CÁC KĨ THUẬT SẮC KÍ TRONG HÓA HỌC PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI NHÓM SINH VIÊN HUẾ THỰC HIỆN by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

Chương1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÍ I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ: Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc người Nga Michael C.Txvet. Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm. Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloit từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm. Do có công trong việc phát triển lý thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được nhận giải thưởng Nobel về hoá học. Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quả tách rất cao. Cột mao quản và các detectơ sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp người ta có thể phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cở ppm và ppb. Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng dụng được nhiều trong thực tế. Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả tách đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance lipuid chromatography- HPLC): Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường khả năng của phương pháp. Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng. Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản (CEC)... Phương pháp có độ chính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp hơn.

II. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1. ĐỊNH NGHĨA - PHÂN LOẠI 1.1 Định nghĩa: Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên hai pha: một pha thường đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. 1.2 Phân loại các phương pháp tách sắc ký 1.2.1 Phân loại theo hệ pha Phương pháp đầu tiên được nhiều người quan tâm, đây là phương pháp phân loại đơn giản theo hệ pha tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gì? Sơ đồ phân loại các phương pháp sắc ký

hệ pha

Cơ chế

1.2.2 Phân loại theo cơ chế tách 1.2.2.1 Sắc ký hấp thụ: Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động nhờ tương tác phân tử thông qua các trung tâm hấp thụ. Pha tĩnh là các chất rắn hoặc lỏng có diện tích bề mặt lớn, bền vững về mặt hoá học. Chúng hấp thụ 2

chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau khi cho pha động chứa chất phân tích tiếp xúa với chúng. Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tử chất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. 1.2.2.2 Sắc ký phân bố lỏng - lỏng Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc ký phân bố lỏng - lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết, còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn. Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ở chỗ: sắc ký phân bố lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững, hiện tương trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm. 1.2.2.3 Sắc ký ion ( trao đổi ion) Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha động.Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả năng trao đổi anion gọi lá anionit. Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện , phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích. Ví dụ: phản ứng trao đổi ion giữa cationit acid mạnh và Ca2+ có thể viết như sau: 2R-SO3H + Ca2+ = (R-SO3)Ca + 2H+ Phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl- : R-N(CH3)3OH + Cl- = R-N(CH3)3Cl + OH1.2.2.4 Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở) Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kých thước cở phân tử. Các phân tử chất phân tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tuỳ theo kých thước của chúng. Các chất phân tích có kých thước lớn không thể đi vào sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giải nhanh còn các phân tử chất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kich thước nhỏ đi ra sau và ngược lại. Thời gian lưu của các chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử của chúng. Tuy nhiên chất 3

phân tích có thể có tương tác khác với pha tĩnh. Như vậy một phép sắc ký có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta không xét ở đây. 1.2.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ 1.2.3.1 Phân tích tiền lưu Các cấu tử A, B, C có ái lực với pha tĩnh là A < B<

Nồng độ

C. Cho hỗn hợp chất phân tích liên tục đi qua cột, chất phân tích có ái lực với pha tĩnh thấp nhất đi trước, tiếp C

theo là chất có ái lực yếu hơn. Tuy nhiên do chúng ta cho liên tục chất phân tích

t. V

vào nên đi sau A là A + B và A+B+C. Chỉ có một phần

Hình 1: Sắc đồ phân tích tiền lưu

chất tinh khiết A đi trước 1.2.3.2 Phân tích thế đẩy Trong sắc ký này, chúng ta cũng nạp lượng

Nồng độ

nhỏ hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột sau đó cho chất D là chất đẩy liên tục đi qua cột. Ái lực hấp thụ là

A <B < C < D. Do D đẩy C, C lại đẩy B, B lại đẩy A nên sắc đồ có dạng::

t, V

Hình 2: Sắc đồ phân tích thế đẩy (phần đậm là phần hai cấu tử xen kẽ)

1.2.3.3 Phân tích rửa giải: Đưa một lượng nhỏ mẫu bao gồm các chất A, B, C vào cột sau đó dùng chất E có ái lực hấp thụ với pha tĩnh yếu nhất để rửa giải liên tục. Cả A, B, C, E đều tan tốt trong 4

pha động . Thứ tự ái lực hấp thụ là E < A < B < C. Một câu hỏi đặt ra làm sao E có ái lực hấp thụ yếu nhất với pha tĩnh lại có thể rửa giải A, B, C ? Để trả lời câu hỏi này chúng ta hình dung là sự tranh chấp những trung tâm hoạt đông ở pha tĩnh không phải chỉ có một cấu tử chất phân tích tương tác với cấu tử chất rửa giải mà ở đây có thể có nhiều cấu tử rửa giải tham gia (câu tử có thể là ion hoặc phân tử). Giả sử có chất tan C(phân tử hoặc ion) đã hấp thụ vào pha tĩnh, để phân bố C trở lại pha động phải cần tới nhiều cấu tử rửa giải E. Quy luật ưu thế số đông xem ra có tác dụng.

Vì

vậy khi rửa giải ta

người

Chiều cao (h) Diện tích (S)

thường

chất

rửa

giải

có

nồng độ lớn hơn

chất

phân

tích

rất nhiều.

Thời gian (t) Hình 3: Sắc đồ phân tích rửa giải

Tóm lại một phép sắc ký nhìn theo cách phân loại nào cũng có thể liên quan đến một hay nhiều cách phân loại khác, thí dụ ở sắc ký lỏng- rắn chỉ đơn giản là pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng theo cách phân loại theo liên kết pha nhưng theo cách phân loại theo cơ chế thì lỏng rắn ở đây có thể là hấp phụ,trao đổi ion. Tuỳ theo pha tĩnh sử dụng, sắc ký lớp mỏng có thể là sắc ký trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, rây phân tử. Ngược lại sắc ký hấp phụ xét về mặt tương tác pha có thể thuộc loại sắc ký - rắn hay lỏng- rắn. Sắc ký rửa giải có ứng dụn Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet, tiến hành như sau: Hòa tan các sắc tố thực vật trong êt dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO3. Tiếp theo, cho liên tục êt dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắ tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt. sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chất 5

màu nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ông gọi đó là “Chromatography”. Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma” là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ đó còn giữ đến ngày nay. Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh một cách bất kỳ không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau. Các chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn. Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại, các chất được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích ở pha tĩnh chúng không di chuyển còn khi ở pha động chúng di chuyển. Vì vậy các chất phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian ở pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn. Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau. Tiếp tục chop ha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự kkhacs biệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vunhf chất của từng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình tách sắc ký. g nhiều trong lĩnh vực phân tích do hiệu quả tách cao 2. QUÁ TRÌNH TÁCH SẮC KÝ VÀ CÁC LOẠI LỰC LIÊN KẾT TRONG HỆ SẮC KÝ 2.1 Quá trình tách sắc ký Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet, tiến hành như sau: Hòa tan các sắc tố thực vật trong ete dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO3. Tiếp theo, cho liên tục ete dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắc tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt. sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chất màu nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ông gọi đó là “Chromatography”. Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma” là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ đó còn giữ đến ngày nay. 6

Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh một cách bất kỳ không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau. Các chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn. Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại, các chất được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích ở pha tĩnh chúng không di chuyển còn khi ở pha động chúng di chuyển. Vì vậy các chất phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian ở pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn. Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau.

Hình 4 :Quá trình tách A và B trong cột tách sắc ký . Tiếp tục cho pha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự khác biệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vùng chất của từng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình tách sắc ký

2.2 Các loại lực liên kết trong hệ sắc ký Trong hệ sắc ký có ba thành phân chủ yếu tác quyết định sự tồn tại của hệ, chất phân tích, pha tĩnh, pha động tạo nên sự phân bố cần thiết, giúp cho sự di chuyển các 7

chất phân tích dọc theo chiều dài cột với tốc độ khác nhau. Chúng ta thường nói chất phân tích phân bố giữa hai pha, tuy nhiên đây la cân bằng động chất phân tích luôn thay đổi pha liên kết (trừ một số trường hợp đặc biệt nó chỉ ở một pha trong suôt quá trình phân tích) vấn đề là tại sao chất phân tích được giữ trong pha tĩnh? Hơn nữa ba thành phần này tương tác như thế nào với nhau, bằngc lực liên kết nào mà kết quả các chất phân tích lại phân bố vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau? Câu trả là do bản chất các của các thành phân trong hệ sắc ký. Chất phân tích có thể là ion, phân tử trung hoá hay chất phân cực, đối tượng liên kết của nó cũng có thể là ion, phân tử, chất phân cực. Như vậy tuy thuộc vào độ lớn của điện tích kich thước phân tử, độ phân cực mà chúng tương tác với nhau theo các lực liên kết khác nhau. Người ta chia các lực liên kết thành bốn loại: 2.2.1 lực liên kết ion Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion. Đó là các phần tử có khả năng phân ly tạo thành các ion, tạo nên trung tâm hoạt động ion chung tham gia liên kết với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết ion. Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các trung tâm cation trên bề mặt, và ngược lại để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các ctrung tâm anion cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là các ion, chúng tham gia tương tác với chất phân tích và pha tỉnh. Chúng có khả năng phân li trong dung dịch tạo thành các cation và anion. Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta có thể dùng pha động là dung dịch HCl loãng. Các phương pháp sắc ký thường gặp có sự tham gia của các liên kết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion. 2.2.2 Lực phân cực Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực, chúng có thể là các lưỡng cực điện cố định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do cảm ứng. Các trung tâm phân cực của chất này liên kết với trung tâm phân cực của chất khác bằng lực liên kết phân cực. Sự phân cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ. Tuy nhiên, sự chênh lệch này là yếu tố quan trọng để có độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để phân chia chúng trong các phép tách sắc ký. Thí dụ: các Cresol (o-, m-,p- cresol) chỉ khác nhau về vị trí nhóm CH3- trong phân tử. Chính sự khác nhau về vị trí này làm cho mật độ electron trong phân tử cresol 8

khác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về độ phân cực, từ đó lực liên kết với pha tĩnh khác nhau. Là nguyên nhân chênh lệch thời gian lưu trong quá trình sắc ký 2.2.3 Lực Van- de- Van (lực phân tán) Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới phân tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực hay cố định. Tương tác phân tán điển hình là mạch hidrocacbon nó là tương tác phân tử . Thí dụ n-heptan là chất lỏng chứ không phải là chất khí sự tương tác giữa các phân tử n-heptan là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các hidrocacbon người ta dùng hidrocacbon khác làm pha tĩnh. 2.2.4 Lực tương tác đặc biệt Lực tương tác đặc biệt là lực tương tác tạo thành do các liên kết hydro, liên kết cho nhận mà có.Sự hình thành liên kết giữ nguyên tử hidro và các nguyên tử có độ âm điện cao như O, N, F... gọi là liên kết hidro. Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi là đám mây electron chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm điện lớn hơn. Như vậy các nguyên tử có độ âm điện cao hơn, liên kết hidro càng bền chặt. 3. MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ 3.1 Hệ số phân bố KD và cách xác định Cấu tử A phân bố giửa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập As

 → ← 

(1)

hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng chất phân tích giữa hai pha KD =

[ As ] (2) [ Am ]

Trong đó : [Am ] là nồng độ chất phân tích trong pha động [As ] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh Cân bằng phân bố trong pha khí gọi là cân bằng động đó là cân bằng giữa lỏng lỏng, khí-lỏng, rắn-lỏng. Giả sử chất phân tích được phân bố ở phần nào đó của cột, đĩa thứ n. Nhưng do pha động di chuyển, chất phân tích lại đi xuống đĩa thứ (n+1) và ở đây lại thiết lập cân bằng mới của cả đĩa thứ n và n+1. Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán trong pha động. Hệ số phân bố KD có thể được xác định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng

độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh sau khi đã đạt cân bằng. Một cách gần đúng KD được xác định theo công thức sau: KD =

( M − M 1 ) .V (3) M 1.m

Trong đó: M là lượng chất ban đầu tính bằng mg M1 là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc mg V là thể tích pha động ml m là lượng chât hấp thụ, gam 3.2 Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất phân tích và KD Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động. Gọi fA là phần thời gian A ở pha động:

fA =

[ A]m .Vm [ A]m .Vm + [ A]s .[V ]s

(4)

chia cả tử và mẩu cho [A]m . Vm ta có: f A =

fA =

1 1+ k 'A

1 1+ KD

VS Vm

(5)

Trong đó k’A là hệ số dung tích.Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động là: uA = u.fA = u / (1+k’A)

(7)

U là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Từ biểu thức (6) và (7) ta có nhận xét: Khi KD hoặc fA càng lớn ; thời gian chất phân tích trong pha động càng ít, nói cách khác là chất phân tích di chuyển càng chậm, ngược lại khi fA càng nhỏ, chất phân tích di chuyển càng nhanh. 3.3 Thời gian lưu tR, thời gian lưu hiệu chỉnh t’R Thời gian lưu tR là thời gian lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại.

tR =

L L (1 + k A ) = uA u

(8)

L/u là thời gian mà cấu tử không lưu giữ trên cột còn gọi là thời gian chết

 V t R A = t m  1 + K D . s Vm 

  = t m (1 + k ' A ) 

(9)

thời gian lưu hiệu chỉnh t’R là thời gian lưu không tính thời gian chết

t R' A = t R A − tm = tm .k ' ⇒

k' =

t R' VR' = tm Vm

(10) 10

3.4 Thể tích lưu Vm, thể tích lưu hiệu chỉnh V’m Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột cho đến khi pic đạt cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động ml/phút,thể tích lưu VR được tính theo công thức:VRA = tRAF; Vm = tmF VRA = Vm(1 + k’)

(11)

Thể tích lưu hiệu chỉnh VR’ là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột VR’ = VR – Vm = VmkA’ = KDAVS Thể tích lưu riêng Vg là thể tích riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh ' VRA = K DA = Vg VS

(12)

3.5 Hệ số tách α (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối) Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và tỷ số của hệ số phân bố của hai chất: một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn. Điều kiện để hai chất tách khỏi nhau là α ≠ 1 α =

k K DA = A' ≠ 1 K § DB kB

(13)

Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau. Mặt khác tỷ số thể tích lưu của hai chất, t’RA/ t’RB cũng chính là tỷ số của hệ số phân bố. Vậy có thể tóm tắt là:

α =

' k K DA t' V RA = A' = RA = ' ' K § DB kB t RB V RB

(14)

3.6 Đĩa lý thuyết và xác định số đĩa lý thuyết bằng thực nghiệm 3.6.1 Khái niệm đĩa lý thuyết: Đĩa lý thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập. Theo quan niệm của Martin và Synge, cân bằng được thiết lập nhanh chóng, tức thời. Tuy nhiên điều này gặp khó

Hình 5:Xác định số đĩa lý thuyết từ thực nghiệm 11

khăn khi giải thích hiện tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện tương pic sắc ký không cân đối. Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng đĩa được cân bằng khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại và tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ. Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cân bằng phân bố chất phân tích. Gọi n là số đĩa lý thuyết, σ là độ lệch chuẩn; σ ~

n . Đối với cột sắc ký n càng

lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, tR ~ n, nên ta có thể vết: tR

Mặt khác:

n t  hay n =  R  n σ 

w = 4 σ hay σ =

W 4

Số đĩa lý thuyết có thể viết lại là: (15) 3.6.2 Đĩa lý thuyết có tính thời gian không lưu giữ, nef n ef

(t = 16 R

n ef = 16

− tm ) 16 ' 2 16 2 '2 = t = tm k 2 2 ( R ) w W W2

t R2 k2 k2 = n . 2 w 2 (1 + k )2 (1 + k )

(16)

Vì từ (8) ta có tm= tR/(1+k’). Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu lực được tính:

Hf =

L (16) nf

Từ (15) và (16) ta có: H

L = 16

(t R

− tm

)

= H

(1 + k

k '2

)

(17)

3.7 Sắc đồ. Sắc đồ là sự biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo được có thể là độ hấp thụ quang,cũng có thể là độ dẫn điện hoặc là tần số xung điện 12

...liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu này được gọi là “ pic” sắc ký.Để tính toán hàm lượng chất phân tích, tính diện tích pic sắc ký là chính xác nhất.Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các thiết bị tÍnh diện tích của pic sắc ký một cách tự động t RB .VRB

S, h

' ' t RB ,VRB

t RA ,VRA ' t ¶' RA ,VRA

t, V t0 ¦ WA

Hình 6: Sắc đồ hai cấu tử A&B 3.8 Độ phân giải và cách làm tăng độ phân giải: 3.8.1 Độ phân giải Độ phân giải nói lên mức độ tách cấu tủ khỏi nhau trong một phép tách sắc ký. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu, tRA, tRB và rộng pic WA, WB. Độ phân giải R được tính theo công thức:

2(t RB − t RA ) WA + WB

(18)

Trong đó: tRB – tRA= ∆tR là sự chênh lệch thời gian lưu(cũng có thể dùng thể tích lưu VRA- VRB)của hai cấu tử A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộng pic, đo bằng giây hoặc mililít, nói lên khả năng tách của cột. Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: tR ~ n, chiều rộng pic tỷ lệ với Vì vậy

n n

hay

R~ L

3.8.2 Cách làm tăng độ phân giải

Cách thứ nhất: Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột. Trong phương pháp này có các biện pháp: Tăng chiều dài cột, sử dụng chất nhồi có kých thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn, thay đổi pha tĩnh và cuối cùng là giảm đường kinh cột Cách thứ hai: Dưa trên cách vận hành cột: đó là tôi ưu hoá tôc độ pha động, giảm lượng mẫu, giảm nhiệt độ cột (GC) và cuối cùng là thay đổi thành phần pha động (LC) 3.9 Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter Thuyết được các tác giả Lapidus và Amundsion đưa ra năm 1952, sau này được Van Deemter phát triển. Theo thuyết này các yếu tố: đường kýnh hạt nhồi, kỷ thuật nạp cột và các yếu tố tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnh hưởng rất nhiều tới sự giản rộng vùng chất phân tích hay độ rộng của pic trong sắc đồ. Đại lượng đặc trưng cho độ giản rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết H, được hình thành do ba thành phần H1,H2, H3. H = H1 + H2 + H3

(19)

H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho sự đồng đều của cột nhồi, đường kính của hạt nhồi, khả năng nạp cột H1 = 2λdp

(20)

Trong đó λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt thì λ= 1,5; dp là đường kính hạt nhồi H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự khuếch tán của chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu diển bằng phương trình: H2 = B/u trong đó B= 2γDm Là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó. Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của chất phân tích không quá khúc khuỷu, γ = 1; Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, như vậy H2 có thể viết lại là: H2 = 2γDm/u

(21)

H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng là yếu tố phụ thuộc vào tốc độ hấp thụ và giải hấp. Quá trình này phụ thuộc vào cả pha động và pha tĩnh, vì vậy H3 có thể viết: H3= (CS - Cm)u (22)

Trong đó Cs là hệ số dặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng của chất phân tích trong pha tĩnh, phụ thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ khi tốc độ dòng F≥1ml/phút, Cs ≈0 Cs= K.df2/Ds

(23)

Trong đó: K- hệ số Ds- hệ số khuếch tán chất phân tích trong pha tĩnh df2- chiều dày pha tĩnh Cm là hằng số chuyển khối của chất phân tích trong pha động, phụ thuộc vào pha động, được xác định theo biểu thức: Cm = βdp2/Dm

(24)

β là hệ số thực nghiệm có giá trị từ 0,5- 1 Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động. Tổng hợp lại H có biểu thức tổng quát là: H = 2λdp + 2γDm/u + (Kdf2/Ds + βdf2/Dm)u

(25)

Phương trình trên được viết tắt là: H

H = A+B/u +Cu (26)

Trong thực tế có thể tính gần đúng H= 3-4dp Để xét cực tiểu chiều

H min

B u

cao của đĩa lý thuyết lấy đạo hàm

của

phương

trình

Van Deemter ta có:

u tu

Hình 7: Đường cong Van Deemter

H’= -B/u2 +C Tại cực tiểu H’=0 => utư =

u , cm / s

B C

III. BÀI TẬP Bài 1: Trên sắc ký đồ người ta thu được 3 pic ở 0,84 phút và 10,60 phút và 11,08 phút tương ứng với các hợp chất A,B và C. Hợp chất A không lưu giữ bởi pha tĩnh lỏng. Các pic của các hợp chất B và C có dạng đường Gauss có chiều rộng tương ứng 0,56 và 0,59 phút. Chiều cao cột sắc ký bằng 28,3cm. . 1. Tính số đĩa lý thuyết (n) của cột sắc ký và chiều cao đĩa lý thuyết (H) của pic B,C. 2. Tính giá trị trung bình T và σ của cột. 3. Tính chỉ số lưu giữ của chất B,C. 4. Thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 12,3ml. Thể tích của pha động bằng 17,6ml. Hãy tính hệ số phân bố B,C. Giải: 1. Tính n và H: + Đối với pic B: 2

t   10, 60  nB = 16  RB  = 16   = 5733  0,56   WB 

+ Đối với pic C t   11, 08  nC = 16  RC  = 16   = 5643  0,59   WC 

Vậy số đĩa lý thuyết của cột tương đương 5688 đĩa lý thuyết. + Chiều cao đĩa lý thuyết: H=

L 28,3 = = 4,975.10−3 (cm) n 5688

2. Tính σ và T: Từ n =

σ2 H

⇒ σ = n.H 2 = 5688.(4, 975.10−3 ) 2 = 0, 375(cm)

Ta có: TB = TC = T=

σ .tRB L

σ .tRC L

10, 6.0, 375 = 0,141( phut ) 28,3

11, 08.0, 375 = 0,147( phut ) 28,3

0,141 + 0,147 = 0,144( phut ) 2

3. Chỉ số lưu giữ của chất B,C: 16

Ta có:

RB =

tm 0,84 = = 0, 079 t RB 10, 6

RC =

tm 0,84 = = 0, 076 t RC 11, 08

4. Hệ số phân bố B,C: Ta có: RB =

Vm V (1 − RB ) 17, 6(1 − 0, 079) ⇒ kB = m = = 16, 68 Vm + k B .VS RB .VS 0, 079.12,3

RC =

Vm V (1 − RC ) 17, 6(1 − 0, 076) ⇒ kC = m = = 17, 40 Vm + kC .VS RC .VS 0, 076.12,3

Bài 2 Tính số đĩa lý thuyết hiệu lực nef và Hef của hệ sắc ký có tính chất sau: t RA = 280 s; t RB = 300 s; WA = 14 s; WB = 15s. Thời gian chết là tm=10s, cột có chiều dài là

3,2m. Giải: Theo lý thuyết ta có số đĩa lý thuyết hiệu lực nef là: n=

n ef

k '2 ; với k’ là tỷ số dung tích. (k '+1)2

 t − tM  = 16  R   W 

 280  nA = 16   = 6400  14  2

 300  nB = 16   = 6400  15 

Từ đó ta có: Đối với pic A:

t − t k'= R M  tM

  280 − 10  =  = 27;   10  2

 27  nef A = 6400   = 5951, 07  27 + 1 

Đối với pic B:

t − t k'= R M  tM

  300 − 10  =  = 29;   10  2

 29  nef B = 6400   = 5980, 4  29 + 1 

Vậy, nef = 5065, 7 ; H ef =

300 = 0, 053 . 5965, 7

Bài 3 Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào (lúc đó của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút). Pic của chất X có dạng đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s. Độ dài của cột là 40,2cm. 1. Tính số đĩa lý thuyết trong cột. 2. Tính H của cột. 3. Tính T và σ của cột. 4. Tính chỉ số lưu giữ của chất X. 5. Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 9,9ml. Thể tích của pha động bằng 12,3ml. Hãy tính hệ số phân bố X. 6. Tiêu chuẩn phân chia X và Y là bao nhiêu nếu yếu tố phân chia đối với X và Y bằng 1,011. Giải: 1. Số đĩa lý thuyết (n): 2

t   15.60  n X = 16 RX  = 16  = 22130  24,2   WX 

2. Tính H: L L 40,2 ⇒H = = = 1,82.10− 3 (cm) H n 22130

Ta có n = 3. Tính σ và T: Từ n =

σ2 H2

Ta có: T =

⇒ σ = n.H 2 = 22130.(1,82.10 − 3 ) 2 = 0,27(cm)

σ .tR L

15.0,27 = 0,101( phut ) 40,2

4. Chỉ số lưu giữ của chất X: Ta có:

t m 1,32 = = 0,088 tR 15

5. Hệ số phân bố X (kX):

Ta có: R =

Vm V (1 − R ) 12,3(1 − 0,088) ⇒ kX = m = = 12,9 Vm + k .VS R.VS 0,088.9,9

6. Tiêu chuẩn phân chia (Rs): Ta có: RS =

n 1 (1 − ) = 4 α

22130 1 (1 − ) = 0,4 4 1,011

với α là yếu tố phân chia. Bài 4:

Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau đây: -

Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh: 25,2 cm.

Tốc độ dòng: 0,312 ml/phút.

Thể tích pha động (Vm): 1,40 ml.

Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,168 ml.

Sau khi cho qua cột một hỗn hợp chứa 4 cấu tử A,B,C và D thu được một sắc ký đồ cung cấp các dữ kiện sau: Cấu tử

Thời gian lưu giữ,phút

Chiều rộng chân pic,phút

Không lưu giữ bởi cột

1,2

4,7

0,48

8,8

0,92

12,5

1,34

13,8

1,44

Hãy tính: 1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic,giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của cột. 2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử. 3. Độ phân giải RS, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D. 4. Chiều dài cột nếu muốn đạt được độ phân giải 1,5 đối với 2 cấu tử C,D. Giải t w

1. Sử dụng phương trình : n = 16( R ) 2 tính được số đĩa lý thuyết A: n = 1534 B: n = 1463 C: n = 1392 D: n = 1469 ntb = 1500 19

σ2

L 25, 2 = = 0, 017cm ntb 1500

⇒ σ = n.H 2 = 1500.(0, 017) 2 = 0, 66(cm)

2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử. Áp dụng công thức k ' X =

t R − tm ta tính được hệ số chứa của từng cấu tử : tm

k’A = 2,9 ; k’B = 6,3; k’C = 9,4 k’D = 10. Từ công thức k ' X =

K X VS ta tính được hệ số phân bố của từng cấu tử : VM

KA = 24; KB = 53; KC = 78; KD = 87; 3. Độ phân giải RS, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D. Rs =

2∆t R = 0,94 wC + wD

α=

K D 87 = = 1,12 K C 78

4.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5 đối với 2 cấu tử C,D;k’ và α không thay đổi khi n và L tăng. Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có: Rs ,1 Rs ,2

n1 n2

⇔

0,94 1500 = ⇒ n2 = 3800 1,50 n2

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5: L2 = H.n2 = 0,017. 3800 = 65 cm. Bài 5: Cho hệ sắc ký có tính chất sau: t R = 280 s; t R = 300 s; WA = 14 s; WB = 15s. Cột có A

chiều dài là 3,2m. Thay đổi chiều dài từ 320 cm lên 400 cm. Tính độ phân giải? Giải: t RA = 280.

400 = 350( s ) 320 2

t RB = 300.

400 = 375( s ) 320 2

t   280  nA = 16.  RA  = 16   = 6400  14   WA 

t   300  nB = 16.  RB  = 16   = 6400  15   WB 

400 t  n = 16.  R  = 6400. = 8000 320 W 20

16.t 2R t  n = 16. R  ⇒ W = n W

Ta có:

16.(350) 2 = 15, 65( s ) 8000

WA =

WB =

16.(375) 2 = 16, 77( s ) 8000

2. ( 375 − 350 ) = 1,54 15, 65 + 16, 77

Bài 6 Trong sắc ký khí tốc độ di chuyển của pha động có thể đo được trực tiếp, nếu đưa vào một lượng nào đó của chất tan tương tự như metan,nó không được giữ bởi pha tĩnh. Trong cột mao quản có chiều dài 50m; thời gian lưu trữ của metan bằng 71,5s;còn thời gian giữ của n-heptadecan là 12,6 phút. Hãy cho biết: a. Tốc độ di chuyển của pha động bằng bao nhiêu? b. Tốc độ di chuyển của dải n-heptadecan bằng bao nhiêu? Giải a. Ta có L = 50 m = 5000 cm. TR = 71,5 s Vậy tốc độ di chuyển của pha động là: F=

L 5000 = = 69, 93cm / s t R 71,5

b. Đối với n-heptadecan: tR= 12,6 phút = 756 s. Vậy tốc độ di chuyển của dải là: F=

5000 = 6, 61cm / s . 756

Bài 7 Một cột sắc ký mao quản dài 30m, chạy một chất chuẩn ở hai tôc độ pha động khác nhau, cho các số liệu sau: Tốc độ (cm/s) 0,5

Số đĩa lý thuyết 150 000 120 000

Xác định vận tốc tối ưu,chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó,cho A=0. Giải TN1

H1 = 3000/150000 = 0,02 cm 21

TN2

H2 = 3000/120000 = 0,025 cm.

Ta có phương trình: B + 0, 5C 0,5 B 0, 025 = + C 1

0, 02 =

Giải phương trình ta được : C= 0,02 s ; B = 0,005 cm2/s. U tối ưu = (B/C)1/2 = 0,5 cm/s Hmin = 2(B.C)1/2 = 0,02 cm. Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là: n=

3000 = 150000 . 0, 02

Bài 8 Một cột dài 360 cm dùng để tách propan và butan bằng phương pháp sắc ký khí. Dùng thước người ta đo được khoảng cách từ lúc bơm mẫu đến đỉnh của pic sắc ký lần lượt là 152,5 mm và 415,5 mm,bề rộng chân các pic lần lượt là 13,5 mm và 33,8 mm. Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với mỗi chất. Giải t w

Sử dụng phương trình : n = 16( R ) 2 tính được số đĩa lý thuyết n(propan) = 2042 n(butan) = 2416 Chiều cao đĩa lý thuyết H =

L ta được n

H(propan) = 0,176 cm H(butan) = 0,149 cm. Bài 9 Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng phương pháp sắc ký lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm. Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5 và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05 phút. Hãy tính: 1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của cột. 2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen. Cho biết khí được sử dụng là không khí với tR(KK) = 1,2 phút (không khí được xem là cấu tử không bị lưu giữ bởi cột). 22

3. Hãy tính chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5. Giải Ký hiệu A : metyl xiclohexan B: metyl xiclohexen C: toluen. t w

1. Sử dụng phương trình : n = 16( R ) 2 tính được số đĩa lý thuyết A: n = 2902 B: n = 3025 C: n =2645 ntb = 2900 L 420 = = 0, 015cm ntb 2900

σ2 H2

⇒ σ = n.H 2 = 2900.(0, 015)2 = 0,81(cm)

2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen Rs , A− B =

2∆t R = 1,16 wA + wB

Rs , B −C =

2∆t R = 2, 70 wA + wB

3.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5. Vì Rs,A-B = 2,70>1,5 nên chỉ cần tính chiều dài để độ phân giải giữa A-B đạt yêu cầu 1,5. Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có: Rs ,1 Rs ,2

n1 n2

⇔

1,16 2900 = ⇒ n2 = 4800 1,50 n2

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5: L2 = H.n2 = 0,015. 4800 = 73 cm. Bài 10: Một phép sắc ký khí sử dụng cột dài 36 m, chạy chất chuẩn ở 3 thí nghiệm với tốc độ pha động khác nhau cho các pic có thời gian lưu và độ rộng pic như sau: 23

Thí nghiệm

u (cm/s)

tR (s)

w (s)

300

250

150

Xác định vận tốc tối ưu, số đĩa lý thuyết cho cột vận hành ở vận tốc tối ưu đó Giải : Theo phương trình Van-Deemter, muốn xác định được vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết ta cần xác định các hệ số A, B, C. Muốn vậy ta xác định số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết cho từng thí nghiệm : Ta có : L=36 m = 3600 cm 2

TN 1:

 300  n1 = 16  = 3600  20 

TN 2:

 250  n2 = 16  = 3906  16 

TN 3:

 150  n3 = 16  = 3600  10 

H1 =

3600 = 1,00(cm) 3600

H2 =

3600 = 0,92(cm) 3906

H3 =

3600 = 1,00(cm) 3600

Thay các số liệu vào phương trình trên ta có hệ phương trình sau: 1,00 = A +

B + 10C 10

0,92 = A +

B + 20C (2) 20

(1) 1,00 = A +

B + 30C (3) 30

Giải hệ gồm 3 phương trình (1), (2) và (3) ta được: A= 0,36 (cm), B = 4,8 (cm2/s) và C = 0,016 (s) Vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết được tính là :

utoiuu =

B = C

4,8 = 17,32(cm / s ) 0,016

H min = A + 2 B.C = 0,36 + 2 4,8.0,016 = 0,914(cm) n=

L 3600 = = 3939 H 0,914

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Từ Vọng Nghi , Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu – Hoá học phân tích –Tập 2 –NXB Khoa học kỹ thuật. 24

2.TS-Nguyễn Đình Lâm- Cơ sở lý thuyết và ứng dụng của sắc ký-Bài giảng. 3.TS- Nguyễn Bá Hoài Anh-Đại cương về sắc ký –Bài giảng. 4.KS-Phan Hiền Lương- Phương pháp sắc ký lỏng HPLC. 5. Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng. Phạm Hùng Việt– NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

Chương 2. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.1. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên 2 pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Quá trình sắc ký khác cơ bản với quá trình tách khác ở 2 điểm: - Sự phân bố chất phân tích lên 2 pha lặp đi lặp lại nhiều lần (hàng ngàn lần, thậm chí hàng triệu lần). - Pha động đi qua pha tĩnh.

1.2. VÀI NÉT VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Ban đầu, phương pháp được thực hiện ở áp suất thường vì chất nhồi cột có kích thước lớn. Cơ chế tách là sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố nhưng do tốc độ phát triển nhanh của phương pháp, các chất nhồi cột khác nhau ngày càng được cải tiến, hiệu quả tách của cột ngày càng được nâng cao. Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký lỏng – lỏng, sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích và được sử dụng nhiều trong lĩnh vực kiểm nghiệm, đặc biệt là trong kiểm nghiệm thuốc và hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần (cho phép định tính và định lượng).

1.3. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động. Do các chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc

độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau.

Hình: Minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký. Như vậy có thể nói HPLC là một sắc ký cổ điển đi kèm với một detectơ nhạy để phát hiện chất phân tích sau khi tách ra khỏi cột trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột tách và detectơ đã chuyển phương pháp phân tích này có một tốc độ nhanh và chính xác nhờ hệ thống bơm cao áp khoảng 300 atm nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài ml/phút. Vì vậy người ta gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Ưu điểm của phương pháp này là lượng mẫu phân tích rất ít chỉ cần khoảng 20µL/1 lần phân tích và mẫu chỉ cần hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ trong quá trình phân tích.

1.4. CÁC GIAI ĐOẠN CHẠY SẮC KÝ HPLC * Giai đoạn tách: - Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất cao (200 ÷ 500 atm). Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch (thường là hòa tan trong dung môi làm pha động). Phương pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường). - Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách → chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.

- Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau). - Kỹ thuật chạy sắc ký: + Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi). + Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục). Građient có thể là từng bậc hoặc liên tục tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn. * Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích: - Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là detectơ. - Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như : thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic, hệ số phân giải, hệ số đối xứng… + Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tính chất này

để phân tích định tính. + Độ lớn pic được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích.

1.5. CỘT TÁCH TRONG HPLC Cột tách là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký, bao gồm các vấn đề: các loại cột tách, chất liệu làm cột, kích thước cột, kích thước hạt nhồi, cách nạp cột,… Hỗn hợp các chất tan có thể được tách hoàn toàn ra khỏi nhau hay không được xác định bởi hiệu quả của cột tách và bởi độ chọn lọc của hệ pha. Do vậy điều quan trọng là phải chế tạo

được các cột tách có hiệu quả. * Cột tách trong HPLC có 3 loại: + Cột thường. + Cột mao quản. + Cột kích thước nhỏ (cột micro).

* Chất liệu làm cột: là thép đặc biệt, nếu làm bằng thủy tinh thì phải bọc thép ở ngoài vì phép sắc ký này được thực hiện ở áp suất rất cao. * Kích thước cột: Loại cột tách

Đường kính

Chiều dài

Tốc độ chảy

(mm)

(cm)

(mL/phút)

Cột thường

4,0 ÷ 4,6

15 ÷ 30

1÷2

40.000 ÷ 60.000

Cột mao quản

4,0 ÷ 4,6

4 ÷ 13

2÷4

40.000 ÷ 60.000

Cột micro

1,0 ÷ 2,0

15 ÷ 100

0,03 ÷ 1

1.000.000

Số đĩa lý thuyết

- Trong đó cột có đường kính 4.6mm được dùng nhiều nhất, chiếm 44,5%;cột đường kính 4,0 mm là 16,7% - Cột mao quản có thời gian phân tích rất ngắn, dễ thay đổi tốc độ chảy từ cột quy ước sang cột mao quản. Tuy nhiên có những bất tiện là phải trang bị thể tích cột phụ, thể tích cuvet của detector phải nhỏ, việc nhận và xử lý tín hiệu phải nhanh. - Cột micro tiết kiệm dung môi pha động.

- Kích thước của cột phụ thuộc vào chất nhồi: hạt nhồi nhỏ thì kích thước cột nhỏ, hạt nhồi lớn thì kích thước cột lớn sao cho đủ số đĩa lý thuyết để thực hiện phép tách hoàn toàn.

Hình: Cột sắc ký. * Kích thước hạt nhồi: - Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể là chất rắn hoặc chất lỏng: + Pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành chất nhồi hay cột sắc ký (các hạt chất nhồi trong pha tĩnh rắn có d = 3 ÷ 10 µm, phổ biến nhất hiện nay là 3 ÷ 7 µm). + Pha tĩnh lỏng thì được giữ trong cột sắc ký nhờ vào hạt chất mang trơ. Màng mỏng thường dùng là các loại dầu như silicon có bề dày d = 1÷3 µm, loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn. Như vậy tùy thuộc vào pha tĩnh mà ta có phương pháp sắc ký lỏng - lỏng (pha tĩnh lỏng) hoặc lỏng - rắn (pha tĩnh rắn). - Hạt chất nhồi có đường kính 30 µm thích hợp cho cột tách có đường kính trong 2 mm. Khi sử dụng chất nhồi có đường kính nhỏ hơn 10 µm, đường kính trong cột tách khoảng 3 ÷ 4 mm sẽ cho hiệu suất tách và độ lặp lại tốt. Như vậy kích thước hạt dùng trong HPLC nhỏ hơn so với sắc ký khí. - Nhằm thu được các cột tách có hiệu quả các chất nhồi được đưa vào trong cột như là lớp đồng nhất và chặt nhằm thu được sự ổn định. Ở đây một số yêu cầu đặt ra cho các chất nhồi là phân bố kích thước hạt chất nhồi cần phải hẹp và các hạt cực nhỏ hoặc cực lớn phải không

có, vì các hạt có kích thước lớn gây nhiễu loạn đáng kể sự đồng nhất quá trình nhồi, trong khi

đó các hạt quá nhỏ lại làm giảm sự thấm ướt...

Hình: Hạt nhồi trong HPLC. * Cách nhồi cột: - Trước khi nhồi, cột tách làm bằng thép không gỉ được làm sạch bằng HNO3 50%, rửa bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng axeton, clorofom rồi lại bằng axeton và cuối cùng làm khô bằng khí N2 hoặc không khí nóng. - Các phần gá lắp ở đầu và cuối cột tách với các bộ phận khác cũng rất quan trọng và làm thể tích chết ít nhất. Ở các đầu cột tách phải sử dụng các màng lọc bằng thép không gỉ, thủy tinh xốp ép, teflon xốp. Bông thủy tinh thường được dùng để ngăn các hạt nhỏ. Lỗ xốp của vật liệu làm ngăn phải nhỏ hơn kích thước các hạt nhồi ít nhất là 5 lần. - Trong thực tế có 2 cách nhồi: nhồi khô và nhồi ướt (huyền phù). Việc lựa chọn cách nhồi cột tách phụ thuộc vào kích thước của chất nhồi: + Các chất nhồi có đường kính lớn hơn 20µm thường được nhồi khô, từng phần nhỏ chất nhồi

được thêm vào cột (khoảng 0,5 ml hoặc ít hơn), vừa rót vừa gõ hoặc rung. Trong một số trường hợp có thể nối với bơm sắc ký và luyện cột ở tốc độ dòng cao và áp suất cao trong 10 phút. Cột nhồi được coi là tốt (đường kính hạt chất nhồi 30÷40 µm) ở tốc độ rửa giải 3 cm/s và chiều cao

đĩa lý thuyết của cột tách khoảng 1 mm. + Với kích thước hạt chất nhồi khoảng 10µm hoặc 5µm người ta hay sử dụng phương pháp nhồi ướt. Trong quá trình nhồi cột, huyền phù phải bền vững, không có sự sa lắng. Huyền phù bền vững khi : • Giữa các tiểu phân và chất lỏng huyền phù có tỷ trọng như nhau (phương pháp cân bằng tỉ trọng). • Độ nhớt của môi trường huyền phù lớn đến mức tốc độ sa lắng của các tiểu phân là cực tiểu (phương pháp độ nhớt cao). Các chất lỏng làm huyền phù thường được dùng là metanol, axeton, dẫn xuất halogen, 29

đioxan... hay hỗn hợp của chúng, các chất lỏng có độ nhớt cao như parafin, xiclohexano. * Ngoài ra, người ta còn sử dụng cột bảo vệ đặt trước cột phân tích để giảm thiểu sự hấp phụ bất thuận nghịch của chất tan đối với pha tĩnh và sự tắc nghẽn cột chính. Cột bảo vệ nói chung giống cột phân tích nhưng được chế tạo từ những vật liệu rẻ hơn với ý nghĩa là cột chấp nhận hi sinh để bảo vệ tuổi thọ của cột phân tích.

1.6. CÁC LOẠI PHA TĨNH THƯỜNG DÙNG TRONG HPLC 1.6.1. Nguyên tắc chọn pha tĩnh trong HPLC Chọn pha tĩnh trong HPLC sao cho: - Cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại phải được thiết lập nhanh. - Pha tĩnh có dung lượng lớn để hấp phụ một lượng lớn chất phân tích. - Khoảng áp suất làm việc tương đối rộng.

1.6.2. Các loại pha tĩnh trong HPLC * Pha tĩnh hấp phụ pha thường :

- Loại pha tĩnh này được chế tạo từ: silicagen, polime (polistiren…). - Silicagen có cấu tạo đặc biệt, xốp, bề mặt gồ ghề, có những mao quản cho nên diện tích bề mặt của silicagen lớn, trên bề mặt của nó còn có các nhóm silanol cũng có thể tham gia các liên kết với chất phân tích. Silicagen có tính axit, pH = 3 ÷ 5 nên hấp phụ tốt các chất có tính bazơ hơn là các hợp chất có tính axit. Vì những đặc tính trên mà Silicagel thường được sử dụng để tách, phân li các hợp chất thuộc họ rượu, phenol, andehit, axit hữu cơ, lipit, amin,….). Trên bề mặt của nó có chứa nhóm –OH là nhóm phân cực. Các nhóm –OH có thể tương tác rất mạnh với các phân tử có chứa nhóm chức. Độ lớn của sự tương tác phụ thuộc vào kiểu và số các nhóm chức trong các phân tử chất tan. OH

OH Si

Khi gặp những hỗn hợp phức tạp thì ta hoạt hóa nhóm –OH bằng một số nhóm phân cực: -C3H6CN, -(CH3)2-O-CH2-CH(OH)-CH2(OH), -C3H6NH2… Nhóm này là những nhóm ưa nước vì dễ tạo cầu liên kết hiđro với các phân tử nước nên làm giảm hoạt tính sắc ký pha tĩnh. - Sự lưu giữ của các chất tan trong các hệ xảy ra là do tương tác giữa các phân tử chất tan và các vị trí hoạt động trên bề mặt của chất rắn. Vì các phân tử dung môi có thể tương tác với các vị trí này, sự hấp phụ có thể coi như là quá trình cạnh tranh giữa các phân tử chất tan và các phân tử dung môi trong sự tấn công các vị trí hấp phụ trên bề mặt của chất rắn. Điều đó có nghĩa là các chất tan có mặt trong 30

pha lỏng đã thay thế một hoặc nhiều các phân tử dung môi từ bề mặt mà chính nó bị hấp phụ. - Như vậy loại pha tĩnh này thích hợp với việc tách các chất tan với các kiểu nhóm chức khác nhau hoặc số các nhóm chức khác nhau và đối với việc tách các đồng phân, miễn là các chất tan không phân cực hoặc phân cực kém bởi chúng phải hoà tan trong pha động ít phân cực. * Pha tĩnh hấp phụ pha ngược :

- Pha tĩnh là những silicagen trung tính đã được ankyl hóa các nhóm -OH trên bề mặt bằng các gốc ankyl (C3, C5, C8, C18 ..., thông dụng nhất là C18).

Vì vậy mà chất nhồi này có bề mặt không phân cực, nó thuộc loại chất nhồi kỵ nước tức là nước không làm ảnh hưởng đến bề mặt của nó. - Loại pha tĩnh này được sử dụng để tách các chất từ không phân cực đến phân cực. Vì vậy phạm vi sử dụng đa dạng, phong phú hơn. * Pha tĩnh hấp phụ trao đổi ion:

- Pha tĩnh là ionit. Ionit là những đại phân tử axit hoặc bazơ không tan trong nước và các loại dung môi, chứa bên trong mạng lưới những ion linh động có khả năng trao đổi theo

đương lượng và thuận nghịch với các ion cùng dấu trong dung dịch chất điện ly khi tiếp xúc. Ionit có thể ở dạng rắn hay dạng lỏng. + Khi ion trao đổi mang điện tích dương (ion cố định của mạng lưới không gian mang điện tích âm) thì ionit gọi là cationit. Ví dụ: R-SO3H + M+ ↔ RSO3M + H+ + Khi ion trao đổi mang điện tích âm (ion cố định của mạng lưới không gian mang điện tích dương) thì ionit gọi là anionit. + Các ionit có khả năng trao đổi cả cation và anion cùng một lúc thì được gọi là ionit lưỡng tính. Ví dụ: R-N(CH3)3OH + X- ↔ R-N(CH3)3X + OH- Ionit thể hiện tính chất như một axit mạnh (cationit axit mạnh) hoặc bazơ mạnh (anionit bazơ mạnh) có khả năng trao đổi ở mọi giá trị pH và dung lượng hấp thụ ít thay đổi theo pH. - Ionit thể hiện tính chất như một axit yếu (cationit axit yếu) có ái lực với H+ - là ion

được dùng để trao đổi của ionit – lớn hơn so với các ion khác trong dung dịch phân tích nên

cationit axit yếu không có khả năng trao đổi cation trong môi trường axit (tức chỉ làm việc ở một giá trị pH xác định) và dung lượng hấp thụ thay đổi nhiều theo pH. - Ionit thể hiện tính chất như một bazơ yếu (anionit bazơ yếu) có ái lực với OH- - là ion

được dùng để trao đổi của ionit – lớn hơn so với các ion khác trong dung dịch phân tích nên anionit axit yếu không có khả năng trao đổi anion trong môi trường bazơ (tức chỉ làm việc ở một giá trị pH xác định) và dung lượng hấp thụ thay đổi nhiều theo pH. - Cationit axit và anionit bazơ có khả năng trao đổi trung bình giữa hai loại mạnh và yếu. Cationit axit trao đổi trong môi trường từ axit yếu đến bazơ, anionit bazơ trao đổi trong môi trường từ bazơ yếu đến axit. * Pha tĩnh rây phân tử:

Pha tĩnh được chế tạo từ các vật liệu bền vững, bề măt xốp, có chứa các mao quản kích thước cỡ phân tử - kích thước mao quản phải được lựa dựa vào kích thước của các phân tử chất phân tích – như: polime tổng hợp, oxit nhôm, silicagen.

1.7. PHA ĐỘNG TRONG HPLC 1.7.1. Nguyên tắc chung để chọn pha động - Phải trơ với pha tĩnh để không làm hỏng chất nhồi. - Hòa tan được mẫu phân tích. - Bền vững, ổn định trong thời gian chạy sắc ký. - Có độ tinh khiết cao. - Phù hợp với detecto.

1.7.2. Chọn pha động phù hợp với pha tĩnh Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là một dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi được trộn theo những tỉ lệ xác định. Tuy nhiên người ta hay dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích. Tách các hỗn hợp mẫu phức tạp người ta phải dùng pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi. * Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp phụ pha thường:

- Vì pha tĩnh có chứa nhóm –OH dễ tạo cầu liên kết H với các phân tử phân cực nên pha

động cho loại pha tĩnh này là những dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như C6H6, C6H5CH3, n–hexan, CCl4. Nếu dùng dung môi phân cực sẽ làm hỏng pha tĩnh. * Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp phụ pha ngược

- Pha tĩnh không phân cực, vì vậy pha động là dung môi phân cực hoặc không phân cực, thông thường người ta lấy hỗn hợp nước với các dung môi hữu cơ tương đối phân cực làm pha

động, thường dùng nhất là: CH3OH – H2O và axetonitril – H2O với tỉ lệ thích hợp. Bảng: Chỉ số phân cực của một số dung môi hữu cơ thông dụng Stt

Pha động

Chỉ số phân cực (P’) 32

Cực đại hấp thụ (nm)

Xyclohexan

0,04

210

n-hexan

0,1

210

Cacbon tetraclorua

1,6

265

i-propyl ete

2,4

220

Toluen

2,4

286

Đietylete

2,8

218

Tetrahydrofuran

4,0

220

Etanol

4,3

210

Etyl axetat

4,4

255

Đioxan

4,8

215

Metanol

5,1

210

Axetonitrin

5,8

190

Nước

10,2

----

- Để có pha động với chỉ số phân cực trung gian chỉ cần trộn hai hay nhiều dung môi trên với tỉ lệ thích hợp tính theo công thức sau : P’(AB) = P’(A).V(A) + P’(B).V(B) Trong đó: P’(A), P’(B) lần lượt là chỉ số phân cực của A, B. V(A), V(B) lần lượt là thể tích của A, B. P’(AB) là chỉ số phân cực của hỗn hợp gồm A, B theo đúng tỉ lệ trên. - Để thay đổi hệ số chọn lọc của một cặp chất tan ta thay đổi một hoặc nhiều dung môi làm pha động. Các dung môi thường được sử dụng cho mục đích này là axetonitrin, metanol, tetrahydrofuran (THF). Để lựa chọn hệ dung môi tốt nhất ta dùng sơ đồ tam giác dung môi.

Hình: Tam giác dung môi để thay đổi độ chọn lọc của một cặp chất tan.

Sự tách được tối ưu hóa trước hết việc thay đổi tỉ lệ axetonitrin trong nước đến khi đạt

được sự phân tách tốt nhất trong thời gian phân tích cần thiết (metanol, THF cũng có thể được chọn đầu tiên). Sau đó, các hệ dung môi này được điều chỉnh (nếu cần thiết) để thành lập điểm ba của tam giác dung môi. Sự kết hợp của 4 dung môi này sẽ tạo ra 7 hệ dung môi như trên sơ

đồ. Từ đây cho phép dự đoán những thay đổi trong sự hình thành pha động để tác động đến sự tách trong quá trình sắc ký. Bảng: Sự tạo thành các pha động có hiệu năng phân tách tương đương.

* Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp phụ trao đổi ion:

- Pha động là dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo phức, chất làm chậm để làm ổn định nồng độ ion H+. - Để tách cation kim loại, dùng dung môi có độ pH thấp vì khi đó nồng độ cation H+ cao nên cation H+ cạnh tranh mạnh và đẩy cation kim loại ra. - Để tách anion, dùng dung môi có độ pH cao vì khi đó nồng độ anion OH- cao nên anion OH- cạnh tranh mạnh và đẩy anion gốc axit ra. * Pha động khi sử dụng cột sắc ký rây phân tử:

- Dung môi làm pha động là dung môi không phân cực, không chứa cation và anion.

1.8 CÁC KỸ THUẬT TÁCH Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp được dùng khá phổ biến trong phân tích hỗn hợp các chất hữu cơ, quá trình phân tích gồm 2 giai đoạn : giai đoạn tách hỗn hợp các chất và giai đoạn phát hiện. *Giai đoạn tách : hỗn hợp chất phân tích được bơm qua cột sắc ký, được lưu giữ trong cột và lần lượt rửa giải khỏi cột nhờ một pha di động chảy qua cột dưới 1 áp lực lớn. *Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích : + Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là detectơ. + Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, 34

kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như : thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic, hệ số phân giải, hệ số đối xứng. + Với 1 chất sẽ có 1 thời gian xác định đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tích chất này để phân tích định tính. + Độ lớn pic được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để phân tích định lượng theo phương pháp lập đường chuẩn hay so sánh với chất đã biết chính xác hàm lượng. HPLC là quá trình tách hỗn hợp các chất ở cột tách sắc ký và ở trạng thái lỏng. Vì vậy mà các chất phân tích muốn tách được theo phương pháp này thì trước hết phải hòa tan trong một chất lỏng nào đó mà thường là hòa tan trong dung môi làm pha động. Phương pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường). - Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành chất nhồi hay cột sắc ký, còn pha tĩnh lỏng thì được giữ trong cột sắc ký nhờ vào hạt chất mang trơ. Màng mỏng thường dùng là các loại dầu như silicon có bề dày d = 1-3 µm , loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn. Như vậy tùy thuộc vào pha tĩnh mà ta có phương pháp sắc ký lỏng - lỏng hoặc lỏng - rắn. - Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là một dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi được trộn theo những tỉ lệ xác định. Việc thực hiện tách sắc ký có thể theo 2 kỹ thuật khác nhau : + Kỹ thuật giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi. + Kỹ thuật gradient pha động (biến đổi pha động liên tục). Gradient có thể là từng bậc hoặc liên tục là tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn.

1.9. SẮC KÝ LỎNG PHA LIÊN KẾT (BPC) Trong BPC ( bonded-phase chromatography), chất phân tích có liên kết với pha tĩnh

được gọi là pha liên kết. 1.9.1 Pha tĩnh - loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silicagel. Nó có cấu tạo đặc biệt, xốp, bề mặt gồ ghề, có nhiều mao quản nên diện tích bề mặt lớn. Trên bề mặt nó còn có các nhóm silanol (OH) có thể liên kết với chất phân tích. Khi có ankylsilan kết hợp với silicagel, các nhóm ankyl khác có thể gắn vào bề mặt của nó. -Si- OH+ Si(CH3)2RCl → -Si-O-(CH3)2R + HCl R là các gốc khác nhau về số lượng cacbon và số nhóm chức. Vì vậy, pha tĩnh có thể phân cực (có chứa nhóm như -NH2; -CN...); ít phân cực hoặc không phân cực (phân tử chỉ 35

chứa hidro cacbon). Chất nhồi pha liên kết thường có độ phân cực khác nhau, được chia thành hai loại - Sắc ký pha thường - Sắc ký pha đảo

1.9.1.1 Sắc ký pha thường - Trên bề mặt của nó có chứa các nhóm -OH là nhóm phân cực. Khi gặp những hỗn hợp phức tạp thì ta hoạt hóa nhóm -OH bằng một số nhóm phân cực như: -C3H6CN; -CH2-CH(OH)CH2-OH; -C3H6NH2... Các nhóm này là nhóm ưa nước vì dễ tạo cầu liên kết hidro với các phân tử nước, vì vậy nó làm giảm hoạt tính sắc ký pha tĩnh. Loại pha tĩnh này được sử dụng để tách các chất không phân cực hoặc ít phân cực.

1.9.1.2 Sắc ký pha ngược - Là những silica trung tính đã được ankyl hóa các nhóm -OH trên bề mặt bằng các gốc ankyl (C3, C5, C8, C18..., thông dụng nhất là C18) -Si-OH + Si(CH3)2RCl → -Si-O-Si(CH3)2R + HCl - Vì vậy mà các chất nhồi này có bề mặt không phân cực, nó thuộc chất nhồi kỵ nước nghĩa là nước không làm ảnh hưởng đến bề mặt của nó. - Loại pha tĩnh này dùng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng, từ không phân cực

đến phân cực 1.9.2 Pha động * Nguyên tắc chung để chọn pha động Pha động trong HPLC được chọn tùy thuộc vào mẫu phân tích, nó có thể là dung môi

đơn hay hỗn hợp 2,3 dung môi được trộn theo những tỉ lệ nhất định. Khi chọn pha động ta phải chú ý đến những yêu cầu sau: - Phải trơ (không tác dụng) với pha tĩnh để không làm hỏng chất nhồi. - Phải hòa tan được mẫu phân tích ( để mang được chất phân tích ra) - Bền vững, ổn định trong thời gian chạy sắc ký. - Có độ tinh khiết cao - phù hợp với detector * Chọn pha động phù hợp với pha tĩnh

1.9.2.1 Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp thụ pha thường - Vì pha tĩnh có chứa nhóm -OH phân cực dễ tạo cầu liên kết hidro với các phân tử phân cực, nên pha động cho loại pha tĩnh này là những dung môi không phân cực hay ít phân cực. Nếu dùng dung môi phân cực sẽ làm hỏng pha tĩnh. - Nói chung đó là dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước như benzen; metylbenzen; n-hexan, tetraclormetan... hệ dung môi hữu cơ này dùng để tách các hidrocacbon hoặc các hợp 36

chất hữu cơ ít phân cực.

1.9.2.2 Pha động khi sử dụng cột sắc ký hấp thụ pha ngược -Vì pha tĩnh không hoặc ít phân cực nên pha động phải là dung môi phân cực hoặc hỗn hợp các dung môi hữu cơ phân cực với nước. Thường dùng nhất là metanol- nước và axetonitril- nước. -Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều hỗn hợp từ phân cực đến không phân cực. Vì vậy phạm vi sử dụng đa dạng, phong phú hơn. Bảng chỉ số phân cực của một số dung môi hữu cơ thông dụng

Stt

Pha động

Chỉ số phân cực (P') Cực đại hấp thụ (nm)

Ciclohexan

0,04

210

n-hexan

0,1

210

Carbon tetraclorur

1,6

265

Nước

10,2

---

Toluen

2,4

286

Dietyleter

2,8

218

Tetrahydrofuran

4,0

220

Etanol

4,3

210

Etylacetat

4,4

255

Dioxan

4,8

215

Metanol

5,1

210

Acetonitril

5,8

190

Để có pha động với chỉ số phân cực trung gian chỉ cần trộn hai hay nhiều dung môi trên với tỉ lệ thích hợp được tính theo công thức sau: P' (AB)= P'(A). VA+ P'(B). VB Với P' (A); P'(B) là chỉ số phân cực của A, B; VA; VB là thể tích pha trộn của A và B; P'(AB) là chỉ số phân cực của hỗn hợp gồm A, B theo đúng tỉ lệ trên. - Sự tách được tối ưu hóa trước hết việc thay đổi tỉ lệ acetonitrl trong nước đến khi đạt được sự phân tách tốt nhất trong thời gian phân tách cần thiết (metanol, THF cũng có thể được chọn đầu tiên). Sau đó, các hệ dung môi này được điều chỉnh (nếu cần thiết) để thành lập điểm ba cảu tam giác dung môi. Sự kết hợp của 4 dung môi này sẽ 37

tạo ra 7 hệ dung môi như trên sơ đồ. Từ đây cho phép ta dự đoán những thay đổi trong sự hình thành pha động để tác động đến quá trình tách sắc ký.

Bảng tóm tắt Loại

Pha tĩnh

Pha động

Chất phân tích

Pha thường

Bề mặt phân cực

Không phân cực

Tách các chất không

(nhóm -OH,...)

hoặc ít phân cực

phân cực hoặc ít phân cực như hidrocacbon; ete; aldehid; ceton...

Pha đảo

Bề mặt không phân

Phân cực hoặc hỗn

Tách các chất từ

cực (đã ankyl hóa)

hợp dung môi hữu

không phân cực đến

cơ phân cực với

phân cực

nước 1.10 SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION, SẮC KÝ CẶP ION, SẮC KÝ LỎNG LỎNG 1.10.1 Sắc ký trao đổi ion Về cơ bản sắc ký trao đổi ion và sắc ký trao đổi ion giống nhau, cơ chế tách tương tự nhau, cùng dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion. Công thức cơ bản của sắc kí trao đổi ion là: Hệ dẫn dung dịch rửa giải + cột tách trao đổi ion+ cột loại trừ + detetor độ dẫn Phản ứng loại trừ là phản ứng loại bỏ yếu tố cản trở để thu được tín hiệu của ion cần tách. Ví dụ: Khi tách các halogenua, sử dụng NaX để rửa giải (X: OH-, Br-, F-…). Nếu cho NaX đi vào detetor thì tín hiệu rất lớn, lấn át cả tín hiệu của các halogenua cần tách, vì vậy cần loại trừ tín hiệu nền đi. Sử dụng anionit dạng R-HCO3 các phản ứng như sau:

Ở cột tách:

R-HCO3 + X- + Na+

Ở cột loại trừ: R-H + Na+ +HCO3+

RX + Na+ + HCO3 RNa + H2CO3

Như vậy cả Na và X không qua detetor, chỉ có các ion halogenua cần tách đi qua và tín hiệu đo được là của chúng.

Hình 5: Sơ đồ hệ sắc kí trao đổi ion 1.Bình đựng dung dịch rửa giải ; 2: Bơm cao áp; 3: Van bơm mẫu; 4: Cột tách ;

5: Cột loại trừ;

6: Detector ; 7: Máy ghi

1.10.2 Sắc ký cặp ion Sắc ký cặp ion (SKCI) được phát triển vào năm 1970 và ngày nay vẫn được áp dụng do có những ưu điểm về khả năng thích ứng với mẫu phân tích. Khái niệm cặp vì chất phân tích và ion đối tạo thành cặp ion để tham gia vào quá trình tách sắc ký. Ion đối được đưa vào pha

động tạo cặp với chất phân tích, làm cho nó có những tính chất cần thiết phù hợp với pha tĩnh cũng như phương pháp tách. Có hai loại : SKCI pha thường và SKCI pha đảo + SKCI pha thường: là phương pháp sử dụng chất hấp thu ưa nước như silicagen, Al2O3… thậm chí silicagen đã biến tính nhưng vẫn ưa nước làm pha tĩnh. Đây là những chất hấp thu có diện tích bề mặt lớn, có các mao quản kích thước cở phân tử. Người ta còn đưa thêm vào bề mặt của chúng các axit vô cơ. Pha động là các dung môi không phân cực chứa các chất phân tích. + SKCI pha đảo: sử dụng silicagen biến tính làm pha tĩnh, ví dụ ODS hay C18, pha động là các dung môi phân cực như nước hoặc hỗn hợp các dung môi phân cực hay ít phân cực Vai trò của ion đối rất quan trọng, chúng liên kết với ion cần tách trước khi phân bố vào pha tĩnh. Chính nhờ ion đối, các chất phân tích cùng với ion đối thể hiện rõ bản chất của nó về khả năng liên kết, và điều đó dẫn đến tính chất của cặp ion bây giờ khác nhau so với ion đơn giản ban đầu. Đây là điều cần thiết của phép tách sắc ký, vì có như vậy thì hệ số phân bố của chúng mới khác nhau và chúng tách khỏi nhau.

Ví dụ: amin R-NH2 có thể tách theo cả hai phương pháp pha đảo và pha thường Để tách pha thường, pha tĩnh là lớp nước trên silicagel chứa HClO4 còn các amin trong dung môi ít phân cực, phản ứng cặp ion xảy ra như sau:

H + + ClO 4 − + R − NH 2 ⇌ R − NH 3+ ClO 4 − Chính cặp R-NH3+ClO4- tham gia liên kết với pha tĩnh khi cho pha động ít phân cực tiếp xúc vớí pha tĩnh. Các amin có các gốc R khác nhau liên kết với pha tĩnh khác nhau là cơ sở để tách khỏi nhau. Để tách pha đảo, pha tĩnh bây giờ là chất không phân cực, thí dụ ODS, pha 39

động là dung môi phân cực có chứa HclO4 0,1M / nước/ ACN. Các cặp ion amin liên kết với pha tĩnh không phân cực theo các cực liên kết khác nhau là cơ sở để tách sắc ký.

1.10.3 Sắc ký lỏng- lỏng Sự phân bố của chất tan trong hệ lỏng-lỏng được đặc trưng bằng nhiệt động học bởi phương trình:

a is aim

Trong đó : K: hệ số phân bố nhiệt động học của chất i

a i s : hoạt độ của chất tan i trong chất lỏng s a i m : hoạt độ của chất tan i trong chất lỏng m Ở sự pha loãng vô cùng của chất tan, hệ số phân bố có thể được biểu thị bằng các đại lượng phân số mol và các hệ số hoạt độ của chất tan i trong pha lỏng ứng với:

K xi =

x is fis = x i m fi m

Trong đó: Kxi : hệ số phân bố của chất tan i ở sự pha loảng vô cùng

x i s , x i m : các phân số mol của chất tan i trong pha s và m f i s ,f i m : hệ số hoạt độ của chất tan i trong pha s và m Sắc kí lỏng lỏng gồm hai kiểu pha thường và pha ngược, phụ thuộc vào pha tĩnh được sử dụng là phân cực hay không phân cực. Nếu pha tĩnh phân cực (LLC pha thường) thì bề mặt chất mang rắn cần phải phân cực và đối với pha tĩnh không phân cực (LLC pha ngược) thì bề mặt chất mang rắn phải không phân cực. Pha tĩnh được trãi căng trên bề mặt chất mang rắn như là lớp chất lỏng có bề dày đồng nhất điều này có tác dụng làm tăng sự vận chuyển khối của hai pha lỏng. Nghĩa là chất mang rắn cần phải có những tính chất hấp phụ lớn để cho pha tĩnh có thể giữ chặt nó dưới dòng chảy, nói một cách khác chất mang rắn cần phải được làm ướt dễ dàng hơn bởi pha tĩnh so với pha động. *Kĩ thuật kết tủa: Dung dịch của pha tĩnh trong dung môi hữu cơ được bơm qua cột tách

đã được nhồi trước, cột này đã được cân bằng trước với cùng dung môi hữu cơ. Khi cột đã được bơm đầy dung dịch pha tĩnh, dung môi khác ( trộn lẫn hoàn toàn với chất pha loãng nhưng không trộn lẫn với pha tĩnh) được bơm qua cột tách, pha tĩnh được kết tủa và lấp đầy các lô của chất mang. Sau đó cột tách được cân bằng với pha động bão hoà pha tĩnh. Đối với các hệ lỏnglỏng trong đó pha tĩnh biểu thị ái lực lớn đáng kể đối với chất mang và hoà tan chừng mực nào

đó trong pha động thì kĩ thuật tẩm động lực có thể được ứng dụng có kết quả.

* Kĩ thuật tẩm động lực: Pha động được bảo hoà với pha tĩnh được bơm liên tục qua cột tách đã được nhồi trước. Vì ái lực lớn với chất mang, pha tĩnh được kéo ra khỏi pha động và hấp phụ ưu tiên lên chất mang. * Kĩ thuật bay hơi dung môi: Đầu tiên chất tan được tẩm với pha tĩnh và sau đó được nhồi khô vào trong cột tách. Một lượng chính xác pha tĩnh được hoà tan vào trong chất lỏng dễ bay hơi và trộn cẩn thận với chất mang khô. Sau đó dung môi được làm bay hơi đều từ hỗn hợp trong máy bay hơi quay chân không, pha tĩnh được nằm lại trong các lô của chất mang. * Diện tích bề mặt đặc trưng của chất mang: Để cho phương pháp sắc kí lỏng lỏng thuần tuý, chất mang rắn cần phải trơ đối với các chất tan có các tính chất hấp phụ kèm theo đối với pha tĩnh, người ta thấy rằng trong thực tế có thể gặp sự hấp phụ cạnh tranh giữa chất tan và pha tĩnh trên chất mang. Mặt khác, sự hấp phụ có thể gây ra hiệu ứng dương hoặc âm đối với độ chọn lọc và điều đó làm giảm ưu điểm của độ lặp lại nhiệt động. Khuynh hướng hấp phụ chất tan trên chất rắn phụ thuộc vào bản chất và diện tích bề mặt của chất mang và vào lượng tẩm của pha tĩnh. * Lựa chọn các hệ lỏng lỏng: Về mặt lí thuyết, tất cả các tổ hợp chất lỏng, tách thành hai pha có thể được áp dụng như là hệ pha trong LLC. Tuy nhiên, trong thực tế số các chất lỏng là ít hơn do các lí do thực tiễn, chẳng hạn những chất có độ nhớt cao dễ phát hiện hoặc có hoạt tính hoá học là không chấp nhận được. Ngoài các lí do hiển nhiên này, sự phân cực khác nhau giữa hai pha lỏng là điều rất quan trọng, có tính chất quyết định để có được các cột LLC chọn lọc và bền vững. Ví dụ: Nếu độ phân cực khác nhau rất lớn thì các chất tan hoặc sẽ không bị giữ hoặc sẽ bị giữ rất mạnh trên cột. Mặt khác, độ chọn lọc nói chung sẽ cao.

-Sự khác nhau về độ phân cực không thích hợp với độ tan của các chất tan cũng làm tăng tính không ổn định của các hệ sắc kí. Không những thế, trong trường hợp này độ chọn lọc sẽ rất thấp. Do đó, trong thực tế cần phải có một sự khác nhau xác định về độ phân cực giữa hai pha để thu được một sự lưu giữ vừa phải và các cột LLC bền vững

* Ứng dụng:

- Sắ c

ký lỏng- lỏng là phương pháp phổ biến được dùng để tách nhiều chất hóa học - Sắc ký lỏng-lỏng đượng ứng dụng trong việc tách các kiểu chất tan khác nhau như các chất diệt cỏ chứa clor, các esterphosphate, các phenol, các hợp chất thơm đa vòng được

hidroxyl hóa, các chất diệt cỏ urea và các dẫn xuất 2,4-dinitrophenylhydrazon của ceton và các aldehid

1.11. DETECTOR TRONG HPLC Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp, nó bao gồm hai loại: - Loại theo dõi tính chất của pha động: Là theo dõi tính chất vật lý hay hoá học của pha

động có liên quan đến chất phân tích. Sự liên quan này được đánh giá bằng sự tăng hay giảm tính chất của pha động tỉ lệ với sự có mặt của chất tan trong dung dịch nên có thể định lượng

được. Đó là các detector chỉ số khúc xạ (RI), detector hằng số điện môi và detector độ dẫn… - Loại theo dõi tính chất của chất phân tích thông qua các phản ứng đặc trưng, detector này chỉ nhạy đối với một số tính chất hoá học hoặc vật lý của chất tan, chúng không phụ thuộc vào tỉ lệ thành phần chất rữa giải. Đó là các máy quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UVVis), máy phổ huỳnh quang, các detector điện hoá và khối phổ. 1. Detector chỉ số khúc xạ Khúc xạ là tính chất của tất cả các loại phân tử. Tuy nhiên khoảng giá trị chỉ số khúc xạ của hầu hết các chất hữu cơ và vô cơ là khá nhỏ và nó phụ thuộc đáng kể vào nhiệt độ. Do đó phương pháp đo chỉ số khúc xạ là phương pháp vạn năng nhưng không phải là phương pháp nhạy và chọn lọc, giới hạn phát hiện nằm trong khoảng 1ng-1pg. Các detector RI chủ yếu được dùng để phát hiện lượng cỡ µg của mẫu chất không hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến, không nhạy huỳnh quang, không có hoạt tính điện hoá và không dễ dàng bị dẫn xuất hoá. Nói một cách khác loại detector này ngày càng không có giá trị. 2. Detector hấp thụ tử ngoại- khả kiến UV-Vis

Đây là loại detector rất thông dụng, hầu hết các thiết bị sắc ký lỏng được trang bị loại detector này. Nó có cấu tạo gần giống với máy trắc quang bình thường, điểm khác nhau ở buồng mẫu, phần cuvet tĩnh được thay bằng Flowcell. Nồng độ chất phân tích tối thiểu có thể phát hiện được thông qua công thức:

A = log

I0 = εlC I

Trong đó: A là mật độ quang; I0 và I là cường độ của tia tới và tia truyền qua;

ε là hệ số

tắt phân tử; l chiều dày cuvet (cm);C nồng độ chất tan cần xác định (mol/L) Giới hạn phát hiện của detector UV-vis là 10-6(mol/L), ngày nay các máy có độ phân giải cao sẽ cho độ nhạy cao hơn.

Hình 2:

1: Nguồn sáng ;

Detectror UV- VIS

2: Gương ; 3,7: Các bán gương ;

5: flowcell ; 6,10: Tế bào quang điện ;

4,8: Các bộ đơn sắc

9: Bộ phận so sánh ; 11: Xử lý số liệu

3. Detector huỳnh quang Detector huỳnh quang có ưu điểm là độ nhạy cao vì bức xạ phát ra được đo đối với nền tối, nhưng được sử dụng ít hơn detector UV-vis vì chất phát huỳnh quang không nhiều. Độ chọn lọc của việc phát hiện dựa trên tính chất huỳnh quang được đặt ra do phải dùng đến hai bước sóng trong quá trình đo: bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ và đặc biệt là các hợp chất phải có cấu trúc nhất định để có khả năng phát huỳnh quang. Detector sử dụng cho các chất có khả năng phát huỳnh quang bao gồm các chất bản thân chúng phát huỳnh quang và trong cả trường hợp chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang. Nguồn kích thích có bước sóng ngắn, thường dùng đèn dơteri 190-400 nm.

Hình 3:

Detector huỳnh quang

1: Nguồn sáng kích thích ; 2,5: Các bộ đơn sắc ; 3: Bán gương ; 4: Flowcell 6,7: Các tế bào quang điện ; 8: Bộ phân xử lý tín hiệu Khi chất phân tích đi vào flowcell nhờ có ánh sáng kích thích chúng phát ra ánh sáng thứ cấp, qua bộ đơn sắc 5 và tới tế bào quang điện 6 để biến đổi thành dòng điện. Tín hiệu này

được khuếch đại và so sánh với tín hiệu từ tế bào quang điện 7, ghi lại pic nhờ bộ xữ lý 8. 4. Detector độ dẫn 43

Detector độ dẫn phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá, ví dụ một số ion kim loại chuyển tiếp như Cu2+, Ag+, Ni2+…Flowcell của detector có cấu tạo đặc biệt gồm một hệ điện cực là điện cực làm việc và điện cực so sánh, đôi khi người ta dùng thêm điện cực phụ trợ.

Hình 4:

Detector độ dẫn

1: Flowcell có gắn các điện cực 2: Điện trở ; 3: Bộ phận xử lí số liệu ; 4: Biến trở

Để đảm bảo tín hiệu của detector ổn định, phản ánh đúng nồng độ chất phân tích, dòng chảy qua flowcell phải không thay đổi vận tốc tuyến tính, điều đó có nghĩa đường kính mao quản qua flowcell càng đều càng tốt. Khi chất phân tích đi qua làm thay đổi độ dẫn diện của dung dịch đó là cơ sở để phát hiện và định lượng chúng. Để loại trừ ảnh hưởng của tín hiệu nền, thông thường người ta sử dụng các chất rửa giải có độ dẫn điện kém như axit benzoic, axit salisilic, axit phtalic …Trong điều kiện như vậy, dung dịch đi qua detector có độ dẫn điện nhỏ. Bộ phận đo và xữ lý tín hiệu sẽ cân bằng dòng điện giữa hai nhánh I và II. Khi có chất phân tích đi qua flowcell thường là các ion có độ dẫn điện tốt làm thay đổi dòng I và II. Bộ phận ghi đo sẽ ghi lại tín hiệu trên dưới dạng pic. .5. Detector bước sóng đơn Các detector bước sóng đơn dùng đèn thuỷ ngân áp suất thấp có hiệu suất năng lượng cao tại 254 nm. Các detector này đơn giản, chắc chắn, rẻ và làm việc với độ nhiễu thấp. Hạn chế chung của detector này là chất tan cần nghiên cứu phải hấp thụ ở 254 nm mà không bị các phân tử của dung môi hoặc các chất khác cản trở. Ngày nay còn có detector đa bước sóng kiểu này (dùng đèn thuỷ ngân khác cùng với bộ lọc; 365nm; có thêm đèn cadimi và kẽm). 6. Detector dùng dãy diot quang tuyến tính Ngày nay detector dãy diot quang tuyến tính là loại detector đa bước sóng được sử dụng nhiều nhất. Bộ diôt bao trùm một cách đặc trưng khoảng 190-600 nm với độ phân giải 2-5 nm. Toàn bộ quang phổ có thể nhận được chỉ trong khoảng 10 ms và cứ sau mỗi 10 ms thì quá trình

đó được lặp lại. Có thể tiến hành đo ghi đồng thời bằng cách dùng tới 8 bước sóng chọn lọc, các tín hiệu của chúng có thể được biểu diễn thành đồ thị bằng các cách khác nhau, có thể thu được các phổ hoàn chỉnh tại đỉnh pic và tại các điểm uốn. Có thể biểu thị các dự kiện dưới dạng đồ thị ba chiều hoặc hai chiều. Detector dùng dãy diot quang tuyến tính được dùng để giải quyết 44

các vấn đề sau: đánh giá pic, xác định pic chưa biết và kiểm tra pic. So với các detector hấp thụ tử ngoại- khả kiến UV-Vis loại detector này có độ nhạy thấp hơn. 7. Detector phổ khố Việc kết hợp LC và phổ khối đã đưa đến một kỹ thuật tách có độ nhạy độ chọn lọc cao. Trong mười năm gần đây người ta đã sử dụng phương pháp này để nhận biết và xác định các hợp chất khi chúng rất khó tách bằng phương pháp GC-MS. Chẳng hạn như các hợp chất có trọng lượng phân tử tương đối cao, các hợp chất không bền với nhiệt và các hợp chất phân cực, chúng thường là các hợp chất tự nhiên, các chất cặn bả môi trường, các loại thuốc và các sản phẩm phân huỷ của chúng. Có hai phương pháp sau đây được dùng để thiết kế các hệ LC-MS + Phương pháp vận chuyển: Phần chất đi ra khỏi hệ LC được tẩm vào một dây curoa hoặc dây kim loại và dung môi được loại bỏ trước khi nó được đưa đến máy khối phổ. Kỹ thuật

đưa trực tiếp cho phép đưa trực tiếp mẫu chất đã đi ra khỏi hệ LC đi vào máy phổ khối như là một vòi phun qua một mao quản dòng nhớt hoặc qua một lô hẹp 1-5 µm .Kỹ thuật này rất thích hợp cho phương pháp LC cột hẹp, cho phép đưa toàn bộ lượng chất ra khỏi hệ LC và cho phép sử dụng phương pháp ion hoá hoá học ( LC-MS tinh vi và LC-MS phun nhiệt) + Phương pháp đưa thẳng chất lỏng vào: Nó bao gồm việc làm bay hơi nhanh trong mao quản kim loại khi có mặt của muối như amoni axetat. Phương pháp này có nhiều triển vọng vì hệ rửa hữu cơ - nước có thể đưa với tốc độ 1-2 ml/phút

Hiện nay đã có một số kiểu ghép LC-MS mỗi kiểu có một giá trị riêng của nó. Các yếu tố cần đến khi phải lựa chọn một kiểu là: giới hạn phát hiện cần thiết, tính bề hay không bề của chất phân tích, tốc độ dòng chảy ra trong hệ LC…phương pháp này rất thích hợp cho phương pháp nhận biết.

1.12 TỐI ƯU HÓA MỘT PHÉP PHÂN TÍCH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Tối ưu hoá một phép sắc kí là nghiên cứu các điều kiện tối ưu để phép tách sắc kí được thực hiện hoàn toàn.

1.12.1 Chuẩn bị mẫu

Mẫu đưa vào cột tách của HPLC phải ở trạng thái lỏng do đó nếu mẫu là chất khí hay là chất rắn thì phải hoà tan bằng một dung môi thích hợp để chuyển chất phân tích về trạng thái lỏng (xử lí mẫu). Dung môi hoà tan chất phân tích thường là dung môi được chọn làm pha động. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích và mẫu chứa chất phân tích mà chọn phương pháp xử lí mẫu phù hợp.

Các phương pháp xử lí mẫu như: Kỹ thuật vô cơ hoá ướt, kỹ thuật vô cơ hoá khô, kỹ thuật khô

ướt kết hợp, các kỹ thuật chiết (chiết thông thường, chiết pha rắn, chiết pha khí, chiết siêu âm…), các kỹ thuật sắc kí, các kỹ thuật chưng cất, kỹ thuật điện phân… -

Ví dụ: Chuẩn bị mẫu để xác định hàm lượng vitamin A trong mẫu rau quả. -

Lấy 10 gam mẫu đã nghiền mịn cho

vào bình nón có nút nhám, thêm 20 gam Na2SO4khan, 1 gam MgCO3 khan, 40 mL dung môi n – hexan, lắc chiết 5 phút, để lắng, gạn lấy dung dịch. Thêm 40 mL dung môi n – hexan vào bã và lắc chiết tiếp. Lọc lấy dung dịch và gộp cả hai lần dung dịch n – hexan vào bình cất quay o chân không. Cất quay từ từ cho dung môi n – hexan bay hơi (giữ nước làm lạnh 4 C ) đến còn

độ 2 mL, để nguội, hoà tan bã sánh còn lại trong 5 mL MeOH hay n – hexan, ly tâm lấy dung dịch mẫu để xác định các chất vitamin A bằng phương pháp HPLC. Thế tich` tiêm có thể là:

20 µL,50 µL,100 µL 1.12.2. Chọn các điều kiện tối ưu * Chọn cột sắc kí:

Chọn pha tĩnh phù hợp với phương pháp sắc kí: + Sắc kí hấp phụ pha thường + Sắc kí hấp phụ pha ngược + Sắc kí phân bố lỏng - lỏng + Sắc kí trao đổi ion rắn - lỏng + Sắc kí hấp phụ rắn - lỏng + Kích thước hạt tối ưu, độ xốp. + Chiều dài cột cố định. * Chọn pha động:

Pha động được chọn phụ thuộc vào pha tĩnh. Có thể là dung môi đơn hay là hỗn hợp 2,3 dung môi trộn lẫn theo tỉ lệ thể tích nhất định để cho sự tách có hiệu quả. + Chọn pha động phải chú ý các điều kiện: + Trơ, không tác dụng với pha tĩnh (tránh làm hỏng chất nhồi). 46

+ Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc kí. + Hoà tan tốt chất phân tích để mang chất phân tích ra khỏi cột. + Phù hợp với loại detectơ đã lựa chọn. + Tốc độ của pha động. + Chất đệm pH, chất tạo phức… * Chọn detector và các thông số của nó để phép phân tích có độ nhạy cao nhất:

Tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích để lựa chọn detector phù hợp: Chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc tạo với thuốc thử để tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang thì chọn detector huỳnh quang, những chất có hoạt tính điện hoá thì phù hợp với detector độ dẫn, nếu chất phân tích có khả năng hấp thụ trong vùng tử ngoại - khả kiến thì dùng detector hấp thụ tử ngoại - khả kiến UV – Vis. Nếu không dùng được các loại detector trên thì dùng loại detector chỉ số khúc xạ RI.

* Chọn khoảng nồng độ:

Tăng liên tục nồng độ của chất biến tính trong pha động ở các hệ pha thường và pha ngược hay thay đổi pH hoặc nồng độ đối ion trong các hệ trao đổi ion: để tách các hỗn hợp phức tạp các chất tan có sự khác nhau lớn về độ phân cực trong một lần chạy sắc kí và trong một thời gian ngắn. * Tiến hành sắc kí với nhiều cột tách:

Nhằm làm giảm thời gian tách hỗn hợp chứa nhiều nhóm chất tan khác nhau rất lớn về độ phân cực và còn tối ưu độ chọn lọc bằng cách sử dụng các cột tách với các pha động khác nhau. * Chọn nhiệt độ thích hợp.

1.12.3. Bơm mẫu vào cột tách -Bơm lượng mẫu vào sao cho đủ độ nhạy của phép phân tích (chọn lượng mẫu khoảng bao nhiêu µL để bơm vào cột sắc ký ). - Chương trình gradien pha động.

1.12.4. Chọn phương pháp phân tích Dựa vào đặc điểm của chất phân tích trong hỗn hợp cần tách (phân tử lượng, khả năng hoà tan trong nước, tính chất phân cực ) mà lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp. 47

Ví dụ: - Nếu những chất có phân tử lượng lớn (M >2000): + Có khả năng tan trong nước: sử dụng phương pháp sắc kí gel, dung môi nước. + Không tan trong nước: sử dụng phương pháp sắc kí gel, dung môi hữu cơ. - Những chất có phân tử lương nhỏ (M < 2000): + Không tan trong nước: • Các chất thuộc đồng đẳng: Sử dụng phương pháp sắc kí phân bố. • Các chất là đồng phân: Sử dụng phương pháp sắc kí hấp phụ. • Các chất có kích thước khác nhau: Sử dụng phương pháp sắc kí gel. + Tan trong nước: • Không phải là hợp chất ion: Sử dụng phương pháp sắc kí phân bố pha đảo hoặc sắc kí gel, dung môi nước. • Hợp chất ion: Nếu là bazơ thì sắc kí trao đổi cation, còn nếu là axit thì sắc kí trao đổi anion. • Có hợp chất ion và hợp chất không ion: Sắc kí pha đảo tạo cặp ion.

1.13. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ SỰ GHÉP NỐI CỦA HPLC VỚI KHỐI PHỔ 1.13.1. Sơ đồ máy HPLC

Hình 1: Giới thiệu hệ thống HPLC

Hình 2: Sơ đồ chức năng thiết bị HPLC

Trong đó * Dung môi rửa giải (hay pha động bởi vì nó di chuyển) Trong sắc ký pha thường, pha động là các dung môi không phân cực như benzen, nhexan, toluen … Trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực có thể là nước, metanol, axetonitril … 49

Tuy nhiên, người ta thường dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích.

* Bơm cao áp (hệ thống quản lý dung môi) Bơm cao áp là dụng cụ để bơm pha động qua cột tách với 1 tốc độ dòng xác định, phù hợp với quá trình rửa giải các chất ra khỏi cột tách sắc ký, thường với tốc độ mL/phút. Có nhiều loại bơm cao áp nhưng hai loại hay được sử dụng là bơm màng tức là nén dung dịch qua màng và bơm pittong là nén trực tiếp bằng pittong . Bơm nén qua màng có ưu điểm là ngăn pittong và ngăn dung môi riêng nên dầu không

ảnh hưởng đến dung môi. Để tạo được dòng dung dịch một chiều, người ta dùng các viên bi.

Hình 3: Bơm cao áp sử dụng màng (bơm màng)

Bơm pittong chỉ có một ngăn, có nghĩa là dung môi tiếp xúc với pittong và xilanh, như vậy vật liệu để làm bơm phải chịu mài mòn và hóa chất để không làm bẩn dung môi. Để tạo

được dòng dung dịch một chiều, người ta dùng các viên bi.

Hình 4: Bơm cao áp kiểu pittong

* Van tiêm mẫu (van bơm mẫu)

Van bơm mẫu là thiết bị rất quan trọng trong hệ sắc ký. Nó có chức năng nạp từng lượng chính xác dung dịch chất phân tích vào đầu cột, đồng thời chịu được áp suất cao và trơ với hóa chất. Van bơm mẫu thông dụng có 6 cửa, có vòng mẫu dung tích khác nhau từ 5 µ L ÷ 50 µ L.

(a) Van bơm mẫu ở vị trí nạp mẫu

b) Van bơm mẫu ở vị trí phun mẫu Hình 5. Van bơm mẫu

* Cột tách Cột tách có thể được làm bằng thép hay thủy tinh thạch anh có vỏ bọc bằng thép để chịu

được áp suất cao trong vòng từ 200 ÷ 500 atm. Kích thước của cột phụ thuộc vào cỡ hạt chất nhồi có trong cột, cỡ hạt chất nhồi lớn thì kích thước cột lớn, cỡ hạt chất nhồi nhỏ thì kích thước hạt nhỏ, để sao cho đảm bảo đủ số đĩa lý thuyết

để thực hiện phép tách đạt hiệu suất cao. Chất nhồi có kích thước 3 ÷ 10 µ m thì cột có chiều dài 3 ÷ 6 cm. Chất nhồi trong cột tách được gọi là pha tĩnh.

* Detector Detector là bộ phận thu nhận tín hiệu chất phân tích theo 1 tính chất hóa học, vật lý, hóa lý nào đó.

Một số detector được sử dụng như: detector UV-VIS, detector huỳnh quang, detector bắt

điện tử, detector đo độ dẫn điện …(Xem rõ hơn ở mục detectơ).

* Bộ phận ghi nhận kết quả Bộ phận ghi nhận kết quả là một máy tính chuyên dụng, tự vẽ đồ thị, xử lý số liệu, tính toán kết quả …

* Bình thải Pha động sau khi thoát ra khỏi detector, sẽ được chuyển tới bình thải.

1.13.2.Ghép nối HPLC với khối phổ(LC-MS) Sự ghép nối HPLC với khối phổ cho phép người ta định dạng và xác định một số hợp chất mà với phương pháp sắc ký – khối phổ không thực hiện được, ví dụ như xác định hợp chất có khối lượng phân tử tương đối cao, các hợp chất không bền nhiệt, các hợp chất phân cực cao, một số dươc phẩm,…

Hình 6.Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 3 tứ cực

1.14. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tương ứng đã được lựa chọn có một thời gian lưu xác

định. Vì vậy để thời gian lưu là tiêu chuẩn để phân tích định tính chất phân tích bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp. Nguyên tắc:

Chạy sắc kí mẫu chuẩn theo những điều kiện tối ưu đã lựa chọn để xác định thời gian lưu của từng chất trong mẫu đó. Sau đó chạy mẫu phân tích cũng trong những điều kiện như chạy mẫu chuẩn và so sánh thời gian lưu để kết luận sự có mặt của từng chất.

Hình 6: Sơ đồ phân tích định tính

Qua sơ đồ trên ta thấy mẫu phân tích có B và C.

1.15. PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Tín hiệu đo là diện tích của pic hay chiều cao của pic. Để tiến hành định lượng chất phân tích, người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân tích có độ tinh khiết cao. Tiến hành khảo sát chất chuẩn để tìm

điều kiện đo của chất chuẩn, mẫu giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế. Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì diện tích (chiều cao) của pic tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích: S = K.C (S: diện tích của pic) h = K.C (h: chiều cao của pic) Các phương trình này dùng để định lượng chất phân tích bằng HPLC, thường người ta dùng diện tích của pic để độ chính xác cao hơn. 53

Có nhiều phương pháp để định lượng chất phân tích, cụ thể:

1.15.1. Phương pháp ngoại chuẩn Tuỳ thuộc vào tính chất của mẫu: hàm lượng, yếu tố cản trở, tính chất phức tạp của nền cũng như

độ chính xác yêu cầu mà người phân tích có thể áp dụng các cách định lượng khác nhau: Chuẩn hoá một điểm và chuẩn hoá nhiều điểm.

Chuẩn hoá một điểm - Nguyên tắc:

Chuẩn hoá một điểm là sử dụng một phép đo của chất chuẩn đã biết trước nồng độ, đo độc lập và song song với phép đo chất cần phân tích. - Phương pháp này thường áp dụng:

+ Đối với chất phân tích có hàm lượng lớn hoặc đã làm giàu đến mức độ cần thiết. + Để đánh giá khi không yêu cầu độ chính xác cao vì ở đây đã bỏ qua các yếu tố cản, các sai số ngẫu nhiên có thể làm giảm tính chính xác của phép đo. + Nồng độ của chất phân tích Cx phải nằm trong khoảng tuyến tính. - Phương pháp:

Sử dụng hai phép đo độc lập: + Phép thứ nhất: Chạy sắc kí chất chuẩn trong điều kiện tương tự chất phân tích (nền và các thông số khác giống nhau). + Phép thứ hai: Chạy sắc kí chất phân tích. - Kết quả tính như sau:

h,S hc hx

Hình 7: Chuẩn hoá một điểm

C x Cc C C = ⇒ C x = c h x hay: C x = c Sx hc hc Sc Ta có: h x Chuẩn hoá nhiều điểm (phương pháp đường chuẩn) - Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau trong điều kiện tương tự mẫu phân tích. Tiến hành phép tách sắc kí và tính diện tích của pic đối với dãy chất chất chuẩn. Sau đó dựng

đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của pic vào nồng độ chất phân tích. Để xác định nồng độ chất phân tích Cx ta cũng thực hiện phép đo đối với chất phân tích, được Sx (hx) nhất định, đối chiếu với đường chuẩn ta có nồng độ chất phân tích trong mẩu.

Hình 8: Đường chuẩn nhiều điểm xác định chất phân tích Phương pháp này có ưu điểm là sau khi đã dụng đường chuẩn rồi thì có thể sử dụng để phân tích hàng loạt trong cùng điều kiện được khảo sát. Nếu hàm lượng chất phân tích quá bé nằm dưới giới hạn của đường chuẩn thì phải sử dụng phương pháp làm giàu để tăng nồng độ của chất phân tích để nó nằm trong vùng tuyến tính. Trong nhiều trường hợp mẫu phân tích có thành phần phức tạp, chúng ta chưa biết chính xác nên không thể chuẩn bị dãy mẫu đầu thoả mãn những quy định cho phương pháp này do

đó không xác định chính xác vị trí của đường chuẩn, vì vậy kết quả phân tích mắc sai số lớn. Trường hợp này không nên sử dụng phương pháp đường chuẩn mà tốt nhất là sử dụng phương pháp thêm chuẩn

để xác định nồng độ của chất phân tích trong mẫu. 1.15.2. Phương pháp thêm chuẩn - Nguyên tắc của phương pháp này là dùng ngay mẫu phân tích làm nền để chuẩn bị dãy mẫu đầu. - Chuẩn bị mẫu: Lấy một lượng mẫu phân tích nhất định (Cx) rồi thêm vào đó những lượng chính xác chất cần xác định vào C1, C2, C3, C4, C5 ta được dãy mẫu đầu có hàm lượng chất xác định là:

Co = C x C I = C x + C1 55

C II = C x + C 2 C III = C x + C3 C IV = C x + C 4 C V = C x + C5 - Tiến hành phép tách sắc kí và tính diện tích (chiều cao) của pic đối với dãy mẫu đầu. Sau đó dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của pic vào nồng độ chất phân tích. h,S

Ao Cx

0 C1 CxC2 C3 C4

Hình 9: Đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn Xác định Cx bằng phương pháp ngoại suy: Kéo dài đường chuẩn về phía trái, đường này cắt trục hoành tại điểm Cx, đoạn OCx chính bằng giá trị nồng độ Cx cần tìm. Cũng có thể xác định Cx bằng cách từ gốc toạ độ O kẻ một đường thẳng song song với đường chuẩn, từ điểm Ao kẻ một đường thẳng song song với trục hoành, hai đường này cắt nhau tại điểm M, từ M hạ đường vuông góc xuống trục hoành.

Điểm cắt này là Cx. Đoạn OCx chính bằng giá trị nồng độ Cx cần tìm. Phương pháp này có ưu điểm là quá trình chuẩn bị mẫu dễ dàng, không cần có nhiều hoá chất có

độ tinh khiết cao để chuẩn bị dãy mẫu đầu. Mặt khác lại loại trừ hoàn toàn ảnh hưởng về thành phần của mẫu cũng như cấu trúc vật lí của mẫu, những sai số ngẫu nhiên do thao tác… Phương pháp này xác

định được hàm lượng chất phân tích ở nồng độ bé mà phương pháp đường chuẩn không phân tích được và cho độ chính xác cao, được nhiều người sử dụng. Nhưng phải chú ý rằng, nồng độ thêm của chất chuẩn phải theo từng bậc và khoảng cách của các bậc đó phải xấp xỉ bằng Cx thì phần nội suy tuyến tính mới chính xác.

1.15.3. Phương pháp nội chuẩn

Trong mẫu, các chất phân tích có thể bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố: ảnh hưởng nên, các điều kiện khác gây sai số hệ thống. Để loại trừ ảnh hưởng này người ta thêm vào mẫu chất nội chuẩn có tính chất gần giống tính chất của chất phân tích, có nồng độ cũng gần bằng nồng độ của chất phân tích (Cx). Tiến hành 3 phép đo sắc kí: một phép cho chất chuẩn nội, một phép cho chất chuẩn có nồng độ xác định (từ các chất chuẩn), từ đó rút ra được hệ số ảnh hưởng Fx, phép sắc kí thứ 3 cho chất phân tích chưa biết và từ đó tính ra nồng độ của nó. Hệ số Fx chính là đại lượng đưa vào để loại trừ ảnh hưởng của nền cũng như các điều kiện đo khác.

Hình 10: Phương pháp chuẩn nội xác định chất phân tích

C c Ci C .h : = F x→ F x= c i hc hi h c .Ci . C x Cc C = → C x = i .h x .Fx h x hc hi 1.15.4. Phương pháp vi sai - Phương pháp vi sai nồng độ lớn: Chuẩn bị mẫu: Dung dịch chuẩn 1: C1 Dung dịch chuẩn 2: C2 (C2 > C1) Dung dịch phân tích: Cx (Cx > C1) Tiến hành phép tách sắc kí dung dịch chuẩn 2 và dung dịch phân tích trên nền dung dịch chuẩn 1 và tính diện tích (chiều cao) của pic:

S21 = S2 − S1 , Sx1 = Sx − S1 . Ta có:

C x − C1 Sx1 S = → C x = x1 ( C 2 − C1 ) + C1 C 2 − C1 S21 S21 . 57

- Phương pháp vi sai nồng độ bé: Chuẩn bị mẫu: Dung dịch chuẩn 1: C1 Dung dịch chuẩn 2: C2 (C2 < C1) Dung dịch phân tích: Cx (Cx < C1) Tiến hành phép tách sắc kí dung dịch chuẩn 1 trên nền dung dịch chuẩn 2 và và dung dịch phân tích. Tính diện tích (chiều cao) của pic:

S12 = S1 − S2 , S1x = S1 − Sx . Ta có:

C1 − C x S1x S = → C x = − 12 ( C1 − C 2 ) + C1 C1 − C 2 S12 S1x . Phương pháp này sử dụng xác định các chất có nồng độ quá lớn hoặc quá bé.

Phần 2 BÀI TẬP VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Bài 1: Hàm lượng fluoranthene (PAHs - một loại hirocacbon đa vòng thơm) trong dầu có thể được xác định bằng phương pháp HPLC với detector UV/Vis sau khi được chiết bằng metylenclorua. Lấy 2,03g dầu thô xử lý bằng 20,00ml metylenclorua, lọc bỏ chất rắn không tan; lấy 1ml dung dịch sau khi lọc pha loãng thành 10ml với axetonitrin. Lấy5 µ l dung dịch thu được phân tích bằng HPLC thì PAHs cho tín hiệu pic 0,2170 (diện tích pic hay chiều cao pic). 5 µ l dung dịch chuẩn chứa fluoranthene 20.0 ppm được phân tích trong cùng điều kiện, dấu hiệu pic tương

ứng là 0,2580. Xác định hàm lượng PAHs trong dầu theo ppm.

Fluoranthene(PAHs)

Bài giải: 58

- Ta biết, diện tích pic S (hay chiều cao H tương ứng) tỉ lệ thuận tuyến tính với nồng độ chất phân tích theo phương trình: S = kC + Với dung dịch chuẩn ta có: S1 = kC1 + Với mẫu phân tích : Sx = kCx (phân tích ở cùng điều kiện nên xem như cùng giá trị - Suy ra:

S1 C1 S2 0, 217 = = 20. = 16,8 ppm ⇒ C x = C1 S2 Cx S1 0, 258

- Khối lượng PAHs trong mẫu: 16,8 ( µ g/ml).10.20 = 3360 µ g - Nồng độ PAHs trong mẫu:

3360 = 1670 ppm 2, 013

Bài 2: Thành phần của đa vitamin được xác định hiệu quả bằng phương pháp HPLC với detector UV – Vis. 5µl mẫu chuẩn có chứa 170 ppm vitaminC, 130 ppm niacin, 120ppm niacinamide, 150ppm pyridoxine, 60ppmm thiamine, 15 ppm axit folic và 10ppm riboflavin phân tích bằng HPLC, các tín hiệu lần lượt là 0,22, 1,35, 0,90, 1,37, 0,82, 0,36 và 0,29. Chuẩn bị mẫu vitamin, nghiền thành bột và chuyển vào bình dung tích 125ml có chứa 10ml dung dịch NH3 1% (v/v) trong dimethy sulfoxide. Sau khi khoáy trong 2 phút, thêm vào 90ml CH3COOH 2%, khoáy hỗn hợp trong một 1 phút, làm nóng ở 400C trong 5 phút, lọc bằng phễu. Lấy 5µl mẫu đo bằng HPLC thu được các tín hiệu phổ 0,87 ứng với vitaminC, 0,00 ứng với niacin, 1,40

ứng với niaciamide, 0,22 ứng với pyridoxine, 0,19 ứng với thiamine, 0,11 ứng với axit folic và 0,44 ứng với riboflavin. Tính số miligam ứng với mỗi loại vitamin có trong mẫu phân tích.

Bài giải: - Áp dụng công thức:

S = kC cho từng vitamin ta có:

 S0 = kC0 S 0,87 ⇒ C x = C0 x = 170. = 672, 27 ppm S0 0, 22  S x = kC x

+ VitaminC : 

Vậy khối lượng vitaminC trong mẫu : 672,27( µ g/ml).100(ml) = 67227 µ g hay 67,227mg.

 S0 = kC0 S 0 ⇒ Cx = C0 x = 130 =0 S = kC S 1,35  x x 0

+ Niacin: 

Vậy khối lượng Niacin trong mẫu bằng 0

 S0 = kC0 S 1, 4 ⇒ Cx = C0 x = 120. = 186, 667 ppm S0 0,9  S x = kCx

+ Niacinamide : 

Vậy khối lượng niacinamide trong mẫu : 186,667.100 = 18666,7 µ g hay 18,6667mg + Tương tự ta có khối lượng các vitamin còn lại trong mẫu: mpyridoxide = 2,4mg mthiamine = 1,390mg 59

maxit folic = 0,0463mg mriboflavin = 1,517mg

Bài 3: Hàm lượng cafein trong thuốc ngủ được xác định bằng phương pháp HPLC, sử dụng phương pháp đường chuẩn. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và phân tích 10µl, kết quả thu được: Nồng độ (ppm)

max (nm)

50,00

8354

100,00

16925

150,00

25218

200,00

33584

250,00

42002

Chuẩn bị mẫu bằng cách cho một viên thuốc ngủ vào một bese, thêm vào đó 10ml methanol. Sau khi thuốc tan, chuyển vào bình có dung tích 25ml; tiếp tục pha loãng đến thể tích bằng metanol; lọc lấy dung dịch. Lấy 1ml dung dịch trên pha loãng thành 10ml bằng metanol, tiến hành phân tích bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao – HPLC, dấu hiệu của chất cafein được phát hiện ở bước sóng 21469nm. Xác định số miligam cafein trong viên thuốc.

Bài giải: - Xử lý số liệu trên ta được phương trình đường thẳng:

λmax = λmax (C ) = 167, 91C x + 30,1

(*)

- Hàm lượng cafein trong thuốc: Thay λmax = 21469 vào (*) ta được: Cx = 127,68 ppm. - Khối lượng cafein: 127,68( µ g/ml).10ml.25ml = 31920 µ g hay 31,920 mg - Kết luận: mcafein = 31,920 mg

Bài 4: Kagel và Farwell đã định lượng nồng độ của axit acetylsalicylic(ASA) và caffein (CAF) trong thuốc ngủ bằng phương pháp sắc kí lỏng pha ngược, dùng axit salisylic (SA) làm chất nền. Dãy mẫu chuẩn được chuẩn bị bằng cách cho ASA và CAF vào bình dung tích 250ml, thêm tiếp vào 100ml metanol, thêm tiếp 10ml axit salisylic vào mỗi bình. Kết quả thu được tương ứng từ các mẫu chuẩn như sau: M ẫu

ASA CAF Tỉ số chiều cao pic Tỉ số chiều cao pic (miligam) (miligam) ASA/SA CAF/SA 01 200,00 20,00 20,5 10,6 02 250,00 40,00 25,1 23,0 03 300,0 60,00 30,9 36,8 Hòa tan viên thuốc ngủ bằng 100ml metanol, thêm tiếp vào dung dịch đó 10ml dung

dịch nền, lọc lấy dung dịch. Phân tích mẫu thu được tỉ số chiều cao của pic như sau: ASA/SA = 23,2 và CAF/SA = 17,9. 60

Xác định số miligam ASA và CAF trong viên thuốc.

Bài giải: - Dùng phương trình H(S) = kC H1 20,5 = = 0,1025 C1 200 H 25,1 H2 = k2C2 ⇒ k2 2 = = 0,1004 C2 250 H 30, 9 H3 = k3C3 ⇒ k3 = 3 = = 0,103 C3 300 k +k +k 0,1025 + 0,1004 + 0,103 = 0,1019 ⇒k= 1 2 3= 3 3 ⇒ H= k C

H1 = k1C1 ⇒ k1 =

- Hàm lượng ASA : thay H = 23,2 vào phương trình trên ta được:

C ASA =

H 23, 2 = = 227, 6742 miligam k 0,1019

- Tương tự, hàm lượng CAF trong thuốc ngủ là :

CCAF =

31,312 miligam

Bài 5: Bohman dùng sắc ký lỏng cao áp – HPLC pha ngược để phân tích định lượng vitamin A trong thực phẩm bằng phương pháp thêm chuẩn. Lấy 10,067g mẫu ngủ cốc cho vào bình dung tích 250ml, thêm vào 1g natri ascorbate, 40 ml etanol và 10ml KOH 50%. Sau khi khuấy 30 phút, tiếp tục thêm vào 60ml etanol. Vitamin A sau đó được chiết ba lần bằng100ml hexan, sau

đó làm bay hơi, phần còn lại chứa vitamin A được chuyển vào bình 5ml và pha loãng bằng metanol. Dung dịch thêm chuẩn pha từ 10,093g ngủ cốc xử lý ở cùng điều kiện trên và thêm vào 0,02mg vitamin A. Đo mẫu và dung dịch chuẩn bằng HPLC thu được diện tích pic tương

ứng là 6,77.103 và 1,32.104. Xác định số mg vitamin A trong 100g ngủ cốc. Bài giải: - Ta có : S = k.C Cx là hàm lượng vitamin A trong 10,067g mẫu, suy ra với 10,093g mẫu hàm lượng vitamin A sẽ là: C x

10, 093 = 1, 00258C x = C’ 10, 067

- Với dung dịch phân tích: Sx = kCx - Với dung dịch chuẩn: S’ = k(C’ + 0,02)

⇒

Sx Cx S Cx 0, 02 S x = ⇒ x = ⇒ Cx = S ' 1, 00258C x + 0, 02 S '− 1, 00258S x S ' C '+ 0, 02

⇒ Cx =

0, 02.6, 77.103 = 0, 0211 mg (1,32.104 − 1, 00258.6, 77.103 )

- Hàm lượng vitamin A trong 100g thực phẩm là: 0, 0211.

100 = 0, 209mg 10, 067

- Kết luận: mvitamin A = 0,209 mg.

Bài 6: Hai chất A, B có thời gian lưu tương ứng là 16,40 và 17,63 phút. Chất không lưu giữ ở cột mất 1,30 phút. Bề rộng chân pic của chất A là 1,11; chất B là 1,21 phút. Tính: 1.Độ phân giải cột 2.Số đĩa lý thuyết trung bình của cột 3. Chiều cao đĩa, biết cột dài 30,0cm 4. Chiều dài của cột để đạt độ phân giải 1,5 5. Thời gian cần để rửa giải chất B ở cột dài hơn.

Bài giải: 1.Độ phân giải cột: Ta có : R =

2(t RB − t RA ) 2(17, 63 − 16, 40) = = 1, 060 wA + wB 1,11 + 1, 21

2. Số đĩa lý thuyết trung bình 2

 16, 4  t  N A = 16  RA  = 16   = 3493 đĩa lý thuyết w  1,11  2

 17, 63  N B = 16   = 3397 đĩa lý thuyết  1, 21  ⇒N=

3493 + 3397 = 3445 đĩa lý thuyết 2

3. Chiều cao của đĩa: HA =

L 30 = = 0, 00858cm N A 3493

HB =

L 30 = = 0, 00883cm N B 3397

⇒ H = 8, 7.10−3 cm

4. Chiều dài cột: Tacó: ⇒

N =

2 R (t RA + t RB ) 2.1,5(17, 63 + 16, 40) = = 83 ⇒ N = 6889 t RA − t RB 17, 63 − 16, 40

⇒ L = H .N = 8, 7.10−3.6889 = 60cm . 5. Thời gian để rửa giải B lâu hơn: 1,3 + 16,40 +17,63 = 35,33 phút.

Bài 7: Trong quá trình tiến hành sắc ký một hỗn hợp chất phân tích gồm 3 chất X, Y, Z trong cột sắc ký có chiều dài 28,3 cm. Người ta thu được trên sắc đồ 3 pic tương ứng với thời gian lưu: 0,84 phút, 10,60 phút, và 11,08 phút tương ứng với 3 cấu tử X, Y, Z. Các pic này đều có

dạng đường Gauss, độ rộng pic của Y và Z lần lượt là WY = 0,56 phút và WZ = 0,59 phút, còn chất X không được lưu giữ bởi vật liệu cột. 1. Tính số đĩa lý thuyết trung bình và chiều cao đĩa theo pic Y và Z. 2. Tính số đĩa lý thuyết hiệu lực trung bình của cột sắc ký. 3. Tính hệ số lưu giữ tương đối giữa Y và Z. 4. Thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt chất mang của cột là 12,3 ml. Thể tích pha động bằng 17,6 ml. Tính hệ số phân bố của Y và Z.

Bài giải: 1. Tính số đĩa lý thuyết trung bình ( n ) và chiều cao mỗi đĩa (H) theo pic Y và Z.

 t * Số đĩa lý thuyết: n = 16 R W 

   

(1) 2

 10,6  - Đối với cấu tử Y: nY = 16  = 5733  0,56  2

 11,08  - Đối với cấu tử Z: nZ = 16  = 5643  0,59 

⇒ Số đĩa lý thuyết trung bình : n = * Chiều cao đĩa trung bình:

nY + n Z 5733 = = 5688 2 5643

L 28,3 = = 4,975.10 −3 (cm) n 5688

 t R − tm  2. Số đĩa lý thuyết hiệu lực của cột sắc ký: n f = 16.    W 

 10,60 − 0,84  - Cấu tử Y: n fy = 16  = 4860 0,56   2

 11,08 − 0,84  - Cấu tử Z: n fz = 16  = 4820 0,59   ⇒ Số đĩa lý thuyết hiệu lực trung bình: n f =

4860 + 4820 = 4840 2

3. Tính hệ số lưu giữ tương đối giữa Y và Z:

α=

t ′RY t RY − t m 10,06 − 0,84 = = = 0,900 ′ t RZ t RZ − t m 11,08 − 0,84

4. Ta có :

 t −t  n f = 16.  R m   W  t R = t m (1 + K D .

Vs ) Vm

(2) ⇒

tm =

(3)

V 1+ KD. s Vm

Thay (3) vào (2) ta được:

tR   tR − V  1+ KD. s  Vm n f = 16. W    

  Vs   2 KD.  Vm  tR      = 16.  W  1 + K . Vs   D  Vm   

     

(4)

Thay (1) vào (4) ta được: V   KD. s Vm n f = n.  Vs 1+ KD. Vm  - Xét cấu tử Y:

- Xét cấu tử Z:

   ⇒ K = D   

K DY =

K DZ =

nf n

Vm × Vs

4860 17,6 × × 5733 12,3

4820 17,6 × × 5643 12,3

1 1−

nf n

1 4860 1− 5733

1 4820 1− 5643

= 16,62

= 17,45

Bài 8: (Trang 67, sách“Bài tập và sổ tay phân tích định lượng”, Nguyễn Thị Thu Vân) Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau: - Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh (L): 25,2 cm. - Tốc độ dòng của pha động (F): 0,312 ml/phút. - Thể tích pha động (Vm): 1,40 ml. - Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,168 ml. Sau khi cho qua cột một hỗn hợp chứa 4 cấu tử A, B, C, D thu được một sắc ký đồ cung cấp các dữ kiện sau: C ấu t ử

Thời gian lưu giữ tR (phút)

Không lưu giữ bởi cột

1,2

4,7

0,48

8,8

0,92 64

Chiều rộng chân pic W (phút)

12,5

1,34

13,8

1,44

Hãy tính: 1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, số đĩa lý thuyết trung bình của cột, độ lệch chuẩn của số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết của cột. 2. Hệ số dung tích và hệ số phân bố của từng cấu tử. 3. Độ phân giải R, hệ số tách α đối với 2 cấu tử C và D. 4. Chiều dài cột nếu muốn đạt độ phân giải 1,5 đối với 2 cấu tử C,D.

Bài giải: 1. - Tính số đĩa lý thuyết (n) đối với mỗi pic:  t Áp dụng phương trình: n = 16 R W 

  ( với tR là thời gian lưu, W là chiều rộng của pic)  

 4,7  Đối với pic A: nA = 16  = 1534  0,48  2

 8,8  Đối với pic B: nB = 16  = 1464  0,92  2

 12,5  Đối với pic C: nC = 16  = 1392  1,34  2

 13,8  Đối với pic D: nD = 16  = 1469  1,44 

- Số đĩa lý thuyết trung bình của cột: ntb = 1465 - Chiều cao đĩa lý thuyết của cột: H =

L 25,2 = ≈ 0,017(cm) ntb 1465

- Độ lệch chuẩn của số đĩa lý thuyết của cột: Từ n =

σ2 H2

⇒ σ = n.H 2 = 1465.0,017 2 = 0,651(cm)

2. - Hệ số dung tích của từng cấu tử (k’X): k ′X =

Đối với cấu tử A: k ′A =

tR − tm tm

4,7 − 1,2 = 2,92 1,2

Đối với cấu tử B: k B′ =

8,8 − 1,2 = 6,33 1,2

Đối với cấu tử C: k C′ =

12,5 − 1,2 = 9,42 1,2

Đối với cấu tử D: k D′ =

13,8 − 1,2 = 10,5 1,2

- Hệ số phân bố của từng cấu tử (KD): Từ công thức:

k ′X =

K D × VS Vm

⇒

KD =

Đối với cấu tử A: K DA =

2,92 × 1,40 = 24,33 0,168

Đối với cấu tử B: K DB =

6,33 × 1,40 = 52,75 0,168

Đối với cấu tử C: K DC =

9,42 × 1,40 = 78,5 0,168

Đối với cấu tử D: K DD =

10,5 × 1,40 = 87,5 0,168

k ′X × Vm Vs

3. - Độ phân giải R đối với 2 cấu tử C và D: RC − D = - Hệ số tách α đối với 2 cấu tử C và D: α =

2.(t RD − t RC ) 2.(13,8 − 12,5) = = 0,94 WC + WD 1,34 + 1,44

K D 87,5 = = 1,115 K C 78,5

4. . Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5 - Gọi L1, L2 lần lượt là chiều dài của cột cũ và cột mới. Ta có:

R2 = R1

L2 . Từ đó suy ra: L1

L2 =

L1 .R22 25,2 × 1,5 2 = = 64,17(cm) R12 0,94 2

Bài 9: Trên cột sắc ký đã cho, hai chất có thời gian lưu hiệu chỉnh lần lượt là 15 và 20 phút. Trên một cột khác với thể tích pha tĩnh lớn hơn, cấu tử thứ nhất có thời gian lưu hiệu chỉnh là 25 phút. Hỏi thời gian lưu hiệu chỉnh của cấu tử thứ 2 trên cột này bằng bao nhiêu?

Bài giải: - Gọi 2 chất đã cho là A và B: - Ta có :

′ = t RA − t m = t m K DA t RA ′ = t RB − t m = t m K DB t RB

Vs Vm Vs Vm 66

- Chất A: + Với cột sắc ký thứ nhất:

′ )1 = t m K DA ( t RA

+ Với cột sắc ký thứ hai:

′ ) 2 = t m K DA ( t RA

(V s )1 Vm (V s ) 2 Vm

- Tương tự với chất B. - Lập tỉ lệ ta được:

′ )1 (VS )1 (t ′RB )1 15 (t RA = = = ′ ) 2 25 (t ′RA ) 2 (VS ) 2 (t RB

25 × (t ′RB )1 25 × 20 = = 33,33( phút ) 15 15

⇒ (t ′RB ) 2 =

Vậy thời gian lưu hiệu chỉnh của cấu tử thứ 2 trên cột sắc ký thứ 2 là: 33,33 phút.

Bài 10: Hiệu quả của cột sắc ký đã cho là 4200 đĩa lý thuyết, với thời gian lưu giữ octadecan và 2-metylheptadecan lần lượt là 15,05 và 14,82 phút. Độ phân giải của các hợp chất này trên cột là bao nhiêu? Cần bao nhiêu đĩa lý thuyết để với những thời gian lưu giữ trên thì độ phân giải bằng 1,5?

Bài giải - Ký hiệu A: octadecan B: 2-metylheptadecan - Ta có: n

= 4200

tRA = 14,82 phút = 889,2s tRB = 15,05 phút = 903s  t - Số đĩa lý thuyết n = 16 R W 

⇒ w = 16

  (với W là độ rộng của pic)  

t R2 n

wA =

889,2 2 = 54,883 ( s ) 4200

wB =

903 2 = 55,734 ( s ) 4200

- Độ phân giải R

R =

2(t RB − t RA ) wA + wB

⇒R =

2(903 − 889,2 ) = 0,249 54,883 + 55,734

Vậy R = 0,249 - Khi R = 1,5 thì: 1,5(wA + wB) = 2(tRB - tRA) ⇔ ⇔

2 2 16 t RA 16 t RB 4 + = (t RB − t RA ) n n 3 4t RA 4t RB 4 + = (t RB − t RA ) 3 n n 2

⇔

 3(t + t RB )   n =  RA  (t RB − t RA ) 

⇔

 3(889,2 + 903)   n =   903 − 889,2 

= 151795

Vậy cần 151795 đĩa lý thuyết để có độ phân giải R =1,5

Bài 11: Cột sắc ký lỏng có chiều dài 2m có hiệu quả 2450 đĩa lý thuyết ở tốc độ của dòng 15ml/phút và hiệu quả 2200 đĩa lý thuyết ở tốc độ dòng 40ml/phút. Vậy nồng độ tối ưu của dòng phải bằng bao nhiêu và hiệu quả ở tốc độ của dòng sẽ gần bằng bao nhiêu ?

Bài giải : Ta có : H =

B + C ⋅u u

Với u1 = 15 ml/phút ⇒ H1 =

L 200 = = 0,0816 cm N1 2450

⇒ H2 =

L 200 = = 0,0909 cm N 2 2200

Với u2 = 40 ml/phút

Ta có hệ :

⇒ Utư =

B + C ⋅ 15 15 ⇔ B 0,0909 = + C ⋅ 40 40 B 0,829 = = 21,74 (ml/phút) C 1,754 ⋅ 10−3 0,0816 =

B = 0,829 C = 1,754.10-3

⇒ Hmin = 2 B ⋅ C = 2 0,829 ⋅ 1,754 ⋅ 10

−3

= 0,076 (cm)

Bài 12: Người ta thử nghiệm cột sắc ký khí - lỏng có chiều dài 2m ở bao tốc độ khác nhau của dòng, mặt khác, để làm pha di động người ta đã dùng hêli. Kết quả thử nghiệm tìm thấy rằng cột có các đặc trưng sau : Mêtan(pha di động)

n-octađecan

18.2 giây

2020 giây

223 giây

8.0 giây

888 giây

99 giây

5.0 giây

558 giây

68 giây

a> Hãy xác định tốc độ di chuyển của pha động đối với mỗi dòng. b> Hãy xác định số đĩa lý thuyết và giá trị H đối với mỗi dòng. c> Bằng cách giải đồng thời các phương trình cần thiết hãy tìm các giá trị của các hằng số

B  + C ⋅u u

trong phương trình sau : H = A + 

d> Tốc độ tối ưu của sự di chuyển của pha di động bằng bao nhiêu ? Bài giải : a> Tốc độ di chuyển của pha di động u1 =

200 200 = 25 cm/s = 11 cm/s ; u2 = 8 18,2

; u3 =

200 = 40 cm/s 5

b> Số đĩa lý thuyết và giá trị H : 2

 tR   2020  N1 = 16 ⋅  1  = 16 ⋅   = 1310 W 223    1 2

H1 =

2 × 100 = 0,1526 (cm) 1310

 tR   888  N2 = 16 ⋅  2  = 16 ⋅   = 1287 W 99    2 2

⇒

H2 =

2 × 100 = 0,1554 (cm) 1287

⇒

H3 =

2 × 100 = 0,1859 (cm) 1067

 tR   558  N3 = 16 ⋅  3  = 16 ⋅   = 1076  68   W3  69

c> Xác định A, B, C : Ta c ó hệ :

B + C ⋅ 11 11 B 0,1554 = A + + C ⋅ 25 25 B 0,1859 = A + + C ⋅ 40 40 0,1526 = A +

A = 0,059

⇔

B = 0,695 C = 2,729 ⋅ 10−3

d> Tốc độ tối ưu : Utư =

B 0,695 = = 15,96 cm/s C 2,729 ⋅ 10−3

Bài 13: Tiến hành sắc ký hỗn hợp 2 chất A và B trên cột sắc ký có chiều dài L=4m có số đĩa lý thuyết n = 800 đĩa. Tốc độ tuyến tính của 2 cấu tử A và B trong pha động lần lượt là 2 cm/s ; 1,6 cm/s, tm = 10s. a> Tính tRA và tRB b> Có thể tách A và B ra khỏi nhau được không ? c> Tính độ phân giải của phép sắc ký. Bài giải: a> Ta có : t R =

L U

Với : L - chiều cao cột sắc ký U - Tốc độ tuyến tính của cấu tử

- Cấu tử A : t RA = - Cấu tử B: t RB =

L 400 = = 200s UA 2

L 400 = = 250 s U B 1, 6

b> Tính hệ số tách : α =

t R' A t

' RB

t RA − t m t RB − tm

200 − 10 = 0,8 ≠ 1 250 − 10

Vây có thể tách 2 chất A và B ra khỏi nhau.

Bài 14: Các thời gian giữ của α- cholestan và β - cholestan trong hệ chất lỏng – pha rắn trên cột sắc ký có chiều dài 1m và với hiệu quả 104 đĩa lý thuyết tương ứng bằng 4025 và 4100 giây. 70

Nếu 2 hợp chất này cần được phân chia với độ phân giải bằng một thì cần bao nhiêu đĩa lý thuyết để đạt được mục đích này ? Chiều dài nào của dạng này cần để nhận được độ phân giải

đã chỉ ra, nếu H= 0,1mm? Bài giải :

 t RA − t RB   =1 W + W  A B 

Ta có : R = 2 ⋅ 

⇒ WA + WB = 150 s (1)

Với t R= A 4025 s t

= 4100 s

Mặt khác :

t RA WA

t RB

⇔ t RB ⋅ WA − t RA ⋅ WB = 0 (2)

Từ (1) và (2) ta được : WA = 74,31 giây

⇒

N=46942 đĩa

WB = 75,69 giây Với H = 0,1 mm ⇒ L = 4,6942 m

Bài 15: Pic sắc ký của hợp chất được phát hiện sau 15 phút khi đưa mẫu vào (lúc đó pic của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút). Píc của chất X đó có dạng đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s. Độ dài của cột là 40,2 cm. a> Tính số đĩa lý thuyết trong cột. b> Tính H của cột c> Tính T và σ của cột. d> Tính chỉ số lưu giữ của X . e> Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 9,9. Thể tích của pha động bằng 12,3 ml. Tính hằng số phân bố KD. Bài giải : a> Tính N : 2

 15.60  t  N = 16 ⋅  R  = 16 ⋅   =22130 đĩa W   24,2  71

b> Tính H :

L 40,2 = = 0,0181 mm N 22130

c> Tính T và σ :

T= N=

W 24, 2 = = 6,05 giây 4 4

σ2 H

⇒

σ = H ⋅ N = 1,81.10 −3. 22130 = 0, 27 cm

d> Tính R :

e> Tính KD :

1,32 = 0,088 15 1 V 1 + KD ⋅ S VM

1 9,9 1 + KD ⋅ 12,3

= 0,088 ⇒ KD = 12,9

Chương 3. SẮC KÍ KHÍ 1. Nguyên tắc và một số yêu cầu của phương pháp sắc ký khí 1.1. Nguyên tắc Dựa vào tương tác khác nhau của các chất đối với pha tĩnh. Với pha tĩnh rắn (GSC) phụ thuộc vào lực hấp phụ, với pha tĩnh lỏng (GLC) phụ thuộc vào sự phân bố của cấu tử. Trong khi đó, pha động chứa chất khí mang trơ chuyển động liên tục qua cột trong quá trình tách. Ở

đây, do sự khác nhau về ái lực liên kết với pha tĩnh, nên sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di chuyển được các quãng đường rất nhỏ khác nhau. Pha động di chuyển liên tục qua cột, kéo theo các cấu tử khác nhau di chuyển được những quãng đường khác xa nhau. Sau một thời gian nhất định, các cấu tử sẽ tách ra khỏi nhau.

1.2. Một số yêu cầu của phương pháp phân tích sắc khí Một số yêu cầu để phép phân tích sắc ký khí có hiệu quả: Cột tách có pha tĩnh phù hợp với mẫu phân tích. Detecto phù hợp với phương pháp cũng như tính chất và hàm lượng mẫu.Khí mang phù hợp với chất phân tích và nguyên lý làm việc của Detecto. Khí phụ trợ có thành phần và tính chất phù hợp.

Đưa ra quy trình vận hành, bao gồm: nhiệt độ cột tách, nhiệt độ Detecto, nhiệt 72

độ hóa mẫu, cách bơm mẫu, tốc độ dòng khí mang, khí phụ trợ,… 1.3. Sơ đồ máy và quá trình phân tích Để phép phân tích sắc ký khí có hiệu quả, căn cứ vào mẫu phân tích, người phân tích bằng những nguyên tắc cơ bản và bằng kinh nghiệm thực tế đã đưa ra một cấu hình máy và điều kiện vận hành phù hợp bao gồm: Cột tách có pha tĩnh phù hợp với mẫu phân tích Detetor phù hợp với phương pháp cũng như tính chất và hàm lượng mẫu Khí mang phù hợp với chất phân tích và nguyên lý làm việc của detetor

Đưa ra quy trình vận hành bao gồm nhiệt độ của cột tách, nhiệt độ detetor, nhiệt độ bộ phận bơm mẫu, cách bơm mẫu, tốc độ dòng khí mang, khí phụ trợ…Những thông số này được

đặt thông qua máy tính điều khiển của thiết bị.

1.3.1. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

4 6

5 2

9 8

Phần mềm vi sử lý

HÖ ®iÒu khiÓn vµ xö lÝ sè liÖu 10 Hình 1.1. Sơ đồ máy c kíthiÕt khí bÞ s¾c kÝ khÝ S¬sắ®å 1. Nguồn khí mang

6.Detetor

2. Điều chỉnh áp suất 7. Khuếch đại 3. Lọc khí

8. Máy ghi

4. Bộ phận bơm mẫu

9. Máy tích phân

5. Cột tách

10. Phần mềm và máy tính

Trung tâm của phép tách sắc ký là cột tách 5, nó là bộ phận quan trọng nhất, quyết định sự thành công của phép tách. Tiếp theo là detetor 6, đây là bộ phận ảnh hưởng lớn tơi tốc độ nhạy

của phương pháp. Các bộ phận tiếp theo là nguồn khí mang, khí phụ trợ và phần hệ điều khiển và xử lý tín hiệu. Sau khi mẫu được đưa vào bộ phận bơm mẫu 4 (injector), nó được hóa hơi do ở đây

được đặt một nhiệt độ hóa hơi phù hợp. Khí mang ở nguồn 1 được điều chỉnh áp suất ở 2 và làm sạch ở bộ phận lọc khí 3, sẽ đẩy mẫu đi dọc theo cột. Nhiệt độ cột được khống chế chặt chẽ bằng hệ rơle và cặp nhiệt điện. Các chất phân tích sau khi được tách trên cột lần lượt đi vào detetor. Tại đây mỗi chất phân tích cho một tín hiệu nhất định, các tín hiệu này được khuếch

đại, xử lý và ghi lại nhờ các bộ phận 7, 8, 9. Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký đều có bộ phận máy tính có cài đặt các chương trình hoạt động cho máy bao gồm tốc độ dòng khí mang, nhiệt độ của các bộ phận bơm mẫu, cột tách, detetor và xử lý tín hiệu sau cột 10. Ngoài ra, bộ phận tự động bơm mẫu và các chế độ làm việc khác phù hợp với từng đối tượng phân tích và detetor cũng được áp dụng.

1.3.2. Các bước tiến hành của phép phân tích sắc ký khí - Chuẩn bị hệ sắc ký Kiểm tra: mức độ rò rỉ của khí mang, sự liên thông giữa thiết bị dùng dùng để tách các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích ra khỏi nhau, thiết bị nhận biết chất tan ra khỏi cột và thể hiện kết quả với thiết bị điều khiển khác. Nếu là cột mới thì phải luyện cột trước khi sử dụng bằng cách cho khí mang chạy qua cột ít nhất 30 phút ở nhiệt độ khoảng 200 – 250OC tùy theo Tmoax của cột trước khi tiến hành bơm mẫu. - Đặt chế độ chạy sắc ký

Đặt chế độ cho tốc độ pha động, điều kiện (chế độ) nhiệt độ, thời gian chạy sắc ký, chọn detetor và điều kiện làm việc của detetor; các điều kiện phân dòng từ buồng bơm mẫu. - Tiến hành chạy sắc ký - Bơm mẫu vào cột - Chạy sắc ký - Phân tích dữ liệu thu được từ sắc đồ: định tính, định lượng Tóm lại yêu cầu tổng quát của quá trình vận hành: độ lặp lại của thí nghiệm phải cao, hạn chế tối đa sai số ngẫu nhiên.

2. Cột tách sắc ký khí Cột thường làm bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ có chứa pha tĩnh. Có hai loại cột: cột nhồi và cột mao quản. Cột nhồi thường dài từ 1 – 5m, đường kính trong 5mm. Cột nhồi

được nhồi đầy pha tĩnh hoặc được phủ bên trong bằng pha tĩnh. Cột mao quản dài từ 10 đến 100m, đường kính trong 250 µm . Pha tĩnh được phủ trên bề mặt phía trong của cột. Cột mao quản có khả năng tách cao hơn cột nhồi nhưng cá c pic lại dễ bị roãng khi bơm quá nhiều mẫu. 74

Hình 2.1. Cột nhồi (Brain M. Tissue, 17/9/2003)

Hình 2.2.Cột mao quản (Brain M. Tissue, 17/9/2003) Cột tách là trung tâm của phép tách sắc ký. Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký đều sử dụng cột tách mao quản, có pha tĩnh là các hợp chất cao phân tử gồm 4 loại: các ancol, các ete và este, các hợp chất amin, các silicon.

2.1. Các loại cột tách. 2.1.1 . Cột nhồi. Cột nhồi là loại cột mà pha tĩnh hoặc chất mang pha tĩnh được nhồi vào đầy cột.

Cột

Chất nhồi Hình 2.3. Hình ảnh mô phỏcột ng chất nhồi và cột nhồi - Đối với Sắc ký khí-rắn (GSC) Chất nhồi đồng thời là pha tĩnh thường dùng là các polyme vi xốp, silicagel; alumina hoặc là một loại rây phân tử nào đó. 75

Đối với loại này ngoài lực hấp phụ là chính thường kèm theo lực phân bố và làm cho sắc đồ bất đối xứng (có dạng đuôi). Do pha tĩnh thường là các chất phân cực và có tính hấp phụ mạnh nên khi tách các chất phân tích có độ phân cực mạnh thì thời gian lưu của chúng cũng sẽ lớn hơn nhiều so với GLC vì thế chỉ thuận lợi khi tách các hỗn hợp có độ phân cực thấp.

Đối với các cấu tử có độ phân cực mạnh như nước, các ancol… do có ái lực rất lớn đối với pha tĩnh loại này nên không thể tách được chúng ra khỏi nhau trong hỗn hợp đồng đẳng của chúng. Điều này phải được chú ý khi chế biến và xử lý mẫu phân tích. Lưu ý: Trong GSC, chất nhồi cũng có thể đóng vai trò như một chất xúc tác, làm xảy ra các phản ứng hóa học trên cột mà chất phân tích cũng tham gia (như silicagel; alumina) Các loại polyme vi xốp thường được tạo ra từ phản ứng trùng hợp styren và

đivinylbennzen, cho nên tùy thuộc vào hàm lượng đivinylbenzen mà có các kích thước lỗ xốp khác nhau. Loại này hấp phụ được cả những chất phân cực rất yếu kể cả nước. - Đối với Sắc ký khí – lỏng(GLC) Chất mang thường dùng là diatomit. Diatomit là loại vật liệu silicat, nó là cấu tử chính trong gạch chịu lửa. Diatomit có ưu điểm là trơ về phương diện hóa học, có khả năng thấm pha tĩnh là lỏng tốt, có bề mặt riêng lớn, chịu được nhiệt độ cao. Nhưng cũng có nhược điểm là dễ vỡ nên kích thước và hình dáng bên ngoài không đồng nhất, dó có nguồn gốc tự nhiên nên nó có chứa nhiều tạp chất. Chế tạo: sơ chế đất diatomit sau đó trộn đều với xôđa ở tỷ lệ thích hợp, nung hỗn hợp ở 900oC rồi nghiền thành bột. Cấu trúc bề mặt silica: OH

OH Si

Trong thực tế, để nâng cao chất lượng của chất mang để sử dụng vào mục đích cụ thể nào đó, người ta tiến hành hoạt hóa chúng bằng các chất phủ thích hợp. Thí dụ, sau khi chế tạo người ta phủ bề mặt để sản phẩm luôn giữ 1% (về khối lượng) pha tĩnh có tính chất chọn lọc đặc biệt nào đó, khi tạo được các cột có tính năng sử dụng tương đương nhau (tương tự như hãng chế tạo ra nhiều cột giống nhau). Lưu ý: Do yêu cầu bề dày của màng pha tĩnh trên toàn cột phải đồng nhất nên thường hòa tan pha tĩnh vào dung môi có nhiệt độ sôi thấp, sau khi thấm đều trên cột, rung, lắc, cho chảy dung

dịch dư, sau đó tiến hành đuổi dung môi. Cột sau khi nhồi mới được uốn cong cho phù hợp kích thước lò. Pha tĩnh lý tưởng phải không phản ứng với chất phân tích, có KD xác định được rõ ràng đối với các chất phân tích, giá trị này không được quá lớn hoặc quá nhỏ - thích hợp đồng thời có nhiệt

độ sôi cao (thích hợp với hệ sắc ký để không hạn chế khả năng làm việc của cột) - Ưu điểm và nhược điểm của cột nhồi. Trơ về mặt hóa học, có khả năng thấm ước pha tĩnh tốt, có bề mặt riêng lớn và chiệu được nhiệt

độ cao. Nhưng chứa nhiều tạp chất và dễ vỡ. 2.1.2.Cột mao quản Loại cột này, người ta phủ thành cột bằng một lớp pha tĩnh. Do độ giảm áp suất trong cột thấp nên các cột này thường rất dài, để có khoảng hơn 105 lý thuyết thì cột phải dài khoảng 10 100m trong khi các cột nhồi chỉ dài khoảng 1 - 5m. Có 3 loại cột mao quản hở: - SCOT: support coated open tubular columns (cột mao quản hở phủ pha tĩnh) - PLOT: porous layer open tubular columns (cột mao quản hở phủ lớp xốp) - WCOT: wall coated open tubular columns (cột mao quản hở phủ thành hoặc phim). Loại cột này thường được chế tạo từ ống SiO2 đường kính trong khoảng 0,25 – 0,50 mm, được “gặm” (ăn mòn – không nhẵn như các ống thủy tinh) và phủ một màng tĩnh (phim), thường có bề dày là 0,5 – 0,25 µ m . → lượng mẫu đưa vào cột phải Do đường kính mao quản nhỏ nên để cos đĩa lý thuyết lớn 

nhỏ < 100ng  → cần lượng mẫu nhỏ (cần có sự tương quan với khả năng tương thích của detetor). Cột này có thể thực hiện các cân bằng chiết trong khoảng 1000 đĩa chỉ cần đến không quá 1 giây (s). Các hình dưới đây thể hiện một số thông số của các loại cột mao quản

Pha

20 µ m SCOT

77 20 µ m

PLOT

0,5 – 0,25 WCO µ m

Hình 2.4. Mô hình mô phỏng mặt cắt ngang của các loại cột mao quản - Các ưu điểm của cột mao quản

Ưu điểm: + Cân bằng thiết lập nhanh; + Độ phân giải tốt (do dùng lượng mẫu nhỏ) + Độ đồng nhất cao (đối với loại cột ăn mòn bằng phương pháp hóa học) + Giới hạn phát hiện nhỏ Nhược điểm của cột mao quản: + Dài, nhỏ  → khó chế tạo → cần có detetor có khả năng tương thích cao. + Lượng mẫu nhỏ 

2.2. Cách nhồi pha tĩnh cột tách Người ta phủ pha tĩnh lên chất mang (pha tĩnh + dung môi + chất mang) sau đó đốt nóng làm bay hơi dung môi. Khi chất mang được tẩm pha tĩnh tiếp tục được sấy trong tủ chân không ở nhiệt độ thích hợp, để nguội rồi ray trên ray có cở số thích hợp sau đó nhồi vào cột. Chất nhồi được đưa vào cột bằng: một đầu cột bằng một phễu đầu cột kia được gắn với một hệ thống chân không ( nhờ vào bơm chân không). Toàn bộ cột được đặc nằm ngang trên một bộ rung có thể điều khiển được tốc độ.

Kiểu cột tách

C ột

mao

phim

Đặc trưng Đường

kính

trong Chiều dài

Tốc độ dòng (tối ưu)

mỏng lớp mỏng

Cột mao

Cột nhồi

quản nhồi

thông thường

WCOT

SCCT

0,,25 – 0,50 mm

0,50 mm

1 mm

2 – 4 mm

10 – 100 m

1–6m

1–4m

Hiệu quả Cột 1000 tách

quản Cột mao quản

–

3000 600

–

1200 1000 – 3000

500 – 1000 đĩa/m

đĩa/m

20 – 30 cm/s

8 – 15 cm/s

4 – 6 cm/s

hydro; heli

10 – 15 cm/s

3 – 10 cm/s

2 – 5 cm/s

nitơ; argon

1 – 5 ml/phút

2 – 8 ml/phút

2 – 6 ml/phút

20–60 ml/phút

Tốc độ thể tích hydro; heli

hydro; heli

dòng (tối ưu)

0,5 – 4 ml/phút

1 – 4 ml/phút

1 – 3 ml/phút

15 – 50 ml/phút

nitơ; argon

10 – 100 ng

10ng – 1g

10ng – 10g

10ng – 1mg

Thấp

Rất cao

Cao

Lượng mẫu Áp suất đòi h ỏi Khí bổ trợ

Đòi

Cho detetor

thường

Nhanh

Trung bình

Tốc độ phân tích Trơ hóa học

T ốt

Tính thấm

Cao

hỏi

thông Đòi hỏi thông Đòi hỏi thông

Đòi

hỏi

thông

thường

Chậm Kém nhất

Cao

Thấp

Bảng 2.1. Cấu tạo và các thông số về các cột tách

Hiện nay ở Việt Nam cột nhồi thông thường vẫn là loại cột sắc ký phổ biến nhất, trong khi đó đa số các phòng thí nghiệm, kể cả trong kỹ nghệ, ở nhiều nước khoa học tiên tiến trên thế giới hầu như đã bỏ hẳn cột nhồi mà chỉ còn sử dụng cột mao quản. Tuy nhiên so với phương pháp sắc ký khí cột nhồi, sắc ký khí sử dụng cột mao quản đòi hỏi những yêu cầu hết sức đặc biệt đối với quá trình bơm mẫu cũng như đối với quá trình phát hiện các cấu tử (ví dụ

đối với các cột mao quản phim mỏng WCOT lượng mẫu được đưa vào cột khoảng 10-7g. 2.3. Các loại pha tĩnh lỏng o

Pha tĩnh loại này được đánh gía dựa vào tsôi (tức là khoảng nhiệt độ làm việc của cột) và độ phân cực

Để sử dụng hiệu quả của pha tĩnh, người ta đưa ra một số nguyên tắc Dùng các pha tĩnh phân cực để tách các mẫu gồm các cấu tử phân cực - Cấu tử có áp suất hơi thấp – cần phải được tách ở nhiệt độ khá cao nên cần pha tĩnh lỏng là chất chịu được nhiệt độ cao - Cũng cần lưu ý rằng khi tách ở nhiệt độ thấp thì độ phân giải của GC sẽ tốt hơn Thí dụ một số pha tĩnh thường gặp 79

Bảng 2.2. Một số pha tĩnh thường sử dụng phân Ứng dụng chính (đối tượng phân

Thành phần hóa học

o tsoôi max Độ C cực

Squalane (C30H62)

150

Các hydrocacbon

Polymethyl siloxane 350

Các hợp chất không phân

400

Các hợp chất có áp suất hơi thấp

200

Các ester, acide béo, pesticides

250

270

Polycarboran siloxane Diethyleneglycol adipate Polyethylene glycol Polytrifluopropylme thyl siloxance Polycyanomethyl siloxance

tích)

Các rượu, các chất thơm, các ester Các amino acide, steorit, các hợp chất chứa N Các ancaloit, dược phẩm, các hợp chất halogeno

NP: không phân cực; I: ít phân cực; P: phân cực

3. Các loại khí mang (pha động) được sử dụng trong sắc ký khí. Có thể sử dụng khí đơn hoặc hỗn hợp 2 hoặc 3 khí theo tỉ lệ thích hợp. Khí mang có vai trò đưa chất phân tích đi dọc theo cột, rửa giải và làm sạch hệ thống sắc ký. Việc chọn khí nào làm khí mang phụ thuộc vào chất phân tích, phụ thuộc vào Detecto, và kỹ thuật sắc ký. Thường sử dụng các khí như: He, H2, Ar, N2, Kr,… có độ tinh khiết cao khoảng 99,995%

đến 99,9999%. Tốc độ trung bình của khí mang: 100 – 250 ml/phút. Từ mối liên hệ giữa tR' với F (lưu lượng dòng pha động) qua phương trình VR' = tR' .F mà F và tốc độ chuyển dời u của pha động phụ thuộc vào áp suất của nó trên cột thông qua hệ số Martin J (J được gọi là hiệu số hiệu chỉnh). J là hàm số, phụ thuộc vào áp suất đầu và áp suất cuối cột qua phương trình:

3.( PPdc ) 2 − 1 2.( PPdc )3 − 1

Cần phải lưu ý rằng do tính chất dễ bị nén của các chất khí nên tốc độ chuyển dời của khí mang không tỷ lệ thuận với áp suất khí mang.

Đồng thời cũng cần thiết phải nhắc lại là khi áp suất hơi bão hòa của cấu tử tăng (chất dễ bay hơi), thời gian lưu của cấu tử sẽ giảm khi tăng nhiệt độ của cột sắc ký. 80

3.1. Yêu cầu đối với khí mang: Do độ giảm áp suất qua cột tách tỷ lệ với độ nhớt của khí mang theo phương trình:

∆P =

η Bo

.L.u

Trong đó : ∆P = Pđ - Pc `

η : độ nhớt của khí mang u : tốc độ dòng trung bình

Bo : độ thẩm thấu riêng Do yêu cầu của đối tượng cần tách và khả năng tương thích của detetor nên khí mang cần có các yêu cầu chính sau:

Đối với cột nhồi cần khí mang có độ nhớt thấp. Cột mao quản có thể sử dụng được các khí mang có độ nhớt cao. Khí mang được dùng phải không thay đổi trạng thái lý, hóa học khi đi qua máy sắc ký khí Phải tương thích với detetor. Chẳng hạn đối với detetor độ dẫn điện (TCD) cần sử dụng khí mang có độ dẫn cao như H2, He; trong một số trường hợp có thể dùng N2, nhưng cần phải chú ý đến khoảng tuyến tính của detetor. Đối với detetor ion hóa ngọn lửa thì có thể sử dụng tất cả các khí mang trừ O2. Ngoài ra đối với khí màn còn lưu ý các điểm:

Độ an toàn khi sử dụng Hiệu quả kinh tế, độ tinh khiết cao…

3.2. Đặc điểm của một số khí mang thường được sử dụng Khí hydro: khí hydro thương mại thường đạt đủ tiêu chuẩn cho sắc ký khí. Trong phân tích lượng vết, khi sử dụng pha tĩnh dễ bị hỏng và trong sắc ký điều chế cần phải làm sạch và khô khí. Khi sử dụng khí hydro làm khí mang cần dùng nitơ làm khí bảo vệ thổi qua cột trước. Các ống dẫn khí hydro phải đủ dày tốt nhất là dùng ống kim loại nhỏ vừa kín vừa tiết kiệm khí. Hydro dùng cho các cột tách làm việc dưới 200oC vẫn tỏ ra trơ. Trong các phòng thí nghiệm hiện đại dừng khá phổ biến máy sản xuất khí hydro với công suất từ 125ml/phút đến 225ml/phút. Khi dùng máy này, lúc đầu phải chờ cho máy đạt áp suất nhất định mới được đưa khí vào cột tách. Trong phòng sắc ký sử dụng khí hydro phải có máy dò độ hở hydro và cấm lửa.

Khí hêli: là khí trơ hóa học rất thích hợp cho sắc ký khí nhiệt độ cao. Khi sử dụng detetor ion hóa bằng tia phóng xạ phải sử dụng hêli tinh khiết.

Khí argon: cũng như các khí trơ khác, argon trên cơ cở không có hoạt tính hóa học được dùng cho sắc ký khí ở nhiệt độ cao. Do độ nhớt của argon cao, yêu cầu về dây dẫn khi sử dụng nó không gặp khó khăn lắm. Khí argon ngày càng được sử dụng nhiều làm khí mang.

Khí nitơ: do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên nitơ được sử dụng rất nhiều trong sắc ký khí. Nhưng cần chú ý với detetor TCD vì gía trị dẫn nhiệt của nitơ rất gần với độ dẫn của nhiều khí hoặc hơi chất hữu cơ nên có trường hợp pic sắc ký sẽ ngược. Trong phân tích định, hệ số hiệu chỉnh đặc trưng sẽ xê dịch rất mạnh khỏi 1 khi dùng khí mang có độ dẫn cao.

Không khí và oxi: Độ tinh khiết của oxi thương mại cũng đạt yêu cầu cho sắc ký khí nhưng cần phải sấy khô vì rất dễ lẫn nước trong bom đựng khí. Không khí nén có thể lấy từ bom khí bơm nén kiểu dầu. Nếu dùng bơm nén thì phải chú ý không cho hơi dầu đi vào thiết bị sắc ký.

Bảng 3.1. Tổng kết về tính chất và khả năng sử dụng của các khí đó TÍNH CHẤT VÀ KHẢ NĂNG KHÍ MANG SỬ DỤNG

Argon

Hêli

Nitơ

Hidro

Độ dẫn điện (10−4 cal / cms o .K )

0,52

4,08

0,73

5,47

Độ nhớt (ở 1atm; 200oC)

321

270

246

121

Khoảng nhiệt độ

Rất rộng

Rộng

Hẹp

Yêu cầu về độ tinh khiết

99,999%

Tính kinh tế

Đắt

Rất đắt

Rẻ

Mức độ an toàn

Cao

Rất thấp

Mức độ phổ biến

Ít

Rất ít

Cao

Ít

làm việc

4. Detetor Detetor là bộ phận có ảnh hưởng đến độ nhạy phương pháp. Detetor phải phù hợp với đối tượng và cấu tử cần tách, có độ nhạy và độ đáp ứng cao. Detetor có nhiệm vụ chuyển hóa một

đại lượng không điện (trong trường hợp này là nồng độ các chất được tách ra khỏi cột sắc ký khí) thành đại lượng điện. Ngày nay đã có gần 30 loại detetor khác nhau. Sau đây là bảng liệt kê một số loại detetor thông dụng với các tính năng của chúng. Sau đây là một số Detetor dùng dùng trong sắt ký khí.

4.1. Detetor độ dẫn nhiệt (TCD – thermal conductivity detetor)

Nguyên tắc hoạt động: So sánh độ dẫn nhiệt của khí mang tinh khiết và của khí mang có chất tan thông qua việc đo điện trở của một dây dẫn đã được đốt nóng. Mạch so sánh được lắp theo kiểu Wheattone.

Khí mang có chất

Khí

Hình 4.1. Sơ đồ của detetor dẫn nhiệt Độ nhạy của detetor phụ thuộc vào khả năng dẫn điện của khí mang, dòng nuôi điện trở Ưu điểm:Đáp ứng được với tất cả các chất Đủ nhạy cho nhiều chất cần phân tích (cỡ 10ppm),Khoảng tuyến tính của tín hiệu kha tốt – rộng (cách nhau đến 104 lần),Cấu tạo đơn giản Tín hiệu khá bền (độ lưu tín hiệu)

4.2. Detetor ion hóa ngọn lửa (FID – Flame ionzation Detetor) Nguyên tắc hoạt động: Đo sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa trong một điện trường khi có chất hữu cơ đi qua. (Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa mà các chất đi ra khỏi cột đặc biệt là các chất hữu cơ bị ion hóa và tạo thành dòng ion trong điện trường  → giảm thế của điện trường).

Ống góp

Bộ phận dò tín hiệu

Ngọn lửa

+ -

Hình 4.2. Sơ đồ của detetor FID: Độ nhạy của detetor phụ thuộc vào khả năng đọc dòng điện cực nhỏ của hệ vi mạch điện tử ( cỡ 10−12 A); nhiệt độ của ngọn lửa ion hóa; bản chất của các cấu tử bị ion hóa (dễ hoặc khó bị ion hóa); không nhạy với các chất vô cơ và các chất hữu cơ vó carbon bị oxi hóa ở mức cao như các nhóm cacbonyl.

Ưu điểm: Độ chọn lọc cao (đáp ứng tốt các hợp chất hydrocacbon – rất thuận tiện khi phân tích dầu khoáng) 83

Có độ nhạy khá cao đối với nhiều chất (có thể phát hiện chất có nồng độ cỡ 100ppb)

Khoảng tuyến tính rất rộng (hơn kém nhau đến hàng triệu lần)

Độ bền tính hiệu cao, ít bị ảnh hưởng bởi tốc độ dòng khí mang và các thông số thực

nghiệm khác

4.3. Detetor cộng kết điện tử (EDC – electron capture detetor) Nguyên tắc hoạt động: dựa trên đặc tính các chất có khả năng cộng kết (bắt) điện tử tự do trong pha khí. Trong trường hợp này, các ion được tạo ra bởi một nguồn phóng xạ như 3 H hoặc

Ni ,

chúng phát ra các hạt β , các hạt này ion hóa các chất (chẳng hạn như khí mang

N 2 + β  → N 2+ + 2e ) và tạo ra một dòng trong mạch. Khi có chất có khả năng “bắt” electron (là các chất chứa các nguyên tử có độ âm điện cao như halogen, oxy, nitơ, photpho, lưu huỳnh)

được đưa vào detetor thì làm cho dòng giảm xuống. Nguồn β

Chất thải

Bộ phận đo dòng

Cột GC

Hình 4.3. Sơ đồ detetor EDC Độ nhạy của detetor EDC phụ thuộc chủ yếu vào:Độ lớn của dòng nền,Mức năng lượng của electron phát ra của nguồn bức xạ,Độ âm điện của nguyên tử gắn vào chất cần phân tích,Điện thế đặt vào hai cực của detetor. Detetor này rất nhạy với các hợp chất halogenua, giới hạn tín hiệu có thể đạt đến cỡ 2.10−14 g / s . Khoảng tuyến tính khá tốt (hơn kém nhau cỡ 1000 lần),Bản chất khí mang

Ưu nhược điểm của detetor EDC: Chỉ chọn lọc và có độ nhạy cao với các hợp chất cơ halogen (cỡ 0,01ppb đối với Lindan), không nhạy đối với các chất khác. vì thế được dùng chủ yếu trong việc phân tích các PCB, Pesticides có nguồn gốc cơ clo, các Fluorocarbons và các chất tương tự Khoảng tuyến tính hẹp

4.4. Detetor khối phổ (MSD – mass spectroscopy detetor) Nguyên tắc hoạt động: các chất ra khỏi cột được chuyển hoàn toàn thành dạng khí và tách chất tan khỏi khí mang, sau đó dùng các nguồn ion hóa cực mạnh để cắt các phân tử thành 84

các mảnh ion, các mảnh ion này được tách ra khỏi nhau theo một trật tự nhất định về khối lượng và cuối cùng nhận biết các ion ra khỏi bộ phân tách khối lượng bằng thiết bị thích hợp. Có thể nói MSD có 4 bộ phận:

Bộ phận lọc khí – mẫu

Bộ phận ion hóa mẫu

Bộ phận tách ion theo khối lượng

Bộ phận phát hiện các ion ra khỏi bộ phận phân tách ion

Hình 4.4. Sơ đồ detetor MSD Độ nhạy của detetor phụ thuộc vào hiệu suất cắt mảnh của bộ phận ion hóa mẫu điện trường của tứ cực.

Ưu nhược điểm: Tùy theo dạng sắc đồ mà có thể dự đoán công thức, cấu trúc của các phân tử mà không cần chất chuẩn (qua catalog có sẵn trong phần mềm), có độ nhạy và độ chính xác cao (cỡ 10−1 đến 10−3 ppm), khoảng tuyến tính tốt (hơn kém nhau cỡ 104 lần), thời gian phân tích nhanh.

4.5. Detector phát xạ nguyên tử (Atomic emission detector: AED) Các nguyên tố trong dòng hơi đi ra từ cột mao quản của SKK. Sau khi ra khỏi cột, hơi

đi vào bào quang điện vi sóng - ở đây các thành phần bị phân hủy và các nguyên tử của chúng bị kích thích bởi năng lượng của tế bào quang điện. Ánh sáng phát ra bởi các phần tử bị kích thích, được tách ra thành các tia riêng biệt đi qua chuỗi quang diod đến máy tính. Máy tính chọn ra các tia riêng biệt và ghi sắc đồ dưới dạng các pic chỉ tương ứng với một cấu tử cụ thể của các chất bay hơi đi ra từ cột SKK.

Hình 4.5. Sơ đồ cấu tạo detector cộng kết điện tử 85

4.6. Detector quang hóa (chemiluminescence detector) Detector quang hóa được nối với máy SK lỏng hoặc SKK và đóng vai trò quan trọng trong các phòng thí nghiệm phân tích. Trong phổ quang hóa, năng lượng cần thiết để kích thích chất phân tích cao hơn các trạng thái điện tử quay vòng quanh và dao động và không xuất phát từ nguồn sáng bên ngoài như laser hoặc đèn. Vấn đề phân tán nguồn kích thích hoàn toàn tránh

được. Năng lượng được tạo ra bằng phản ứng hóa học giữa chất phân tích và thuốc thử: CH3 – S – CH3 + F2 → sản phẩm + hv (ánh sáng) Quang hóa ở pha khí, sự phát ánh sáng được tạo ra bởi phản ứng giữa chất phân tích và khí oxy hóa mạnh . Phản ứng xảy ra vào khoảng thời gian mà sản phẩm của ánh sáng tạo ra ngay lập tức. Vì vậy hệ thống phân tích trộn chất phân tích với thuốc thử ngay trong bình thể tích nhỏ, trực tiếp ở phía trước của khuếch đại ánh sáng. Khi chất phân tích đi ra từ cột sắc ký khí, đuôi cột gắn trực tiếp vào bình phản ứng. Vì vậy năng lượng của phản ứng được giải phóng ra bao nhiêu thì được dùng bấy nhiêu để kích thích phân tử chất phân tích. Sự mất năng lượng thông qua sự va chạm của pha khí là không mong muốn. Vì vậy áp suất khí ở bình phản ứng phải được duy trì thấp bằng bơm chân không để hạn chế tối đa tác dụng bất hoạt của sự va chạm

Hình 4.6.Sơ đồ cấu tạo của detector quang hóa 4.7. Detector quang kế ngọn lửa (Flame – photometric detector: FPD) Detector quang kế ngọn lửa được sử dụng để xác định các chất có chứa lưu huỳnh và phosphor. Detector này sử dụng các phản ứng quang hóa của lưu huỳnh và phosphor trong ngọn lửa hydro / không khí như một nguồn thông tin tương đối đặc biệt của các hợp chất có chứa nguyên tử lưu huỳnh và nguyên tử phosphor. Lama cực đại dẫn truyền của các hạt lưu huỳnh được kích thích (S2) vào khoảng 394nm. Lamda cực đại cặp đôi (duplet) của các hạt phosphor bị kích thích (HPO): 510-526. Để có thể phát hiện một cách chọn lọc hoặc lưu huỳnh hoặc phosphor khi các thành phần này đi ra từ cột SKK, người ta sử dụng một kính lọc nhiễu sóng. Kính này được đặt giữa vùng bức xạ khả kiến và tử ngoại phát xạ bởi ngọn lửa. Khi 86

không có tổng lượng lớn bức xạ hồng ngoại, phát xạ bởi ngọn lửa cháy, phản ứng đốt nóng đến PMT và làm tăng tín hiệu của PMT.

Hình 4.7 . Sơ đồ detector quang kế ngọn lửa 4.8. Detector nitrogen – phosphor (Nitrogen – phosphorus detector: NPD) Cấu tạo của detector nitrogen – phosphor tương tự như detector ion hóa ngọn lửa. Sự khác nhau chính là ngọn lửa hydro / không khí của detector ion hóa ngọn lửa được thay bằng hạt rubidisilicat đốt nóng trong detector nitrogen – phosphor. Các chất từ cột SKK đi ra qua hạt muối rubidi nóng phát ra các ion của cac thành phần có chứa nitrogen và phosphor đi qua nó. Các ion được tập trung ở bình thu ở phía trên hạt nung nóng, tạo ra dòng điện tương tự như det ion hóa ngọn lửa.

4.9. detector quang hóa ion (Photoionization detector:PID) Detector quang ion hóa được ứng dụng để xác định các hydrocabua thơm hoặc các hợp chất có nguyên tử dị vòng. Detector quang ion hóa sử dụng ánh sáng tử ngoại để ion hóa các chất bị kích thích đi ra từ cột SKK. Các ion tạo ra được tập hợp ở điện cực. Vì vậy dòng điện phát sinh là thước đo nồng độ chất phân tích. Phản ứng quang ion hóa xảy ra như sau: R = hv → R+ + eNếu năng lượng của một phonton đi vào đủ cao, thì sự quang kích có thể xảy ra, 1 điện tử hoàn toàn tách ra khỏi phân tử quỹ đạo – là sự ion hóa. Nếu sự ion hóa củ một chất xảy ra, thì dòng diện sinh ra tập trung ở điện cực của bình phản ứng của detector quang ion hóa, tỷ lệ thuận với chính chất đi vào bình phản ứng. Chỉ có các hydrocabua thơm và các chất các nguyên tử dị vòng (tương tự như sunlfua hữu cơ và phosphor hữu cơ) mới được xác định bằng detector quang ion hóa, bởi vì chỉ có các chất này mới có khả năng ion hóa trong phạm vi nguồn ánh sáng của các đèn ngoại tử đang có bán trên thị trường. Năng lượng của các đèn tử ngoại từ 8,3

đến 11,7 ev, có nghĩa là lamda max trong khoảng từ 150nm đến 106 nm. Hầu hết các detector quang ion hóa bán trên thị trường chỉ có 1 đèn tử ngoại. Các đèn tử ngoại được thay đổi phụ thuộc vào yêu cầu phân tích.

Phát hiện chọn lọc bằng detector quang ion hóa: thí dụ về sự phát hiện chọn lọc benzen trong sự có mặt của isopropanol. Điểm sôi của benzen 80,10C, khả năng ion hóa = 9,24 ev - ứng với đèn tử ngoại có năng lượng bằng 9,5 ev ở trong detector quang ion hóa bởi vì năng lượng này cao hơn khả năng ion hóa của benzen (9,24 ev). Isopropanol có điểm sôi tương tự như benzen (82,50C) và 2 chất này sẽ ra khỏi cột SKK gần như cùng một thời gian. Mặc dù vậy, isopropanol có khả năng ion hóa cao hnw năng lượng của đèn tử ngoại (10,15 ev) nên không nhìn thấy hoặc cảm ứng rất yếu ở detector quang ion hóa và vì thế chỉ phát hiện nên không nhìn thấy hoặc cảm ứng rất yếu ở detector quang ion hóa và vì thế chỉ phát hiện được một chất là benzen.

Hình 4.8. Sơ đồ cấu tạo detector quang ion hóa Cấu tạo của detector quang ion hóa được trình bày ở hình 25: detector quang ion hóa là detector SKK không phân hủy vì chỉ có một phần rất nhỏ của chất phân tích bị ion hóa ở buồng của detector. Vì thế có thể nối ống xả từ detector quang ion hóa với một detector khác (như detector ion hóa ngọn lửa hoặc detector cộng kết điện tử) để có kết quả phân tích đồng thời bằng 2 detector. Nhiệm vụ chính ở đây là thiết kế buồng ion hóa và ống nối với detector thứ 2 có thể tích nhỏ nhất (đường kính trong nhỏ) để các pic khi tách bằng cột SKK không bị mở rộng trước khi phát hiện.

5. Lựa chọn các điều kiện cho phép sắt ký khí Để chọn quy trình phân tích sắc ký khí, cần phải biết nguồn gốc và thành phần mẫu, điều này đặc biệt quan trọng đối với phân tích định lượng. Nói chung, mỗi một mẫu đều có thể được phân loại theo thành phần hoặc các đặc tính của cấu tử theo một trong các nhóm sau: Nhóm A: các cấu tử có hàm lượng tương tự nhau trong mẫu Nhóm B: bên cạnh cấu tử chính, mẫu còn chứa một số cấu tử với hàm lượng rất nhỏ (thường gọi là cấu tử vết) Nhóm C: các cấu tử của mẫu (thuộc nhóm A hoặc B) có điểm sôi rất khác nhau (gọi là hỗn hợp với khoảng sôi rộng)

Nhóm D: các cấu tử của hỗn hợp (nhóm A, B hoặc C) rất phân cực như ancol với số nguyên tử cacbon thấp, axit béo tự do, các amin bậc 1 và este của axit béo. Nhóm E: mẫu (nhóm A, B, C hoặc D) tồn tại ở dạng dung dịch Nhóm F: mẫu có chứa một số thành phần không bay hơi hoặc rất khó bay hơi. Trên cơ sở thành phần của mẫu sẽ quyết định lựa chọn những phương tiện thiết bị và

điều kiện làm việc. 5.1. Chọn cột tách. 5.1.1. Chọn kiểu cột tách Nếu mẫu thuộc nhóm A và C thì cột mao quản sẽ cho kết quả tốt hơn cột nhồi. Nếu mẫu thuộc nhóm B thì không được phép dùng cột mao quản phim mỏng (WCOT) mà phải dùng cột mao quản lớp mỏng (SCOT) hoặc cột nhồi. Mẫu thuộc nhóm D sẽ được phân tích tốt trên các cột mao quản có bề mặt thủy tinh đã

được muội hóa. 5.1.2. Chọn kích thước cột tách Chiều dài cột tách được xác định bởi hiệu suất phân giải cần thiết. Song nếu tăng chiều dài cột tách gấp đôi thì độ phân giải chỉ tăng thêm khoảng 40%. Mặt khác, việc tăng chiều dài cột tách lại làm tăng độ chênh lệch áp suất theo phương trình: ∆p =

η B0

.Lu

Vì vậy không thể kéo dài cột tách một cách tùy ý. Riêng về tiết diện cột tách sẽ do dung lượng cần thiết của mẫu quyết định. Trog sắc ký khí điều chế, đường kính trong của cột tách phải lớn hơn 4mm. Khi sử dụng detetor TCD để phân tích những mẫu thuộc nhóm A hoặc C cần phải dùng cột có đường kính thật nhỏ, sao cho với những lưu lượng khí mang thấp không làm giãn pic. Để giữ tốc độ khí mang u trong cột cố định, đối với cột có tiết diện nhỏ phải làm giảm lưu lượng dòng khí. Trong trường hợp đó, khả năng chịu tải của cột sẽ giảm tỷ lệ thuận với tiết diện cột, tức là lượng mẫu phải giảm. Song nồng độ mẫu trong khí mang vẫn giữ nguyên, do đó các tín hiệu đo được cũng không bị giảm. Nếu mẫu thuộc nhóm B (phân tích lượng vết) mà vẫn muốn sử dụng detetor TCD (để phân tích các khí vĩnh cửu, hydro, oxy, khí có chứa nitơ như: NO, H2S là những chất không thể phát hiện được bằng detector FID) thì phải bơm nhiều mẫu, tải trọng của cột tăng nên bắt buộc cột phải có đường kính lớn hơn. Mức độ lớn tùy thuộc vào hàm lượng mẫu phân tích (thường

đường kính trong của cột tách khoảng 4,25 – 6,35mm). Tuy vậy, khi phân tích lượng vết thường sử dụng detetor FID. Khi vận hành với detetor ion hóa (FID, ECD), cần phải tạo ra các dòng chất lớn có thể

được bằng cách tăng tốc độ dòng khí mang nhưng vẫn nằm trong vùng tối ưu. Mặt khác cũng 89

cần quan tâm đến các phản ứng xảy ra tại detetor (nếu dòng khí quá lớn sẽ làm tắt ngọn lửa hoặc ngọn lửa sẽ cháy ở vùng không tối ưu), thông thường chỉ sử dụng cột có đường kính trong từ 3 – 4mm. Với cột mao quản cần lựa chọn cột có đường kính trong nhỏ để đạt hiệu suất tối

đa. Nếu độ tải trọng của cột mao quản không đáp ứng được yêu cầu tách thì dùng cột mao quản lớp mỏng. Khi dùng cột mao quản, vấn đề tiết kiệm chiều dài cột tách thường ít được đề cập. Với mẫu có hằng số phân bố K khá lớn thì cột mao quản phim mỏng có chiều dài 25m là thích hợp

5.1.3. Điều khiển nhiệt độ cột tách Đẳng nhiệt : Đây là phương pháp đơn giản nhất và đặc biệt cần thiết đối với việc xác định các thông số hóa lý. Nếu mẫu có chứa ít cấu tử với các hằng số phân bố tương tự nhau thì phương thức làm việc sẽ cho số thông tin tối đa. Mẫu thuộc nhóm C thì thời gian phân tích quá dài cũng như tỷ số giữa chiều cao và độ rộng pic ngày càng bất lợi cho phân tích định lượng. Trường hợp này tốt nhất là sử dụng chương trình nhiệt độ. Chương trình nhiệt độ: Chương trình nhiệt độ giúp phân tích hỗn hợp nhóm C chỉ cần một lượng bơm mẫu.

Ưu điểm của phương pháp này là: - Rút ngắn thời gian phân tích đối với các mẫu có khoảng điểm sôi rộng - Tỷ lệ giữa chiều cao pic và chiều rộng pic luôn ổn định vì thế thuận lợi cho phân tích định lượng. Thông thường, các mẫu hợp chất thiên nhiên rất phức tạp nên không thể bằng một phương trình tuyến tính thu được kết quả mong muốn mà phải sử dụng đa phương trình, nghĩa là ở khoảng nhiệt độ giữa chừng có thể giữ đẳng nhiệt cột trong thời gian thích ứng rồi lại tăng tiếp với tốc độ mong muốn. Trước và sau chương trình có thể giữ ở nhiệt độ cố định.

Đối với một số pha tĩnh, khi tăng nhiệt độ cột tách thì dễ bị cuốn đi bởi dòng khí, gây ra hiện tượng lệch đường nền gây khó khăn cho việc sử dụng tích phân kế điện tử. Điều này được khắc phục bằng cách sử dụng cột kép, tín hiệu của hai cột được phân cực trái dấu nhau nên bù trừ được việc pha tĩnh bay hơi. Tuy vậy, khi sử dụng chương trình nhiệt độ cần lưu ý đến các

điểm sau đây: Nhiệt độ của buồng điều nhiệt phải được điều chỉnh với tốc độ thích ứng như chương trình quy định. Hiện nay chưa có máy sắc ký nào làm việc chính xác với tốc độ nhỏ hơn

0,3o C /phút và lớn hơn 24 o C /phút. Thực tế cột nhồi thường dùng với tốc độ 5 − 20o C /phút, cột mao quản là 0, 25 − 2,5 oC /phút. Việc làm nguội buồng điều nhiệt cần phải được tiến hành nhanh chóng, và thường làm nguội sâu hơn nhiệt độ làm việc ban đầu để quá trình thực hiện chương trình mới nhanh chóng

ổn định, vì khi cửa buồng điều nhiệt nóng, nhiệt trong các tấm cách nhiệt lại phả ra. 90

Nhiệt độ của buồng bay hơi mẫu cần phải được đưa lên cao, độc lập với nhiệt độ của buồng điều nhiệt nhằm làm sự bay hơi mẫu ổn định và lặp lại cho dù nhiệt độ tăng hay giảm. Khí mang sử dụng phải tinh khiết, nếu không các tạp chất sẽ tích tụ trước hết ở phần đầu của cột tách. Khi nhiệt độ của cột tăng lên nó sẽ vận chuyển qua cột gây ra pic lạ bất ngờ. Sử dụng cột nhồi cần lưu ý đến độ dày của thành cột để đảm bảo truyền nhiệt tốt và

đường kính cột không quá lớn (thường sử dụng cột có đường kính 3mm) để đảm bảo cho độ chênh lệch nhiệt độ trong và ngoài cột tách là ít nhất. Cột mao quản thích hợp với chương trình nhiệt độ hơn so với cột nhồi.

5.2. Chọn pha tĩnh Bao giờ cũng nên sử dụng pha tĩnh có độ chọn lọc cao nhất. Song cần lưu ý phải sử dụng loại pha tĩnh có độ bền nhiệt thích hợp, nghĩa là nhiệt độ làm việc tối đa bao giờ cũng nhỏ hơn nhiệt độ chặn trên của pha tĩnh đó. Do đó, trong nhiều trường hợp có những pha tĩnh rất chọn lọc cho một đối tượng nhưng vì nhiệt độ chặn trên quá thấp (áp suất hơi quá lớn) nên không sử dụng được. Trong thực tiễn phải sử dụng một cách dung hòa hai yếu tố vừa nêu. Riêng trong trường hợp pha tĩnh là tinh thể lỏng, cần phải lưu ý cả nhiệt độ chặn dưới bởi vì hiệu quả tách cao nhất chỉ thể hiện trong trường hợp pha tĩnh ở trạng thái tinh thể lỏng. Ví dụ: đối với metoxietoxiazo xibenzen là 96 - 1220C. Với pha tĩnh là cao su silicon, khi sử dụng detetor FID thì nhiệt độ cột tách phải thấp hơn nhiệt độ chặn vài chục độ vì trong trường hợp này một phần pha tĩnh thoát ra khỏi cột sẽ cháy trong ngọn lửa hydro tạo thành SiO2 gây bẩn hai bản điện cực và làm tắc đầu phun, điều

đó sẽ làm giảm độ nhạy và nhiễu đường nền. Trong trường hợp sắc ký điều chế, pha tĩnh có thể bị kéo theo vào bình hứng mẫu và ngưng tụ ở đó làm bẩn các chất thu được nên phải tinh chế lại.

5.3. Chọn và phối hợp detector Việc lựa chọn detetor là một trong những vấn đề rất khó và phụ thuộc vào nhiều thông s ố. - Đối với cột mao quản thường sử dụng detetor FID. - Các detetor dẫn nhiệt cỡ nhỏ cho đến nay hầu như không được sử dụng vì chúng quá nhạy với sự thay đổi tốc độ. Đó cũng là một khó khăn khi muốn phát hiện một số loại khí như CO, CO2, H2O nếu dùng cột mao quản.

Đối với mẫu thuộc nhóm B hoặc C thì nên dùng detetor FID vì có phạm vi tuyến tính lớn và không nhạy cảm với sự thay đổi lưu lượng dòng khí nhất là trong trường hợp sử dụng chương trình nhiệt độ. Để phát hiện các mẫu đặc thù phải sử dụng detetor đặc trưng tương ứng.

Ví dụ, để phát hiện hợp chất chứa halogen trong thuốc trừ sâu, chất độc,… cần phải sử dụng detetor ECD, để phát hiện các hợp chất chứa lưu huỳnh và photpho phải dùng detetor FPD. Nhằm phát hiện một cách hiệu quả các chất cần tách, đôi khi có thể sử dụng kết hợp hai hoặc nhiều detetor cùng một lúc. Ví dụ, kết hợp FID cới TCD, FID với ECD, kết hợp với sự giúp đỡ của bộ chia dòng lối ra và máy tự ghi nhiều kênh. Trong sắc ký mao quản, thường sử dụng bộ chia dòng lối vào nhằm để khống chế lưu lượng khí mang và lượng mẫu bơm vào cột.

5.4 Chọn khí mang Việc lựa chọn khí mang trước hết phụ thuộc vào detetor sử dụng. - Với detetor TCD, tốt nhất là dùng hêli hoặc hydro. - Với detetor FID thì dùng nitơ là đủ. Gần đây, hydro được sử dụng nhiều làm khí mang vì nó có độ nhớt thấp, đặc biệt trong sắc ký mao quản. Detetor ECD sử dụng nitơ sử dụng nitơ hoặc argon có trộn 5% metan..

6. Cơ sở lý thuyết của sắc ký khí mao quản Sắc kí khí mao quản là một hình thái đặc biệt của phương pháp sắc kí khí, được đặc trưng bởi năng suất tách và hiệu suất phân giải rất cao. Nhờ việc sử dụng các cột mao quản hở với chiều dài khá lớn (25m, 50m, 100m…). Về nguyên tắc không có gì khác và có tính nguyên tắc giữa sắc ký khí mao quản với sắc ký khí cột nhồi. Tuy nhiên do việc không sử dụng chất nhồi cột (dưới dạng các hạt chất mang có tẩm pha tĩnh), từ đó tạo ra đường đi tự do cho dòng khí mang, nên có một vài thay đổi trong phương trình cơ bản để đánh giá cột tách so với trường hợp sắc ký khí cột nhồi. Ví dụ : Phương trình Van Deemter thì trong sắc ký khí mao quản được thay bằng phương trình Golay: h= B/u +(Cl + Cs).u Cl,Cs đặc trưng cho sự cản trở đối với quá trình vận chuyển chất từ pha động sang pha tĩnh và ngược lại. Tương tự như sắc ký khí cột nhồi, trong sắc ký khí mao quản thường phải chọn tốc độ khí mang trung bình lớn gấp đôi so với tốc độ khí mang tối ưu (vì nhánh bên phải của đường cong Golay choãi hơn so với nhánh bên trái ) Trong sắc ký khí mao quản chiều cao của đĩa lý thuyết giảm nên làm tăng năng suất cột tách : Giảm độ dày của lớp phim pha tĩnh Giảm nhiệt độ cột tách Giảm đường kính cột tách 92

Sử dụng khí mang với độ nhớt thấp

7. Ph©n tÝch b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ 7.1. Phân tích định tính: Thông thường người ta só sánh thời gian lưu của chất cần xác định với thời gian lưu của chất chuẩn đã có sẵn hoặc thêm. Điều này chỉ có nghĩa khi tiến hành tách trong cùng điều kiện nhiệt độ. Thực tế không phải khi nào cũng có sẵn chất chuẩn nên có nhiều chương trình phần mềm của máy đã cài sẵn thời gian lưu của một số chất ở điều kiện chạy sắc ký nào đó để người phân tích tham khảo. Do t R' phụ thuộc vào nhiều yếu tố (u, to, khối lượng mẫu, pha tĩnh, Vs, tm, p) nên việc xác

định nó để so với các dữ liệu có trong phần mềm có sẵn là cực kỳ khó, vì thế người ta đã dùng thời gian lưu tương đối – chỉ số lưu Kovats (KRI) – để định tính. Theo phương pháp này, dãy

đồng đẳng n-parafin được chọn làm chất chuẩn. Thời gian lưu của các chất cần xác định được tính so với một chất nào đó trong dãy đồng

đẳng của n-parafin. Từ thời gian lưu tương đối này tiến hành so sánh các chất cần phân tích với chất chuẩn có sẵn. Theo Kovats, mỗi parafin có một giá trị chỉ số là 100Z (Z – chỉ số carbon ví dụ CH4 = 100; C2H6 = 200; C3H8 = 300…) do đó một chất phân tích có KRI là 540 tương đương với 1 parafin thông thường chứa từ 4 đến 5 cacbon. KRI có thể tính được từ sắc đồ dựa vào phương trình:

KRI = 100.

lg tR' , X − lg tR' , Z lg t R' , Z +1 − lg tR' , Z

t R' , X là thời gian lưu hiệu chỉnh của chất X cần phân tích t R' , Z ; t R' , Z +1 là thời gian lưu hiệu chỉnh lần lượt của hidrocacbon no chứa Z nguyên tử C được rửa

giải trước X và của hidrocacbon no chứa Z+1 nguyên tử cacbon được rửa giải sau X. Chỉ số lưu Kovats có những ưu điểm sau: - Rất ít phụ thuộc vào thông số làm việc, do đó nó là gia trị đặc trưng cho mối chất ứng với một pha tĩnh và một nhiệt độ nhất định. Sự phụ thuộc vào nhiệt độ của chúng rất nhỏ và về nguyên tắc chỉ khoảng 2 – 6 đơn vị khi thay đổi 10oC. - Độ lặp lại của việc xác định chỉ số lưu của hai phòng thí nghiệm khác nhau chỉ lệch 1

đơn vị và thậm chí với những điều kiện thuận lợi chỉ lệch 0,05 đơn vị.

7.2. Phân tích định lượng Từ việc xác định diện tích hoặc chiều cao của pic, so sánh với mẫu chuẩn (nội chuẩn, ngoại chuẩn hoặc thêm chuẩn) hoặc từ đường chuẩn (nội hoặc ngoại chuẩn) tương ứng, tính ra hàm lượng của chất cần phân tích trong mẫu bơm vào cột. Dưới đây là thí dụ về cách xác định diện tích của một pic: cách thứ nhất tính theo bề rộng của chân pic; cách thứ hai tính theo bề rộng của pic ứng với 1/2 chiều cao của pic.

S p ic ≅

1 ( w .a) 2

S pic ≅ w1/2 .h H×nh 7.1: S¬ ®å pic s¾c kÝ

H = K.Cx; S = K.Cx - Qu¸ tr×nh ®Þnh l−îng gåm 4 giai ®o¹n: Giai ®o¹n 1: T¸ch s¾c ký (nghiªn cøu ®Ó t×m ®iÒu kiÖn t¸ch tèi −u - hÖ sè t¸ch gi÷a hai cÊu tö liÒn kÒ b»ng 1 lµ tèt nhÊt). Giai ®o¹n 2: Thu tÝn hiÖu ë detector vµ chuyÓn tÝn hiÖu thµnh sè liÖu (®o diÖn tÝch ®Ønh). Giai ®o¹n 3: §Þnh l−îng b»ng çch so s¸nh çc diÖn tÝch ®Ønh. Giai ®o¹n 4: Xö lý sè liÖu vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶. - Çc ph−¬ng ph¸p phæ biÕn ®Ó ®Þnh l−îng:

a) Phương ph¸p ngoại chuẩn Tuỳ thuộc vào tÝnh chất của mẫu: hàm lượng, yếu tố cản trở, tÝnh chất phức tạp của nền cũng như độ chÝnh x¸c yªu cầu mà người ph©n tÝch cã thể ¸p dụng c¸c c¸ch định lượng kh¸c nhau: Chuẩn ho¸ một điểm và chuẩn ho¸ nhiều điểm.

Chuẩn hãa một điểm 94

- Nguyªn tắc: Chuẩn hãa một điểm là sử dụng một phÐp đo của chất chuẩn đã biết trước nồng độ, đo độc lập và song song với phÐp đo chất cần ph©n tÝch. - Phương ph¸p này thường ¸p dụng: + Đối với chất ph©n tÝch cã hàm lượng lớn hoặc đP làm giàu đến mức độ cần thiết. + Để đ¸nh gi¸ khi kh«ng yªu cầu độ chÝnh x¸c cao v× ở đ©y bỏ qua çc yếu tố cản, çc sai số ngẫu nhiªn cã thể làm giảm tÝnh chÝnh x¸c của phÐp đo. + Nồng độ của chất ph©n tÝch Cx phải nằm trong khoảng tuyến tÝnh. - Phương ph¸p: Sử dụng hai phÐp đo độc lập: + PhÐp thứ nhất: Chạy sắc kÝ chất chuẩn trong điều kiện tương tự chất ph©n tÝch (nền và çc th«ng số kh¸c giống nhau). + PhÐp thứ hai: Chạy sắc kÝ chất ph©n tÝch. Kết quả tÝnh như sau:

H×nh 7.2: Chuẩn hãa một điểm Ta cã:

C x Cc C C = ⇒ C x = c h x hay: C x = c Sx h x hc hc Sc

Chuẩn hãa nhiều điểm (phương ph¸p đường chuẩn) - Chuẩn bị một dPy dung dịch chuẩn cã nồng độ kh¸c nhau trong điều kiện tương tự mẫu ph©n tÝch. Tiến hành ph©n tÝch sắc kÝ và tÝnh diện tÝch của pic đối với dPy chất chất chuẩn. Sau đã dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tÝnh biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tÝch) của pic vào nồng độ chất ph©n tÝch. Để x¸c định nồng độ chất ph©n tÝch Cx ta cũng thực hiện phÐp đo đối với chất ph©n tÝch, được Sx (hx) nhất định, đối chiếu với đường chuẩn ta cã nồng độ chất ph©n tÝch trong mẩu.

h,S hx

H×nh 7.3: Đường chuẩn nhiều điểm x¸c định chất ph©n tÝch Phương ph¸p này cã ưu điểm là sau khi đP dùng đường chuẩn rồi th× cã thể sử dụng để ph©n tÝch hàng loạt trong cïng điều kiện được khảo s¸t. Nếu hàm lượng chất ph©n tÝch qu¸ bÐ nằm dưới giới hạn của đường chuẩn th× phải sử dụng phương ph¸p làm giàu để tăng nồng độ của chất ph©n tÝch để nã n»m trong vïng tuyến tÝnh. Trong nhiều trường hợp mẫu ph©n tÝch cã thành phần phức tạp, chóng ta chưa biết chÝnh x¸c nªn kh«ng thể chuẩn bị dPy mẫu đầu thoả mPn những quy định cho phương ph¸p này do đã kh«ng x¸c định chÝnh x¸c vị trÝ của đường chuẩn, v× vậy kết quả ph©n tÝch mắc sai số lớn. Trường hợp này kh«ng nªn sử dụng phương ph¸p đường chuẩn mà tốt nhất là sử dụng phương ph¸p thªm chuẩn để x¸c định nồng độ của chất ph©n tÝch trong mẫu. b) Phương ph¸p thªm chuẩn - Nguyªn tắc của phương ph¸p này là dùng ngay mẫu ph©n tÝch làm nền để chuẩn bị dPy mẫu đầu. - Chuẩn bị mẫu: Lấy một lượng mẫu ph©n tÝch nhất định (Cx) rồi thªm vào đã những lượng chÝnh x¸c chất cần x¸c định vào C1, C2, C3, C4, C5 ta được dPy mẫu đầu cã hàm lượng chất x¸c định là:

Co = C x C I = C x + C1 C II = C x + C 2 C III = C x + C3 C IV = C x + C 4 C V = C x + C5 - Tiến hành ph©n tÝch sắc kÝ và tÝnh diện tÝch (chiều cao) của pic đối với dPy mẫu đầu. Sau đã dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tÝnh biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tÝch) của pic vào nồng độ chất ph©n tÝch.

H×nh 7.4: Đường chuẩn của phương ph¸p thªm chuẩn X¸c định Cx bằng phương ph¸p ngoại suy: KÐo dài đường chuẩn về phÝa tr¸i, đường này cắt trục hoành tại điểm Cx, đoạn OCx chÝnh bằng gi¸ trị nồng độ Cx cần t×m. Cũng cã thể x¸c định Cx bằng çch từ gốc toạ độ O kẻ một đường thẳng song song với đường chuẩn, từ điểm Ao kẻ một đường thẳng song song với trục hoành, hai đường này cắt nhau tại điểm M, từ M hạ đường vu«ng gãc xuống trục hoành. Điểm cắt này là Cx. Đoạn OCx chÝnh b»ng gi¸ trị nồng độ Cx cần t×m. Phương ph¸p này cã ưu điểm là qu¸ tr×nh chuẩn bị mẫu dễ dàng, kh«ng cần cã nhiều hãa chất cã độ tinh khiết cao để chuẩn bị dPy mẫu đầu. Mặt kh¸c lại loại trừ hoàn toàn ảnh hưởng về thành phần của mẫu cũng như cấu tróc vật lÝ của mẫu, những sai số ngẫu nhiªn do thao t¸c… Phương ph¸p này x¸c định được hàm lượng chất ph©n tÝch ở nồng độ bÐ mà phương ph¸p đường chuẩn kh«ng ph©n tÝch được và cho độ chÝnh x¸c cao, được nhiều người sử dụng. Nhưng phải chó ý rằng, nồng độ thªm của chất chuẩn phải theo từng bậc và khoảng çch của çc bậc đã phải xấp xỉ bằng Cx th× phần nội suy tuyến tÝnh mới chÝnh x¸c. c) Phương ph¸p nội chuẩn Trong mẫu, çc chất ph©n tÝch cã thể bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố: ảnh hưởng nÒn, çc điều kiện kh¸c g©y sai số hệ thống. Để loại trừ ảnh hưởng này người ta thªm vào mẫu chất nội chuẩn cã tÝnh chất gần giống tÝnh chất của chất ph©n tÝch, cã nồng độ cũng gần bằng nồng độ của chất ph©n tÝch (Cx). Tiến hành 3 phÐp đo sắc kÝ: một phÐp cho chất chuẩn nội, một phÐp cho chất chuẩn cã nồng độ x¸c định (từ çc chất chuẩn), từ đã rót ra được hệ số ảnh hưởng Fx, phÐp sắc kÝ thứ 3 cho chất ph©n tÝch chưa biết và từ đã tÝnh ra nồng độ của nã. Hệ số Fx chÝnh là đại lượng đưa vào để loại trừ ảnh hưởng của nền cũng như çc điều kiện đo kh¸c.

H×nh 7.5: Phương ph¸p chuẩn nội x¸c định chất ph©n tÝch

C c Ci C .h : = F x→ F x= c i . hc hi h c .Ci C x Cc C = → C x = i .h x .Fx h x hc hi d)Phương ph¸p vi sai - Phương ph¸p vi sai nồng độ lớn: Chuẩn bị mẫu: Dung dịch chuẩn 1: C1 Dung dịch chuẩn 2: C2 (C2 > C1) Dung dịch ph©n tÝch: Cx (Cx > C1) Tiến hành phÐp tÝch sắc kÝ dung dịch chuẩn 2 và dung dịch ph©n tÝch trªn nền dung dịch chuẩn 1 và tÝnh diện tÝch (chiều cao) của pic có:

S21 = S2 − S1 , Sx1 = Sx − S1 . Ta

C x − C1 Sx1 S = → C x = x1 ( C2 − C1 ) + C1 . C2 − C1 S21 S21 - Phương ph¸p vi sai nồng độ bÐ: Chuẩn bị mẫu: Dung dịch chuẩn 1: C1 Dung dịch chuẩn 2: C2 (C2 < C1) Dung dịch ph©n tÝch: Cx (Cx < C1) Tiến hành phÐp t¸ch sắc kÝ dung dịch chuẩn 1 trªn nền dung dịch chuẩn 2 và và dung

dịch ph©n tÝch. TÝnh diện tÝch (chiều cao) của pic S12 = S1 − S2 , S1x = S1 − Sx . Ta cã:

C1 − C x S1x S = → Cx = − 12 ( C1 − C2 ) + C1 . C1 − C2 S12 S1x

Phương ph¸p này sử dụng x¸c định c¸c chất cã nång độ qu¸ lớn hoặc qóa bÐ 98

8. Sắc ký khí ghép khối phổ và một số ứng dụng (GC/MS) 8.1. Sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS (Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và

định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm… •

Sắc ký khí (GC: Gas Chromatography)

Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động. Trong sắc ký lỏng (LC) pha động là một dung môi hữu cơ, còn trong GC pha động là một khí trơ gống như helium. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu. Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động. Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích thước, kích cỡ rất đa dạng. Cột của GC dài có thể là 25m, 30m, 50m, 100m và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tránh bằng một lớp polimer đặc biệt nhưphenyl 5% + dimetylsiloxane polymer 95%), đường kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn. Thông thường cột được sử dụng là semivolatile, hợp chất hữu cơ không phân cực như PAHs, các chất trong hỗn hợp được phân tích bằng cách chạy dọc theo cột này. Một chất chia tách, rửa giải phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò. Đầu dò có khả năng tạo ra một tín hiệu bất kỳ lúc nào, khi phát hiện ra chất cần phân tích. Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (TR). Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ từ các tín hiệu như hình 8.1. Đây gọi là sắc đồ, mỗi một peak trong sắc đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu, trong hình 1 mỗi đỉnh (peak) biểu diễn một chất riêng lẻ, chất này được 99

tách từ hỗn hợp mẫu phân tích, peak có thời gian lưu (TR) 4,97 phút là đodecan , 6.36 phút là biphenyl, 7.64 phút là chlolobiphenyl, 9.41 phút là hexadecanoic acid methyl ester. Nếu trong cùng điều kiện sắc ký như nhiệt độ, loại cột… gống nhau thì cùng chất luôn có thời gian lưu giống nhau, khi biết thời gian lưu của hợp chất thì chúng ta có thể chấp nhận

được độ nhạy của nó. Tuy nhiên, chất có tính chất giống nhau thì thường có thời gian lưu giống nhau.

Hình 8.1: Sắc đồ của sắc ký khí •

Khối phổ:

- Sự xuất hiện phổ khối lượng: Khi cho các phân tử trạng thái khí va chạm với một dạng electron có năng lượng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra một hay hai electron và nó trở thành các ion có điện tích +1 (chiếm tỉ lệ lớn) và +2. Giả thiết phân tử chất nghiên cứu là ABC thì:

ABC + e

ABC+ + 2e

(1)

ABC+2 + 3e

(2)

Loại ion ABC+ được gọi là ion gốc hay ion phân tử. Nếu các ion phân tử ABC+ tiếp tục va chạm với chùm electron có năng lượng cao thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các gốc hoặc các phân tử trung hòa khác nhau. Quá trình này được gọi là quá trình phân mảnh (gracmentation). . ABC+ A+ + BC ABC+

. AB+ + C . A+ +B

100

Năng lượng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30-100eV, hơn nhiều so với năng lượng ion hóa của phân tử (8-15eV). Quá trình biến các phân tử trung hòa thành các ion được gọi là sự ion hóa. Trên đồ thị hình dưới đây: I

AB+ ABC+•

A(eV) 20

Hình 8.2: Xác suất có mặt ion mảnh ở axeton. Cho thấy: xác suất có mặt của các ion phụ thuộc vào năng lượng va chạm ở phân tử. Năng lượng khoảng 15eV thì ion phân tử ABC+ đạt cực đại nhưng các mảnh ion AB+ tiếp tục tăng đến năng lượng∼70eV thì tăng chậm và đạt giá trị cực đại. Các ion có khối lượng ion và điện tích e. Tỉ số m/l được gọi là số khối z. Bằng cách nào

đó, tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa xác suất có mặt (hay cường độ phổ khối lượng I) và số

m khối z, tức là: I = ( ) thì đồ thị này gọi là phổ khối lượng. e

100 50 O

m/e Hình 8.3: Phổ khối lượng.

- Khối phổ: được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry). Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, do chúng bị bỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ; 101

Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là iôn, điều này là quan trọng bởi vì các hạt cần ở trạng thái tích điện thì mới đi qua được bộ lọc. Các khối nhỏ chắc chắn, khối của mảnh vỡ được chia bởi các vật mang gọi là tỉ lệ vật mang khối (M/Z); Hầu hết các mảnh vụn có điện tích là +1, M/Z thường miêu tả các phân tử nặng của mảnh vụn.Nhóm gồm có 4 nam châm điện gọi là tứ cực (quadrapole), tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, tứ cự được thành lập bởi phần mền chương trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ. •

Phân tích kết quả

Máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét. Trục hoành biểu diễn tỉ lệ m/z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector. Đây là đồ thị của số khối. Trong hình 19, hình ảnh khối cao nhất là dodecane, phần nềm của GC/MS nó giống như là một thư viện hình ảnh dùng để nhận ra các chất chưa biết tồn tại trong hỗn hợp mẫu. Thư viện này có thể so sánh hình ảnh khối từ thành phần của mẫu với hình ảnh khối trong thư viện của máy.

Hình 8.4: Mass-spectrum 8.2. Một số thành công trong phân tích lượng vết Ví dụ : Tinh dầu từ rễ và thân cây pơmu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Các chỉ tiêu hoá - lý của tinh dầu được xác định bằng phương pháp phân tích hoá học. Thành phần và cấu trúc của một số cấu tử chính được xác định bằng phương pháp phân tích sắc ký - khối phổ (GC-MS). Kết quả thu được cho thấy, hàm lượng một số cấu chính trong tinh dầu là E-Nerolidol (14.91% trong thân, 11.03% trong rễ), Elemol (13.56% trong thân, 31.29% trong rễ), β-Eudesmol (13.09% trong thân, 31.43% trong rễ), γ-Eudesmol (5.34% trong thân, 12.03% trong rễ). 102

- Thành phần hoá học của tinh dầu pơmu: Phổ GC-MS của tinh dầu rễ và thân pơmu được trình bày ở hình 21 và 22.

Hình 8.5: Phổ GC-MS của tinh dầu rễ pơmu

Hình 8.6: Phổ GC-MS của tinh dầu thân pơmu

103

C. BÀI TẬP Bài 1: Tính số đĩa lý thuyết hiệu lực nef và chiều cao của đĩa lý thuyết hiệu lực Hef của hệ sắc ký có tính chất sau: t RA = 280 s; t RB = 300 s; WA = 14 s; WB = 15s. ,thời gian chết là tm=10s, cột có chiều dài là 3,2m. Giải: Theo lý thuyết ta có số đĩa lý thuyết hiệu lực nef là: k '2 ; với k’ là tỷ số dung tích. n=n (k '+1)2

n ef

 t − tM  = 16  R   W 

 280  nA = 16   = 6400  14  2

 300  nB = 16   = 6400  15  Từ đó ta có:  t − t   280 − 10  Đối với pic A: k ' =  R M  =   = 27;  t M   10  2

 27  nef A = 6400   = 5951, 07  27 + 1   t − t   300 − 10  Đối với pic B: k ' =  R M  =   = 29;  t M   10  2

Vậy,

 29  nef B = 6400   = 5980, 4  29 + 1  300 nef = 5065, 7 ; H ef = = 0, 053 . 5965, 7

Bài 2: Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào (lúc đó của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút). Pic của chất X có dạng đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s. Độ dài của cột là 40,2cm. 1. Tính số đĩa lý thuyết trong cột. 2. Tính H của cột. 3. Tính T và σ của cột. 4. Tính chỉ số lưu giữ của chất X. 5. Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 9,9ml. Thể tích của pha động bằng 12,3ml. Hãy tính hệ số phân bố X. 6. Tiêu chuẩn phân chia X và Y là bao nhiêu nếu yếu tố phân chia đối với X và Y bằng 1,011. Giải: 1. Số đĩa lý thuyết (n): 2

t   15.60  n X = 16 RX  = 16  = 22130  24,2   WX  104

2. Tính H:

L L 40,2 ⇒H = = = 1,82.10− 3 (cm) H n 22130

Ta có n = 3. Tính σ và T:

Từ n =

σ2 H

Ta có: T =

⇒ σ = n.H 2 = 22130.(1,82.10− 3 ) 2 = 0,27(cm)

σ .t R L

15.0,27 = 0,101( phut ) 40,2

4. Chỉ số lưu giữ của chất X: t 1,32 Ta có: R = m = = 0,088 tR 15 5. Hệ số phân bố X (kX): Vm V (1 − R ) 12,3(1 − 0,088) Ta có: R = ⇒ kX = m = = 12,9 Vm + k .VS R.VS 0,088.9,9 6. Tiêu chuẩn phân chia (Rs): n 1 22130 1 Ta có: RS = (1 − ) = (1 − ) = 0,4 với α là yếu tố phân chia. 4 α 4 1,011 Bài 3: Cho hệ sắc ký có tính chất sau: t RA = 280 s; t RB = 300 s; WA = 14 s; WB = 15s. Cột có chiều dài là 3,2m. Thay đổi chiều dài từ 320 cm lên 400 cm. Tính độ phân giải? Giải: 400 400 t RA = 280. = 350( s ) t RB = 300. = 375( s ) 320 320 2

t   280  nA = 16.  RA  = 16   = 6400  14   WA 

t   300  nB = 16.  RB  = 16   = 6400  15   WB 

400 t  n = 16.  R  = 6400. = 8000 320 W 2

16.t 2R t  Ta có: n = 16. R  ⇒ W = n W 16.(350) 2 = 15, 65( s ) 8000 2. ( 375 − 350 ) R= = 1,54 15, 65 + 16, 77

WA =

WB =

16.(375) 2 = 16, 77( s ) 8000

Bài 4: Một cột sắc ký mao quản dài 30m, chạy một chất chuẩn ở hai tôc độ pha động khác nhau, cho các số liệu sau: Tốc độ (cm/s) Số đĩa lý thuyết 0,5 150 000 120 000 Xác định vận tốc tối ưu,chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó,cho A=0. Giải TN1 H1 = 3000/150000 = 0,02 cm TN2 H2 = 3000/120000 = 0,025 cm. Ta có phương trình: 105

B + 0, 5C 0,5 B 0, 025 = + C 1 Giải phương trình ta được : C= 0,02 s ; B = 0,005 cm2/s. U tối ưu = (B/C)1/2 = 0,5 cm/s Hmin = 2(B.C)1/2 = 0,02 cm. Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là: 3000 n= = 150000 . 0,02

0, 02 =

Bài 5: Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng phương pháp sắc ký lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm. Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5 và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05 phút. Hãy tính: 4. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của cột. 5. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen. Cho biết khí được sử dụng là không khí với tR(KK) = 1,2 phút (không khí được xem là cấu tử không bị lưu giữ bởi cột). 6. Hãy tính chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5. Giải Ký hiệu A : metyl xiclohexan B: metyl xiclohexen C: toluen.

t 1. Sử dụng phương trình : n = 16( R ) 2 tính được số đĩa lý thuyết w A: n = 2902 B: n = 3025 C: n =2645 ntb = 2900 L 420 H= = = 0, 015cm ntb 2900

σ2

⇒ σ = n.H 2 = 2900.(0, 015)2 = 0,81(cm) H2 2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen 2∆t R Rs , A− B = = 1,16 wA + wB

2∆t R = 2, 70 wA + wB 3.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5. Vì Rs,A-B = 2,70>1,5 nên chỉ cần tính chiều dài để độ phân giải giữa A-B đạt yêu cầu 1,5. Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có: Rs ,1 n 1,16 2900 = 1 ⇔ = ⇒ n2 = 4800 Rs ,2 1,50 n2 n2 Rs , B −C =

106

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5: L2 = H.n2 = 0,015. 4800 = 73 cm.

Bài 6: Một phép sắc ký khí sử dụng cột dài 36 m, chạy chất chuẩn ở 3 thí nghiệm với tốc độ pha động khác nhau cho các pic có thời gian lưu và độ rộng pic như sau: Thí nghiệm

u (cm/s)

tR (s)

w (s)

300

250

150

Xác định vận tốc tối ưu, số đĩa lý thuyết cho cột vận hành ở vận tốc tối ưu đó

Giải : Theo phương trình Van-Deemter, muốn xác định được vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết ta cần xác định các hệ số A, B, C. Muốn vậy ta xác định số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết cho từng thí nghiệm : Ta có : L=36 m = 3600 cm 2

TN 1:

 300  n1 = 16  = 3600  20 

TN 2:

 250  n2 = 16  = 3906  16 

TN 3:

 150  n3 = 16  = 3600  10 

H1 =

3600 = 1,00(cm) 3600

H2 =

3600 = 0,92(cm) 3906

H3 =

3600 = 1,00(cm) 3600

Thay các số liệu vào phương trình trên ta có hệ phương trình sau: 1,00 = A +

B + 10C 10

0,92 = A +

B + 20C (2) 20

1,00 = A +

B + 30C (3) 30

(1)

Giải hệ gồm 3 phương trình (1), (2) và (3) ta được: A= 0,36 (cm), B = 4,8 (cm2/s) và C = 0,016 (s) Vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết được tính là :

utoiuu =

B = C

4,8 = 17,32(cm / s ) 0,016

H min = A + 2 B.C = 0,36 + 2 4,8.0,016 = 0,914(cm )

107

L 3600 = = 3939 H 0,914

108

D. KẾT LUẬN Qua một thời gian tìm hiểu, tôi đã thu được một số kết quả như sau : - Tổng quan được tài liệu và đưa ra được những vấn đề chung nhất và cơ bản nhất trong lý thuyết của phương pháp sắc ký khí như: nguyên tắc của sắc ký khí, thiết bị kỹ thuật sắc ký khí, một số ứng dụng cơ bản của sắc ký khí, các điều kiện tối ưu nhằm giúp việc phân tích đạt hiệu quả cao nhất ... và trên cơ sở đó đã đưa ra kết luận về ưu nhược điểm của sắc ký khí. - Sưu tầm một số bài tập có lời giải về sắc ký. Từ những gì tôi tìm hiểu được, một lần nữa đã giúp tôi khẳng định rằng sắc ký khí thật sự là một phương tiện đầu tay cho các nhà khoa học. Mặc dù đã cố gắng nhiều nhưng do thời gian và trình độ có hạn nên bài tiểu luận của tôi không tránh khỏi thiếu sót. Vì vậy tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cũng như các bạn

để kiến thức của tôi được hoàn chỉnh hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, Tập 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ

thuật. 2. Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Trần Văn Sung (2005), Các phương pháp phân tích vật lý trong hóa học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 4. Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Hùng Việt (1985), Các phương pháp sắc ký, NXB Khoa học và kỹ thuật.

5. TS. Nguyễn Văn Tứ, Bài giảng chuyên đề hóa phân tích hiện đại, Khoa Hóa trường ĐHSP Huế

109

Chương 4. SẮC KÍ ĐIỆN DI MAO QUẢN HIỆU NĂNG CAO

1. Giới thiệu về phương pháp HPCEC 1.1. Sự ra đời và phát triển Năm 1937: Sắc kí điện di được nghiên cứu lần đầu tiên bởi Tiselius (Thụy Điển) khi ông tách được các cấu tử trong huyết thanh (α, β, γ globumin). Sau đó được ông phát triển trên cơ sở nghiên cứu tách và phân tích các hỗn hợp protein, amin, amino axit ở thế thấp

(110 – 220V) và được gọi là điện di cổ điển. Nhờ kết quả nghiên cứu và đề xuất ra kĩ thuật tách mới này nên Tiselius đã nhận được giải thưởng Nobel năm 1949. Năm 1953: Edstrom đã dùng sơi mao quản đường kính 15 µm để tách được lượng nhỏ ADN. Năm 1967: Hjerten nghiên cứu một cách có hệ thống và mô tả chi tiết, cũng như hoàn chỉnh cơ sở lý thuyết sắc kí điện di mao quản trong ống hở. sau đó là các nhà khoa học Later Virtamen, Mikkers đã nghiên cứu và phát triển tiếp kĩ thuật này trên ống mao

quản bằng thủy tinh và teflon. Tiếp đó nhà khoa học Jorgen son đã phân loại lý thuyết về các kiểu CE và mô tả đặc điểm và cách hoạt động của mỗi loại. Giữa thập kỷ 80: sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao (HPCEC) được nghiên

cứu và phát triển, nó là sự kết hợp giữa điện di cổ điển với tính chất của cột sắc kí khí mao quản và các detector có độ nhạy cao của kĩ thuật HPLC. Song muốn thực hiện điện di được trong ống mao quản thì phải áp vào 2 đầu mao quản thế cao (15 – 50 kV), vì vậy có tên là sắc kí điện di mao quản thế cao. Cuối năm 1992: một số hãng như ISCO, HP, Berkman đã bắt đầu đưa ra thị trường một số hệ thống máy CEC đầu tiên. Năm 1994: thời kì phát triển của HPCEC. Năm 1995: các nước tiên tiến đã áp dụng kĩ thuật phân tích này trên nhiều lĩnh vực khoa học, kinh tế, nông công nghiệp và y dược.

Từ năm 1995 đến nay, kĩ thuật HPCEC có bước phát triển nhảy vọt. Hiện nay kĩ thuật phân tích HPCEC đã và đang phát triển ở mức độ cao và được ứng dụng rất hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoa học công nghệ, nhất là y dược và sinh học.

110

Hình 1. Sự phát triển của HPCEC (giai đoạn từ năm 1980 đến 1997) 1.2. Phân loại các kiểu HPCEC

Sắc kí điện di mao quản rất đa dạng, có nhiều kiểu (mode) từ đơn giản đến hoàn chỉnh và phức tạp. Tùy theo cơ chế, bản chất và đặc điểm của sự tách xảy ra trong ống mao quản mà người ta phân thành các kiểu khác nhau như sau: Bảng 1. Phân loại các kiểu điện di mao quản Kiểu điện di

Bản chất của sự tách và đặc trưng

- Sự điện di dung dịch tự do theo vùng mẫu. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis-CZE)

- Sự tách các chất xuất hiện do sự di chuyển của chất tan trong mao quản theo mỗi vùng của chất riêng rẽ, chúng di chuyển theo tốc độ khác nhau và do dòng EOF trong ống mao quản là nhân tố quyết định dưới tác dụng của lực điện trường E.

Sắc kí điện di mao - Sự tương tác ionic hay hydrophobic với Micell. quản điện động Micell - Bản chất, trung tâm của sự tách là sự hình thành các (Micellary Capillary Micelle trong mao quản, các tiểu phân này sẽ dẫn dắt và Electro-Kenetic đóng góp thêm khả năng của quá trình tách các chất trên Cromatoghraphy-MEKC) nền dung dịch đệm và chất điện di trong ống mao quản. Sắc kí điện di mao

Tách theo kích thước và điện tích chất tan.

quản gel (rây phân tử) 111

((Capillary Gel Electrophoresis-GelCEC) Sắc kí điện di mao - Dựa vào tính chất của điểm đẳng điện pI và vùng mẫu. quản hội tụ đẳng điện - Sự tách sắc kí ở đây là dựa trên cơ sở của sự điện di kết ((Capillary Isoelectric hợp với sự khác nhau giá trị pI của chất tan và sự hội tụ Focusing đẳng điện trong một điều kiện nhất định để hội tụ vùng Chromatographymẫu gọn lại, làm giàu chất phân tích.

CIEFC) Sắc kí điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Isotachophores Chromatography-

Dựa vào tính chất đẳng tốc độ nhất thời.

CITEC) 1.3. Đặc điểm của sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao

Phương pháp HPCEC có các đặc điểm sau đây: 1. Có hiệu lực tách các chất rất cao trong ống mao quản thủy tinh, ống teflon

(đường kính trong 25-100 µm). 2. Thế điện di rất cao, thường từ 10 – 50 kV ( 150-550 V/cm ) đặt ở hai đầu ống mao quản để tạo điện trường E. 3. Số đĩa hiệu lực của cột tách là rất lớn, thường từ 105 đến 106 đĩa /m nên cho kết

quả tách tốt đối với những chất phức tạp. 4. Thời gian tách hỗn hợp nhanh, khoảng 5 – 20 phút. 5. Việc phát hiện hầu hết các chất bằng detector UV hay UV-VIs (trực tiếp hoặc

gián tiếp) được thực hiện ngay trên một đoạn nhỏ của đầu cuối ống mao quản nên không cần bộ flowcell như trong HPLC (Hình 2). 6. Lượng mẫu nạp vào cột tách rất nhỏ, khoảng 5 - 20nL (nhỏ hơn lượng mẫu của HPLC trên 1000 lần) nên rất phù hợp để tách các mẫu có khối lượng rất nhỏ, như mẫu

máu bệnh nhân, vật liệu quý hiếm. 7. Có nhiều kiểu tách (bảng 1) nên khả năng ứng dụng thực tế rất rộng rãi, đa dạng và phong phú. Đặc biệt thích hợp cho nhiều đối tượng phức tạp như các mẫu sinh học. 8. Sự tách chủ yếu thực hiện trong dung môi nước có chất đệm pH và chất điện ly nên không tốn nhiều dung môi đắt tiền như trong HPLC. 9. Việc vận hành tách và phân tích không phúc tạp, cũng dễ dàng tương tự HPLC. 112

10. Có thể sử dụng nhiều trang bị của HPLC như máy tự ghi, tích phân kế. Do vậy cơ sở nào đã có HPLC thì dễ dàng phát triển và ứng dụng HPCEC. 11. Tự động hóa được trong quá trình tách và phân tích hàng loạt mẫu. 12. Do đường kính trong của mao quản nhỏ nên nó giới hạn và làm khó khăn dòng chảy, vì thế dễ xuất hiện hiệu ứng nhiệt Jun không có lợi. Do đó phải khống chế nhiệt độ của mao quản để đảm bảo thu được kết quả phân tích ổn định.

Hình 2. Một đoạn ống mao quản trong HPCEC được xem như một Fowcell

Với những đặc điểm trên, kĩ thuật phân tích HPCEC đã được phát triển rất nhanh và ứng dụng nhiều trong y học, hóa học, sinh học, dược, nông nghiệp với tốc độ chưa từng thấy trong các kĩ thuật phân tích.

2. Một số đại lượng trong HPCEC 2.1. Tốc độ điện di, độ điện di, thời gian điện di 2.1. 1. Tốc độ điện di

Sự tách các chất bằng điện di dựa trên cơ sở tốc độ di chuyển khác nhau của các chất trong ống mao quản trên nền dung dịch đệm và chất điện li thích hợp dưới tác dụng của điện trường E thích hợp do thế V đặt vào 2 đầu ống mao quản sinh ra. Tốc độ di chuyển của chất i được tính theo công thức:

vi = µiE = µi.

V L

(2.1)

Trong đó: vi là tốc độ điện di của chất i trong ống mao quản; µi là độ điện di của chất i;

V là thế đặt vào 2 đầu ống mao quản (V); E là cường độ điện trường giữa 2 đầu cột mao quản do thế V sinh ra; L là chiều dài tổng của ống mao quản (cm). 113

2.1.2. Độ điện di

Theo công thức (2.1) ta có:

µi =

vi E

(2.2)

Trong điều kiện tốc độ dòng ổn định, lực điện trường FE và lực cản Ff (lực ma sát) cân bằng nhau (cùng độ lớn nhưng ngược chiều), FE = Ff , do đó:

qE = 6πηR.vi

(2.3)

Trong đó: η là độ nhớt của dung dịch; R là bán kính của ion i. Từ (2.1), (2.2), (2.3) ta có biểu thức độ điện di µi:

µi =

(2.4)

6πη R

Theo (2.4) ta thấy: Độ lớn của độ điện di µi tỉ lệ thuận với điện tích ion q và tỉ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch η, bán kính của ion R, nghĩa là trong điện trường E nhất định thì: Phần tử nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh. Các ion cùng điện tích thì ion nào có kích thước nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn. Các ion cùng kích thước thì ion nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển nhanh

hơn. Độ điện di µi của các chất được xác định bằng thực nghiệm trong điều kiện chuẩn được gọi độ điện di chuẩn µi0. Nhưng trong thực tế, các dung dịch trong ống mao quản

không phải trong điều kiện chuẩn hay chỉ duy nhất chất nghiên cứu mà còn có các chất khác. Để phản ánh đúng và phù hợp các điều kiện thực nghiệm trong ống mao quản người ta dùng độ điện di hiệu lực µef. Giá trị µef ngoài phụ thuộc bản chất, kích thước, điện tích của chất phân tích, điện thế V đặt vào 2 đầu ống mao quản thì còn phụ thuộc: Giá trị pH và nồng độ của dung dịch đệm điện giải trong mao quản; Thành phần và nồng độ chất điện giải trong pha động; Hằng số điện li K của chất tan (axit, bazo, phức, …); Chất hoạt động bề mặt, chất phụ gia trung tính trong pha động; Dung môi hữu cơ thêm vào pha động điện di hay mẫu phân tích, … 2.1.3. Thời gian điện di

Khi điện di, thời gian cần thiết để cho một chất tan di chuyển từ lúc được nạp vào đầu ống mao quản đến khi nó đến vị trí trung tâm flowcell của detector, được phát hiện ở vị trí pic sắc kí cực đại, được gọi là thời gian điện di của chất tan. Tương tự như trong HPLC, người ta cũng gọi là thời gian lưu hay thời gian rửa giải của chất tan ti. 114

Thời gian điện di được tính theo công thức:

ti =

l L.l = vi V µi

(2.5)

Trong đó: l là chiều dài hiệu lực (cm) (tính từ điểm mẫu được nạp đến vị trí trung tâm của flowcell của detector); L là chiều dài tổng của ống mao quản (cm), L > l; V là điện thế đặt vào 2 đầu ống mao quản (V). Vì chất tan di chuyển trong dòng điện di thẩm thấu (EOF) nên thời gian điện di và các thông số thực nghiệm khác có thể được dùng để tính toán độ điện di phải là giá trị tổng số µtot của các phân tử chất tan. Do đó độ điện di toàn phần trong mao quản của chất tan i là (E là cường độ điện trường tạo bởi điện thế V):

µtot = ( µi + µEOF ) =

vi l L.l = = E ti .E V .ti

(2.6)

Suy ra thời gian lưu của chất tan i là:

ti =

L.l V µtot

(2.7)

2.2. Hệ số phân bố và hệ số dung tích 2.2.1. Hệ số phân bố Ki

Trong quá trình điện di, nếu ống mao quản có pha tĩnh (giả hoặc thật) thì luôn có sự phân bố chất tan giữa 2 pha là pha tĩnh và pha động. Sự phân bố này cũng là một quá trình cân bằng động học của sự điện di. Đặc trưng cho quá trình phân bố này là hằng số cân bằng hay hệ số phân bố Ki. Hệ số phân bố Ki cho biết trong điều kiện điện di cụ thể thì chất tan i phân bố như thế nào giữa 2 pha trong ống mao quản:

Ki =

Ci ( SP )

(2.8)

Ci ( MP )

Trong đó: Ci(SP) và Ci(MP) lần lượt là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh (SP) và pha động (MP). Hệ số phân bố Ki được xác định bởi: Bản chất và các đặc trưng của pha tĩnh; Bản chất, thành phần, các chất có trong pha động và giá trị pH của nó; Lực điện trường E, tức là thế V đặt vào 2 đầu mao quản; 115

Nhiệt độ của mao quản.

Theo quan điểm của nhiệt động học, hệ số phân bố Ki được xác định bởi công ∆H 0 ∆S 0 + RT R

ln(Ki) =

thức sau:

(2.9)

Trong đó: ∆H0, ∆S0 lần lượt là entapi chuẩn, entropy chuẩn của chất tan; R là hằng số khí; T là nhiệt tuyệt đối trong ống mao quản. 2.2.2. Hệ số dung tích ki’

Hệ số dung tích ki' cho biết trong điều kiện điện di cụ thể thì chất tan i tồn tại như thế nào trong pha tĩnh của ống mao quản và được xác định bằng công thức sau:

ki' =

Hay Trong đó :

(ti − t0 ) [t0 .(1 − ti / t0 )]

ki' = K i .

VSP VMP

(2.10)

(2.11)

ti là thời gian lưu của chất tan i trong mao quản; t0 là thời gian không lưu giữ của chất tan i trong mao quản; Ki là hệ số phân bố; VSP,VMP là thể tích của pha tĩnh và pha động; VSP được gọi là tỉ số pha của hệ cột tách. VMP

Việc điều chỉnh tỉ số pha sẽ làm thay đổi hệ số dung tích ki’. Mặt khác nếu tỉ số pha không đổi thì hệ số dung tích của chất tan coi như là hàm của hệ số phân bố Ki của chúng. Chính mối quan hệ này tạo điều kiện để tối ưu hóa các điều kiện điện di, từ đó có được ki’ thích hợp để thu được kết quả sắc kí tốt nhất. Ngoài ra ki’ còn phụ thuộc pH của pha động. Lợi dụng điều này người ta thay đổi điều kiện pha động như chất đệm, pH đệm, thành phần và nồng độ chất điện giải để có ki’ thích hợp. Nếu trong cột tách là hệ pha MEKC thì đại lượng ti / t0 được thay bằng ti / tMC với tMC là thời gian không lưu giữ của pha Micell. Từ đó tính được thời gian lưu tổng của chất tan là:

t0 .tMC (1 + ki' ) ti = tMC + t0 ki'

(2.12)

Nếu tMC << t0ki’ thì ta có:

tMC (1 + ki' ) ti = ki' 116

(2.13)

Từ (2.12) và (2.13) ta thấy: khi ki’ lớn thì thời gian điện di ti sẽ dài và ngược lại. 2.3. Chiều cao đĩa, số đĩa và số đĩa hiệu lực của mao quản Sự khác nhau cần thiết về độ điện di µef để cho 2 vùng mẫu của 2 chất tan tách khỏi nhau phụ thuộc các điều kiện điện di và độ rộng của vùng chất tan tồn tại trong ống mao quản. Độ rộng này lại phụ thuộc quá trình phân tán của chất tan trong mao quản khi nó di

chuyển dưới tác dụng của điện trường E. Sự phân tán thường gây ra do sự mở rộng vùng chất tan trong mao quản. Nó là kết quả của sự di chuyển không đồng đều của các chất tan trong vùng mẫu đó, và được coi như bằng độ rộng của pic sắc kí điện di Wb, Wb = 4σ, σ là độ lệch chuẩn. Số đĩa lý thuyết N của ống mao quản được tính theo công thức :

µ .V .l l N = ( ) 2 = ef σ 2 Di .L Trong đó:

với

σ 2 = 2 Di ti

(2.14)

l là chiều dài hiệu lực của ống mao quản; Di là hệ số khuếch tán của chất tan i trong pha động; ti là thời gian lưu của chất tan i.

Từ đó ta có chiều cao của một đĩa lý thuyết là:

2 Di .L l = N µi .V

(2.15)

Mặt khác ta lại có:

2 Di 1 ki' d 2V . + . H= V 16 (1 + ki' ) 2 Di Trong đó :

(2.16)

ki' là hệ số dung tích của chất tan i;

Di là hệ số khuếch tán của chất tan i trong pha động; d là đường kính trong của ống mao quản; V là điện thế đặt vào 2 đầu ống mao quản. Tương tự như trong HPLC số đĩa lý thuyết của cột mao quản cũng có thể tính trực tiếp từ sắc đồ theo công thức:

N = 5,54.(

Trong đó :

tR 2 ) W1/ 2

tR là thời gian lưu của chất tan i, t R = W1/2 là độ rộng ở nửa chiều cao pic; 117

(2.17)

L.l ; V .µi

Trong thực tế thì người ta hay dùng công thức (2.17) để xác định số đĩa lý thuyết N hơn là dùng công thức (2.14). Để đặc trưng cho hiệu lực của sự tách trong các điều kiện cụ thể nhất định mà có

kể đến sự mở rộng vùng mẫu thì người ta dùng khái niệm số đĩa lý thuyết hiệu lực Nef và tính theo công thức sau:

N ef = (

σ tot

(2.18)

Trong đó: l là chiều dài hiệu lực; (σ tot )2 là độ lệch chuẩn có tính đến các yếu làm mở rộng vùng mẫu, bao gồm: (σ D ) 2 - sự khuyếch tán thẳng; (σ ln J )2 - sự nạp mẫu; (σ Temp ) 2 - sự gradient nhiệt độ và hiệu ứng nhiệt Jun; (σ ad )2 - sự hấp phụ của thành mao quản; (σ det )2 - của detector; (σ elect ) 2 : do yếu tố điện và điện tích.

Như vậy:

(σ tot )2 = (σ D ) 2 + (σ ln J )2 + (σ Temp ) 2 + (σ ad ) 2 + (σ det )2 + (σ elect ) 2

2.4. Tốc độ tuyến tính

Tương tự như trong HPLC, trong các hệ HPCEC, tốc độ tuyến tính u cho biết trong một đơn vị thời gian, vùng mẫu của một chất trong mao quản di chuyển được một đoạn là bao nhiêu. Đơn vị của u là ( mm/s). Tốc độ tuyến tính u được xác định bởi các yếu tố: Thế một chiều V đặt vào 2 đầu của mao quản; Bản chất của các chất, kích thước và điện tích của nó; Bản chất, thành phần và pH của pha động điện di.

Ngoài ra u chịu tác động của các yếu tố: Các đặc trưng bề mặt của ống mao quản; Các chất phụ gia, dung môi hữu cơ,…thêm vào pha động; Nhiệt độ của mao quản.

So với HPLC, trong HPCEC thì các giá trị tốc độ u ở 2 bên giá trị u0 tối ưu thay đổi rất ít. Điều này cho phép chọn các giá trị u ở một vùng rộng xung quanh u0 mà vẫn cho kết quả tách điện di tốt. Cũng vì vậy mà trong HPCEC việc tính toán chính xác tốc độ tuyến tính u không yêu cầu nghiêm ngặt như trong HPLC. Một cách gần đúng, đại

lượng u được tính theo công thức:

l ti

(2.19)

Trong đó: l là chiều dài hiệu lực của mao quản; ti là thời gian lưu của chất. 118

2.5. Độ phân giải Độ phân giải R của 2 chất i và j liền nhau (pic sắc ký cạnh nhau) được định nghĩa như sau:

Rij =

2(ti − t j ) (Wi + Wj )

(ti − t j )

(2.20)

4σ

Trong đó: ti , t j là thời gian lưu của chất tan i và j ( giây hoặc phút ) và ti > t j ; wi , w j là độ rộng đáy của pic 2 chất i, j ( giây hoặc phút );

σ là độ lệch chuẩn. Độ phân giải Rij của 2 chất i và j trong HPCEC cũng có thể được biểu diễn theo số đĩa lý thuyết hiệu lực Nef như sau:

Rij = 0.25 N ef .

∆µ

µtb

với

N ef =

µef .V l 2 Di

(2.21)

Trong đó: ∆µ = µi − µ j là hiệu độ điện di hiệu lực của 2 chất i và j;

µtb =

µi + µ j là trung bình cộng độ điện di hiệu lực của 2 chất tan i và j. 2

Ta có thể viết lại biểu thức độ phân giải Rij như sau:

Rij = 0, 25.( N ef ).(∆ µ ).

Hay:

Rij = 0, 25. ( µi + µEOF ).

V Di .( µtb + µ EOF )

(2.22)

V .l ∆µij .( ) 2 Di L µ tb

(2.23)

Theo (2.22) thì Rij phụ thuộc vào căn bậc 2 của Nef và V nhưng theo (2.23) thì Rij phụ thuộc tuyến tính vào ∆µij của 2 chất tan kề nhau. Cũng theo (2.21) thì Rij đạt cực đại khi µtb và µEOF bằng nhau nhưng ngược dấu, tức là tốc độ di chuyển của dòng ion cùng độ lớn với tốc độ dòng điện di thẩm thấu EOF nhưng ngược chiều nhau. Lúc này thời gian điện di sẽ rất dài. Do vậy cần cân đối giữa thời gian phân tích và độ phân giải để đạt hiệu quả tách tốt nhất. 2.6. Hiệu ứng nhiệt và sự gradient nhiệt độ 2.6.1. Hiệu ứng nhiệt Jun và ảnh hưởng của nó

* Khái niệm: Hiệu ứng nhiệt Jun ở đây là nhiệt được sinh ra (làm nhiệt độ ống mao quản tăng) khi có một dòng điện i chạy qua dung dịch trong ống mao quản. Sự tăng

119

nhiệt độ này được quyết định bởi công suất của dòng điện qua ống mao quản (tích số i.V). * Ảnh hưởng của hiệu ứng nhiệt Jun: hiệu ứng nhiệt Jun gây ra sự gradien nhiệt độ trong mao quản, dẫn đến thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong mao quản. Điều này làm cho các phần tử của ngay một chất cũng di chuyển không đồng nhất, kết quả làm doãng chân pic sắc kí, giảm số đĩa hiệu lực và làm giảm hiệu quả tách. Sự gradien nhiệt độ giữa tâm và thành ống mao quản phụ thuộc vào đường kính của ống mao quản, độ dày thành mao quản, độ dày của lớp polime phủ lên thành mao quản và hệ số truyền nhiệt ra môi trường xung quanh. Sự phụ thuộc này được mô tả gần đúng theo công thức:

 W.(r1 ) 2   1 r3 r2 1 1 1  ∆Ttot =  . ln( ) + ln( ) + ( ).( )    r1 k2 r2 r3 h   2   k1

(2.24)

Trong đó: W là công suất sinh nhiệt ( w/mm2 ); r1, r2, r3 lần lượt là bán kính mao quản trong, ngoài và có lớp PVC phủ ngoài (µm); ki là độ dẫn nhiệt ở vùng i ( i=1,2,3); h là tốc độ truyền nhiệt từ mao quản ra ngoài. Bảng 2. Sự chênh lệch nhiệt độ giữa tâm và thành mao quản ( với V = 350V/1cm, thành mao quản dày 250 µm) Nhiệt độ (K)

Bán kính trong ống mao quản (µm )

Sát thành

Ở tâm

Sự chênh lệch nhiệt độ, ∆T

299,00

299,55

0,55

301,20

302,59

1,39

304,40

307,64

3,24

100

307,00

312,58

5,58

125

311,60

320,32

8,72

150

324,80

335,90

11,10

Thực nghiệm cho thấy khi đường kính trong của mao quản càng lớn thì sự chênh lệch nhiệt độ bên trong và bên ngoài mao quản càng lớn, tức sự gradien nhiệt độ càng mạnh. Với các mao quản đường kính trong 15 – 25 µm thì hiệu ứng nhiệt Jun hầu như không đáng kể. Song khi dùng mao quản nhỏ như thế ( dưới 25 µm) thì lượng mẫu nạp vào là quá nhỏ (chỉ 2 – 3 nL) nên khó nạp mẫu chính xác hoặc việc phát hiện chất phân tích gặp khó. Vì thế nên dùng mao quản có đường kính trong từ 25 - 75 µm. 120

2.6.2. Kiểm tra và khống chế hiệu ứng nhiệt

Sự gradien nhiệt độ do hiệu ứng nhiệt Jun gây ra là một điều bất lợi và là nhược điểm cũng như là khó khăn của kĩ thuật sắc kí điện di mao quản. Vì vậy việc kiểm tra và khống chế nhiệt độ của mao quản hằng định là điều rất cần thiết. Sau đây là một số phương pháp: 1. Điều hòa buồng mao quản bằng dòng không khí mát có nhiệt độ mong muốn, hay không khí ở nhiệt đô phòng thí nghiệm. Cách này đơn giản, dễ thực hiện nhưng việc khống chế nhiệt độ chỉ đạt được trong phạm vi ± 20C. 2. Điều nhiệt mao quản bằng chất lỏng nhờ máy điều nhiệt. Có 2 cách thực hiện: Điều hòa mao quản bằng dòng nước sạch mát có nhiệt độ được khống chế

nhờ máy điều nhiệt (ống mao quản đặt trong hộp nước có điều nhiệt). Cách này chỉ áp dụng khi điện thế V đặt vào 2 đầu mao quản dưới 18 kV, còn khi V cao hơn thì rất nguy hiểm. Điều hòa mao quản bằng dòng dầu trơ (không dẫn điện ở thế cao) có khống

chế nhiệt độ mong muốn (ống mao quản đặt trong hộp dầu trơ có điều nhiệt). Cách này rất tốt, có thể dùng khi thế đến 40 kV. 2.7. Sự tương tác của chất phân tích với thành mao quản 2.7.1. Khái niệm về sự tương tác

Sự tương tác của chất phân tích với thành ống mao quản trong CEC là một yếu tố luôn xảy ra và là bất lợi cho sự tách các chất. Sự tương tác này có thể theo các cơ chế sau: Tương tác tĩnh điện của các phần tử có điện tích trái dấu; Tương tác hấp phụ vật lí của bề mặt; Tương tác phân tán của bề mặt xốp hạt pha tĩnh (khi mao quản có pha tĩnh).

Các tương tác đó có thể xảy ra đồng thời, hoặc cũng có thể chỉ ưu tiên một trong ba cơ chế trên, tùy thuộc các điều kiện điện di, như pha động, pH, thế V và loại mao quản, cũng như các chất mẫu. Chất phân tích có thể bị hấp phụ một phần, hoặc là bị hấp phụ toàn phần lên bề mặt thành mao quản. Nguyên nhân chủ yếu gây ra sự hấp phụ của thành ống mao quản silica là tương tác ionic giữa cation của chất tan với bề mặt mao quản mang điện tích âm, kể cả sự tương tác ưa nước hay kị nước. 2.7.2. Kiểm tra và khống chế tương tác có hại

Sự tương tác của chất phân tích với thành mao quản trong hầu hết các trường hợp thường gây ra ảnh hưởng xấu đến sự điện di của chất phân tích, như làm doãng pic, giảm hiệu quả tách. Vì thế kiểm tra và khống chế sự tương tác của chất phân tích với thành mao quản là một việc rất cần thiết để loại bỏ hay hạn chế đến mức tối thiểu sự 121

tương tác đó. Để khắc phục ảnh hưởng này, người ta phải xử lí bề mặt mao quản bằng cách là hoạt hóa và biến đổi bề mặt mao quản. Hoạt hóa và biến đổi bề mặt mao quản là làm thay đổi lớp điện tích trên bề mặt

thành mao quản, để giới hạn, hay làm nhỏ sự hấp phụ, hay sự tương tác của nó với các chất phân tích, để cho quá trình điện di xảy ra tốt, hạn chế sự doãng pic do tương tác chất phân tích với thành mao quản gây ra. Để biến đổi bề mặt thành mao quản, hiện nay có 2 kiểu thực hiện: Kiểu 1: Biến đổi vĩnh cửu và cố định bề mặt thành mao quản

Người ta tráng hay phủ lên thành mao quản một lớp màng mỏng của một polime thích hợp. Có thể dùng phương pháp tráng phủ vật lí hay dùng phương pháp liên kết hóa học của chất polime phủ với silica của mao quản để tạo thành một lớp màng mỏng polime không hay rất kém tương tác với chất phân tích. Lớp màng này được gọi là màng bám hay pha bám. Ưu điểm:

+ Không yêu cầu nghiêm ngặt sự bảo dưỡng thường xuyên bề mặt đó ( chỉ cần rửa sau mỗi lần thí nghiệm ). + Bền với nhiều loại dung dịch rửa và dòng chảy. Nhược điểm:

+ Chỉ sử dụng trong vùng pH hẹp. + Lớp màng này mòn dần ( khi pH >8 và t0 >400C ). Kiểu 2: Biến đổi bề mặt mao quản theo kiểu động học

Thêm vào pha động điện di một chất phụ gia có nồng độ thích hợp. Chất này phải có ái lực hấp phụ mạnh với thành mao quản, để khi chạy điện di thì chất này sẽ phủ lên thành mao quản ngăn không cho chất phân tích tiếp xúc và tác dụng với thành mao quản. Các ống mao quản được hoạt hóa động học bề mặt để khử tính hấp phụ của bề mặt thành mao quản có tính ưu việt hơn các ống mao quản có bề mặt đã được hoạt hóa vĩnh cửu. Đây là cách hoạt hóa bề mặt mao quản chỉ trong quá trình chạy sắc kí điện di nên được gọi là phương pháp hoạt hóa động học. Trong phương pháp này người ta chỉ cần thêm vào dung dịch pha động điện di những chất thích hợp để trong quá trình điện di nó tự tạo ra một lớp mỏng bám lên bề mặt thành mao quản có tác dụng làm giảm hay khử

bỏ tác dụng của sự tương tác hấp phụ giữa bề mặt mao quản và chất phân tích. Ưu điểm chính của phương pháp là độ bền và sự ổn định của lớp màng Lớp màng hoạt hóa liên tục được củng cố và bảo vệ, chống lại các tác động ăn mòn trong quá trình điện di (Vì các chất phụ gia luôn ở ngay trong dung dịch pha động nên sự hoạt hóa, sửa

122

chữa lớp màng trên bề mặt mao quản là liên tục được duy trì trong suốt quá trình điện di). Nhược điểm:

+ Có khi chất tan cũng như bề mặt mao quản đều có tác dụng với chất phụ gia thêm vào; + Thời gian cân bằng cần thiết để có được bề mặt lặp lại ổn định và dòng chảy điện di thẩm thấu EOF ổn định bị kéo dài; + Chất phụ gia bị thành mao quản hấp phụ lớn → Tạo lớp ngăn cách giữa chất phân tích với thành mao quản. + Một số trường hợp làm độ nhạy của CEC giảm xuống, nhất là khi thêm phụ gia với nồng độ cao.

3. Cơ sở lý thuyết của sắc kí điện di mao quản 3.1. Nguyên tắc của sắc kí điện di mao quản

Nguyên tắc của sự tách trong kỹ thuật sắc ký điện mao quản hiệu năng cao (HPCEC) là dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong ống mao quản (đường kính trong 25 - 100 µm) trên nền của dung dịch chất điện giải và chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một điện trường E nhất định được cung cấp bởi nguồn thế cao một chiều (10 - 40 kV) đặt vào hai đầu ống mao quản. Cơ chế tách:

Dựa trên sự di chuyển khác nhau của chất tan dưới tác dụng của điện trường E nhất định và tính chất đặc trưng của dòng điện di thẩm thấu trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của nó. Thế V tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu của ống mao quản được dùng trong CEC là rất lớn (thường trong vùng 10-40 kV/1m hay từ 100-550V/1cm chiều dài mao quản) tạo ra lực điện FE (FE = qE). Chính lực điện trường này là động lực làm cho các phần tử chất tan di chuyển theo hướng nhất định. Các chất khác nhau có điện tích và kích thước khác nhau sẽ di chuyển với các tốc độ khác nhau và tạo ra sự tách sắc ký các chất.

123

Hình 3. Sự tách các chất trong HPCEC (kiểu CZE) 3.2. Thế điện di và lực điện di

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều nhất định (thế điện di) đặt vào 2 đầu của mao quản. Thế V này tạo ra điện trường E và dòng điện i trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất và là một trong các yếu tố chính quyết định kết quả của sự điện di. Vì thế trong quá trình sắc kí một hỗn hợp mẫu, để có kết quả tốt và ổn định, phải chọn giá trị thế V thích hợp nhất, khống chế và giữ cho giá trị thế V này luôn không đổi, để có được giá trị E và dòng điện i cũng không đổi. Dòng điện i trong mao quản phụ thuộc vào: Điện thế một chiều V đặt vào hai đầu mao quản; Giá trị pH và thành phần của chất điện giải trong pha động điện di; Bản chất, điện tích của các chất có trong mao quản.

Trong CEC, điện thế V một chiều thường được dùng đặt vào hai đầu mao quản từ 15 – 40kV, hay là từ 100 – 550V/1cm mao quản. Song thế V được dùng phải làm sao không cho dòng điện i quá lớn trong mao quản, nói chung dòng điện i này chỉ nên nằm trong vùng từ 70 – 75 µA. Vì khi dòng điện i quá lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm nóng mao quản, gây ra sự doãng pic, tức là giảm hiệu quả tách. Việc chọn thế điện di V tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố như: Bản chất của chất phân tích và chất nền của mẫu; Bản chất của mao quản và pha tĩnh trong mao quản (nếu có); Bản chất, thành phần của các chất điện giải và chất đệm trong pha động; Giá trị pH của pha động điện di. 3.3. Dung dịch đệm và pha động trong HPCEC 3.3.1. Khái niệm về pha động trong HPCEC

Quá trình điện di trong kỹ thuật HPCEC được thực hiện trong môi trường của một dung dịch đệm pH và chất điện giải thích hợp (có khi chỉ có chất đệm pH làm cả 2 chức năng), dung dịch này gọi là pha động. Giá trị pH, nồng độ, loại chất đệm điện giải có vai trò rất quan trọng, nó xác định các tính chất và đặc trưng của các quá trình xảy ra trong mao quản, gồm: + Bề mặt trong của ống mao quản Silica; + Sự tồn tại và ổn định độ lớn của lớp điện kép, thế Zeta; + Xác định sự chuyển động và tính bền vững của dòng điện thẩm thấu EOF; + Duy trì và ổn định dòng điện i trong mao quản. Qua các yếu tố đó cuối cùng sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình sắc ký: giá trị Hef và Nef của mao quản, độ nét của pic sắc ký,… 124

Do đó tùy vào chất phân tích ta phải chọn pha động có thành phần, giá trị pH thích hợp. 3.3.2. Chất đệm và giá trị pH đệm trong HPCEC

Chất đệm và giá trị pH của chất đệm (pha động) có ảnh hưởng trực tiếp đến thành mao quản: + Quyết định sự hình thành lớp điện kép, độ lớn của lớp điện kép và thế Zeta; + Giá trị pH của pha động có thể làm cho thành mao quản tích điện âm (bị anionic hóa) hoặc tích điện dương (bị cationic hóa) tùy vào giá trị pH của pha động (vì trên bề mặt mao quản silica có các nhóm OH, nhóm này bị ion hóa theo sự tăng pH). Do đó phải chọn được dung dịch đệm có pH phù hợp và đồng thời khống chế nó không đổi suốt quá trình điện di. Các hệ đệm dùng trong HPCEC chỉ có hiệu lực tốt khi giá trị pH của nó nằm trong vùng: pH = pKa ± 1 hoặc pH = pKb ± 1. Trong các loại hệ đệm thì hệ đệm của các poli axit hay poli bazơ có hiệu lực tốt hơn hệ đệm của các đơn axit-bazơ ( Vì các poli axit hay poli bazơ do có nhiều nấc nên có khả năng đệm trong vùng pH rộng và do đó sẽ có tính linh hoạt cao). Song nói chung, các hệ đệm dùng trong HPCEC phải thỏa mãn các điều kiện sau: Phải có dung lượng đệm khá lớn trong vùng pH đã chọn. Phải có độ hấp phụ quang rất nhỏ (khi dùng detector UV hay Vis). Các ion của chất đệm có độ điện di không lớn (các ion trong dung dịch đệm phải có điện tích nhỏ nhưng có kích thước lớn để hạn chế việc tạo ra dòng điện vô ích hoặc tạo ra hiệu ứng nhiệt trong mao quản). Các chất đệm phải tan tốt trong nước và bền vững trong quá trình bảo quản cũng như trong quá trình điện di.

Hiện nay các hệ đệm sinh học được sử dụng rất phổ biến như: TRIS, Borat, Histidin, Caps,…Vì khi sử dụng các hệ đệm này ta có thể dùng được ở nồng độ cao mà không gây ra hiệu ứng nhiệt cao đối cho ống mao quản. Tuy nhiên hệ đệm này có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay Vis ở một mức độ nhất định do đó mà gây khó khăn cho việc phát hiện các chất phân tích khi dùng detector UV hay UV-Vis. Vì vậy chúng ta cần phải quét phổ các chất đệm, xem xét và chọn bước sóng đo thích hợp cho chất phân tích, chọn nồng độ thích hợp để hạn chế ảnh hưởng của chất đệm. Bảng 3. Một số loại hệ đệm thường dùng trong CEC STT

Loại chất đệm

Vùng pH hiệu lực

Borat/NaOH

9-12

125

Borat/HCl

4-9

Axit boric/NaCl

4-9

Axit boric/NaOH/NaCl

4-9

Na2HPO4/ NaH2PO4

4-8

NaH2PO4/NaOH

7-12

CH3COOH/CH3COONa

4-6

TRIS/HCl

4-7

TRIS/NaOH

6-9

3.3.3. Chất điện giải trong pha động của HPCEC

Cùng với chất đệm pH, trong pha động cua HPCEC cũng có chứa các chất điện giải. Các chất điện giải thường là các muối tan tốt trong nước cho các ion có điện tích nhỏ nhất nhưng bán kính hidrat của nó lại lớn, thường là các muối halogen hay là nitrat của các ion kim loại kiềm và amoni như: NaCl, LiCl, NH4Cl,… Trong một số trường hợp thì chất đệm pH đồng thời đóng vai trò chất điện giải cho quá trình điện di, như CH3COONH4. Các chất điện giải này được lựa chọn cho vào pha động với nồng độ phù hợp với phép phân tích. Vai trò: Chất điện giải rất cần thiết để duy trì và ổn định dòng điện i trong mao quản nhờ làm giảm độ lớn lớp điện kép. 3.4. Mao quản và pha tĩnh trong HPCEC 3.4.1. Mao quản trong HPCEC

Mao quản là một bộ phận quan trọng của HPCEC, là một trong các yếu tố chính quyết định sự tách sắc ký hỗn hợp các chất. Mao quản được chế tạo chủ yếu bằng silica, được gọi là mao quản silica. Trong một số trường hợp người ta sử dụng mao quản teflon khi mao quản silica không phù hợp (ví dụ mẫu có chứa ion F- và tách ở pH thấp). Mao quản thường có đường kính trong từ 20-150 µm, song tốt nhất là 25 -75 µ m. Mao quản có thành dày từ 80-120 µ m. Chiều dài của mao quản tùy thuộc vào hỗn hợp chất cần phân tích. Nhưng nói chung, hiện nay được dùng các ống mao quản có chiều dài tổng L từ 30-120cm, nhưng chiều dài hiệu dụng l từ 20-100cm.

Bên ngoài mao quản bao giờ cũng được bao bởi lớp polyme (PVC) có độ dày từ 200-350 µ m, để cho mao quản có độ dẻo, có thể uốn lại được mà không gẫy. Song

126

chính lớp polyme này lại làm cho mao quản có nhược điểm là sự truyền nhiệt từ trong mao quản ra môi trường bên ngoài kém đi.

Hình 4. Một loại mao quản trong HPCEC

Trong HPCEC, mao quản có thể là ống silica trống, cũng có thể là ống silica có nhồi pha tĩnh (thực hoặc giả) tùy thuộc kiểu HPCEC và chất nghiên cứu. 3.4.2. Pha tĩnh trong HPCEC Pha tĩnh thực

Pha tĩnh thực chủ yếu là được chế tạo trên nền của silica đã được hoạt hóa và biến tính để có tính chất sắc ký của sự hấp phụ, sự trao đổi ion, hoặc là rây phân tử. Nó bao gồm các loại silica trung tính trên bề mặt có các nhóm –OH, hay silica trung tính đã được alkyl hóa các nhóm –OH trên bề mặt hạt pha tĩnh bằng các nhóm alkyl loại mạch cacbon C1, C3, C8, C18, hoặc nhóm phenyl (-C6H5) như pha tĩnh của HPLC.

127

Hình 5. Sự ankyl hóa bề mặt pha tĩnh Đó là các hạt pha tĩnh có lỗ xốp, chịu nhiệt, chịu áp, có kích thước nhỏ từ 2-5 µ m.

Cách nhồi nó vào ống mao quản cũng tương tự như cột mao quản của sắc ký khí. Vì thế nó là một lớp màng pha tĩnh bám vào thành mao quản, có độ dày từ 5-15 µ m, tùy cỡ hạt của pha tĩnh. Như thế, loại pha tĩnh này là được giữ cố định trên thành của ống mao quản. Trong kiểu Gel-CE, pha tĩnh là các chất cao phân tử hữu cơ, được chế tạo trên nền của polyme hữu cơ, nó thường là các keo xốp cao phân tử, có độ xốp thích hợp, để thực hiện quá trình tách của các chất phân tích theo cơ chế điện di rây phân tử. Pha tĩnh giả Đối với hệ MEKC, khi điện di trong ống mao quản luôn có xuất hiện pha tĩnh giả, đó là các tiểu phân Micell. Nó được hình thành từ các chất hoạt động bề mặt, như chất

SDS trong pha động điện di với nồng độ thích hợp (nồng độ giới hạn hình thành các tiểu phân Micell). Trong quá trình điện di, các chất tan cũng phân bố vào pha tĩnh này. Nghĩa là giữa pha tĩnh và pha động có một cân bằng phân bố các chất tan và chúng có hệ số phân bố Ki nhất định. Các tiểu phân micelle sẽ dẫn dắt và đóng góp thêm khả năng của quá trình tách sắc kí điện di trên chất nền của dung dịch đệm và chất điện li trong mao quản.

128

Hình 6. Micell và HPCEC với mao quản có pha tĩnh loại micell 3.5. Lớp điện kép trên thành mao quản

Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế Zêta sát thành mao quản luôn xuất hiện, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di. Yếu tố bề mặt mao quản, thành phần và pH của pha động có liên quan đến sự hình thành, độ lớn và sự tồn tại của lớp điện kép trên bề mặt mao quản và thế Zêta. Khi lực ion của dung dịch điện di tăng thì lớp điện kép sẽ bị nén lại làm thế Zêta giảm và ảnh hưởng đến dòng điện di thẩm thấu.

Hình 7. Lớp điện kép trên thành mao quản (thành mao quản tích điện âm do các nhóm SiO-) Độ lớn của thế Zêta (Vzet) được tính gần đúng theo công thức: 129

VZet =

4π RD q

(3.1)

Trong đó: ε là hằng số điện môi của dung dịch pha động; q là tổng điện tích dung dịch theo một đơn vị thể tích; RD là bán kính hydrat của ion (bán kính Debye) được xác định theo biểu thức:

RD =

ε kT 8π e2 I

(3.2)

Trong đó: e là điện tích của electron; k là hằng số Bolzoman; T là nhiệt độ tuyệt đối; I là lực ion của dung dịch đệm điện di. Công thức (3.2) cho thấy: khi nồng độ chất đệm điện li lớn, thì giá trị lực ion I lớn thì RD giảm dẫn đến thế Zeta giảm theo (3.1). Bên cạnh việc ảnh hưởng đến lớp điện kép trên bề mặt mao quản, nồng độ của chất đệm, loại chất điện giải cũng ảnh hưởng đến sự điện di của chất tan. Tác động này thể hiện qua sự ổn định và duy trì dòng điện i và cả dòng điện di thẩm thấu EOF trong mao quản. Từ đó ảnh hưởng đến độ điện di hiệu lực µef của chất phân tích. 3.6. Dòng điện di thẩm thấu 3.6.1. Khái niệm về dòng điện di thẩm thấu

Bản chất chính của sự hoạt động trong ống mao quản của HPCEC là dòng chảy điện di thẩm thấu EOF, gọi tắt là dòng điện di thẩm thấu. Dòng EOF là dòng chảy khối của chất lỏng trong ống mao quản, nó quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành mao quản. Dòng EOF sẽ xác định thời gian tồn tại của chất tan trong mao quản. Nó bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan, nghĩa là chất tan di chuyển trong dòng EOF này. 3.6.2. Nguồn gốc dòng điện di thẩm thấu

Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (Si-OH) trên thành mao quản sẽ giải phóng ra ion H+ và bề mặt mao quản mang điện tích âm. Do bề mặt mang điện tích âm nên các cation do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành lớp điện kép để cân bằng điện tích và tạo nên hiệu thế sát thành mao quản (thế Zeta).

130

Hình 8. Dòng điện di thẩm thấu EOF

Khi áp thế V vào 2 đầu mao quản, các cation trong lớp điện kép sẽ đi về catot. Nhưng vì các cation này bị sonvat hóa nên kéo cả khối dung dịch trong mao quản đi về catot. Sự di chuyển của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường tạo nên dòng điện thẩm thấu EOF. Tốc độ v của dòng EOF tỉ lệ thuận điện trường E, với thế zeta VZet và tỉ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch đệm điện li theo công thức:

Tốc độ tuyến tính u:

Độ điện di của dòng EOF:

vEOF =

ε EVZet η

uEOF =

ε EVZet 4πη

(3.4)

εVZet η

(3.5)

µEOF =

(3.3)

Dòng EOF được quyết định bởi thế V đặt vào 2 đầu mao quản, pH dung dịch đệm điện li, chất điện giải, lớp điện kép, độ nhớt của dung dịch pha động, hằng số điện môi, độ xốp, cỡ hạt. Nhờ đặc tính này người ta chọn được các điều kiện tối ưu để có tốc độ dòng EOF phù hợp cho quá trình tách sắc kí.

131

Hình 9. Ảnh hưởng của pH lên dòng EOF 3.6.3. Đặc điểm của dòng điện di thẩm thấu

Dòng EOF có 2 đặc điểm chính: Thứ nhất, dòng EOF là dòng chuyển khối phẳng trong mao quản. Có đặc điểm

này vì lực tạo ra sự di chuyển của dòng EOF phân bố đồng nhất dọc theo mao quản nên không có sụt áp trong mao quản. Trong HPLC thì dòng chảy có dạng parabol do hiệu ứng thành: các phần tử giữa dòng di chuyển nhanh, các phần tử gần thành di chuyển chậm). Vì vậy pic sắc kí trong HPCEC gọn và sắc nét hơn HPLC. Thứ hai, dòng EOF đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung dịch điện di, bất kể có mang điện hay không di chuyển theo cùng một hướng nhất định từ anot (cực +) về catot (cực -) (nếu pH ≥ 4): Các cation di chuyển nhanh về catot với tốc độ khác nhau tùy điện tích và kích thước của nó; Các phân tử trung hòa được dòng EOF mang theo cùng với tốc độ của dòng

EOF (nhưng chúng không tách ra được trong CEC); Các anion di chuyển về anot nếu tốc độ của nó lớn hơn tốc độ dòng EOF. Ngược lại chúng bị dòng EOF mang theo về catot

132

Hình 10 . So sánh dòng chảy trong HPLC và trong CEC

133

Hình 11. Sự chuyển của các phần tử trong CEC

Theo đó thứ tự rửa giải theo thời gian sẽ là: cation điện tích lớn, kích thước nhỏ ra đầu tiên → các phân tử trung hòa → anion có điện tích lớn và kích thước nhỏ ra sau cùng (Hình 12).

Hình 12 . Thứ tự rửa giải trên điện di đồ 3.6.4. Kiểm tra và khống chế dòng điện di thẩm thấu

Theo trên ta thấy dòng EOF là một yếu tố thuận lợi và có vai trò quan trọng trong kĩ thuật CEC nên cần kiểm tra và khống chế nó ở mức độ phù hợp cho mục đích phân tích. Các cách kiểm tra, khống chế dòng EOF được tổng kết ở bảng 4.

Bảng 4. Các cách kiểm tra, khống chế EOF Cách thức thay đổi

Kết quả 134

Nhận xét chung

Điện trường E (tức điện Sự thay đổi tỉ lệ với EOF thế V)

+ Độ phân giải và số đĩa lý thuyết hiệu lực giảm. + Làm nóng mao quản.

Giá trị pH của dung EOF giảm ở pH thấp và + Cách tiện lợi để thay đổi dịch đệm điện di tăng ở pH cao EOF + Thay đổi được điện tích, cấu trúc chất tan Lực ion, nồng độ dung Làm giảm thế zeta và EOF + Lực ion lớn, tạo dòng điện lớn dịch đệm khi tăng lực ion, nồng độ và hiệu ứng Jun lớn + Độ nét pic sắc kí bị ảnh dung dịch đệm hưởng nếu độ dẫn khác độ dẫn của mẫu + Hạn chế sự nạp mẫu Nhiệt độ

Thay đổi độ nhớt 2 – Dùng khi kiểm tra và khống 3%/0C chế nhiệt độ tự động

Dùng các chất phụ gia, Thay đổi thế zeta, độ nhớt, + Thay đổi phức, xác định dễ dung môi hữu cơ EOF bị giảm dàng bằng thực nghiệm + Có thể thay đổi độ chọn lọc của hệ pha Các chất hoạt động bề mặt

Hấp phụ lên thành mao + Chất hoạt động bề mặt là ation quản qua tương tác ionic làm tăng EOF, cation làm giảm hay hydrophopic

EOF, có thể đổi chiều EOF + Thay đổi độ chọn lọc

Dùng polymer hydrophilic trung tính

Hấp phụ lên thành mao + Làm giảm EOF qua thay đổi quản qua tương tác điện tích bề mặt hydrophopic

+ Làm tăng độ nhớt

Hoạt hóa bề mặt bằng Tạo liên kết hóa học mới + Có nhiều cách thay đổi: cách cộng hợp lên thành mao quản hydrophylicity, thay đổi điện tích + Làm bền bề mặt mao quản

4. Tối ưu hóa phép phân tích sắc kí điện di mao quản Muốn có kết quả sắc kí điện di tốt nhất thiết phải tối ưu hóa các điều kiện cho sự tách sắc kí. Nội dung công việc này gồm các vấn đề sau: 135

4.1. Chuẩn bị mẫu, nạp mẫu 4.1.1. Chuẩn bị mẫu

Xử lý mẫu bằng các kĩ thuật như: vô cơ hóa ướt, vô cơ hóa khô, khô – ướt kết hợp, các kĩ thuật chiết, sắc kí, điện phân, … Mẫu đưa vào ống mao quản của HPCEC phải ở trạng thái lỏng, do đó phải hòa tan chất phân tích bằng dung môi thích hợp. Dung môi này thường là dung môi làm pha động. Tùy chất phân tích mà chọn dung môi thích hợp. Ví dụ: xử lý mẫu để xác định các α và β-caroten:

+ Mẫu xay thành bột và bảo quản ở -150C. + Lấy 5g mẫu đã xay mịn cho vào bình chiết, thêm 15 – 20g Na2SO4 khan, 1g MgCO3 khan, trộn đều, thêm 20 mL dung môi THF, khuấy đều trong 5 phút. Lọc hút chân không, lấy pha hữu cơ chứa các carotene vào bình cất quay chân không, cất dến còn khoảng 1 mL, để yên 1 phút cho khô rồi hòa tan và định mức thành 5 mL bằng THF. Li tâm tách bỏ cặn. Đây là dung dịch để xác định các α và β-caroten bằng HPCEC. 4.1.2. Nạp mẫu

Nạp mẫu vào ống mao quản chỉ được phép tối đa là 2% chiều dài hiệu lực l của ống. Có 3 phương pháp nạp mẫu là: dùng áp suất, dùng xi-phong và phương pháp điện động học.

Hình 13. Ba cách nạp mẫu trong CEC: a) dùng xi-phong; b) dùng áp suất; c) dùng dòng điện 4.2. Chọn các điều kiện tối ưu 4.2.1. Chọn mao quản và pha tĩnh Chọn mao quản và pha tĩnh tùy thuộc mỗi kiểu HPCEC và mẫu nghiên cứu:

+ Mao quản trống: dùng cho CZE; 136

+ Mao quản có pha tĩnh: các kiểu còn lại. Chọn chiều dài mao quản: thường L = 30 – 120 cm, l = 20 – 100 cm. Chọn đường kính trong của mao quản: thường khoảng 25 – 75 µm. 4.2.2. Chọn pha động Chọn pha động phụ thuộc mẫu phân tích. Pha động thường là dung dịch đệm pH và có chất điện li thích hợp hoặc chỉ có chất đệm pH làm cả 2 chức năng. Chọn pha động phải chú ý các điều kiện: thành phần và giá trị pH đệm; nồng độ chất điện li; các chất phụ gia nếu có; dung môi hữu cơ để biến tính pha động điện di. 4.2.3. Chọn thế điện di

Chọn thế điện di V dựa vào các yếu tố: Bản chất chất phân tích, chất nền của mẫu; Bản chất mao quản và pha tĩnh; Bản chất, thành phần chất điện giải và chất đệm pH trong pha động; Giá trị pH đệm. 4.2.4. Chọn đetector

Tùy bản chất chất phân tích để chọn detector phù hợp theo bảng 5. 4.3. Chọn phương pháp phân tích thích hợp

Dựa vào đặc điểm chất phân tích để lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp. * Sắc kí điện di mao quản vùng (CZE): dùng tách và phân tích các amino axit,

peptit, các chất có cấu tạo ion, các đồng phân không gian, các loại hợp chất có khả năng ion hóa như các ion kim loại, muối của axit hay bazo hữu cơ, … * Sắc kí điện di mao quản kiểu Micell (MEKC): sử dụng để tách các chất mang điện và không mang điện, các hợp chất ưa nước và kị nước. Nó cũng dùng để tách các amino axit, các họ nucleotit, các loại vitamin, hidrocacbon thơm, các sản phẩm dược (thuốc viên, thuốc tiêm, thuốc dạng kem) và các hợp chất sinh học. Bảng 5. Một số detector dùng trong HPCEC Detector

Áp dụng cho

Giới hạn phát hiện (M)

Hấp thụ UV- Chất hấp thụ trong vùng 10-5 – 10-8 Vis UV-Vis Huỳnh quang

Chất có khả năng phát 10-7 – 10-9 137

Ghi chú

Phân tích nhiều chất Nhạy

huỳnh quang hoặc tạo với thuốc thử chất có khả năng phát huỳnh quang Độ dẫn điện

Vạn năng

10-7 – 10-8

Đo ampe

Chất có hoạt tính điện hóa

10-10 – 10-11

Nhạy, chọn lọc. Đòi hỏi vận hành chặt chẽ

10-8 – 10-9

Phổ khối

B ức x ạ k ế

Chất có hoạt tính phóng xạ

Nhạy, cung cấp thông tin về cấu trúc

10-10 – 10-12

Hình 14. Tách các cation trong CZE (dùng tác nhân gián tiếp Cu2+) Điều kiện: mao quản 50 cm x 50 µm; V = 20 kV; detector UV, 215 nm. Sb 3,6 ppm (1), K 7,8 ppm (2), Na 4,6 ppm (3), Ca 4 ppm (4), Mg 2,4 ppm (5), Sr 15 ppm (6), Li 0,69 ppm (7), Ba 27 ppm (8).

138

Hình 15 . Tách các heroin bằng MEKC Điều kiện: dung dịch đệm (SDS 85 mM, borat 8,5 mM, photphat 8,5 mM, CH3CN 15%) pH = 8,5; l = 50 cm; đường kính trong 50 µm; V = 30 kV; t0 = 500C; detector UV, 210 nm * Sắc kí điện di gel (Gel-CE): dùng tách các chất có khối lượng phân tử lớn như

axit nucleotit, protein, … dựa vào kích thước của các phân tử chất tan.

Hình 16.. Tách các AND dùng Gel-CE Điều kiện: gradient điện trường 400 – 100 V/cm; mao quản 27 cm x 100 µm; đệm pH = 8,3 (TRIS – borat 100 mM, EDTA 2 mM) M: 72 (1), 118 (2), 194 (3), 234 (4), 271 (5), 281 (6), 310 (7), 603 (8), 72 (9), 1078 (10), 1353 (11)

139

* Sắc kí điện di mao quản hội tụ đẳng điện (CIEFC): dùng tách các chất như peptit, protein, các đồng phân hình học, phân tích hemoglobin, các dung dịch sinh học loãng…

Hình 17. Tách các hemoglobin bằng CIEFC Điều kiện: mao quản: 12 cm x 25 µm; V = 8 kV; pH đệm 3 – 10; detector UV 280 nm Điểm đẳng điện pI: A 7,1; F 7,15; S 7,25; C 7,5.

5. Máy sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao 5.1. Cấu tạo, trang bị

140

Hình 18. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ HPCEC Để thực hiện sự điện di thì hệ thống máy HPCEC phải có các bộ phận sau: 1. Bộ buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt); 2. Cột tách sắc kí (ống mao quản); 3. Nguồn cấp thế 1 chiều (10 – 40 kV) để tạo điện trường E; 4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản; 5. Bộ phận phát hiện các chất sau khi tách (detector); 6. Bộ phận điều nhiệt cho ống mao quản; 7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất.

141

Hình 19. Sơ đồ nguyên tắc hoạt động của máy HPCEC 5.2. Hoạt động của máy HPCEC

Thế 1 chiều V gây ra điện trường E và phát sinh lực điện làm cho các chất tan di chuyển theo một hướng nhất định. Các chất khác nhau, có điện tích và độ lớn khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ nhanh, chậm khác nhau và tạo nên sự tách sắc kí. Có thể phát hiện các chất bằng cách phát hiện trực tiếp hoặc gián tiếp tùy thuộc vào bản chất các chất phân tích hoặc các tính chất lý hóa và vật lý của chất như: - Sự hấp thụ quang phân tử và nguyên tử của các chất; - Sự phát xạ huỳnh quang của các chất, khi bị kích thích; - Tính chất điện hóa của các chất, như phản ứng điện hóa trên điện cực; - Chỉ số chiết suất của các chất; 142

- Độ dẫn nhiệt, hay sự hấp thụ nhiệt của các chất,… Ứng với mỗi tính chất đó người ta có một loạt detector tương ứng:

+ Detector đo phổ hấp thụ phân tử vùng UV- Vis (190 - 800 nm); + Detector đo phổ huỳnh quang phân tử; + Detector đo phổ phát xạ và hấp thụ phân tử; + Detector điện hóa đo dòng hay đo thế; + Detector đo chỉ số chiết suất của chất; + Detector đo dẫn điện, hay độ hấp thụ nhiệt; + Detector khối phổ; + Detector mảng diốt.

6. Các phương pháp định tính, định lượng bằng HPCEC 6.1. Phân tích định tính Nguyên tắc:

Mỗi chất phân tích trong các điều kiện tách CEC đã chọn nhất định có một thời gian lưu tRi nhất định. Thời gian lưu tRi là thông số đặc trưng dùng để phát hiện định tính các chất trong hỗn hợp mẫu. Cách tiến hành:

+ Chạy sắc kí của mẫu chuẩn trong điều kiện tối ưu đã chọn để xác định thời gian lưu của từng chất. + Chạy sắc kí mẫu phân tích trong cùng điều kiện như mẫu chuẩn và so sánh thời gian lưu để kết luận sự có mặt của từng chất.

Nhìn vào sắc đồ trên ta thấy trong Chewing gum có các cấu tử 3, 5, 6, 7.

143

6.2. Phân tích định lượng 6.2.1. Phương trình cơ bản

Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã chọn, ở vùng nồng độ nhất định thì tín hiệu phân tích (diện tích S, chiều cao H của pic) liên hệ với nồng độ C của chất phân tích qua biểu thức:

Si = k1Ci

và

Hi = k2Ci

(6.1)

Trong đó k1, k2 là các hằng số thực nghiệm. Dựa trên phương trình (6.1) người ta thường định lượng các chất theo phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn. 6.2.2. Phương pháp đường chuẩn * Cách tiến hành:

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn chứa chất phân tích có nồng độ C khác nhau trong điều kiện tương tự mẫu phân tích. Tiến hành phép tách sắc kí để tính chiều cao hay diện tích đối với dãy chuẩn. Dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc S hay H của pic vào nồng độ C. Thực hiện phép phân tích với chất nghiên cứu X trong cùng điều kiện để xác định Sx hay Hx rồi thay vào phương trình đường chuẩn để có Cx cần tìm. * Ưu điểm: Phương pháp đường chuẩn tiện lợi cho việc phân tích hàng loạt một loại mẫu cùng đối tượng vì nó đơn giản, nhanh và dễ thực hiện. * Nhược điểm: dễ mắc sai số hệ thống vì không thể chuẩn bị một dãy các dung

dịch chuẩn trong điều kiện hoàn toàn giống nhau và giống với mẫu thật. Lúc này phải dùng phương pháp thêm chuẩn.

Hình 20 . Đường chuẩn để xác định Cx

144

6.2.3. Phương pháp thêm chuẩn * Cách tiến hành:

+ Pha dãy chuẩn cũng chính là dung dịch nghiên cứu và có thêm chất cần xác định với những nồng độ chính xác Cti rồi đo S hoặc H của pic: C

Cx + Ct1

Cx + Ct2

Cx + Ct3

Cx + Ct4

Cx + Ct5

+ Vẽ đồ thị Si – Cti rồi ngoại suy hoặc tịnh tiến đồ thị về gốc tọa độ để xác định Cx.

Hình 21.. Xác định Cx bằng phương pháp thêm chuẩn * Ưu điểm:

Phương pháp thêm chuẩn khắc phục được hạn chế của phương pháp đường chuẩn do đã loại trừ được mọi ảnh hưởng của nền (vì mẫu nào cũng có nền giống nhau). Do đó phương pháp này có độ chính xác cao hơn phương pháp đường chuẩn.

BÀI TẬP Bài 1. Trong ống mao quản có chiều dài hiệu lực 50 cm, độ dài tổng cộng 58,5 cm đặt một hiệu thế 25000 V. Sau quá trình chạy sắc kí, trên sắc đồ người ta thu được 3 pic với thời gian lưu lần lượt là 38,4s, 50,7s, 93,1s ứng với 3 chất X, Y, Z. Tính độ điện di

toàn phần, độ điện di hiệu lực của X, Y, Z. Biết Y là chất trung tính, từ đó có nhận xét gì về giá trị độ điện di hiệu lực µef ? GIẢI • Ta có công thức tính độ điện di toàn phần: µtot = µi + µ EOF = →

µtot ( X ) =

58,5.50 = 3,05.10-3 (cm2.V-1.s-1) 38, 4.25000 145

L.l V .ti

µtot ( Z ) =

58,5.50 = 1,26.10-3 (cm2.V-1.s-1) 93,1.25000

Chất Y trung tính nên µi = 0, do đó:

µtot (Y ) = µEOF =

58,5.50 = 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1) 50, 7.25000

• Độ điện di hiệu lực: µef = µtot − µEOF → µef (X) = 3,05.10-3 - 2,31.10-3 = 7,40.10-3 (cm2.V-1.s-1) µef (Z) = 1,26.10-3 - 2,31.10-3 = -1,05.10-3 (cm2.V-1.s-1) µef (Y) = 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1) Nhận xét: µef (Z) < 0 → Z là một anion; µef (X) > 0 → X là một cation. Bài 2. Định lượng NO3- trong một bể nuôi cá bằng phương pháp CZE với chất nội chuẩn IO4-. Dung dịch chuẩn NO3- 15,0 ppm và IO4- 10,0 ppm cho diện tích pic lần lượt là 95,0 và 100,1 đơn vị. Một mẫu nước được pha loãng 100 lần rồi thêm chất nội chuẩn đến nồng độ 10,0 ppm. Phân tích bằng CZE thu được các diện tích lần lượt là 29,2 và 105,8 đối với NO3- và IO4-. Tính nồng độ NO3- trong mẫu nước bể nuôi cá theo ppm.

GIẢI Áp dụng công thức trong phương pháp nội chuẩn:

SA C = k. A S IS CIS Trong đó: SA, SIS lần lượt là diện tích pic của chất chuẩn và chất nội chuẩn; CA, CIS lần lượt là nồng độ của chất chuẩn và chất nội chuẩn. Theo đề bài ta có:

95 15 = k. 100,1 10

→ k = 0,6327

Thế các giá trị vào tính đối với mẫu nước ta có:

29, 2 C = 0, 6327. A 105,8 10

→ CA = 4,362 ppm

→ Nồng độ NO3- trong mẫu nước bể nuôi cá: 100CA = 436,2 ppm. Bài 3. Tách các ankylpiridin bằng CZE. Việc tách được thực hiện trong ống mao quản có đường kính trong 50 µm, chiều dài tổng cộng 57 cm, chiều dài hiệu lực 50 cm. Dung dịch đệm pH = 2,5. Sự tách tối ưu với thế điện di là 15 kV. Độ điện di thẩm thấu đo được là 6,398.10-5 cm2.V-1.s-1. Hệ số phân bố của các ankylpyridin, D = 1,0.10-5

cm2.s-1. a) Tính độ điện di của 2-etylpyridin, biết thời gian lưu của nó là 8,20 phút. b) Tính số đĩa lý thuyết đối với 2-etylpyridin. 146

c) Độ điện di của 3-etylpyridin và 4-etylpyridin lần lượt là 3,366.10-4 cm2.V-1.s-1 và 3,397. 10-4 cm2.V-1.s-1. Tính độ phân giải của 2 chất này. GIẢI a) Áp dụng công thức:

→

µi =

µtot = µi + µEOF =

L.l V .ti

L.l 57.50 − µEOF = - 6,398.10-5 = 3,22.10-4 (cm2.V-1.s-1) V .ti 15000.8, 2.60

b) Áp dụng công thức tính số đĩa lý thuyết ta có: N=

( µi + µ EOF ).V (3, 22.10−4 + 6,398.10 −5 ).15000 = = 28950 2D 2.1.10 −5

c) Để tính độ phân giải R trước hết tính: ∆µ = µ2 - µ1 = 3,397.10-4 - 3,366.10-4 = 0,031.10-4 (cm2.V-1.s-1) µTB =

µ1 + µ2 2

= (3,366.10-4 + 3,397.10-4)/2 = 3,3815.10-4 (cm2.V-1.s-1)

Ta có: R = 0,177.∆µ

V ( µTB + µ EOF ).D

= 0,177.0, 031.10−4.

15000 (3,3815.10 + 6,398.10 −5 ).10−5 −4

R = 1,1. Bài 4. Tách các protein bằng HPCEC. Mao quản dài 84 cm, thế điện di 25000 V. Một phân tử trung hòa được dòng EOF mang theo phải mất hết 308s để di chuyển đoạn 64 cm từ chỗ nạp mẫu đến detector. Chất A có thời gian lưu là 343s. Tính độ điện di tổng cộng và độ điện di hiệu lực của chất A.

GIẢI Độ điện di tổng cộng của chất A:

Cường độ điện trường E: E = V/L = 25000/84 = 298 V/cm µtot =

u A 64 / 343 = = 6,26.10-4 (cm2.V-1.s-1) E 298

Tốc độ tuyến tính của dòng EOF: uEOF =

64 = 0,208 ( cm/s) 308

Độ điện di của dòng EOF:

Từ uEOF = µEOF.E → µEOF = uEOF /E = 0,208 /298 = 6,98.10-4 (cm2.V-1.s-1) Độ điện di hiệu lực:

µef = µtot − µEOF = 6,26.10-4 - 6,98.10-4 = -0,72.10-4 (cm2.V-1.s-1) 147

Vì µef < 0 nên có thể suy ra A là một anion. Bài 5. Phân tích sắc kí điện di mao quản với kỹ thuật CZE. Mao quản có chiều dài tổng là 32cm, chiều dài hiệu lực là 24,5cm ở thế điện di 30 kV. Dưới những điều kiện

của thí nghiệm ghi được trong môi trường trung tính đã xuất hiện chất có thời gian lưu là 3 phút. a) Tính độ điện di hiệu lực của một chất có thời gian lưu 2,5 phút. b) Tính hệ số khuyếch tán dưới những điều kiện đã cho của chất đó, biết số đĩa lý thuyết N = 80 000. ĐS:

a) 2,88.10-5 (cm2.V-1.s-1) b) D = 2,5.10-5 (cm2.s-1) Bài 6. Trong một phép tách HPCEC, mao quản có chiều dài tổng bằng 1m, chiều dài hiệu lực bằng 90cm. Thế áp đặt vào hai đầu ống mao quản là 30 kV. Detector được đặt phía trước catot với chất đệm có pH = 5. Trong một dung dịch tiêu chuẩn, chất tan có thời gian lưu là tm = 10 phút.

a) Tính độ điện di tổng cộng của chất đó. b) Nếu một phân tử nhỏ không mang điện có thời gian lưu bằng 5 phút, hãy xác định độ điện di của dòng EOF.

c) Tính độ điện di hiệu lực của chất đó. d) Tính số đĩa lý thuyết N nếu chất có hệ số khuếch tan D = 2.10-5 cm2/s. ĐS: -4

-1

-3

-1 -1

a) 7,5.10 (cm .V .s ) b) 1,5.10 (cm .V .s ) c) – 7,5.10-4 (cm2.V-1.s-1) d) N = 337 500. Bài 7. Cho một cột mao quản dài 50cm được áp đặt thế 30 000V, độ điện di tính được với thời gian 10 phút là 2.10-8 m2s-1V-1. Tính số đĩa lý thuyết cho ion Li+ (D = 1,0.10-9 m2s-1) và cho một protein có phân tử khối 105 (D = 3.10-11m2s-1). ĐS: Li+: 3.105 đĩa; Protein: 107 đĩa. Bài 8. Định lượng vitamin B1 bằng kĩ thuật CZE hoặc MEKC sử dụng chất nội

chuẩn là o-ethoxybenzamide. Khi phân tích dung dịch chứa 100,0 ppm B1 và 100,0 ppm o- ethoxybenzamide thì diện tích pic của B1 bằng 71% diện tích pic chất nội chuẩn. Phân tích 0,125g thuốc viên vitamin B cho diện tích pic của B1 bằng 1,82 lần so với chất nội chuẩn. Tính số mg vitamin B1 có trong thuốc này, biết thể tích dung dịch ban đầu là 20 mL. ĐS: 5,1 mg

148

Bài 9. Một cation vô cơ có độ điện di 4,31.10-4 cm2.V-1.s-1 và hệ số khuếch tán 9,8.10-6 cm2.s-1 được phân tích bằng kĩ thuật CZE với mao quản dài 50 cm và thế điện di 10 kV. Trong điều kiện này, dòng điện di thẩm thấu có tốc đô 0,85 mm/s đi về phía

catot. Nếu detector được đặt cách điểm nạp mẫu 40 cm thì cation mất bao lâu để đến được detector ? ĐS: 3,9 phút.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phạm Luận (2002), Cơ sở lý thuyết của Sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao (HPCEC), ĐH KHTN – ĐHQG Hà Nội. 2. David Harvey (2000), Modern analytical chemistry, Mc Graw Hill. 3. Daniel Harris (2007), Quantitative Chemical Analysis, W.H Freeman and Company, New York. 4. Nicola Volpi (2005), Capillary Electrophoresis of Carbohydrates, Humana

Press. 5. Robetr Weinberger (1999), Practical Capillary Electrophoresis, AP. 6. Ruth Freitag (2002), Modern Advances in Chromatography, University of California, USA. 7. Jack Cazes (2004), Encyclopedia of Chromatography. 8. Skoog, West, Holler & Crouch (2004), Fundamentals of analytical chemistry, Thomson Brooks/Cole.

149

MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 NỘI DUNG ........................................................................................................................... 2 1. Giới thiệu về phương pháp HPCEC ................................................................................ 2 1.1. Sự ra đời và phát triển ................................................................................................. 2 1.2. Phân loại các kiểu HPCEC.......................................................................................... 3 1.3. Đặc điểm của sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao .................................................. 4

2. Một số đại lượng trong HPCEC ...................................................................................... 5 2.1. Tốc độ điện di, độ điện di, thời gian điện di ................................................................ 5 2.1. 1. Tốc độ điện di ..................................................................................................... 5 2.1.2. Độ điện di ............................................................................................................ 6 2.1.3. Thời gian điện di .................................................................................................. 7

2.2. Hệ số phân bố và hệ số dung tích ................................................................................ 7 2.2.1. Hệ số phân bố Ki .................................................................................................. 7 2.2.2. Hệ số dung tích ki’ ............................................................................................... 8

2.3. Chiều cao đĩa, số đĩa và số đĩa hiệu lực của mao quản................................................. 9 2.4. Tốc độ tuyến tính ...................................................................................................... 11 2.5. Độ phân giải ............................................................................................................. 11 2.6. Hiệu ứng nhiệt và sự gradient nhiệt độ ...................................................................... 12 2.6.1. Hiệu ứng nhiệt Jun và ảnh hưởng của nó ........................................................... 12 2.6.2. Kiểm tra và khống chế hiệu ứng nhiệt ................................................................ 13

2.7. Sự tương tác của chất phân tích với thành mao quản ................................................. 14 150

2.7.1. Khái niệm về sự tương tác .................................................................................. 14 2.7.2. Kiểm tra và khống chế tương tác có hại ............................................................. 14

3. Cơ sở lý thuyết của sắc kí điện di mao quản ................................................................. 16 3.1. Nguyên tắc của sắc kí điện di mao quản .................................................................... 16 3.2. Thế điện di và lực điện di.......................................................................................... 17 3.3. Dung dịch đệm và pha động trong HPCEC ............................................................... 17 3.3.1. Khái niệm về pha động trong HPCEC ................................................................ 17 3.3.2. Chất đệm và giá trị pH đệm trong HPCEC......................................................... 18 3.3.3. Chất điện giải trong pha động của HPCEC........................................................ 19

3.4. Mao quản và pha tĩnh trong HPCEC ......................................................................... 19 3.4.1. Mao quản trong HPCEC .................................................................................... 19 3.4.2. Pha tĩnh trong HPCEC ...................................................................................... 20

3.5. Lớp điện kép trên thành mao quản ............................................................................ 22 3.6. Dòng điện di thẩm thấu ............................................................................................. 23 3.6.1. Khái niệm về dòng điện di thẩm thấu ................................................................. 23 3.6.2. Nguồn gốc dòng điện di thẩm thấu ..................................................................... 23 3.6.3. Đặc điểm của dòng điện di thẩm thấu ................................................................ 25 3.6.4. Kiểm tra và khống chế dòng điện di thẩm thấu ................................................... 27

4. Tối ưu hóa phép phân tích sắc kí điện di mao quản ..................................................... 29 4.1. Chuẩn bị mẫu, nạp mẫu ............................................................................................ 29 4.1.1. Chuẩn bị mẫu..................................................................................................... 29 4.1.2. Nạp mẫu ............................................................................................................ 29

4.2. Chọn các điều kiện tối ưu ......................................................................................... 30 4.2.1. Chọn mao quản và pha tĩnh ............................................................................... 30 4.2.2. Chọn pha động................................................................................................... 30 4.2.3. Chọn thế điện di ................................................................................................. 30 4.2.4. Chọn đetector .................................................................................................... 30

4.3. Chọn phương pháp phân tích thích hợp ..................................................................... 30

5. Máy sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao.................................................................. 34 5.1. Cấu tạo, trang bị ....................................................................................................... 34 5.2. Hoạt động của máy HPCEC ...................................................................................... 35

6. Các phương pháp định tính, định lượng bằng HPCEC................................................ 36 6.1. Phân tích định tính .................................................................................................... 36 6.2. Phân tích định lượng ................................................................................................. 37 6.2.1. Phương trình cơ bản .......................................................................................... 37 6.2.2. Phương pháp đường chuẩn ................................................................................ 37 151

6.2.3. Phương pháp thêm chuẩn................................................................................... 38

BÀI TẬP ............................................................................................................................. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 43

152