Nr. 1/2018 – 19. Jahrgang
Zellanalyse/ Screening
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Zukunftsmarkt Zellanalytik Martin Laqua, Redaktion LABORWELT Zellen sind eigenständige biologische Funktionseinheiten. Ein besseres Verständnis dieser bringt auch die angewandte Forschung und ultimativ die Biotechnologie-Industrie nach vorn. Im vorliegenden LABORWELT-Spezial werden einige aktuelle Innovationen rund um die Analyse von Zellen vorgestellt. Ob in vivo oder in vitro, ob ein oder viele Parameter, ob seltene Tumorzelle oder gewöhnlicher Erythrozyt – jede Zellanalyse hat ihre eigenen Anforderungen. Große Anbieter beobachten den Markt und sichern sich neue Technologien, wenn sie eine Lücke in ihrem eigenen Portfolio ausmachen. Zuletzt war die US-Firma Agilent am Drücker, als sie Anfang des Jahres die irische Firma Luxcel kaufte. Deren Produkte sind Kits für In-vitro-Assays zur Bestimmung des Zellmetabolismus mit Hilfe von Echtzeitfluoreszenzplattenlesern, darunter Assays zum Sauerstoffverbrauch von Zellen oder einzelnen Mitochondrien sowie zur Aktivität des Kohlenhydratabbauweges Glykolyse.
Wachstumsmarkt Zellanalyse
Abb.: Zeiss Microscopy/flickr.com (CC BY-NC-ND 2.0)
Neben Agilent sind es Firmen wie Danaher, Thermo Fisher oder Merck/Sigma Aldrich, die Hochdurchsatztechnologien für Wirkstoffentdecker anbieten. Der Markt wächst ungebremst. Die Marktprognosen des Analysehauses Research & Markets liegen bei 8% Umsatzwachstum pro Jahr bis 2022. Dem Report „High Throughput Screening Market – Global Opportunity Analysis And Industry Forecasts“ zufolge wird es 2022 ein Markt von 22 Mrd. US-Dollar sein. 2016 lag dieser Wert noch bei 12,2 Mrd. US-Dollar.
Auch die Zellkultivierung ist ohne Zweifel ein Zukunftsmarkt. Zelltherapien, regenerative Medizin oder Produktion in Bioreaktoren – für jede Anwendung gibt es mittlerweile die optimale Technologie. Welches Einsatzsspektrum Hohlfaser-Bioreaktoren haben, erläutern die Spezialisten von Cellab auf Seite IV.
Hilfe für Zellatlas-Projekt Beim Menschen entstehen aus einer befruchteten Eizelle geschätzt 37 Billionen Zellen. Mit dem Aufkommen neuer Sequenzierungsmethoden wurde schnell klar, dass diese in weit mehr als die histologisch bestimmten 300 Zelltyp-Klassen fallen. Seit 2016 nimmt sich ein Forscherkonsortium der Aufgabe an, all diese Zellen zu kartieren. Das Human Cell Atlas Consortium muss dabei mit enormen Datenmengen aus zum Beispiel Einzellzell-Sequenzierungen jonglieren. Wie ein in München konzipiertes Softwarepaket bei der Datenanlyse helfen kann, erklärt Alexander Wolf vom Helmholtz-Zentrum München auf Seite V. Eine für die Biowissenschaften relative neue spektroskopische Analysemethode stellt Christian Matthäus auf Seite IX vor. Der Wissenschaftler ist Experte für die RamanSpektroskopie.
Drei Zelltypen: Rote Blutkörperchen, T-Zellen (orange) und Blutplättchen (grün)
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Zellanalyse/Screening Zellkultivierung
Tanja Seiler, Dr. Stephan Rudolph, Cellab GmbH, Radeberg Die Hohlfasertechnologie findet zunehmend Verwendung in Bioreaktoren in der Zellkultur. Während Hohlfaser-Bioreaktoren früher hauptsächlich zur Proteinproduktion eingesetzt wurden, werden sie heute auch häufig für Zellexpansion und -differenzierung genutzt.
Cellab® Bioreactor-System in einem CO2 -Inkubator: In Deutschland wird das System über die Meintrup DWS Laborgeräte GmbH vertrieben. Hohlfaser-Bioreaktoren bestehen aus einem Kunststoffgehäuse, in welchem Hunderte von Hohlfasern eingefasst sind. Das System besteht aus zwei Kammern, dem Innenraum der Hohlfasern und dem Raum, der die Hohlfasern umgibt. In der einen Kammer werden die Zellen angezogen, auf der anderen Seite befindet sich das Nährmedium. Die Faserwand bildet dabei eine semi-permeable Membranbarriere zwischen beiden Kammern. Die Membran ermöglicht einen ständigen Stoffaustausch, so dass Sauerstoff und Nährstoffe von der Mediumseite auf die Zellseite diffundieren, während Stoffwechsel-Abbauprodukte in entgegengesetzter Richtung vom Zellkompartiment ins Medium übertreten können und im Mediumfluss abtransportiert werden. Zugleich verbleiben gewünschte Zellprodukte wie zum Beispiel rekombinante Proteine oder Antikörper im Zellkompartiment und reichern sich dort bis zur Ernte in hoher Konzentration an. Dadurch können sich die nachfolgenden Downstream-Prozesse wie die Proteinaufreinigung deutlich beschleunigen.
Der Bioreaktor bietet aufgrund der Hohlfasergeometrie ein äußerst vorteilhaftes Oberflächezu-Volumen-Verhältnis (OVV). Daraus ergibt sich eine große Kultivierungsfläche, die mit einer sehr geringen Menge an Medium versorgt werden kann. Das OVV sowie das dichte, mehrlagige Zellwachstum und die niedrigen Scherkräfte erlauben eine Zellkultivierung, die den physiologischen Gegebenheiten sehr nahe kommt. Daraus ergeben sich in allen Anwendungsgebieten Vorteile. So können beispielsweise mesenchymale Stammzellen (MSC) in Hohlfaser-Bioreaktoren über einen längeren Zeitraum kultiviert und vermehrt werden und behalten dabei ihre Multipotenz. Gerade auf dem noch jungen Gebiet der MSC-extrahierten Exosomen für die therapeutische Anwendung und für regenerative Therapien auf Basis großer Mengen von Stammzellen bieten Hohlfaser-Bioreaktoren eine erfolgversprechende Alternative. Auch die Proteinproduktion profitiert von den HohlfaserBioreaktor-eigenen Charakteristika, indem sie nicht nur effektiver und effizienter abläuft, son-
dern die sezernierten Proteine häufig auch über typische Modifikationen und Multimerisierung entsprechend dem physiologischen Vorbild verfügen. Das erlaubt die Ernte großer Mengen rekombinanter Proteine, die den körpereigenen Proteinen sehr ähnlich sind.
Geschlossenes, vorsterilisiertes System Hohlfaser-Bioreaktorsystemen haftet das Vorurteil an, komplex in der Bedienung zu sein. Moderne teil- beziehungsweise vollautomatisierte Systeme wie das Cellab® Bioreactor-System unterstützen jedoch effizient den Anwender, in kurzer Zeit reproduzierbare und skalierbare Ergebnisse zu erreichen. Ein wiederverwendbares elektronisches Kontrollsystem steuert das Einwegset automatisch. Auf diesem Einwegset sind je nach Konfiguration der Bioreaktor, ein Gastransfermodul zur Anreicherung des Mediums mit dem im Inkubator vorherrschenden Luftgemisch und der Mediumbeutel über Schläuche zu einem geschlossenen System verbunden. Das Einwegsystem wird bereits vorsterilisiert geliefert, so dass es mit wenigen Handgriffen einsatzbereit ist. Jeder einzelne Schritt des Kultivierungsprozesses wird von der mitgelieferten Software überwacht und zur späteren Auswertung notiert.
Zelltherapie – schon frühzeitig an die Kultivierungsmethode denken Ein validierter, reproduzierbarer Prozess in einem geschlossenen, vorsterilisierten System ist ein bedeutender Faktor vor der Initiierung klinischer Versuche[1]. In den frühen klinischen Phasen kommen heute noch immer StandardZellkulturmethoden mit offenen Systemen wie T-Flaschen und Roller-Flaschen zum Einsatz, die schnell aufgrund der benötigten hohen Zellzahlen und regulatorischen Anforderungen wie GMP-Konformität an ihre Grenzen stoßen[2]. Zudem ist die Flexibilität limitiert, Prozessmethoden zwischen den einzelnen klinischen Phasen zu wechseln. Daher ist es wichtig, sich schon frühzeitig Gedanken über eine geschlossene, reproduzierbare und skalierbare Zellkulturmethode zu machen. Der Einsatz eines modernen Hohlfaser-Bioreaktorsystems ist als alternative Prozessmethode in Betracht zu ziehen.
Literatur [1]
[2]
Clarke D., 2012, Implementing Custom Single-Use Solutions for Cell Therapy Production Bioprocess International 10(5)s Szczypka M. et al., 2014, Single-Use Bioreactors and Microcarriers Scalable Technology for Cell-Based Therapies, Bioprocess International 12(3)
Abb.: Cellab GmbH
Bewährt und immer beliebter: HohlfaserBioreaktorsysteme
IV | 19. Jahrgang | Nr. 1/2018
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Transfektion Viromere für effiziente Transfektion
Big Data? – Kein Problem! Dr. Alexander Wolf, Helmholtz Zentrum München, Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH), Neuherberg Während sich die NGS-Technologie und der NGS-Markt rasant entwickeln, hat sich die Analyse und Interpretation von NGS-Daten als einer der komplexesten Aspekte herausgeschält. Ein Knackpunkt hierbei ist die tertiäre Analyse, die „Interpretation“ der Information. Mit Scanpy haben Alexander Wolf, Philipp Angerer und Fabian Theis vom Helmholtz-Zentrum München kürzlich ein Programm vorgestellt (doi: 10.1186/s13059-017-1382-0), das die tertiäre Analyse so schnell wie kein anderes durchführen kann. Die Chancen stehen gut, dass Scanpy als Auswertesoftware beim Human Cell Atlas-Projekt zum Einsatz kommt.
Dr. Dr. Alexander Wolf
ist Teamleiter für Maschinelles Lernen am Institute of Computational Biology des HelmholtzZentrums München LABORWELT Was ist Scanpy und vor allem, was kann Scanpy?
Abb.: Helmholtz-Zentrum München
Wolf Scanpy ist die erste Software, die eine umfängliche Analyse sehr großer Genexpressionsdatensätze mit einem breiten Spektrum aus Methoden des maschinellen Lernens und Statistik erlaubt. Mit Scanpy decken wir den Bereich der tertiären Sequenzdaten-Analyse ab. Die primäre Analyse ist die eigentliche Sequenzierung, also die Bestimmung der Basenfolge der vielen kurzen Erbgut-Moleküle. Die sekundäre Analyse ist das „Read Mapping“ – also die rechenintensive Zuordnung der einzelnen Fragmente zu einem Referenzgenom. Die tertiäre Analyse meint die algorithmische „Interpretation“ der Genexpressionsmatrizen, also insbesondere die Identifikation von Zelltypen, Zellsubgruppen,
biologischen Prozesse und relevanten Genen. Mit welcher experimentellen Technologie die Primärdaten gewonnen wurden, ist dafür übrigens unerheblich – genauso, welche Art von Probe untersucht wurde. Es ist aber so, dass es im Bereich Einzellzellanalyse einige algorithmische Lösungen gibt, die sich als besonders relevant herausgestellt haben, um Aussagen zu DosisWirkung-Beziehungen, zu Entwicklungsprozessen oder zu Krankheitsverlaufprozessen treffen zu können. Hier spielt Scanpy seine Stärken aus. Wenn man Daten mit Einzelzellauflösung vorliegen hat, kann man wunderbar undifferenzierte und differenzierte Zellen oder gesunde und Krebszellen miteinander vergleichen. Wenn man alle Zellen des Human Cell Atlas kartografieren möchte, braucht man Programme wie Scanpy. Im Gegensatz zu bestehenden quelloffenen Programmen, ist Scanpy überhaupt erst in der Lage, die anfallenden Datenmengen zu verarbeiten. Nur die kommerzielle Lösung der US-Firma 10x Genomics bietet eine, allerdings um ein Vielfaches langsamere, Alternative. Wir wurden deshalb in den kommenden Wochen für eine Vorstellung beim Human Cell Atlas eingeladen. Übrigens beschreiten wir auch technologisch neue Wege: Während entsprechende Biostatistik-Software traditionell in der Programmiersprache R geschrieben wurde, basiert Scanpy auf der Sprache Python, die die Machine Learning Community dominiert.
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Inhibitor-freie DNA für zuverlässige PCR-Analysen BioEchos Ein-Schritt-Technologie zur Reinigung von DNA aus biologischen Proben ist signifikant einfacher im Handling und schneller als bisherige Methoden. PCRAnwendungen werden robuster und Ausfallrisiken eliminiert. Das EchoLUTION Spin-Säulen-Verfahren funktioniert unter physiologischen Bedingungen, ohne denaturierende Salze und Ethanol – also Reagenzien, die in herkömmlichen Silica-basierten Bind–Wash–Elute-Verfahren Anwendung finden, bis in die DNA-Fraktion verschleppt werden können und zur Inhibition enzymatischer Schritte wie der PCR bis hin zum vollständigen Ergebnis-Ausfall führen.
Schnelle Lyse biologischer Proben Die Echolution-Technologie startet mit der Lyse der Zellen beziehungsweise des Gewebes unter nativen, wässrigen Bedingungen. Die für den jeweiligen Probentyp bestgeeigneten lytischen Aktivitäten (TurboLyseTM) wie Proteasen oder
Lipasen werden so gewählt, dass eine vollständige Freisetzung der DNA in kürzester Zeit gewährleistet ist. Im Gegensatz zu EchoLUTION findet bei bisherigen Methoden eine Bindung an eine Silica-Matrix in einem denaturierenden Milieu bei 7 M Guanidinium-Hydrochlorid statt. Unter diesen Bedingungen sind diese Methoden auf nur ein kommerziell verfügbares Enzym und damit auf ein enges Substratspektrum angewiesen: die Proteinase K. Das optimierte Substratspektrum der TurboLyse-Enzyme im neutralen Milieu hingegen führt zu einer schnelleren Lyse bei gleichzeitiger effizienter Unterdrückung nukleolytischer Aktivitäten. So ist die Lyse bei den meisten Gewebetypen (Epithel-, Binde-, Nerven- und andere fettreiche Gewebe) nach 15 Minuten abgeschlossen und bei filamentösen Proben nach spätestens 30 Minuten.
Zur Trennung der Nukleinsäure von zellulären Bestandteilen sowie von Prozess-Komponenten (Enzyme, Salze, Detergenzien) wird das Lysat auf die BioEcho-Spinsäule geladen und mit nur einem Zentrifugations-Schritt prozessiert. Die proprietäre Matrix wird je nach Probentyp so eingestellt, dass alle Proben- und Prozesskomponenten – und damit mögliche Inhibitoren späterer enzymatischer Analysen – vollständig zurückgehalten werden. Die DNA passiert ungehindert die chromatographische Trennstrecke und befindet sich nach der Zentrifugation hochrein, entsalzt und gepuffert im Auffanggefäß. DNA bleibt ohne jede Adsorption über den gesamten Prozess in Lösung und erfährt nur minimale Scherkräfte. Das patentierte EchoLUTION-Verfahren stellt sicher, dass DNA mit hoher mittlerer Kettenlänge erhalten wird. Durch die maximale Reinheit werden Nachweisreaktionen wie die qPCR deutlich sensitiver und zuverlässiger als zuvor. Die Abbildung zeigt ein typisches qPCR-Ergebnis: die EchoLUTION-DNA wird mit einer um 1 bis 5 reduzierten Zyklenzahl (Ct) detektiert. Dies stellt eine signifikante Verbesserung der Sensitivität gegenüber dem aktuellen Stand der Technik dar. Die Entwickler von BioEcho sind sich sicher, dass die EchoLUTION-Extraktion eine Bereicherung des molekularbiologischen Methodenspektrums darstellt. Zudem ist das Verfahren nachhaltig: 70% weniger biomedizinischer Plastikmüll, kein organischer Abfall, deutlich reduziertes Verpackungsvolumen.
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Abb.: BioEcho
Kontakt Verbesserte Sensitivität bei Echtzeit-PCR. Genomische DNA aus je 5 mg Mausschwanzgewebe wurde mittels Echolution Tissue DNA Micro-Kit (BE) und einem gängigen Silica-Kit (Q) gereinigt und in den angegebenen Verdünnungen in qPCRReaktionen (HOX D9 Amplikon) eingesetzt. Die Tabelle zeigt die zugehörigen CtWerte sowie die Differenz bei den jeweiligen Verdünnungen.
VI | 19. Jahrgang | Nr. 1/2018
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Neue Optionen dank Hightech-Polymeren Dr. Monika Burbach, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf; Bettina Weber, Lipocalyx GmbH, Halle (Saale) Eine neue Generation von Reagenzien erhöht die Transfektionseffizienz bei einer Vielzahl von Zelltypen. Daten für mehr als 160 verschiedene Zelltypen sind bereits verfügbar. Die Transfektion beschreibt eine Reihe unterschiedlichster Methoden, mit denen man fremde Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen einbringen kann. Die Lipocalyx GmbH, ein in Deutschland ansässiger Spezialist auf dem Gebiet des Nukleinsäure-Delivery, hat eine neue Generation synthetischer Transfektionsreagenzien entwickelt, die auf Hightech-Polymeren basieren. Der Transfektionsmechanismus imitiert die Aufnahme des Influenzavirus und damit einhergehend auch das aktive Ausschleusen der Transfektionspartikel aus den Endosomen. So wird die Transfektionseffizienz bei Nutzung des sogenannten Viromer® bei einer Vielzahl schwer transfizierbarer primärer Zellen wie beispielsweise Makrophagen oder Kardiomyozyten, aber auch Zelllinien wie RAW 264.7 Makrophagen oder C2C12 Myoblasten deutlich erhöht. Da sich alle Zelltypen auf ihre Weise unterschiedlich verhalten, kann eine geplante Transfektion auch schnell zu einer Herausforderung werden. In den meisten Fällen ist das optimierte Protokoll für einen bestimmten Zelltyp nicht zwangsläufig ohne Adaption übertragbar. Um überhaupt Partikel aus der Umgebung aufnehmen zu können, ist zunächst einmal für alle zu transfizierenden Zellen das Vorhandensein von ungerichteter Endozytose die Grundvoraussetzung. Die Optimierung der In-vitro-Transfektion erfolgt dann in vier Schritten:
Celltron – Ihr Einstieg in die geschüttelte Zellkultur. Die Celltron ist ein speziell für den Einsatz in CO2-Brutschränken entwickelter Kleinschüttler, der mit minimalem Energieverbrauch und antimikrobieller Beschichtung für einen idealen Start der Zellkultur sorgt.
l Fokus auf das Wachstum der betreffenden Zellen: Optimale Voraussetzungen ergeben sich bei einer Zellkonfluenz von 60–80% am Tag der Transfektion. l Variation der Menge an Transfektionskomplexen, die auf die Zellen gegeben werden: Das Verhältnis von Viromer zu Target (DNA oder RNA) bleibt hierbei immer konstant. l Variation des Verhältnisses von Viromer zu Target: Das ermöglicht bei beispielsweise größeren Plasmiden (>8kb) eine bessere „Verpackung“ durch mehr Transfektionsreagenz. l Variation der Inkubationszeit: Ausschlaggebend hierfür ist vor allem der Turnover des betreffenden Proteins – sowohl bei Expressionsals auch bei Knock-down-Studien – der den optimalen Zeitpunkt der Analyse bestimmt. Der Standardwert beträgt zwischen 24–72h (abhängig von der Readout-Methode). Bei Einsatz eines neuen Zelltyps oder Targets ändern sich die Transfektionskonditionen zwangsläufig, so dass es immer empfehlenswert ist, eine neue Optimierungsrunde durchzuführen. Weitere Informationen zur Transfektion von mehr als 160 verschiedenen Zelltypen sind auf www.viromer-transfection.com zu finden.
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Service Verbände
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LABORWELT-Partner Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)
Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V.
www.dgkl.de
Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung www.dgpf.org BIO Deutschland www.biodeutschland.org Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM)
www.dghm.org
bts (Biotechnologische Studenteninitiative e.V.) www.bts-ev.de Gesellschaft für Genetik
Wissensvorsprung mit Qualitätssiegel Im Oktober 2017 startete die Diagnostik Akademie ihr auf den Bedarf der In-vitroDiagnostik (IVD) zugeschnittenes Seminarprogramm. Den Auftakt bildete ein Workshop zur im Mai 2017 in Kraft getretenen EUVerordnung über IVD. Daran nahmen mehr als 40 Vertreter aus dem Bereich Qualitätsmanagement teil, um sich über den neuen Rechtsrahmen zu informieren und mit Experten Lösungsansätze zu diskutieren. Die Teilnehmer nutzten zudem ausgiebig die Chance, sich über Unternehmensgrenzen hinweg zu vernetzen und auszutauschen. Aufgrund der künftig geltenden höheren Anforderungen rücken für Diagnostik-Hersteller – intensiver als bisher – Themen wie Leistungsbewertung und klinische Studien, Qualitätsmanagement und Software oder Risikomanagement in den
Vordergrund. Aber auch Aspekte hinsichtlich der Qualitätsanforderungen an IVD außerhalb der EU spielen eine wichtige Rolle. Daher bietet die Diagnostik Akademie 2018 vor allem auch zu diesen Themen Seminare an. Die geplanten Veranstaltungen im Einzelnen: l 14. März | Internationales Qualitätsmanagement l 17. April | Leistungsbewertung & Klinische Studien l 17. Mai | Qualitätsmanagement & Software l 7. Juni | Projektmanagement l 30. August | Risikomanagement l 22. November | Arbeitsrecht Kontakt: d.wimmer@diagnostiknet-bb.de
GENE
K TI
ELLSC S
R
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GE
www.gfgenetik.de Gesellschaft für Signaltransduktion www.sigtrans.de Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie
www.dgpt-online.de
Nationales Genomforschungsnetz www.ngfn.de Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik www.hih-tuebingen.de/dgng/
ÖRRG
Einladung zum Kamingespräch im Norden Die nächsten Kamingespräche der Österreichischen Reinraumgesellschaft (ÖRRG) finden im Norden Deutschlands statt. In Norderstedt erwartet die Teilnehmer am 17. und 18. April das neue Logistik- und Produktionswerk der Schweizer Condair-Gruppe, einem Spezialisten für Luftbefeuchtungsanlagen. Dort wurden moderne Technologien wie Geothermie, Hybridkühldecken, Photovoltaik und eine CO2-Einsparung implementiert. Ebenfalls interessant: Auf Hologrammen können alle Technologien für die
Luftbefeuchtung dargestellt werden. Das zweite Highlight der Reise ist der Besuch des Camfil Experience Center in Reinfeld, wo interaktiv und multimedial die Wichtigkeit der Luftqualität in Gebäuden erlebbar gemacht wird. Die Kosten für Flug und Übernachtung sind von den Teilnehmern selbst zu tragen, die restlichen Kosten (Verpflegung, Transport) werden von der ÖRRG, Condair und Camfil übernommen. Kontakt: michael.baumgartner@oerrg.at
DGHM
Highlights beim DGHM-Kongress
Netzwerk Nutrigenomik www.nutrigenomik.de DiagnostikNet-BB www.diagnostiknet-bb.de Verband der Diagnostica-Industrie e.V. www.vdgh.de Österreichische Reinraumgesellschaft (ÖRRG) Österreichische Ges. f. Laboratoriumsmedizin & Klinische Chemie
www.oerrg.at
www.oeglmkc.at
Der Jubiläumskongress der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) e. V. im Februar ist Geschichte. Zu den Highlights der 70. Jahrestagung gehörte die Vorstellung aktueller Entwicklungen im Bereich Mykotische Erkrankungen und Wirtssuszeptibilität. Kongresspräsident Prof. Dr. Jan Buer zeigte sich hier beeindruckt: „Der Arbeitsgruppe von Julian Nagli vom King’s College in London ist es in Zusammenarbeit mit deutschen Wissenschaftlern gelungen, bei Candida albicans, einem Kommensal der normalen menschlichen Flora, das aber auch lebensgefährliche Infektionen hervorrufen kann, wenn der Wirt ein geschwächtes Immunsystem hat, ein Gift nachzuweisen. Das Toxin, das Candidalysin, bildet an der Membran der Wirtszelle Löcher
und kann sie so zerstören. Am Beispiel von Schleimhautzellen des Mundes konnten die Wissenschaftler diesen Mechanismus nachweisen. Solche oralen Infektionen mit Candida albicans sind extrem häufig bei HIV-Patienten, aber auch bei sehr jungen und alten Menschen mit einem schwachen Immunsystem.“ Buer ist am Institut für Medizinische Mikrobiologie am Universitätsklinikum Essen tätig. Neben ihm gehörten noch Prof. Dr. Sören Gatermann, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum, und Prof. Dr. Frauke Mattner, Institut für Hygiene der Kliniken der Stadt Köln gGmbH, zum Kongresspräsidium. Kontakt: kerstin.aldenhoff@conventus.de
VIII | 19. Jahrgang | Nr. 1/2018
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Interview Zellanalyse/Screening
Raman-Fingerabdrücke auf dem Weg in die Klinik Mit Raman-Spektroskopie können Analysen von biologischen Proben mit hoher Auflösung und hoher Spezifität gemacht werden. Trotzdem ist die Technologie nur selten in Forschungslaboren anzutreffen. LABORWELT sprach mit dem Spektroskopie-Experten Christian Matthäus vom Leibniz-Institut für Photonische Technologien über die Vor- und Nachteile der Methode und über mögliche klinsiche Anwendungen.
Abb.: Christian Matthäus
LABORWELT Worin unterscheidet sich die RamanSpektroskopie von der Fluoreszenzspektroskopie? Matthäus Bei einer Anregung, die Fluoreszenz zur Folge hat, wird immer ein Elektron von einem Orbital in ein anderes transportiert. Verlässt das Elektron dieses Orbital, emittiert es Licht. Dessen Auswertung erlaubt qualitative und quantitative Aussagen über die untersuchte Substanz. Bei der Raman-Spektroskopie wird kein elektronischer Übergang angeregt, sondern ein Schwingungszustand. Ein Photon trifft auf ein Molekül und transferiert einen Teil seiner Energie in dieses Molekül. Dass ein Photon dies schafft, ist allerdings ein äußerst seltenes Ereignis. Von einer Million Photonen ist es nur ein einziges. Diese durch die Energieabgabe veränderten Photonen zählen wir. Das ist die Raman-Spektroskopie. LABORWELT Wo liegen die Vorteile bei der Analyse von biologischen Proben?
Matthäus Das Verfahren ist nicht zerstörend und funktioniert ohne zusätzliche Markierungen. Zudem tragen alle Bestandteile von Zellen und Geweben zu den Raman-Spektren bei. Dadurch können Informationen gewonnen werden, wie sie durch keine andere Spektroskopietechnonolgie ermittelt werden können. LABORWELT Aber es gibt Nachteile … Matthäus Gerade die Komplexität der sogenannten spektralen Fingerabdrücke macht die Auswertung aufwendig. Die Datensätze sind riesig und die Datenanalyse der Raman-Spektren ist ein langwieriger Prozess. Daher wird an vielen Methoden gearbeitet, die Komplexität zu verringern ohne dabei die Aussagekraft zu schmälern. Verfahren wie die Resonanz-Raman-Streuung und die oberflächenverstärkte Raman-Streuung verstärken die Signale und führen zu weniger komplexen Spektren. Ein anderer Weg ist, die Raman-Spektroskopie mit anderen Bildgebungstechnologien zu verknüp-
Dr. Christian Matthäus
arbeitet in der Abteilung Spektroskopie und Bildgebung des Leibniz-Institutes für Photonische Technologien e.V. in Jena (Leibniz-IPHT). Bereits seit seiner Doktorarbeit in den USA in den frühen 2000er Jahren beschäftigt sich Matthäus mit der Infrarot- und Raman-Spektroskopie von eukaryotischen Zellen und Geweben. Seit 2009 forscht er in der Arbeitsgruppe von Prof. Jürgen Popp am Leibniz-IPHT und an der Friedrich-Schiller-Universität Jena.
fen. Vielversprechend ist die Kombination mit einem für die Gewebedarstellung besonders geeignetem Lichtmikroskop, zum Beispiel einem Multiphotonenmikroskop. LABORWELT Welche Gewebe eignen sich besonders gut für eine Untersuchung?
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Zellanalyse/Screening Interview/Produktwelt
LABORWELT Gibt es schon eine klinische Anwendung der Raman-Spektroskopie? Matthäus Zirka 90% der medizinischen Anwendungen sind bisher Machbarkeitsstudien. Aber für die Zukunft sehe ich hier großes Potential. Wir selbst stehen kurz vor einer zugelassenen Anwendung. Derzeit laufen zwei klinische Studien mit dem von unserem Institut mitentwickelten System Hemospec. Es besteht aus einem kleinen Mikrofluidikchip, auf den das Blut aufgetragen wird, und einem Lesegerät in Fernbedienungsgröße. In den Studien mit 80 beziehungsweise 183 Teilnehmern wird die Fähigkeit des Tests untersucht, Sepsis-Patienten schnell und verlässlich zu erkennen. Eines der Module von Hemospec ist ein Sepsis-Modul. Im Prinzip handelt es sich hier um einen Leukozytentest. Aus ein bis zwei Milliliter Blut des Patienten isoliert Hemospec die weißen Blutkörperchen und fertigt von ihnen Raman-Spektrogramme an. Inklusive automatisierter Auswertung und statistischer Interpretation dauert das ganze maximal 40 Minuten. Dann kann der Arzt anhand des Raman-Fingerabdrucks der Leukozyten erkennen, ob eine Entzündung oder eine Infektion vorliegt. Sogar die Klasse des Krankheitserregers kann grob bestimmt werden. LABORWELT Was kann mit dieser markerfreien Methode auf Zellebene unterschieden werden? Matthäus Für die Bildgebung von Zellen ist die RamanSpektroskopie grundsätzlich gut geeignet. Es
hängt immer ein bisschen davon ab, welche Moleküle oder Molekülgruppen von Interesse sind. Zytosol, Zellkern und Mitochondrien sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Zusammensetzung einfach zu unterscheiden. Schwierig, aber nicht unmöglich, wird es, wenn man auf subzellulärer Ebene bestimmte Biomoleküle detektieren will. Hier kommt es auf das Molekül an. Resonanz-Raman funktioniert zum Beispiel gut bei Chromophoren. Im Prinzip geht es darum, ein in der Probe vorliegendes, fluoreszierendes Molekül anzuregen, Raman-Strahlung zu emittieren. Es gibt die Möglichkeit, Raman-Strahlung mit Elektronenübergängen zu koppeln. Es wird also eine Schwingung und ein Elektronenübergang angeregt. Mit dieser Technik kann zum Beispiel Cytochrom C in der lebenden Zelle ohne zusätzliche Markierungen beobachtet werden. Neben Enzymen, die mit Metallatomen oder -ionen komplexiert sind, können mit ResonanzRaman auch Moleküle mit konjugierter Doppelbindung detektiert werden. Carotinoide wären hier ein gutes Beispiel. Für Moleküle, welche in die Zelle aufgenommen werden, wie zum Beispiel Lipide, kann man stabile Isotopen (Deuterium u.a.) einsetzen. Sie verschieben das Raman-Signal der Streckschwingungen der Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen erheblich – in einen Bereich in dem biologische Moleküle normalerweise keine Banden aufweisen. Die chemischen Eigenschaften bleiben bei dieser Art der Markierung jedoch unverändert. LABORWELT Sie hatten bereits Hemospec erwähnt. Welche anderen Anwendungen außerhalb der Grundlagenwissenschaft sind denkbar? Matthäus Die Biotech- und Pharmaindustrie könnte die Raman-Spektroskopie intensiver nutzen. Zellmetabolismus, Aufnahme von Wirkstoffen, Drug-Delivery-Systeme etc. – dieses Feld ist meines Erachtens noch nicht vollständig beackert. Da ist noch viel zu erwarten. Zielsetzung ist, was unser Institut angeeht, die klinischen Anwendingen so weit zu treiben wie möglich.
Schematische Abbildung des Hemospec-Mikrofluidik-Chips
Promocell GmbH
Große Auswahl an zellbasierten Assays Unter der Marke PromoKine bietet die Promocell GmbH eine Vielzahl an Kits und Reagenzien zum sensitiven und schnellen Nachweis von Zellviabilität/Zellproliferation, Zytotoxizität, Nekrose/ Apoptose sowie Signaltransduktion, Seneszenz, Zellstress und Zellmetabolismus an. Die PromoKine Colorimetric Cell ViabilityKits basieren auf der Reduktion verschiedener Tetrazolium-Salze (MTT, XTT, WST-1 & WST-8), während die Fluorometric Cell Viability-Kits Resazurin beziehungsweise Calcein-AM in fluoreszierende Verbindungen umwandeln. Mit den Bioluminescent Cell Viability-Kits kann die ATPProduktion als Marker der Zellviabilität mittels eines Luziferase-Assays bestimmt werden.
Die Zellproliferationskits von PromoKine basieren auf zum Beispiel CFSE, DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen oder EdU-Konjugaten und erlauben eine Detektion und Quantifizierung der Zellteilung über Fluoreszenzmikroskop, Durchflusszytometer oder Mikroplatten-Photometer. Die Zytotoxizitätsassays quantifizieren den Anteil toter Zellen kolorimetrisch, fluorometrisch oder luminometrisch über die Menge an freigesetzter Laktatdehydrogenase (LDH) beziehungsweise Adenylatkinase (AK) – oder über Bindung von Farbstoffen wie Neutralrot, Kristallviolett oder Sulforhodamin B. Dem Angebot der Zellmetabolismus/Zellstress-Kits werden momentan zahlreiche Assays für die Forschung in den Bereichen Onkologie, Diabetes, Adipositas und kardiovaskuläre Krankheiten zugefügt. Detaillierte Informationen gibt es unter www.promokine.info/cell-analysis und www.promokine.info/apoptosis. PromoCell GmbH Tel.: +49 (0)6221-649-34-0 info@promokine.info www.promokine.info
Abb.: Promocell (rechts), Hemospec/youtube.com (unten)
Matthäus Wenn fluoreszierendes Gewebe in der Nähe ist, dann wird es schwierig, die Raman-Strahlung zu detektieren. Farbintensive Gewebe wie die Leber sind daher herausfordernd und müssen unter Umständen durch höhere Laserleistung gebleicht werden. Bei beispielsweise Gehirn und Haut ist die Anwendung deutlich einfacher.
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Produktwelt Zellanalyse/Screening Sarstedt AG & Co. KG
CEM GmbH
Cell Imaging – die Zellen im Fokus Ganz gleich ob fluoreszenz- oder lichtmikroskopische Analysen an lebenden oder fixierten Zellen, Parallelanalysen oder Einzeluntersuchungen durchgeführt werden sollen – die Vielfalt der Sarstedt lumox®- und x-Well-Produkte bietet ideale Lösungen für bestmögliche Ergebnisse bei Cell-Imaging-Versuchen. Die Vorteile der x-well-Zellkulturkammern im Überblick: l erhältlich mit Objektträgern aus PCA, Glas, Deckglas oder lumox-Folie, l zeiteffiziente Durchführung aller Schritte von histologischen und Fluoreszenzfärbungen in den x-Well-Zellkulturkammern und l kosteneffiziente Durchführung von Experimenten aufgrund kleiner Kompartimentierung (Reduzierung der Zellzahl und Reagenzien). l Bei den mit „ablösbar“ gekennzeichneten Produkten lässt sich die Kammer ohne Werkzeug so ablösen, dass keine Kleberückstände auf dem Objektträger verbleiben. Bei den lumox multiwell & dish-Produkten sorgt der gasdurchlässige, hochtransparente Folienboden für ausgezeichnete Ergebnisse bei mikroskopischen Analysen von lebenden und fixierten Zellen. Die schwarzen
24-, 96- und 384-Well-Zellkulturplatten mit lumox-Folienboden (50 µm) sind für fluoreszenzmikroskopische Analysen konzipiert. Die Schalen mit Folienboden (25 µm) eignen sich für weitere Anwendungen wie zum Beispiel die Elektronenmikroskopie, bei denen der Boden ausgeschnitten werden muss. Details sind abrufbar unter www.sarstedt.com. Sarstedt AG & Co. KG Sarstedtstraße 1, 51588 Nümbrecht Tel.: +49 (0)2293-305-0 info@sarstedt.com
IBA GmbH
Vollständig reversible Zellisolation mit FABian®
Abb.: Sarstedt (oben), IBA (links), CEM (rechts)
Üblicherweise werden mononukleare Zellen (PBMCs) mittels Dichtegradientenzentrifugation aus Vollblut isoliert. Für Subpopulationen, wie T- und B-Zellen, stehen Magnetbead-basierte Systeme zur Verfügung, welche mit Hilfe von Antikörpern die Zielzellen binden. Diese PositivSelektionen liefern im Regelfall die besten Reinheiten der isolierten Zellpopulation, haben aber auch gravierende Nachteile: So ist die Bindung der hochaffinen Antikörper nahezu irreversibel,
was zur Blockierung von Zellrezeptoren oder gar zu einer Zellaktivierung führen kann. FABian, die nicht-magnetische Affinitätschromatographie Fab-TACS® (Traceless Affinity Cell Selection) von IBA Lifesciences, bietet die Vorteile einer Positiv-Selektion, verzichtet jedoch auf die Verwendung von irreversibel bindenden Antikörpern. CD-spezifische, niedrigaffine Fab-Fragmente binden reversibel an Zielzellen, welche anschließend über das Strep-tag®:StrepTactin®-System schonend isoliert werden. Unter der Verwendung der Fab-TACS-Technologie bietet FABian ein vollautomatisiertes Standardverfahren zur Zellisolation, welches die derzeit üblichen Verfahren überflüssig macht. PBMC-ähnliche Zellpopulationen, T- und BZellen lassen sich dadurch mit hohen Ausbeuten und großer Reinheit direkt aus Vollblut oder Buffy Coat isolieren. Dabei liefert FABian nichtaktivierte, reagenzienfreie Zielzellpopulationen, deren Vitalität neue Maßstäbe setzt.
Prämierte FestphasenPeptidsynthese Das Liberty Blue als Mikrowellen-PeptidSynthesizer der 2. Generation ermöglicht in wenigen Stunden die schnelle Synthese von reinen Peptiden und schwierigen Sequenzen. Im Vergleich ist das neue System: l noch schneller. Nur 4 min Zykluszeit ermöglichen die Synthese in Stunden statt in Tagen. l noch sparsamer. Bis zu 90% Einsparung an Lösungsmitteln erhöht den Umwelt- und Arbeitsschutz – und spart Geld. l noch universeller – von Kleinstmengen für die PNA-Synthese bis zu 5 mmol. l noch flexibler – zum Beispiel 27 Positionen für Reagenzien, Umbenennen von Reagenzien. l noch einfacher. Intuitive Software erleichtert das Programmieren von Sequenzen. Die einfache Technik mit wenigen Ventilen und Sensoren vereinfacht den Service. l noch informativer – Beobachtung der Reaktion mit der Kamera. Mit der typischen Synthesezeit von wenigen Stunden ist das Liberty Blue eine Alternative zu Parallel-Synthesizern. So wird beispielsweise das 76mer-Peptid Ubiquitin mit >60% Reinheit in weniger als vier Stunden synthetisiert. CEM GmbH Carl-Friedrich-Gauß-Straße 9 47475 Kamp-Lintfort Tel.: + 49 (0)2842-964 40 Fax: + 49 (0)2842-964 411 info@cem.com www.peptid-synthese.de
IBA GmbH Rudolf-Wissell-Straße 28, 37079 Göttingen Tel.: +49 (0)551-50672-0 fabian@iba-lifesciences.com
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19. Jahrgang | Nr. 1/2018 | XI
21.02.2018 15:47:43 Uhr
Ausblick
Vorschau Heft 2/2018
Gesundheit
Auch Atem kann Grippeviren übertragen
Axolotl-Forschung
Genetik
Genom geknackt
Saure Sinne
Verliert der kannibalistisch veranlagte mexikanische Axolotl ein Körperteil, wächst innerhalb weniger Wochen ein perfekter Ersatz mit Knochen, Muskeln und Nerven an den richtigen Stellen nach. Hinweise, wie der Wunder-Lurch das macht, hoffen Wissenschaftler im Genom zu finden. Erstmals hat ein Team von Forschern aus Wien, Dresden und Heidelberg nun alle Teile des gigantischen Erbsubstanz-Puzzles des Axolotls entschlüsselt (Nat. doi:10.1038/nature25458).
Was hat saurer Geschmack mit dem Gleichgewichtssinn zu tun? Eine ganze Menge, wie Forscher aus den USA herausfanden (Science, doi: 10.1126/science.aao3264). Denn das Gen Otopetrin 1 führt nicht nur dazu, dass in den Geschmackszellen Protonenkanäle entstehen, sondern ist auch für die Bildung winziger Ohrsteinchen im Mittelohr verantwortlich. Die Steinchen sorgen durch ihre träge Masse und ihre Gewichtskraft für die Wahrnehmung von Schwerkraft und Beschleunigung.
Aus der laborwelt.de-Galerie
Bakterium produziert Gold Das Bakterium C. metallidurans kann dort leben, wo es anderen Organismen zu giftig ist: in der Umgebung von Schwermetallen. Der Trick des Winzlings: Er kann die Konzentration der Metallverbindungen regulieren – und bei Bedarf giftige Goldverbindungen in ungiftiges Reingold umwandeln. Diese sind im Bild als kleine Goldnuggets zu erkennen. Welche molekularen Prozesse genau ablaufen, haben Forscher der MartinLuther-Universität Halle-Wittenberg (MLU) und der Technischen Universität München (TUM) herausgefunden (M etallomics, doi: 10.1039/c7mt00312a).
Themen
Analytica 2018 Das nächste LABORWELT-Spezial wird wie gewohnt in den Händen – und Köpfen – der Teilnehmer der diesjährigen Analytica sein. Dort kommen Gerätehersteller, Laboranalytiker, Wissenschaftler und Anwender zusammen, um neue Entwicklungen rund um Themen wie DNA-, RNA- und Proteinanalytik, 3D-Druck oder die Prozessdigitalisierung aufzusaugen. Erscheinungstermin des Spezials ist der 29. März 2018. Beiträge können bis 12. März 2018 eingereicht werden (Redaktionskontakt: m.laqua@biocom.de).
Termine Werbekunden bietet diese Ausgabe, begleitend zum redaktionellen Inhalt, eine ideale Plattform für ihre Anzeigen. Reservieren Sie Ihren Werbeplatz bis spätestens 12. März 2018. Informationen geben Oliver Schnell (Tel.: +49-30-264921-45, E-Mail: o.schnell@ biocom.de) und Christian Böhm (Tel.: +4930-264921-49, c.boehm@biocom.de).
Impressum LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint 5-mal im Jahr im Verlag der BIOCOM AG Lützowstraße 33–36 10785 Berlin, Germany Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11 laborwelt@biocom.de www.biocom.de Redaktion Dr. Martin Laqua, Tel.: 030/264921-68 Titelbild: tilialucida/fotolia.com Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt und dürfen ohne schriftliche Genehmigung des BIOCOM Verlages nicht reproduziert oder verbreitet werden.
Abb.: American Society for Microbiology (unten), pxhere.com (oben), science photo/fotolia.com (rechts)
Um Grippeviren nicht weiter zu übertragen, halten infizierte Patienten am besten Abstand von gesunden Menschen. Denn Tröpfcheninfektionen verbreiten sich schnell. Bislang ging man davon aus, dass die virusbeladenen Partikel hauptsächlich über Niesen oder Husten weitergegeben werden. Doch einer kürzlich veröffentlichten Studie (PNAS,
doi: 10.1073/pnas.1716561115) zufolge reicht Ausatmen bereits aus, um Grippeviren zu verbreiten. Besonders in den ersten Krankheitstagen sollen Grippepatienten infektiöse Aerosole in die Luft abgeben, welche dann über kurze Distanzen auf die Schleimhäute anderer Menschen übertragen werden. Die Forscher untersuchten 142 Patienten mit einer Influenza-Infektion. Sie nahmen am ersten, zweiten und dritten Tag nach Ausbruch der Grippe-Symptome Proben der InfluenzaAerosole während die Probanden atmeten, sprachen, husteten und niesten. Anschließend bestimmten sie, wie infektiös die Tröpfchen waren. 11 aller 23 Aerosolproben, die ohne Husten oder Niesen gesammelt wurden, enthielten virale RNA. Darunter wiesen die Forscher in acht der elf Proben infektiöse Viren nach.
XII | 19. Jahrgang | Nr. 1/2018
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Medizintechnik „Made in Germany“
Die englischsprachige „Visitenkarte” der deutschen MedizintechnikBranche beleuchtet die Stärken der deutschen Unternehmen und die Vielfalt ihrer Produkte auf zweiseitigen Firmenprofilen – von innovativen Medizinprodukteherstellern bis hin zu Dienstleistern im Gesundheitswesen. Abgerundet wird das Buch mit informativen Wirtschafts- und Finanzkennzahlen sowie einem Überblick zu den Technologietrends im nationalen und internationalen Gesundheitsmarkt.
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