Reproducción asistida mediante el uso de hormonas en la rana cubana osteopilus septentrionalis by Emy J. Riquero

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Reproducción asistida mediante el uso de hormonas en la rana cubana Osteopilus septentrionalis. (Anura: Hylidae) Trujillo Hernández. J., Carballo Hondal. O., Sais Guerra. Y. Centro Nacional de Toxicología. Ciudad de la Habana. Cuba..

Correspondencia: Centro Nacional de Toxicología. Dirección: Calle 114 y Ave 31. Marianao. Ciudad de la Habana. Cuba. Teléfono: 260 7821, 260 3252. e-mail: josetrujillo@infomed.sld.cu; cenatox@infomed.sld.cu

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Resumen Reproducción asistida, es un grupo de técnicas cuyo objetivo es lograr la reproducción y /o obtención de huevos o embriones con diversos fines, mediante el empleo de diferentes técnicas: estimulación hormonal de la ovulación y espermatozoides, inseminación artificial, fertilización in Vitro. La estimulación de los ovarios de la rana con el fin de obtener óvulos maduros se consigue empleando hormonas como la HCG (gonadotropina coriónica humana), la FSH (hormona folículo estimulante), la LH (hormona

luteinizante),

GnRH

(hormona

liberadora

gonadotropinas),

combinaciones múltiples y en dosis variables. En el país no existían antecedentes de resultados en la aplicación de estas técnicas en la especie cubana O. septentrionalis (rana platanera). Los objetivos de este trabajo son, lograr la obtención de huevos de la rana Osteopilus septentrionalis en condiciones de laboratorio y determinar el protocolo más indicado a seguir en la técnica de la reproducción asistida para esta especie. La selección de dosis y esquema de aplicación, tuvo su base en las guías ASTM, FETAX, OECD; así como en los resultados publicados por: Herkovits. J y Pérez-Coll. C.S., Rend. G. M., Bantle. J. A. y Agostinho. C.A. Lograr que los animales se adaptaran a las condiciones de laboratorio por más de 120 días de cautiverio y al tipo de alimentación a base de alimento vivo (lombrices de tierra) constituyó la primera etapa, y la segunda, consistente en determinar las dosis y tipo de hormona a aplicar, siguiendo el principio de no sacrificar a los animales. Se probaron diseños basados en el empleo de dosis única y repetida de HCG y la combinación de una dosis de FSH más dos dosis de HCG. Los resultados esperados se obtuvieron cuando se combinó una dosis de 0.007 mg FSH / g pv a ambos sexos y 24 horas después dos dosis de HCG, a los machos (200 y 400 UI) y a las hembras (400 y 800 UI) con un intervalo de cinco horas entre la primera y la segunda dosis de HCG. Tras la última inyección fueron apareados machos y hembras en acuarios de 40 x 20 x 20 cm, ubicadas a la oscuridad y a una temperatura ambiental de 24 ± 1 0C. Al día siguiente se obtuvieron de 1 000 a 1 400 huevos, con un por ciento de fertilización superior al 75 %, un 0 % de malformación y más del 80 % de sobrevivencia

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al estadio embrionario E-13 (Gosner 1960). Se concluye que la O. septentrionalis puede reproducirse en condiciones de laboratorio y el protocolo más indicado para la ovulación y fecundación de los huevos, fue empleando la combinación de FSH más HCG.

Palabras claves: Osteopilus septentrionalis, reproducción, FSH, HCG

Abstract ASSISTED

REPRODUCTION

USING

HORMONES

THE

CUBAN

FROG

Osteopilus Septentrionalis. (Anura: Ranidae) Assisted reproduction consists of a group of techniques for achieving reproduction or attaining eggs or embryos for different purposes and using diverse approaches (hormonal stimulation of ovulation and spermatozoids). The stimulation of the frog's ovaries, aimed at obtaining mature eggs is possible by the use of hormones in multiple combinations and with variable dosis. In Cuba, there is not previous history of results applying these techniques on the Cuban specie Osteopilus Septentrionalis ("tree frog",). The objectives of this research were obtaining eggs from this frog under laboratory conditions and determining the most recommended protocol for applying the assisted reproduction to this specie. The dosis and schedule of application were based on the guides ASTM, FETAX, OECD, as well as on the results published by: Herkovits.J and Pérez-Coll, C.S.,Rend.G.M.,Bantle.J.A and Agostinho.C.A. Designs were tested based on the use of single and repeated dosis of HCG and the combination of FSH plus HCG. The expected results were seen when a dose of 0.007 mg FSH/gpv was administered to both sexes and 24 hours after two dosis of HCG. Next day, around 1000-1400 eggs were produced, with a fertilization per cent higher than 75, a 0% of malformation and more than 80% of survival to the embryonary stage E-13 (Gosner 1960). It was concluded that O. Septentrionalis can be reproduced under laboratory conditions and the most appropiate protocol for the ovulation and fecundation of eggs was the combination of FSH and HCG.

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Keywords: Osteopilus Septentrionalis, reproduction, FSH ,HCG.

Introducción En Cuba aparte de la Rana catesbeiana o rana toro, no existen especies estudiadas y utilizadas en estudios ecotoxicológicos como el caso de la Xenopus. En nuestra fauna anura existe una representante que le permite asumir el papel de biomodelo en ensayos ecotoxicológicos; la Osteopilus septentrionalis, la que cumple con los criterios para la selección del organismo de prueba:

•

Sensibilidad constante de la población utilizada

•

Alta disponibilidad y abundancia (amplia distribución geográfica)

•

Estabilidad genética y uniformidad de las poblaciones usadas en los ensayos

•

Organismos autóctonos o representativos del ecosistema que se evalúa

•

Conocimiento de su biología, fisiología y hábitos nutricionales

•

Preferencia por especies de importancia recreacional, comercial o ecológica

•

Disponibilidad de ejemplares a lo largo de todo el año

•

Sencillo mantenimiento y cultivo en condiciones de laboratorio

La Osteopilus septentrionalis o rana platanera, como se conoce comúnmente, es la más conocida y común de todos los anfibios cubanos. Fuera de Cuba se conocen poblaciones naturales en Islas Caimán y en Islas Bahamas; ha sido introducida en gran parte de la Florida, Estados Unidos de América, Puerto Rico y Martinica. Alcanza un tamaño máximo de 89 mm de longitud en los machos y 140 mm en las hembras, con una gran diferencia sexual. Se puede encontrar activa, principalmente, durante la noche, en jardines, patios así como bosques, plantaciones de plátano y otros cultivos. Es extremadamente

voraz,

consumidora

insectos (grillos,

cucarachas,

mariposas

nocturnas, etc.). (Anfibios y Reptiles de Cuba). La reproducción se inicia en la época de

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lluvia, con el llamado del macho atrae a la hembra al lugar escogido para fertilizar los huevos que se obtienen a partir de que el macho monta a la hembra llevándose a cabo el aplexus que es axial, el cual puede demorar horas. La hembra puede poner más de 1000 huevos, contenido en una masa gelatinosa que flota en el agua. Los renacuajos emergen entre las 20 y las 48 horas a partir de la puesta de los huevos y la metamorfosis que transcurre posteriormente.

Taxonomía: Clase: Anphibio.

Genero: Osteopilus.

Orden: Anura.

Especie: Osteopilus septentrionalis.

Familia: Hylidae.

Nombre común: Rana platanera.

Sub. Familia: Hylinae.

Los anfibios son organismos muy utilizados en estudios ecotoxicológicos y evaluación de impacto ambiental, su semejanza con los mamíferos en la embriogénesis y la característica de desarrollar una etapa de su vida en el medio acuático y otra en la tierra, los convierten en un organismo bioindicador del medio ambiente muy importante, tanto para estudio y desarrollo de nuevos fármacos así como la evaluación de la salud ambiental. Para la realización de estos estudios se hace necesario disponer de este material biológico durante todo el año, de manera que se pueda disponer de huevos y larvas en el laboratorio independientemente de la época de reproducción. A partir del año 2 000 se inician en Cuba por el Centro Nacional de Toxicología, los primeros trabajos de evaluaciones ecotoxicológicas a bioproductos de uso en la agricultura. Uno de los organismos en los cuales se decide evaluar es en la rana cubana Osteopilus septentrionalis, comúnmente conocida como rana platanera o rana de ciudad, la que solo se reproduce en la época de lluvia y por consiguiente solo durante ese tiempo es posible encontrar u obtener sus huevos y larvas del medio ambiente.

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Atendiendo a la necesidad de disponer de estos en condiciones de laboratorios para la realización de los ensayos ecotoxicológicos, surge la idea de lograr inducir la reproducción de la O. septentrionalis bajo condición de cautiverio. En el país no existían antecedentes de haber inducido la reproducción en una especie Anura y la bibliografía existente nos remite a trabajos realizados en otros países con especies como la Xenopus sp y Bufo arenarum, no existente en nuestro ecosistema, por lo que sobre inducción de la reproducción en condiciones de laboratorio de la rana Osteopilus septentrionalis, son estos los primeros resultados alcanzados.

Objetivos Obtener huevos fecundados mediante la reproducción asistida, en ranas de la especie Osteopilus septentrionalis. Logrando primero la adaptación de esta especie a la alimentación y condiciones de cautiverio (laboratorio), determinando así, el protocolo a seguir para inducir la reproducción.

Materiales y métodos Se

capturaron

del

medio

ambiente

ranas

hembras

machos

maduros

sexualmente y aparentemente saludables los que se mantuvieron independientes en cajas plásticas con dimensiones de 40 cm. de largo x 20 cm. de ancho x 20 cm de alto, en condiciones de iluminación de 9 horas luz y 15 horas de oscuridad y temperatura controlada de 23 ± 2 0C. La alimentación fue a base de lombriz de tierra a razón de 15.0 g por semana, distribuidas en tres raciones. Se utilizaron Hormonas Gonadotropina Coriónica Humana (HCG) y la Hormona Folículo Estimulante (FSH) para la inducción de la reproducción, siguiendo diferentes protocolos ya diseñados para este fin, los que fueron evaluados en la rana de la especie O. septentrionales. Los protocolos que proponen la aplicación de diferentes dosis de HCG y métodos para la obtención de huevos fecundados son:

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1. Inyección subcutánea en el saco dorsal linfático de 300 UI de HCG durante dos días consecutivos al macho y 600 UI de HCG el segundo día a la hembra. Tras la inyección se dejan reposar y se observan los huevos al día siguiente. Ciencia y tecnología en protección y experimentación animal. Zúñiga J. M. col. Interamericana. Pág. 73 2. Inyección subcutánea en el saco dorsal linfático, dos dosis con un intervalo entre ellas de 1 – 5 horas. El macho recibe una dosis entre 500 – 800 UI, la hembra una dosis entre 750 – 1 000 UI, ambos en dos inyecciones. Se deja reposar en un estanque de cría y al día siguiente se observan los huevos. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No 46. Amphibian Metamorphosis Assay for the detection of Thyroid active substances 3. Inyección subcutánea de HCG en el saco dorsal linfático, a machos 400 UI y a las hembras con 1000 UI. Los animales son colocados en tanque para crianza. Effects, Enviorunmental fate, and Risk Assessment Edited by Gary M. Rend, Ph.D. ecological services Inc North Palm Beach, Florida, Cap 7 Fetax- A DEVELOMENTAL TOXICITY ASSAY USING FROG EMBRYOS J. A. Bantle. 4. Inyección subcutánea en el saco dorsal linfático a machos y hembras, con 200 y 400 UI de HCG respectivamente, 48 horas antes del apareamiento. La noche antes del apareamiento se inyecta al macho con 400 y a la hembra con 800 UI de HCG y se coloca en el tanque de cría. Effects, Environmental fate, and Risk Assessment Edited by Gary M. Rend, Ph.D. ecological services Inc North Palm Beach, Florida, Cap 7 Fetax- A DEVELOMENTAL TOXICITY ASSAY USING FROG EMBRYOS J. A. Bantle.

Un quinto protocolo a estudiar propone la aplicación de una dosis de FSH 0.007 mg / ml a ambos sexos. Posterior a las primeras 24 horas de aplicada la FSH, se aplican 200 y 400 UI de HCG a machos y hembras respectivamente, repitiendo la HCG 24 horas más tarde con una dosis para los machos de 400 y 800 UI a las hembras. Luego de esta inyección se procede al apareamiento.

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Resultados Las ranas mantenidas en condiciones de laboratorio mostraron una adaptación al cabo de los sietes días. El consumo de alimento fue en aumento hasta consumir 10.0 g de lombriz de tierra viva a la semana, equivalente a 0.5 g de alimento por gramo de peso vivo, logrando un incremento de su peso corporal. La estancia de los animales en el laboratorio llegó hasta los 120 días. Este primer resultado posibilitó en primera instancia, la continuidad de los estudios encaminados a lograr la inducción de la reproducción de la O. septentrionalis en condiciones de laboratorio. Existen dos tipos de patrones reproductivos en anuros, la reproducción continua y la discontinua. Dentro del patrón de reproducción discontinua están las formas intrínsecas y extrínsecamente cíclicas, la que se caracteriza por una reproducción estacional, pero es posible, encontrar espermatozoides y óvulos maduros durante todo el año en algunos animales de poblaciones ubicadas en zonas muy favorables para la estimulación a la reproducción. La reproducción la O. septentrionalis cuyo patrón reproductivo es estacionario, no se realiza en cualquier época ni lugar, se reproduce en los meses lluviosos y todo el proceso reproductivo constituido por un conjunto de factores internos (actividad hormonal) y externos (factores ambientales) son los responsables de la existencia de estaciones y ciclos reproductivos en los anuros. Los ovocitos de los anfibios detenidos en profase I pueden estar años en el ovario sin completar la meiosis. Una vez concluida la vitelogénesis y el crecimiento del ovocito, tiene lugar un estímulo hormonal de gonadotropinas procedentes de la hipófisis, inducido por el hipotálamo en épocas de apareamiento Al mantener los reproductores aislados de las condiciones climáticas exteriores, los factores de estimulación de la actividad reproductiva por efectos ambientales dejan

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de actuar sobre ellos, y por ende, la estimulación hormonal que actúa en la formación de gametos no ocurre. Los cinco métodos fueron probados en la especie O. septentrionalis, dentro y fuera de la época de reproducción, en ninguno de los casos se obtuvieron resultados. La hormona no actuó en estos animales que permanecieron aislados de las condiciones ambientales y cambios climáticos a que están sometidos cuando se encuentran en libertad, o en algún tipo de cautiverio que le permite el contacto con el medio ambiente. Ej. Ranarios provisto de estanques de para cría. Los resultados se obtuvieron cuando se le inyectaron a hebras y machos una dosis de 0.007 mg FSH / g pv, y al día siguiente (24h) fueron inyectados machos y hembras con 200 y 400 UI de HCG respectivamente. Antes de aparear las parejas se aplica una segunda dosis de 400 y 800 UI de HCG a macho y hembra respectivamente. Luego se colocaron en cajas de 40x20x20 cm con agua en un lugar tranquilo y a la oscuridad. La respuesta al tratamiento se comenzó a observar a partir de las cinco horas de aplicada la ultima inyección, la primera respuesta al tratamiento fue el inició del aplexus y concluyó con la ovulación y fecundación. El número de huevos obtenidos en cada ovulación, estuvo entre los 100 y 130 mil, HUEVOS

con más de un 75% de fertilidad, más del 70% de sobrevida hasta el estadio E-13 (Gosner 1960), con menos del 10% de malformaciones y de mortalidad. Alcanzar ovulaciones con estas características permite la validez de estos huevos para ser utilizados en estudios toxicológicos y ecotoxicológicos.

Conclusiones Quedó establecido que la aplicación de 0.007 mg de FSH / g de peso vivo a ambos sexos, seguida de dosis de 200 y 400 UI de HCG a las 24 horas, más una segunda dosis de 400 y 800 UI de HCG a machos y hembra respectivamente, es el protocolo indicado para lograr la inducción de la ovulación en la rana Osteopilus septentrionalis, mantenidas en condiciones de laboratorio.

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Por demás esta especie demostró una gran adaptación a las condiciones de manejo y tipo de alimentación en el laboratorio. Esto permitió determinar que el cautiverio continuo hasta 120 días que duró el estudio, no afecta a la reproducción de esta especie.

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Fotos

FOTOS TRUJILLO

Fig. 1 condiciones de laboratorio

FOTOS TRUJILLO

Fig. 2 Jaulas en las que se mantuvieron en cautiverio las ranas

FOTOS TRUJILLO

Fig.3 Macho inyectándole la hormona en el saco dorsal linfático.

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FOTOS TRUJILLO

Fig.4 Macho inyectándole la hormona en el saco dorsal linfático. FOTOS TRUJILLO

Fig. 5 Desove de las ranas tratadas Recibida: 14/04/08 Aceptada: 03/06/08

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