Antioxidante by economiasaavedra

IES SAAVEDRA FAJARDO

2018-2019

Actividad antioxidante en distintos frutos Estudio de sus efectos ALUMNAS:

Lola Campillo Carla Carrasco Marta Saura

TUTORES:

Mª Asunción Amorós Mª Soledad Almansa Mª José Urios

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INDICE

Resumen o Abstract ....................................................................................... 3 Introducción ................................................................................................... 4 Antecedentes .................................................................................................. 5 1. ¿Qué es un antioxidante?.................... .................................................. 5 2. El papel de los antioxidantes en la salud .............................................. 6 3. Antioxidantes a nivel nutricional .......................................................... 7 4. Actividad antioxidante en distintas frutas ............................................. 8 Hipótesis del trabajo y objetivos de la investigación ..................................... 10 Materiales y métodos ..................................................................................... 11 1. Material vegetal..................................................................................... 11 2. Sólidos solubles totales, acidez total, pH y vitamina C ....................... 11 3. Fenoles totales y actividad antioxidante total ....................................... 12 Resultados ...................................................................................................... 16 Conclusiones .................................................................................................. 20 Agradecimientos ............................................................................................ 21 Bibliografía y webgrafía ................................................................................ 22 Anexo ............................................................................................................. 23

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RESUMEN

Los antioxidantes son una parte fundamental de nuestra dieta, pues ayudan a contrarrestar la acción negativa de los radicales libres y traen consigo beneficios para nuestra salud. Conocer los antioxidantes, cómo actúan y dónde se encuentran es fundamental para lograr obtener beneficios a través de la alimentación. El objetivo principal de nuestro trabajo fue conocer cuál de las frutas estudiadas (arándano, mora negra, grosella, frambuesa, uva tinta, manzana, kaki inmaduro y kaki sobremaduro) posee una mayor actividad antioxidante. Para ello, calculamos los sólidos solubles totales, acidez total, pH, vitamina C, fenoles totales y actividad antioxidante total de dichas frutas. Los resultados más significativos fueron: la mayor acidez la tiene la grosella, mientras que el mayor pH lo presentan ambos kakis. Los ºBrix más elevados pertenecen a la uva tinta, y el índice de madurez y la vitamina C es ampliamente elevada en el kaki inmaduro. Finalmente, la mora presenta la mayor actividad antioxidante y fenoles totales. Por lo que concluimos, en base a estos resultados, que las moras entre todas las frutas analizadas, presentan la mayor actividad antioxidante seguidas de los arándanos y las frambuesas. Los análisis también nos indican que la manzana presenta la menor actividad antioxidante, seguida de los kakis maduros. 

ABSTRACT

Antioxidants are a fundamental part of our diet, as they help to counteract the negative action of free radicals and bring benefits to our health. Knowing antioxidants, how they work and where they are found is fundamental in order to obtain benefits through our diet. The main objective of our work was to find out which of the fruits studied (blueberry, blackberry, currant, raspberry, red grape, apple, green persimmon and ripe persimmon) had the highest antioxidant activity. To this end, we have calculated the total soluble solids, total acidity, pH, vitamin C, total phenols and total antioxidant activity of these fruits. The most significant results were: the greater acidity is present in the currant, while the greater pH is presented in both kakis. The highest ºBrix belongs to the grape, and the index of maturity and vitamin C is widely high in the green persimmon. Finally, the blackberry has the highest antioxidant activity and total phenols. Based on the results, we conclude, that among all the fruits analyzed blackberries have the highest antioxidant activity followed by blueberries and raspberries. These analyses also indicate that apples have the lowest antioxidant activity, followed by ripe kakis.

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INTRODUCCIÓN

Los antioxidantes son una parte fundamental de nuestra dieta, pues ayudan a contrarrestar la acción negativa de los radicales libres y traen consigo beneficios para nuestra salud. Conocer los antioxidantes, cómo actúan y dónde se encuentran es fundamental para lograr obtener beneficios a través de la alimentación. La curiosidad de conocer el impacto de la nutrición en nuestro organismo nos llevó a comenzar este trabajo, mediante la búsqueda de información y pruebas experimentales. En la Universidad Miguel Hernández obtuvimos, de forma adecuada, la información sobre cómo actúan realmente estas sustancias, y en qué proporción se encuentran en las frutas seleccionadas. Encontramos diferentes clases de antioxidantes que se pueden clasificar en antioxidantes naturales y antioxidantes sintéticos. Gracias a ellos, nuestro organismo es capaz de actuar contra los radicales libres que forman el estrés oxidativo el cual está asociado a diferentes patologías como pueden ser el cáncer, enfermedades neurodegenerativas o enfermedades inflamatorias. Los antioxidantes buscan y eliminan las especies reactivas oxigenadas (ROS) mediante diferentes procesos de oxidación natural. Estos los podemos encontrar de forma natural en frutas y verduras, además, las industrias alimentarias han ido añadiéndolos a los alimentos debido a que mejoran su calidad. Para esta investigación, se han llevado a cabo diferentes métodos experimentales para averiguar la cantidad de antioxidantes y cómo actúan en las diferentes frutas seleccionadas. En cada método se han utilizado diferentes tipos de reactivos para llevar a cabo la experimentación.

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ANTECEDENTES

1. ¿Qué es un antioxidante? 1.1 Definición. Se nombra como antioxidante a cualquier sustancia que reduce la oxidación de otra sustancia más oxidada que ella. Son, por lo tanto, sustancias capaces de invertir en una cierta medida el deterioro oxidativo de otra (Halliwell y Gutteridge, 1995). Los antioxidantes a su vez reducen el daño producido por los radicales libres, es decir, sustancias que han perdido un electrón y tienden a quitárselo a otra, lo que las deja inestables (Halliwell, 1990). Por esto los antioxidantes evitan que los radicales libres dejen a otras sustancias inestables. Los antioxidantes están presentes naturalmente en frutas y verduras en forma de vitaminas y compuestos polifenólicos, entre otros compuestos (Serrano y col., 2011). 1.2 Tipos de antioxidantes. Las clases de antioxidantes son muy variadas, principalmente se clasifican en antioxidantes naturales y sintéticos (Carocho y Ferreira, 2013). Dentro de los naturales se clasifican en: enzimáticos y no enzimáticos (Esquema 1). Pueden también ser clasificados por su acción defensora frente a radicales libres. Los antioxidantes enzimáticos se dividen en distintos tipos de defensas enzimáticas, la primaria y la secundaria. Los antioxidantes enzimáticos primarios se caracterizan por actuar directamente en contra de los radicales libres, los secundarios sin embargo se caracterizan por no actuar directamente en contra de los radicales libres (Carocho y Ferreira, 2013). Los antioxidantes no enzimáticos tienen una mayor clasificación. Las vitaminas antioxidantes, de las cuales las más conocidas son la vitamina A, la vitamina E, la vitamina C y la vitamina K. Carotenoides y compuestos nitrogenados no proteicos. Compuestos fenólicos, los flavonoides, como las antocianinas, son un grupo de compuestos antioxidantes que actúan gracias a unos hidróxidos fenólicos que están unidos a ellos y además de sus propiedades antioxidantes propias activan enzimas antioxidantes. Los ácidos fenólicos, los cuales tienen actividad antioxidante como quelantes. Otros cofactores de enzimas como pueden ser minerales como el zinc y el selenio.

Esquema 1: Tipos de antioxidantes (Carocho y Ferreira, 2013). 5

Los antioxidantes sintéticos son compuestos principalmente creados por su utilidad en la industria alimenticia, al ser de origen sintético son por tanto antioxidantes químicos. Son antioxidantes sintéticos el hidroxibutilanisol (BHA) y el butilhidroxitolueno (BHT). Está demostrado que su consumo no es perjudicial para la salud según la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) (Carocho y Ferreira, 2013). Ciertos antioxidantes son producidos por nuestro cuerpo para contrarrestar la acción de los radicales libres obtenidos mediante procesos moleculares como pueden ser la respiración celular, por ejemplo, la vitamina A (retinol) se produce en nuestro hígado y presenta actividad antioxidante; el ácido úrico, producido en los riñones se reabsorbe al 90% y se sabe que tiene una potente actividad antioxidante. Sin embargo otros muchos antioxidantes han de estar presentes en nuestra dieta para mantener una cantidad baja de radicales libres en nuestro cuerpo. Un ejemplo de antioxidante que ha de ser suministrada por la dieta es la vitamina C (Carocho y Ferreira, 2013). 1.3 Usos de los antioxidantes. La industria de los alimentos usa principalmente antioxidantes sintéticos para evitar que la comida pierda sus propiedades nutritivas y reducir la oxidación de sus componentes, como pueden ser los ácidos grasos, a los cuales se les implantan ciertos aditivos, pues se oxidan con gran facilidad. En el campo de la medicina los antioxidantes se emplean como suplementos en tratamientos y como componentes de ciertas medicaciones para el Alzheimer, Parkinson y demás enfermedades neurodegenerativas. Los antioxidantes son ingeridos naturalmente en una dieta equilibrada gracias a estar presentes en frutas y verduras frescas. Las especias y hierbas aromáticas, también son fuentes naturales de antioxidantes y han sido utilizadas a lo largo de la historia para evitar el deterioro de otros alimentos, porque confieren sus propiedades antioxidantes al alimento al que acompañan (Sindhi y col., 2013). Los antioxidantes que se obtienen a través de la nutrición, por ejemplo la vitamina C y vitamina E tienen un gran poder inmunoestimulante, anticancerígeno, antiinflamatorio y son de gran utilidad en la protección de la integridad estructural de los tejidos, por lo que dichos antioxidante son usados como tratamientos de enfermedades además de mantener el sabor, la textura y el color del alimento al que pertenecen. En los últimos años se han creado extractos de antioxidantes naturales para reemplazar a los antioxidantes sintéticos. Estos extractos son considerablemente más baratos y además al ser naturales y estar presentes en frutas y verduras que ingerimos diariamente está comprobado que no perjudican a nuestra salud (Sindhi y col., 2013). 2. El papel de los antioxidantes en la salud. 2.1 ¿Qué es el estrés oxidativo? Se define como estrés oxidativo a la producción excesiva de radicales libres, es decir, especies reactivas oxigenadas (ROS), nitrogenadas (RNS) o sulfuradas (RSS), lo que resulta en un desequilibrio entre estas y las defensas antioxidantes presentes en nuestro organismo. La falta de equilibrio entre especies radicales libres y defensas antioxidantes del organismo produce una alteración del balance redox celular (Pisoschi y Pop, 2015). El estrés oxidativo nace debido a la reducción de la defensa antioxidante del organismo, por lo que se producen ataques oxidativos que influyen directamente sobre biomoléculas importantes, como son los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos. A su vez puede desencadenar mutaciones que se expresan en los genes de la célula y por tanto la modifican, lo que puede llevar a la peroxidación lipídica, degradación de proteínas y la muerte celular. 2.2 Relación de diferentes enfermedades con el estrés oxidativo. El estrés oxidativo, y por tanto los radicales libres, está asociado a varias patologías como pueden ser enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, degeneración de tejidos como las cataratas, diabetes y envejecimiento (Pisoschi y Pop, 2015).

A. Enfermedades neurodegenerativas El estrés oxidativo está considerado como una causa de las enfermedades neurodegenerativas. El estrés oxidativo produce la lipoperoxidación, es decir, la degradación oxidativa de los lípidos. La lipoperoxidación resulta en un agotamiento de los fosfolípidos presentes en una membrana celular. Este proceso es conocido por ser la causa más común que da lugar a enfermedades neurodegenerativas. La peroxidación lipídica o lipoperoxidación y la reducción de la actividad de enzimas antioxidantes están altamente relacionadas con la formación de placas seniles y ovillos neurofibrilares, característicos del Alzheimer, además de que los pacientes con esta patología presentan ciertos rastros de estrés oxidativo en el cerebro. El estrés oxidativo también está presente en enfermedades como el Parkinson. El Parkinson es una enfermedad que produce la pérdida gradual de neuronas relacionadas con la acción de la dopamina. En esta enfermedad la concentración de ácidos grasos poliinsaturados en la sustancia negra se ve reducida a la misma vez que se produce un aumento en los indicadores de peroxidación lipídica además de presentar rastros de estrés oxidativo. B. Enfermedades inflamatorias Se ha comprobado que hay una correlación entre las inflamaciones crónicas y el estrés oxidativo. El desequilibrio entre especies oxidantes y antioxidantes es un promotor de daños oxidativos. La defensa antioxidante a su vez está relacionada con el asma y la rinitis alérgica. Los radicales hidroxílicos pueden producir alteraciones en las mucosas nasales y de las vías respiratorias. También puede iniciar a su vez alergias. C. Cáncer El estrés oxidativo es producido por un desequilibrio entre antioxidantes y oxidantes favoreciendo a los oxidantes. Produce entre otras cosas daño a las biomoléculas más esenciales para la vida, como pueden ser proteínas, ADN, fosfolípidos. El daño producido en estas moléculas entre otras cosas puede dar lugar a la muerte celular. Las células que presentan cáncer o un fenotipo canceroso tienen mayor nivel de especies de oxígeno reactivo que las células sanas, además ha sido comprobado que las especies de oxígeno reactivo son responsables de la manutención del fenotipo del cáncer. 2.3 Cómo reducen los antioxidantes el estrés oxidativo. Los sistemas antioxidantes actúan buscando y eliminando las especies de oxígeno reactivo. Actúan en diferentes pasos del proceso de oxidación natural. El paso de propagación de la peroxidación comienza por la adición de oxígeno a radicales centrados en carbono. La propagación de estas oxidaciones ocurre de forma lenta y se representa mediante la transferencia de un átomo de hidrógeno. Los antioxidantes pueden reaccionar agotando o reduciendo la concentración de oxígeno molecular. Hay antioxidantes que rompen cadenas (antioxidantes primarios), antioxidantes que buscan oxígenos singletes (antioxidantes secundarios) y enzimas antioxidantes que pueden catalizar la síntesis o regeneración de antioxidantes no enzimáticos. 3. Antioxidantes a nivel nutricional. 3.1 Dónde se encuentran naturalmente los antioxidantes. Los antioxidantes no están presentes en todo tipo de alimentos o suplementos que tomamos, tanto los antioxidantes sintéticos como los naturales, ricos en aceites y grasas que ayudan a proteger el alimento contra la oxidación, son utilizados diariamente en comidas y aplicados en la medicina. Se ha demostrado que varios tipos de hierbas y especias como Eugenia caryophyllus o Elettaria cardamomum presentan una gran actividad antioxidante. Aunque estas no tengan un papel protagonista en nuestro 7

plato de comida, siguen teniendo una gran importancia en nuestra toma de antioxidantes diarios sobre todo en aquellas dietas donde las hierbas y especias se usan con regularidad. Se han llevado a cabo estudios para analizar el potencial antioxidante de una gran variedad de verduras y frutas como las patatas, las espinacas, los tomates, las legumbres, fresas, cerezas, ciruelas y aceitunas. Además de esto el té verde y el té negro han sido estudiados durante años como objeto de curiosidad sobre sus propiedades antioxidantes debido a que el total de su peso en seco, el 30% se basa en compuestos fenólicos como los flavonoles, flavandioles, flavonoides y ácidos fenólicos. Los suplementos alimenticios pueden llegar a contener una serie de antioxidantes como pueden ser la vitamina A (retinoides y carotenoides) o las vitaminas C y E (tocoferoles). Estudios clínicos han demostrado que una dieta rica en frutas, verduras, productos integrales, legumbres y ácidos grasos omega-3 nos beneficia ya que puede funcionar como agente preventivo ante la aparición de enfermedades en nuestro organismo y además proporcionarnos una gran cantidad de compuestos antioxidantes beneficiarios. 3.2 Antioxidantes en la industria alimentaria. A día de hoy las personas buscan estar en forma, por lo tanto, intentan mantener una dieta más sana. Los antioxidantes han sido utilizados como protectores de la salud para que la calidad de los alimentos sea mayor y dichos alimentos sean aprobados por los consumidores. Estos han sido añadidos como aditivos a grasas y aceites; y como tratamiento en industrias de alimentos para evitar y prevenir el desperdicio de comida. Antioxidantes nutricionales, como la vitamina C, tienen importantes efectos inmunoestimulantes, antiinflamatorios y anticancerígenos. Estos protegen la integridad estructural de tejidos además de poseer factores antitrombóticos. La prevención o el tratamiento del cáncer, problemas cardiovasculares, infecciones, inflamaciones y demás enfermedades derivadas de la diabetes, podrían mejorar si suplementamos nuestra dieta con altas dosis de antioxidantes nutricionales. Los antioxidantes tienen un papel vital tanto en la alimentación como en el funcionamiento del cuerpo humano. En la alimentación, los antioxidantes nutricionales ayudan a mantener el sabor, la textura y el color del producto durante su almacenamiento, evitando de esta manera la peroxidación lipídica. Algunos antioxidantes como la vitamina C o el té, han sido comercializados para su uso como alternativos a antioxidantes sintéticos presentes en alimentos. En el cuerpo humano, se puede evitar el daño oxidativo gracias a antioxidantes endógenos como los radicales hidroxilos (OH一). Tanto la acción de aminoácidos como la contribución de péptidos y proteínas ayudan a la capacidad antioxidante de algunas células a mantener el buen estado y la salud de tejidos biológicos. Con el paso del tiempo, la absorción de antioxidantes disminuye. Esto provoca un gran cambio en el equilibrio antioxidante del cuerpo humano que, acompañado de otros factores externos como la contaminación, la fatiga, la toma excesiva de alcohol, tabaco, drogas y alimentos altos en grasas, produce el envejecimiento. 4. Actividad antioxidante en distintas frutas. 4.1 Antioxidantes presentes en la fruta. Como se ha dicho anteriormente, las frutas tienen una gran cantidad de antioxidantes, como pueden ser los flavonoides, y antioxidantes suplementarios que ayudan a combatir contra diferentes tipos de cáncer y enfermedades cardiovasculares. Los antioxidantes naturales como las vitaminas o los polifenoles, son considerados como los principales responsables de los beneficios que las frutas pueden aportarnos (Bartosz, 1997; Leja y col. 2003). 8

Además, se pueden encontrar varias categorías de antioxidantes en las frutas. Un ejemplo, serían los antioxidantes fitoquímicos y compuestos fenólicos, los cuales contienen una gran capacidad antioxidante y una alta disposición para eliminar radicales libres. Los antioxidantes se pueden clasificar en tres grandes categorías, todas ellas presentes en la fruta. La primera categoría se basaría en la primera línea de defensa donde encontraríamos antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y minerales como el selenio (Se), cobre (Cu), zinc (Zn), etc. A continuación, encontraríamos los antioxidantes de segunda línea de defensa como la vitamina C, la albúmina, la vitamina E, los carotenoides, los flavonoides, etc. Finalmente, los antioxidantes de tercera línea de defensa contienen un grupo de enzimas para reparar daños en el ADN, las proteínas y lípidos y peróxidos oxidados. Estas enzimas son por ejemplo: la lipasa, la proteasa o las enzimas reparadoras de ADN. 4.2 Utilidad de antioxidantes de las frutas. Los antioxidantes presentes en la fruta son de gran utilidad en nuestro organismo ya que nos ayudan a combatir graves enfermedades y daños para nuestra salud. En las frutas encontramos antioxidantes específicos que pueden combatir diferentes elementos que otros no pueden. Uno de estos sería la vitamina E. Esta se encarga específicamente de la protección de la capa externa de grasa de las células, sin embargo, no es la responsable de estabilizar el material genético de la célula. Como ya ha sido comentado, los antioxidantes reducen los efectos nocivos de los radicales libres. Se han realizado estudios en los cuales se demuestra una gran disminución de lesiones en atletas solamente con la adición de un buen suplemento antioxidante en la dieta de dichos deportistas. Uno de los órganos más vulnerables a los daños causados por el estrés oxidativo es el cerebro debido a su alta tasa metabólica y niveles elevados de lípidos poliinsaturados. Consecuentemente, los antioxidantes están siendo utilizados en la medicina para tratar diferentes formas de enfermedades y lesiones cerebrales. Además, se están investigando como posibles tratamientos contra enfermedades degenerativas como el Alzheimer, el Parkinson y la Esclerosis Lateral Amiotrófica, y como una manera de prevención de la sordera. Los antioxidantes fenólicos naturales actúan como agentes reductores para acabar con la reacción en cadena de radicales libres eliminando a estos mismos, la absorción de la luz en la región ultravioleta y los metales de transición quelados. De esta manera inhiben las reacciones de oxidación al oxidarse ellos mismos y evitan la aparición de malos olores y sabores. Es esencial mantener los sistemas de varios antioxidantes nutricionalmente, como pueden ser el selenio, la vitamina C y la vitamina E, ya que tienen importantes efectos inmunoestimulantes, antiinflamatorios y anticancerígenos. Asimismo, tienen un importante papel en la protección de la integridad estructural de algunos tejidos y en diversas acciones antitrombóticas. De esta manera, debido a los grandes usos y aplicaciones de los antioxidantes presentes en frutas, están siendo ampliamente estudiados en farmacología orientándolos en tratamientos contra el cáncer, accidentes cerebrovasculares, enfermedades neurodegenerativas y varios problemas en relación con la diabetes. A causa de todo lo mencionado previamente, las personas son cada día más conscientes de los beneficios que aportan las frutas a nuestra salud, por eso toman suplementos antioxidantes directamente de frutas y verduras frescas.

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HIPÓTESIS DEL TRABAJO Y OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN.

Mediante procesos tan simples como la respiración, los seres humanos generamos continuamente compuestos perjudiciales y dañinos para nuestro organismo. Estos compuestos reciben el nombre de radicales libres. Los radicales libres dañan las moléculas de nuestro cuerpo uniéndose a ellas y oxidándolas, lo que produce un aumento del envejecimiento y las enfermedades. Para contrarrestar la acción perjudicial de los radicales libres, existen una serie de compuestos químicos naturales, son los compuestos antioxidantes. Estos neutralizan y disminuyen su acción negativa en nuestro cuerpo. Los seres humanos sintetizamos estos compuestos de forma natural, sin embargo, no fabricamos los suficientes compuestos antioxidantes, por lo que debemos añadir más para complementar nuestra alimentación. Podemos encontrar los antioxidantes en frutas y verduras que, dependiendo de distintos compuestos presentes en ellas, presentarán un mayor o menor poder antioxidante. Nuestro principal objetivo es analizar la actividad antioxidante de diferentes tipos de frutas, lo cual se realizará a través de diferentes procedimientos de laboratorio, con la finalidad de conocer cuál de las frutas estudiadas posee una mayor actividad antioxidante y, por tanto, será más beneficiosa para nuestra salud. Se conoce que la actividad antioxidante será diferente en los distintos frutos estudiados debido a diversos factores como: la acidez total, el pH, la Vitamina C o los compuestos fenólicos totales. Dada la información presente en los antecedentes será más beneficiosa para la salud la fruta con mayor actividad antioxidante por la relación de estos con nuestra salud. Además, características de la fruta en cuestión, como lo ácidas que son, suponemos que tendrá relación con lo antioxidante que sea dicha fruta.

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MATERIALES Y MÉTODOS

1. Material vegetal: Los materiales vegetales utilizados en este trabajo han sido los siguientes frutos: arándanos, moras negras, uvas tintas, manzanas, grosellas, frambuesas, kaki inmaduro y kaki sobremaduro.

2. Sólidos solubles totales, acidez total, pH y Vitamina C Todas las muestras se realizaron por triplicado. Los sólidos solubles totales son todos aquellos compuestos sólidos que son solubles, principalmente azúcares reductores. Para calcular este parámetro se debía diluir 1g de fruto en 5 ml de agua destilada y triturarlo en el politrón Ika Labortechnik T24 basic (Foto 1). A continuación, cogíamos unas gotas de esa disolución y las vertíamos en el refractómetro marca ATAGO (Foto 2) el cual nos mostraba cuales eran los sólidos solubles totales que se medían en ºBrix de la muestra.

Foto 1: Politrón Ika Labortechnik T24 basic (Elaboración propia)

Foto 2: Refractómetro marca ATAGO (Elaboración propia) Para valorar la acidez, añadimos a esa disolución 30 ml de agua destilada y la llevamos al valorador TitraLab AT-1000 Series de la marca Hach (Foto 3), que tras valorar la muestra con NaOH 1N hasta un pH de 8.1 nos mostraba la acidez total de la muestra. Este valorador también daba el pH de cada muestra.

Foto 3: Valorador TitraLab AT-1000, Hach (Elaboración propia) Para la cuantificación de la vitamina C, diluimos 1 g de fruto en 10 ml de agua destilada y se trituró la nueva muestra en el politrón citado anteriormente. A continuación le añadimos otros 25 ml de agua destilada y lo volvimos a llevar al valorador, que nos mostró el contenido de vitamina C por valoración con yodo.

3. Fenoles totales y Actividad antioxidante total La extracción de fenoles y la actividad antioxidante total se realizó diluyendo 1 g de fruto en 6 ml de tampón fosfato. Posteriormente se trituró la muestra con el politrón citado anteriormente a 4500 rpm durante 60 segundos. Después, pasamos el extracto a un tubo de centrífuga y pesamos los tubos para su reparto equilibrado en la centrífuga P Selecta Medifriger (Foto 4) donde la muestra se centrifugó a 4500 rpm durante 20 minutos a 4ºC. Al finalizar el centrifugado, tomamos el sobrenadante de los tubos para congelarlo para su uso posterior (Foto 5).

Foto 4: Centrífuga P Selecta Medifriger (Elaboración propia).

Foto 5: Muestra de mora negra centrifugada (Elaboración propia). 12

Para la cuantificación de los fenoles totales se utilizó el método de Singleton y col. (1999). Para ello, se prepararon unos tubos de ensayo de 15 ml por duplicado para cada muestra con: 2.5 ml de reactivo Follin-Ciocalteu al 10%, 50 µL de muestra (antes, agitamos el eppendorf, que es el lugar donde se encontraba la muestra) y 450 μL de tampón fosfato 50 mM a pH 7´8. Seguidamente, agitamos brevemente con el agitador de tubos (Foto 6) y añadimos 2.5 mL de Na 2CO3 (75 g/L) que volvimos a agitar durante 10 segundos.

Foto 6: Agitador de tubos (Elaboración propia). Pudimos observar como el color de las muestras cambiaba a diferentes tonos de verdes (Foto 7).

Foto 7: Muestras que han tomado una tonalidad verdosa (Elaboración propia). Preparamos también dos blancos con un procedimiento similar pero esta vez con 500 μL de tampón fosfato (Foto 8).

Foto 8: Blancos (Elaboración propia). Introducimos todos los tubos, incluidos los dos blancos, en un baño María (Foto 9) a 50ºC durante 5 minutos. Al sacar los tubos volvimos a observar que las preparaciones habían vuelto a cambiar de color, pero ahora adquiriendo una tonalidad azul oscuro (Foto 10).

Foto 9: Baño María P Selecta Termofin (Elaboración propia).

Foto 10: Muestras que han adquirido un color azul oscuro (Elaboración propia).

Luego, medimos la absorbancia en el espectrofotómetro UNICAM HEƛIOS α (Foto 11) a 760 nm en cubetas de 2.5 mL.

Foto 11: Espectrofotómetro UNICAM HEƛIOS (Elaboración propia). Para la cuantificación de la actividad antioxidante total se siguió el método de Arnao y col. (2001). Primeramente se prepararon todos los reactivos de medida: El tampón glicina 50 mM: 0.938 g de glicina diluida en 250 ml de agua Milli-Q, y se ajusta el pH a 4,5 con HCl muy diluido: -La Peroxidasa 10 μM: 0.0044 g diluidos en 10 mL de agua Milli-Q (tiene caducidad de una semana, por lo que se debe conservar en una nevera y en un envase opaco). -El ABTS 10 mM: 0.055 g diluidos 10 mL de agua Milli-Q (este compuesto también tiene una caducidad de una semana y hay que conservarlo en una nevera y en un envase opaco); H2O2 1mM de una disolución de 100 μL de esta a 900 μL de agua Milli-Q que llevaba una semana en la nevera. De esta disolución ya preparada, tomamos 28 μL y los llevamos a 25 mL con agua Milli-Q. Esta última disolución se tiene que preparar a diario, es el reactivo a utilizar en la medida. Se conserva durante todo el día en una nevera o en una bandeja con hielo. Después de preparar todos los reactivos procedimos a cuantificar la actividad antioxidante de todas las muestras. Para esta cuantificación, volvimos a utilizar el espectrofotómetro citado anteriormente. Procuramos que hubiese una iluminación del puesto no excesiva ya que los reactivos son fotosensibles. Pusimos el espectrofotómetro en autocero con tampón glicina en las cubetas. A continuación, preparamos otra cubeta de espectrofotometría de 2.5mL y añadimos los siguientes reactivos: 20 μL de ABTS, 20 μL de H 2O2 y 15 μL de peroxidasa (todos ellos estaban en una bandeja con hielo), después agitamos golpeando suavemente la base de la cubeta en la poyata del laboratorio. Pudimos observar como las muestras se coloreaban de un tono verde oscuro cada vez que golpeábamos la cubeta. Seguidamente, añadimos 925 μL de tampón glicina (reactivo a temperatura ambiente), lo introducimos en el espectrofotómetro y esperamos unos segundos hasta que llegase a la absorbancia máxima (730 nm) y anotamos ese valor, que aproximadamente era 0,9. Antes de coger la muestra, agitamos el eppendorf. Finalmente añadimos 25 μL de muestra en la cubeta, agitamos y volvimos a introducir la cubeta e hicimos otra lectura a los 90 segundos y anotamos todos los valores dados. Hicimos dos medidas de cada muestra, si diferían en más de un 20% había que repetir, pero no se dio el caso.

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RESULTADOS

A partir de los procedimientos realizados, que han sido previamente nombrados en el apartado Materiales y métodos, hemos obtenido los resultados de sólidos solubles totales, acidez total, pH, vitamina C, fenoles totales y actividad antioxidante total. En la figura 1 podemos observar que el fruto más ácido ha sido la grosella seguida por la frambuesa, y los frutos menos ácidos han sido el kaki tanto inmaduro como sobremaduro, seguido por la manzana y la uva tinta.

Acidez 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 Acidez

0,50 0,00

Figura 1: Acidez en g /100g pf de los frutos. (Elaboración propia).

Estos datos se corresponden perfectamente con los del pH de sus zumos que se puede observar en la figura 2. Efectivamente la grosella y la frambuesa presentan el pH menor seguidos por arándanos y moras negras, mientras que los pH más altos, casi neutros, los presentan los kakis.

pH 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00

1,00 0,00

Figura 2: pH del zumo de los frutos. (Elaboración propia).

En cuanto al dulzor de los frutos, representado en la figura 3 como ºBrix del zumo de los frutos, se puede observar que la uva tinta presenta el máximo dulzor, con casi 18 ºBrix seguido por los arándanos que presentan más de 14 ºBrix, seguidos por el kaki y la manzana. Las frambuesas son los frutos con menor dulzor seguidas por las moras negras.

ºBrix 20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00

ºBrix

Figura 3: ºBrix del zumo de los frutos. (Elaboración propia). La relación de ºBrix/acidez nos indica el Índice de Madurez (IM) de los frutos, con cuyo valor obtenemos una idea bastante clara de lo maduro que está el fruto, puesto que normalmente al madurar un fruto se incrementan los azúcares y disminuye la acidez. De esta forma, al madurar un fruto tendrá un IM más alto, y también da una idea clara de lo dulce o ácido que es ese fruto en su madurez. Como se puede observar en la figura 4: los kakis presentan el máximo del IM con valores absolutamente altísimos, por encima de 200 debido a que han presentado unos ºBrix muy altos y una acidez ínfima, de 0.06 g/100g pf. La uva tinta también ha presentado un IM de 51.90, muy alta también, ya que ha presentado el máximo contenido de ºBrix y una acidez también muy baja de 0.34, datos parecidos a los obtenidos por la manzana. Los datos más bajos de IM los ha obtenido la frambuesa y la grosella, debido a su alta acidez y relativamente bajos ºBrix.

Indice de madurez 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00

Indice de madurez

0,00

Figura 4: Índice de Madurez (ºBrix/acidez) de los frutos. (Elaboración propia).

En la figura 5 se pueden observar los resultados del contenido de vitamina C de los frutos. El máximo lo ha obtenido el kaki, a pesar de tener un mínimo de acidez, lo cual hace de él un fruto muy interesante. La grosella y la mora negra siguen en contenido de vitamina C al kaki con valores cercanos a 40 mg/10 g pf. Los valores más bajos los han obtenido la manzana y la uva tinta.

Vitamina C (divid/100) 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00

Vitamina C (divid/100)

10,00 0,00

Figura 5: Vitamina C de los frutos en mg/10 g pf. (Elaboración propia). Seguidamente, el contenido de fenoles totales, representado en la figura 6 muestra que la mora negra presenta el máximo contenido de fenoles totales con 311.51 mg equivalentes de ácido gálico /100 g pf, seguido por los arándanos con 194.07. Los valores más bajos los presentó la manzana con 59.85 mg equivalentes de ácido gálico /100 g pf) seguido por los kakis y la uva tinta.

Fenoles 350,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00

Fenoles

50,00 0,00

Figura 6: Fenoles totales en mg equivalentes de ácido gálico / 100 g peso fresco de los frutos. (Elaboración propia). Finalmente, en la figura 7 se puede observar la actividad antioxidante total (AAT) de los frutos estudiados. La mora negra ha obtenido el máximo de la AAT con un valor de 150 mg equivalentes de Trolox/100 g pf (y máximo contenido de fenoles totales). Este es un valor muy alto de AAT seguido por los arándanos con 104.38 mg equivalente de Trolox/100 g pf que también es un valor muy alto de este parámetro (que presentó el 2º contenido más alto de fenoles totales). La manzana y la uva tinta, seguidos de los kakis sobremaduros e inmaduros presentan valores muy por debajo de aquellos, de 15.97, 24.88, 22.47 y 30.29 respectivamente, y que también presentaron los mínimos contenidos de fenoles totales. 18

Estos últimos datos corroboran que en los frutos estudiados, los fenoles totales son los compuestos que más han contribuido a la AAT de estos frutos.

AAT 160,00 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00

AAT

Figura 7: Actividad Antioxidante Total (AAT) en mg equivalentes de Trolox / 100 g pf de los frutos. (Elaboración propia).

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CONCLUSIONES

A raíz de nuestra investigación hemos llegado a la conclusión de que hay ciertas frutas más antioxidantes que otras, podemos concluir que las moras negras de todas las frutas analizadas, presentan la mayor actividad antioxidante seguidas por los arándanos y las frambuesas. Los análisis también nos indican que la manzana presenta la menor actividad antioxidante, seguida de los kakis sobremaduros. Los análisis realizados en fenoles nos llevan a la conclusión de que son el factor más determinante de la actividad antioxidante de una fruta. En las tablas y gráficos del apartado resultados podemos observar que la cantidad de fenoles totales coincide, en relación con la actividad antioxidante, algo que también ha sido nombrado en el apartado antecedentes. Las frutas y verduras contienen gran cantidad de compuestos polifenólicos que contienen abundantes propiedades antioxidantes. Los beneficios que estas frutas analizadas tienen en nuestro cuerpo van más allá de la actividad antioxidante total. Pues en el apartado antecedentes se menciona la alta propiedad antioxidante de la Vitamina C en nuestro organismo, por lo que frutas como los arándanos que tienen mayor concentración de Vitamina C, pese a tener una actividad antioxidante menor que las moras negras, también nos supondrá un beneficio para la salud, pues será una forma de suplementación natural de Vitamina C, la cual no es generada por nuestro cuerpo. Los grados Brix nos indican la cantidad de sólidos solubles presentes. Esto tiene relación con los azúcares presentes en la fruta. Los azúcares tienen además de relación con los grados Brix, relación con el índice de madurez, pues podemos observar que el kaki, una fruta muy dulce, que tiene gran cantidad de azúcares y por tanto de grados Brix tiene un índice de madurez muy alto. La presencia de más azúcares hará que disminuya el gusto ácido. En esta investigación hemos analizado la actividad antioxidante de distintas frutas basándonos en acidez, pH, Vitamina C, grados Brix, índice de madurez, fenoles totales y la actividad antioxidante total, pero estos estudios pueden realizarse de distintas maneras. Como se puede observar en los resultados las frutas que tienen una mayor actividad antioxidante son las frutas que se consideran frutos rojos, ya que los pigmentos que le proporcionan el color rojo a estas frutas, las antocianinas, tienen influencia también en la actividad antioxidante de estos frutos, ya que son compuestos fenólicos.

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AGRADECIMIENTOS

Nuestro más sincero agradecimiento a todas las personas que han colaborado en este proyecto de investigación. Al proyecto IDIES en su VI edición, por ir en busca de los jóvenes investigadores; a la Universidad Miguel Hernández, por sus magníficas instalaciones sin las cuales no habríamos sido capaces de llevar este proyecto a cabo. En especial, a nuestras tutoras de investigación, Mª Asunción Amorós Marco y Mª Soledad Almansa Pascual de Riquelme, por sus consejos, cariño y confianza depositada en nosotras desde el primer momento. Habéis sido unos espléndidos ejemplos de investigadoras, gracias por vuestro compromiso indudable. De igual modo agradecer a nuestra profesora de Biología y Geología y tutora del proyecto, Mª José Urios Martínez, por ofrecernos sus conocimientos y su paciencia en este trabajo día a día. Mención especial a nuestra profesora de Iniciación a la Investigación, Virginia Verdú Tortosa, por despertar en nosotras la curiosidad de la investigación y por su apoyo incondicional sin el cual este proyecto no habría sido posible. Gracias también a los profesores que nos han proporcionado ayuda en este proyecto, Mª Dolores Gálvez y Mª Dolores Meseguer, profesoras de Química e Inglés del centro y por supuesto a nuestros compañeros de investigación por sus ánimos y fuerzas diarios en los momentos de frustración más duros. Por último, gracias a nuestras familias y amigos, sin cuya confianza no habríamos tenido el valor suficiente de emprender esta gran aventura.

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BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA

Listado de obras consultadas Arnao, M. B., Cano, A., Acosta, M. (2001). The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity. Food Chemistry. 73, 239–244. Bartosz, G. (1997). Oxidative stress in plants. Acta Physiologiae Plantarum, 19, 47–64. Carocho, M., Ferrerira, I.C.F.R. (2013). A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food and Chemical Toxicology. 51, 15-25. Halliwell, B. (1990). How to characterize a biological antioxidant. Free Radical Research Communications. 9, 1-32. Halliwell, B., Gutteridge, J.M. (1995). The definition and measurement of antioxidants in biological systems. Free Radical Biology and Medicine. 18, 125-126. Leja, M., Mareczek, A., & Ben, J. (2003). Antioxidant properties of two apple cultivars during long-term storage. Food Chemistry, 80, 303–307. Pisoschi, A.M., Pop, A. (2015). The role of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: A review. European Journal of Medicinal chemistry. 97, 55-74. Serrano, M., Díaz-Mula, H.M., Valero, D. (2011). Antioxidant compounds in fruits and vegetables and changes during postharvest storage and processing. Stewart Postharvest Review. 1:1 Sindhi, V., Gupta, V., Sharma, K., Bhatnagar, S., Kumari, R., Dhaka, N. (2013). Potential applications of antioxidantsA review. Journal of Pharmacy Research. 7, 828-835. Singleton, V. L., Orthofer, R., Lamuela-Raventos, R. M. (1999). Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin–Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology. 299, 152–178.

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ANEXO

Tablas de cálculos de propiedades de los arándanos muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Arándanos 1 1 1,085 1´ 1 1,085 2 1 1,261 2´ 1 1,261 3 1 1,008 3´ 1 1,008

6 6 6 6 6 6

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,393 248,74 0,05 0,419 262,84 0,05 0,253 148,71 0,05 0,241 143,12 0,05 0,244 180,79 0,05 0,243 180,21 PROMEDIO ERROR

1 1 1 1 1 1

Peso (g) 1,085 1,085 1,261 1,261 1,008 1,008

mg/100g 139,54

ERROR

14,60 2,11 1,22

24,37 6,50 3,75

70,44 71,15 121,27 119,49

6 6 6 6 6 6

muestra nº muestrapH Mora negra 1 2 3

ERROR

2,77 0,32 0,19

11,80 1,51 0,87

4,32 0,97 0,56

3,95 0,04 0,02

0,83 0,04 0,02

8,80 2,11 1,22

10,59 2,34 1,35

1 1 1 1 1 1

Peso (g) mg/100g 1,23 80,42 1,23 78,60 1,108 126,27 1,108 94,64 1,08 152,39 1,08 62,82 150,00 33,71 13,76

3626,00 350,34 202,27

muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Frambuesa 1 1 1,04 1´ 1 1,04 2 1 1,15 2´ 1 1,15 3 1 1,25 3´ 1 1,25

6 6 6 6 6 6

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,181 139,59 0,05 0,188 143,55 0,05 0,17 120,61 0,05 0,16 115,50 0,05 0,201 125,55 0,05 0,228 138,26 PROMEDIO ERROR

Peso (g) mg/100g 1 1,127 44,38 1 1,127 52,74 1 1,022 43,02 1 1,022 44,11 1 1,26 50,20 1 1,26 61,59

130,51 11,49 4,69

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Frambuesa 1 0,025 0,456 0,072 0,384 6 1´ 6 0,025 0,563 0,15 0,413 2 6 0,025 0,47 0,139 0,331 2´ 6 0,025 0,47 0,192 0,278 3 6 0,025 0,469 0,058 0,411 3´ 6 0,025 0,556 0,16 0,396

49,34 7,13 2,91

1 1 1 1 1 1

Peso (g) mg/100g 1,04 82,17 1,04 88,43 1,15 63,97 1,15 53,64 1,25 73,21 1,25 70,52

PROMEDIO ERROR

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 3,38 2,82 10,2 3,62 4521 3,35 3,07 12 3,91 4099 3,43 2,43 13,2 5,43 4485 3,39 0,04 0,02

311,51 23,38 9,55

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 3,95 0,87 10,8 12,41 3810 3,91 0,83 6,6 7,95 3222 3,98 0,79 9 11,39 3846

121,83 7,93 3,24

PROMEDIO

Tablas de cálculos de propiedades de las frambuesas

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,155 115,25 0,05 0,183 129,86 0,05 0,129 112,12 0,05 0,141 119,03 0,05 0,217 132,03 0,05 0,197 122,69

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Grosella 1 0,025 0,465 0,239 0,226 6 1´ 6 0,025 0,474 0,206 0,268 2 6 0,025 0,469 0,27 0,199 2´ 6 0,025 0,45 0,246 0,204 3 6 0,025 0,44 0,155 0,285 3´ 6 0,025 0,463 0,114 0,349

muestra nº muestrapH Grosella 1 2 3

ERROR

PROMEDIO

ERROR

PROMEDIO

1662,00 128,64 74,27

PROMEDIO

104,38 31,65 12,92

Tablas de cálculos de propiedades de las grosellas muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Grosella 1 1 1,127 1´ 1 1,127 2 1 1,022 2´ 1 1,022 3 1 1,26 3´ 1 1,26

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Mora negra 1 0,025 0,444 0 0,444 6 1´ 6 0,025 0,434 0 0,434 2 6 0,020 0,552 0,05 0,502 2´ 6 0,020 0,377 0 0,377 3 6 0,020 0,59 0 0,59 3´ 6 0,020 0,495 0,25 0,245

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 3,79 0,65 16,8 25,85 1515 3,75 0,73 12,6 17,26 1717 3,95 0,48 14,4 30,00 1754 0,62 0,13 0,07

ERROR

3,83 0,11 0,06

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,674 353,80 0,05 0,606 321,2817 0,05 0,49 295,0733 0,05 0,487 293,4806 0,05 0,477 295,6427 0,05 0,503 309,8039 PROMEDIO

PROMEDIO

muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Mora negra 1 1 1,23 1´ 1 1,23 2 1 1,108 2´ 1 1,108 3 1 1,08 3´ 1 1,08

194,07 50,48 20,61

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Arándano 1 0,010 0,347 0,074 0,273 6 1´ 6 0,010 0,416 0,309 0,107 2 6 0,025 0,476 0,077 0,399 2´ 6 0,025 0,525 0,122 0,403 3 6 0,025 0,553 0,005 0,548 3´ 6 0,025 0,637 0,097 0,54

muestra nº muestrapH Arándano 1 2 3

Tablas de cálculos de propiedades de las moras negras

muestra nº muestrapH Frambuesa 1 2 3

4368,33 233,94 135,07

PROMEDIO ERROR

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 3,28 2,15 8,4 3,91 2584 3,3 2,14 7,8 3,64 2665 3,31 2,13 9 4,23 2133 3,30 0,02 0,01

2,14 0,01 0,01

8,40 0,60 0,35

3,93 0,29 0,17

2460,67 286,64 165,49

71,99 12,48 5,09

Tablas de cálculos de propiedades de las uvas tintas muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Uva tinta 1 1 1,25 1´ 1 1,25 2 1 1,02 2´ 1 1,02 3 1 1 3´ 1 1

6 6 6 6 6 6

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,131 92,61 0,05 0,172 111,91 0,05 0,101 96,19 0,05 0,098 94,46 0,05 0,08 85,76 0,05 0,088 90,47 PROMEDIO ERROR

ERROR

4,17 0,02 0,01

1 1 1 1 1 1

Peso (g) mg/100g 1,25 19,74 1,25 17,94 1,02 31,23 1,02 29,91 1 27,59 1 22,88

17,80 0,35 0,20

51,90 2,45 1,41

6 6 6 6 6 6

muestra nº muestrapH Manzana 1 2 3

ERROR

PROMEDIO ERROR

6,17 0,12 0,07

13,60 0,92 0,53

236,11 80,90 46,71

4,22 0,02 0,01

0,33 0,01 0,00

12,80 0,69 0,40

39,20 2,54 1,47

Peso (g) mg/100g 1,07 16,77 1,07 16,14 1 14,58 1 15,48 1,14 17,31 1,14 15,54 15,97 0,98 0,40

1083,67 124,62 71,95

muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Kaki sobremaduro 1 1 1,01 1´ 1 1,01 2 1 1,02 2´ 1 1,02 3 1 1,01 3´ 1 1,01

6 6 6 6 6 6

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,07 79,09 0,05 0,063 75,01 0,05 0,065 75,43 0,05 0,076 81,78 0,05 0,057 71,52 0,05 0,051 68,03

ERROR Peso (g) mg/100g 1,13 27,59 1,13 29,77 0,97 29,37 0,97 41,85 1 29,61 1 23,55

75,14 4,97 2,03

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Kaki sobremaduro 1 0,025 0,462 0,326 0,136 6 1´ 6 0,025 0,48 0,433 0,047 2 6 0,025 0,476 0,334 0,142 2´ 6 0,025 0,42 0,352 0,068 3 6 0,025 0,433 0,325 0,108 3´ 6 0,025 0,47 0,344 0,126

30,29 6,13 2,50

1 1 1 1 1 1

Peso (g) mg/100g 1,01 29,54 1,01 9,77 1,02 30,57 1,02 14,29 1,01 23,32 1,01 27,32

PROMEDIO ERROR

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 0,09 13,8 153,33 6001 0,04 12,6 315,00 4334 0,06 14,4 240,00 5797 0,06 0,03 0,01

1 1 1 1 1 1

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 0,32 13,2 41,25 947 0,33 13,2 40,00 1191 0,33 12 36,36 1113

PROMEDIO

6,12 6,31 6,08

4,2 4,21 4,24

78,16 5,92 2,42

1 1 1 1 1 1

59,85 17,26 7,05

Tablas de cálculos de propiedades de los kakis sobremaduros

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,068 69,65 0,05 0,075 73,30 0,05 0,061 76,90 0,05 0,068 81,14 0,05 0,076 83,41 0,05 0,078 84,59

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Kaki inmaduro 1 0,025 0,466 0,324 0,142 6 1´ 6 0,025 0,481 0,328 0,153 2 6 0,025 0,469 0,339 0,13 2´ 6 0,025 0,479 0,295 0,184 3 6 0,025 0,448 0,313 0,135 3´ 6 0,025 0,447 0,339 0,108

muestra nº muestrapH Kaki inmaduro 1 2 3

ERROR

PROMEDIO

ERROR

PROMEDIO

1646,67 339,63 196,09

PROMEDIO

24,88 5,50 2,25

Tablas de cálculos de propiedades de los kakis inmaduros muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Kaki inmaduro 1 1 1,13 1´ 1 1,13 2 1 0,97 2´ 1 0,97 3 1 1 3´ 1 1

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Manzana 1 0,025 0,484 0,401 0,083 6 1´ 6 0,025 0,507 0,427 0,08 2 6 0,025 0,484 0,416 0,068 2´ 6 0,025 0,465 0,393 0,072 3 6 0,025 0,48 0,389 0,091 3´ 6 0,025 0,447 0,365 0,082

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 0,33 18 54,55 1271 0,35 17,4 49,71 1932 0,35 18 51,43 1737 0,34 0,01 0,01

Fenoles totales Vol extrac Ab 760 (mg equivalentes de ác gálico/100 g pf) 0,05 0,05 0,063 70,81 0,05 0,068 78,71 0,05 0,04 62,24 0,05 0,038 53,56 0,05 33,95

ERROR

PROMEDIO

4,16 4,17 4,19

muestra nº muestraFactor dilucPeso Vol Tp Manzana 1 1 1,07 1´ 1 1,07 2 1 1 2´ 1 1 3 1 1,14 3´ 1 1,14

95,24 8,93 3,65

muestra nº muestraVol Tamponextract Ab inic Ab final Dif Ab Diluc Uva tinta 1 0,025 0,486 0,373 0,113 6 1´ 6 0,025 0,468 0,365 0,103 2 6 0,025 0,496 0,351 0,145 2´ 6 0,025 0,476 0,337 0,139 3 6 0,025 0,462 0,336 0,126 3´ 6 0,025 0,458 0,353 0,105

muestra nº muestrapH Uva tinta 1 2 3

Tablas de cálculos de propiedades de las manzanas

muestra nº muestrapH Kaki sobremaduro 1 2 3

5377,33 909,29 524,98

PROMEDIO ERROR

6,31 6,31 6,22 6,28 0,05 0,03

g/100g pf mg/kg acidez ºbrix ïndice de madurez Vitamina C 0,07 12,6 180,00 1864 0,07 11,4 162,86 1872 0,09 12 133,33 0,08 0,01 0,01

12,00 0,60 0,35

158,73 23,61 13,63

1868,00 5,66 3,27

22,47 8,58 3,50