CONOCIMIENTO DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS COMO COMPONENTE DE LA BIODIVERSIDAD. Londoño Sánchez Laura1, Montoya Carlos1, Velasco Vélez Ricardo 2 Escuela de microbiología - Universidad de Antioquia 1 Estudiantes de Microbiología Industrial y Ambiental, 2Docente de Gestión y legislación ambiental. Calle 67 No. 53 – 108, Barrio Sevilla. Medellín - Colombia. 19 de noviembre de 2012
RESUMEN Aunque los microorganismos forman un gran porcentaje de la biodiversidad de la tierra se conoce poco de la estructura de sus comunidades y poblaciones, en parte a las limitaciones que ofrecen los métodos para su estudio. Muchos de los métodos se han basado en el cultivo, no obstante se ha empezado a llamar la atención por el conocimiento de las propiedades y funciones del 95 restante de microorganismos que se estima falta por conocer y que no son cultivables. Para ello se han desarrollado técnicas independientes del cultivo basadas en DNA y RNA. Estas técnicas han resultado en parte un problema pero siguen teniendo sus limitaciones, por ahora el desarrollo de la metagenómica vislumbra tener un gran protagonismo. Conocer la diversidad microbiana es de gran importancia ya que son la base de la red trófica y de su función e interrelaciones en el ambiente depende el correcto funcionamiento de los ecosistemas de los que se sustenta el hombre. Por esto se deben crear políticas claras que incluyan estrategias de conservación y estudio de la diversidad microbiana, conocerlos es fundamental ya que es más difícil tratar de preservar algo que no se conoce. Se debe actuar rápido, antes de que desaparezca el hábitat que se destruye a un ritmo acelerado y se pueden extinguir especies si antes haberlas estudiado con características que pueden representar un gran aporte a la calidad de vida de las personas.
ABSTRAT Although microorganisms form a large percentage of the earth's biodiversity, little is known of the structure of communities and populations, in part to the limitations provided for study methods. Many methods have been based on the crop, however it has begun to draw attention to the knowledge of the properties and functions of microorganisms remaining 95 estimated lack of knowledge and non-arable. For this techniques have been developed based on cultureindependent DNA and RNA. These techniques have resulted in part this problem but still have their limitations, for now the development of metagenomics looms have a major role. Knowing microbial diversity is of great importance as they are the base of the food web and their role and relationships in the environment depends on the proper functioning of ecosystems that sustain man. For this you must create clear policies that include conservation strategies and study microbial diversity is essential to know as it is more difficult to try to preserve something that is not known. They must act quickly, before it disappears habitat is destroyed at a rapid rate and can extinguish species without first having studied with features that can represent a significant contribution to the quality of life of people.
El termino biodiversidad microbiana se refiere al número de especies, riqueza de especies, el número total de especies presentes, la cantidad de actividades que una especie realiza durante su existencia con sus miembros, la expresión no fenotípica de su genoma y la distribución de la especie (RR Colwell, 1997; Kirk J. et al., 2004). La riqueza de especies (número de especies de una comunidad), y el tamaño de la población de una especie son dos parámetros esenciales para definir la estructura y diversidad de una comunidad (Liu W. et al., 1997) Otros autores definen la biodiversidad como la variedad y variabilidad de todas las formas de vida, el complejo ecológico en el que están presentes y los procesos de los que forman parte (Olalde V. y Aguilera L, 1998). Para los organismos procariotas el concepto de especie es confuso. Este problema ha conllevado a reemplazar la identificación y clasificación tradicional con taxonomía numérica. En este método la distancia entre aislados es calculada y almacenados en biotipos, donde un biotipo es una unidad taxonómica operacional que se usa en vez de especie para caracterizar y comparar poblaciones y comunidades. Una definición común de especie en procariotas hace referencia al grupo de cepas que tienen algún grado de consistencia fenotípica, exhibiendo al menos un 70% de hibridación DNA-DNA y más del 97% de similaridad en la secuencia del rRNA 16s (Torsvik V. et al., 1998).
Tener claras estas definiciones tiene repercusiones enormes en los estudios sobre diversidad microbiana de los cuales depende nuestro bienestar ya que los organismos y sus interacciones son fundamentales para muchos procesos y funciones del suelo incluyendo descomposición de la materia orgánica, circulación de nutrientes, estructura y formación del suelo, regulación de plagas y biorremediación de contaminantes. Todos estos procesos y funciones están relacionados con los ecosistemas siendo esenciales para el hombre en cuanto a la producción de alimentos, regulación del clima, provisión de agua limpia (Pulleman et al., 2012) Los estudios de diversidad han recibido poca atención pero estos deben empezar a cambiar ya que la pérdida de biodiversidad debido a la expansión, intensificación y mecanización de la agricultura ha generado graves problemas en Europa que incluyen erosión del suelo, reducción de la materia orgánica, compactación y contaminación, salinización y cambio climático (Pulleman M. et al., 2012), y desde el punto de vista genómico, cada secuencia de DNA es única e irremplazable, por lo que la desaparición de cualquier especie biológica implica la pérdida irreversible de un conjunto único de información (Olalde V. y Aguilera L., 1998). 1. IMPORTANCIA DE MICROORGANISMOS
LOS
Los microorganismos son clave para el funcionamiento de los sistemas biológicos y el mantenimiento de la vida sobre el planeta, pues participan en
procesos metabólicos, ecológicos y biotecnológicos de los cuales dependemos para sobrevivir y enfrentar los retos del futuro (Montaño A. et al., 2010) Todos los organismos de la biósfera dependen de la actividad microbiana. Los microorganismos del suelo son vitales para la recirculación de nutrientes y para el funcionamiento de los ecosistemas (Kirk J. et al., 2004). La vida microbiana es componente primordial de la biodiversidad y son indispensables para el 1 mantenimiento de los ecosistemas Los microorganismos son ubicuos en la tierra, están presentes en todas las áreas climáticas incluyendo las que alguna vez fueron consideradas improbables para albergar la vida: el frío del ártico y antártico, el calor de géiseres. Son descomponedores, generan nutrientes de desechos inorgánicos y de organismos muertos en moléculas que son reusadas en los ecosistemas. Muchos de ellos viven en simbiosis con ellos u otros organismos superiores. Los microorganismos incluyen agentes patógenos, en algunas ocasiones mantienen el balance y en otras reducen las poblaciones de hospederos (RR Colwell)
1
Diversidad microbiana.
Disponible en:
<
http://www.cua.uam.mx/IB/page13/Biodiversidad -2.pdf>
En un alto porcentaje la biomasa del planeta es microbiana y los microorganismos participan directamente en los ciclos biogeoquímicos (fijación del nitrógeno, nitrificación, des nitrificación, fijación quimiolitotrófica del dióxido de carbono, formación de metano, reducción de sulfatos), en la regulación del clima, en la composición atmosférica (incluyendo los gases de efecto invernadero). Según Kirk et al. (2004) participan en la recirculación de compuestos orgánicos, influyen en el desarrollo de los ecosistemas al nutrir y mantener la salud de las plantas y contribuyen con la estructura y fertilidad del suelo. Además, proveen la mayor fuente de información genética para la biología molecular y la biotecnología. Los ecosistemas naturales terrestres y acuáticos dependen de los microorganismos para sostener sus requerimientos nutricionales, muchas veces a través de relaciones simbióticas con plantas (Rhizobium, Frankia, micorrizas de las raíces de ciertas plantas) y con animales (mejillones). Los animales dependen de los microorganismos de sus tubos digestivos para la digestión y para la producción de nutrientes y vitaminas esenciales. Por esto los microorganismos, incluyendo Procariotas (bacterias y archaea), Eucariotas (hongos, algas protozoos) y Virus, ocupan importantes nichos en todos los ecosistemas, son responsables del reciclaje de muchos compuestos de la naturaleza y son elementos básicos en las cadenas tróficas.
Los primeros microorganismos comenzaron su evolución hace más de 3 mil millones de años no es extraño que muestren una diversidad genética y metabólica mucho mayor que animales y plantas. Los microorganismos se encuentran tanto en el mar como en el agua dulce, y en extremos tan diversos como el agua destilada del laboratorio o las aguas hipersalinas del Mar Muerto. Pueden crecer en temperatura desde -5ºC a 118ºC (Pyrodictium crece en autoclaves). Soportan pH de 0 a 11. Aparecen en el suelo o en el aire, desde el agua del subsuelo profundo hasta las gotas de agua que constituyen las nubes (Deinococcus), y lo hacen en las más variadas formas: Archaeas halófilos en microscópicas bolsas de agua salada en domos de sal subterráneos, bacterias que utilizan hidrógeno en las profundas capas de agua subterránea, Archaeas metanógenos en depósitos de aceite formando gas natural, en las aberturas hidrotermales del fondo del mar. Los microorganismos han conseguido sobrevivir y desarrollarse en muchos lugares gracias a que han sido capaces de desarrollar estrategias de adaptación altamente eficaces de cara a las extremas condiciones a que han sido sometidos: temperaturas demasiado altas o demasiado bajas, presión excesiva, presencia de sustancias químicas destructivas, etc. Estos procesos de adaptación han ido mejorando
progresivamente a lo largo de millones de años de evolución, y aunque el número de especies capaces de sobrevivir en estos ambientes extremos es muy inferior al de las que viven en condiciones, "normales", no cabe duda de que llegar a comprender los mecanismos de adaptación de estos microorganismos y las condiciones en que se producen, nos ayudaría a comprender muchas, y muy complejas cuestiones relacionadas con los principios básicos de la vida y su origen en la Tierra, con su diversidad y con sus límites. Tabla 1. Servicios ecosistémicos de los microorganismos. Tomado de (Montayo A. et al., 2010)
Todas las características y funciones descritas anteriormente por Montaño A. et al. (2010) y los demás autores nos permiten estar de acuerdo con lo planteado con por Peh Kelvin y Lewis Simon (2012) en que la reducción de la diversidad biológica puede influir en el bienestar de los ecosistemas y sus
funcionalidad que regulan los sistemas en la tierra y de los cuales la población humana depende, de ahí la importancia de ser conservarla. 2. ¿CUÁNTO CONOCEMOS DE LOS MICROORGANISMOS? Sólo entre el 0,1 y el 1% de de todas las especies de bacterias existentes han sido descritas y la vasta mayoría remanente a de las especies son desconocidas, muchas de las cuales no pueden ser cultivables usando las técnicas corrientes de cultivo. Se ha descrito el 1% de especies de virus, del 5 al 10% de especies de hongos, y se conoce especies de protozoarios (RR Colwell, 1997). Según O kaiser et al. (2001) poco se conoce de la biodiversidad microbiana de la rizósfera debido a que sólo del 1 al 10% de estas comunidades son cultivables y los métodos tradicionales se han basado en el análisis de los aislados en platos de cultivo. Se ha estimado que en 1g de suelo hay 4000 unidades genómicas bacterianas diferentes (Kirk J. et al., 2004) . EL 99 % de bacterias observables al microscopio son no cultivables por técnicas comunes de laboratorio (Kirk J. et al., 2004) 3. TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS.
Las técnicas para el estudio de los microorganismos se clasifican en dos: las basadas en técnicas bioquímicas y basadas en técnicas moleculares Técnicas bioquímicas: Medios de cultivo, patrones de utilización de una única fuente de carbono (SSCU)/ elaboración de perfiles del nivel fisiológico comunitario (CLPP), análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos. Técnicas moleculares: Guanina +citosina, Re asociación e hidridización de ácidos nucleícos, micro arreglos de DNA e hibridización de DNA, Electroforesis en un gel de gradiente de temperaturas desnaturalizante (DGGE), polimorfismo de la conformación de la cadena sencilla (SSCP), análisis automatizado de los espacios internos del rRNA, análisis de restricción del DNA ribosomal amplificado (ARDRA), polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción terminales (T-RFLP) ((Kirk J. et al., 2004) O kaiser et al. (2001) encontró notables diferencias al estudiar la diversidad de una comunidad microbiana al usar métodos moleculares y de cultivo. Mediante la librería del rRNA 16s encontró que la comunidad estaba dominada por α proteobateria (51%) y bacterias del filum Cytophaga– Flavobacterium–Bacteroides (CFB) en un (30%), mientras que al emplear métodos de cultivo menos del 17% de bacterias pertenecían a estos dos grupos. Más del 64% pertenecían a la subclase β y γ de proteobacteria que en la libraría de
rRNA 16s tenían un porcentaje alrededor del 14%. Muchos de los clones mediante la librería de rRNA 16s presentó alta similaridad con Bradyrhizobium sp. y en cultivo no se encontró ninguna con esta característica. Lo anterior enfatiza en la necesidad de usar enfoques que combinen varias herramientas en el estudio de la diversidad microbiana, por esto más del 95% aún está por descubrirse y los avances recientes en biología molecular han revelado la incapacidad de los métodos tradicionales de la microbiología para rastrearla2 Para sobrellevar los problemas relacionados con el estudio e identificación de bacterias y hongos no cultivables se han desarrollado métodos basados en el análisis de ácidos grasos y basados en DNA y RNA. Los últimos desarrollos técnicos para el estudio de la diversidad microbiana incluye la metagenómica donde el DNA total (metagenoma) es aislado de una muestra ambiental y analizado. El análisis directo del DNA metagenómico se considera el método más preciso para conocer la estructura de una comunidad microbiana del ambiente ya que no envuelve ninguna selección (cultivo, enriquecimiento) y minimiza el sesgo técnico cómo las introducidas 2
Diversidad microbiana.
Disponible en:
<
http://www.cua.uam.mx/IB/page13/Biodiversidad -2.pdf>
por la amplificación por PCR del gen del 16 (Lewin A. et al., 2012) 3.1. LIMITACIONES DE LAS TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS. Algunas de las limitaciones en el estudio de los microorganismos del suelo incluyen limitaciones metodológicas y carencias en el conocimiento taxonómico. Por otro lado está la variación heterogénea que por naturaleza cuenta el suelo, la inmensa diversidad genética y fenotípica de hongos y bacterias (Kirk J. et al., 2004). Otros autores dan cuenta de que cuando se cultiva un microorganismo se altera la estructura de la comunidad al imponer nuevas condiciones selectivas que no reflejan precisamente la estructura original (Liu W. et al., 1997) 3.1.1. Limitaciones métodos moleculares
de
los
La eficiencia de la lisis de células u hongos varía de acuerdo al grupo microbiano. Si el método de extracción celular es muy suave bacterias Gram (-) pueden ser lisadas y las gram (+) no, y si el método es muy fuerte ambas células serán lisadas pero su DNA puede ser estropeado. La lisis actuará diferencialmente si se trata de esporas, micelio y micelio de diferentes edades, haciendo el estudio tendencioso (subjetivo)
En muestras ambientales es necesario remover ácidos húmicos ya que pueden interferir con la PCR Los pasos subsecuentes de purificación pueden conllevar a una perdida de DNA o RNA La amplificación diferencial de genes blanco puede conllevar a un sesgo en el estudio de diversidad. Aunque se usan genes o fragmentos presentes en todos los organismos (rRNA 16s, rRNA 18s, regiones ITS) los primers presentan diferente afinidad por el templado, en genes con bajo contenido de G +C se separan más eficientemente y a la vez ser preferencialmente amplificados obteniendo diferente número de copias del gen (Kirk J. et al., 2004). Para conocer cómo los cambios en la estructura de una comunidad microbiana influencia los ecosistemas se debe contar con mecanismos precisos y confiables para el estudio de los microorganismos del suelo (Kirk J. et al., 2004).
3.1.2. Ambigüedad en taxonomía de los microbios
la
Existen cerca de 24 definiciones de especie y todas son diferentes. La definición tradicional de especie está basada en plantas superiores y animales, esta no aplica para procariotas u organismos
asexuales. Además las bacterias presentan plasticidad genética, transfieren su DNA a través de plásmidos, bacteriófagos y transposones dificultando el concepto bacteriano de especie (Kirk J. et al., 2004). 4. NORMATIVA CONSERVACIÓN DE DIVERSIDAD MICROBIANA
Y LA
No existe hoy en día en Colombia una normativa que regule el uso y aprovechamiento sostenible de los microorganismos aún siendo estos la base de innumerables investigaciones, productos y procesos biotecnológicos que demandan derechos de propiedad intelectual como fuente de protección, incentivos y divulgación. En Colombia las normativas existentes se dedican a controlar el número de microorganismos presentes en cuerpos de agua o alimentos, pero nada está escrito con relación a su uso sustentable. A su vez, las autoridades ambientales prestan servicios ecosistémicos de aprovisionamiento, de regulación, servicios culturales y esenciales, estas se encargan de designar las áreas protegidas e identificar problemas para desarrollar planes de manejo para proteger los ecosistemas con su biodiversidad en general, suponiéndose que allí, están los microrganismos característicos de cada hábitat, pero no hay una ley que proteja el microcosmos tal vez porque parten del supuesto de su ubiquidad y de que no presentan vulnerabilidad.
Actualmente al hablar de conservación del medioambiente se piensa en proteger animales y plantas, desconociendo la importancia de proteger igualmente ambientes ácidos o alcalinos, hipersalinos, con temperaturas extremas, ya que son igualmente importantes para la diversidad microbiana donde desarrollan características genéticas y fisiológicas que les permiten sobrevivir y crecer bajo estas condiciones extremas en las cuales ellos han evolucionado hasta la aparición de un medio ambiente como el que nosotros conocemos actualmente. En el mundo existen políticas de conservación de especies individuales de flora y fauna, pero no de microorganismos es el caso de la US Endangered Species Act (ESA) y Convention on International Trade in Endangered Species of Fauna y Flora (CITES) y se hace aún más difícil conservar organismos que no se conocen. Caring of the earth es una actualización de World Conservation Strategy presentada en 1980 que aboga por la preservación del ambiente y la diversidad biológica, y aunque no especifica en la conservación de microorganismos propende por el establecimiento de áreas protegidas para cuidar de todos los organismos allí, la producción de energía de biomasa, mantener buenas condiciones del suelo para agricultura, incentivos a la investigación taxonómica y sistemática. Todas las anteriores estrategias si se llegan a cumplir tendrán un impacto positivo en la preservación y estudio de la
diversidad microbiana (RR Colwell, 1997) Otras iniciativas alrededor de la conservación de la diversidad microbiana incluyen: La convención de biodiversidad de Rio de janeiro de 1993 que incluye un acuerdo sobre tarifas y comercio (GATT) y este un tratado relacionado con la sección de propiedad intelectual (TRIPS) de microorganismos genéticamente modificados, microorganismos y procesos microbianos.
Las iniciativas de conservación son una lucha contra el tiempo ya que los hábitats naturales que albergan estos microorganismos no descubiertos están desapareciendo rápidamente. La desaparición de bosques tropicales está estimada entre hectáreas por año. Sólo un pequeño porcentaje de los bosques templados de la tierra aun se conservan, la cantidad y calidad de los humedales del mundo están en decline y sólo las partes más profundas del océano mantienen algún grado de calidad prístina (original) (RR Colwell, 1997) Los microorganismos también están desapareciendo de la tierra, Penicilliopsis clavariaeformis que vivía en una especie de árbol Diospyros de Indonesia, desapareció cuando el árbol lo hizo. De igual manera cookeina tricoloma por perturbaciones ambientales en Java (RR Colwell, 1997) Debido a esto lo más beneficioso para los microorganismos sería hablar de conservación del hábitat ya que se incluiría la protección de
los organismos y su hábitat (RR Colwell, 1997) Se debe empezar cuanto antes una discusión en torno a la conservación de los microorganismos que no se pueden ver al microscopio ya que se puede perder la estructura y función de microorganismos al extinguirse sin antes haber sido estudiados y es sabido que muchos de ellos permiten mantener la salud de los ecosistemas de la tierra (RR Colwell, 1997) 5. PERSPECTIVAS Y TENDENCIAS. Los microorganismos tienen una influencia muy significativa en los sistemas biológicos y biotecnológicos, de modo que la diversidad microbiana ha de ser considerada como un recurso para elaborar tecnologías novedosas que generen riqueza y bienestar para los países (Montaño A. et al., 2010) Se debe estudiar la diversidad microbiana no sólo como base del conocimiento científico, sino para comprender la relación entre diversidad, estructura de la comunidad microbiana y función ya que las actividades humanas como la polución, agricultura y aplicaciones químicas pueden afectar la biodiversidad microbiana y por ende afectar la función de los ecosistemas (Kirk J. et al., 2004). Los estudios sobre conservación y diversidad microbiana se han basado en escalas pequeñas por lo que se debe empezar a considerar grandes escalas de escalas de estudio en todos los niveles trópicos (Peh Kelvin y Lewis Simon, 2012)
Se debe propender por un mayor conocimiento de los organismos del suelo, su distribución, interacciones y funciones y cómo todo esto se traduce en servicios ecosistémicos, de este modo será más fácil desarrollar acciones y políticas en pro de su conservación (Pulleman M. et al., 2012) Es creciente el interés por el estudio de las comunidades microbianas en ambientes extremos ya que son la fuente de enzimas con inusuales y deseables propiedades. Tal entendimiento se puede hacer fácil con el desarrollo de estrategias como la metagenómica (Lewin A. et al, 2012) ¿Cómo sería el mundo si se tuviera alto conocimiento de las comunidades microbianas?
Basta mirar a nuestro alrededor para ver que los microorganismos no interesan ya sólo a los científicos, la industria mundial está invirtiendo millones de euros en investigación básica sobre ellos porque han comprendido que su mejor conocimiento puede aportar grandes beneficios en todos los terrenos imaginables. Los microorganismos expertos en adaptabilidad, con su experiencia en todos los procesos evolutivos y de supervivencia por lo que dan a la ciencia y a la humanidad lecciones que bien aprovechadas podrían frenar la destrucción de la vida en el planeta, o por lo menos mitigar algunos de los desastres generados por el hombre. Uno de los graves problemas que enfrenta el mundo es la violencia
por hambre, por eso debemos comprometernos con alternativas de solución, donde la biotecnología de la mano con la genética molecular, tiene un gran protagonismo debido a sus grandes posibilidades partiendo del pasado evolutivo y de la gran versatilidad metabólica demostrada por los microorganismos. Así que el hombre “en la cima de la evolución” debe bajar la mirada hacia ese pequeño gran mundo de los microorganismos ya que nos pueden salvar de la hecatombe. La profesora Lucía Atehortúa Garcés, coordinadora del grupo de Biotecnología de la universidad de Antioquia, viene trabajando en la producción de pigmentos altamente cotizados en el mercado, extraídos de un alga roja, bioactivos de las microalgas que inhiben las enzimas que se activan con los años destruyendo el acido-hialurónico, el colágeno y la elastina, que impiden el envejecimiento, entre muchos otros productos. Ella afirma que todas estas posibilidades que brinda la biotecnología deben ponerse al alcance de todos, y no sólo, en manos de las multinacionales que explotan los recursos para beneficio de las macroeconomías en detrimento de los países ricos en biodiversidad pero pobres en avances científicos y tecnológicos. En la Universidad Politécnica de Valencia en la 1ª jornada de biolimpieza de obras de arte se consideraron los últimos avances en cuanto a la utilización de bacterias para la limpieza de obras de arte. Esta experiencia posibilito el conocimiento de los métodos de biolimpieza, comprender los mecanismos y procesos de
biolimpieza y discernir las ventajas de estas técnicas con respecto a los procesos habituales de restauración. Así, se demuestra como los microorganismos se muestran competentes en tratamientos concretos donde otras técnicas y materiales han fracasado. El mundo sin duda se concebirá muy diferente cuando profundicemos más en el conocimiento de los microorganismos. Así como ahora sería imposible concebir todo el mundo de la biología molecular sin DNAsas, RNAsas, polimerasas y otras enzimas que han cambiado el sistema legal (RR Colwell). El conocimiento de los microorganismos ayudara a preservar el bienestar de la tierra y los humanos si se hace un uso racional y equitativo de este recurso. Así que nuestras ideas sobre el papel de los microorganismos (MO) y su influencia en los ecosistemas está basada en información incompleta ya que la gran mayoría no se han podido estudiar por falta de técnicas más avanzadas, o por limitación en medios de cultivo que simulen su hábitat natural y faciliten su investigación. Así que un largo y maravilloso mundo aun nos falta por recorrer y explorar en beneficio de la humanidad. Conclusión: Los microrganismos es la base de la diversidad biológica en
general,
son
capaces
de
desarrollar procesos y soluciones inimaginables problemas humanidad.
para
que
innumerables
existen
en
la
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Lewin A. et al., 2012. Metagenomics of microbial life in extreme temperature environments. Current Opinion in Biotechnology. 10 páginas Liu W. et al., 1997. Characterization of Microbial Diversity by Determining Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms of Genes Encoding 16S rRNA. Applied and environmental microbiology 63 (11) 4516–4522. Montaño A. et al., 2010. Los microorganismos pequeños gigantes. Elementos (77) 15-23. Olalde V. y Aguilera L. 1998. Microorganismo y biodiversidad. Terra latinoamericana (16) 289-292. O. Kaiser et al., 2001. Phylogenetic Analysis of Microbial Diversity in the Rhizoplane of Oilseed Rape (Brassica napus cv. Westar) Employing Cultivation-Dependent and Cultivation-Independent approaches. Microbial Ecology ( 42)136:149 Peh Kelvin y Lewis Simon, 2012. Conservation implications of recent advances in biodiversity–functioning research. Biological Conservation (151) 26–31 Pulleman M. et al., 2012. Soil biodiversity, biological indicators and soil ecosystem services—an overview of European approaches Current Opinion in Environmental Sustainability (4):529–538 RR Colwell 1997. Microbial diversity: the importance of exploration and conservation. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (18) 302:307. Torsvik V. et al., 1998. Novel techniques for analysing microbial diversity in natural and perturbed environments. Journal of Biotechnology 64 53–62 Kirk J. et al. 2004 Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods (58) 169– 188