Vacunas de DNA by Arturo Reyes Sandoval

VACUNAS DE DNA Arturo Reyes Sandoval1 Aguinaldo R. Pinto2 Programa Institucional de Biomedicina Molecular Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía Instituto Politécnico Nacional Guillermo Massieu Helguera 239 Colonia La Ecalera 07320 México, D.F.

Instituto Adolpho Lutz Av. Dr. Arnaldo, 355 São Paulo - SP 01046-902 Brasil

________________________________________________________________ En: TEMAS DE ACTUALIDAD EM MICROBIOLOGÍA, AMBIENTE Y SALUD. Rocha-Gracia, R. del C., Y. Martinez-Laguna y J. F. López-Olguín J.F. (Eds). 2002. Publicación Especial de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México. pp. 327-342. ________________________________________________________________

RESUMEN La vacunación se encuentra entre las metodologías que más han impactado en la salud del ser humano. El desarrollo sistemático de las primeras vacunas fue favorecido en sus inicios por los avances en la microbiología y el desarrollo de técnicas de cultivo de células in vitro. Ello permitió la creación de las primeras vacunas basadas en microorganismos patógenos inactivados o atenuados que se emplearon de manera exitosa para lograr algunos de los mayores avances del siglo XX en materia de salud: la erradicación de la viruela a nivel mundial y la eliminación casi total de la poliomielitis gracias a los esfuerzos de la Organización Mundial de la Salud. Durante la década pasada, el campo de la vacunación ha tenido cambios radicales debido a la aplicación de los conocimientos en biología molecular y en virología, lo que ha llevado a la creación de vacunas de nueva generación como aquellas basadas en DNA. Las vacunas de DNA consisten en vectores plasmídicos a los que se ha insertado un gen que codifica para una proteína de algún microorganismo patógeno contra el que se busca brindar protección. La expresión genética se lleva a cabo bajo la influencia de un promotor, el cual permite la síntesis de la proteína transgénica en células que son transfectadas in vivo tras la inyección del vector plasmídico. La característica más notable de las vacunas de DNA es que constituyen un estímulo muy potente para la generación de respuestas celulares que hasta la fecha sólo se ha obtenido con aquellas basadas en microorganismos atenuados. Esta nueva generación de vacunas ha mostrado su eficacia en modelos animales. En humanos, sin embargo, los resultados han sido menos impresionantes cuando se utilizan de manera aislada, pero ofrecen un gran potencial al administrarse de manera conjunta con otro tipo de vacunas recombinantes. PALABRAS CLAVE: Vacunación, vacunas de DNA, inmunización genética, vectores plasmídicos.

INTRODUCCIÓN Es ampliamente aceptado que las vacunas constituyen la manera más efectiva que existe para el combate de las enfermedades infecciosas debido al gran beneficio que brindan a tan bajo costo; esto hace de ellas una tecnología bastante atractiva tanto para países desarrollados en los que los precios en materia de salud se elevan exponencialmente conforme las técnicas de diagnóstico y tratamiento se vuelven más sofisticadas, como para países en vías de desarrollo en los que el acceso a ciertos tratamientos son prohibitivos debido a los altos precios. En las décadas pasadas se ha logrado un gran avance en el conocimiento a nivel molecular tanto de microorganismos y los diferentes eventos que los llevan a causar enfermedades, como del sistema inmune que permite evitarlas. La generación de tal cantidad de información y su combinación con las herramientas moleculares disponibles en la actualidad, ha creado un campo fértil para el desarrollo de nuevas y mejores vacunas basadas en un diseño racional en el que se tomen en cuenta una mayor cantidad de factores que intervienen en el desarrollo de una respuesta inmune protectora. Las vacunas de DNA ofrecen una serie de ventajas sobre las tecnologías ya existentes para la producción de vacunas. Ellas estimulan tanto la respuesta inmune humoral como la celular y a diferencia de las vacunas con microorganismos recombinantes no hay respuesta inmune hacia el vector lo cual permite su utilización de manera repetida. La vacunación genética puede considerarse segura, y debido a que no se administran microorganismos vivos

puede emplearse en individuos inmunocomprometidos y mujeres embarazadas. Los vectores plasmídicos utilizados para vacunación con DNA son fabricados con facilidad, de tal manera que una persona con conocimientos básicos en biología molecular puede crear un vector en unos cuantos días, el cual puede ser facilmente modificado para añadir o remover dominios transmembranales, secuencias señalizadoras que modifiquen la ubicación final del antígeno en la célula, residuos que sean glicosilados y que afecten el procesamiento antigénico. Las secuencias de DNA pueden ser modificadas por mutación dirigida, permitiendo cambios en aminoácidos individuales que permitan potenciar la respuesta inmune o eliminar determinantes antigénicos que inducen respuestas inmunes no deseadas. Otra serie de modificaciones genéticas de uso en la actualidad consisten en la optimización de codones mediante el cambio de tripletes de secuencias virales por aquellos que son utilizados de manera preferencial en mamíferos debido a las diferencias en la abundancia de RNA de transferencia, teniendo cuidado de no alterar la estructura primaria de la proteína. Ventajas de otro tipo incluyen la estabilidad de los vectores plasmídicos a diferentes temperaturas, lo cual permite disminuir costos en el proceso de elaboración, transporte y administración debido a que no se requiere una "cadena fría" o serie de refrigeraciones para mantener la estabilidad de la vacuna. Esta nueva generación de vacunas ofrecen alternativas prometedoras para las vacunas que se han venido utilizando de manera clásica desde décadas atrás, con las cuales se han combatido enfermedades infecciosas causadas

principalmente por bacterias y virus. Adicionalmente, mediante su empleo se han abierto nuevas y excitantes posibilidades para el tratamiento de patologías como cáncer, enfermedades autoinmunes y alérgicas.

BREVE HISTORIA DE LA VACUNACIÓN CON DNA. La vacunación mediante el empleo de DNA plasmídico tuvo sus inicios en las observaciones de Jon A. Wolff, quien inicialmente intentó utilizar DNA plasmídico como control negativo en experimentos de transferencia genética en ratones. El resultado, sin embargo, fue la demostración de que las células musculares son capaces de expresar genes como consecuencia de la inyección de DNA plasmídico “desnudo”, sin la necesidad de utilizar vectores virales o DNA encapsulado en liposomas. Sus resultados lo llevaron a plantear la posibilidad de que la transferencia genética mediante DNA plasmídico podría ser utilizada para el desarrollo de vacunas (Wolff et al., 1990). Posteriormente, se reportó la generación de anticuerpos contra dos proteínas, la hormona de crecimiento humano (hGH) y la α 1-antitripsina (hAAT) mediante la inoculación de DNA codificante para ambas, demostrando la posibilidad de realizar una inmunización genética mediante bombardeo de partículas de oro cubiertas con DNA (Tang et al., 1992). Mas adelante, el campo de la vacunación con DNA quedó firmemente establecido tras la demostración de que la inyección de vectores codificantes para proteínas del virus de la influenza protegían a animales ante un reto mortal con el virus (Robinson et al., 1993; Ulmer et al., 1993). A partir de estos primeros experimentos se inició un

tremendo ímpetu en la investigación tanto en sectores académicos como a nivel privado para el desarrollo de vacunas basadas en DNA, lo cual ha llevado al desarrollo de vacunas hacia una gran cantidad de enfermedades de origen viral, bacterianas y parasitarias; asi como dirigidas al tratamiento de otras patologías como cáncer, enfermedades autoinmunes y alérgicas (Reyes-Sandoval y Ertl, 2001).

ESTRUCTURA DE LAS VACUNAS DE DNA Las vacunas de DNA están compuestas por un plásmido bacteriano o vector en el cual se ha insertado una secuencia de cDNA que codifica el antígeno de interés o proteína transgénica. Los plásmidos bacterianos son basicamente los mismos que se utilizan en experimentos que involucran la expresión de proteínas en cultivos celulares. De manera funcional, el vector plasmídico empleado para vacunas de DNA está compuesto por una unidad transcripcional que incluye un promotor, un intrón, un cDNA que codifica para el antígeno y una secuencia de terminación de la transcripción; el segundo componente consiste en el esqueleto plasmídico que contiene el origen de replicación, un sitio de clonación múltiple que facilita la inserción del gen, un gen de resistencia a antibióticos y las secuencias CpG inmunoestimulatorias que funcionan como un adyuvante interno en la misma vacuna (Figura 1) (Kowalczyk y Ertl, 1999).

origen de replicación

promotor intrón

ISS

sitio de clonación cDNA

ISS gen de resistencia a antibióticos

ISS

sitio de clonación secuencia de terminación

Figura 1. Representación de la estructura de un vector plasmídico empleado como vacuna de DNA. El vector posee una unidad transcripcional compuesta por un promotor, intrón, cDNA que codifica para el antígeno y una secuencia de terminación de la transcripción. El esqueleto plasmídico posee un gen de resistencia a antibióticos, origen de replicación, sitios de clonación múltiple y secuencias CpG inmunoestimulatorias (ISS) que funcionan como adyuvantes internos de la vacuna.

UNIDAD TRANSCRIPCIONAL Promotor. En la actualidad, la mayoría de las vacunas de DNA contienen el promotor de la región inmediata temprana de Citomegalovirus (CMV/IE), el cual permite altos niveles de transcripción de manera constitutiva en una gran variedad de células eucarióticas (Montgomery et al., 1993; Bohm et al., 1996;

Hartikka et al., 1996). La inclusión de la secuencia del intrón A del CMV (CMVIA) ha permitido una mejoría en la expresión de cDNAs microbianos (Chapman et al., 1991). Otros promotores virales comunmente utilizados, aunque de expresión más débil, son los del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) y el promotor temprano viral SV40. Este último es unas 40 veces menos potente que el de CMV, sin embargo funciona de manera óptima en vacunas con inmunógenos como la glicoproteína del virus de la rabia, la cual no genera una buena respuesta inmune cuando se encuentra bajo la influencia del promotor CMV/IE por la posible toxicidad causada a la célula que lo expresa (Xiang et al., 1994; Xiang et al., 1995). Lo anterior hace evidente que no necesariamente se genera una respuesta inmune más potente con los promotores fuertes, por lo que es necesario elegir el promotor apropiado para el antígeno que se desea emplear. Es posible lograr una buena respuesta inmune al utilizar promotores no virales como aquellos que participan en la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II. En algunos modelos, los primeros han generado una respuesta inmune más fuerte, mientras que los de clase II propician una respuesta menor (Xiang et al., 1997). Otros promotores, como el de la creatina cinasa muscular que solamente se expresa en músculo esquelético diferenciado han sido empleados en vacunas miogénicas de DNA ofreciendo protección contra la infección del virus Herpes Simplex tipo 2 (HSV-2) (Gebhard et al., 2000). Secuencia de terminación de la transcripción. La terminación de la transcripción en las vacunas de DNA se realiza mediante secuencias de terminación y

poliadenilación ubicada en la región 3' del DNA que codifica para el antígeno. Estas se conocen como regiones 3' no traducidas (3'-UTR) y la mayor parte de los vectores emplean secuencias provenientes del virus SV40, como el vector pSG5; de la Hormona del Crecimiento Bovino (BGH 3'-UTR), en pCDNA3 y VR1012; o de la cadena β-globina de conejo (mRBG), en el vector VR1255. Las secuencias de terminación/poliadenilación dan estabilidad a la molécula de mRNA y están formadas por una secuencia ubicua AATAAA seguida de una secuencia rica en GT o en T, los cuales bajo condiciones óptimas se encuentran separados por 22 ó 23 nucleótidos (Levitt et al., 1989). Las diversas secuencias de terminación provocan variación en los niveles de expresión de las proteínas, ya que se ha mostrado que la sustitución de aquellas provenientes de SV40 por las de la BGH provoca un incremento en la expresión de genes como la luciferasa, y el reemplazo de la secuencia de BGH por la de mRBG la incrementa aun más (Hartikka et al., 1996; Norman et al., 1997).

ESQUELETO PLASMíDICO Origen de replicación (ori). Aunque algunos vectores poseen el origen de replicación viral dependiente del antígeno T del virus SV40, por motivos de seguridad en cuanto al potencial uso clínico es preferible sustituir éste por otros de origen bacteriano. El origen de replicación comunmente utilizado en las vacunas de DNA es el ColE1, con el cual se obtienen grandes cantidades de DNA plasmídico debido a que permite la presencia de hasta 20 copias de DNA por célula (Azevedo et al., 1999).

Sitio de clonación múltiple. Uno de los primeros plásmidos que se desarrollaron con una serie de características deseables, como la presencia de varios sitios de restricción fue el pBR313 (Bolivar et al., 1977a), el cual posteriormente derivó en la construcción de un vector de menor tamaño, el pBR322 (Bolivar et al., 1977b) que rapidamente se convirtió en el más comunmente utilizado y del cual se derivan un gran número de vectores de clonación empleados en la actualidad (Sambrook, 1989). La mayoría de los plásmidos poseen una serie de sitios de clonación sintéticos con secuencias que son reconocidas por enzimas de restricción utilizadas de manera común en ensayos de clonación, los cuales no se presentan en el resto del plásmido (Sambrook, 1989). De esta manera es posible clonar secuencias de DNA que codifican para el antígeno de interés y que han sido obtenidas mediante PCR con cebadores que poseen idénticos sitios de restricción que las secuencias blanco, o mediante restricción con enzimas a partir de otros plásmidos. Gen de resistencia a antibióticos. Los vectores plasmídicos utilizados como vacunas de DNA se obtienen mediante transformación de bacterias competentes como E. Coli cepa DH5α previamente tratadas con una mezcla de cationes divalentes que las hacen permeables temporalmente a pequeñas moléculas de DNA. La pequeña población de bacterias que adquieren el plásmido es identificada mediante marcadores selectivos que confieren resistencia a antibióticos. Un buen número de vacunas de DNA poseen marcadores que codifican para β-lactamasa y confieren resistencia a ampicilina. Sin embargo, éste antibiótico podría estar presente como contaminante en las vacunas de

DNA ya que se requiere durante el proceso de amplificación del vector en cultivos bacterianos. Esto genera preocupación en cuanto a la seguridad de la preparación, ya que la ampicilina contaminante es capaz de provocar choque anafiláctico en personas previamente sensibilizadas al antibiótico. Por ello, los vectores con marcadores selectivos para kanamicina son preferidos para uso en humanos, y la expresión de la proteína no disminuye en estos últimos sino más bien puede incrementarse si el marcador se inserta en sentido contrario al gen de interés en la vacuna de DNA (Hartikka et al., 1996). Secuencias CpG inmunoestimulatorias. Las secuencias inmunoestimulatorias de DNA (ISS

por sus siglas en inglés “immunostimulatory DNA sequences”),

también conocidas como secuencias CpG, son motivos en el DNA compuestos por una citosina seguida de una adenina presentes en contextos especiales en el DNA, es decir, la secuencia CpG debe estar precedida por dos purinas en la región 5’, seguidas a la vez por dos pirimidinas en la región 3’. Cuando las secuencias CpG se encuentran de esta manera en el DNA, activan al sistema inmune innato para producir citocinas inmunoestimulatorias (Pisetsky et al., 1995; Krieg et al., 1995). Las secuencias CpG son aproximadamente 20 veces más comunes en el DNA bacteriano que en el de organismos vertebrados; mientras que en este último, además de la baja frecuencia, el 80% de las citosinas de las secuencias CpG se encuentran metiladas. La capacidad inmunoestimulatoria de las secuencias CpG se pierde cuando la citosina es reemplazada por metilcitosinas, como se ha observado cuando las secuencias CpG bacterianas son metiladas (Krieg y Wagner, 2000). Las ISS forman parte de

un grupo conocido como patrones microbianos asociados a patogenicidad (PAMPs, por sus siglas en inglés "pathogen-associated molecular patterns") que son reconocidos por células del sistema inmune innato que poseen sobre su superficie los receptores conocidos como TLR-9 (por sus siglas en inglés "tolllike receptors") y cuya interacción con los PAMPs correspondientes induce su activación (Krug et al., 2001; Kadowaki et al., 2001).

METODOS DE INOCULACIÓN La respuesta a las vacunas de DNA ha sido determinada mediante diferentes rutas de inoculación, incluyendo intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal, epidérmica mediante escarificación de la piel, oral, intranasal y vaginal. De todas estas formas, las que han dado mejores resultados y más reproducibles son la inoculación intramuscular y en los diferentes estratos de la piel mediante agujas hipodérmicas, asi como el bombardeo de partículas mediante pistolas genéticas en piel y en mucosas. Otros métodos que se encuentran en desarrollo, aunque con resultados menos satisfactorios consisten en la inoculación de DNA encapsulado en microesferas (Jones et al., 1997) y bacterias atenuadas de los géneros Salmonella (Darji et al., 2000), Shigella (Sizemore et al., 1995) y Vibrio (Kenner et al., 1995). Estos últimos ofrecen la posibilidad de generar una respuesta inmune que proteja las mucosas del tracto respiratorio y digestivo, que son el principal sitio de entrada de patógenos.

En la selección del método a emplear hay que tomar en cuenta dos consideraciones importantes: la cantidad de DNA a inocular y las características de la respuesta inmune que se desea obtener. La administración de vacunas mediante agujas posee la ventaja de ser un método barato, aunque requiere de 100 a 1000 veces más DNA que el bombardeo de partículas para inducir una respuesta inmune. Las cantidades de DNA necesario van de 10 a 100 µg de DNA en inyecciones intramusculares en ratones y hasta 1 mg en primates no humanos para para inducir la aparición de anticuerpos y linfocitos citotóxicos; mientras que las dosis empleadas mediante bombardeo de partículas van de 0.1 a 10 µg en ratones y de 0.1 a 100 µg en primates para generar respuestas inmunes de similar magnitud (Robinson y Torres, 1997). En un estudio en el que se compararon diferentes métodos de inmunización se determinó que la dosis de DNA necesaria para proteger animales de la infección por el virus de la influenza era de 100 µg en inyecciones intramusculares, y tan sólo 0.4 µg del mismo DNA cuando la inoculación se realizó por bombardeo de partículas (Fynan et al., 1993). Por ello, ésta última metodología es la más eficiente desde el punto de vista de la cantidad de DNA utilizada. Por otro lado y a diferencia de las vacunas utilizadas de manera convencional en las que el tipo de respuesta por linfocitos T cooperadores (Th por sus siglas en inglés "T helper") es constante y se altera ligeramente por el uso de adyuvantes, una misma vacuna de DNA puede generar respuestas cooperadoras de tipo Th1 o Th2 al alterar el método y la ruta de inoculación (Feltquate et al., 1997). El bombardeo de partículas con pistola de genes tiende

a inducir una respuesta T cooperadora de tipo Th2 caracterizada por la producción de las interleucinas (IL) IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10; inmunoglobulinas de la clase IgE y subclases IgG1 que no se unen al complemento y que en conjunto combaten infecciones parasitarias y en mucosas. Por su parte, las inyecciones intramusculares desvían la respuesta cooperadora hacia Th1 en la que se activan células mediadoras de la respuesta inmune celular, se generan anticuerpos que pueden unirse al complemento como IgG2a e IgG2b, y citocinas como IL-2 e interferón gamma (IFN-γ), lo cual en conjunto permite el control infecciones bacterianas intracelulares y virales. Las bases de éste fenómeno no se han elucidado por completo, pero hay dos factores que podrían tener una participación importante: la inyección intramuscular deposita el DNA de manera extracelular teniendo asi la posibilidad de que las secuencias CpG interactúen con los correspondientes TLR generando la producción de IL-12 e IFN-γ; Por su parte, el bombardeo de partículas deposita el DNA directamente en el citosol de las células de la epidermis y dermis, evitando la interacción de éste con los receptores membranales, la generación de IFN-γ y con ello la producción de las citocinas características de la respuesta Th1. El segundo factor podría ser el tipo y la localización de células presentadoras de antígeno transfectadas tras la inoculación. Se ha observado que tras la inyección intramuscular la presentación de antígeno se lleva a cabo en el bazo principalmente, mientras que en el bombardeo por partículas se produce en los ganglios linfáticos (Robinson & Torres, 1997). Un factor importante a considerar es que una vez que se genera un tipo de respuesta por la inoculación inicial, ésta ya no se altera por las

subsecuentes inyecciones independientemente del tipo de DNA, sitio o método empleado.

MECANISMOS DE LA RESPUESTA INMUNE POR VACUNAS DE DNA Un aspecto que aún no se comprende del todo consiste en la interacción de la vacuna de DNA con el sistema inmune. Las cantidades del antígeno que se producen cuando se administra el vector están en el orden de los picogramos o nanogramos. Estos niveles relativamente pequeños de antígeno hacen pensar que la respuesta inmune tan fuerte y sostenida se debe a las propiedades adyuvantes que posee el DNA y al tipo de células presentadoras de antígeno transfectadas. Hay tres mecanismos principales por el que el antígeno es procesado y presentado al sistema inmune tras la vacunación con DNA Transfección de células presentadoras de antígeno (APC por sus siglas en inglés "antigen-presenting cells"). Se sabe que éste tipo de células se encuentran presentes en pequeñas cantidades en músculo y que constituyen un potente estímulo para el sistema inmune. Adicionalmente, se conoce que pueden ser transfectadas in vivo por DNA para generar una fuerte respuesta por linfocitos T citotóxicos (Condon et al., 1996). Tan sólo se requieren 100 APCs para activar al sistema inmune, y ésta cantidad no es difícil de transfectar si consideramos que 8% de las células en la epidermis corresponden a células dendríticas. Mediante el bombardeo por partículas se administran alrededor de 108 particulas de oro, y de éstos 100 millones de "proyectiles" se requiere que

solamente 100 alcancen su objetivo (Robinson y Torres, 1997). Para responder a las hipótesis que señalan a las APC y a células musculares o queratinocitos como responsables de la presentación del antígeno posterior a la vacunación, se han realizado experimentos elegantes en modelos de ratón quiméricos en los que ha quedado claro que la presentación del antígeno se lleva a cabo principalmente por células provenientes de la médula ósea, es decir, células presentadoras de antígeno (Doe et al., 1996). Activación de la respuesta inmune por transfección de células carentes de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II. La mayor parte de las células transfectadas tras la inyección de DNA consisten en células musculares y queratinocitos. Ambos participan de manera importante en la inducción de la respuesta inmune a la proteína transgénica, aunque es difícil pensar que lo hacen mediante la presentación de antígeno de manera directa a linfocitos, ya que carecen del MHC de clase II así como de moléculas coestimulatorias del tipo de CD80 y CD86 necesarias para activar el sistema inmune. El papel que éstas células desempeñan lo hacen a través de la síntesis y secreción de proteínas que aumenta la magnitud de la respuesta inmune (Klinman et al., 1998). Activación cruzada o "cross-priming". Es generalmente aceptado que los péptidos adquiridos de manera exógena por las APCs son presentados por medio del MHC clase II. Aunque se considera que éste tipo de proteínas son excluidas del MHC clase I, existe evidencia de que éste fenómeno puede ocurrir in vivo (Harding y Song, 1994). Durante la activación cruzada, las APCs

introducen péptidos o proteínas sintetizados por otras células, y los presentan a linfocitos a través del MHC clases I y II. Esto permite que las células somáticas actúen como reservorios de antígeno, contribuyendo a aumentar la respuesta inmune hacia la proteína transgénica. Los mecanismos antes mencionados ayudan a explicar las características de la respuesta inmune generada por las vacunas de DNA. La activación del sistema inmune por la inyección de un vector plasmídico es un proceso lento, en el que se detectan anticuerpos a las dos semanas de vacunación y se alcanza un máximo en la respuesta alrededor de la semana 10 (Xiang et al., 1995). Por su parte, la vacunación con proteínas o virus recombinantes genera una respuesta detectable durante la primera semana. Estas diferencias podrían deberse a la pequeña cantidad de antígeno que se produce por la vacunación con DNA. Su expresión, sin embargo se sostiene durante un largo período de tiempo lo cual podría permitir que otras APCs que lleguen a la zona de inoculación adquieran la proteína. Esto generaría un proceso de activación "en olas" y de manera contínua, lo cual permitiría que la respuesta inmune se mantenga por un largo período de tiempo, dando lugar a la generación de memoria inmunológica durante años característica de las vacunas basadas en microorganismos atenuados y en DNA.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS VACUNAS DE DNA Entre las diferentes propuestas para clasificar a las vacunas que se utilizan en la actualidad, una de ellas toma en cuenta si el microorganismo se encuentra

atenuado y por lo tanto vivo, o si éste se encuentra inactivado o muerto (Estrada-Parra, 1996; Ertl y Xiang, 1996). Las primeras constituyen las vacunas tradicionales elaboradas con microorganismos atenuados seleccionados por mantener su inmunogenicidad aunque desprovistos de su patogenicidad, en este grupo se incluyen las vacunas hechas a partir de microorganismos recombinantes que son virus o bacterias que expresan antígenos heterólogos provenientes de otros microorganismos. Pocas vacunas recombinantes han sido aprobadas para uso veterinario y ninguna de ellas se emplea en humanos todavía. Por su parte, las vacunas inactivadas consisten en microorganismos muertos o proteínas aisladas nativas o recombinantes las cuales se conocen como vacunas de subunidades. Las principales características, asi como las ventajas y desventajas se resumen en la tabla 1.

TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS VACUNAS EMPLEADAS EN LA ACTUALIDAD Y SU COMPARACIÓN CON LAS VACUNAS DE DNA Vacunas de DNA

Vacunas con microorganismos atenuados (vivos)

Vacunas recombinantes con microorganismos vivos Si

Vacunas con microorganismos inactivados (muertos) o de subunidades No

Potencialmente

Respuesta anti-vector (permitiendo una utilización repetida) Competencia entre vector y antígeno Seguridad al utilizar en pacientes inmunocomprometidos Riesgo de reversión del microorganismo a su forma virulenta Riesgo de contaminación por otros agentes Facilidad en la preparación Termoestabilidad

No aplicable

Si (excepto en vacunas de subunidades) No aplicable

Costo de producción

Bajo

Alto

Presentación de antígeno a través del MHC clase I Presentación de antígeno a través del MHC clase II Inclusión de todo el espectro de antígenos

La naturaleza de las vacunas, ya sea con microorganismos vivos o inactivados, es un factor importante en la respuesta inmune que se pretende inducir. Los microorganismos atenuados tienen la capacidad de replicarse de manera limitada en el organismo, por lo que se requieren dosis menores para inducir un estado de inmunidad que puede durar toda la vida. Las vacunas inactivadas requieren de un mayor número de inoculaciones para lograr un grado comparable de protección (Estrada-Parra, 1996). Por su parte, las vacunas de DNA inducen una respuesta duradera con una inoculación. Cualitativamente, el

tipo de respuesta inmune que se induce varía con los diferentes tipos de vacunas. Los antígenos de las vacunas de subunidades no son presentados a través del MHC tipo I y por lo tanto no inducen respuestas por linfocitos citotóxicos necesarias para combatir microorganismos intracelulares. Este tipo de respuestas son características de las vacunas vivas y de DNA, siendo éstas últimas uno de los estímulos más potentes para la generación de linfocitos citotóxicos. Otro de los puntos importantes que es importante mencionar de la tabla 1 es la seguridad de las vacunas. Las vacunas inactivadas, de subunidades y las de DNA se consideran seguras, debido a que no involucran la inoculación de microorganismos vivos que pudieran ser peligroso en mujeres embarazadas e individuos inmunocomprometidos o incluso en individuos sanos debido a la posibilidad de reversión a la forma virulenta del microorganismo (Rabinovich et al., 1994). Para entender mejor el papel que los diferentes tipos de vacunas existentes pueden jugar, algunas de las características deseables en toda vacuna se mencionan a continuación: Seguridad. Las vacunas no deben producir efectos secundarios o causar enfermedad alguna. Las vacunas basadas en virus atenuados pueden revertir a su forma virulenta, llevando de manera inherente un riesgo potencial en su utilización. Aunque la posibilidad de que esto suceda es muy baja en la actualidad, el riesgo potencial no desaparece. El mejor ejemplo de vacuna viral preparada con microorganismos atenuados es la vacuna oral anti-poliomielítica tipo Sabin, la cual se considera segura y es utilizada a nivel mundial. Sin

embargo, se han reportado algunos casos de poliomielitis por la reversión a la forma virulenta de los virus atenuados tipo dos y tres que son constituyentes de esta vacuna. Por su parte, las vacunas de DNA carecen de este riesgo, y tal vez la principal preocupación en términos de seguridad sea la posibilidad de integración del DNA al genoma del individuo, provocando la activación de protooncogenes o inactivación de genes supresores de tumores. Hasta la fecha, se ha observado que el DNA permanece en forma episomal, descartando la posibilidad de integración genómica (Nichols et al., 1995). Métodos de inoculación. Esta característica va estrechamente ligada a la seguridad de la vacuna. El método de aplicación de ésta no debe de presentar riesgo alguno a los individuos que la reciben o que la aplican. La utilización de jeringas y agujas constituye un riesgo sobre todo por la generación de desechos en lugares con poco control sobre ellos permitiendo su reutilización. Por lo anterior, las vacunas de administración oral resultan ideales en cuanto a seguridad. La inmunización con DNA ha sido realizada con éxito mediante este tipo de administración, asi como mediante pistolas genéticas, las cuales se consideran también seguras. Memoria inmunológica. Una de las características más deseadas en cualquier vacuna es la generación de una respuesta inmune duradera. Las vacunas basadas en microorganismos atenuados son bastante efectivas en este aspecto, ya que con menos aplicaciones se puede lograr una respuesta que dure años. Las

vacunas

con

microorganismos

inactivados

requieren

varias

inmunizaciones para producir el mismo efecto. Por su parte, las vacunas de DNA

generan respuestas capaces de durar toda la vida cuando se han probado en ratones. Esta característica se ha observado en la respuesta humoral basada en anticuerpos, en la generación de linfocitos T cooperadores y de células T citotóxicas, para las cuales las vacunas de DNA se consideran el más potente estímulo. Costos.

elaboración

vacunas

tradicionales

requieren

una

infraestructura costosa, por lo que las formas alternativas que puedan reducir este precio son siempre deseables. Las técnicas empleadas para clonación de genes en nuevos vectores para vacunación con DNA son bastante simples, rápidas y no requieren del mismo tipo de instalaciones necesarias para producir virus recombinantes. Las vacunas con microorganismos atenuados son menos estables que las que se preparan con microorganismos inactivados, por lo que requieren cuidados especiales como el mantenimiento a temperaturas bajas durante todo el proceso que culmina en la administración al individuo. Por su parte, las vacunas de DNA son estables a temperatura ambiente lo cual contribuye a la disminución significativa de los costos de producción.

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Las vacunas de DNA han sido probadas en diferentes patologías las cuales incluyen enfermedades para las cuales se han venido utilizando las vacunas tradicionales, es decir infecciones virales y bacterianas. Otras patologías que ya se incluyen dentro del repertorio de la vacunación con DNA incluyen las parasitarias, micosis y enfermedades por priones. La capacidad que las vacunas

de DNA tienen para inducir respuestas celulares ha hecho que su aplicación sea principalmente hacia infecciones virales y por bacterias intracelulares. Sin embargo, ésta nueva generación de vacunas ha abierto nuevos campos para la prevención y tratamiento de enfermedades en las que la vacunación no formaba parte del repertorio empleado para el tratamiento como cáncer, enfermedades autoinmunes y alérgicas (Kowalczyk y Ertl, 1999). Hasta la fecha, se han utilizado inmumerables modelos animales como ratones, conejos, cobayos, gallinas, gatos, primates no humanos, etc. mostrando diferentes grados de eficiencia en ellos. Como se ha mencionado con anterioridad el primer reporte de la generación de anticuerpos mediante vacunación con DNA ocurrió en 1992 (Tang et al., 1992) y apenas cinco años después comenzaron a aplicarse en humanos. Este constituye un intervalo de tiempo muy corto entre un descubrimiento científico y su aplicación directa en seres humanos. Las infecciones contra las que se han utilizado vacunas de DNA en ensayos clínicos en humanos inluyen al Virus de la Inmunodeficiencia Humana (MacGregor et al., 1998) y malaria (Wang et al., 1998), entre otros. Los resultados que se han obtenido en modelos animales son prometedores, sin embargo, los resultados en humanos han sido desalentadores. A pesar de que las vacunas de DNA han sido bien toleradas la inmunidad obtenida ha sido mínima cuando se emplean de manera aislada. Por otro lado, estudios recientes demuestran en primates no humanos que las vacunas de DNA contribuyen en gran medida a la generación de una respuesta protectora cuando se utilizan en combinación con virus recombinantes. Esta estrategia se basa en la vacunación inicial con DNA y la

posterior administración de virus recombinantes con lo cual se evita la infección ante un reto (Robinson et al., 1999; Rasmussen et al., 2002). En esta estrategia ambos métodos se ven favorecidos ya que la respuesta inmune es mayor que la administración aislada de los diferentes vectores. Esta metodología ha sido ampliamente utilizada en vacunas contra el VIH lo cual representa una gran esperanza en la busqueda de vacunas contra este virus.

Para obtener mayor información sobre el tema, los autores recomiendan consultar la siguiente dirección en internet: http://www.dnavaccine.com

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