thesis

臺北醫學大學醫學研究所碩士論文 Taipei Medical University Graduate Institute of Medical Sciences Master Thesis

利用阿黴素與馬兜鈴酸建立斑馬魚腎臟疾病模式 並探討其可能之致病機轉 Using doxorubicin and aristolochic acid to establish a zebrafish disease model for the molecular mechanisms of kidney disease study

指 導 教 授 ：周志銘 博士 (Dr. Chih-Ming Chou)

研究生：杜品樺 (Ping-Huang Tu)

中華民國一百年七月 2011, July

致謝 兩年的碩士班生涯轉眼間就結束了，時間真的過的很快，這兩年研 究所的路上首先要特別感謝我的指導老師周志銘 老師，老大在這兩年的 諄諄教誨讓我的收穫很多，從實驗上的細心、用心與專心，就是我學到 最大的觀念，另外面對科學的真實與謙虛，也是與老大言談之間所學到 的道理，對於實驗的熱忱更是在老師言語之間清晰可見。謝謝老師總是 很有耐心的指導我，並幫助我解決實驗上碰見的種種問題，即使有任何 的不順遂也給予正面積極的討論與建議，真的很謝謝老師這兩年來的帶 領與付出，辛苦了!老大! 一路上蒙受許多人的恩惠與幫助，感謝擔任我的口試委員老師，陽 明大學生理所李怡萱 老師、陽明大學口腔生物研究所羅正汎 老師、台 北醫學大學醫學科學所阮淑慧 老師、陳建志 老師大力斧正我的論文， 讓我的論文可以更臻完美，在實驗設計上的邏輯、嚴謹、與方向給予不 吝的建議，讓我更知道在研究上要更加謹慎及思考周延。 另外要感謝醫學科學所張淑芬 老師大方地提供儀器供我進行實驗 的分析，並且給我許多無論在實驗上或人生道路上很好的建議，同時也 要感謝實驗室博士班學長 丁豪，在技術上的教導與研究上的討論，讓我 在這兩年時間的實驗可順利的進行；也要感謝這兩年來碩士班的同學們， 江峰、孟瑜、心偉、純平、阿欣、小八、韋誌、碰碰貍，這些總是在課 業上互相合作或在實驗不順遂的時候互相鼓勵的好同學，謝謝大家。最 後要謝謝我的家人，老爸、老媽、老哥、老姊一直對我的支持，讓我沒 有後顧之憂，當然也要感謝我的女友家誼，謝謝妳的一直陪伴，最後還 是要謝謝一路上幫助我指導我的每個人，謝謝!

中文摘要 哺乳類生物出生後，腎臟是一個主要的排泄器官，依發育的過程可分 為三個時期：pronephros (前腎)、mesonephros (中腎)、與 metanephros (後 腎)等時期。而環境中存在的化學物質和藥物會影響腎臟的發育，進而影響 腎臟和泌尿系統的形成甚至造成變異。而腎臟和泌尿系統發育發生異常， 被認為與幼兒時期腎臟功能喪失有很高的相關性。在腎絲球疾病研究中， 目前瞭解的致病機轉主要是因為腎絲球足細胞 (podocytes)， 細胞內氧化 壓力異常增加和細胞發生凋亡造成。由先前研究顯示哺乳類和硬骨魚類腎 臟器官型態存在許多相似之處，例如腎臟在魚類和哺乳類主要功能都是執 行血液過濾、腎小管再吸收、以及體液排泄等功能。斑馬魚發育早期腎臟 構造非常簡單，其腎元構造只包含兩個腎絲球，以及連接到泄殖腔的原腎 小管。雖然較哺乳類腎臟構造簡單，但在斑馬魚腎臟中也具有與其他脊椎 動物相似的同源基因且腎臟組織中相同型態的細胞，其功能或發育的過程 都很相似。不過在哺乳類中對於腎臟發育相關的基因表現調節、細胞間的 作用與其分子機轉，都還尚未清楚。本研究利用在腎絲球部位專一表現的 wt1b 和表達在原腎管 (pronephric tubule and ducts) 部位的 cadherin 17 (cdh 17) 等基因的啟動子 (promoter) 片段，建立具有腎臟組織螢光的轉殖 斑馬魚並將利用藥物處理誘發腎病變的腎臟疾病模式，用來探討其致病機 轉。當使用藥物處理斑馬魚胚胎時，發現腎臟的部分在外觀上則是沒有明 顯的異常，但以腎臟發育相關基因之表現分析，發現近曲腎小管專一表現 的 slc20a1a 基因在藥物處理下會明顯受到抑制， 研究結果顯示斑馬魚系 統中確實可利用藥物處理來建立斑馬魚腎臟疾病模式，並可用以探討急、 慢性腎臟疾病形成的分子機轉並建立腎臟疾病藥物快速篩選的平台。 I

英文摘要 The development of the kidney, the major excretory organ after birth, has been well described and consists of 3 stages: the pronephros (primitive kidneys), mesonephros (middle kidneys), and metanephros (permanent kidneys). The effects of environmental chemicals, drugs, and physical agents on developing kidney are influenced by the stat of renal development and maturation. Abnormalities of kidney and urinary tract development are the most common cause of end-stage kidney failure in childhood. The segmental glomerulosclerosis was related to chronic renal failure and the glomerular podocytes were damage by oxidative stress. The mechanism of glomerulosclerosis might trigger age-associated genes to mediate free radical imbalance and glomerular podocytes death, particularly apoptosis. The zebrafish pronephros, which comprises only two nephrons and is structurally simpler than the mesonephros of adult fish and the metanephros of mammals.

That provides an attractive model system for studying cyst formation at the cellular level. Unfortunately, the molecular mechanism and the cell-cell interactions of kidney development were not completely understood. After drug-treatment we found the slc20a1a (proximal convoluted tubule-specific expression gene) was inhibited, we suggested that slc20a1a could as a kidney damage marker in developmental stage. In this study, we utilized doxorubicin and aristolochic acid to establish renal failures disease model for

study the renal failure molecular mechanisms and using kidney-specific promoter wt1b and cdh17 driven EGFP gene (wt1b::GFP and cdh17::GFP) to establish transgenic zebrafish lines for drug screening.

II

縮寫表 AA

aristolochic acid

AARN

aristolochic acid nephropathy

ARF

acute renal failure

CDH17

cadherin17

DE

pronephric distal early tubule

dpf

days post fertilization

EPO

erythropoietin

GBM

glomerular basement membrane

hpf

hours post fertilization

IV

intavenous injection

JGA

juxtaglomerular apparatus

PCT

proximal convoluted tubule

PD

pronephric ducts

PKD

polycystic kidney disease

PST

proximal straight tubule

PT

pronephric tubules

SLC12A1

solute carrier family 12, member 1

SLC20A1A solute carrier family 20, member 1a TRPM7

transient receptor potential cation channel, subfamily M, 7

VEGF

vascular endothelial growth factor

WT1B

wilms tumor 1 B

III

章節目錄 中文摘要 ............................... Ⅰ 英文摘要 ............................... Ⅱ 縮寫表 ................................. Ⅲ 章節目錄 ............................... Ⅳ 前言 .................................... 1 實驗材料與方法 ......................... 12 結果 ................................... 20 討論 ................................... 26 未來展望 ............................... 32 圖表 ................................... 33 參考文獻 ............................... 51

IV

壹、 前言 腎臟功能 (Kidney function) 腎臟是泌尿系統中最重要的器官，主要作用是調節和維持人體內體液 容量和成分。腎臟的結構可分為皮質和髓質兩部分，皮質中主要為腎小球， 而髓質中主要是集合尿液的管道；腎臟功能和結構的基本單位為腎元 (nephron)。每個單位由腎小球 (renal corpuscle) 和腎小管 (renal tubule) 所 組成。 腎臟的生理功能： 一. 分泌尿液，排出代謝廢物、毒物和藥物：腎臟的血液供應充沛， 腎血流量約佔全身血流量的五分之一，腎小球濾液每分鐘生產約 120 c.c.，經過腎小管時絕大部分物質會被再吸收而水分回收比率 高達 99％左右，正常人的尿液每天約有 1.5 公升。腎小管會將葡 萄糖、胺基酸、維生素、鹽類和少量蛋白質回收再利用，而代謝 的廢物則全部被排出。 二. 調節體內水和滲透壓：水和鈉、其他鹽類及溶液的再吸收通常是 一起進行的，腎小管不同部位的吸收功能不同，但綜合而言，能 夠有效調節人體內的水份和滲透壓恆定。 三. 調節電解質的濃度：腎小球過濾的液體中含有多種電解質，當進 入腎小管後，鈉、鉀、鈣、鎂、碳酸氫、氯及磷酸鹽等大部分都 被回收，按人體的需要，及通過一系列的內分泌因子調節，可選 擇性的將這些電解質吸收並調節體內電解質濃度。 四. 調節酸鹼度的平衡 1

腎臟的內分泌功能：除了作為一個排泄的器官外，腎臟還是一個 很重要的內分泌器官。 五. 腎 臟 分 泌 的 內 分 泌 激 素 可 分 為 兩 大 類 ： 一 為 血 管 收 縮 素 (angiotensin)，參與腎臟內、外血管舒張收縮的調控，而另一類為 非血管收縮素。這類激素包含：腎素 (renin)，主要為調節腎臟血 液流量；另一為紅血球生成素 (erythropoietin, EPO)，是一種能刺 激紅血球 (erythrocytes) 生長的激素，功能是刺激骨髓中紅血球 的生長，防止貧血 (Smith, 1956)。

腎臟發育 (Kidney development) 哺乳類生物的腎臟由中胚層分化而來，發育過程主要可以分成三個時 期，原腎 (pronephroi)、中腎 (mesonephroi)、以及發育成熟時期的後腎 (metanephroi)，在人類中於妊娠後第五周腎臟開始發育，而老鼠腎臟發育 是在胚胎期第 10.5 天開始，成熟的腎臟是由腎小體 (絲球體) 組成，一對 腎約有 200 萬個腎小體組成 (Walker and Bertram, 2011)。每一顆腎臟含有 一百萬個相似的次級單位，稱之為腎元 (nephron)，每一個腎元由腎小球 (renal corpuscle) 與腎小管 (renal tubule) 所組成。腎小球是由介於傳入小 動脈和傳出小動脈之間的腎絲球 (glomerular capillary) 所組成。腎絲球中 的血液與鮑氏囊腔中的液體之間有三層過濾的阻礙：最內側是單層扁平的 內皮細胞，中間是不含有細胞的基底膜 (glomerular basement membrane, GBM)，及外層鮑氏囊腔內襯的上皮細胞。這部分的上皮細胞與鮑氏囊腔 其他的組成不同，也與身體其他部分的微血管有很大分別，這群上皮細胞 稱之為足細胞 (podocyte) 會伸出許多偽足般的突起。在腎小球中，濾過液 先透過內皮細胞的小孔，在通過基底膜，最後通過足細胞偽足之間的縫隙。 2

腎小管為鮑氏囊的延伸構造，由一單層上皮細胞所組成的中空細管。腎小 管又可分成 10-12 個不同的區段，各區段的結構和功能各異。例如近曲腎 小管 (proximal tubule) 是回收幾乎所有的葡萄糖，胺基酸， 70-80%的

鈉、鉀也是在這個部位主動吸收，氯離子則是被動擴散回收，有 60-70 % 的鈣離子是在這個部位與鈉離子同時主動回收，所謂主動回收是消 耗能量從低濃度的部位強迫回收到高濃度的區域，還有磷有 80-90% 也 是在此部位回收。在近曲腎小管後分節為亨利氏彎管 (loop of Henle’s) 為腎小管伸入腎臟髓質的部份，腎臟髓腎部份的滲透壓 (osmolality) 很

高，Cl- 是以主動運輸的方式，以正負離子形態 Na+/Cl- 同時回收，有 20-30% 的 Na+、Cl-、K+ 與 Ca2+ 是在此區域收回，也有 50-60% 的 Mg2+ 在此回收。 液體由遠曲腎小管進入集尿管系統 (collecting duct system)，其中包含連結小管 (connecting tubule)，皮質集尿管 (cortical collecting duct)、和髓質集尿管 (medulla collecting duct) (Acobson, 1981)。 從鮑氏囊開始到集尿管系統為止，每個腎元都是完全獨立的，最後經由數 百條的髓質集尿管，開口到腎盂 (renal pelvis)，將尿液排出體外。另外在 腎臟組織解剖學上的研究發現有一個重要部位是腎絲球傍器 (juxtaglomerular apparatus, JGA)，由緻密斑 (macula densa) 和腎絲球傍細 胞 (juxtaglomerular cell) 所組成。腎絲球傍細胞，則為具有分泌功能的細 胞，可分泌腎素 (renin) 來調節尿液的形成 (Smith, 1956)。

腎臟疾病 (kidney disease)

在人類腎絲球缺陷造成的腎病症候群例如，主要是因為 slit diaphragm 失去功能，slit diaphragm 即是腎小球過濾血液的關鍵，如果此結構被破壞 則造成腎絲球無法過濾大分子量蛋白而直接排入尿液形成蛋白尿 (Cooper 3

et al., 2002)，其形成原因及分子機轉仍不清楚，有待進一步釐清。此種現 象在斑馬魚腎絲球足細胞中也可以得到證實，斑馬魚腎絲球足細胞會分泌 兩 種 對 於 血 管 新 生 相 當 重 要 的 因 子 ，分 別 為 血 管 內 皮 細 胞 生 長 因 子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 和血管新生素 2 (angiopoietin 2)(Drummond and Majumdar, 2000; Pham et al., 2001) 。藉由這些與血管新 生相關的蛋白，腎絲球足細胞扮演著腎絲球微小管叢的形成和聚集 ，也 相對影響 slit diaphragm 的形成，並進一步去促使腎病症侯群的發生。腎臟 疾病中又可分為由基因遺傳所引起的遺傳性腎臟疾病，另一類為藥物所引 起的腎臟疾病。

常 見 的 遺 傳 性 腎 臟 疾 病 (Hereditary kidney disease) - 多 囊 腎 病

(Polycystic kidney disease, PKD)

多囊腎病 (Polycystic kidney disease, PKD) 多囊腎病 (polycystic kidney disease, PKD) 是一種最常見的腎臟遺傳 疾病，多囊性腎病變可分成兩種，第一種是多囊腎病變一型，是由第 16 對染色體變性引起；而另一種是多囊腎病變二型，是第 4 對染色體變性引 起。病患者的腎臟會長出許多囊腫，令病患者的腎體積驟增及腎功能減退。 統計數字顯示，其發病率為萬份之一，即每萬人就有一人患此症。當中有 百分之九十是多囊性腎病變一型，其餘的百分之十是多囊性腎病變。多囊 腎病又可為嬰兒型與成人型，前者是隱性遺傳較嚴重，後者是顯性遺傳較 輕微。嬰兒型多囊腎可能出現的併發症包括：羊水過少、肺部發育不全、 血尿、腎功能異常、高血壓以及尿崩症(大量而不受控制的排尿) 等，有 4

時候也會合併發生其他器官的畸形；有可能在幼年期死亡，也可能在稍微 長大以後出現腎衰竭。成人型多囊腎在兒童時期大多沒有症狀，到了成人 才出現腎功能障礙、高血壓等表現。多囊腎的積極性治療只有換腎一途。 有些文獻指出 ADPKD、pkd1、pkd2、ADF 和 CKD 等基因可能與此腎臟 疾病相關，但是它的機轉至今還不清楚。在斑馬魚中同樣發現和哺乳類動 物一樣有 pkd1、pkd2 基因，最近研究顯示 pkd1、pkd2 這兩個基因一同參 與體液流通，影響纖毛偏移改變鈣離子進入細胞內的功能 (Nauli et al., 2003; Praetorius and Spring, 2001)，這種纖毛功能在哺乳類腎臟主要扮演限 制腎小管的管腔直徑以及細胞分化的回饋機制，一旦這種纖毛功能無法作 用將會形成腎小管囊腫。

常見藥物引起之腎臟疾病-急性腎衰竭 (Acute renal failure, ARF)

和馬兜鈴酸引發之腎病 (Aristolochic acid nephropathy, AARN)

急性腎衰竭 (Acute renal failure, ARF) 急性腎衰竭 (Acute renal failure, ARF) 自從第一次與第二次世界大戰時 就引起醫師的注意，當時有很多戰壕打仗負傷的士兵，很多都會引起無尿 或尿毒症；另外亦有所謂“壓擊症候群 (Crash syndrome)＂，這些都是因 為腎小管細胞受傷所引起的急性腎小管壞死，因而造成急性腎衰竭。近年 來由於車禍外傷層出不窮，外科手術施行頻率增加，以及各種具腎毒性之 新藥品的廣泛使用，例如:利尿劑、抗生素、減肥藥與抗癌藥物。在抗乳癌 藥物中 doxorubicin (阿黴素或小紅莓) 的研究就指出此藥物會使心肌細胞 對氫氧自由基的傷害特別敏感，造成心臟累積性的傷害，除了對心臟傷害， 在 1998 年研究中，將單一劑量的 doxorubicin 利用靜脈注射 (intavenous 5

injection, IV) 的方式投予老鼠體內，在 18 天後發現老鼠腎功能異常包含腎 絲球蛋白尿、免疫球蛋白尿、尿中亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度上升、高膽固醇血 症、腎絲球硬化與腎小管萎縮，最後導致腎臟組織壞死 (Chen et al., 1998)。 另 外 2009 年 的 研 究 中 更 指 出 ， doxorubicin 會 抑 制 蛋 白 質 多 醣 (proteoglycan) 的合成，改變腎絲球表面電荷和通透性，使腎絲球內皮細胞 層變薄，進而導致腎絲球硬化 (Jeansson et al., 2009)。這都是使急性腎衰竭 發生率逐漸增加之原因。急性腎衰竭是一種高致死率的嚴重疾病，在加護 病房裡都有將近 50~70% 的死亡率 (DuBose et al., 1997; Torres and Harris, 2007)，目前並沒有一個很好的治療方式。急性腎衰竭常使用老鼠動物模型 來進行研究，在這個分析系統中，除了腎臟和腎小管的構造不易觀察外 (Dunn et al., 2002)，最受爭議的問題在這個系統並無法完全說明人類急性 腎衰竭徵狀 (Bonventre and Weinberg, 2003)。而目前仍找不到一個更適合 的生物模式系統來進行分析。

馬兜鈴酸腎病變 (Aristolochic acid nephropathy, AARN) 馬兜鈴酸 (aristolochic acid, AA) 腎病變是一種會持續惡化的腎臟間 質性腎炎 (Progressive interstitial nephropathy)。在 1953 年，首先是由 Ganshirt 從 歐 洲 的 馬 兜 鈴 屬

(Aristolochiaceae) 植 物 中 分 離 得 到

(Ganshrt,1953)。馬兜鈴酸是一種混合物，由 nitrophenanthrene carboxylic acids 構成，而馬兜鈴酸 I (aristolochic acid I, AA I) 和馬兜鈴酸 II (aristolochic acid II, AA II）是主要之成分。兩者的差別在於馬兜鈴酸 I 較 馬兜鈴酸 II 多一個甲氧基。馬兜鈴酸 I 的沸點為 275-278℃，裂解溫度 為 281-286℃；馬兜鈴酸 II 的沸點為 270-273℃，裂解溫度為 270- 272℃。 Bieler 等學者證實馬兜鈴酸之致突變和致癌作用與馬兜鈴酸-核酸鍵結物 (aristolochic acid-DNA adduct ） 之 形 成 有 關 ， 其 成 分 主 要 為 3’, 6

5’-bisphospho-7-(deoxyadenosin-N6-yl)-aristolactam I (dA- AA I)。大部分的 患者都是由於誤用了含有馬兜鈴酸成分的製劑，因而罹病，尤其在使用中 草藥非常頻繁的台灣及中國大陸，由於有些中草藥藥材名稱相似度極高， 因此混淆誤用的情況一直存在。在台灣含馬兜鈴酸中藥雖已經由政府加以 管制，但臨床尚仍然有使用馬兜鈴酸來做為減肥、保肝與強身藥中的添加 成分。而未被禁用的細辛，也傳出引起馬兜鈴酸腎病變的個案。因此，衛 生署不要只禁用 (2003 年 11 月起) 關木通、廣防己、青木香、天仙藤、馬 兜鈴；所有其他馬兜鈴科藥物包括春木香、朱砂蓮、尋骨風、青香藤、南 木香、通城虎、假大薯、淮通、管南香、鼻血雷、白金古欖、細辛、黃細 辛、花臉細辛、苕葉細辛、杜衡、金耳環、台灣野薄荷、毛茛科鐵線蓮屬 等，衛生署應重新加以評估其毒性，甚至禁用。 1988 年 Mengs 將馬兜鈴酸以口服投予 (rigid gastric tube) 或是靜脈注 射的方式投予至大公、母鼠 (rats) 與小公、母鼠(mice) 體內，給予劑量依 照投予方式與動物種類不同而異，結果顯示老鼠都在投藥後十五天內死亡， 體重都比原先減輕了約 20%，組織切片顯示腎小管損傷與投予劑量成正相 關性，且淋巴結內的淋巴球由於細胞被破壞而耗盡 (lymphocyte depletion)， 皮質層普遍出現了大量的腎小管壞死，大量的凋零細胞碎削 (cell debris) 與蛋白質沉積物 (protein cast) 阻塞在腎小管中，在輸尿管中也有相同的沉 積 物 。 而 且 在 肝 臟 以 及 十 二 指 腸 也 觀察 到 組 織 有 退 化 性 的 變 異 情 形 (Mengs, 1988)。1993 年 Mengs and Stotzen 再次利用雌性 Wistar 大鼠進行 AARN 的研究，此次是用口服方式將 10、50 或是 100 mg/kg 馬兜鈴酸單 次投予至大鼠體內，之後觀察三天。結果顯示投藥後老鼠體重下降，腎損 傷情形與投予馬兜鈴酸之劑量呈正相關 (Mengs and Stotzem, 1993)。 除了老鼠模式外，2001 年 Cosyns 等學者利用紐西蘭家兔 (New Zealand White Rabbit） 建立慢性馬兜鈴酸腎病變，利用腹腔注射 0.1 mg/kg 7

馬兜鈴酸，每週投藥五天，持續投予十七到二十一個月不等。結果顯示投 予馬兜鈴酸之後家兔食慾下降，體重相對控制組而言較輕。血清肌氨酸酐 上升，尿糖與蛋白尿偏高。近曲腎小管細胞扁平化，腎小管萎縮伴隨著輕 微的細胞間質浸潤，腎小管基底層增厚，細胞間質纖維化，輸尿管上皮細 胞分化異型 (atypias)。腎損傷程度由皮質層向髓質遞減。胃部細胞纖維化 以及胃黏膜細胞萎縮。所以不論是在老鼠或是兔子的模式生物中，不管是 口服投予馬兜鈴酸或是直接以靜脈注射，也都證實馬兜鈴酸確實會引起腎 臟病變，並會造成動物體內多處器官的壞死，具有致癌毒性 (carcinogenic) 與腎毒性 (nephrotoxic)。腎毒性物質不只會傷害腎臟，引起慢性腎臟病之 外低劑量長期暴露下，也會加速本來有慢性腎臟病的患者病情的惡化。

斑馬魚腎臟發育 (Zebrafish kidney development) 當胚胎發育至 12hpf (hours post fertilization)，斑馬魚腎臟前驅細胞是 由體軸兩側的中間中胚層 (intermediate mesoderm) 發育而來，在幼魚時期 兩對原腎管 (pronephric ducts) 分布在背側主動脈兩側，原腎 (pronephron) 的組成是兩個腎元融合形成一個腎絲球構造 (Drummond et al., 1998)。原 (nephrogenic mesenchyme) 經 由

腎管會由生成腎臟的間質細胞

mesenchyme-to-epithelium transformation 作用而產生。當胚胎發育至 16 到 24hpf，原腎管上皮細胞 (epithelia cells) 逐漸發育完成並開始進行上皮化 作用 (epithelialization)，使這些上皮細胞具有極性，並表現離子運輸蛋白 (ion-transport proteins)，使原腎管開始具有滲透壓調節功能。胚胎發育至 30 到 40hpf，原腎小管 (pronephric tubular) 與腎絲球 (glomerular) 結構開始 形成。發育至 40 到 48hpf，腎絲球內微血管已經形成，血液開始經由背 側動脈 (dorsal aorta) 血管進入腎絲球中，開始執行過濾 (filtration) 功能。 當胚胎發育至 48 到 50hpf，體軸兩側的腎絲球會開始慢慢在體軸中線融合 8

在一起 (Kimmel et al., 1995; Serluca and Fishman, 2001)。所以斑馬魚腎臟 大約在受精後 48 小時，即可開始發揮過濾作用。 斑馬魚腎臟構造與哺乳類動物腎臟相似，雖然斑馬魚腎臟構造相當簡 單，但斑馬魚也同樣擁有高等脊椎動物腎臟中所形成的通透性微血管內皮 細胞、腎絲球足細胞以及特定離子通道表皮細胞，由這些性質功能相同的 細胞，就演化觀點而言，斑馬魚腎臟的功能與較複雜的脊椎動物具有一定 的相似性。斑馬魚原腎對於血液過濾、腎小管再吸收、體液排泄是屬於封 閉系統 (Drummond, 2003)。魚類的原腎主要功能在調節體內滲透壓，一旦 幼魚失去原腎的功能便會因為血中鹽分過低導致嚴重水腫致死。而且斑馬 魚腎臟從受精卵到發育成具有腎臟功能只需兩天，因此在探討腎臟不同細 胞間相關的作用或是在腎臟發育過程中基因的調節，利用腎臟構造較簡單 且接近哺乳類動物的斑馬魚模式生物可在短時間內探討這些機制。 儘管哺乳類和硬骨魚類腎臟器官型態存有一些差異，但由先前研究顯 示也存在許多相似之處，在細胞或是分子機轉層面斑馬魚可以被用來進一 步了解腎臟發育和疾病。相同基因與細胞型態在所有的脊椎動物發育和功 能都相似，而這些相似基因突變後所造成人類腎臟疾病亦會在斑馬魚原腎 造成病變，因此以斑馬魚為模型進行腎臟發育以及相關基因的探討，無論 是在基因功能的探討和細胞間的交互作用都做為所有腎臟發育的基礎。造 成腎臟病變的原因相當多，但其致病的分子機轉或是細胞間的交互作用， 仍然不是很清楚，因此建立一個快速、有效率的活體分析平台，是有其必 要性。

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以斑馬魚作為模式動物的優點 在研究生物發育的過程當中，利用適當的動物模型能有效率的對欲研 究的基因進行功能性分析，其中魚類則是脊椎動物實驗中常使用的對象。 利用魚類做為實驗對物的優點有 (1) 多產 (2) 體外受精及發育，便於控制 (3) 許多魚的胚胎在發育過程中呈透明狀，利於觀察 (4) 成本低廉等。 而斑馬魚 (Danio rerio) 目前則為魚類中最常使用的物種之一，主要是 由於除了上述優點外，斑馬魚更具有下列優勢： (1) 成熟期短，約 2~3 個月，(2) 容易以人為方式控制其生殖時間，(3) 容 易採集受精卵，(4) 胚胎幾乎完全透明便於觀察胚胎發育過程，(5) 胚胎發 育時間短僅需 3~4 天即可發育為自由活動的幼魚，(6) 胚胎發育過程不需 要餵食，(7) 人工飼養容易，成熟短，(8) 已完成大部分基因定序 以上的數種優點使斑馬魚成為研究胚胎發育、遺傳學以及基因表現調 控機制方面很好的實驗動物。因此目前在實驗動物的選擇上，斑馬魚適合 作為初期的活體分析系統，將所得到的實驗結果，可再進一步應用到其他 陸生哺乳類動物系統。而另一個利用斑馬魚的優點是，研究過程中的變化 或是局部的差異可以直接的透過顯微鏡觀察，加上螢光蛋白基因蛋白的廣 泛應用，更可在斑馬魚透明的胚胎中更直接且明顯的觀察到基因分佈與表 現情形。 而在疾病分析上，在多囊腎病 (polycystic kidney disease, PKD) 研究中 發現 pkd1 與 pkd2 基因突變會導致此疾病的產生，在斑馬魚中同樣發現 和哺乳類動物一樣有 pkd1 和 pkd2 基因，從先前的研究指出 pkd2 突變 在斑馬魚中會造成原腎囊腫 (Sun et al., 2004)，但是在同時注射人類 pkd2 mRNA 到斑馬魚胚胎中會使得原腎囊腫情形恢復，可見 pkd2 在人類和斑

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馬魚間對於腎臟發育造成的影響有著高度保留性，由此結果就開啟利用斑 馬魚活體系統來探討 pkd 相關基因功能的可能性。 利用斑馬魚腎臟作為研究的對象，因為斑馬魚腎臟腎絲球也含有支持 性的基質細胞與足樣細胞，這些細胞型態與哺乳類生物的腎絲球組織中的 細胞型態相似 (Drummond et al., 1998)。斑馬魚的原腎小管與原腎管結構 上，也有一些特異化的細胞，可以將腎絲球所過濾出的過濾液，將其中的 離子經由再吸收作用 ( reabsorption ) 回到斑馬魚體內。且斑馬魚的原腎管 與原腎小管細胞，會表現 Na+/K+ ATPase 活性，證實這些細胞具有攝取離 子的能力 (Drummond et al., 1998)。斑馬魚腎臟也具有哺乳類生物腎臟器 官所具有的功能。因此，斑馬魚適合做為研究腎臟發育與疾病之模式動 物。

研究目的 為探討腎臟病變的機轉，本研究利用在腎絲球部位專一表現的 wt1b； 和表達在原腎管 (pronephric tubule and ducts) 部位的 cadherin17 (cdh17) 等基因的啟動子 (promoter) 片段，建立具有腎臟螢光特性的轉殖斑馬魚。 並且利用藥物造成腎毒性藥物 doxorubicin、馬兜鈴酸浸泡處理後，探討藥 物是否影響腎臟發育相關的基因表達如 slc20a1a、cdh17、trpm7、slc12a1， 未來將利用 MO 進行 knockdown，來誘發斑馬魚產生局部腎絲球硬化， 慢性腎絲球病變、急性腎臟疾病。因此本研究將建立一個腎臟組織具有螢 光特性，以腎臟螢光的斑馬魚生物模式系統，並利用此系統來探討急、慢 性腎臟疾病形成的分子機轉並建立腎臟疾病藥物篩選的平台。

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貳、 材料與方法 具有腎臟組織專一性表現載體的構築 參考人類、老鼠或斑馬魚文獻，並利用 Genbank 資料庫搜尋，分別將 wt1b、cadherin17 和 podocin 等基因 exon1 的 5’ 上游序列約 20kb 下載， 參考過去的文獻 (Bollig et al., 2009)，先選取 wt1b (~2.5 kb) 與 cadherin17 ( ~3.5 kb )，並分別設計 PCR primer (表一)。利用 PCR 技術將這些啟動子 (promoter) 進行合成，將 PCR 產物選殖入 pGEM-T easy (Promega, USA) 載體，並以 DNA sequencing (ABI 3730 automated sequencer) 定序確認序 列。待序列確認後分別將這些啟動子片段，利用限制酶 NotI，選殖入表現 載體 pT2-EGFP 或 pT2-DsRed

(pTol2 表現載體，由中研院生化所黃銓

珍研究員贈與；利用限制酶 EcoRI 和 XhoI 分別將 EGFP gene 或 DsRed gene 選 殖 入 pTol2 質 體 ) 。 最 後 構 築 成 pT2-wt1b-pro 或 cdh17-pro -EGFP/DsRed 的不同腎臟部位表達的表現載體。

聚合酶連鎖反應 取 0.1μg 的 whole embryo cDNA 或斑馬魚染色體 DNA，加入設計好 所要選殖不同腎臟組織表現之啟動子的核苷酸引子 (primer, 1μg/μl, primer 序列如表 1) 各 1μl，dNTP (2.5mM,Takara) 8μl，10x PCR buffer (Takara) 10 μl 以及 Taq polymerase (2.5units/μl, Takara) 1μl，並加無菌水至 100μl。 先以 96oC 處理 2 分鐘，再以 96oC (30 秒)、52 oC (30 秒)、72 oC (3 分鐘) 以 此條件反應 30 個循環 (cycles)；最後以 72 oC 加熱 15 分鐘後停止於室溫， 以 0.8％ 洋菜膠電泳分析產物。

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洋菜膠電泳分析 取適量洋菜膠 (agarose) 粉末，先以 TBE 緩衝液 (50mM Tris-HCl, pH 8.0 ; 50mM Boric acid; 1mM EDTA) 混和，使其最終濃度為 0.8％ (最終 濃度依分析 DNA 片段大小而定)，經微波加熱溶解待冷卻至 60oC，加入 EtBr (ethidium bromide；最終濃度 0.3~0.5 μg/ml )，並將洋菜膠倒在鑄膠盤 上，待其凝膠後將之移至電泳槽中，並以 0.5 x TBE 緩衝液覆蓋滿膠盤， 加 入 DNA 樣 品 (DNA 樣 品 須 先 加 入 gel loading dye : 0.05 ％ bromophenol blue, 0.05％ xylene cyanol 及 50％ glycerol)，並以 130 伏特 電壓進行電泳，並以紫外光偵測 DNA 訊號並照相紀錄

DNA 膠體純析 (DNA gel elution) 將純化的 DNA 片段從洋菜膠上切下，裝入 1.5 ml 離心管，加入 500 μl PG buffer (EasyPure, Bioman) 並置於 55 oC 水浴中加熱使其膠體溶解為 止；再將溶解的膠體溶液轉移至 spin column 中，並以 10000 rpm 離心 1 分鐘，之後加入 0.5 ml wash buffer 沖洗，以 10000 rpm 離心 1 分鐘，再 經開蓋空轉 2 分鐘後置入烘箱中待酒精揮發。最後加入 50μl 滅菌水，並 以 10000 rpm 離心 2 分鐘，回收純析後的 DNA 片段。

接合反應 (DNA ligation) 取純析後的 DNA 樣品 3μl，分別加入 1μl (～5 ng) 適當的載體 (比例 約 3～5:1)，2μl 的 10x ligation buffer (Fermentas)，1μl (3 units) T4 DNA ligase (Fermentas)，並加入滅菌水至體積為 20 μl，於室溫反應 1.5 小時。

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勝任細胞 (competent cell) 製備 先準備以下兩種液體 (1) TSS 溶液：Yeast extract 0.5g, Tryptone 1g, NaCl 1 g, PEG 4000 10 g, DMSO (dimethylsufoxid ) 5 ml, 1M MgSO4 2.5 ml, 以及 1M MgCl2 2.5 ml，加水至 100 ml 後以 0.45 μm 濾膜過濾 (Millipore) 備用。(2) ice-cold TSS 溶液：上述 TSS 溶液和 60% glycerol 以相等體積混 和。取 JM 109 大腸桿菌單一菌落，接種於 5ml LB 培養液 (1% Typtone, 0.5% Yeast extract, 1% NaCl)，於 37oC 培養 14~16 小時，第二天取 50μl 之菌種液重新接種於 5ml 之 LB 培養液，於 37oC 再培養 2~3 小時。以 2500 rpm，4oC，離心 10 分鐘，倒去上清液，下層沉澱菌種加入 2.5 m l 的 TSS 溶液，以震盪器混和均勻。再以 2500 rpm，4oC，離心 10 分鐘， 倒去上清液，菌種加入 0.3 ml ice-cold TSS 溶液，再以震盪器搖散沉澱菌 種後，分裝成 80 μl 儲存於 -80oC 備用。

細菌轉型作用 (transformation) 取與載體完成接合反應的 DNA 溶液 10 μl 加入勝任細胞中，插於冰 上靜置 30 分鐘後，以 42oC 加熱處理 90 秒，隨後插置冰上 1 分鐘。接 著加入 200 mM IPTG (Isopropyl-β-D-1- thiogalactopyranoside)及 50 mg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro -3- indoly-beta-gakactopyranoside) 各 15 μl，混和 均勻後取 40~50μl 之混和液均勻塗佈在含有 ampicillin ( 50 μg/ml ) 之 LB 洋菜膠培養皿上，於 37oC 培養 14~16 小時，並利用菌株之藍白進行篩選 重組質體。

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純化質體 DNA 以 WizardR Plus SV Mini-preps kit (Promega) 純化質體 DNA：取 5ml 隔夜培養菌液於 2500 rpm 離心 10 分鐘，倒除上清液，加入 200μl resuspension solution 與菌體混合均勻，再加入 200μl lysis buffer 以及 10μl alkaline protease 與菌液充分搖晃均勻至呈透明狀 (勿超過 5 分鐘)，再加入 300μl neutralization solution，輕輕混合均勻插至冰上 5～10 分鐘。隨後以 13000 rpm 離心 10 分鐘，將上清液轉移至 spin column 中，並以 13000 rpm 離心 1 分鐘，以 washing buffer 沖洗 2 次，接著空轉 2 分鐘後，置 入烘箱以除去酒精。最後加入滅菌水 50μl，以 10000 rpm 離心 2 分鐘， 收集純化後的質體 DNA，並保存於 -20oC。

Fish 斑馬魚養置於 28.5oC 環境下，並以光照 14 小時/黑暗 10 小時飼養。 採卵前一日將斑馬魚集中至產卵缸內，燈亮後開始收集受精卵，受精卵在 受精後三十分鐘內仍保持單一細胞之狀態。斑馬魚胚胎置於 28 oC 水浴， 發育時期由 Zebrafish Book 中描述來判定。

顯微注射 (Microinjection) 將構築好的質體 DNA 與注射標定染劑 (1% phenol red) 混合，利用 配備有微量注射系統 (IM 300 microinjected system, Narishige) 的立體顯微 鏡 (SZX16, Olympus Optical Co., LTD)，於斑馬魚卵 1 cell-stage 進行顯微 注射。顯微注射所使用的毛細管針孔徑大小為 0.1mm 左右，注射壓力為 26 psi。受精卵發育 24~26 小時，置換養殖的去氯水為含有 0.3% PTU 溶 液 (propylthiouracil, Sigma) ， 並 於 胚 胎 發 育 過 程 中 利 用 倒 立 顯 微 鏡 15

(Olympus IX70-FLA inverted fluorescence microscope) 持續觀察，以 SPOT 數位影像分析系統 (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, Michigan, USA) 記錄其結果，斑馬魚胚胎影像則利用 photoshop program (Adobe System Inc., CA, USA) 軟體組合。

藥物浸泡斑馬魚胚胎實驗 1

Doxorubicin 溶液前處理 將 doxorubicin (感謝三軍總醫院腎臟科許育瑞醫師提供) 溶液，配製

成 200 ng/ml 的保存濃度，儲存於 -20℃ 備用。進行胚胎浸泡實驗時，再 分別依比例配製成 40 ng/ml、80 ng/ml 與 100 ng/ml。 1.1 Doxorubicin 浸泡處理斑馬魚胚胎實驗 將受精後的斑馬魚胚胎，先置入 28.5℃ 恆溫培養箱中培養。於受精 後 24 小時，挑選發育良好的胚胎進行實驗。將胚胎分裝至 6 孔盤中， 每一個孔洞分別放入

15 個胚胎，孔洞中溶液總體積為 5ml。再依照不

同的實驗需求，放入實驗組不同濃度 40 ng/ml、80 ng/ml 與 100 ng/ml 之 doxorubicin 溶液；對照組則是加入等體積的 embryo buffer (0.29g NaCl, 0.013g KCl, 0.05g CaCl2·2H2O, 0.08g MgSO4·7H2O in 1 L dd H2O；pH 7.2 )。 依照不同的實驗需求，以不同時間持續浸泡，於特定時間將胚胎以胚胎培 養清洗數次並收集。 2

馬兜鈴酸溶液前處理 將馬兜鈴酸粉末 (Sigma) 溶於 DMSO 中，配製成 30mM 的保存濃

度，儲存於 -20℃ 備用。進行胚胎浸泡實驗時，再分別依比例配製成 1μM、 5μM、10μM。

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2.1 馬兜鈴酸浸泡處理斑馬魚胚胎實驗 將受精後的斑馬魚胚胎，先置入 28.5 ℃ 恆溫培養箱中培養。於受 精後 24 小時，挑選發育良好的胚胎進行實驗。將胚胎分裝至 6 孔盤中， 每一個孔洞分別放入 15 個胚胎，孔洞中溶液總體積為 5 ml。再依照不同 的實驗需求，放入實驗組不同濃度 1μM、5μM 與 10μM 之馬兜鈴酸溶液； 對照組則是加入等體積的 DMSO。依照不同的實驗需求，以不同時間持續 浸泡，於特定時間將胚胎以胚胎培養清洗數次並收集。

Real-time PCR 搜尋基因資料庫中腎臟近曲小管專一表現基因 slc20a1a，根據資料庫 序列，設計一組長度為 20bp 左右的引子。 引子設計：Solute carrier family 20, member 1a (slc20a1a) zslc20a1a-qPCR-F：5’-TCTCTGGGACACATTGCATC-3’ zslc20a1a-qPCR-R：5’-AGCAGTTCCAGCCATTTGAC-3’ 使用 Power SYBR Green PCR Master Mix kit，由 ABI 公司購買而來。 利用 ABI 7300 進行 qPCR 加入下列藥品進行反應 (感謝醫科所張淑芬 老師提供)：

NTC

Sample

cDNA template

0μl

1μl

Forward primer (2.5uM)

1μl

1μl

Reverse primer (2.5uM)

1μl

1μl

ddH2O (nuclease-free)

8μl

7μl

10μl

10μl

Power

SYBR

Green

PCR Master(2X) Total volume

20μl 17

反應條件：50℃，反應 2 分鐘；95℃，反應 10 分鐘；95℃，反應 30 秒，再以 60℃，反應 30 秒，此步驟重複 45 循環；最後再以 95℃，反 應 15 秒；60℃，反應 20 秒；95℃，反應 15 秒做 dissociation curve。 反應完成後，將結果進行分析整理。為了絕對定量 slc20a1a 基因表現量我 們設計 slc20a1a 全長 (Full length) 約為 2 kb 的片段，將 PCR 產物選殖 入 pGEMT-easy 載體，利用 NanoDrop1000 (Thermo, USA)測量 DNA 濃 度後經過序列稀釋達到操作標準曲線濃度，序列稀釋的方法： (1) 一般製作 standard curve 時，至少會需要有 4 個不同稀釋倍數的 樣本，所以採用的濃度大約會是在稀釋 102X~ 105X 之間，每個稀 釋樣本間的差距為 10 倍。 (2) 製作 cDNA 的序列稀釋樣本時，會先由原始樣本取出 10μl 的 sample 加入 90μl 的滅菌過濾的 ddH2O 中先行稀釋 10 倍，之後以 該 10 倍稀釋樣本為原液，連續作四次的 10 倍稀釋，並以最終稀 釋倍數為 102X~ 105X 間的四個樣本作為序列稀釋的操作樣本； (3) 進行序列稀釋時，須注意每次抽取 10μl 的樣本前，務必將該樣本 vortex 完全並進行 spin down 的動作（操作核酸時，因為單股核酸 帶負電，會黏合在 tube 管壁上），以確保序列稀釋的準確性。 利 用 已 知 DNA 複 製 數 質 體 做 出 絕 對 定 量 時 標 準 曲 線 (standard curve)(附圖一)。

統計分析 RT-PCR 結果以 Image J (National Institutes of Health, USA) 軟體分析 量化，以 β-actin 表現量作為參考標準，各基因與 β-actin 表現量先做標準 化 (normalize)，再與對照組基因表現量為 1，得到各基因與對照組比值。

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Real-time PCR 結果，以 Prism 7000 軟體分析得到 Ct 值，根據 PCR 之反應原理，當 cDNA template 量愈多 Ct 值愈低，兩者之間成對數反比 的關係，再經過與內部對照組 (internal control) β-actin mRNA 之標準化， 可得到 slc20a1a mRNA 之相對表現量。

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參、 結果 建立腎臟螢光轉殖斑馬魚 為了建立腎臟螢光轉殖斑馬魚，參考人類、老鼠或斑馬魚文獻，利用 Genbank 核酸序列資料庫搜尋，參考過去的文獻 (Bollig et al., 2009)，先 分別選殖專一表達在腎絲球部位的 wt1b、原腎管的 cadherin17 或足細胞 的 podocin 等基因 5’上游啟動子 (promoter) 片段，來建立腎臟組織螢光 的斑馬魚。先選取 ~2.5 kb wt1b 和 ~3.5 kb cadherin17 基因 5’ 上游啟動 子片段來進行表現載體的構築，利用 PCR 將這些片段加以合成，經核酸 定序確認。再分別將這些啟動子片段，利用限制酶 NotI，選殖入表現載體 pT2-EGFP 或

pT2-DsRed ， 構 築 完 成 的 表 現 載 體 分 別 命 名 為

pT2-wt1b-pro-EGFP 及 pT2-cdh17-pro-EGFP (圖一)，利用顯微注射，分別 將上述構築完成的表現載體，打入斑馬魚胚胎，以建立腎臟螢光基因轉殖 斑馬魚。

具有腎臟專一表達螢光基因之表現載體在斑馬魚中表達情形之分析 分別將 pT2-wt1b-pro-EGFP 及 pT2-cdh17-pro-EGFP，構築好可以表 達在腎絲球部位的 wt1b 和表達在原腎管 (pronephric tubule and ducts) 部 位的 cadherin17 (cdh17) 的啟動子片段，利用顯微注射的方式打入斑馬魚 胚胎內，並連續觀察胚胎發育與螢光蛋白表現情形，利用此具腎臟組織專 一表現之啟動子 (tissue-specific promoter) 來啟動下游綠色或紅色螢光蛋 白基因表現，透過綠色螢光蛋白表達位置來模擬不同腎臟部位的標定。在 cdh17 啟動子的分析，顯微注射後於發育至 3dpf (days post-fertilization) 後 記錄其結果。結果顯示，明視野觀察下實驗組與野生組斑馬魚在外觀型態 20

上並無明顯差異 (圖二 A)，由此結果可知本實驗中構築的表現載體並不會 影響斑馬魚胚胎的發育。而綠色螢光蛋白表達的位置如白色箭頭所示 (圖 二 B)，皆表達在原腎管的細胞中，其表達的位置和過去文獻指出 cadherin 17 mRNA 表達的位置完全一致，證實選取的 3.5 kb 啟動子片段，確實可 以將綠色螢光蛋白專一的表達在 pronephric tubules 和 pronephric ducts (圖二 D-E)。可以明顯觀察到在耳蓋後 nephron 的位置 (圖三 D) 開始有 成管柱狀的綠色螢光蛋白表現，在 40 X 和 100 X 下觀察則可明顯看到綠 色螢光蛋白表達在管柱狀的構造中(圖三 E-F)。 而在 wt1b ~2.5 kb 啟動子片段的分析，利用 pT2-wt1b-pro-EGFP 表 現載體送入斑馬魚胚胎中，待發育至 2dpf 時，可以觀察到大部份轉殖後 綠色螢光蛋白會表現在心臟或肌肉組織 (圖四 B-C)，而圖四 D 與 E 顯 示，在耳蓋下方腎絲球部分有綠色螢光蛋白表現，但其比率低於 6%，因 此本研究選用之 2.5kb 啟動子片段並未如預期具有很高的專一性表達在 腎絲球構造中，由結果顯示，實驗選用的啟動子片段並未包含完整在腎絲 球表現的調控序列。

斑馬魚腎臟疾病模式之建立

Doxorubicin 處理對於斑馬魚胚胎發育影響之分析 為了建立斑馬魚腎臟疾病模式生物，參考老鼠建立慢性腎絲球病變的 方式，選用 doxorubicin hydrochloride 分別將發育 24hpf 的斑馬魚，放入 6 孔盤中，分成 4 組，每組放入 15 尾斑馬魚 (n=15)，每個處理組加入不 同濃度 doxorubicin，0、40、80 與 100 ng/ml 浸泡，連續五天(發育時期 24-144hpf)，藥物可透過血液循環送至全身，處理結果如表 2 所示，結果 顯示隨著濃度增加其變異的比率分別為 0%、26.7%、57.3% 與 89.1% (圖 21

五)，突變比率明顯的與給予的藥物濃度成正相關。使用 doxorubicin 處理 斑馬魚胚胎浸泡處理時間 (圖六 A)，在藥物處理下，心臟發育異常，心臟 會有膨大的情形 (圖六 C，黑色箭頭處)；圖六 (B)為實驗對照組；而圖六 (D)、(E) 結果顯示，藥物處理後胚胎發育發生異常的狀況都非常相似，主 要是圍心腔異常腫大。在 80 以及 100 ng/ml 濃度處理下，魚體兩側明顯 膨大，圍心腔也明顯腫大，隨著藥物劑量增加異常的狀態也有越趨嚴重的 情形 (表 2、圖六 C-E)，同時在圍心腔內造成大量積血，導致全身血液循 環異常，進而影響胚胎發育而造成死亡；而對於腎臟組織的觀察，從外觀 上並無辦法直接辨識。

Doxorubicin 處理對於斑馬魚胚胎腎臟發育相關基因表現之分析 由於外觀上無法辨識腎臟發育是否受到藥物影響，為瞭解藥物對於斑 馬魚腎臟發育的影響，參考過去文獻研究，發現腎臟發育時期，在不同腎 臟部位皆會有具專一性的特定基因表現，來調控腎臟不同部位的發育 (Wingert and Davidson, 2008; Wingert et al., 2007)，本研究分別選在腎臟不 同部位，具專一性表達的基因進行基因表現之分析。其中 wt1b、cdh17、 trpm7 、 slc20a1a 與 slc12a1 分 別 代 表 腎 足 細 胞 (podocytes) 、 腎 小 管 (pronephric duct；PD)、近直小管 (proximal straight tubule；PST)、近曲小 管 (proximal convoluted tubule；PCT) 和近直小管後的 pronephric distal early tubule (DE) 專一表現的基因(附圖二)。利用上述基因表現差異來探討， 不同腎臟部位在發育時期是否會受到 doxorubicin 藥物影響。我們利用不 同濃度 doxorubicin 浸泡處理後，收集發育至 144hpf 且發育異常的胚胎 進行基因表現之分析，利用 RT-PCR 來分析藥物處理後基因表現之差異 (圖七 A)，結果顯示，隨著 doxorubicin 藥物濃度增加在近曲小管專一表現 之 slc20a1a 基因表現有被抑制的情形 (圖七 B)，而其他腎臟部分發育相 22

關基因則沒有明顯的變化；另一方面因觀察到圍心腔膨大的情形，因此同 時也利用與心臟發育相關的基因 col2a1a (collagen type II α-1-a，骨骼與軟 骨系統發育的指標) (Yan et al., 1995) 及 myf5 (肌肉發育調控因子之一，在 肌肉細胞的特化與分化上都扮演著相當重要的角色) (Chen et al., 2001)，進 行分析。由實驗結果發現在 doxorubicin 藥物處理後 col2a1a 與 myf5 基 因表現亦有被抑制的情形，由上述基因表現差異分析結果，結果顯示在 doxorubicin 藥物浸泡處理下，除了腎臟近曲小管發育指標 slc20a1a 表現 量受到抑制之外，還會抑制 col2a1a 以及 myf5 基因造成胚胎肌肉發育也 受到影響，使心臟發育明顯異常 (圖七 D-E)。

馬兜鈴酸 (aristolochic acid, AA) 處理對斑馬魚胚胎發育影響之分析 在過去的文獻研究，已經證實馬兜鈴酸 (aristolochic acid, AA ) 主要的 影響部位是“腎臟” (Cosyns et al., 1998; Huong and Hsiao, 2008; Mengs and Stotzem, 1993)。為了觀察馬兜鈴酸浸泡處理下，在斑馬魚的模式生物系統 是否會影響到原腎的發育，進而去改變腎臟的功能。本實驗使用 1μM、5μM 與 10μM 不同濃度的馬兜鈴酸處理，發育至 24hpf 的胚胎，持續浸泡處 理 24 小時 (圖八 A)。同時以等體積的 DMSO 作為實驗的對照組 (native control)。結果顯示，對照組胚胎外觀上腎臟並沒有明顯的囊腫或缺陷 (圖 八 C-E) ，但經馬兜鈴酸浸泡處理的斑馬魚胚胎，與 doxorubicin 浸泡處 理的胚胎相似，發現胚胎腹部兩側膨大，且圍心腔有明顯脹大的現象，處 理 24 小時 隨著馬兜鈴酸濃度的增加 (DMSO 對照組 0μM、1μM、5μM 與 10μM) 變異的比例分別為 0%、57.1%、62.9% 與 100%；而處理 48 小 時後則變異的比例分別為 0%、76.2%、100% 與 100%。結果顯示，隨著

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藥物濃度與時間增加對於圍心腔的變異也隨之嚴重，心臟畸形也越嚴重 (圖九)。

馬兜鈴酸處理對於斑馬魚胚胎之心臟發育影響之分析 為瞭解馬兜鈴酸是否影響斑馬魚胚胎心臟的發育，利用 0μM、1μM、 5μM、與 10μM 馬兜鈴酸浸泡 24hpf 的斑馬魚胚胎，然後持續觀察，在發 育至 36hpf 胚胎，顯示心臟的搏動力道有明顯的下降趨勢，而顯微鏡下觀 察，更發現心臟內腔的空間有縮小的情況。除此之外，不論實驗組或是對 照組，在胚胎的外觀上則是沒有任何的差異產生。持續觀察發育至 48hpf 胚胎，62.9% 胚胎出現圍心腔腫大情形 (表 3)，而且卵黃囊下方嚴重積血 (圖八 D)，在高濃度 10μM 處理下，心臟發育明顯異常，同時魚體也明顯 出現彎曲的情況 (圖八 E)。近一步觀察，發現處理後的胚胎，心臟變小， 心房的搏動能力已經嚴重下降，心室則是幾乎喪失搏動能力，最後胚胎會 喪失血液循環能力、組織開始壞死，進而胚胎死亡。因此推測，馬兜鈴酸 藥物處理也會影響斑馬魚胚胎心臟的發育及之功能。

馬兜鈴酸處理對於斑馬魚胚胎腎臟發育相關基因表現之分析 為瞭解斑馬魚胚胎腎臟發育是否受到馬兜鈴酸影響，利用上述特定腎 臟部位表達的 wt1b、cdh17、trpm7、slc20a1a 與 slc12a1，來比較腎臟不 同部位在發育時期馬兜鈴酸藥物處理之影響；另外藥物處理後心臟發育明 顯異常，因此也利用 myoD 基因，做為肌肉早期發育時分化的重要指標基 因 ， myoD 與 myf5 都 是 屬 於 肌 原 調 節 分 子 家 族 myogenic regulatory factors (MRFs) family 的成員， myoD 主要由肌原母細胞表現，功能與 myf5 相似 (Berkes and Tapscott, 2005; Weintraub et al., 1991)。

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取發育至 24hpf 的胚胎分別加入 0μM、1μM、5μM 與 10μM 馬兜鈴 酸，浸泡處理 24 小時，收集這些發育畸形胚胎 (圖八 C-E)，萃取 RNA， 經反轉錄成 cDNA，並以 RT-PCR 進行基因表現分析。圖十 (A)馬兜鈴酸 藥物處理後 slc20a1a、slc12a1、cdh17、與 myoD 基因表現之變化，RT-PCR 結果，並將上述結果量化如圖十 (B)。實驗結果得知 slc20a1a 的表現量與 對照組相比，在 1μM、5μM 及 10μM 馬兜鈴酸的處理下 slc20a1a 表現量分 別降低 0.83、0.56 與 0.46 倍；而有趣的是 slc12a1 的表現量與對照組相 比，卻出現增加的情形，分別在 1μM、5μM 及 10μM 馬兜鈴酸的處理下 slc12a1 表現量分別增加 1.22、1.54 與 2.1 倍。而 cdh17 及 myoD 表現， 不論馬兜鈴酸濃度如何增加其表現量都沒有明顯差異。 為了進一步確認馬兜鈴酸藥物處理後 slc20a1a 基因的表現量是否會受 到抑制，利用 real-time PCR 來進行分析，實驗結果以 DMSO 浸泡處理 組做為對照組，將其表現量視為 1 倍。結果顯示，分別在 1μM、5μM 及 10μM 馬兜鈴酸的處理下 slc20a1a 基因表現量相較於對照組，分別降低 0.77、0.55 與 0.28 (圖十一 A)。結果與上述 RT-PCR 趨勢相似。並利用 絕對定量方式比較馬兜鈴酸的處理下 slc20a1a 基因表現受抑制的程度， 結果顯示，對照組 DMSO 處理時 slc20a1a DNA 複製數目 (copy number) 為 293.4；而 1μM、5μM 及 10μM 馬兜鈴酸的處理下 slc20a1a DNA 複製 數目分別為 214、136.45 與 59 (圖十一 B)。所以無論是在半定量 PCR (RT-PCR)、相對定量及絕對定量 real-time PCR 中皆證實 slc20a1a 基因表 現量，會隨著馬兜鈴酸劑量的增加會受到抑制，具有劑量關係 (dosage-dependent manner)，因此我們認為馬兜鈴酸會透過影響 slc20a1a 基因表現進而造成斑馬魚腎臟發育異常。

25

肆、 討論 過去對於腎臟疾病模式的研究，主要利用老鼠的基因剃除模式，或是 藥物注射來進行分析，而老鼠腎臟必須發育到成熟的後腎階段 (metanephros)，才具有腎臟功能，實驗操作費時，尤其是在胚胎發育時期， 老鼠系統更是無法連續觀察腎臟病變的過程。目前的研究顯示斑馬魚的腎 臟發育和高等脊椎動物不僅功能相似，其各部分腎臟分節及構造也極相似 (Wingert and Davidson, 2008)。在發育早期的斑馬魚腎臟-原腎 (pronephric) 即 具 有 功 能 性 且 構 造 相 當 簡 單 ， 構 造 中 包 含 一 個 融 合 腎 絲 球 (fused glomeruli) 和一對左右對稱的原腎管 (pronephic ducts)，在過去斑馬魚大量 基因突變篩選的研究中，已知有一些的斑馬魚腎臟突變品系，其中有些腎 臟變異的品系，其腎臟的絲球體組織發生變異，造成絲球體組織有「囊腫」 情況，目前研究顯示其變異的基因例如 double bubble (dbb)、bazooka joe (bzj)、dizzy (dzz)、junior (jnr)、mr. bubble (mrb)、blowup (blp)、fusen (fsn)、 bubblicious (bcs)、big league chew (blc)、hubba bubba 和 inflated (ifl) 等與 哺乳類生物多囊性囊腫致病的基因類似。如果從外觀觀察這些突變品系的 胚胎，例如 dbb 基因突變種可以從魚體背側，卵黃囊的上方觀察到「∞」 腫脹外觀 (Drummond et al., 1998)，而這些基因變異的斑馬魚，近年來被 廣泛的用來進行腎臟發育和腎臟病變的分子機轉探討。 在哺乳類生物中，cadherin17 基因主要表現位置在肝臟與腸胃道中， 所 以 被 命 名 為 liver-intestine cadherin (LI-cadherin)(Gessner and Tauber, 2000)，cadherin 17 屬於鈣黏蛋白 (cadherin)，其組成在細胞膜外具有七個 cadherin 穿膜蛋白區域 (domain)，是一種存在於細胞膜上的細胞沾黏分子 (cell adhesion molecule)，其功能為細胞與細胞間的接合，以及在胚胎發育 中扮演調控不同組織及器官的形成，但在健康的成熟肝臟或腸胃 cadherin 26

17 的表現量就被抑制，同時它與細胞的分化 (differentiation) 也有密切的 關 係 。 2010 年 的 研 究 報 告 ， 當 cadherin 17 失 去 調 控 時 在 肝 細 胞 癌 (hepatocellular carcinoma , HCC) 中會使組織異常增生、腫瘤形成及癌細胞 轉移有直接相關 (Lee et al., 2010)。在斑馬魚系統中 cadherin 17 基因主要 表達在腎小管，在肝臟的形成並沒有參與其中，由此結果顯示 cadherin 17 在不同物種間的表現具有差異性 (Horsfielda et al., 2002)。 在本實驗中所建立的腎臟螢光轉殖斑馬魚目前只得到顯微注射後所 得到斑馬魚，未來會將此轉殖斑馬魚繁殖成穩定的轉殖品系，並且利用浸 泡方式給予腎毒性藥物，直接利用螢光顯微鏡觀察在腎臟所表達的綠色螢 光蛋白分布及型態，利用影像觀察直接分析腎臟是否受到藥物影響。在野 生種斑馬魚的腎臟外觀觀察不到明顯囊腫或是變化，所以希望建立腎臟螢 光專一表達轉殖斑馬魚，或許就可透過螢光蛋白的表達更直接的觀察腎臟 組織是否受到影響，例如在腎絲球專一表達的 pT2-wt1b-pro-EGFP 轉殖班 馬魚，就可用來探討腎絲球上皮細胞受到藥物影響影響造成細胞壞死之研 究，可以就綠色螢光蛋白消失或是擴散，來快速篩選具有腎絲球毒性的藥 物。另外表達在原腎管之 pT2-cdh17-pro-EGFP 轉殖班馬魚，也可以用來 篩選影響原腎管功能和發育的藥物。除了浸泡方式給予藥物外，在 2010 年的研究中也指出可使用 2dpf 斑馬魚利用顯微注射的方式將腎毒性藥物 注射於卵黃囊前方的靜脈竇，直接讓藥物透過血液循環運送腎臟成功誘導 腎臟發生病變。利用 Na+/K+ ATPase antibody (α-6F) 免疫螢光的染色分析， 結果顯示，這種處理方式確實可以觀察到腎小管 (pronephic duct) 細胞排 列變鬆散，影響到物質的回收 (Cianciolo et al., 2010 )，因此未來我們也可 以 利 用 此 實 驗 方 式 將 藥 物 以 注 射 方 式 投 予 pT2-wt1b-pro-EGFP 、 pT2-cdh17-pro-EGFP 轉殖班馬魚，可以直接觀察相關腎臟組織病變相關的 變化。 27

本實驗中所使用的藥物之一 doxorubicin 是一種廣泛使用及對多種癌 症均有治療效果的抗癌藥物，尤其在乳癌治療中常是不可或缺且效果佳。 doxorubicin 的主要抗癌機制是經由螯合 DNA、抑制 topoisomerase II 和 產生氫氧自由基等作用來毒殺癌細胞。在臨床上 doxorubicin 的使用會引 起心臟毒性 (cardiotoxicity) 而且不只單純影響心臟，還會造成間質性腎臟 炎，在 1986 年的研究中在老鼠模式裡指出 doxorubicin 會先導致腎絲球上 皮細胞損傷引起蛋白尿，近一步破壞腎小管基底膜 (tubular basement membrane, TBM) 使腎小管阻塞，使遠曲腎小管管柱形成異常引發間質性 腎臟炎 (Bertani et al., 1986)，因此 doxorubicin 常被用為哺乳類動物裡誘 發腎小管間質病變的腎臟疾病模式生物，同樣在本研究實驗結果顯示，在 斑馬魚系統中，觀察到 doxorubicin 處理斑馬魚胚胎下心臟型態明顯發現 膨大 (圖六黑色箭頭處)，並且在腎臟發育相關基因 slc20a1a 基因表現也 受到抑制，由此結果證實斑馬魚系統也可以利用 doxorubicin 誘發腎臟病 變，作為研究腎臟疾病的模式生物。 在本研究中所使用的另一種藥物，馬兜鈴酸在過去哺乳類生物的研究 認為主要是會造成“腎臟”病變 (Cosyns et al., 1998; Huong and Hsiao, 2008; Mengs and Stotzem, 1993)。在 1996 年的研究更指出馬兜鈴酸會引起近曲小 管上皮細胞轉分化 (AA-DNA adducts) 會使得新生細胞之基因序列異常， 轉而分化成異常細胞，導致細胞纖維化或甚至是癌化 (Schmeiser et al., 1996)。馬兜鈴酸也會造成腎小血管管腔增厚，在 AARN 的動物及病人組 織切片中可以觀察到腎小血管增厚的現象，而增厚的腎小血管因為管腔變 狹隘了，所以血液輸送受阻，導致慢性間質性缺血，腎小管獲得不到充足 的養分，於是萎縮、凋零。也有研究發現近曲小管間質細胞蓄積免疫細胞， 活化免疫機制導致纖維化產生近曲小管纖維化過程中牽涉到許多免疫機 轉，在初期一般認為腎臟的損傷活化了周邊腎小血管上皮細胞（peritubular 28

capillary endothelium），因此而促使單核球 （mononuclear cells） 聚集至 腎間質內，之後單核球便轉變成為巨噬細胞 （macropages），除此之外， 肌 纖 維 母 細 胞 （ myofibroblasts ） 與 活 化 型 纖 維 母 細 胞 （ activated fibroblasts） 也開始在腎間質聚集，而這些細胞都不斷分泌使細胞持續發 炎的物質，這些物質會誘發纖維化，最後導致腎臟纖維化產生 (Vanherweghem et al., 1996)。研究中證實馬兜鈴酸是可以直接損傷腎臟上 皮細胞的，特別是近曲小管上皮細胞 (Lebeau et al., 2001) 馬兜鈴酸會使腎 小管細胞萎縮、凋零，在體外實驗時發現若是直接將馬兜鈴酸加入猪的近 曲小管細胞培養液中，近曲小管細胞明顯凋零，而凋零的嚴重度隨著加入 馬兜鈴酸濃度上升而加重，但對於發育中的腎臟組織傷害並沒有太多的研 究。 為探討其對於發育中腎臟病變可能之機轉，本研究擬利用斑馬魚為模 式動物，來研究馬兜鈴酸在斑馬魚腎臟的發育過程中，造成斑馬魚腎臟病 變的可能機轉。利用發育至 24hpf，以馬兜鈴酸浸泡處理胚胎，並觀察馬 兜鈴酸對斑馬魚腎臟的影響，研究結果顯示，就外觀上腎臟並沒有明顯差 異 (圖八)，但比較於哺乳動物實驗中，如兔子、老鼠，都是以「餵食」 、 「靜 脈注射」 、 「腹腔注射」…等方式給予馬兜鈴酸，這些給予方式會使馬兜鈴 酸藉由消化系統、血液系統等方式進入體內，最後在經由排泄系統，將未 吸收的藥物排出體外。因為腎臟器官主要是負責將血液中的物質分為兩類： 一類為尚有利用價值的物質，如葡萄糖、氨基酸、或是一些重要的離子， 此類離子會經由腎臟的再吸收作用，再次被送回體內。另一類則為廢棄物 質，廢棄物質則會經由腎元中的絲球體由血液中濾出，形成尿液並收集於 膀胱，最後排出體外。馬兜鈴酸在哺乳動物中，就因為此過程，而使馬兜 鈴酸成為具有「腎毒性」的藥物。在斑馬魚的實驗中，則是使用浸泡處理 的方式，透過滲透與鰓攝取水中的馬兜鈴酸，應該也會造成斑馬魚腎臟病 29

變，但就研究結果顯示，此實驗處理在腎臟組織外觀上並無法發現腎臟異 常 (圖八 C-E)。 因此本研究利用 wt1b、cdh17、trpm7、slc20a1a 以及 slc12a1 這些腎 臟組織特異表現的基因來探討藥物對於腎臟各部位在發育時期之影響。這 些基因用以分別表示腎足細胞 (podocytes)、腎小管 (pronephric duct；PD)、 近直小管 (proximal straight tubule；PST)、近曲小管 (proximal convoluted tubule；PCT) 和近直小管後的 pronephric distal early tubule (DE) (Wingert and Davidson, 2008; Wingert et al., 2007) 等腎臟不同部位，來比較不同腎臟 部位在發育時期是否會受到影響，由實驗結果得知，以 doxorybicin 和 aristolochic acid 浸泡處理 24hpf 斑馬魚胚胎時，會造成 slc20a1a 基因表 現量隨著劑量的增加而減少 (圖七、十)，slc20a1a 是屬於 SLC (solute carrier) 20 的家族，主要功能是 sodium-phosphate (Na+/P+) cotransporters， 在骨骼、血管、副甲狀腺、小腸、腎臟具有生理功能，其中在老鼠腎臟在 近曲小管 (proximal convoluted tubule, PCT) 中扮演磷酸再吸收的角色 (Collins et al., 2004)，在 2006 年的文獻研究發現，在斑馬魚胚胎發育過程 中，當發育至 18 hpf 時期 slc20a1a 基因的表現位置在就會聚集在近曲小 管 (Nichane et al., 2006) 另一方面在藥物浸泡處理斑馬魚胚胎後，無論是使用 doxorubicin 或 是 aristolochic acid 都會發現心臟出現嚴重缺陷 (圖六、八)。至於腎臟部 份在外觀上則是沒有觀察到任何異常出現。在仔細觀察心臟的表現型，發 現以下幾個缺陷：(1) 心臟變小且變形，(2) 心室的搏動能力降低，(3) 心 房的搏動能力嚴重下降，(4) 心臟內腔空間縮小，以及心臟功能喪失後， 所併發的缺陷。例如：卵黃囊下方積血，圍心窩水腫而導致胚胎死亡。在 2007 年研究中也看到相同的結果，此研究認為馬兜鈴酸會影響般斑馬魚胚 胎發育時期心臟的缺陷，馬兜鈴酸會引起之發炎反應，發現馬兜鈴酸會誘 30

導發炎相關因子 IL-1β、SAA、COX-2 基因表現量上升，當加入 COX-2 抑 制劑 NS-398，發現會抑制 COX-2 與 SAA 的表現，而減緩發生心臟衰竭 的速度 (Huang et al., 2007)，由此研究可以解釋心臟發生缺陷的原因。 由過去文獻研究結果馬兜鈴酸除了會傷害心臟而引起發炎反應，導致 心臟細胞壞死，造成心臟衰竭外；我們實驗結果發現，馬兜鈴酸也會影響 腎臟發育，推測其可能的影響分子為，透過抑制 slc20a1a 基因的表現， 造成近曲小管細胞凋零，導致近曲小管的功能 phosphate (P+) 再吸收發生 異常，造成腎臟組織不可逆性的傷害。 本實驗所建立的腎臟螢光的轉殖斑馬魚系統，未來可提供快速、簡便、 便宜的篩選系統，用來進行藥物腎臟毒性之分析與評估。另一方面也可以 利用藥物處理建立的斑馬魚疾病模式，來探討藥物對於腎臟在發育時期， 腎臟病變的分子機轉。

31

伍、 未來展望 本實驗所建立的腎臟螢光的轉殖斑馬魚系統，未來可提供快速、簡便、 便宜的篩選系統，用來進行藥物腎臟毒性之分析。另外腎臟螢光的轉殖斑 馬魚可以利用 morpholino antisence oligonucleotides 將與腎臟囊腫 (pkd1 或 pkd2) 及腎絲球足細胞病變 (podocin) 相關基因表現降解，觀察腎臟發 育時期器官的變化及其機轉，另一方面也可以利用此斑馬魚系統，經過藥 物處理建立的疾病模式，來探討腎臟在發育時期，腎臟病變的分子機轉。

32

陸、 圖表

33

Table 1 primer sets for promoter construction

Primer

5’ to 3’ Sequences

Zwt1B-pro-F

GGAACAAGTTTGCTGGTTTCTGTTTCGGT

Zwt1B-pro-R

CCGCCTTGTATAAGTAATGTTTCTGTTT

Zwt1B-enh-F

TCTGTGTTACCGCCTTGCTCACCTCCCTG

Zwt1B-enh-R

ACACCGGCCCTCTAGGAACAAGTTTGCTG

Zpodocin-pro-F

CGGTCACCGGAAGTTTATAAGTATATGGG

Zpodocin-pro-R

AAGAATGTCGAGATGTTTCTGTTTCGGTCC

Zcdh17-pro-F

CCGCCTTGCTCACCTTTCTGTTTCGGTCC

Zcdh17-pro-R

CGGCCCTCTAGGAATTCTGTTTCGGTCCA

Zcdh17-RT-F

GCGTTGGACAGAGAGACAGTGGATC

Zcdh17-RT-R

AGACAACGCTGGGCTTGGCATCACA

Zslc12a1-RT-F

CAACTCTTCAGACGGACGCGG AGGAC

Z slc12a1-RT-R

CAACTCTTCAGACGGACG CGG AGGAC

Ztrpm7-RT-F

CACTGGACGTATGAATACACACGAGG

Ztrpm7-RT-R

CCGCCTTGCTCACCATTCTGTTTCGG

34

Table 2 statistic results of doxorubicin treatment

Total number

Survival rate %

Mutant number

Mutation rate %

Control

75

100 %

0

0%

40 ng/ml

75

100 %

20

26.7%

8.2%

80 ng/ml

75

100 %

43

57.3 %

19.2%

100 ng/ml

75

97.3 %

65

89.1%

17.4%

35

SD

Table 3 statistic results of aristolochic acid treatment

Total number

Survival rate %

Mutant number

Mutation rate %

SD

105 105 105 105

100 % 100 % 67.6% 51 %

0 60 66 105

0% 57.1% 62.9% 100%

13.7% 15.9% -

105 105 105 105

100 % 32.4% 0% 0%

0 80 105 105

0% 76.2% 100% 100%

7.8% -

48 hpf DMSO 1 μM AA 5 μM AA 10μM AA 72 hpf DMSO 1 μM AA 5 μM AA 10μM AA

36

% of drug treatment embryo mutant

120%

89.1%

100% 57.3%

80% 60% 26.7%

40% 20%

0.0%

0% 0

40

80

Doxorubicin dosage (ng/ml)

100

% of embryo mutants after AA‐treated

120% 48hpf 100%

100.0%

100.0%

72hpf

76.2%

80%

62.9%

57.1%

60% 40% 20%

0.0% 0% 0

1

5

10

Aristolochic acid dosage (μM)

圖九、不同濃度 Aristolochic acid 浸泡處理下斑馬魚突變率之分析 分別以 0、1、5 與 10 μM 浸泡胚胎，處理兩天(發育至 24hpf 至 72 hpf) 後， 統計圍心腔膨大情形之斑馬魚胚胎 (n=75)，結果顯示隨著濃度增加其變異的比 率分別在 48 hpf 為 0 %, 57.1 %, 62.9%,100%、 72 hpf 為 0 %, 76.2 %, 100%,100%， 突變比率明顯的與給予的藥物濃度成正相關。

45

Wingert et al., 2007

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