo cristalização, extraia o acetato, em funil de separação com 3 vezes 10ml de clorofórmio.

4. Saponifique o óleo sob refluxo durante 40-60 minutos e, em seguida, destile 70-80% do metanol.

5. Para retirar o excesso de piridina, lave o extrato clorofórmico 2-3 vezes com HCL-N, rapidamente e, em seguida, com água destilada. Verifique o pH que deve estar abaixo de 7.

5. Restaure o volume inicial com água (solução de sabão com o insaponificável) e extraia os insaponificáveis, em um funil de separação, usando 5-6 porções sucessivas de éter etílico equivalentes a 1/10 a 1/4 do volume de água.

Para retirar o excesso de ácido, lave o extrato clorofórmico com solucão 5% de bicarbonato de sódio e, em seguida, com água destilada .. 7. Separe bem a solução c1orofórmica, trate-a com sulfato de sódio anidro, filtre, concentre, deixe cristalizar. Obs.: Caso reste ainda piridina ou anidrido (ácido acético) repita as etapas 5 a 7. Faça as operações 1 e 2 na capela. * Shriner et aI/i. Op. cito

6. Reúna todo éter resultante das lavagens, concentre até 100-150ml, e lave uma vez com solução dilu ída de KOH (aproximadamente 0,1 N) e duas vezes com água; agite com Na2S04 anidro, deixe em repouso por 15 minutos, filtre, destile todo o éter, pese o resíduo e calcule a proporção de insaponificáveis no óleo (%). 7. Reúna as águas de lavagens, inclusive a de KOH, com a solução de sabão, acidule com H2S04, extraia com três porções sucessivas de éter após a separação dos ácidos graxos que formam a camada sobrenadante. 8. Lave o éter uma vez com água, agite-o com Na2S04 anidro, filtre e concentre. Pese os ácidos graxos obtidos. Para obtenção dos ésteres metílicos, siga a técnica 12.

TÉCNICA 12

* Adaptado de Oficial methods of analysis of A.O,A.C - 11th ed" Washington, 1970.

ANALISE DE ÓLEOS FIXOS (RENDIMENTO, INSAPONIFICAvEIS ACIDOS GRAXaS) DE SEMENTES~

1. Determine o teor de umidade (voláteis a 100-5°C) de 5-10 gramas de sementes ou, de preferência, de suas amêndoas. Neste caso, calcule também a proporção de amêndoas nas sementes. 2. Extraia com hexano 2-5g de semente, ou de preferência as amêndoas das sementes. Trate o extrato hexano com Na2S04 (15 minutos), concentre, pese e calcule o rendimento de extrativos em hexano (óleo ou gordura) sobre o peso seco, isto é, descontando a umidade. 3. Misture o óleo ou gordura obtido com solução de KOH em metanol preparada na ocasião de usar, conforme a seguinte tabela. 110

TÉCNICA 13 METILAÇÃO DE ACIDOS GRAXaS COM TRIFLUORETO DE BORO (ÁCIDOS EM C8-C24)* 1. Colocar a quantidade 50-125ml.

de ácidos graxas indicada na tabela em um balão

2. Adicionar a quantidade especificada de BF3 MeOH, adaptar o condensador e submeter à fervura por dois minutos. 3. Deixar esfriar. Adicionar, pelo condensador, deixar ferver por mais um minuto.

2-5ml de hexano puro e

111

-----.olIlIIl

"'~

i "

4. Deixar esfriar. Retirar o condensador- e adicionar alguns mililitros ção saturada de NaCI, agitar dUl'ante 2-3 minutos e transferir para de decantacão .

de S"III UIlI

. 'I.'.

a~V'!

5. Depois de separadas as duas camadas, retirar o hexano que contém os ésteres meti'licos, agitar' a solução hexânica com 4-5g de Na2S04 anidro e deixar em contato por 15 minutos. Filtrar. que deve ser fechada

Tabela para escolha do recipiente e quantidade do reagente em função da disponibilidade da amostra.

~\f

.Hít.,K~di

6. Transferir a solução hexânica para um ampola mantida na geladeira até sua análise por CGL-EM.

)

I.. .ji

1111111

l~'

Costêil,

et aiii. Rio

~h'

L·U para metilação A a

Ácidos -graxos (mg)

759 Recipiente 50 (ml) (ml) 12 125 BF3-MeOH

,..

* Adaptado de Oficial \"ashington, 1970.

methods

of analysis of A.O.A.c.

T~CNICA METILAÇÀO

11 th ed.,

'}:'.

14 Di ~U3iBsta

COM DIAZOMETANO*

'~1dif,;~oner por rrU(]hi

4. Cuidado: Use a Capela, evite o contato dos vapores com os olhos, a pele e as mucosas. 1. Coloque em um erlenmeyer de 250ml de solução aquosa 50ml de éter etílico; resfrie a misture abaixo de 5°C.

de KOH (1:1) e

2. Transfira a mistura para um erlenmeyer de 250ml gelado e adicione, pouco a pouco, com agitação, 0,5g de nitrosometiluréia. A camada de éter deve adquirir uma coloração amarelo-esverdeada.

~(j\f~9"OS

5. COtl"j

3. Escoe a solução de KOH e receba a solução etérea de diazometano em um erlenmeyer de 125ml contendo cerca 5-10g de KOH em pastilhas. Feche com uma rolha de borracha e deixe em repouso por duas horas. Esta solução deve conter 0,05 e 0, 19 de diazometano e pode ser conservada em geladeira por 48 horas. 4. Dissolva 0,2 fenol) em 1

°-

112

0,3g da substância a ser metilada (ácido carboxílico ou 20ml de éter ou metanol absoluto. Adicione, pouco a

onrtf;r

fl'mtoxi!a

,e..ddplíJdc)

de Janei!o,

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H L -~-',,~lcLCos·(a.

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...

....••

APÊNDICE

Neste apêndice estão inclu ídas as seguintes informações complementares ao texto. 1. Técnica de herborização de plantas. 2. Relação, por ordem alfabética, de reagentes e soluções utilizadas na técnica de abordagem fitoquímica.

TÉCNICA EXTRA

HERBORIZAÇÃO

DE PLANTAS

1. Disponha adequadamente o material da prensa como mostra a figura seguinte, para facilitar sua montagem. 2. Corte vários pedaços, de aproximadamente folhas e, se poss ível, frutos.

30cm, de ramos floríferos com

3. Coloque sobre um dos lados da prensa sobre as cordas, e disponha um sobre o outro sucessivamente, um papelão, um jornal, um ou dois ramos, um jornal e um papelão. De novo um jornal, um ou dois ramos, um jornal e um papelão e assim até completar 3-5 conjuntos de uma dada espécie. 4. Junto ao último ramo coloque uma ficha de identificação do material com indicação sobre o nome vulgar, porte da planta (erva, subarbusto, arbusto, trepadeira, árvore) local, data de coleta e o nome do coletor. 5. Repita a operação com outras espécies até formar um conjunto de no máximo 50cm de altura. 6. Coloque o último papelão e a outra parte da prensa, amarre o conjunto fortemente e deixe-o ao solou em estufa, para secar. 7. Reaperte as amarras à medida que o material for secando e, no dia seguinte, troque os jornais e termine a secagem. 8. Separe as exsicatas, cada uma em uma folha dupla de papel, coloque a ficha de identificação e consulte o botânico para conseguir a determinação taxonômica do material.

Obs.:

A secagem poderá ser feita após estabi lização em forno de microondas em três etapas de dois minutos cada uma. As exsicatas ficam esterilizadas e as cores naturais são mantidas (M. M. Plumel, Paris, 1987 (informação pessoal). 117

-------.....

~~-

PREPARAÇÃO

DE EXSICATAS

AMARRAS

REAGENTES MAIS UTILIZADOS NA ABORDAGEM FITOQUrMICA *

DE CORDA FINA

1. ACETA TO DE SOOlO ANIDRO:

5,Og de acetato fechados.

J __jI

1/ I /

I /1

I I(

PAPELÃO CORRUGADO

de sódio anidro

Pese, rapidamente, cinco porções de e conserve-as em recipientes bem

CLORlbRICO CONCENTRADO: Meça 100ml de ácido clorídrico concentrado e conserve em frasco de v~dro de tampa esmerilhada. Proteja o rótulo com um filme de matéria plástica. Cuidado: evite a aspiração iJãs vapores e o contato com a pele e mucosas.

2. ÁCIDO

CLORIDRICO (3 N): Dilua 33,3ml de ácido clorídrico concentrado com água até obter 100ml. Esta solução é correspondente a 10 por cento p/v de HCI.

3. ÁCIDO

CLORIDRICO rv 0,1 N (concentração aproximada): Meça, em uma pequena proveta, 12ml de ácido clorídrico concentrado e transfira para uma proveta de 1000ml. Complete o volume com água destilada. Conserve em frasco de vidro com tampa rosqueada.

4. ÁCIDO

SULFÚRICO CONCENTRADO: Separar e reacondicionar em porções de 50ml em frascos de rolha esmerilhada, hermeticamente fechados. Cuidado: altamente corrosivo.

5. ÁCIDO

ET/LtCO (isento de alde ídos): Deixe 1 litro de álcool etílico comercial (960 GL) em contato com 10g de hidróxido de potássio em pastilhas durante cinco dias. Aqueça até a ebulição sob refluxo durante duas horas. Destile até recolher 700ml. Conserve em frascos bem fechados.

6. ÁLCOOL

(6 /11) OU HIDROXIDO DE AMÔNIO (6 N): Dilua com água 50cm3 de hidróxido de amônia concentrado, até obter 1OOcm3. E-sta solução corresponde a 10 por cento p/v de NH3, aproximadamente. Cuidado: evite a aspiração dos vapores e o contato com o olho, pele e mucosas.

7. AMÔNIA

RAMO FLORfFERO

ACÉT/CO: Meça 250ml de anidrido acético, "pro análise" transfira rapidamente para um frasco de tampa rosqueada .. Cuidado: evite o contato com a pele e a aspiração dos vapores.

8. ANIDRIDO

TO DE SOOlO a 10"/0 (solução-mãe): Pese 100g de bicarbonato de sódio, transfira para uma proveta de 1000ml e complete o volume com água destilada. Conserve em frasco de vidro com tampa rosqueada.

9. BICARBONA

PACOTE FORTEMENTE AMARRADO COM ALTURA MÁX IMA DE 50cm.

Fig. 9 - Seqüências de operações de montagem da prensa para preparação de exsicatas de plantas. 118

DE SOOlO a 2,5%: Em uma proveta de 1000ml dilua 250ml da solução-mãe com água destilada até completar o volume. Conserve em frasco de vidro com tampa rosqueada.

10. BICARBONATO

* Adaptado da Farmacopéia Brasileira, 2,a edição,

Ed. Governo Federal, M. S., São

Paulo,1958.

119

---

1'1. CAPBOllIA anidro ou q!,Jantidade

21. PIRlDiNA: Destile 150ml de piridina de modo a recolher 100m I do destilado. Mantenha sobre 5-lOg de hidróxido de sódio em lentilhas, em 'frasco âmbar bem fechado .

h iclr:i.itadio

Cuidado: Evite o contato com a pele e a aspiraçâ'o de seus vapores. 12.

22. REAGENTE DE BERTRAND (ÁCIDO SILlCOTÚNGSTlCO): 59 de ácido silicotúngstico em q. s. de água para aLter 100ml.

13.

Cuidado:

il/i:iDG're'8

"~4.

contato com os alhos,

fechado.,

Cuidado:

~.) t~

25. REAGEIIITE DE HAGER (SOLUÇÃO SATURADA DE ÁCIDO PICf1'!CO): Dissolva '12g de ácido pícrico em 100ml de água qüente. Deixe esfriar e filtre. Conserve em frasco de tampa esmerilhada.

, íJiil.lil

26. REAGENTE DE MA YER (IODOMEf1CUARATO DE POTÁSSIO): de cloreto de mercúrio em 60ml de água e 5g de iodeto Dissolva, 'j de potássio en! 20ml de água. Misture as 2 soluções e dilua com água até obter 100ml.

6.. 17.

{)l·::-

:'p50m~ 250ml

~:1e

carbono quando gua.dadas Cuidaa'o:

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b()uT3Cha

ou p!~~stk:o.

C{}tf(}1sivD,

WOOml

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t:;

os i/aparc;s. Hl. fllflS i

de dicromato comercial.

de sódio em de écido sulfÚtampa r:smerilhada.

t:c'nS'2'n,'<~

Cuidado: Tóxico e 20. f"/-Wt:L Vi:: PiCHA a tiras entre dUiClS de carbonato i}~~,;ti ras 120

23. REAGENTE DE DRAGENDORFF (lODOBISMUTADO DE POTÁSSIO)' Junte 50cm3 de água a 5g de carbonato de blsmutila, adicione 12cm3 de ácido clorídrico e agite- até quase dissolução; junte a"os poucos e agitando sempre 259 de iodeto de potássio, e após dissolução, complete com água até obter 100m!. 24. REAGENTE DE DRAGENDORFF MODIFICADO (reagente de pulvede cromatoplacas ou papel): Em um balão de 1DOml junte a 25ml do reagente de Dragendor'ff 18ml de ácido acético e complete os 100ml com água destilada.

becher

<1.

Dissolva

U0%.

ole de

Torne

ck~ 'km){ 8em de papel de p8tri contendo saiu·· de prensando as er1'1 seguida em a retirar excesso da saiu·

27. REAGEIVTE ALCALINO):

DE fIIESSLER Em uma cápsula

(IODOMERCURA TO de porcelana, dissolva

DE POTÁSSIO 59 de c1oreto de

merclJrío em cerca de 50ml de água aquecida a 60-10° e- a essa solução outra de 7,4g de iodeto de potássio em lOml de água. mlKJiataime se forma um precipitado vermelho; deixe depositar, decante e lave uma vez com água. Em seguida, junte 7g de iodeto de potássio e q.s. de água dissolver. Transfira para um balão volumétrico de 1DOcm3 e adicione uma solução de 20g de hidróxido de sódio em cerca de 60cm3 de água. Complete o volume com água e deixe em repouso por 48 horas. Filtre através de placa filtrante de vidro; conserve em frascos âmbar de tampa esmerilhada. 28. TRIFLUORETO DE BORO-METANOL: Transfira porções de 5ml da solução comerciai para frascos hermeticamente fechados com selo de borracha (tipo frasco de penicilina) ou, preferencialmente, para ampolas de vidro.

Cuidado: muito tóxico_ Evite a aspiração dos vapores e o contato com os olhos, a pele e as mucosas.

121

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fndice Remissivo

ASSUNTO

PÁG.

18,19 113 109 119 54 113 53, 109 110 Ácido Acético 121 Ácido Cafêico 40 Ácido Cloridríco Concentrado 119 Ácido Cloridrico-O,l N 119 Ácido Cloridrico-3N 119 Ácido Clorogênico 40 Ácido Dimetil-Elágico 40 Ácido Gálico 43 Ácido Oxálico 40 Ácido Picrico 10% 120 Ácido Ouimico 40 Ácido Salicllico 40 Ácido Silicotúngstico 121 Ácido Sulfúrico Concentrado 119 Ácido Tartárico 40 Ácidos Fortes 47,50,59 61,88 51,88 Ácidos Fracos 61,411 Ácidos Graxos 33 Ácidos Orgânicos 74,75, Adsorção 101 77 Adsorventes 8 Agave 46 Agave spp 53 Agliconas Esteróides

Abordagem Acetamida Acetato de Sódio Acetato de Sódio Anidro Acetato de Vinhaticila Acetil-Metil-Uréia Acetilação

PÁG.

ASSUNTO

Agliconas Flavonóides Agliconas Triterpenóides Alcalóides Álcool Etilico Anacardium occidentale L. Análise Imediata Anetol Anidrido Acético Antirhinus majus L. Antocianina Antranóis Antraquinonas Aspidosperma pyrifolium Mart. A tropa beladona L. Atropina Aureosidina Auronas Babaçu Bases Orgânicas Bases Ouaternárias Bergaptol Beta-Amirina Bicarbonato de Sódio Bicarbonato de Sódio 10% BÍl:arbonato de Sódio 2,5% Biflorina Bioflavonóides Bordo Caudal Bordo Frontal Borracha Botânica Promo Brosimum

gaudichaudii

53 53 7,47,55 119

43 69 32 109

44 39

5,58 51

38 49

8 44 39,44

15 33,55 57

54 60 119 120 119

52 41 72, 73 72, 73

22 25 113

54 123

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".....~-

de Potássio Helianrhus L. Estévia 61 46 7110 lodomercurato 111 Fitognomônica 45 38 53.58,59, 47,121 11"'8,os(d,os Clanogênicos IWild "'xitois Pilocarpina jaborandi Rutina 8,20 38 llidrólise Ácida Resinas Il,u,ólise IIICiróxido Concentrado Alcaiina de Amônlo Piloearpus Holmes lodobismutato 70%annuus HPLC Ilidróxido de Amônio-6N Bertrand Sehinus terebentifolius Raddi 43 1l,',;pcridlna Hidróxido de Potássio-N Sódio Sódio-N 2% Reserpina 111,112 Reagente de Mayer Scopolia camiolica Saponificação Esteres Erva-Doce Met li icos Emulsões Picrato deBibliográfica Sódio lodeto de Potássi oL.Cogn. Emetina Eluentes Espermatófitas Dulcitol Eletroforese Iso-Cucurbi taci na-B Isotermas deperuiferum Adsorção N-NitrOSo-N-Metil Uréia Nicotiana tabaeum Nitrito de Sodio Escopolanina Nicotina Isolamento Oleandrogenina Non-Equilibrium Esquimianina Nerium Sulfo-Crômica Esterificação Insaponificáveis Leucoantocian idinas Latex Móvel Marcha Ou (mica Dioscorea spp Mistura "'ter-Clorofórmio Morfina Ergonovina Espectrometria Leucocianidina Líeberman· Burchard Linamarina Normal Reversa Manihor eseulenta Crantz Dipteryx Pesquisa odorata 22 Fase Fixa Ir 58,59,88 83 7 Luffa opereulata Lampada Uv Nepetionaoleanaer Metilação 60 38 Lapachol 41 Fenóis MVroxylon L. Mangiferina Lupeol 78 45 Farmacognosia 44 Laguneularia raeemosa Liqueretina 116 Migração Diferencial Mangifera indica Ligada 52 Lip(dios 54 48 8 120 42 40 100 58 Protidios 47 50,51,61 Selagine!a convoluta Polaridade Paulinia cupana L. var Saponinas 1 '13 37 58,110, LI 32 121 27 07 46,60 38 119 Ij" 46 '11\ :n 38 24 110 Ouinonas 51 56 45,53 69 Benth. Piridina 73 70 49 SlIica Gel H 14 Olivacina Série Eluotrópica 50 -li 1/ 111 Miers. Peneiramento 37 Molecular 54 Polihidroxi lados 109 75,77 Pirifolina HF 17 41 22,87 94 121 112 113 40 Peletierina 31 40 &,41 32 44 S(lica Fluorescente 46 8 Periandra Óleos Fixos mediterranea 56 Taub. 32 Óleo Essencial Pesehiera affinis 23 (Muel :,Arg.) 72 8,48 107 48 7 60 39,51,57 16 32 Ouebrachitol 32 39 99 15 58 39 52 59 43 sorbilis L, 107 104 8 Polvgala spp 45 58 Punica granatum 74,84 L. Herbário 49 H 48 Oxalis Spp 55 47,151 Esteróides 45,53,59 Pirogalol 120 Papaina Sephadex LH-20 Piloearpus Plathymentia mierophy/lus retieulata Exsicatas Exclusão Estérica Papel de Picrato 39,42 de Sódio 50,G1 Stapf. 85,86, Glicidios Gordura Flavonóides 20,39,42 85,102 41,42, Pimpinella anis um L. Glicosídios Flavanonóis Heineanina (EPI) Flavanonas Flavona Dimorphandra molis Eucalipto Eucaliptus globulus Labil Eugenia earyophyllus Eugenol Hecogenina Spreng Gradiente de Eluição Gossypium spp Giosogenina Filtração em Gel 111111HHIL<.Jçáo Reagente de Hager Sapogeninas

Salicilato lunatus de Dragendorff MetilaL Reagente de dePhaseolus Potássio Picrovataireina

125 43 110,121 98 95.99

)- ... 'li,

1.'1 Sorção

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Tubucurarina Triterpenóides Ultrn Violei" Trifluoreto Trealose de40 Boro 2 24 5 p' 1 02 70 /\1 Torresea cearenslS 33 20 102 ,. 69,17 856 II1 I!l 14,25 !)) 108 Xantonas Vincristina Vincamina Volume Morto 39,42 /11 I, na I I _~. Ducke I I' I V ingaleucoblasti Varairea macrocarpa Zanrhoxylon rhoifolium Uricuri

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IllIl Engl. Viris spp

m 126 i.

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