INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL PRACTICA N° 6
Laboratorio de Bioorgánica
Hidrólisis de una proteína y ensayos para proteínas y aminoácidos
ALVAREZ ALVAREZ VERONICA
MONTIEL ZUÑIGA XAREMI
VALDES ORTIZ ALVARO ANTONIO
OBJETIVOS
Efectuar la hidrólisis total de una proteína
Identificar algunos aminoácidos presentes en un hidrolizado de proteína, por medio de sus propiedades físico-químicas
Identificar por cromatografía en placa fina algunos de los aminoácidos presentes en un hidrolizado de proteína.
INTRODUCCION
Antecedentes teóricos
Fundamentos teóricos
ANTECEDENTES TEORICOS
¿Qué son las proteínas?
Largas cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Constituyentes fundamentales de todas las células y tejidos del cuerpo.
Constituyentes esenciales de la dieta necesarios para la síntesis de tejido corporal, enzimas, algunas hormonas y componentes proteicos de la sangre.
Se componen por carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y azufre.
SEGÚN SU FUNCION
A) Fibrosas o estructurales
B)Globulares
C) Conjugadas
SEGÚN SU NIVEL DE COMPLEJIDAD
A) primarias
B) secundarias
C) terciarias
D) cuaternaria
AMINOACIDOS
Moléculas simples formadas por la hidrólisis completa de una proteína
Unidad principal delas proteínas
Son esencialmente un ácido orgánico que contiene un grupo amínico en el átomo de carbono que se encuentra adyacente al grupo carboxilo
Estructura general
cα
Aminoácidos proteicos
Un grupo amino, -NH2, que aparece como su forma protonada -NH3+
Un grupo carboxilo, -COOH, que aparece como su forma disociada -COO-
Un hidrógeno, -H
Una cadena lateral, que es la que distingue unos aminoácidos de otros.
Tanto el grupo amino como el carboxilo aparecen ionizados; amino como -NH3+ y carboxilo comoCOO-.
CLASIFICACION DE AMINOACIDOS
Alifaticos
Aromáticos
Hidroxiaminocidos
Tioaminoácidos
Aminas secundarias
Dicarboxilicos
Dibasicos
FUNDAMENTO TEÓRICO
Hidrólisis de una proteína
La hidrólisis de proteínas es la ruptura de la estructura primaria, es decir la ruptura de la secuencia de una proteína.
La hidrólisis de las proteínas termina por fragmentar las proteínas en aminoácidos.
Debido a la hidrólisis, las propiedades moleculares de las proteínas cambian, produciéndose la disminución del peso molecular, el aumento de la carga y la liberación de grupos hidrofóbicos, entre otros fenómenos.
Tipos de hidrolisis
Hidrólisis ácida
Se basa en la ebullición prolongada de la proteína con soluciones ácidas fuertes (HCl y H2SO4).
Este método destruye completamente el triptófano y parte de la serina y la treonina.
Hidrólisis enzimática
Se utilizan enzimas proteolíticas cuya actividad es
PROPIEDADES DE LOS REACTIVOS
REACTIVOS
Acetato de plomo
Ácido clorhídrico
Ácido nítrico
Hidróxido de sodio
Nitrito de sodio
Sulfato de cobre
Alcohol terbutilico
Ninhidrina
INDICADORES
Fenolftaleina
Rojo Congo
AMINOACIDOS
Esenciales
Valina
Fenilalanina
No esenciales
Glicina
Alanina
0 3 0
LOS REACTIVOS. Acetato de plomo Ácido clorhídrico conc. Ácido nítrico conc. Hidróxido de sodio PM 325,2 g/mol 36.46 g/mol 63.02 g/mol. 2100 kg/m3 SOLUBILIDAD Soluble en agua y glicerina Soluble en agua soluble en agua soluble en agua PUNTO DE EBULLICIÓN 100◦C 48 °C 86 °C 1390 °C PUNTO DE FUSION 75°C -26 °C -42 °C 318 °C DENSIDAD indeterminad a 1190 kg/m3 (solución 37 %) 1413.4 kg/m3 (solución 70%) 1111 kg/m3 (solución al 10%) CARACTERISTICAS
PROPIEDADES DE
Nitrito de sodio Sulfato de cobre Alcohol terbutilico Ninhidrina PM 68.9953 160.61 g/mol g/mol 74.12 kg/m3 178.15 g/ mol. SOLUBILIDAD Soluble en agua Soluble en agua y metanol y ligeramente solubles en alcohol y glicerina soluble en agua Soluble en agua PUNTO DE EBULLICIÓN 320 °C 650 °C 83 °C Indeterminado PUNTO DE FUSION 271 °C 110 °C 26 °C 250-258 (descomposición DENSIDAD 271 kg/m3 (solución 80 %) 3603 kg/m3 (solución 20%) 775 kg/m3 680 kg/m³ CARACTERISTICAS 3 1 0 3 1 0 0 1 2
PM SOLUBILIDAD FORMULA MOLECULAR ph Vire Fenolftal eina 318,32 g/mol Soluble en agua y alcohol 0-8 8.2 12-14 Incoloro Rosa pastel Fiusha Rojo Congo 696.665 g/mol soluble en agua y soluciones orgánicas Menor de 3 3.0-6.2 7-13.5 Azul rey Purpura Rojo
Indicadores
Aminoácidos
Esenciales PM DENSIDAD PUNTO DE FUSION SOLUBILIDAD Formula Valina 117.15 g/mol 1316 kg/m3 25 °C Insoluble en agua Fenilalanina 165,19 g/mol Indetermi nada 283 °C Insoluble en agua No esenciales Glicina 75,07 g/mol 1607 kg/m3 236 °C Soluble en agua Alanina 89,09 g/mol 1401 kg/m3 297 °C Soluble en agua
DESARROLLO DE LA PRACTICA
a) PREPARACION DE SOLUCIONES
b) REACCIONES DE IDENTIFICACION
Preparación de soluciones
I. HIDRÓLISIS DE GRENETINA
II. SOLUCION NEUTRALIZADA DE HIDROLIZADO DE GRENETINA
III. SOLUCION DE GRENETINA SIN HIDROLIZAR
IV. SOLUCION DE ALBUMINA
I. Hidrólisis de grenetina (solución “A”)
REACCION DE HIDRÓLISIS DE UNA PROTEINA
DENOMINADAGRENETINA
PROTEINA α-AMINOACIDO
REACTIVOS
Cantidad Reactivo 1 g Grenetina 10 mL Ácido clorhídrico concentrado 10 mL Agua destilada 0.5 g Carbón activado
PROCEDIMIENTO
matraz
• 1g grenetina +
• 10mL HCl
reflujo
• Calentar suavemente
• 35 minutos
agregar
Filtrar
En caliente
• 0.5g carbón
activado
• Calentar 2 minutos
II. Solución neutralizada de hidrolizado de grenetina (solución “B”)
REACTIVOS
cantidad
Reactivo
5.0 mL SOLUCION A
La necesaria
El necesario
NaOH 10%
Papel PH
III. Solución de grenetina sin hidrolizar (solución “C”)
Cantidad Reactivo 0.5 g Grenetina 20 mL Agua destilada
REACTIVOS
IV. Solución de albumina (solución “D”)
Cantidad Reactivo 0.5 g Grenetina 20 mL Agua destilada
REACTIVOS
REACCIONES DE IDENTIFICACION
1. Reacción Xantoproteica
2. Reacción de precipitación
3. Reacción de Biuret
4. Reacción con Ninhidrina
5. Reacción con ácido nitroso
6. Acción reguladora de aminoácidos
7. Cromatografía en placa fina
REACCION XANTOPROTEICA
Solución “A”
HNO3 (CONCENTRADO)
Calentar en baño maría
Solución “A”
Adicionar NaOH 10% (pH básico)
Enfriar
Observar
REACCION DE PRECIPITACION
Solución A
Solución D
NaOH al10% Pb(CH3COO)2 AL 10% Calentar a ebullición 5 minutos
OBSERVAR
H2O
MECANISMO REACCION CON NINHIDRINA
Testigo H2O, NaOH al 10% Solución C, NaOH al 10%
REACCION DE BIURET
Solución D
Solución A, NaOH al 10% Solución D, NaOHal 10%
Adicionar CuSO4 al 2%
Agitar
OBSERVAR
Solución A
H2O
REACCION CON NINHIDRINA
Solución B
Solución C
Adicionar ninhidrina al 3%
Calentar 5 min en baño maría
OBSERVAR
Solución D
Solución al 1% de Aa patrón D
NaOH al 10%
5. REACCION CON ÁCIDO NITROSO
6. ACCION REGULADORA DE AMINOACIDOS
REACCION CON ÁCIDO NITROSO
Testigo sin proteína
Solución A
Solución C
Adicionar HCl concentrado
Enfriar adicionar NaNO2 al 5% OBSERVAR
Solución D
ACCION REGULADORA DE AMINOACIDOS
Solución B
Adicionar solución de rojo Congo
Adicionar NaOH 0.1 N
OBSERVAR
H2O
Adicionar solución fenolftaleína al 1%
7. Cromatografía en placa fina
Aplicar dos gotas de cada sustancia (solución B, aminoácidos patrón) Dejar secar
Realizar cromatografía en una mezcla 7:3 alcohol terbutilicoagua
Revelar usando solución de ninhidrina y calor Determinar valores de R.f
Sacar y dejar secar
BIBLIOGRAFIA
Lehninger, PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA, editorial omega, quinta edición.
Mathews, Van Holde, Ahern, BIOCHEMISTRY, editorial , tercera edición.
Rendina G. TECNICAS DE BIOQUIMICA APLICADA, edicion 1974, editorial interamericana.