Equin Tumordiagnostik – anvendelige parametre

Diagnostik

Equin Tumordiagnostik

– anvendelige parametre

Som følge af hestepopulationens stigende alder bliver tumordiagnostik stadig vigtigere inden for hestepraksis. Laboratorietests bliver mere almindelige, som anvendelige og oftest non-invasive værktøjer for diagnose, prognose og som terapikontrol.

Af Charlotte Hoffmann-Timmol, DVM, Nordic-Baltic Manager, LABOKLIN GmbH & Co. KG, Steubenstrasse 4, DE-97688 Bad Kissingen, timmol@laboklin.com

Tumordiagnostik er en af de største diagnostiske udfordringer for hestedyrlægen, på trods af stadig bedre billeddiagnostik og øget faglig viden.

De ofte uspecifikke symptomer, som feber, anoreksi, ødemer, vægttab samt adfærdsændringer kan skyldes en række sygdomme. Her kan laboratoriediagnostik give vigtig information og være en hjælp til diagnostikken.

Diagnostik ved levertumor

Alfa-1-fetoprotein

Hvis mistanke om levertumor (for eksempel hepatocellulært karcinom) kan alfa-1-fetoprotein (AFP) bestemmesA. AFP er et glukoprotein, der dannes fysiologisk hos det perinatale føl (og indtil halvanden års alderen), og er derfor også fysiologisk forhøjet hos drægtige hopper. Hos voksne og ikke-drægtige heste kan en forøgelse være indikation på en levertumor: AFP dannes af de tumorlignende leverceller og findes derfor i forøgede koncentrationer i serum.

Alkalisk fosfatase (AP)

AP er mindre sensitiv ved diagnostik af levertumorer. Forøgede værdier ses hyppigere ved knoglemarvstumorer (for eksempel osteosarkom), som dog er yderst sjældne hos hestB,C .

Figur 1. Granulosacelletumor. På grund af den makrofollikulære tumorvækst, dannes hulrum (stjerne), der er med til at give den dets typiske udseende. Kilde: LABOKLIN.

Diagnostik ved granulosacelle tumor (GCT)

Anti-Müllersk hormon (AMH)

Granulosacelle tumor er en af de hyppigste tumorformer hos hopper. Diagnosen kan oftest entydigt stilles vha. AMH-testenD .

AMH er et glukoprotein, der påvirker den embryonale kønsdifferentiering, og hos de kønsmodne hopper dannes i granulosacellerne i follikulogenesen og hos hingste i sertolicellerne i testes. Derfor kan AMH-testen også benyttes til diagnostik af mange andre problemstillinger, foruden tumordiagnostik:

For diagnostik af granulosacelle tumor er AMH-testen, i forhold til både inhibin og testosteron, den mest sensitive testE .

Klinisk udviser disse hopper typisk acykli med lave progesteronværdier (<1 ng/ml) og unilateralt forstørret ovarie med et helt karakteristik sonografisk udseende (figur 1).

Det kontralaterale ovarie er oftest kraftigt formindsket i størrelse.

Differentialdiagnostisk er det ofte ikke muligt at stille diagnosen sonografisk ved andre ovariesygdomme, som ovarie-hæmatom, teratom eller cystadenom. Her kan AMH-testen hjælpe, da proteinet udelukkende dannes ved store mængder ensartede granulosaceller. Giver AMH-testen intet klart resultat, anbefales det at teste igen tre-fire måneder senere.

AMH kan også benyttes under drægtighed, da denne, modsat testosteron og inhibin, vedbliver at være konstant selv sidst i drægtighedenF .

Under den normale cyklus udviser AMH ingen signifikante udsving og dannes udelukkende i ovariet, modsat testosteron, der også produceres i binyrebarken. Hos ældre hopper (>20 år) begynder AMH-værdien dog at synke i takt med follikelreserverne.

Også hos hingste finder AMH-testen anvendelse. Til kryptorkisme-diagnostik er AMH-testen også de tidligere anvendte østronsulfat og testosteron overlegne. AMH er her en meget nyttig, aldersuafhængig biomarkør for testikulært vævG. Basal testosteron kan ligge lavt, og endog under referenceværdien for kryptorkide hingste, og kan derfor ikke benyttes som diagnostisk test alene, men udelukkende som en hcG-stimulationstest, hvor både basal og stimulationsværdi måles.

På grund af AMH’s lange halveringstid (halvanden-to dage) bør man tidligst bestemme AMH to uger post kastration, hvor serumkoncentrationen er sunket så meget, så den er diagnostisk valid.

Inden for disse to uger kan man benytte hcG-stimulationstesten, skulle det blive nødvendigt, da testosteron har en kort halveringstid på blot cirka en time.

Meget lave AMH-værdier hos intakte hingste kan indikere te-

Figur 2. A Sektionsfund hos en treårig islænderhoppe med multiple abdominale neoplasier. Hesten havde haft feber, epistaksis og nedsat almentilstand. Laboratorieprøver viste markant anæmi (erytrocytter 1.55 T/l, hæmatokrit 0.08 l/l, hæmaglobin 54 g/l) samt trombocytopeni (17 G/l). B Histologisk fandtes et lymfom med massiv infiltration af tumorceller (røde pile). Kilde: LABOKLIN.

stikeldegeneration eller være sæsonbetinget (efterår/vinter)H . Testikeldegeneration hos ældre hingste ses ofte, men her kan en lav AMH intet sige om hingstens fertilitet.

Derimod kan meget høje AMH-koncentrationer, sammenholdt med kliniske symptomer, være en indikator på en sertolicelletumor og bør derfor altid undersøges nærmere histopatologisk.

Diagnostik ved lymfom

Equin lymfom er den hyppigst forekommende ondartede tumorform hos hest og inddeles i følgende formerA: • Gastro-intestinal • Kutan • Mediastinal • Multicentrisk (figur 2)

Prøveudtagning for en histopatologisk diagnose (gold standard) er, afhænging af placering og sygdomsstadie, ofte ikke mulig. Her finder tumorproliferationsmarkøren thymidin kinase anvendelseB .

Thymidin kinase

I veterinær smådyrspraksis samt humant benyttes thymidin kinase til diagnostik, terapikontrol samt evaluering af prognose. Det er et cellulært enzym, der spiller en afgørende rolle for DNA-syntesen, og derved celledelingen, når thymidin inkorporeres i DNA. Dets koncentration i serum stiger, når celledelingshastigheden stiger.

Eftersom maligne sygdomme i det hæmatopoietiske og lymfatiske system (lymfom, leukæmi, multipelt myelom) ofte er meget proliferative, kan thymidin kinase bestemmes som en såkaldt proliferationsmarkørB .

Kraftige inflammationer kan dog også forårsage lavgradige stigninger i thymidin kinase, hvilket derfor må udelukkes som differential diagnose ved blandt andet at bestemme akut-fase-proteiner. Dog udelukker et negativt resultat ikke en underliggende tumorsygdom.

Atypiske lymfocytter

Ved lymfoproliferative neoplasier (figur 4A og B) (lymfom stadie V, lymfatisk leukæmi) kan atypiske lymfocytter findes i det perifere blodA. Oftest ses her leukocytose med lymfocytose eller neutrofili (ved myeloid leukæmi eller sekundær inflammation).

En cytologisk undersøgelse af lufttørrede, farvede blodudstrygninger vil allerede kunne give en indikation på et lymfom, såfremt denne diagnose mistænkes (figur 4C og D), hvis der findes neoplastiske celler.

Punktater fra bughule eller thorax samt finnålsaspirater fra forstørrede lymfeknuder er også velegnede til cytologiske undersøgelse.

Flowcytometri

For at kunne klassificere i B- eller T-celle lymfom og for at skelne mellem lymfoproliferativ og myeloproliferativ leukæmi må flowcytometri benyttesC. Denne såkaldte immunofenotypning detekterer med hjælp fra bestemte antistoffer antigener på cellen, så celler kan klassificeres som T-hjælper, cytotoksiske T-celler og B-celler (figur 3).

For flowcytometri kan følgende materiale anvendes: • EDTA fuldblod • Knoglemarv • Punktat fra thorax og abdomen • Finnålsaspirater fra lymfeknuderC .

Figur. 3. Immunofenotypning ved hjælp af flowcytometri fra EDTAblod fra en hest med lymfoproliferativ neoplasi (lymfom stadie V, lymfatisk leukæmi) med udspring i T-hjælperceller. Diagrammet viser lymfocytpopulationen i øverste kvadrant med CD4-antistoffer. Populationen er med 99.4 procent positiv for CD4 overfladeantigenet. Derfor klassificeres disse som T-hjælperceller (CD=Closter of Differentiation). Kilde: LABOKLIN.

Figur 4. A Histologiske snit fra en hest med mistanke om multicentrisk lymfom. B Snit fra lymfeknude med multifokale proliferationer af atypiske store neoplastiske rundceller med destruktion af organspecifikke strukturer. C, D Blodudstrygninger viste anisocytose, middelstore til store atypiske lymfocytter med ovale cellekerner med opløst kromatin. Dertil enkelte intranukleære vakuoler og cytoplasma-udløbere. Kilde: LABOKLIN.

Når diagnosen lymfom er stillet histologisk, kan lymfomatypning ske ved hjælp af immunhistokemiD .

Mistænkes lymfom bør der, foruden det store blodbillede, altid analyseres de klinisk kemiske parametre.

Heste med lymfom har ofte anæmi, trombocytopeni eller forhøjede akut-fase-proteiner (fibrinogen eller serum-amyloid A (SAA)D .

Yderligere laboratorie parametre

Akut-fase-proteiner

Akut-fase-proteiner, som serum-amyloid A (SAA) og fibrinogen, kan hjælpe med at estimere inflammationens sværhedsgrad samt vurdere resultat af terapienE .

Akut-fase-proteiner dannes som følge af en akut-fase-reaktion overfor en inflammation og er en uspecifik, systemisk reaktion på vævsskade forårsaget af infektion (bakteriel, viral eller parasitær), trauma eller neoplasiF. Som følge af frigivelse af inflammationsmediatorer, som proinflammatoriske cytokiner, stimuleres leveren, foruden lokale og systemiske påvirkninger, til syntese af akut-fase-proteiner i hepatocytterne. En meget hurtig (6-12 timer) og kraftig stigning (100-1000-fold) ses ved påvirkning, og et ligeså hurtigt fald (indenfor 12 timer) ses ved eliminering af skaden.

SAA er en yderst sensitiv markør for tidlig inflammation, der kan yde en vigtig hjælp for diagnose, prognose og monitoreringE .

Fibrinogen stiger noget langsommere (indenfor 24 timer) og ikke nær så kraftigt (1-2-fold) og når sin maksimale koncentration efter cirka 48 timer. Derudover kan den forblive høj op til et par uger, så den er derfor ikke så sensitiv som terapikontrol.

Serum-protein elektroforese

En yderligere, og meget billig, diagnostisk mulighed ved mistanke om tumor forekomst er også serum-protein elektroforesen. Monoklonale forandringer, ofte i beta- eller gammafraktionen,

Figur 5. Serum-protein elektroforese med monoklonal peak i betafraktionen. Denne hest viste en svær leukocytose, deriblandt flere atypiske lymfocytter i den perifere blodprøve, en høj SAA (85.15 μg/ml) og en thymidin kinase værdi på 19.3 U/l (reference <3 U/l). Kilde: LABOKLIN.

skyldes en overdreven produktion af et specielt immunglobulin sfa. en plasmacelle-klon og er hovedsageligt beskrevet ved lymfoproliferative sygdomme (figur 5)G .

Paraneoplastiske forandringer, såsom hypercalcæmi, kan også give yderligere diagnostisk indsigtH .

Konklusion

Laboratoriediagnostisk er der flere forskellige, sensitive biomarkører til rådighed, som alene eller i kombination kan anvendes til diagnosestilling, vurdering af prognose, som terapikontrol eller hjælpe til behandlingsbeslutning. 

Litteratur

A. Muños A, Riber C, Trigo P, Castjón F. Hematopoietic neoplasias in horses: Myeloproliferative and lymphoproliferative disorders. J Equine Sci 2010; 20(4): 59-72 B. Larsdotter S, Nostell K, von Euler H. Serum thymidine kinase activity in clinically healthy and diseased horses: A potential marker for lymphoma. Vet J 2015; 205(2): 313-316 C. Taintor J. Equine leukaemia. Equine Vet Educ 2012; 24(12): 604-609 D. Winter J, Kershaw O, Schmitz R, Gehlen H. Das equine leukämische Lymphom – eine seltene Unterart des equinen Lymphoms. Tierarztl Prax G 2014; 42(5): 311-317 E. Jacobsen S. Review of Equine Acute-Phase Proteins. Am Assoc Equine Prax 2007; 53: 230-235 F. Wirkowska-Pilaszewicz OD, Zmigrodzka M, Winnicka A, Miskiewicz A, Strzelec K,

Cywinska A. Serum amyloid A in equine health and disease. Equine Vet J 2019; 51(3), 293-298 G. Tothova C, Nagy O, Kovac G. Serum proteins and their diagnostic utility in veterinary medicine; A review. Veterinami Medicina 2016; 61(9): 475-496 H. Toribio RE. Disorders of Calcium and Phosphate Metabolism in Horses. Vet Clin

North America – Equine Pract 2011; 27(1): 129-147 I. Beeler-Marfisi J, Arroyo L, Caswell JL, Delay J, Bienzle D. Equine primary liver tumors: A case series and review of the literature. J Vet Diagn investing 2010; 22(2): 174-183 J. Bush JM, Fredrickson RL, Ehrhart EJ. Equine osteosarcoma; A series of 8 cases. Vet

Path 2007; 44(2): 247-249 K Livesay MA, Wilkie IW. Focal and multifocal osteosarcoma in two foals. Equine

Vet J 1986; 18(5): 407-410 L Ball BA, Almeida J, Conley AJ. Determination of serum anti-Müllerian hormone concentrations for the diagnosis of granulosa-cell tumours in mares. Equine Vet J 2013; 45(2): 199-203 M. Almeida J, Ball BA, Conley AJ, Place NJ, Liu IKM, Scholtz EL, Mathewson L, Stanley

SD, Moeller BC. Biological and clinical significance of anti-Müllerian hormone determination in blood serum of the mare. Theriogenol 2011; 76(8): 1393-1403 N. Silberzahn P, Zwain I, Martin B. Concentration increase of unbound testosterone in plasma of the mare throughout pregnancy. Endocrinol 1984; 115(1): 416-419 O. Claes A, Ball BA, Almeida J, Corbin CJ, Conley AJ. Serum anti-Müllerian hormone concentrations in stallions: Developmental changes, seasonal variation, and differences between intact stallions, cryptorchid stallions, and geldings. Theriogenol 2013; 79(9): 1229-1235 P. Oristaglio Turner RM. Pathogenesis, Diagnosis, and Management of Testicular

Degeneration in Stallions. Clin Techn Equine Pract 2007; 6(4): 278-284

Parameter

Thymidin kinase

Alfa-1-fetoprotein

Alkalisk fosfatase (AP)

Anti-Müllersk hormon (AMH)

Serum-amyloid-A (SAA)

Fibrinogen

Serum-protein-elektroforese

Indikation

Lymfoproliferativ neoplasi

Levertumor

Prøvemateriale

Serum, sendt kølet

Serum

Leverparameter, knoglemarv Serum

Granulosacelletumor (GCT), Kryptorkisme Serum, sendt kølet

Inflammation Serum

Inflammation

Tumor mistanke Inflammation Infektion Citratplasma

Serum

Cytologi Anæmi, leukæmi, mistanke om neoplasi

Immunofenotypning Leukæmi- og lymfom-klassificering

Immunohistologi

Histopatologi Lymfomtypning

Tumoridentificering

Tabel 1. Oversigt over de vigtigste parametre i tumordiagnostikken. Blodudstrygninger (lufttørret), thorax- eller abdominal punktat, lymfeknudeaspirat

EDTA-blod, lymfeknudeaspirat i suspension, knoglemarv, thorax- eller abdominal punktat

Biopsier

Biopsier / tumor