Evaluación de la aplicación de distintos productos sobre el estado fisiológico vegetal y la vida post-cosecha del fruto de tomate. Laboratorio de Ecofisiología y Biotecnología Departamento de Ciencias Agrarias y del Medio Natural Universitat Jaume I
En colaboración con
Evaluación de la aplicación de distintos productos sobre el estado fisiológico vegetal y la vida post-cosecha del fruto de tomate
Laboratorio de Ecofisiología y Biotecnología Departamento de Ciencias Agrarias y del Medio Natural Universitat Jaume I
Septiembre 2012
ÍNDICE
RESUMEN
3
MATERIALES Y MÉTODOS
4
RESULTADOS
7
Concentración de prolina y MDA
7
Concentración de fitohormonas
8
Cosecha y parámetros de calidad de los frutos
10
Peso
10
Dureza
11
Anomalías en la superficie de los frutos y evolución del destrío
12
Comportamiento post-cosecha mediante parámetros de pérdida de agua
13
Etileno
14
Concentración de solutos solubles (Grados Brix)
15
Aparición de infecciones
15
Resumen En este trabajo se estudió el efecto de la aplicación foliar de dos productos a base de calcio (Nitrato Cálcico y Borocal + Maytips) sobre la fisiología de la planta de tomate y sobre la producción y calidad de fruto antes y después de la cosecha. Los resultados muestran que el tratamiento con Borocal + Maytips redujo el daño oxidativo en las plantas durante los tres muestreos de forma más eficiente que el tratamiento con Nitrato Cálcico. Sin embargo, no se observaron variaciones en la concentración de prolina foliar entre las plantas de los distintos grupos experimentales. El tratamiento con Borocal + Maytips redujo los niveles foliares de las 3 hormonas vegetales relacionadas con el estrés. Todos estos datos en conjunto indican que las plantas tratadas con Borocal + Maytips tienen un mejor estado fisiológico y sufren en menor medida el estrés ambiental. Los resultados a nivel de cosecha indican que no hubo diferencias apreciables en el número de tomates cosechados entre los tres grupos de tratamiento. Sin embargo, se aprecia que el tratamiento con Borocal + Maytips aumenta el peso medio de los tomates recolectados en las dos primeras tandas. Además los tomates tratados con este producto presentan una mayor consistencia (dureza) y mayor contenido en sólidos solubles lo que da cuenta de una mayor calidad intrínseca. Cabe destacar que el cultivo sufrió altas temperaturas combinadas con una baja humedad ambiental durante la formación del primer piso de cosecha lo que se tradujo en un importante destrío debido a necrosis apical. Este accidente fue eficientemente corregido por el producto Borocal + Maytips. Por último el tratamiento con este producto mejoró la vida post-cosecha de los tomates. Tanto la producción de etileno como la pérdida de agua en post-cosecha se redujo en las tres tandas de tomates cosechados.
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Materiales y métodos Material vegetal El ensayo se realizó sobre plantas de tomate de la variedad Montecarlo, que combina rapidez de crecimiento y gran producción con unas adecuadas características de maduración y consistencia de fruto, lo cual resultó beneficioso para el desarrollo de este proyecto. Estas plantas se cultivaron en contenedores de 12 litros que contenían un sustrato comercial basado en una mezcla de turba (80%) y perlita (20%). De forma previa, las plantas se germinaron en semilleros bajo condiciones ambientales controladas y posteriormente fueron trasplantadas a los contenedores definitivos en el estadio de 4 hojas. Los experimentos se llevaron a cabo en los invernaderos de la Universitat Jaume I, en condiciones de humedad y CO2 ambientales. Tratamientos y muestreos Las plantas se distribuyeron siguiendo un esquema de bloques partidos, cada bloque compuesto de 10 tomateras, con el objetivo de minimizar el efecto de variaciones ambientales dentro del entorno del invernadero. Durante el desarrollo de los experimentos, las plantas se regaron tres veces por semana con una solución de Hoagland modificada para tomate. Los bloques establecidos, que se trataron cada diez días con los distintos productos vía foliar (Figura 1), fueron: 1- Plantas control: Tratadas únicamente con agua vía foliar. 2- Plantas tratadas con el producto 1 (Nitrato de calcio). El primer tratamiento se realizó 3 semanas después del trasplante y se repitió cada 10 días (dosis 1.5 g/L). 3- Plantas tratadas con el producto 2 (Borocal y May Tips), con la misma frecuencia que en el tratamiento anterior y a dosis de 3 cc/L y 1 cc/L respectivamente.
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Figura 1. Tratamiento foliar de las plantas de tomate. En tres fechas distintas se seleccionaron hojas de plantas al azar de cada tratamiento para llevar a cabo los siguientes ensayos bioquímicos: 1.- Concentración de prolina y MDA El estado redox vegetal y el posible estrés se evaluó en función de la concentración de malonildialdehido (MDA) y prolina respectivamente. La medida de la concentración de prolina se llevó a cabo mediante determinación espectrofotométrica a 520 nm, interpolando los valores obtenidos a una curva estándar realizada con prolina comercial, expresados en µmol de prolina por gramo de peso fresco. El cálculo de la concentración de MDA en el extracto viene dada por [Abs532-Abs600] × [155 mM]-1. El valor de la acumulación de MDA se expresó en nmol de MDA por gramos de peso fresco. Una extensa descripción de ambos protocolos pueden encontrarse en Arbona et al. (2003, Plant Cell Physiol 44: 388-394). 2.- Concentración de fitohormonas Se analizaron las concentraciones endógenas de diferentes fitohormonas (SA, JA y ABA) como marcadores/señalizadores de estrés siguiendo el protocolo descrito en Durgbanshi y col. (2005, -5-
J.Agric.FoodChem. 53: 8437−8442). El análisis se llevó a cabo mediante un equipo HPLC (Alliance 2860, Waters Corp., Milford, USA) acoplado a un espectrómetro de masas en tándem con interficie de electrospray (Quattro LC, Micromass, Manchester, UK). Se inyectaron alícuotas de 20 µL y se separaron en una columna de fase reversa (Kromasil 100, C18, 5 μm, 100 × 2.0 mm, Scharlau) utilizando un gradiente lineal de metanol y agua ultra pura complementada con ácido acético hasta una concentración final de 0.01 % (v/v) y un flujo de 0.3 mL/min. La discriminación y detección de cada analito se consiguió siguiendo el patrón de fragmentación y tiempo de retención característicos. Las condiciones propias de ionización y colisión para cada compuesto se optimizaron mediante infusión directa de estándares puros concentrados (aproximadamente 5 mg/L). La cuantificación de los analitos de interés se llevó a cabo atendiendo al factor respuesta (áreaanalito/áreastd) interpolando en una curva de calibrado inyectada de forma alternada con las muestras. El procesado de los cromatogramas, la integración y la cuantificación se realizó mediante el software propio del instrumento, MassLynx 4.0. Además de estos ensayos bioquímicos sobre las muestras foliares, se llevó a cabo un análisis de la vida post-cosecha de los frutos de tomate en su estado óptimo. Concretamente, se cosecharon en tres fechas distintas tomates de cada tratamiento. Para cada una de las tres tandas de cosecha se realizaron las siguientes medidas: a) Peso de los frutos de los tomates. b) Dureza (utilizando un penetrómetro). c) Anomalías en la superficie de los frutos y evolución del destrío. d) Comportamiento post-cosecha (shelf life) mediante parámetros de pérdida de agua (Maalekuu et al. 2006. Postharvest Biology and Technology. 42: 248-255). e) Etileno (utilizando cromatografía de gases con un detector FID). f) Concentración de solutos solubles (Grados Brix). g) Aparición de infecciones y accidentes fisiológicos
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Resultados 1.- Concentración oncentración de prolina y MDA. Enn primer lugar, se recogieron muestras foliares aleatorias de cada uno de los tratamientos en tres fechas distintas con una diferencia de 15 días. Las figuras 1 y 2 muestran los niveles de MDA y prolina obtenidos respectivamente, para cada uno de los productos en tres fechas distintas:
19
Control
17
Nitrato de Calcio Borocal + Maytips
15 13 11 9 7 5 31/07/2012
14/08/2012
31/08/2012
Figura 2. Concentración foliar de MDA en tres fechas distintas. La concentración foliar de MDA, indicadora del daño oxidativo de la planta, disminuyó claramente con los tratamientos con los dos productos ensayados. Como puede observarse en la figura 22, los tratamientos redujeron el daño oxidativo, siendo este efecto más claro en las plantas tratadas con Borocal junto a Maytips Maytips. Cabe también destacar que el primer día de ensayo, la concentración de MDA de las plantas control fue mayor que en el resto de días en los que se tomó muestra. Estas diferencias podrían deberse a las altas temperaturas y baja humedad registradas en el invernadero durante los días en que fue tomada la muestra de la primera tanda. Estas condiciones medioambientales adversas podrían haber supuesto un cierto estrés hídrico para las plantas de tomate que se habría traducido en un aumento de la concentración de especies reactivas de oxígeno en la célula.
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Prolina (umol/ g PF)
2,6 2,4 2,2 2 1,8
Control
1,6 1,4 1,2 1
Nitrato de Calcio Borocal + Maytips
31/07/2012
14/08/2012
31/08/2012
Figura 3. Concentración foliar de prolina en tres fechas distintas La concentración de prolina,, tal y como se observa en la figura 3, disminuyó ligeramente en los dos últimos muestreos y su oscilación se situó entre los valores de 1,5 y 2,5 µmol por gramos de peso fresco en los tratamientos y días de muestreo. muestreo Los valores de la concentración de prolina de los tratamientos fueron similares a los valores obtenidos para el control, demostrando así que los tratamientos no causaron estrés alguno a la planta. También se observó un mayor contenido en prolina en todas las plantas cosecha cosechadas el 31 de julio que se correlacionaría con el posible estrés ambiental provocado por las altas temperaturas combinadas con bajos niveles de humedad. 2.- Concentración de fitohormonas
SA 80
SA (mg/g PF)
60 40
Control Nitrato Cálcico
20
Borocal + Maytips
0
31/07/12
16/08/12
31/08/12
Figura 4. Concentración foliar de SA en tres fechas distintas
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A continuación se llevó a cabo el análisis del perfil hormonal de las muestras foliares recogidas en tres fechas distintas. Las figuras 4, 5 y 6 muestran las concentraciones foliares de ácido salicílico ((SA), ácido jasmónico (JA) y ácido abscísico (ABA ABA) obtenidas para cada tratamiento estudiado. El ABA es una hormona vegetal que señaliza el estrés abiótico (sequía, salinidad, etc.), mientras que el SA es un indicador de infecciones. Los niveles de JA en planta aumentan tanto en respuesta al estrés abiótico co como biótico. Como puede observarse en la figura 4, en las dos primeras tandas, existe una tendencia de disminución de la concentración de SA en las hojas de plantas tratadas con ambos productos testados. En la tanda 3 no se observan diferencias significativas significativas entre los niveles de SA con respecto del grupo control.
JA 120
JA (mg/g PF)
100 80 60
Control
40
Nitrato Cálcico
20
Borocal + Maytips
0
31/07/12
16/08/12
31/08/12
Figura 5. Concentración foliar de JA en tres fechas distintas distintas. En la figura 5 se observan niveles de JA significativamente superiores en la primera tanda con respecto a la segunda y tercera tanda. Estas stas diferencias podrían deberse a las altas temperaturas y baja humedad registradas en el invernadero como se ha comentado anteriormente en este informe. Junto a este dato se aprecia que los niveles de JA disminuyeron en las plantas tratadas con ambos productos lo que podría indicar una mejor condición de cultivo y un menor estrés en todas toda las fases del cultivo. Finalmente, en la figura 6 se observa el mismo incremento en la concentración foliar de ABA en plantas cosechadas el 31 de julio con respecto respecto al resto de muestreos. Las plantas tratadas con Nitrato Cálcico muestran concentraciones foliares de ABA incluso mayores en esa fecha. Sin embargo, las plantas tratadas con Borocal y Maytips muestran unos niveles foliares de ABA mucho menores. El rest resto de las fechas en las que se estudió la evolución de los niveles de ABA foliar se apreció una reducción en la concentración de esta hormona en plantas tratadas con ambos productos aunque fue muy clara la diferencia entre ambos. En todos los casos, las plantas ntas tratadas con Borocal + Maytips presentan niveles de ABA menores.
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ABA ABA (mg/g PF)
600 500 400
Control Nitrato Cálcico
300
Borocal + Maytips
200
31/07/12
16/08/12
31/08/12
Figura 6. Concentración foliar de JA en tres fechas distintas. Cosecha y parámetros de calidad de los frutos a) Peso En primer lugar see determinó el número de tomates totales para cada tratamiento. En la figura 7 se muestra el porcentaje del número de tomates total cosechados por tratamiento.
Número tomates cosechados Control
Nitrato Cálcico
32%
Borocal + Maytips
33%
35%
Figura 7. 7 Número total de tomates cosechados por tratamiento. Los datos de la figura 7 muestran que los tratamientos no tuvieron un efecto significativo sobre el número de frutos cosechados, de forma que los tomates del grupo grupo control representaron un 33 33% del total de frutos cosechados; los tomates tratados con Nitrato Cálcico un 35%; %; y finalmente los tratados con Borocal + Maytips un 32%. A continuación los tomates se pesaron y se obtuvo el peso medio por trtratamiento y tanda, representado en la figura 8. - 10 -
Peso medio por tanda 220
Peso (g)
200 180 160
Control
140
Nitrato Cálcico
120
Borocal + Maytips
100
Tanda 1
Tanda 2
Tanda 3
Figura 8. Peso medio obtenido para cada tratamiento en las tres tanda tandas de cosecha. Tal y como se observa en la figura 8, los frutos cosechados pertenecientes a plantas tratadas con Borocal + Maytips tuvieron un peso mayor a los grupos control y a los tratados con nitrato de Calcio, especialmente en las recolecciones más tempranas. tempranas b) Dureza La dureza de los distintos tomates se midió mediante un penetrómetro. A continuación, en la figura 9 se representa la dureza de los tomates pertenecientes a los grupos de tratamiento por tanda.
8
Dureza (Lb)
7 6 Control
5
Nitrato Cálcico
4
Borocal + Maytips
3
Tanda 1
Tanda 2
Tanda 3
Figura 9. Dureza de la piel del fruto de tomate para los distintos distintos tratamientos tratamientos. Como se puede observar el la figura 9, la dureza de los tomates aumentó con los dos tratamientos aunque fue claramente mayor en el tratamiento a base de Borocal + Maytips. También cabe destacar que en la primera fecha de muestreo, los resultados son erráticos ya que, como se verá más adelante, el grado de destrío de esta tanda es muy elevado debido a la necrosis apical. - 11 -
c) Anomalías en la superficie de los frutos y evolución del destrío. En los tomates de la tanda 1 se observó podredumbre apical en los tres grupos de tratamiento (Figura 10). Sin embargo, la tasa de incidencia varió mucho en los distintos grupos de plantas. Este fenómeno fue debido probablemente a las altas temperaturas combinadas binadas con bajas humedades relativas que tuvieron lugar durante el periodo inicial de crecimiento de los frutos de la primera tanda. Cabe indicar que este tipo de accidentes se producen por falta de calcio en el fruto pero no siempre tienen que ver con su deficiencia absoluta sino que muchas veces se asocian a la falta de transporte y asimilación en el fruto. Tal y como se aprecia en la figura 11, el tratamiento con Borocal + Maytips fue muy efectivo corrigiendo este accidente fisiológico.
Figura 10. Podredumbre apical observada en los tomates de la primera tanda.
70 60
Destrio (%)
50 40
Control
30
Nitrato Cálcico
20
Borocal + Maytips
10 0 Tanda 1
Tanda 2
Tanda 3
Figura 11. Porcentaje de destrío debido a necrosis apical para los distintos tratamientos. - 12 -
No se observó ninguna anomalía adicional. d) Comportamiento post-cosecha mediante parámetros de pérdida de agua A continuación se evaluó la pérdida de agua en post-cosecha (shelf life). Este comportamiento es representado en las figuras 12, 13 y 14.
Tanda 1 100 98
Peso (g)
96 Control
94
Nitrato Cálcico
92
Borocal + Maytips
90 88
8-sep
13-sep
18-sep
23-sep
Figura 12. Pérdida de agua en post-cosecha de los frutos de tomate de la tanda 1 durante 10 días.
Tanda 2
Control
100
Nitrato Cálcico
98
Borocal + Maytips
Peso (g)
96 94 92 90 88 86
18-sep
20-sep
24-sep
26-sep
28-sep
Figura 13. Pérdida de agua en post-cosecha de los frutos de tomate de la tanda 2 durante 10 días.
- 13 -
Tanda 3
100
Control Nitrato Cálcico
98
Borocal + Maytips
Peso (g)
96 94 92 90 88 86
28-sep sep
01-oct
03-oct
05-oct
Figura 14. Pérdida de agua en post-cosecha post cosecha de los frutos de tomate de la tanda 3 durante 10 días. Los datos presentados en las figuras 12, 1 13 y 14 muestran que los tratamientos a base de Borocal + Maytips mejoraron claramente la vida post-cosecha post de los frutos en las tres tandas. Esto es especialmente significativo en la tanda 2. Los resultados de la tanda 3 son sorprendentes ya que los frutos tratados con Nitrato Cálcico mostraron una mayor deshidratación que los frutos control o los tratados con Borocal + Maytips.. Estos resultados son difíciles de explicar y quizá estén relacionados con la falta de asimilación del producto. e) Etileno Los niveles de etileno de los tomates pertenecientes a cada tratamiento fueron analizados mediante un cromatógrafo de gases con detector FID. Los frutos fueron cosechados y mante mantenidos en botes herméticos durante 3 horas, tras las cuales fue analizado en contenido en etileno. La figura 115 muestra la concentración de etileno para los tres grupos de tratamiento.
Etileno (nmol /g*h)
8 7 6 5 4 3 Control
Nitrato Cálcico
Borocal + Maytips
Figura 15. Niveles dee etileno obtenidos en frutos de tomate de los tres grupos de tratamiento. - 14 -
Tal y como se observa en la figura 15, 15 la producción de etileno en frutos de plantas tratadas con Nitrato Cálcico fue ligeramente superior a la de frutos de plantas control. El día en que se realizó esta medida, los frutos de plantas tratadas con Borocal + Maytips mostraron una producción de etileno menor a los grupos de tomates anteriores. f) Concentración de solutos solubles (Grados Brix) La concentración de solutos solubles se determinó mediante un refractómetro. Los resultados obtenidos para cada tanda y grupo de tratamiento se resumen en la figura 16. Control
4,4
Nitrato Cálcico
4,2
Borocal + Maytips
4
ºBrix
3,8 3,6 3,4 3,2 3
Tanda 1
Tanda 2
Tanda 3
Figura 16. 1 Grados Brix obtenidos para cada tanda y tratamiento. Los grados Brix de los tomates se mantuvieron entre valores de 3.3 y 4. 4.4. El tratamiento con Borocal + Maytips aumentó ligeramente los grados Brix en la segunda y tercera tanda (aproximadamente un 10% en la tanda 3 y un 5% en la tanda 2); 2) el incremento fue mayor en la primera tanda probablemente debido a las especiales ales condiciones de cultivo a las que se sometieron esos primeros frutos y que se ha detallado anteriormente. g) Aparición de infecciones No se apreciaron infecciones reseñables durante el periodo experimental
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