Olga Martins Marques (Prof a UFPE - DEQ) Maria Alice Gomes de Andrade Lima (Prof a UFPE-DEQ) Maria de Los Angeles Peres Palha (Prof a UFPE - DEQ) Sonia M a Souza Cavalcante de Albuquerque (Prof a UFPE -DEQ)
Recife - Pernambuco 2011
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Apresentação A inexist ência de um t ext o de prát icas de Microbiologia Geral adapt ado às nossas condições do nosso laborat ório, e dest inado aos cursos superiores de Engenharia Química, Química Indust rial e out ros, nos mot ivaram à realização dest e ma nual. Os experiment os foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assunt os cont idos no programa referent es à primeira unidade do curso e podem ser facilment e efet uados em laborat órios de recursos limit ados. Cada experiment o, poderá ser efet uado p or um grupo de dois ou mais alunos. Muit as vezes o experiment o pode ser dividido ent re vários grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o experiment o numa det erminada condição. Nest e caso, o inst rut or dever fazer uma discussão a posteiori e global do problema apresent ado.
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PRÁTICA N 1: NORMAS DE CONDUTA OBJETIVOS: Conscient izar os alunos at ravés do conheciment o das normas condut as como proceder durant e sua permanência no laborat ório de microbiologia
INTRODUÇÃO : Inúmeras infecções podem est ar associadas aos t rabalhos com micro -organismos em laborat órios de microbiologia. Muit as vezes t ais infecções podem result ar na mort e do indivíduo. Ao cont rário dos acident es envolvendo subst âncias químicas e fogo, onde a causa e o efeit o são pront ament e id ent ificados, é muit o difícil, na maioria das vezes, det erminar se a molést ia infecciosa foi cont raída no laborat ório. O indivíduo pode ficar enfermo por muit os dias ou semanas após o cont agio, sem fazer associação. É part icularment e difícil fazer t al t ipo de associação com doenças que são freqüent es na comunidade, t ais como t uberculose, hepat it e e febre t ifóide. A experiência t em demonst rado que a inocuidade do t rabalho de pesquisa com micro -organismos perigosos depende das boas prát icas de laborat ório, da disponibilidade e uso de equipament os de segurança da inst alação, do funcionament o do local das pesquisas e de uma organização eficient e. Dest a forma para evit ar cont aminação, exist e a necessidade de aplicação das boas prát icas de laborat ório, o microbiologist a deve est ar seguro de que seus t écnicos cult ivam e empregam est as prát icas. As regras enumeradas a seguir const it uem a base das prát icas seguras de laborat ório. Em muit os laborat órios est as normas podem ser est abelecidas como regulament o de t rabalho. NORM AS DE CONDUTA NO LABORATÓRIO DE M ICROBIOLOGIA Os ar tigos de uso pessoal devem ser guar dados em locais apr opr iados, nunca na bancada do labor atór io; Manter cabelos compr idos pr esos; Não beber , não fazer higiene bucal ou maquiagem, não b ar bear -se, não fumar , não r oer as unhas; Não tr abalhar com calçados aber tos, ou seja, use sapatos que pr otejam inteir amente os pés; dur ante a r otina de tr abalho, O pr ofissional dever á utilizar r oupas apr opr iadas ao tr abalho desenvolvido, como por exemplo, aventais, jalecos com manga compr ida (se necessár io) e outr os unifor mes afins;
4 Lavar as mãos antes e após a jor nada de tr abalho; Após uso, os jalecos devem ser colocados em saco plásticos, separ ados do mater ial de uso pessoal; Quando do uso de luvas, evitar abr ir por tas e atender telefone; Se houver fer ida na mão ou no pulso, medidas adicionais devem ser consider adas. Consulte o chefe do labor atór io; Não se alimentar ou conduzir alimentos par a o inter ior do labor atór io de análise; No labor atór io de análise, não fazer r efeições ou pr epar ar alimentos, Nunca pipetar com a boca. Usar , sempr e que possível, pipetador es automáticos e per as de bor r acha; Cuidado com a for mação de aer ossóis e r espingos (agitador es, ultr a -som, centr ífuga); Após a manipulação de ma ter ial contaminado, despr ezar , adequadamente, em solução desinfetante ou r ecipiente par a autoclavação; As bancadas de tr abalho dever ão ser desinfetadas antes e depois da r otina de tr abalho; Em caso de acidente, descontaminar utilizando álcool a 70%, álcool iodado ou solução de hipoclor ito de sódio (água sanitár ia) a 0,5% pr epar ado r ecentemente (máximo dois dias), dependendo do tipo de mater ial biológico; Evitar tr abalhar sozinho no labor atór io; A Dir eção da Unidade é r esponsável por : assegur ar uma infr a -estr utur a mínima indispensável, per mitindo o seguimento destas nor mas. Não se pode lavar as mãos na falta de água cor r ente, por exemplo. Se esta estr utur a falta por alguma r azão, cabe a Dir eção suspender as atividades que envolvam r isco de manipulação; O chefe do labor atór io é r esponsável por : a) estabelecer uma or denação e r otina em r elação ao mater ial per igoso; b) pr ovidenciar tr einamento adequado dos iniciantes no labor atór io; c) super visionar o cumpr imento das nor mas de biossegur ança; Cada membr o do labor atór io, após r ecebimento das instr uções biossegur ança do labor atór io, é r esponsável pelo seu cumpr imento.
de
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PRÁTICA N 2: MATERIAIS E EQUIPAMENTOS DE LABORATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA OBJETIVOS: Discriminar as funções e/ou aplicações Limpar Acondicionar 1. FUNÇÕES E/OU APLICAÇÕES LABORATÓRIO DE MICRO BIOLOGIA
DO
MATERIAL
DO
1.1. Material Permanente a. Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com
disposit ivos que permit em o enchiment o da câmara com vapor sat urado e sua manut enção em det erminadas t emperat ura e pressão por quaisquer períodos de t empo. O aut oclave é um equipament o indispensável ao laborat ório de microbiologia na est erilização de meios de cult ura, água, soluções e cult uras de despejo .
Figura 01: Aut oclave Vert ical
Modo de Operação: ligar o aparelho à rede elét rica. Após a co locação do mat erial dent ro do cest o de inox, a t ampa é fechada e a t orneira de remoção de ar ou vapor é deixada abert a para remover t odo o ar. Quando t odo o ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluent e persist a por cerca de 5 minut os, ant es de fech ar a t orneira. A part ir de ent ão a pressão int ernament e irá aument ar e chegar à pressão de
6 est erilização usada, que é de 15 lb/pol 2 , ou 1at m, ou 1 kgf/cm 2 , correspondendo a uma t emperat ura de 121 0 C. O t empo de exposição do mat erial no int erior dest e equipa ment o irá depender do volume de líquido a ser est erilizado. Para pequenos volumes, at é 3 lit ros, podem ser est erilizados durant e 20 a 30 minut os a uma pressão de 15 lb/pol 2 . Com relação a maiores volumes, será necessária, uma exposição mais prolongada. Quando a t emperat ura requerida para a est erilização é alcançada, deve-se começar a cont ar o t empo, usando um relógio de laborat ório (com alarme). Decorrido o t empo desliga -se o aparelho da corrent e elét rica e mant ém-se a aut oclave e a t orneira de ar e vapor fechados, at é o manômet ro volt ar ao pont o zero, pois quando a pressão da aut oclave é aliviada rapidament e, os líquidos dent ro dos t ubos e frascos fervem violent ament e, fazendo com que os t ampões sejam arremessados para fora dos mesmos. Concluída a est eriliz ação, abre-se a t orneira de vapor; em seguida a t ampa do aut oclave é levant ada. b. Centrífuga: equipamento utilizado para separar os sólidos dos líquidos. A centrifugação permite a separação de substâncias com diferente massa molecular, baseando-se na sua densidade, ao ser aplicada uma força centrífuga. No Laboratório de microbiologia pode ser utilizado para separar microrganismos, proteínas, membranas celulares (insolúveis em água) e citoplasma (solvente celular aquoso) após ruptura de células, etc.
Figura 02: Cent rífuga
c. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - est eriliza a seco t oda vidraria convenient ement e acondicionada, a t emperat ura de 170 ºC por 2 horas ou a 200 o C por 1 horas.
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Figura 03: Est ufa de Est erilização
d. Espectrofotômetro – são usados para medir a radiação absorvida ou transmitida por uma solução a um comprimento de onda definido. Nesse equipamento a absorbância ou transmitância é efetuada por medida da cor ou turvação das amostras.
Figura 04: Espect rofot ômet ros
e. Refrigerador - ut ilizado na conservação de cult uras de micro organimos sob baixa t emperat ura, diminuindo o t empo de geração
f. Estufa Incubadora (estufa bacteriológica) - favorece o cresciment o de microrganismos pela incubação na t emperat ura adequada. Incubação = manut enção do meio semeado em det erminadas condições para promover o desenvolviment o dos microrganismos.
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(a)
(b)
Figura 05: Est ufa Incubadora de bancada (a); est ufa BOD (b) f. Mesa Incubadora (Shaker) - favorece o cresciment o de microrganismos aeróbios, p ela dissolução do oxigênio no meio, at ravés da agit ação da mesa, em moviment os rot at órios.
Figura 06: Mesa Incubadora com Agit ação Orbit al
g. Cabine de fluxo laminar - câmara assépt ica, dot ada de exaust or e lâmpada fluorescent e, sendo ut ilizada em repiques de microrganismos
Figura 07: Cabine de Fluxo Laminar
9 h. Biorreator (Fermentador) - equipament o onde ocorrem as ferment ações, podendo ser dot ado de sist emas de agit ação, aeração, refrigeração.
Figura 08: Ferment ador es
1.2. Vidraria a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de culturas puras de micro-organismos. Os tubos de ensaio podem também ser usados para efetuar reações químicas de pequena escala com pequenas quantidades de reagentes de cada vez.
(a)
(b)
(c)
Figura 09: Tubos de ensaio com micro-organismo(a); tubos de ensaio com reações químicas (b) e (c) b. Placa de Petri - facilit a o isolament o de microrganismos devido à grande superfície de cresciment o que apresent a, possibilit ando o apareciment o de colônias separadas. Colônia = aglomerado de células em meio sólido, geralment e originadas de uma única célula progenit ora.
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(b) Figura 10: Placa de Pet ri(a); Placa com diversas colônias de micro organismos (b) (a)
c. Pipeta - para diluir preparações diversas e inocular cult uras líquidas Inocular = inserir, introduzir
Inóculo (ou semente) = concent ração de células suficient es para cult ivar uma de meio com bom rendiment o
(a)
(b)
Figura 11:Pipet as graduadas(a); Pipet ador monocanal
d. Pipeta Pasteur (micropipeta) - é um t ubo de vidro ou plást ico espichado em capilar, ut ilizada para t ransport ar pequenos volumes de líquido
(a)
(b)
Figura 12:Pipet as Past eur de plást ico(a) ;Pipet as Past eur de vidro (b) e.Alça Esfregaço (Alça de Drigalsky) - ideal para esfregaço em aplicações microbiológicas. A Superfície polida não danifica o meio de cultura distribuído na placa. Pode ser fabricado em polipropileno ou a part ir de um t ubo de vidro ,
1 1 dobrada em ângulo ret o e depois em 45 ºC na chama. É ut ilizada para espalhar microrganismos em meio de cult ura sólido.
(a)
(b)
Figura 13: Alça de Drigalsky de plást ico(a) e de vidro (b) .
f. Balão de fundo chato- ut ilizado geralment e para guardar meios de cult ura. g. Frasco de Erlenmeyer - ut ilizado para propagação celular de microrganismos em meio líquido sob agit ação em mesa agit adora. h. Fernbach - idem
(a)
(b)
(c)
Figura 14: balão(a);Frascos de Erlenmeyer (b); Fernbach (c).
i. Lâmina - para examinar microrganismos ao microscópios Lâmina Escavada - possui uma ou duas depressões possibilit ando observar a mobilidade de microrganismos suspensos numa go t a de líquido (Ensaio em got a pendent e) j. Lamínula - ut ilizada para recobrir preparações microscópicas “in vivo
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(a)
(b)
Figura 15: Lâminas e lamínulas (a);Lâmina escavada (b). 1.3.Materiais utilizados em titul ações, destilações, preparações de solução e de meios de cultura - Bequer, bast ão de vidro, buret a, funil, provet a, balão volumét rico, condensador dent re out ros. 1.4.
Diversos
a. Lápis dermatográfico - ut ilizado para escrever em superfície de vidro b. Algodão bruto (ou cardado) - serve para prot eger o mat erial est erilizado, do cont at o com o ar ambient e. c. Cabo de K olle - feit o com mat erial isolant e, adapt ado em t rês formas (círculo, ele, agulha). Serve de suport e para um fio de plat ina ou uma liga níquel-cromo, sendo ut ilizado em inoculação de microrganismos.
Figura 16: Cabo de Kol l e e al ças de pl at i na
2. DESINFECÇÃO a. Desinfecção do ar: A desinfecção do ar no laborat ório de microbiologia é feit a at ravés da vaporização de uma soluç ão de hipoclorit o de sódio a 1% ou
1 3 periodicament e com a vaporização de uma solução de formalina (formol a 40%). Salient a-se, no ent ant o, que a solução de formalina não pode ser usada para a desinfecção de ambient es ocupados. As câmaras assépt icas são est erilizada luz ult raviolet a.
pelo uso de lâmpadas de
b. Desinfecção da bancada: Ant es da realização de um det erminado t rabalho de microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma solução det ergent e seguida de uma solução alcoólica a 70%.
c. Desinfecção da vidraria: - vidraria contam inada - deverá ser inicialment e est erilizada em aut oclave para que t oda flora present e seja dest ruída e, em seguida lavada com uma solu ção det ergent e ou sabão neut ro; - vidraria sem contam inação - idem ao ant erior, porém sem necessidade de aut oclavação. Observação: não é cost ume se ut ilizar solução sulfocrômica na lavagem dos mat eriais do laborat ório de microbiologia, uma vez que est a solução cont ém cromo que é um met al que pode int oxicar as células vivas e t ambém por ser de difícil remoção no mat erial
3. ACONDICIONAMENTO a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geralment e formando conjunt o de 3 unidades. A quant idade depende da n ecessidade do t rabalho. b. Pipetas - obt ura-se as boquilhas com mecha de algodão (1cm) para filt rar o ar soprado e para prot eger o operador durant e a manipulação; em seguida são enroladas uma a uma com papel, anot ando a capacidade de cada uma. c. Tubos de ensaio, balões de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs são preparados int roduzindo -se um t ampão de algodão cardado na boca do recipient e. Esse t ampão deve ser feit o, enrolando o algodão no sent ido da fibra em quant idade suficient e para facilit ar o manus eio, ist o é, não deve ser nem muit o apert ado, nem muit o frouxo. d. Lâminas - mergulhadas em solução alcoólica, ficam apt as a serem ut ilizadas a qualquer moment o, evit ando paralelament e que sejam arranhadas.
1 4 ATENÇÃO: Toda vidraria ut ilizada no laborat ório de microbiologia ant es de ser preparada para est erilização deverá est ar limpa e seca.
PRÁTICA 3: TÉCNICAS DE PRÁTICAS ASSÉPTICAS E DIFERENCIAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS OBJETIVOS: Aprender t écnicas de prát icas ass épt icas Avaliar a presença de micro -o rganismos em ambient es diversos Diferenciar macroscopicament e fungos, leveduras, bact érias INTRODUÇÃO O homem no seu meio ambient e convive com inúmeras formas de vida. Os microrganismos ocupam lugar de dest aque t ant o pelos benefícios como pelos malefícios que proporcionam ao homem, sendo encont rados na nat ureza em abundância e variedade de formas. Para que os mesmos sejam cult ivados art ificialment e é necessário conhecer suas exigências nut ricionais e suas condições físicas de cresciment o, t rabalhar com mat erial est erilizado e ob edecer às normas de prát ica assépt ica. Dependendo da finalidade da operação, os micro -organimos podem ser cult ivados em: lâminas, placas, t ubos, balões, fra scos de Fernbach ou recipient es de maior capacidade. O cult ivo em lâmina é ut ilizado quando se deseja acompanhar microscopicament e o cresciment o e reprodução de um microrganismo. Emprega -se o cult ivo em placas quando se quer isolar espécies microbianas dis t int as, devido à ext ensa área de superfície que apresent a. Porém, devido à pequena quant idade de meio em exposição ao ar, com freqüência ocorre ressecament o e/ou apareciment o de cont aminações. Cult ivando os microrganismos em t ubos, há facilidade de manipulação das cult uras, além da vant agem de economizar meio e espaço físico. Para se obt er grandes volumes de cult ura, o microrganismo é cult ivado inicialment e em balões, frascos de Fernbach, para depois ser t ransferido para recipient e maior, cuja capacidade é função da necessidade do t rabalho.
NORMAS DE PRÁTICA ASSÉPTICA 1. Não t rabalhar em corrent e de ar, nem ambient e agit ado pelo acúmulo de pessoas; 2. Não falar nem respirar em frent e ao recipient e abert o cont endo mat erial de est udo; 3. Abrir o recipient e inclinado junt o à chama, onde o ar est á rarefeit o de formas vivas;
1 5 4. Ret irar o t ampão de algodão com o dedo mínimo e a palma da mão sem t ocar na boca do recipient e e sem encost ar o t ampão em lugar algum; 5. Flambar a boca do recipient e sempre que for iniciar uma inoculação, para que uma corrent e de ar quent e seja formada de dent ro para fora; 6. Int roduzir o mais rápido possível a alça ou pipet a sem t ocar nas paredes do recipient e; 7. Ao t erminar a inoculação, flambar a boca do recipient e e ajust ar o t ampão, conservando o mat erial ao abrigo da poeira e umidade. PROCEDIMENTO PRÁTICO Limpar a bancada; Marcar t odo mat erial (placa e t ubos), especificando o t ipo de meio e a font e da inoculação; Fundir dois meios de cult ura diferent es (por exemplo AN e CZ); Dist ribuir os meios em placas de Pet ri e t ubos (inclinar); Esperar solidificar; Fazer inoculações nas superfícies dos meios dist ribuídos em placas; Incubar na t emperat ura ambient e por 2 a 5 dias, não esquecendo de guardar placas sem inocular, uma de cada meio ut ilizado para cont role da est erilização e da eficácia da t écnica ut ilizada. FONTES: água poluída, ferment o de padaria, ar, gargant a, mãos, cabelo, suor et c.
DIFERENCIAÇÃO MACROSCÓPICA DOS MICRORGANISMOS Os micro -organimos crescem e reproduzem qua ndo cult ivados e inoculados adequadament e. Podemos fazer avaliação dos grupos aos quais eles pert encem, por observações das caract eríst icas das colônias nos meios em que eles foram cult ivados. O cresciment o em meio líquido pode ser evidenciado pela t urvaçã o, pela formação de pequena massa de célula que flot am (velo) ou por sediment ação das células. Em placas de Pet ri est uda-se o cresciment o dos microrganismos em meio sólido, observando -se o apareciment o de colônias cujos aspect os macroscópicos auxiliam na diferenciação de grupos microbianos. I) Descrição de colônias em placas de Petri: Após o período de incubação pré -est abelecido as colônias de micro -organismos cult ivados em placas de Pet ri podem ser descrit as de acordo com os seguint es crit érios:
1 6 a. forma:
C ircular
R izóide
I rregular
Filament osa
Figura 17: Formas de colônias de microrganismos
b. quanto à dimensão - As colônias de fungos são geralment e grandes e filament osas, algumas vezes ocupam t oda a placa onde est ão cult ivadas. - As colônias de leveduras são médias e leit osas, enquant o as de bact érias são menores e brilhant es sendo algumas t ão pequenas que se denominam punt iformes. c. quanto à cromogênese - Cor do pigment o: banca, bege, alaranjada, azul, colorida et c - Presença de pigment o solú vel ou insolúvel no meio d. superfície plana ,elevada, convexa, lisa, rugosa, seca, brilhant e, t ranslúcida, opaca, pregueada, pulverulent a
II) Descrição da cultura em caldo nutriente O cresciment o em caldo de cult ura pode apresent ar -se sob diferent es formas. a. turbidez: mais ou menos acent uada
b. forma da película: uma massa de células que flut ua à superfície do caldo
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c. sedimento: depósit o de células no fundo do t ubo.
PRÁTICA N 4: MEIOS DE CULTURA OBJETIVOS: Preparar meios de cult ura de usos em prát icas microbiológicas Dist ribuir convenient ement e, est erilizar em aut oclave INTRODUÇÃO: Meios de cult ura são associações de subst âncias que permit em o cult ivo dos microrganismos fora do seu meio nat ural. Nas preparações dos meios de cult ura t odos os nut rient es devem ser dissolvidos em água para que possam ser absorvidos pelas células microbianas. Nos laborat órios geralment e ut iliza -se água dest ilada no preparo dest es meios, no ent ant o nas unidades indust riais cost uma -se ut ilizar água de rios ou poços. A água deve t er boa origem e composição química const ant e; quando necessário, deve ser devidament e t rat ada. Como const it uint es básicos dos meios de cult ura, além da água, pode-se especificar: as font es de carbono, as font es de nit rogênio, os sais. Em meios de cult ura solidificados, além dest es component es deve se int roduzir agar, gelat ina ou sílica gel com a função específica de solificar esses meios. NORMAS DE PREPARAÇÃO : Pesagem dos componentes: os diversos component es dos meios de cult ura podem ser pesados separadament e, ou consecut ivament e num único recipient e (Béquer). Para quant idades inferiores a 1g ut iliza -se uma balança analít ica (semi-analít ica). O agar-agar geralment e é pesado separadament e, sendo o valor da pesagem em função da quant idade do meio a ser dist ribuído nos recipient es. Ut iliza-se de 10 a 20g dest e agent e solidificant e em pó para cada lit ro de solução nut rient e. Solubilização dos componentes: adicionar os nut rient es previament e pesados a um Béquer cont endo água dest ilada em quant idade suficient e para dissolvê-los. Os ext rat os de carne e de leveduras podem ser aquecidos ligeirament e para facilit ar a solubilização . Deve-se evit ar o uso de fogo diret o e prolongado para não haver queima do mat erial e consequent e escureciment o do meio. O agar não é solúvel a frio, devendo se necessário ser solubilizado em um banho -maria ou em aut oclave a vapor fluent e.
1 8 Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao máximo os meio líquidos, ant es de acert ar o pH. No caso dos meios solidificados ajust ar na menor t emperat ura em que não haja solidificação. São empregadas para ajust e do pH soluções de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico a 0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos casos pode-se verificar o pH at ravés do uso de um papel de t ornassol. Em meios solidificados, o pH ácido só deverá ser ajust ado depois da est erilização para evit ar a hidrólize do agar quando em t emp erat ura elevada. Nest e caso o pH ácido é ajust ado com uma solução est éril de ácido lát ico. Clarificação: em alguns casos há necessidade de clarificação dos meios que durant e o preparo t ornam-se t urvos. A clarifição pode ser feit a simplesment e pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo, aquecendo em seguida at é ebulição e filt rando -se em gase ou algodão hidrófilo. Distribuição, esterilização e conservação: os meios de cult ura depois de preparados são dist ribuídos em recipient es adequados (t u bos, balões, Erlenmeyeres), especificando o respect ivo nome ou sigla e a dat a do preparo dos mesmos. Terminada a dist ribuição, os t ubos, balões ou Erlenmeyers são arrolhados com algodão ou t ampas met álicas especiais, acondicionados em cest as e levados à es t erilização em aut oclave. A t emperat ura e o t empo de exposição nest e equipament o depende da composição e da quant idade de meio de cult ura recipient e (vide est erilização). Após a est erilização, os meios são resfriados espera -se 72 horas ant es de usá-los ou est ocá-los em geladeira, a fim de que se possa det ect ar algum t ipo de cont aminação, ou falha de est erilização.
COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
A) MEIOS DE CULTURA PARA ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS AGAR NUTRITIVO (AN) Ext rat o de carne....................... .............. 3,0g Pept ona................................................. 5,0g Agar..................................................... 20,0g Água dest ilada....................................... 1000ml pH = 6,8 - 7,0
CALDO LACT OSADO Pept ona...... ............................................ 5,0g Ext rat o de carne...................................... 3,0g
1 9 Lact ose.................................................. 5,0g Água dest ilada........................................1000ml pH = 6,8 - 7,0 VERDE-BRILHANT E Pept ona ................................................... Lact ose..................................................... Bile de boi................................................ Verde brilhant e........................... ............ Água dest ilada........................................... pH = 7,2
10,0g 10,0g 20,0g 0,0133g 1000mL
Aut oclavar a 115 o C por 15 min. Para adicionar o verde brilhant e pode-se preparar uma solução a 0,1% em água dest ilada (0,1g de verde brilhant e em 100mL d e água dest ilada) e dela junt ar 13,3 mL ao meio de cult ura. Dist ribuir 10mL do caldo em t ubos grande com t ubinhos de Duhran.
EOSINA-AZUL DE METILENO (MEIO DE LEVINE OU EMB) Pept ona ................................................... 10,0g Lact ose... .................................................. 5,0g Sacarose................................................... 5,0g K 2 HPO 4 .................................................... 2,0g Agar......................................................... 12-15g Água dest ilada........................................... 1000mL
Dividir em balões de 250 mL, 100mL e 200mL de meio. Est erilizar a 120 o C por 20 minut os. Quando for dist ribuir em placas para uso, fundir e adicionar para cada 100 mL de meio, 1mL de solução est éril de eosina (4%) e 1mL de solução est éril de azul de met ileno (0,65%). As placas podem ser guardadas por uma semana em refrigerador.
SORO DE LARANJA Tript ona................................................ 10,0g Ext rat o de leveduras............................... 3,0g Glicose................................................. 4,0g Fosfat o dipot ássico................................ 15,0g Soro de laranja......................................200,0ml Água dest ilada................ .......................800,0ml
2 0 Preparar o soro de laranja aquecendo 1 lit ro do suco recém ext raído, a aproximadament e 93 C. Adicionar 30g de diat omácea e mist urar. Filt rar com sucção at ravés de um funil de Buchner usando papel de filt ro grosseiro recober t o com o auxílio de filt ração. Refilt rar os primeiros mililit ros. Ajust ar o pH a 5,5 , dist ribuir em recipient es adequados.
B) MEIOS DE CULTURA PARA ISOLAMENTO FILAMENTOSOS E LEVEDURAS
DE
FUNGOS
BAT AT A GLICOSE AGAR - BGA Bat at as descascadas e cort adas em fat ias ..... 300g Água dest ilada.......................................... 1000ml As bat at as devem ser manuseadas com o mínimo de exposição ao ar. Aquecer em 500ml de água at é complet ament e cozidas. Filt rar at ravés de gase, complet ar o volume para 1000ml e adicionar: Agar ........................................................ 15,0g Glicose..................................................... 20,0g pH = 6,8 - 7,0 CALDO GLICOSADO Ext rat o de carne....................................... 3,0g Pept ona... ................................................ 5,0g Glicose...................................................10,0g Água dest ilada.........................................1000ml pH = 6,8 - 7,0 GLICOSE LEVEDURA (GL) Pept ona ............................. ..................... 10,0g Ext rat o de carne....................................... 3,0g NaCl....................................................... 5,0g Ext rat o de levedura................................... 10,0g Glicose................................ .................... 10,0g Agar........................................................ 12 -15g Água dest ilada.......................................... 1000mL pH 6,9 -7,1 GLICOSE AGAR (GA) Ext rat o de carne .................................... 3,0g Pept o na................................................. 5,0g
2 1 Glicose................................................. 10,0 Agar..................................................... 20,0g Água dest ilada....................................... 1000ml pH = 6,8 - 7,0
CZAPECK (CZ) NaNO 3 (nit rat o de sódio)........................... 3,0g K 2 HPO 4 (fosfat o monoácido de pot ássio)...... 1,0g MgSO 4 (sulfat o de magnésio)...................... 0,5g KCl (cloret o de pot ássio).......................... 0,5g FeSO 4 (sulfat o ferroso).............................. 0,01g Sacarose.................................................. 30,0g Agar........................................................ 20,0g Água dest ilada..........................................1000ml pH = 6,6
GODOY Pept ona................................................. 1,0g Caldo -de-cana........................................ 500g Agar...................................................... 15g Junt ar ao caldo -de-cana uma clara de ovo bat ida. Aquecer at é fervura, filt rar complet ando o volume at é 1000ml. Junt ar a pept ona e o agar.
PRÁTICA N 5: HIGIENE E SANITIZAÇÃO OBJETIVOS: Avaliar as condições higiênico-sanitárias das mãos de manipuladores de alimentos; de superfícies de bancadas e de utensílios usados no preparo dos alimentos INTRODUÇÃO: As indústrias e os estabelecimentos que comercializam alimentos devem se preocupar com a manutenção das condições higiênico-sanitária para evitar que doenças sejam transmitidas aos consumidores. As condições higiênico-sanitárias no preparo dos alimentos nem sempre são satisfatórias podendo apresentar contaminação proveniente, principalmente, dos operadores a partir do manuseio constante, da matéria-prima contaminada ou por limpeza deficiente dos equipamentos e utensílios usados no preparo dos alimentos. Dessa forma é importante um controle efetivo das boas prática e avaliação periódica da higiene por meio de testes laboratoriais usando micro-organismos indicadores de contaminação. Nesta prática utilizaremos a
2 2 contagem de bactérias, bolores e leveduras como indicadores de contaminação ambiental e dos manipuladores. MATERIAL: Swabs: preparados por meio de uma “zaragatoa” (chumaço de algodão esterilizado, montado em haste de madeira): esterilizados em autoclave a 121oC por 15 minutos ou 1 caixa de cotonetes. Meios de cultura: 500mL de meio Plate Count Agar (PCA) e 500mL de meio CZapeck (CZ) e 500mL de meio Saboraund; 40 tubos pequenos com 9mL de Solução Tampão de Água Salina Peptonada a 0,1% - para diluição da amostra Placas de Petri Estéreis: 40 placas Soluções sanitizantes: solução de hipoclorito de sódio a 100-200 mg/L, solução de álcool a 70%, solução de álcool iodado (2% em etanol); NaOH 3%, ácido peracético Locais de coleta: superfícies de táboas e facas fatiadoras de frios, bancadas, pia e mãos dos manipuladores PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: I)
Prepare 500mL de solução sanitizante de hipoclorito de sódio a 200 mg/L, a partir de uma solução a 10% de cloro livre;
II)
Faça a higienização das superfícies e utensílios de acordo com os procedimento a seguir:
A) Higienização dos utensílios ( superfícies de taboas e facas fatiadoras de frios) 1. 2. 3. 4. 5.
Retire o excesso de sujidades dos utensílios, Lave com água corrente na temperatura ambiente; Lavar com esponja com detergente; Enxaguar em água corrente até a remoção total do detergente. Em seguida, faça a desinfecção, imergindo numa bacia com uma solução clorada a 200ppm, 6. Aguarde 15minutos; remova e deixar secar naturalmente. B) Higienização de equipamento (fermentador) 1. Limpar manualment e com us o de esponja e det ergent e neut ro (comercial). 2. Realizar limpeza por circulação com NaOH 3%, 3. Lavar com água, 4. Sanit izar com (ácido peracét ico /peróxido de hidrogênio a 0,3%), 5. Deixar at uar por 20 minut os, remover 6. Deixar secar nat uralment e
2 3 C) Higiene das superfícies de trabalho como mesas, bancadas, pias e cubas 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Proteja suas mãos com auxílio de uma luva de plástica, Remova as sujidades com rodo de pia, Passe uma esponja umedecida com o detergente, Lave a torneira da pia, enxaguando com água Remova todo o detergente com uma flanela úmida, Borrife álcool 70% deixando secar naturalmente
D) Higiene das superfícies das mãos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Abra a torneira e molhe a mão, antebraço; Coloque o detergente na palma da mão, Lave primeiro a palma da mão e depois o dorso; Lave em seguida os dedos e as unhas; Por último lave o antebraço; Deixe secar naturalmente ou use um papel toalha estéril.
OBS: A utilização de gel alcoólico a 70% ou de solução alcoólica a 70% com 1-3% de glicerina pode substituir a higienização com água e sabão quando as mãos não estiverem visivelmente sujas. Duração do Procedimento: 20 a 30 segundos
AVALIAÇÃO DA HIGIENEIZAÇÃO:
Umedecer os swab em solução tampão (água salina peptonada a 0,1%);
Avaliação da superfície de utensílio antes e após higienização com solução sanitizante: friccionar formando um ângulo de 300 com a superfície teste, vinte vezes na forma de “zigue-zague”, nos sentidos das diagonais, na área de coleta com dimensão (10cmx10cm);
Avaliação das mãos dos manipuladores antes e após higienização: friccionar o swab na palma da mão e entre os dedos iniciando pelo dedo mínimo e terminado no polegar na forma de “zigue-zague”;
Transferir cada swab para um tubo de ensaio contendo 10 mL de solução tampão;
A partir de cada swab, preparar diluições sucessivas em tubos com 9ml de diluente (solução tampão) obtendo as seguintes diluições: 1/101 , 1/102, 1/103.
Pipetar assepticamente alíquota de 1ml de cada diluição para placas de Petri esterilizadas
Adicionar, a cada placa, 15-20mL de ágar padrão para contagem, previamente fundido e resfriado à temperatura de 44-46oC;
Homogeneizar com movimentos suaves, em forma de oito, sucessivamente por duas vezes, e deixar à temperatura ambiente até completa solidificação do ágar;
2 4
Após solidificação, incubar as placas em posição invertida a 35- 37oC por 48 horas.
RESULTADO: Transcorrido o tempo de incubação, considerar para contagem as placas de mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias, multiplicar a média aritmética das contagens pelo respectivo fator de diluição e expressar o resultado em Unidades Formadoras de Colônias/mão (UFC/mão) ou Unidades Formadoras de Colônias /cm2 de superfície (UFC/cm2).
PRÁTICA N 6: ISOLAMENTO DE MICRORGAISMOS OBJETIVOS: Isolar microrganismos t ais como: bact érias, fungos filament osos e leveduras de ambient es diversos Ident ificar morfologicament e as espécies isoladas INTRODUÇÃO: Os microrganismos em seus ambient es nat urais ( água, solo, ar et c) exist em como uma população mist a. Para que possamos est udar uma det erminada espécie de microrganismo nas suas caract eríst icas morfológicas e bioquímicas individuais é necessário separá -la das diversas espécies cont idas nessa população , obt endo uma cult ura pura e é formada por microrganismso derivados de uma única célula original. O isolament o de microrganismos requer t écnicas adequadas de inoculação dest es microrganismos em meios de cult ura adequados que possibilit em o seu rápido cre sciment o, livre de cont aminações. Para o cult ivo, em condições laborat oriais, de microrganismos é necessário o conheciment o de suas exigências nut rit ivas e das condições físicas requeridas. Ext ensas pesquisas det erminaram exigências nut rit ivas de muit as espécies de microrganismos e est a informação result ou no desenvolviment o de numerosos meios de cult ura. Por causa da grande variedade das necessidades nut rit ivas dos microrganismos há, t ambém, grandes diferenças na composição dos meios ut ilizados. Do mesmo modo, exist em amplas variações no que se refere ao ambient e físico que favorece seu cresciment o. Alguns microrganismos, por exemplo crescem abaixo de 0 C; out ros exigem t emperat ura acima de 45C e podem desenvolver -se at é mesmo a 70C. cert as bact érias necessit am do oxigênio at mosférico; out ras são indiferent es ou inibidas pelo oxigênio.
2 5 MÉT ODOS DE ISOLAMENT O DE CULT URAS PURAS Técnica de sementeira em superfície e de esgotamento do inóculo:
- Com o uso de uma alça de plat ina, coloca -se uma po rção de espécime na superfície de um meio de cult ura com ágar. - Espalhar a amost ra de lado a lado, na superfície da placa , t racando linhas de acordo com as figuras 1 e 2 , de modo que as bact érias individuais se separem umas das out ras.
- Incubar as placas na t emperat ura adequada - Examinar as placas que apresent arem colônias isoladas - Selecionar uma colônia caract eríst ica da espécie est udada e anot ar seus aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, forma, consist ência, cor da colônia e de s eu reverso, se há pigment o solúvel et c. - Transferir com a ajuda de uma alça de plat ina, mat erial da colônia escolhida para um t ubo cont endo meio inclinado e incubar à t emperat ura e t empo adequados. - Examinar as caract eríst icas do microganismo at ravés de observações microscópicas “in vivo” e “in vit ro” com colorações específicas ut ilizando para isso um microscópio ót ico luminoso.
Técnica da placa derramada (pour-plate): O princípio da t écnica é o da diluição do mat erial em t ubos de agar liquefeit o. - Transfere-se uma alça de plat ina da suspensão original para o t ubo A (agar fundido). O t ubo é rolado ent re as mãos, permit indo a mist ura complet a do inóculo com o meio. Transferências similares são efet uadas do t ubo A para o B e, dest e, para o C. - Os cont eúdos de cada t ubo são derramados em placas separada - Incubar as placas na t emperat ura e período de t empo adequados - Examinar as placas que apresent arem colônias isoladas - Selecionar uma colônia caract eríst ica da espécie est udada e anot ar seus aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, forma,
2 6 consist ência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigment o solúvel et c. - Transferir com a ajuda de uma alça de plat ina, mat erial da colônia escolhida para um t ubo cont endo meio inclinado e incubar à t emperat ura e t empo adequados. - Examinar as caract eríst icas do microganismo at ravés de observações microscópicas “in vivo” e “in vit ro” com colorações específicas ut ilizando para isso um microscópio ót ico luminoso. 3- Técnica das diluições sucessivas: se o microrganismo suspeit o, numa população mist a, est á present e em número maior do que out ros germes ele pode ser obt ido em cu lt ura pura por meio de uma série de diluições em meios apropriados. - Transfere-se 1ml ou 1g do mat erial a ser examinado para um frasco de Erlenmeyer cont endo 99ml de água est éril. Homogen eiza-se permit indo a mist ura complet a do inóculo com a água. A part ir daí, t ransfere-se 1ml para um t ubo com 9ml de água est éril, agit a -se e repet e a o peração para os t ubos rest ant es, o bt endo -se assim uma série de diluições decimais. De cada t ubo t ransferir para duas placas est éreis, amost ra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e resfriado a 45 o C. Após est e procediment o incubar as placas na t emperat ura e período de t empo adequados e ent ão e xaminar as placas que apresent arem colônias isoladas. Maiores det alhes sobre est a t écnica est ão no esquema apresent ado na Figura 19.
FIGURA 19 - Esquema de diluição da t écnica das diluições sucessivas. Visando facilit ar o ent endiment o e t reinar o alunos nas t écnicas de isolament o acima referidas, foram selecionadas de algumas t écnicas sobre bact érias, bolores e leveduras. Est as t écnicas deveram ser
2 7 realizadas em grupo de t rês alunos e realizadas num período de 1 a 2 semanas.
ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO MATERIAL Amost ra de t erra seca Erlenmeyer com 99 ml de á gua est éril 4 t ubos de ensaio cont endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão com meio de Czapeck (CZ) Placas de Pet ri est erilizadas Tubos de ensaio com meio Cz Placa com meio AVP
TÉCNICA 1 o DIA -
Pesar um grama de t erra e suspender no Erlenmeyer que cont ém água est éril. Agit ar para obt er uma suspensão dos microrganismos exist ent es. Transferir com pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um dos t ubos de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para out ro t ubo com água e assim sucessiva ment e sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada t ubo t ransferir para duas placas est éreis, amost ra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45 o C.
Agit ar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minut os, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 5 a 7 dias.
2 8 2 o DIA -
Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de Streptom yces: pequenas, secas, de cores variadas. Na escolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, caract eríst icas da superfície da colônia, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com CZ e para uma placa com meio de CZ e para uma placa com AVP, fazendo nest a últ ima uma est ria no cent ro com auxílio de uma alça em L. Incubar.
3 o DIA -
Observar o cresciment o no t ubo de cult ura. Test ar a at ividade ant i-microbiana da cepa ut ilizando a placa de AVP que apresent a uma est ria cent ral; inocular diferent es germes (bact érias, leveduras) fazendo est rias perpendiculares à est ria cent ral, começando a 30 mm da est ria cent ral e t erminando junt o à mesma. Fazer placas t est emunha s inoculando apenas as est rias de microrganismos -t est es. Incubar as placas a 30 o C ou 37 o C dependendo da t emperat ura dos microrganismos -t est es.
4 o DIA -
Observar se houver inibição e medir (o halo correspondent e) a dist ância em milímet ros do cresciment o do microrganismo t est e at é a est ria de Streptomyces.
2 9
ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO
MATERIAL Amost ra de t erra seca 1 Erlenmeyer com 99 ml de água est éril 1 t ubos de ensaio cont endo 10ml de caldo glicosado 4 t ubos de ensaio cont endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão com meio de Agar Nut rit ivo (AN) Placas de Pet ri est erilizadas Tubos de ensaio com meio AN TÉCNICA 1 o DIA -
Pesar um grama de t erra e suspender no erlenmeyer que cont ém água est éril. Agit ar para obt er uma suspensão dos microrganismos exist ent es. Transferir com pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um t ubo de caldo glicosado. Imergir o t ubo em água fervent e pelo espaço de t empo de 5 minut os. Resfriar e t ransferir 1 ml do caldo para um t ubo com 9ml de água est éril, agit ar para homogenizar e repet ir a operação para mais 3 t ubos. Obt ém -se assim uma série de diluições decimais 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluição t ransferir para duas placas est éreis, amost ra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 o C.
Agit ar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minut os, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 48 horas.
3 0 2 o DIA -
Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de superfície rugosa. Na encolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com AN e incubar à t emperat ura ambient e.
3 o DIA -
Observar o cresciment o no t ubo de cult ura em AN. Fazer lâmina “ In vivo” para observar se há moviment o. Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos.
3 1
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE ÁGUA
MATERIAL Amost ra de água poluída 1 Erlenmeyer com 99 ml de água est éril 4 t ubos de ensaio cont endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão com meio de Agar Nut rit ivo (AN) Placas de Pet ri est erilizadas Tubo s de ensaio com meio AN
TÉCNICA 1 o DIA -
Pesar 1 mL da amost ra e suspender no Erlenmeyer que cont ém 99mL de água est éril. Agit ar para obt er uma suspensão dos microrganismos exist ent es. Transferir com pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um dos t ubos de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para out ro t ubo com água e assim sucessivament e sendo realizada uma série de diluições 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluição t ransferir para duas placas est éreis, amost ra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 o C.
Agit ar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minut os, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 48 horas.
3 2 2 o DIA -
Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bact érias. Na escolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, consist ência, caract eríst icas da superfície da colô nia brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com AN e incubar à t emperat ura ambient e.
3 o DIA -
Observar o cresciment o no t ubo de cult ura em AN. Fazer lâmina ïn vivo” para observar se há moviment o . Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos.
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
3 3
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS
MATERIAL Amost ra de sorvet e, carne moída, charque, pudim et c 1 Erlenmeyer com 90 ml de água est éril 4 t ubos de ensaio cont endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão com meio de Agar Nut rit ivo (AN) Placas de Pet ri est erilizadas Tubos de ensaio com meio AN
TÉCNICA 1 o DIA -
Pesar 10g ou pipet ar 10 mL da amost ra e suspender no Erlenmeyer que cont ém 90mL de água est éril. Agit ar para obt er uma suspensão dos microrganismos exist ent es. Transferir com pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um dos t ubos de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para out ro t ubo com água e assim sucessivament e sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 ,10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluição t ransferir para duas placas est éreis, amost ra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 o C.
Agit ar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em
3 4
2 o DIA -
3 o DIA -
repouso por mais ou menos 3 minut os, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 48 horas. Observar as colônias que cre sceram e escolher colônias t ípicas de bact érias. Na escolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, consist ência, caract eríst icas da superfície da colônia brilho, presença de pigment o solúvel. Transfer ir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com AN e incubar à t emperat ura ambient e. Observar o cresciment o no t ubo de cult ura em AN. Fazer lâmina ïn vivo” para observar se há moviment o. Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos .
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COLIFORMES
MATERIAL Amost ra de água de banheiro, ou pedaço de queijo coalho ou carne de sol; Tubos com meio de verde -brilhant e-lact ose-bile (VB) Tubos de ensaio cont endo caldo lact osado 1 balão com meio de Agar Nut rit ivo (AN) Placas de Pet ri com meios diferenciais (EMB ou Endo ouTTC) Tubos de ensaio com meio AN
TÉCNICA 1 o DIA -
Inocular o t ubo de Verde -brilhant e com o mat erial a ser pesquisado, incubar a 35 o C por 48 horas.
2 o DIA -
Inocular o t ubo ferment ado em placas de Pet ri com meio diferencial seguindo um dos esquemas abaixo.
Incubar à 35 o C durant e 48 horas.
3 6 3 o DIA -
Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de coliformes. Na escolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, consist ência, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com AN e para um t ubo com caldo lact osado (CL) incubar à 35 o C.
4 o DIA -
Observar se o t ubo de caldo lact osado ferment ou e ent ão se o t ubo t iver dado result ado posit ivo (presença de bolha de ar) prosseguir a análise com o t ubo de cult ura com o meio de agar-nut rit ivo (AN). Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos. Anot ar os result ados e comparar com a lit erat ura.
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTE (Lactobacillus e Streptococcus)
MATERIAL Uma amost ra de Iogurt e nat ural Placa de Pet ri com meio de Agar -glicose-levedura (GL) Tubos de ensaio com meio de leit e desengordurado Tubos de ensaio com meio de Agar-glicose-levedura (GL)
TÉCNICA 1 o DIA -
Fundir e resfriar o meio de cult ura; em seguida dist ribuir em placas de Pet ri. Quando o meio solidificar fazer est rias com o mat erial pesquisado na superfície de cada uma das placas. Cada aluno deverá realiza r a t écnica de esgot ament o ut ilizando apenas uma placa, segundo o desenho abaixo:
ou ent ão, com uma alça em L fazer est rias paralelas a part ir da got a deposit ada na primeira placa e cont inuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo:
3 8 Agit ar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minut os, invert er as placas e incubar em condições anaeróbicas ou sob t ensão de CO 2 (por exemplo, ut ilizando uma lat a cuidadosament e no fundo da lat a e a seguir fechar bem, por um período de 48 a 72 horas. 2 o DIA -
Observar as colônias que cresceram e escolher colônias dist int as. Na escolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos , consist ência, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com meio de GL e para um t ubo com meio de leit e (o qual pode cont er um corant e indicador). Incubar.
3 o DIA -
Observar o se há coagulação no t ubo com meio de leit e. Verificar se há cresciment o no t ubo de GL e realizar uma coloração de Gram. Incubar. Comparar com os dados obt idos na prát ica com os fornecidos pela lit erat ura.
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent reg a do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
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ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO MATERIAL Uma amost ra de t erra seca Um Erlenmeyer com 99 ml de água est éril 4 t ubos com 9 ml de água est éril Um balão com meio de Czapeck (CZ) fundido 8 placas de Pet ri est éreis 4 t ubos e quat ro placas com meio de Czapeck
TÉCNICA 1 o DIA -
Pesar um grama de t erra e suspender no Erlenmeyer que cont ém água est éril. Agit ar para obt er uma suspensão dos microrganismos exist ent es. Transferir com pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um dos t ubos de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para out ro t ubo com água e assim sucessivament e sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada t ubo t ransferir para duas placas est éreis, amost ra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45 o C.
2 o DIA -
Agit ar para homogenizar e incubar à t emperat ura ambient e durant e 5 a 7 dias. ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bolores: filament osas, grandes, de cores variadas. Na escolha da colônia devem ser anot ados aspect os
4 0 macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, consist ência, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar. 3 o DIA -
Observar o cresciment o da colônia gigant e na placa e a part ir da cult ura crescida no t ubo, preparar um cult ivo em câmara úmida. Incubar
4 o DIA -
Observar a lâmina ao microscópio para det erminar t ipos de hifas, t ipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em est udo
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
4 1
ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO MATERIAL Uma amost ra de pão, queijo, frut a ou out ro mat erial mofado Placa de Pet ri com meio de Czapeck (CZ) e Bat at a -glicose-agar (BGA) Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA 1 o DIA -
Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida acidificar com ácido lát ico a pH 3,5. Dist ribuir em placas de Pet ri. Esperar solidificar. Com o auxílio de uma alça em agulha incubar mat erial mofado no cent ro de cada um dos meios cont idos em placas. Incubar à t emperat ura ambient e d urant e 5 dias.
2 o DIA -
( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bolores: filament osas, grandes, de cores variadas. Na encolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor , forma, bordos, consist ência, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar.
3 o DIA -
Observar o cresciment o da colônia gigant e na placa e a part ir da cult ura crescida no t ubo, preparar um cult ivo em câmara úmida. Incubar
4 o DIA -
Observar a lâmina ao microscópio para det erminar t ipos de hifas, t ipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em est udo
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
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ISOLAMENTO DE FUNGOS DO AÇÚCAR CRISTAL
MATERIAL Açúcar crist al Erlenmeyer com 99 ml de água est éril Balão com bat at a-glicose-agar (BGA) acidificado a pH 3,5 Balão com meio de Czapeck (CZ) Placas de Pet ri est éreis Tubos de ensaio com BGA e CZ
TÉCNICA 1 o DIA -
Pesar 11g de açúcar e t ransferir para o Erlenmeyer com água est éril, agit ando bem para dissolver. Transferir porções de 1 e 2 ml para placas de Pet ri. Os meios de cult ura CZ e BGA devem ser fundidos, refriados a 45 o C e em seguida acidificados com ácido lát ico a pH 3,5. Adicionar os meios de cult ura às placas. Deixar esfriar para solidificar (2 a 3minut os) e incubar à t emperat ura ambient e durant e 5 a 7 dias.
2 o DIA -
(5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bolores: filament osas, grandes, de cores variadas. Na encolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, co r, forma, bordos, consist ência, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar.
3 o DIA -
Observar o cresciment o da colônia gigant e na placa e a part ir da cult ura crescida no t ubo, preparar um cult ivo em câmara úmida. Incubar
4 3 4 o DIA -
Observar a lâmina ao microscópio para det erminar t ipos de hifas, t ipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em est udo.
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
4 4
ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FRUTA
MATERIAL Frut a (uva, maçã, abacaxi, mamão, cajá et c.) Erlenmeyer com 50 ml de caldo glicosado (CG) Meio de glicose-agar (GA) Ácido lát ico Placas de Pet ri est éreis Tubos de ensaio est éreis Tubos de ensaio para ferment ação com caldo glicosado
TÉCNICA 1 o DIA -
Acidificar o caldo glicosado com ácido lát ico a pH 3,5. Cort ar a frut a com casca e macerar com ajuda de uma faca. Tranferir para o Erlenmeyer com o meio acidificado, agit ar e incubar à t emperat ura ambient e, durant e 48 a 72 horas.
2 o DIA -
Adicionar o meios de cult ura às placas. Deixar esfriar em repouso para solidificar. Com uma alça de plat ina, deposit ar uma got a do caldo na superfície do meio cont ido na placa de Pet ri e fazer est rias por esgot ament o seguindo o esquema abaixo:
ou ent ão, com uma alça em L fazer est rias paralelas a part ir da got a deposit ada na primeira placa e cont inuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema a seguir:
4 5
Incubar à t emperat ura ambient e por 48 horas. 3 o DIA -
Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de leveduras. Na encolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, consist ência, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com GA e para um t ubo com meio de CG. Incubar.
4 o DIA -
Analisar o cresciment o no t ubo co m caldo glicosado e observar se a levedura é ferment at iva. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anot ar os aspect os microscópicos do microrganismo em est udo, t ais como: t ipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), presença de grânulos, de vacúolos.
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
I
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ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO -DE-CANA
MATERIAL Caldo de cana ferment ado (24horas) Meio de glicose-agar (GA) 4 Placas de Pet ri est éreis Tubos de ensaio est éreis Tubos de ensaio para ferment ação com caldo glicosado
TÉCNICA 1 o DIA - Adicionar o meios de cult ura às placas. Deixar esfriar em repouso para solidificar. Com uma alça de plat ina, deposit ar uma got a do caldo na superfície do meio cont ido na placa de Pet ri e fazer est rias por esgot ament o seguindo um dos esquemas abaixo:
Incubar à t emperat ura ambient e por 48 horas.
4 7 2 o DIA -
Observar as colônias que cresceram e escolher c olônias t ípicas de leveduras. Na encolha da colônia devem ser anot ados aspect os macroscópicos, t ais como: t amanho, cor, forma, bordos, consist ência, brilho, presença de pigment o solúvel. Transferir com alça de plat ina part e da colônia para um t ubo com GA e para um t ubo com meio de CG. Incubar.
3 o DIA -
Analisar o cresciment o no t ubo com caldo glicosado e observar se a levedura é ferment at iva. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anot ar os aspect os microscópicos do microrganismo em est udo, t ais como: t ipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), presença de grânulos, de vacúolos.
OBSERVAÇÃO: A prát ica deverá ser encerrada mediant e a ent rega do relat ório e do t ubo de cult ura isolada.
4 8
PRÁTICA N 7: MICROSCÓPIOS OBJET IVOS: Dist inguir os diversos component es de um microscópio ót ico compost o Focalizar “in vivo”: células de leveduras em suspensão, microrganismos (algas, prot ozoários e bact érias móveis em água)
COMPONENT ES DE UM MICROSCÓPIO ÓT ICO COM POST O:
1 = lente ocular 2 = lentes objetivas e revólver 3 = platina 4 = charriot 5 = parafuso macrométrico 6 = parafuso micrométrico 7 = diafragma no condensador 8 = condensador 9 = botão do condensador 10 = dois parafusos centralizadores do condensador 11 = fonte de luz 12 = controle de iluminação 13 = diafragma de campo (alavanca no lado esquerdo do microscópio) 14 = dois parafusos de ajuste da lâmpada (esquerdo e direito) 15 = focalizadora da lâmpada (alavanca no lado direito do microscópio - não visível na fotografia)
FIGURA 20: Microscópio óptico composto
4 9 I - PARTE MECÂNICA: 1. Base ou pé - disposit ivo de t amanho e peso suficient e para assegurar o equilíbrio est ável do inst rument o, evit ando t repidações; 2.Corpo, braço ou coluna - hast e dest inada a sust ent ar o t ubo microscópico e cont er os mecanismos de moviment o; alguns apresent am art iculação, facilit ando a observação do pesquisador; 3.Tubo ou canhão microscópico - cilindro oco que serve de suport e para os dois sist emas de lent es (oculares e objet ivas); 4. Revólver - peça girat ória onde ficam fixadas as lent es objet ivas, permit indo que cada lent e possa ser colocada em foco ( uma de cada vez), ist o é, em coincidência com o eixo ót ico; 5. Platina - plat aforma horizont al com uma abert ura circular no cent ro por onde passam os raios luminosos. Exist em plat inas móveis; 6. Pinça ou presilh as - alças flexíveis e ajust áveis, sit uadas na plat ina. São ut ilizadas para fixar a lâmina; 7. “Charriot”- disposit ivo facult at ivo que permit e a moviment ação da lâmina em dois sent idos: horizont al e vert ical, pela manipulação de dois parafusos; 8. Sistema de cremalheira - peça munida de dent es, cont rolada pelos parafusos macromét rico e micromét rico; a) Macromét rico - ocasiona diferent es aproximações ent re a objet iva e a preparação, variando a dist ância vert ical de vários cent ímet ros. Serve para t razer o objet o ao foco aproximado; b) Micromét rico - permit e mínimos deslocament os vert icais da ordem de cent ésimos de milímet ros, sendo ut ilizado na focalização final; Observação: Nos microscópios mais modernos exist e um único parafuso que oferece o cont role des t es dois moviment os.
II - PARTE ÓTICA 1. Fonte de luz: 1.1. Natural - luz solar 1.2. Artificial - lâmpada 1.2.1. Direta - quando a lâmpada est á fixada no eixo ót ico 1.2.2. Indireta - quando se ut iliza font e luminosa anexa ao microscópio.
5 0 2. Diafrágma - cont rola a ext ensão angular do feixe luminoso, reduzindo o ângulo do cone de luz, de modo que não exceda o diâmet ro da objet iva após at ravessar o objet o; 3. Condensador - conjunt o de lent es convergent es que projet a sobre a preparação o feixe de luz em forma de um amplo cone; por deslocament os vert icais diminui ou concent ra a luz no objet o; 4. Lentes objetivas - são as lent es que ficam próximas ao objet o, formando na part e superior do t ubo microscópico uma imagem invert ida e ampliada do objet o. Podem ser: a) a seco - quando o meio ent re o objet o e a lent e é o ar, podendo ser de pequeno, médio ou grande aument o; b) de imersão - quando a lent e fica mergulhada numa camada de líquido; 5. Sistema de lentes oculares - apresent a um conjunt o de lent es: lent e de campo (corret ora) que corrige a esfericidade da imagem e a lent e ampliadora que at ua em conjunt o com o observador como uma simples lent e de aument o, aument ando a imagem formada pela objet iva.
MANIPULAÇÃO DO MICROSCÓPIO 1. Instalação do aparelho Ret irar o microscópio da caixa ou armário pelo braço e colocá -lo na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir ligar a font e luminosa e dispor a objet iva no revólver e regular a alt ura do banco, de maneira a permit ir um t rabalho confort ável.
2. Iluminação de campo Se a luz ut ilizada é uma luz nat ural, usar a face plana do espelho, caso cont rário, a face côncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir complet ament e a superfície do espelho e est e deve est ar cent rado de maneira que o cone luminoso reflet id o at ravesse complet ament e o condensador (que deve est ar complet ament e levant ado, com o diafragma abert o) bem como a abert ura da plat ina, de t al sort e que o campo do microscópio (ist o é, o espaço da plat ina visualizado com a ocular) fique t ot alment e iluminado.
3. Adaptação da preparação Colocar a lâmina cont endo a preparação sobre a plat ina e prendê la, depois, com o auxílio do Charriot , deslocar o conjunt o de t al forma que a preparação cont ida na lâmina, fique sobre a abert ura da plat ina, perfeit ament e iluminada pelo cone luminoso.
5 1 4. Escolha da objetiva a) preparações a fresco (“In vivo”): t rabalhar apenas com objet ivas a seco, começando pela de menor aument o; b) preparações coradas (“In vitro”): - focalizar inicialment e com a objet iva a seco de menor aument o; - girar o revólver de maneira que nenhuma das objet ivas fiquem em uso; - colocar sobre a preparação uma pequena got a de óleo de imersão; - colocar no eixo ót ico a objet iva de maior aument o (imersão) 5. Iluminação da preparação Para as preparações coradas que dão imagens por absorção, usar o máximo de iluminação com o condensador complet ament e elevado e o diafragma t ot alment e abert o. Para as preparações a fresco, que dão imagens por refração, iluminar menos a fim de que o fenômeno seja m ais percept ível. Começar descendo o condensador, a uns dois t erços da sua abert ura, depois olhando pela ocular, regular o cone luminoso, fechando aos poucos o diafrágma.
6. Focalização É a operação que consist e em t razer o objet o para o foco da objet iva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, será vist a pelo obsevador. A focalização const a das seguint es et apas: a) girar o revólver colocando a objet iva de menor aument o no eixo ót ico; b) ajust ar a iluminação de campo; c) cent ralizar a preparação ; d) aproximar ao máximo a preparação, da objet iva de menor aument o, por meio do mecanismo de moviment o. Durant e est e t rabalho deverá ser observado a aproximação diret ament e com a vist a, não devendo ser ut ilizado a ocular; e) observando ent ão pela ocular , imprimir moviment o moderado de afast ament o ent re a preparação e a objet iva, at é que seja dist inguida a imagem do objet o; f) moviment ar o micromét rico para focalização final;
5 2 g) regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais nit idez; h) para t rocar de objet iva bast a o revólver e em seguida ajust ar o foco imprimindo moviment os lent os no micromét rico; i) ao t érmino da observação, girar o revólver at é a menor objet iva e apagar a luz. Ret irar a lâmina e colocar num recipient e com det ergent e. OBSERVAÇÃO: Quando o microscópio é binocular deve -se ajust ar a dist ância int er-ocular de t al forma que o observador visualize um só campo de luz. Trabalhando com microscópio monocular, procurar mant er ambos os olhos abert os, a fim de evit ar fadig a.
7. Causas de erro na observação a) Obscuridade t ot al do campo - má cent ralização do aparelho de iluminação b) Obscuridade parcial - revólver mal cent rado, verificar se o pont o em que há resist ência não foi at ingido ou foi ult rapassado. c) Falt a de nit idez da imagem - preparação invert ida ou com sujos; - ocular suja - verificar se rodando -a, o sujo acompanha o moviment o; limpar a objet iva; - objet iva suja ou com arranhão - limpar com mist ura xilol-ét er; - aparelho de iluminação - falt a de cent ralização, poeiras deposit adas ou objet os est ranhos int erpost os na marcha dos raios; d) Dificuldade subjet iva Corpúsculos de forma diversas que parecem deslocar -se no campo. Com alguma prát ica, verifica -se que eles são independent es da preparação, e provêm do observador; repousar um pouco e repet ir a operação; e) Moviment o Browniano Quando os microrganismos deslocam-se num só sent ido devido à corrent es líquidas formadas por corrent es de ar na água ou como conseqüência dos choques das moléculas do fluido nos microrganismos durant e a observação nas preparações “In vivo”. Salient ando que o moviment o dos microrganismos é proporcionado por estruturas de locomoção e ocorre aleatoriamente.
5 3 8. Conservação dos microscópios O aparelho deve est ar semp re prot egido, seja com capa plást ica, seja com caixa própria e deve ser guardado em ambient e provido de luz art ificial para evit ar o cresciment o de fungos. A cada ut ilização o pó do microscópio deverá ser removido com um pano limpo. Evit ar a ação de vapor es ácidos e cont at o com reat ivos; só manuseá-lo com mãos limpas; só observar preparações limpas e t er o cuidado de não deixar escorrer nada sobre a plat ina ao adapt ar a preparação. Se ist o ocorrer, limpar imediat ament e, se necessário com água dest ilada, enxugando a seguir. As oculares devem ser limpas ext ernament e com papel de seda e int ernament e, por um t écnico, só quando necessário. A objet iva de imersão é limpa com papel de filt ro ou algodão umedecido com uma mist ura de clorofórmio e ét er na proporção de 1:1, que deve ser imediat ament e removido com papel ou algodão limpo. Nunca deixe ficar óleo na lent e pois, ali resinifica e depois para limpar, exige excesso de dissolvent e, podendo est e penet rar no sist ema, dissolvendo o bálsamo que liga as diversas p art es. As objet ivas a seco são limpas com um linho ocasionalment e, com papel umedecido com água dest ilada.
macio
e
A part e int erior das objet ivas não deve ser limpa usualment e e quando é feit o deverá ser prat icada por pessoa habilit ada. Deve -se remover a objet iva e passar suavement e um pincel macio ou uma bucha de pano macio na ext remidade de uma hast e. Não se deve assoprar para evit ar a umidade. Est a operação deverá ser feit a com muit o cuidado para não descent ralizar as objet ivas. As lent es do aparelho de iluminação são limpas como as demais, com freqüência, pois delas depende a boa iluminação fornecida. A part e mecânica é limpa e polida com uma flanela e a cremalheira com óleo det ergent e fino. Para uma boa conservação do microscópio o operador deverá seguir uma rot ina diária que vai desde uma simples remoção do pó at é uma lubrificação mensal de t odas as part es móveis com um óleo fluido. A cada t rimest re o aparelho deve ser enviado a um t écnico especializado para uma inspeção rigorosa, limpeza e lubrificação geral.
5 4
PRÁTICA N 8: TÉCNICAS DE COLORAÇÃO OBJET IVOS: OBJET IVOS: Realizar t écnicas colorações simples e diferenciais ( Gram e Esporos ) Observar ao microscópio sob imersão as preparações in vit ro Diferenciar as formas de bact érias (cocos , bacilos) e arranjos celulares ( em cadeia, t ét rades, cúbicos, em cachos). OBSERVAÇÕES “IN VITRO” Os microrganismos são usualment e t ransparent es, t ornando difícil o est udo de det alhes morfológicos quando são examinados em seu est ado nat ural, assim t orna-se necessário a ut ilização de t écnicas de coloração. As observações microscópicas “in vit ro” são realizadas com o microrganismo previament e fixado ã lâmina. Nest as condições as células microbianas são observadas mort as. Após a fixação, submet e -se a preparação à et apa de coloração pela adição de soluções adequadas em função da t écnica de coloração desejada. As t écnicas de coloração não só facilit am a visibilidade das células microbianas, como t ambém, propiciam a visualização de det erminadas est rut uras c elulares em função de afinidades específicas com det erminados corant es, e facilit am ident ificação de micorganismos devido a comport ament o diferent es frent e à ação de soluções diferenciadoras. A menos que algum aspect o morfológico específico, dependent e de idade da cult ura, deva ser demonst rado, o microbiologist a deve usar sempre cult ura nova nas observações microscópicas. As células com o t empo de cult ivo, modificam o met abolismo, alt erando a afinidade com muit os corant es. Excluindo os organismos que t êm um t empo de geração especialment e grande, uma cult ura com 24 horas de cult ivo dará sempre bons result ados.
SUBST ÂNCIAS CORANT ES Segundo Langeron, corant es são subst âncias coradas que gozam da propriedade de t ransmit ir cor a out ros corpos. Muit as são as subst âncias corant es empregadas na rot ina diária dos laborat órios, a maioria derivados da anilina, podendo ser classificados em nat urais e art ificiais. Ent re os nat urais dest acam -se: o carmim, a hemat oxilina. Os art ificiais são agrupados em função dos
5 5 grupos químicos present es e da afinidade com est rut uras celulares, podendo ser: a) Básicos ou nucleares: violet a de genciana, crist al violet a, verde de malaquit a, azul de met ileno, fucsina básica, azul de t oluidina, verde de met ila et c. b) Ácidos ou citoplasmáticos: eosina, fluoresceína, fucsina ácida, orange G, vermelho congo, ácido picrico et c c) Neutros: eosinat o de azul de met ileno e de azul AZUR, giensa et c.
PREPARAÇÃO E FIXAÇÃO DE ESFREGAÇO Em processos de coloração de rot ina, uma boa observação microscópica depende t ant o da preparação do esfregaço como de sua fixação à lâmina. T ÉCNICA . Flambar a alça de plat ina (“em círculo”) ao rubro, deixar esfriar, conservando -a próxima à chama; . Deposit ar com o auxílio da alça, got as da suspensão microb iana na lâmina, se for o caso, suspender a amost ra da cult ura na própria lâmina; . Espalhar bem o mat erial na lâmina, empregando moviment os rot acionais na alça de plat ina ( do cent ro para a periferia), a fim de se obt er um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme; . Secar a fina película do mat erial (esfregaço) ao ar ou pela passagem na chama do bico de Bunsen; . Fixar o esfregaço, passando o dorso da lâmina t rês vezes ou mais na chama, a fim de que o mat erial fique bem aderido à lâmina; . Deixar a preparação esfriar ao ar e corar.
A fixação do esfregaço com água pode formar aerossóis (part ículas projet adas durant e a fervura de líquidos); evit a -se int roduzindo a lâmina no cone azul da chama (part e redut ora, a mais quent e), permanecendo alguns inst ant es a fim de secar o mat erial. A preparação e fixação do esfregaço requer cuidados evit ando -se t rat ament os bruscos, para que as células da amost ra a serem observadas não fiquem aglomeradas dificult ando a observação, como t ambém não t enham seus arr anjos caract eríst icos dest ruídos.
5 6 COLORAÇÃO SIMPLES Denomina-se de coloração simples à coloração em que se adiciona qualquer solução corant e ao esfregaço fixado durant e um det erminado t empo (30s a 3 min) em função do corant e ut ilizado. Depois lava -se a lâmina em água corrent e, seca -se e observa-se usando a objet iva de imersão. Essa coloração t em a finalidade de nos dá uma visão da forma, do t amanho e dos arranjos das células, bem como de out ros det alhes est rut urais.
T ÉCNICA 1. Preparar e fixar o esfregaço; 2. Cobrir com algumas got as de uma solução corant e (azul de met ileno, crist al violet a, fucsina, safranina); 3. Deixar o corant e agir por 60s; 4. Lavar em água corrent e; 5. Secar cuidadosament e na chama ou com papel absorvent e; 6. Observar com a objet iva de imersão (não esquecer de colocar 1 got a de óleo de imersão ant es de adapt ar a referida objet iva no eixo ót ico). Obsevação: Não se deve facilit ar com os papéis absorvent es usados, especialment e se os microrganismos em est udo forem pat ógenos.
COLORAÇÕES DIFERENCIAIS As colorações diferenciais dist inguem grupos de microrganismos ent re si, devido à diferenças químicas exist ent es ent re as células microbianas. Nest a t écnica de coloração ut iliza -se inicialment e soluções de corant es e mordent es; numa segunda et apa um agent e diferenciador; para finalment e realizar out ra coloração que cont rast a com a primeira. COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM Em 1884, CHRISTIAN GRAM descobriu um mét odo de coloração, baseado no fat o de que, quando cert as bact érias são coradas pelo crist al de violet a e depois t rat adas pelo iodo (solução iodo iodet ada, dit a lugol),forma -se um compost o de coloração escura ent re o iodo e o corant e, o qual é fort ement e removido pelo t rat ament o subseqüent e com álcool (diferenciador). São as bact érias Gram posit ivas, as que t omam o corant e de Gram (crist al violet a). Out ras bact érias, dit as Gram negat ivas, deixam-se descorar facilment e pelo
5 7 álcool. Assim sendo, se após a ação do álcool, fizermos uma coloração de fundo pela safranina ou pela fucsina básica, as bact érias Gram negat ivas aparecerão vermelhas (Figura 21).
Figura 21: Coloração de Gram
MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM As bact érias Gram posit ivas e Gram negat ivas int eragem com o corant e crist al violet a devido à ligações irônicas ent re os grupos básicos dos corant es e grupos ácidos dos const it uint es celulares. O iodo em solução penet ra nos dois t ipos de células e forma um precipit ado com o corant e. O agent e descorant e (álcool et ílico ou acet on a) nas células Gram negat ivas passa facilment e at ravés da membrana celular dissolvendo o complexo corant e -iodo, deixando a célula incolor. Nas células Gram posit ivas o álcool penet ra com dificuldade e a dissolução do complexo é lent a. A maior part e do comp lexo corant e-iodo permanece na célula que ret ém assim a sua coloração. Pela adição do cont ra-corant e (safranina ou fucsina básica) as células Gram posit ivas permanecem violet as enquant o as Gram negat iva int eragem com o mesmo, ficando vermelhas. As diferenças químicas ent re os const it uint es da parede celular das bact érias são responsáveis pela ret enção ou não do crist al violet a. Todas as células desprovidas de parede celular (cert os prot ozoários), bem como as células art ificialment e despojadas de parede celular (mesmo que sejam Gram posit ivas), comport am -se como Gram negat ivas.
5 8 As bact érias Gram negat ivas cont êm uma concent ração elevada de lipídeos, e suas paredes são t ambém mais delgadas com relação às bact érias Gram posit ivas. O descorament o ext rai os li pídeos aument ando a porosidade ou permeabilidade da parede favorecendo a ret irada do complexo crist al violet a -iodo. As paredes celulares das bact érias Gram. posit ivas em virt ude de sua composição diferent e (menos cont eúdo lipídico, presença de ácido t eicó ico, maior quant idade de pept oglicano (mucocomplexo) cujos aminoácidos encont ram-se mais int ercruzados, deixando a parede mais compact a), t ornam-se desidrat adas durant e o t rat ament o com o descorant e; a porosidade diminui, a permeabilidade se reduz e o complexo crist al violet a-iodo não é ext raído. O mét odo de Gram é dent re os processos de coloração para bact érias, o mais import ant e. Todas as leveduras quando submet idas a est a coloração comport am-se como Gram posit ivas, enquant o os fungos filament osos e para os prot ozoários, geralment e não se aplica est a t écnica por não ser convenient e. REGRAS GERAIS DA COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM 1 - Os cocos, são geralment e Gram-posit ivos, com exceção dos pert encent es ao gênero Neisseria (Gonococos , Meningococos). 2 - Os bacilos, são geralment e Gram-negat ivos, excet uando -se os pert encent es aos gêneros: Corynebacterium (bacilo dift érico); Bacillus (B. subtilis ), B. antracis (do carbúnculo) e Clostridium (bacilo do t ét ano) Cl. tetani; Cl. botulinum (do bot ulismo).
TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM 1. Preparar um esfregaço; 2. Depois de frio cobrir o esfregaço com solução de crist al de violet a (1 minut o); 3. Cobrir com solução de lugol (mordent e) - 1 minut o; 4. Lavar em água corrent e; 5. Descorar pelo álcool absolut o (evit ar o descorament o deficient e ou em excesso; 6. Lavar em água corrent e; 7. Cont rast ar, rapidament e com safranina (30 segundos); 8. Lavar em água corrent e; 9. Secar com papel fino; 10.Examinar com objet iva de imersão.
5 9 AMOSTRAS: Bacillus subtilis; Escherichia coli ; Aerobacter aerogenes; Staphylococcus aureus; Sarcina lútea; Micrococcus
COLORAÇÃO DE ESPOROS Os esporos são células de resist ência, não sendo caract eríst ica predominant e de t odos os microrganismos. Algumas bact érias são capazes de formar esporos, como por exemplo: bact érias do gênero Bacillus e Clostridium . TÉCNICA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Preparar o esfregaço e fixar; Cobrir o esfregaço com papel de filt ro; Adicionar o corant e verde malaquit a; Aquecer at é emissão de vapores; Repet ir as operações 3 e 4 por 3 minut os; Lavar em água corrent e; Adicionar safranina (0,5 a 1 minut o); Lavar em água corrent e; Secar e observar em imersão
RESULTADO: Os esporos coram-se em verde e o rest o da célula em vermelho.
COLORAÇÃO DE ZIEHL -NEELSEN As bact érias do Gênero Mycobact erium e algumas espécies de Nocardias quando submet idas à coloração diferencial de Ziehl -Neelsen, são denominadas bact érias álcool-ácido -resist ent es. Dificilment e, est as bact érias, coram-se pelos corant es básicos da anilina, mas uma vez coradas, fixam-nos de t al forma que não se descoram pela ação diferenciadora conjunt a do álcool e dos á cidos minerais fort es diluídos. A ácido -resist ência, evidenciada pela coloração de Ziehl, est a definit ivament e relacionada à exist ência, na parede celular das micobact érias, de lipídeos fort ement e ligados, que resist em à ext ração sucessivas do resíduo bact eriano seco com álcool-ácido. É int eressant e not ar, ent ret ant o, que a int egridade física da parede celular é t ambém essencial à ácido -resist ência, pois est a propiedade desaparece quando as bact érias são desint egradas pelo ult ra -som.
6 0 MECANISMO DA COLORAÇÃO DE ZIEHL -NEELSEN O gênero Mycobact erium e algumas espécies de Nocardias possuem alt o cont eúdo lipídico em sua parede celular. Essa bainha prot et ora de cera e graxa é insolúvel em ácidos minerais diluídos e, para a maior part e desses org anismos, t ambém em álcool ou ét er. Uma vez coradas à quent e pela fucsina de Ziehl, ret ém esse corant e e na se descora pelo t rat ament o subseqüent e com álcool acidulado. TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE ZIEHL -NEELSEN AMOSTRAS: Staphylococcus aureus Mycobacterium sm egm atis. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: - Preparar e fixar o esfregaço; - Cobrir com um pedaço pequeno de papel de filt ro(para evit ar que a solução ferva e seque rapidament e); - Cobrir a preparação com a solução de fucsina de Zieh l e aquecer, brandament e, at é emissão de vapores(não deixar ferver nem secar) por 5 a 10 minut os; - Lavar em água corrent e; - Descorar pela solução de álcool-ácido(ácido clorídrico a 3% em et anol); - Lavar em água corrent e; - Corar com azul de met ileno a 1,0% por 1 minut o; - Lavar em água corrent e; - Secar e observar em imersão. RESULTADOS: As bact érias álcool-ácido -resist ent es(A.A.R.) se coram em vermelho cont rast ando com as não álccol-ácido -resist ent es(N.A.R.) que se coram em azul.
6 1
PRÁTICA N 10: TÉCNICAS DE CONTAGEM OBJET IVOS: Obt er a concent ração celular por cont agem em placa ; pelo uso de câmara de cont agem (câmara de Neubauer) e por t urbidimet ria
A) CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS PELA TÉCNICA D E PLAQUEAMENTO
MATERIAL: - Amostra: Saccharomyces cervisiae (solução de ferment o prensado em água) - Meio de cultura: Glicose Agar - Diversos: Pipet as de 1ml, Placas de Pet ri, t ubos de ensaio com 9ml de água est éril, Erlenmeyer com 99ml de água est éril, Bico de Bunsen PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: Para a cont agem em placa, da amost ra cont endo a cult ura S. cerevisiae fazer diluições at é 1x10 - 7 e plaquear em duplicat a 1ml das diluições de 1x 10 - 4 a 1x10 - 7 . Colocar 1 ml de cada diluição em placas e adicionar 10-20ml de meio de cult ura (GA) , homogeneizar, esperar solidificar. A seguir incubar a t emperat ura ambient e por 24 -48 horas.
Figura 22: Esquema de diluição da técnica das diluições sucessivas
6 2 B)
CONCENTRAÇÃO CELULAR POR TUR BIDIMETRIA
Um cult ivo de bact érias ou leveduras em meio líquido, at ua como uma suspensão coloidal, reflet indo ou pondo obst áculos a passagem da luz at ravés do mesmo. At é cert o pont o, a luz que foi absorvida ou reflet ida é proporcional a concent ração de c élulas present es na suspensão. A t urvação que apresent a um t ubo de ensaio cont endo uma cult ura em cresciment o, é provocada pela absorção e reflexão da luz. Port ant o, ao se medir a percent agem de absorção da luz (t urbidimet ria) ou a reflexão da luz (nefelomet ria) se pode est imar a concent ração de células present es. Ficaremos rest rit os ao primeiro caso. Para as medidas t urbidiméricas da massa celular, podem ser ut ilizados inst rument os como um espect rofot ômet ro ou fot ocolorímet ro. Na t urbidimet ria, a capac idade do cult ivo para det er a luz, se expressa como percent agem de luz t ransmit ida, sendo est a percent agem inversament e proporcional à concent ração de células. A percent agem da t ransmit ância (T) é igual a I/I 0 , sendo I 0 , a int ensidade da luz incident e e I, a int ensidade da luz t ransmit ida. Para verificar a relação diret a proporcional ent re a concent ração de células e a absorbância da luz (Densidade Ót ica, DO = log I 0 /I), vamos medir a t urbidez de várias diluições (Figura 3) de uma suspensão de uma cult ur a de E.coli e proceder a cont agem em placa dest as diluições.
AMOSTRAS E MATERIAIS - Microrganismos: Escherichia coli (bact éria) e cerevisiae (levedura) - Meios de cult ura:
Caldo lact osado e
Saccharomyces
Caldo glicosado
- Equipament os: Agit ad or magnét ico ; Espect rofot ômet ro - Diversos: Tubos ou cubet as para o espect rofot ômet ro ; Pipet as de 5ml est erilizadas
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: - Fazer a diluição das cult uras, conforme most ra a figura 3. - Calibrar o espect rofot ômet ro, ut ilizando luz com compriment o de onda variando ent re 500 e 600nm. Colocar no aparelho um t ubo cont endo 5ml de meio de caldo lact osado ou caldo glicosado est éril. Com est e t ubo (“branco”) o espect rofot ômet ro é ajust ado para D.O. igual a zero, ou t ransmit ância igual a 100%;
6 3 - ret irar o “branco” do aparelho e colocar o t ubo da cult ura. Fazer a leit ura da D.O. e anot ar o result ado. Imediat ament e proceder a cont agem em placa, da cult ura no t ubo que foi feit a a leit ura no espect rofot ômet ro. - repet ir o mesmo procediment o para os demais t ubos da cult ura diluída, ajust ando sempre o espect rofot ômet ro cont ra o “branco”, a cada leit ura, e agit ando bast ant e o t ubo com a cult ura; - para a cont agem em placa, dos t ubos cont endo a cult ura de E.coli e S. cerevisiae fazer diluições at é 1x10 - 7 e plaquear em duplicat a 1ml das diluições de 1x 10 - 4 a 1x10 - 7 .
FIGURA 23. Diluição da cult ura para leit ura no espect rofot ômet ro
RESULTADOS: Anot ar na t abela, os result ados das leit uras das densidades ót icas e das co rrespondent es cont agens em placas. Após obt er o número de células por cont agem em placa, das diluições, relacionar num gráfico, os valores da D.O. das diversas diluições na ordenada, cont ra os números de microrganismos correspondent es que se det erminou. Assim, obt emos uma curva de calibração para o referido microrganismo nas condições do experiment o.
6 4 Diluições da cultura (ml)
Densidade Ótica (D.O)
Concentração celular (células/ml)
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
B) CONCENTRAÇÃO CELULAR E VIABILIDADE CELULAR POR CONTAGEM DIRETA COM USO DE CÂMARAS DE CONTAGEM A cont agem diret a por microscópio é a mais rápida e é levada a efeit o com a cont agem de organismos num volume conhecido da cult ura. Est a enumeração é feit a com o auxílio de câmaras de cont agem que são inst rument os de precisão, feit as de vidro ópt ico especial. As mais comuns são as de Fuchs rosent hal, Neubauer e as Helber. Est as câmaras apresent am uma área ret iculada, com pequenos quadrados de superfície conhecida. Fazendo p art e do conjunt o, exist e uma lamínula que recobre os pequenos quadrados, de modo que a alt ura dest es à lamínula é conhecida. No nosso experiment o, as leveduras serão cont adas numa câmara de Neubauer, que apresent a uma área dividida em quadrados com 1/400mm 2 ; a câmara é cobert a com uma lamínula, deixando uma alt ura de 1/10mm, i.é., de cada quadrado à lamínula. Assim sendo o volume que fica acima de cada quadrado é de 1/4000 mm 3 . Est e mét odo de cont agem diret a, t em a vant agem de fornecer um result ado quase imediat o, no ent ant o t em a desvant agem de não se t er a dist inção ent re células vivas e mort as. A cont agem de leveduras pode diferenciar os organismos viáveis dos mort os pela coloração com o corant e azul de met ileno e, det erminar a cont agem t ot al de células e a viabilidade celular. MATERIAL - Microrganismo: Cult ura de Saccharomyces cervisiae - Reagent es: Solução salina fisiológica (0,85% NaCl) -Equipament os:
6 5 Microscópio ót ico comum Câmara de cont agem de Neubauer Bico de Bunsen - Diversos: Pipet a Past eur
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
-Adicionar com uma pipet a Past eur ou similar, uma got a da suspensão da cult ura de levedura sobre a área ret iculada da câmara; -Colocar a lamínula sobre a got a. Alt ernat ivament e, pode -se colocar primeiro a lamínula, e deixar -se que a suspensão do microrganismo, que sai da pipet a, escorra por ação capilar sob a lamínula; - Esperar cerca de dez minut os, at é que o mat erial sediment e; - Usando a objet iva de 40 -45X, cont ar as leveduras em cerca de 10 quadrados dispost os em “X” (ver figura 2).
RESULTADOS - Calcular o número de leveduras/mL, e a viabilidade celular cont idas em uma suspensão ut ilizando as fórmulas abaixo:
CONCENTRAÇÃO CELULAR (LEVEDURAS/ML) = N X 25000 X DILUIÇÃO Onde
N= número de células dos quadrados
VIABILIDADE CEL ULAR (%) =
células vivas x 100 células vivas + células mortas
6 6
1
6
2
7
3 / 8
4
9
5
1 0
Figura 24- Câmara de Neubauer
PRÁTICA N º 11 – CRESCIMENTO MICROBIANO PART E 1: OBJET IVO: Det erminar uma curva de calibração para a det erminação da concent ração da levedura Saccharomyces cerevisiae a part ir do ferment o prensado. INT RODUÇÃO: A part ir do conheciment o do t eor de mat éria seca em ferment o prensado comercial é possível preparar uma suspensão pa drão de leveduras, de det erminada concent ração, com bast ant e confiabilidade. At ravés de uma série de diluições convenient es dessa suspensão padrão são obt idas novas suspensões de concent rações conhecidas. Finalment e, a t urbidez provocada no meio pelas diferent es suspensões de leveduras é medida at ravés de um inst rument o adequado e os valores obt idos são relacionados com as respect ivas concent rações por int ermédio de uma expressão mat emát ica.
6 7 As diluições adequadas são obt idas at ravés de t ent at ivas de for ma a abranger um int ervalo de concent rações que at enda as seguint es condições: 1 a .) Deve haver uma correlação linear ent re a concent ração e o logarit mo da t rasmit ância e; 2 a ) Os valores das t ransmit âncias obt idas devem est ar sit uadas na região de maior sensibilidade na escala do inst rument o ut ilizado.
T ÉCNICA: 1.
Em um copo de Béquer de 50ml pesar, em balança semi -analít ica, 2g de ferment o prensado, anot ando o valor exat o. Diluir em um pouco de água e t ransferir, analit icament e, para um balão de 1000ml. Complet ar o volume e homogeneizar;
2.
A part ir da concent ração da suspensão padrão escolher os valores para as concent rações, de forma a cobrir uma det erminada faixa de concent rações;
3.
Realizar uma série de diluições com um conjunt o de pipet as e balões volumét ricos adequados. Ut ilizar como sugest ão os valores da t abela abaixo.
4.
Suspensão número
Conc. da diluição, X (g/l)
Fator de diluição
1 2 3 4 5 6 7 8
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1,2
20x 10x 6,67x 5x 4x 3,33x 2,5x 1,67x
Modo de preparo (ml da susp. padrão) 25 at é 500 25 at é 250 15 at é 100 20 at é 100 50 at é 200 15 at é 50 20 at é 50 15 at é 25
Homogeneizar cada suspensão e t ransferir para um t ubo de espect rofot ômet ro previament e ajust ado ao compriment o de onda de 610 nm.
6 8 5.
Realizar, pelo menos, duas leit uras do valor da absorbância para cada concent ração. O espect rofot ômet ro é calibrado ant es de cada leit ura, com um “branco” de água dest ilada.
6.
Const ruir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da concent ração X (g/l) e no eixo d as abssissas os valores da absorbância (D.O).
7.
Fazer uma regressão linear com o auxílio de um programa de comput ador ou ut ilizando o mét odo dos mínimos quadrados.
8.
Calcular o coeficient e de correlação, r, e det erminar o int ervalo de concent rações, X 1 X 2 , no qual a expressão é válida.
Observação: A curva de calibração obt ida pelos pont os descrit os é válida apenas para o ferment o prensado ut ilizado na sua confecção.
PART E 2: OBJET IVOS: Avaliar o cresciment o de um microrganismo em diferent es meios de cult ivo; Confeccionar a curvas de cresciment o celular, ut ilizando o mét odo t urbidimét rico; Calcular o t empo de geração (G )e a velocidade específica máxima de cresciment o ( má x ) e a produt ividade celular (P) em cada meio de cult ivo.
INT RODUÇÃO: O cresciment o microbiano pode ser definido em t ermos, t ant o da massa, como t ambém do número de células. Em condições de cresciment o exponencial, massa celular e número de células permanecem proporcionais, embora a relação ent re est es dois valores po ssa variar em det erminadas condições de cult ivo. O cresciment o de um microrganismo em diferent es meios de cult ivo, por exemplo, pode ser avaliado pela det erminação da massa celular que, por sua vez, pode ser medida indiret ament e pela t urvação de uma suspe nsão. A evolução do cresciment o pode ser avaliada ut ilizando um cult ivo em bat elada em condições de incubação cont roladas. Com leit uras da densidade ópt ica (absorbância) de uma série de amost ras ret iradas a int ervalos de t empo regulares, e com auxílio da curva padrão de calibração, é possível confeccionar uma curva de cresciment o
6 9 relacionando a concent ração celular (ordenada) com o t empo de cult ivo (abcissa). Nest a curva são, ent ão, ident ificadas as diferent es fases do cresciment o microbiano. Durant e a fase exponencial de cresciment o pode -se ent ão det erminar o t empo de geração (G) e a velocidade específica máxima de cresciment o ( M Á X . ). Pode-se ainda det erminar a produt ividade celular (P)que é a relação ent re a variação da concent ração celular p ela variação do t empo de cult ivo. Est e valor deverá ser det erminado pela seguint e equação: P= (X f - X o )/(t f - t o ) ) Onde: X o = Concent ração celular inicial, (g/l) X f = concent ração celular final , (g/l) t f = t empo final, (h) t o = t empo inicial, (h)
MAT ERIAL - Microrganismo Saccharom yces cerevisiae - Meios de cult ura Caldo nut rit ivo suplement ado com 1% de açúcar (glicose, frut ose e sacarose) - Equipament os: Espect rofot ômet ro Mesa agit adora (rumbeira) Balança semi-analít ica - Diversos: Cubet as do espect rofot ômet ro Tubos de ensaio est éreis 3 Erlenmeyers, 1000ml Pipet as, 10ml MÉT ODOS 1. Preparar 1,5 lit ros de caldo nut rit ivo, dist ribuir 500ml em 3 Erlenmeyers de 1000ml de capacidade. Adicionar no primeiro 5g de glicose, no segundo 5g de sacarose e no t erceiro 5g de frut ose, homogeneizar e est erilizar a 121 o C por 15 minut os. Deixar esfriar; 2. Ret irar uma amost ra de 5 -10ml de cada meio para servir como um branco;
7 0 3. Colocar os Erlenmeyers na balança semi-analít ica e inocular est erilment e cerca de 0,2g a 0,4g do microrganismo Saccharomyces cerevisiae (ferment o prensado ); 4. Ret irar 3ml de amost ra com uma pipet a est éril, imediat ament e após a inoculação, correspondent e , port ant o, ao t empo zero. Efet uar a leit ura da Absorbância (ou densidade ópt ica). Anot ar o result ado; 5. Colocar os Erlenmeyers na mesa agit adora, t endo o cuidado de fixá los bem. Ligar a agit ação a 9000 rpm. Deixá -los sob agit ação durant e t odo o cult ivo ; 6. Ret irar amost ras de 3ml a int ervalos de 1 hora, at é que se observe um mínimo de t rês valores idênt icos, ou muit o próximos, de densidade ópt ica (DO). Anot ar os result ados; 7. Const ruir um gráfico para cada meio de cult ivo, colocando no eixo das ordenadas os valores do t empo (h) e no eixo das abcissas concent ração X (g/l); 1.
Calcular a velocidade específica máxima de cresciment o ( má x ) o t empo de geração (G ) e a produt ividade celular ( X/t ) em cada meio de cult ivo;
1. Comparar os result ados obt idos e t irar conclusões a respeit o do meio mais adequado ao cresciment o.
Modelo de registro tabular Meio de Cultivo: Tempo Densidade Concentração (h) Óptica X(g/l) (DO) 0 1 2 3 4 5 6 7 8