Clonado y expresiรณn del cDNA de los factores de transcripciรณn Pax8A y C humano en bacterias
Informe de Trabajo Prรกctico Grupo 5A Integrantes: Costilla Melisa, Degiusti Bรกrbara, Fiore Ana, Gรณmez Alejandra, Rigoni Adriana
Primer Objetivo: amplificación del inserto a clonar cDNA del factor de transcripción Pax 8A por PCR
Resultado: El factor de transcripción Pax8A fue amplificado correctamente. Corroborándose, por corrida electroforética, la presencia del mismo en las 4 reacciones realizadas por este grupo de trabajo, más un tubo control negativo.
Figura 1. Corrida electroforĂŠtica en gel de agarosa 1,5%.Calles 2 a 6 pertenecen al grupo 5A. Calle 2: control negativo, calles 3 a 6 productos de amplificaciĂłn del Pax8A FotografĂa tomada en el transiluminador UV
Segundo Objetivo: Preparaciรณn del inserto y del vector para la clonaciรณn, por doble digestiรณn con las enzimas BamHI y EcoRI. Ligaciรณn en pGEMT y transformaciรณn de bacterias competentes.
Resultados: Luego de cultivar las bacterias en agar LB/ampicilina/IPTG/XGal, se obtuvo desarrollo de colonias blancas y azules, indicando el crecimiento de las recombinantes y no recombinantes respectivamente.
Figura 2. Placa de agar LB/ampicilina/IPTG/X-Gal. Se observa el desarrollo de colonias blancas y azules.
Tercer Objetivo: Purificación del DNA plasmídico bacteriano y caracterización del plásmido recombinante por corrida electroforética. Caracterización del mismo por digestión con enzima de restricción.
Resultado: La calidad y cantidad del plásmido purificado se controló por corrida electroforética de los plásmidos circulares y plásmidos digeridos, observándose dos bandas.
Figura 3. Corrida electroforĂŠtica en gel de agarosa al 1% . Se observa la presencia de dos bandas correspondientes al vector con y sin inserto. Chorreado de ARN en el extremo derecho de la foto
Figura 4. :Corridas electroforĂŠticas obtenidas por otros grupos
Cuarto Objetivo: Expresión recombinante en bacterias de PAX8 A y posterior visualización de proteínas totales en gel SDS-PAGE coloreado con Coomassie blue
Resultados: Obtención del gel y análisis de los resultados. (Pendiente… )
Conclusión: Se realizó el clonado del cDNA del factor de transcripción Pax8A en bacterias competentes DH5a. No se pudo evidenciar los resultados de la expresión de la proteína debido a dificultades técnicas. Queda pendiente la repetición de la corrida para evaluar la funcionalidad del factor de transcripción además de la secuenciación del gen que codifica para la misma.