1. BIOMOLÉCULAS Compostos de carbono ligados à grupos funcionais. São derivados de hidrocarbonetos, em que o H foi substituído por estes grupos funcionais. Ex.: carboidratos, proteínas, lipídeos.
1.1 ELEMENTOS DAS BIOMOLÉCULAS Macroelementos: H, Na, K, Ca, C, N, O, P, S, Cl Micronutrientes: Mg, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Se, Mo, I 1.2 POLÍMEROS: são moléculas grandes, principal constituinte da célula, formadas por vários monômeros. proteínasaminoácidos nucleotídeosac. Nucléicos monossacarídeoscarboidratos lipídeoshidrocarbonetos Estereoisômeros: moléculas com mesmas ligações químicas, mas configurações diferentes. São chamados de enantiômeros, quando são imagens espetaculares um do outro. Enantiômeros: possuem propriedades químicas semelhantes, mas físicas distintas. Chama-se mistura racêmica, uma solução equimolar de 2 enantiômeros. Carbono quiral: Carbono que possui 4 ligantes diferentes. 2. AMINOÁCIDOS São unidades monoméricas, unidas por ligações peptídicas, que formam as proteínas No total, são 20 αaminoácidos (grupo amino e carboxílico ligado no carbono α) Para todos os AA, exceto a glicina, o Cα está ligado à 4 ligantes diferentes, por isso, os aa têm 2 estereoisômeros enantiômeros. Estrutura geral do aa
2.1 CLASSIFICAÇÃO DOS AA QUANTO A CADEIA LATERAL A classificação é baseada na tendência, ou não, dos grupos R interagirem com a água em pH 7 (polar) 1. R apolar: somente C e H na composição da cadeia lateral 2. R aromático: têm um anel aromático na cadeia lateral 3. R polar positivo: há uma carga positiva na cadeia lateral, a qual não é um hidrocarboneto 4. Rpolar negativo: há uma carga negativa na cadeia lateral, a qual não é um hidrocarboneto 5. Rpolar neutro: não há cargas na cadeia lateral
2.2 PROPRIEDADES DOS AMINOÁCIDOS 1. São anfóteros: podem atuar como ácido (doa H+) ou base (recebe H+), pois quando dissolvido em água, ele vira um íon dipolar (zwitterion), podendo tanto doar, quanto receber prótons.
O pKa é uma medida de tendência de um grupo de oferecer um próton, diminuindo, com essa tendência, 10x a medida que o pKa aumenta em 1unidade PI= Ponto Isoelétrico= pH onde o AA predomina na forma dipolar
2. Atuam como tampões: O primeiro estágio corresponde a remoção do próton do grupo carboxílico, sendo que no segundo, a remoção é do grupo amino. Em baixo pH, predomina a forma protonada (1) Em PK1, as concentrações de 1 e 2 são iguais Em PI, a concentração de 2 é 100% Em PK2, as concentrações de 2 e 3 são iguais. PI corresponde a média dos pKs
Os retângulos sombreados, representam regiões de maior poder tamponante funcionam como tampão no valor de pK Se o aa apresentar 2 grupos carboxílicos, sendo um na cadeia lateral, PI é igual a média dos pKs dos grupos carboxílicos Se o aa apresentar 2 grupos aminos, sendo um na cadeia lateral, PI é igual a média dos pKs dos grupos aminos.
3. P E PTÍDE OS União de aminoácidos através de uma ligação peptídica. Possuem um PI, como os aminoácidos, em que o peptídio permanece na forma dipolar (∑cargas=0) 3.1 LIGAÇÃO PEPTÍDICA Remoção de água do grupo carboxila e do grupo amino do outro aminoácido. É rígida (sem liberdade de rotação) e planar: cada ligação apresenta um caráter de dupla ligação devido à ressonância e não consegue rodar. Planar porque os átomos associados com a ligação peptídica são coplanares É uma ligação dupla Sempre configuração trans: o oxigênio da carbonila e o hidrogênio da amida se colocam em posição trans Oligopeptídeos: ligação de poucos aminoácidos Polipeptídeos: ligação de muitos aminoácidos
3.2 PROTEÍNAS São uniões de peptídeos 3.2.1 Classificação Classificação quanto ao número de cadeias polipeptídicas 1. 1 cadeia: proteínas cadeia 2. 2 ou + cadeias: proteínas multisubunidades Quando há mais de uma cadeia polipeptídica, a proteína chama-se “subunidades múltiplas”. Caso contrário, são referidas como “cadeias”. Classificação das proteínas quanto à composição 1. Proteínas simples: somente aminoácidos em sua composição. Ex.: enzima ribonuclease A 2. Proteínas conjugadas: além dos aminoácidos, há um grupo prostético. Ex.: lipoproteínas, glicoproteínas.
3.2.2 Estruturas das proteínas É determinada pela sequência de aminoácidos A função da proteína depende da sua estrutura As forças que estabilizam as estruturas são interações não covalentes As conformações (arranjos espaciais) existentes são usualmente àquelas termodinamicamente as mais estáveis, ou seja, tendo a menor energia livre (> numero de ligações fracas) 1. Primária: vários aminoácidos unidos em uma única cadeia. A força que estabiliza a estrutura é a ligação peptídica 2. Secundária: conformação local de uma parte da proteína.
2.1 α hélice
Esqueleto enovelado ao redor de um eixo imaginário. Os grupos R dos AA se projetam para fora. A força que estabiliza a estrutura é a ponte de hidrogênio entre o átomo de hidrogênio ligado ao nitrogênio e o oxigênio da carbonila do outro aa. Algumas sequências de aa desfavorecem a estrutura hélice, pois devido às cargas das cadeia laterais, elas podem se repelir, bem como o tamanho das cadeia. Para formação da hélice, é essencial a presença de Prolina (Pro) e Glicina (Gly) 2.2 Conformação β: Esqueleto em zigue-zague, que se sobrepostas, chama-se folha β pregueada A força que estabiliza a estrutura β pregueada são as pontes de hidrogênio entre os segmentos adjacentes da cadeia polipeptídica. Folha β pregueada paralela: quando a orientação amino é a mesma nas cadeias Folha β pregueada antiparalela: quando a orientação amino é oposta nas cadeias Representada por setas 2.3 β curvatura Conectam as extremidades de dois segmentos adjacentes de uma folha β antiparalela. A dobra é constituída por 4 aa A força que estabiliza a estrutura β curvatura é a ponte de hidrogênio entre os aminoácidos das pontas.
3. Solventes orgânicos (álcool, acetona, uréia): os polares afetam as pontes de hidrogênio, já os apolares (benzeno), interfere com as interações hidrofóbicas. 4. Metais pesados: se liga com a proteína, mudando a conformação do aa.
4. ENZIMAS 4.1 DEFINIÇÃO: São proteínas especializadas com a função de catalisar reações .Por ser um catalisador, tem a função de aumentar a velocidade das reações sem afetar o equilíbrio das mesmas. Não exigem condições especiais como os catalisadores químicos. Funcionam em condições suaves de temperatura e pH. A atividade da enzima depende da integridade da conformação protéica nativa. 4.2 CARACTERÍSTICAS 4.2.1 Especificidade: capacidade de discriminação de substratos distintos e reações. 4.2.2 Sítio Ativo: local onde se liga o substrato. O sitio ativo é contornado por aminoácidos que se ligam ao substrato.
3. Terciária: Corresponde ao dobramento final das cadeias anteriores. As forças atuantes para manter a configuração são: Pontes de hidrogênio, interações iônicas, interações hidrofóbicas, e pontes dissulfeto.
4. Quaternária: Arranjo das cadeias em proteínas multisubunidades (com 2 ou + cadeias) As forças atuantes são as mesmas que da terciária.
Modelo Chave-Fechadura: o sitio ativo da enzima tem o formato do substrato, ou seja, possui um sitio ativo rígido. Uma enzima totalmente complementar ao seu substrato seria uma enzima pouco eficiente, pois impediria que o substrato se quebrasse pelo fato de estabilizá-lo. Modelo do ajuste induzido: O sítio ativo não é rígido, se ajustando ao substrato. As interações ótimas entre enzima e substrato ocorrem somente no estado de transição.
4.2.3 Co-fatores: algumas enzimas não necessitam de outro grupo químico além dos aminoácidos. Outras requerem um componente químico adicional chamado co-fator. O grupo químico adicional ligado à parte protéica da enzima chama-se grupo prostético.
3.2.3 Desnaturação da Proteína Perda da conformação nativa, e conseqüente perda de função, provocada por alterações no ambiente. Fatores que desnaturam 1. Calor: quebra das pontes de hidrogênio através do aumento da vibração. 2. Extremos de pH: alteram a carga líquida nas proteínas, causando repulsão eletrostática e ruptura de pontes de hidrogênio.
Íon inorgânico: Molécula orgânica: a enzima passa a ser chamada de coenzima Coenzimas: são transportadores transitórios de grupos funcionais. Derivadas de vitaminas e nutriente orgânicos. ex.: Coenzima biocitina transporta CO2
4.3 MECANISMOS DE CATÁLISE Os grupos funcionais, adequadamente posicionados, auxiliam na quebra e formação de ligações. 3- Hidrolases
Reações de hidrólise (transferência de grupos funcionais da água)
4.3.1 Redução da energia de ativação Energia de ativação alta corresponde a uma reação lenta. Introdução ou remoção de ligação dupla 4-Liases
5-Isomerases
4.3.2 Estabilização do estado de transição Redução da energia do estado de transição pelas enzimas.
6- Ligases
4.3.3 Reação entre substrato e grupos funcionais da enzima Catálise ácido-base geral: os aminoácidos do sítio ativo da enzima podem atuar tantio como doador quanto como receptor de prótons. A retirada ou adição de prótons do substrato para formar espécies que se quebram am produtos mais rapidamente que os reagentes. Catálise covalente: formaçao de ligação covalente transitória entre enzima e substrato. Esse caminho resultará em uma reação de menor energia de ativação.
Rearranjo dos átomos formando uma molécula diferente (isômeros)
Formação de ligações do tipo C-C, C-S, C-O e C-N
4.5 CINÉTICA ENZIMÁTICA Quantidade de produto formado em certo tempo 4.5.1 Fatores que afetam a velocidade da reação 4.5.1.1Temperatura
4.4 NOMENCLATURA DE ENZIMAS 4.4.1 Nomenclatura Usual: adição do sufixo –ase ao nome do substrato ou adição do sufixo –ase à atividade da enzima Ex.: urease catalisa a hidrólise da uréia DNA polimerase:catálisa a polimerização dos nucleotídeos para formar o DNA.
1. Em baixas temperaturas, menor a velocidade 2. Na temperatura ótima, a velocidade é máxima 3. Desnaturação da enzima em altas temperaturas.
4.4.2 Nomenclatura sistemática: uma enzima possui 4 dígitos e um nome sistemático, de acordo com a função que exerce Classe 1Oxirredutases (desidrogenas e)
Reação catalisada Transfere elétrons
4.5.1.2 pH
Exemplo 1.3. Extremos de pH desnaturam a proteína 2. Velocidade máxima em pH ótimo
Transfere grupos funcionais 2Transferases
4.5.1.3 [Enzimas]
Transformação algébrica da equação Vantagem de permitir uma determinação mais acurada de Vmáx V α [E]
4.5.1.4 Tempo de incubação
1. Substratoproduto. V α T 2. Acaba o substrato ou o produto funciona como inibidor da enzima ou ainda há uma reversão no equilíbrio
4.6 INIBIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 4.6.1 Inibidor reversível competitivo (IRC) A susbtância inibidora é parecida com o substrato, competindo o sítio ativo da enzima com o mesmo Vmáx não altera Km altera
4.5.1.5 Concentração de ligantes [S]; [cofatores];[inibidores]
1. Alta quantidade de enzima livre. É uma etapa rápida 2. Enzima na forma de complexo ES 3. A velocidade é independente da [S], pois todo o substrato está já ligado com a enzima. A Vmáx é adquirida quando todas as moléculas da enzima estiverem formando o complexo ES
Cinética de Michaellis-Menten Inicialmente a enzima se liga reversivelmente com o substrato, formando o complexo ES. E + S ES. É um processo rápido O complexo ES se quebra, liberando a enzima. É um processo lento. ES E + P. É essa segunda etapa que determina a velocidade de uma reação
Equação da velocidade para uma reação catalisada por uma enzima com um único substrato Vo = Vmax.[S]/Km + [S] Vo = ½ Vmáx Km= cte de Michaellis. É a [S] para se ter uma velocidade de reação iguaal a metade da velocidade máxima. Km afinidade enzima-substrato Gráfico duplo-recíproco
4.6.2 Inibidor reversível não competitivo (IRNC) A substância inibidora não se liga ao sítio ativo. Pode se ligar tant na enzima livre quanto no cplexo ES Vmáx será menor Km não altera Dialisar o sistema para reverter a inibição. Aumentar a [S] não resolve 4.6.3 Inibidor reversível incompetitivo (IRI)
A substância inibidora só se liga no complexo ES Km altera Vmáx altera
PRÁTICAS PRÁTICA 1: PH E TAMPÕES Determinação do pH: uso de compostos (indicadores ácido-base) com a capacidade de mudança de cor em função da [H+]. Indicadores universais são misturas de vários outros indicadores, a fim de abranger um intervalo mais amplo de pH. Soluções-tampão: formadas por um ácido ou uma base fraca + sal correspondente. Tais soluções, atenuam a variação dos valores de pH com a adição de pequenas quantidades de ácidos ou bases.
4.6.4 Inibidores irreversíveis Se ligam covalentemente com a enzima. Ex.: metais pesados que se ligam no grupo tiol da cisteína
PRÁTICA 2: PROTEÍNAS: REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO E PRECIPITAÇÃO
O objetivo é determinar se uma amostra possui proteína ou não. Uso do método de coloração e precipitação com e sem desnaturação
Reações de caracterização (colorimétrica) Pelo fato das proteínas reagirem com vários compostos, elas formam produtos coloridos.
REAÇÃO COM NINHIDRINA A ninhidrina reage com os agrupamentos aminos livres, formando um produto de coloração violeta. A intensidade da cor é proporcional à concentração de aminoácidos livres. REAÇÃO COM BIURETO O biureto reage com as ligações peptídicas, desenvolvendo uma coloração lilás. O cobre do biureto complexa com o NH da ligação peptídica. É necessário 2 ligações peptídicas (tripeptídeo).
Reações de precipitação Se interação proteína-proteína for grande, a proteína é insolúvel Se a interação proteína-água for grande, a proteína é solúvel PRECIPITAÇÃO COM DESNATURAÇÃO A desnaturação diminui a solubilidade da proteína. Temperatura elevada, pH extremos, sais de metais pesados e solventes orgânicos são condições desnaturantes. PRECIPITAÇÃO SEM DESNATURAÇÃO Adição de sais em baixa concentração aumenta a solubilidade da proteína, porque diminui as interações proteína-proteína. Salting in Adição de sais em alta concentração, diminui a solubilidade da proteína, porque aumenta as interações proteína- proteína, ocorrendo a precipitação. Salting out.
Objetivo: analisar a presença de proteína. Se houver, o biureto deixará a coloração lilás. Neste caso, senso a uréase uma proteína (enzima), o meio ficará lilás. II- ATIVIDADE DA UREASE A atividade da enzima é verificada pela formação de carbonato de amônio na presença de proteína . O carbonato é sal básico, que sob a ação do indicador, deixa o meio rosa No tubo D, a solução ficou amarela devido ao indicador estar em um meio de pH 7,0.
III- ESPECIFICIDADE DA ENZIMA As enzimas têm uma especificidade com o substrato. Neste caso, a urease reage de 15 a 30x mais forte com a urease que com a tiuréia.
IV- REAÇÃO DE HELLER O ácido desnatura a proteína, pois diminui drasticamente o pH da solução. Com isso, há formação de um precipitado
V- EFEITO DO CALOR a. Temperaturas altas desnaturam a proteína. Formação de precipitado b.
PRÁTICA 3: CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA UREASE DA SOJA Urease: catalisa a hidrólise da uréia Uréia+águaCO2 + 2NH3 CO2+H2OH2CO3 2NH3+ 2H2O 2NH4OH 2NH4OH+H2CO3 (NH4)2CO3+ 2H2O Como o carbonato de amônio é um sal básico, sob a presença do indicador vermelho de fenol, o meio fica rosa. No lugar da uréia, é usado a tiouréia. No entanto, a enzima tem seu efeito reduzido em 6x. I-REAÇÃO DO BIURETO O biureto reage com as ligações peptídicas, desenvolvendo uma coloração lilás.
VI- EFEITO DE SAIS DE MERCÚRIO O mercúrio se liga no sítio ativo da enzima. Isso impede a uréia de se ligar no sítio ativo da enzima, e portanto, ela não é quebrada. Se reagisse, o meio ficaria rosa.
PRÁTICA 4- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS Método da espectofotometria:dependendo da concentração de proteínas, uma parte da luz incidente será absorvida. A absorção de luz é dada pela absorbância, sendo esta proporcional a concentração e a espessura do tubo contendo a solução. Tubo branco para calibração do aparelho: de forma a descontar as interferência como por outros reagentes ou mesmo pelo tubo. Contêm todos os reagentes do experimento menos a amostra. T=100% e A=0 Curva padrão ou de calibração: serve para comparar a absorbância da solução padrão. Traçada por meio dos valores de absorbância e concentração conhecidos. Curva de calibração: reta [proteína] x absorbância Todos vão biureto 1 2 3 Proteína: --0,2 0,4 Água: 1 0,8 0,6 Concentração:0 1 2 Absorb.0 0,05 0,09
4 0,6 0,4 3 0,13
5 0,8 0,2 4 0,17
6 1,0 --5 0,21
Concentração de proteína de uma amostra 1 2 Amostra 1 0,5 Agua 0 0,5 Concentração 2,45 1,45 Absorb. 0,11 0,065
P RÁTICA 5- CINÉTICA ENZIMÁTICA Enzima invertase Efeito do pH: diferentes concentrações de solução tampão em faixas de pH diferentes. Sacarose, água e enzima nas mesmas quantidades em cada tubo. Efeito da variação da concentração de substrato: Sacarose em diferentes concentrações. Água, enzima e pH na mesma situação para cada tubo. (gráfico pg. 108) Em [S] tem-se quase toda a enzima na forma livre, sendo a velocidade proporcional a [s]. A velocidade máxima será atingida quando toda a enzima estiver na forma ES, sendo a [E] livre muito pequena.
P RÁTICA 6- CINÉTICA ENZIMÁTICA 2 Enzima invertase: quebra a sacarose em αDglucose+αDfrutose, os quais, por sua vez, cedem elétrons ao dinitrosalicitato (amarelo) quando em temperaturas elevadas. Este último, reduz-se, formando um composto laranja-amarronzado Efeito da concentração de enzima: a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração de enzima, desde que haja substrato suficiente. Efeito da variação no tempo de incubação: a velocidade é proporcional ao tempo de incubação até um certo período. A partir deste, o substrato acaba e a velocidade permanece cte. (gráfico pg 110)