UNIVERSIDAD ESTATAL PENINSULA DE SANTA ELENA FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR ESCUELA DE BIOLOGIA MARINA TEMA: Evaluación de la efectividad de los probióticos y ácidos orgánicos frente a infecciones de pseudomonas sp. en el Dormitator latifrons (Chame) INFORME FINAL ASIGNATURA: ACUACULTURA DOCENTE: MSC. SONNYA MENDOZA INTEGRANTES CÓRDOVA LINDAO GRECIA ANALI SOLANO VERA ANGELA MARÍA VITERI SANTANA ERMEL ROLANDO
SANTA ELENA -2012
Contenido
Índice
1. Introducción
El chame (Dormitator latifrons), perteneciente a la familia Eleotridae es
de
amplia distribución a lo largo de las costa del Pacifico de nuestra América, que comprende desde el sur de California hasta el norte del Perú. En nuestro país se lo encuentra en: el estuario de San Lorenzo y delta del río Esmeraldas, delta del río Chone, río Portoviejo, delta del río Guayas y estuario de Santa Rosa. Este pez dado a las bondades que presenta para los cultivos acuícolas, es producido de una manera artesanal en especial en la provincia de Manabí en las tradicionales chameras.
En condiciones naturales de las ciénagas, hábitat preferido por estos peces, c on espacios abiertos que no brindan una buena calidad de agua, con flora circundante abundante, es propicia para la propagación de agentes patógenos peyorativos a estos nichos ecológicos y que el chame a través de una hipersecreción de mucus por sus células glandulares bloquearían la acción de
virus y bacterias nocivas. En otras especies de peces se ha determinado la presencia de actividad antimicrobiana en extractos de proteicos de mucus, además la actividad de ciertas
enzimas como
la
L-amino
oxidasa
ácida
con
propiedades
antibacterianas se ha puesto de manifiesto en Sebastes schelegeli
1.1. Adaptaciones únicas Se aprecia que en la región dorsal posee una alta vascularización, que al ser presionada levemente sangra con facilidad. A través de esta zona el chame realiza intercambio gaseoso con el aire solventando la hipoxia del medio. El chame soporta concentraciones bajas de oxígeno desde 1 ppm y sus branquias no colapsan cuando están fuera del agua; se mantienen húmedas y en intercambio gaseoso es cutáneo. Esta adaptación le permite al chame vivir fuera del agua, en ambiente húmedo, de tres a cinco días. Comportándose de manera normal después de un tiempo en el que es devuelto al agua.
1.2. Hábitos alimenticios Es un pez que se alimenta básicamente del detritus natural de su hábitat. Es también filtrador, sus branquiespinas se encuentran muy desarrolladas.
1.3. Sistema inmune Al encontrarse los peces en el paso evolutivo intermedio, estos poseen una
mezcla entre
los sistemas inmunes innatos o no específicos y adquiridos
o específicos de animales más complejos. Los peces al encontrase en medios tanto marinos como dulce acuícolas, sumergidos en estos desarrollaron medios de defensa en las vías más sensibles al ingreso de patógenos como son la boca, branquias, intestino y piel.
1.3.1. Órganos linfoides El timo, riñón (anterior y medio) y el bazo son los órganos linfoides más grandes en los teleósteos. En teleósteos de agua dulce, el timo es el primer órgano en volverse linfóico, pero antes de este evento, el riñón anterior podría contener progenitores hematopoyéticos, pero no linfocitos.
1.3.2. Timo Este órgano tiene dos lóbulos, es homogéneo y esta representado por una delgada hoja de tejido linfóico oval que esta arreglada subcutáneamente en la comisura dorsal del opérculo y esta linealizada por tejido mucoso del epitelio faringeo. La estructura que caracteriza el timo de un pez, es la cápsula que envuelve la corteza del tejido linfóico. Básicamente, el timo puede ser considerado como
un agregado
de macrófagos
que
promueve
la
proliferación encapsulada de células T. La diferenciación de la estructura tímica es altamente variable en los teleósteos; y en muchas especies, no es posible observar una diferencia clara entre la corteza y medula que es encontrada en vertebrados superiores. Otros estudios describieron
la aparición de nidos focales de epitelio,
también conocidos como corpúsculos de Hassal. El timo es el responsable por la
producción de células T. En los peces cebras, el desarrollo del timo involucra las células de la cresta neural derivadas del neuroectodermo, el cuál migra a la tercera y cuarta bolsa faringea, la cual interactúa con el endodermo.
1.3.3. Riñón El riñón en peces teleósteos es el equivalente de la médula ósea en arcoiris, el
riñón
esta
bien
principalmente produce células
desarrollado
antes
de
eclosionar,
cuando
sanguíneas rojas y granulocitos. Estudios
sugieren la presencia de células linfoideas que liberan IgM entre 12 y 14 dpf (días después de fecundado) y ha demostrado dos variantes de IgM por ELISA en embriones 8 días antes de la terminación del periodo de incubación. Este hallazgo sugiere que la fuente de células B existen antes del final del periodo de incubación en el riñón o en otros sitios hematopoyéticos. Estructuralmente, el riñón anterior está compuesto de una red de fibras reticulares que proveen soporte para el tejido linfático y que son encontradas dispersadas entre las células del sistema hematopoyético. Las principales células encontradas en el riñón anterior son macrófagos, los cuales son agregados en estructuras llamados centros melanomacrofagos (CMMs) y células linfóicas, las cuales son encontradas en todas las etapas de desarrollo, que existen mayormente como células Ig+ ( células B).
1.3.4. Bazo El bazo esta compuesto de un sistema de elipsoides esplénicas. CMMs y tejido linfático. En la mayoría de las especies, estos elipsoides están agrupados juntos y
son
organizados
alrededor
de
otros
dos
componentes.
Los
elipsoides
son capilares de paredes gruesas que se abren en la pulpa y
resultan de la división de las ateriolas esplénicas. Las células a lo largo de las paredes son activamente involucradas en la fagocitosis por macrófagos de antígenos.
1.4. Sistema inmune adquirido El sistema inmune especifico ocurre a través del mecanismo que esta involucrado en una compleja red de células especializadas, proteínas, genes y mensajes bioquímicos que proveen los medios necesarios para el cuerpo
y
la respuesta
específica
de
antígenos,
anticuerpos,
células
efectoras con una alta especificidad y afinidad.
1.4.1. Anticuerpos La inmunoglobulina dominante en los teleósteos es un tetrámero de tipo IgM y contiene ocho sitos de anclaje de antígenos. Algunos teleósteos tienen un monómero de IgM en su suero, aunque los factores lideran a la expresión son todavía desconocidos. La afinidad de unión de los monómeros y tetrámeros IgM en la trucha arcoiris son similares, pero en el tetrámero IgM, el complejo activo es mas efectivo que la forma monómero debido a las diferencias estructurales en la porción Fc. (fragmento cristalizable) de la molécula. IgD fue el segundo isotipo de inmunoglobulinas identificadas en el pez, específicamente en el bagre, debido a la secuencia similar con
IgD
en
mamíferos,
es
localizado
inmediatamente debajo del gen IgM y es expresado en las células B. Además la concentración de IgM en el suero de los salmónidos es extremadamente bajo comparado con otros teleósteos como
la
anguila
japonesa
(Anguilla
japonica), Cyprinidae y algunos perciformes. Sin embargo, la cantidad de IgM en el suero de trucha café (Salmo trutta) y la trucha arcoiris que son infectados o aclimatados a una alta temperatura de (19ºC) alcanzar esos valores similares a aquellos en el bacalao y egelefino (Melanogrammus aeglefinus). Además, los niveles IgM en salmón y en el bacalao del Atlántico (Gadus morhua) varia con el tamaño, temperatura, y la calidad del agua que varía por la estación. Los anticuerpos de los teleósteos son encontrados en la piel, intestino, mucus de las branquias, bilis, y en el plasma. La respuesta inmune de la piel y las branquias son importantes debido a que estos órganos están en contacto directo con el medio ambiente. Anticuerpos específicos pueden ser generados en la piel, intestino y branquias sin la necesidad de generar un sistema de respuesta.
1.4.2. Memoria Inmunológica Los peces desarrollan una respuesta de memoria antes de una segunda exposición
ante un antígeno. La trucha arcoiris responde a una subóptima
dosis de ambos linfocitos T
en un antígeno-dependiente
y de modo
independiente después una exposición inicial ante el mismo antígeno. Es notable que sean necesarias dos exposiciones antes que el pez responda a una segunda administración de antígenos T-dependientes, contrario al antígeno T-independiente que requiere una sola exposición. Además, mientras que la respuesta es rápida y tienen una gran magnitud que la primera respuesta, el número de antígenos-específicos de las células B en el bazo es directamente proporcional a la frecuencia de las células B de antígenos específicos en el precursor. Este descubrimiento sugiere que la respuesta secundaria es causada por la expansión de los grupos de la memoria de las células B y no diferencias específicas en los anticuerpos. Sin
embargo, la respuesta a niveles
suboptimos de anticuerpos sugiere que talvez las células B con su gran afinidad fueron seleccionadas como células B de memoria.
1.4.3. Sistema inmune innato En los peces, la respuesta innata es considerada como un componente esencial ante la respuesta frente a un patógeno debido a las limitaciones presentes en el sistema inmune adquirido. Su naturaleza ectodérmica, su limitado repertorio de anticuerpo y la baja proliferación, maduración y memoria de sus linfocitos. Es por eso que se ramifica en tres barreras: epitelial/barrera mucosa, respuesta humoral y los componente celulares. El epitelio y la barrera mucosa de la piel, branquias y el tracto contra
alimenticio
son
extremadamente
importantes
como
barrera
los patógenos en los peces, debido a que estos siempre se encuentran
sumergidos en medios que pueden contener agentes potencialmente dañinos. Este tipo de respuesta requieren una serie de mecanismos que envuelven factores humorales, células y tejidos, péptidos antimicrobianos y factores complementarios.
Factores humorales pueden
ser
receptores
celulares
o
moleculares que son solubles en el plasma y en otros fluidos corporales
1.4.4. Barreras Físicas Las escamas, mucus de la piel y branquias son las primeras barreras físicas ante una
infección. El mucus de la piel contiene lectinas, pentraxinas, lisozima,
proteínas complementarias, péptidos antibacteriales e inmunoglobulina M (IgM) quien tiene un importante
rol
Adicionalmente, la epidermis es
en la inhibición de la entrada de patógenos. capaz de reaccionar a diferentes ataques
(engrosamiento e hiperplasia celular) y su integridad es
gracias al balance
osmótico y prevenir la entrada de agentes foráneos. También poseen células de defensa como son linfocitos, macrófagos y células granuladas eosinófilos.
1.5. Actividades antibacterianas del mucus La presencia de actividades antibacterianas del mucus del pez chame sobre diferentes bacterias de tipo Gram (+) y Gram (-), implica que el efecto inhibitorio es de amplio espectro.
En estos instantes, es muy difícil determinar el origen
de esta actividad antibacteriana encontrada en las secreciones dérmicas de pez chame. Esta podría tener diferentes orígenes, uno de ellos puede estar vinculado con la presencia de péptidos antibacterianos que pueden estar presentes en las secreciones dérmicas como ha sido demostrada la presencia en otros peces tanto de agua dulce o marina. Sin embargo, no podemos descartar que dicha actividad se deba a la presencia de algún tipo de enzima u otro componente de diferente naturaleza química que sea responsable dicha actividad. Desde otro punto de vista, debemos también analizar que la acción antibacteriana puesta en evidencia en el mucus de chame no solo tenga su origen en un solo compuesto y sea el producto de un sinergismo entre diferentes componentes. Desde el punto de vista fisiológico, el presente trabajo da indicios sobre la resistencia de este pez para desarrollarse en lugares inhóspitos, así la secreción de determinados componentes en el mucus del chame puede conferirle algún tipo de inmunidad innata. Esta inmunidad, por lo demostrado en este trabajo funcionaría en forma selectiva, basados en el hecho, que algunas cepas no fueron inhibidas bajo exposición con mucus de chame. Este particular, nos indica algún tipo de adaptación fisiológica a determinados ambientes para conferir cierta resistencia a estos animales, hecho que le permite defenderse en forma selectiva contra cierto tipo de cepas bacterianas.
1.6. Ácidos orgánicos El uso de ácidos orgánicos como preservantes en alimentación animal es muy antiguo. De hecho, el tradicional ensilado de forrajes se basa en las propiedades antimicrobianas del ácido láctico, generado –irónicamente- por la fermentación que llevan a cabo bacterias lácticas. También en la Industria Alimentaria son bien conocidos los procesos que emplean este ácido como conservador, tales como el yogur, el “chucrut” o el salami. Sin embargo, el empleo de acidificantes en alimentación animal ha adquirido un considerable interés los últimos años, debido a la necesidad de encontrar alternativas al empleo de varios antibióticos, cuyo uso como preventivo se ha prohibido en la legislación europea. Este puede limitar la proliferación de bacterias y otros microorganismos patógenos o nocivos. Al mismo tiempo, es muy difícil prever las complejas interacciones que pueden darse entre ácidos orgánicos y otros componentes del alimento, así como la influencia de éstos en el metabolismo del animal y la microflora saprófita. El propósito de este artículo es revisar, desde un punto de vista básico, algunos conceptos relacionados con el empleo de acidificantes en alimentación animal.
1.6.1. Tipos de ácidos orgánicos
•
ácido fórmico ó metanoico: H-COOH
•
ácido etanoico ó acetico: CH3-COOH
•
ácido propanoico: CH3-CH2-COOH
•
ácido butanoico: CH3-CH2-CH2-COOH
•
ácido pentanoico: CH3-CH2-CH2-CH2-COOH
•
ácido hexanoico: CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH
•
ácido acetil salicílico: HOOC-benceno-COOH
•
ácido tereftálico: H3C-OOC-benceno-COOH
•
ácido benzoico: HOOC-benceno
•
ácido sórbico: CH3-CH=CH-CH=CH-COOH
Intuitivamente, un ácido es una sustancia cuya solución tiene un sabor “ácido” característico. En química se han formulado distintas definiciones para este concepto. La teoría clásica o teoría de Arrhenius, formulada en 1884 establece que ácido es toda sustancia que en disolución da lugar a iones hidrógeno, H+. Son ácidos, por ejemplo el clorhídrico, ClH el acético, CH3-COOH, ya que al disolverse en agua dan lugar a un ión negativo, que es al anión del ácido y otro positivo, que es el catión hidrógeno H+. Este ion hidrógeno se encuentra normalmente hidratado, por lo que suele escribirse también como ión hidronio H3O+. ClH + H2O ↔ Cl- + H3O+ Según la teoría de Arrhenius, base es toda sustancia que en disolución acuosa se ioniza dando lugar a iones hidróxido, OH-. Así, son bases el amoniaco, NH3, y todos los hidróxidos porque en disolución acuosa dan lugar a un ión positivo y al anión negativo OH-NH3 + H2O ↔ NH4+ + OHUna reacción de neutralización es la reacción en disolución acuosa de un ácido con una base. Esta reacción siempre tiene como producto moléculas de H2O, ya que los iones hidrógeno H+ liberados por el ácido se combinan con los iones hidroxilo OH- de la base. Así, en una reacción donde mezcláramos cantidades equimoleculares de ácido clorhídrico, ClH y de hidróxido sódico, NaOH, tendríamos: (Cl- + H+) + (Na+ +OH-) ↔ (Cl- +Na+) + H2O es decir, cloruro sódico (sal común) y agua. Esta reacción es reversible, aunque el equilibriose encuentra por lo general muy desplazado hacia la formación de la sal
y el agua. La reacción inversa a la de neutralización se llama hidrólisis, por la que la reacción de una sal con agua produce el ácido y la base correspondientes.
1.7. Efecto antimicrobiano Es importante señalar que los ácidos ejercen sobre los microorganismos dos tipos de efectos distintos, aunque estrechamente relacionados. En primer lugar, existe un efecto antimicrobiano debido a la acidez en sí, esto es, a la bajada del pH extracelular. El segundo tipo, más importante en la práctica, es el efecto antimicrobiano
específico
debido
a
la
forma
no
disociada.
Todos
los
microorganismos tienen un pH óptimo de crecimiento y un intervalo de pH fuera del cual les resulta imposible proliferar. Esto se refiere al pH del medio o extracelular, ya que el pH intracelular tiene que estar necesariamente cerca de la neutralidad, incluso el de los organismos que crecen mejor a pHs ácidos (acidófilos). El mantenimiento de estas condiciones adecuadas de pH se consigue mediante diversos mecanismos de homeostasis (Booth, 1985). Las bacterias entéticas, como Escherichia y Salmonella sólo crecen a pHs próximos a la neutralidad (neutrófilos). Dada la naturaleza logarítmica de la escala de pH, una disminución de 1 o 2 unidades (equivalente a un aumento de 10 o 100 veces en la concentración de protones) tienen un efecto drástico sobre la proliferación de microorganismos. La mayoría de las bacterias crecen mal a pHs inferiores a 5, pero este nivel de acidez no garantiza, naturalmente, la esterilidad microbiológica: muchas bacterias pueden sobrevivir en estas condiciones durante periodos prolongados de tiempo. (Madigan et al., Biology of microorganisms, 1997). Un pH extracelular muy alejado de 7 perturba el gradiente de protones, que es el principal componente de la fuerza proto-motriz, necesaria para los procesos de transporte a través de la membrana, motilidad y síntesis de ATP acoplada al proceso respiratorio. Además, el metabolismo anaeróbico de bacterias se encuentra regulado por el pH del medio (Booth, 1985). El efecto de la acidificación
del medio depende de la concentración y fuerza del ácido. Por tanto, este tipo de efecto antimicrobiano ocurrirá igual con ácidos orgánicos que inorgánicos, con la salvedad de que hará falta utilizar una cantidad mayor de un ácido orgánico (débil) que de un ácido inorgánico (fuerte) para alcanzar el mismo pH. El efecto antimicrobiano de muchos ácidos orgánicos se ejerce a través de la forma no disociada y este factor tiene mayor importancia que la bajada del pH por sí misma. La forma disociada de los ácidos, al ser un anión, es altamente polar y por tanto no atraviesa fácilmente la membrana plasmática de los microorganismos. La forma no disociada del ácido, por el contrario, sí atraviesa la membrana. Una vez en el interior de la bacteria, el ácido puede disociarse y entonces afecta directamente al pH intracelular microbiano (Östling y Lindgren, 1993). Esto puede afectar gravemente a su metabolismo, ya que afecta al gradiente de protones y de carga con el exterior, e interfiere con los sistemas de transporte de aminoácidos y fosfatos. Además, muchas enzimas esenciales para el metabolismo microbiano se inactivan a pHs ácidos (Bearson et al., 1997) . Otra consecuencia negativa de este proceso se debe al aumento de turgor celular. Al producirse la disociación del ácido en el interior de la célula, la concentración interna de aniones va aumentar. Esto a su vez, desencadena un mecanismo de compensación de la carga eléctrica que obliga a la bacteria a aumentar los niveles de Na+, K+ y/o glutamato, lo que lleva a un incremento mayor de la fuerza iónica intracelular y del turgor. Este proceso provoca un gran aumento de la presión mecánica sobre la pared del microorganismo, lo que hace que eventualmente estalle (Foster, 1999).
1.8. Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa (o Pseudomonas pyocyanea) es una bacteria Gramnegativa, aeróbica, con motilidad unipolar. Es un patógeno oportunista en humanos y también en plantas. Como otras Pseudomonas, P. aeruginosa secreta una variedad de pigmentos como piocianina (azul verdoso), fluoresceína (amarillo verdoso fluorescente) y piorubina (rojo pardo). King, Ward, & Raney desarrollaron "Pseudomonas Agar P" (también conocido como "medio King A") para mejorar la producción de piocianina y piorubina; y "Pseudomonas Agar F" (también conocido como "medio King B") para la fluoresceína. P. aeruginosa es a menudo identificada, de modo preliminar, por su apariencia perlada y olor a uvas in vitro. La identificación clínica definitiva de P. aeruginosa frecuentemente incluye, tanto identificar la producción de piocianina y fluoresceína como determinar su habilidad de crecer a 42 °C. P. aeruginosa es capaz de crecer en combustibles como queroseno o gasóleo, ya que es un microorganismo capaz de nutrirse a partir de hidrocarburos, causando estragos de corrosión microbiana, y creando una gelatina oscura que a veces se identifica inadecuadamente con un alga.
1.8.1. Etimología Etimológicamente, 'pseudomona' significa 'falsa unidad', del griego pseudo, que significa 'falso', y monas, que significa unidad simple. El nombre fue usado inicialmente en la historia de la microbiología como sinónimo de gérmenes. Aeruginosa es el nombre latino para el cardenillo u 'óxido de cobre'. Esto describe el pigmento azul verdoso bacteriano, visto en los cultivos de laboratorio " de P. aeruginosa ". La biosíntesis de piocianina es regulada por mecanismos
homeostáticos, como en un biofilme asociada a la colonización de P. aeruginosa en los pulmones de los pacientes con fibrosis quística.
1.8.2. Patogénesis Este patógeno oportunista de individuos immunocomprometidos, P. aeruginosa infecta el tracto pulmonar, el urinario, tejidos, heridas, y también causa otras infecciones de sangre. Pseudomonas puede causar neumonías a grupos, necesitando a veces ayuda mecánica para superar dichas neumonías, siendo uno de los más comunes agentes aislados en muchos estudios. La piocianina es un factor de virulencia de la bacteria y se ha conocido que puede hasta causar muerte en C. elegans por estrés oxidativo. Sin embargo, la investigación indica que el ácido salicílico puede inhibir la producción de piocianina. Uno en diez hospitales se infectan con pseudomonas. La fibrosis quística está también predispuesta a la infección con P. aeruginosa de los pulmones. P. aeruginosa es el causante de dermatitis, causada por disminución del control de la calidad del agua de bebida. El más común causante de altas fiebres en infecciones es P. aeruginosa[cita requerida]. También ha estado involucrado en foliculitis de tinas de agua caliente, en especial aquellas sin un control higiénico continuo. La P. aeruginosa es productora de la exotoxina A. En plantas induce síntomas de "pudrición de raíces" con Arabidopsis thaliana y Lactuca sativa (lechuga). Es un poderoso patógeno con Arabidopsis y con varias spp. animales: Caenorhabditis elegans, Drosophila y Galleria mellonella. Las asociaciones de factores de virulencia son los mismos para infecciones vegetales y animales. Walker et al han demostrado en 2001 que en la colonización radicular, P. aeruginosa forma biofilmes que confieren resistencia contra los antibióticos secregados por las raíces. La raza patogénica P. aeruginosa PAO1 y PA14 causa
mortalidad de plantas 7 días de postinoculación en Arabidopsis y en Ocimum basilicum. P. aeruginosa forma biofilmes antes de la mortalidad alrededor de las raíces. Ya infectado, las raíces de Ocimum secretan ácido rosmarínico, un multifuncional éster del ácido cafeico que exhibe in vitro actividad antibacterial contra células planktónicas de ambas razas de P. aeruginosa con un mínimo de concentración inhibitoria de 3 µg mL-1. Sin embargo, el ácido rosmarínico no produjo niveles de concentración mínimos inhibitorios en exudados de raíces de Ocimum, antes de P. aeruginosa que forma un biofilme que resiste los efectos microbiales del ácido rosmarínico, y al final causa mortalidad de plantas. La inducción de la secreción de ácido rosmarínico suplementando las raíces y con suplementación exógena de exudados de taíces de Arabidopsis con ácido rosmarínico antes de la infección, confiriendo resistencia a P. aeruginosa. Bajo las últimas condiciones y con microscopía de escaneado laser confocal, grandes aglomerados de P. aeruginosa muerta se han visto en la superficie radicular de Arabidopsis y no se observa formación de biofilme. Los estudios con mutantes quorum sensibles PAO210 (rhlI), PAO214 (lasI), y PAO216 (lasI rhlI) demostraron que todas las razas eran patogénicas a Arabidopsis, que naturalmente no secretan ácido rosmarínico como un exudado de raíces. Sin embargo, PAO214 fue la única raza patogénica que emitió exudado dulce, y biofilme de PAO214 pareció comparable con biofilmes formados en razas salvajes de P. aeruginosa.
1.8.3. Tratamiento P. aeruginosa es frecuentemente aislada de sitios no estériles (boca, esputo, y demás) y en esas circunstancias, frecuentemente representa una colonización, sin
infección. El aislamiento de P. aeruginosa de especímenes no estériles debería interpretarse con cautela y el aviso del microbiólogo o el médico infectólogo deberían corroborase antes del comienzo del tratamiento. A veces, no es necesario tratar. Cuando P. aeruginosa es aislada de sitios estériles (sangre, hueso, colecciones profundas), debe tomarse con mucha seriedad y en la mayoría de los casos requiere tratamiento rápido. P. aeruginosa es naturalmente resistente a una gran cantidad de diferentes familias de antibióticos. Es indispensable usarlos con una guía de tratamiento acorde con los resultados de antibiogramas (sensibilidad de la especie de P. aeruginosa a diferentes potentes antibióticos), más que a elegir determinado antibiótico
empíricamente.
Si
se
comienza
con
un
antibiótico
genérico
empíricamente, hay que realizar lo adecuado para obtener cultivos y elegir el mejor de los resultados bioquímicos, revisando el elegido.
2. Justificación:
Los problemas infecciosos que ocasionan ciertas bacterias patógenas en los sistemas de cultivo de peces se han potenciado en nuestro país en los últimos años, como producto del desconocimiento de métodos de diagnóstico, de igual forma por el uso indebido e indiscriminado de agentes terapéuticos que favorecen el desarrollo de factores de resistencia y nutrición de estas cepas bacterianas. Cabe recalcar que un tanque de cultivo de peces no es completamente estéril sino
más bien necesita de bacterias saprofitas propias que regulan los procesos de intercambio o degradación de nutrientes asimilables para peces, de tal forma que siempre estarán presentes dentro de su flora normal manteniendo o regulando las condiciones normales. Por lo general las infecciones bacterianas se presentan cuando las condiciones de cultivo se vuelven desfavorables, no hay una buena y adecuada alimentación por lo tanto no hay una buena nutrición, de la densidad de los animales, por lo que existe una resistencia inmunitaria de la virulencia y la cantidad de patógenos aumenta ya que tiene la capacidad de adaptarse y sobrevivir en el medio provocando la desestabilización del cultivo. Al no tener conocimiento de las dosificaciones de los productos antibacterianos se ha realizado el presente trabajo que tiene como objetivo evaluar el efecto que tienen los probióticos y los ácidos orgánicos frente a las infecciones con pseudomonas en
Dormitator latifrons
(Chame), para saber la efectividad que tiene este
producto antibacteriano, proporcionando de esta forma datos estadísticos así como también resultados obtenidos durante el proceso experimental.
3. Objetivos: 3.1. Objetivo general:
Evaluar el efecto que tienen los probióticos y los ácidos orgánicos frente a las infecciones con pseudomonas en Dormitator latifrons (Chame)
3.2. Objetivos específicos: •
Aplicar los tratamientos profilácticos con probióticos y ácidos orgánicos a los organismos.
•
Tomar parámetros físico-químicos mediante la utilización del YSI, salinómetro, pHmetro, termómetro.
•
Infectar los organismos con pseudomonas sp, por vía intramuscular.
•
Realizar muestreos
visualizando el comportamiento de los organismos
durante los diferentes tratamientos.
•
Realizar análisis microbiológicos para la conservación de la cepa bacteriana patógena.
3.3. Hipótesis La acción de los ácidos orgánicos mas los probióticos inhiben la infección por pseudomonas sp. en el Dormitator latifrons.
4. MetodologĂa 4.1. DiseĂąo experimental
4.2. Biometría de los organismos: Todos los organismos utilizados para el experimento fueron pesados en la balanza y medidos con un ictiómetro al inicio al finalizar
el proyecto para obtener su
ganancia o pérdida de peso.
4.3. Profilaxis: 4.3.2. Adición de probiótico (VC7): Se agregó el probiótico en 21 g del alimento preparado diariamente, solamente se agregó en los tratamientos #3 (profilaxis-bacterias) y #4 (Profilaxisbacterias-Profilaxis) respectivamente, se realizó este procedimiento durante 5 días antes de agregar las bacterias probióticas.
4.3.1. Adición de ácidos orgánicos: Utilizamos una cantidad de 5ml en 500l del ácido, solamente se agregó en los tratamientos #3 (profilaxis-bacterias) y #4 (Profilaxis-bacterias-Profilaxis) respectivamente, se realizó este procedimiento durante 5 días antes de agregar las bacterias patógenas (pseudomonas).
4.4. Mantenimiento de la cepa bacteriana (Pseudomonas sp.)
Esta cepa bacteriana fue resembrada diariamente en Agar Tsa, para mantener sus colonias jóvenes y estas fueran viables al momento de la infección, para obtener las concentraciones adecuadas fue necesario sembrarlas el Agua de Peptona y realizar un conteo bacteriano en le microscopio y también se realizaron diluciones seriadas en la solución salina al 0.85%.
4.5. Infección por Pseudomonas sp. a los tratamientos #3 (profilaxisbacterias) y #4 (Profilaxis-bacterias-Profilaxis) Antes se realizar la infección mantuvimos la cepa bacteriana con resiembras en el laboratorio para evitar disminuir la acción patogénica por la producción de mortalidades de las mismas, las concentraciones utilizadas fueron de (0,10 ml x 108 ufc/ml) para cada uno de los organismos experimentales vía intraperitonial, durante 3 días, hay tomar en cuenta que también preparamos solución salina al 0.85% a los organismos de control para observar cualquier error en el bioensayo solo al Tratamiento # 1(Control sin bacterias). Una vez infectados ambos tratamientos luego de dos días posteriores procedimos a realizar nuevamente la adición de ácidos orgánicos en las proporciones antes mencionadas.
4.6. Disección de los organismos: Fue necesario diseccionar el 25% de organismos de cada tanque para observar morfológicamente sus estructuras externas e internas como: Branquias, aletas, piel, hígado, vaso, estómago y gónadas. En las cuales identificamos anomalías como necrosis, textura, pigmentación, deformidad.
5. Resultados:
5.1. Tabla de pesos de los organismos en dos etapas del Bioensayo
T#1 (Sin bacterias)
T#2(bacteriassin profi)
T#3(profilaxisbacterias)
T#4(profibact-prof)
ANTES DEL ENSAYO
67,37
63,29
31,74
35,28
DESPUÉS DEL ENSAYO
66,27
59,63
36,01
35,11
5.1.1. Gráfico de pesos de los organismos en dos etapas del Bioensayo
5.2. Tablas de mortalidades y signos clínicos de los organismos: Tratamiento # 1 (Control sin bacterias)
%
de
Tratamiento #2
(control
con bacterias sin profilaxis)
Tratamiento
Tratamiento
#3(profilaxis- #4 (Profilaxisbacterias)
bacteriasProfilaxis)
0%
33%
0%
0%
0%
100%
8.3%
16.6%
Mortalidades % con signos clínicos
5.2.1. Gráfico de mortalidades y signos clínicos de los organismos
5.3. Tratamiento # 1 (Control sin bacterias): Inyección vía intraperitonial de solución salina al 0.85% a los organismos Aplicamos solución salina al 0.85% a los organismos con peso promedio de 66,27g en los cuales no se observó mortalidad alguna, al momento de la disección analizamos órganos internos como hígado, vaso, gónadas en los cuales no existió afecciones aparentes, los que se encontraban sanos.
5.4. Tratamiento #2 (control con bacterias sin profilaxis): Infección con Pseudómonas sp, (0,10 ml x 108 ufc/ml), a una temperaturapromedio de 22° C y salinidad de 00 o/oo.
DÍAS DE INFECCIÓN
Nº
DE
PECES
CON PORCENTAJE
SIGNOS CLÍNICOS
INFECTADOS
1
0/12
0%
2
0/12
0%
3
4/12
33.3%
4
8/12
66.6%
TOTAL
12/12
100%
DE
Aplicamos Pseudómonas sp, (0,10 ml x 108 ufc/ml) a los organismos con peso promedio de 59,63 g en los cuales el primer y segundo día de infección no se observó signo clínico alguno, mientras que al tercer día de infección 4 de los 12 organismos que representa el (33%) se encontraban en estado de letargo, con variadas pigmentaciones en la parte dorsal y alrededor del ano, descamación, anorexia, aletas pectorales rojizas; el cuarto día de infección encontramos 8 de los 12 organismos que representa un (66%) con los mismos síntomas, el quinto día observamos mortalidad 4 de 12 organismos que representa (33%). Al momento de la disección analizamos órganos internos como hígado de color (café pálido) e hinchado más de lo normal, vaso con acumulación de coágulos (rojo oscuro) y las gónadas atrofiadas.
5.5. Tratamiento # 3 (profilaxis-bacterias): Infección con Pseudómonas sp, (0,10 ml x 108 ufc/ml), a una temperaturaPromedio de 22° C y salinidad de 00 o/oo. DÍAS DE INFECCIÓN
Nº
DE
PECES
CON PORCENTAJE
SIGNOS CLÍNICOS
INFECTADOS
1
0/12
0%
2
0/12
0%
3
0/12
0%
4
1/12
8.3%
TOTAL
1/12
8.3%
DE
Estos organismos con peso promedio de 36,01g fueron infectados con la misma bacteria a las mismas concentraciones. Al momento de la infección no se observaron signos clínicos hasta el cuarto día que un organismo presentó alteraciones en su morfología externa como palidez en la piel, al momento de la disección este organismo presentaba en su hígado un color mas opaco en relación al control (sano).
5.5. Tratamiento # 4 (Profilaxis-bacterias-Profilaxis): Infección con Pseudómonas sp, (0,10 ml x 108 ufc/ml), a una temperaturapromedio de 22° C y salinidad de 00 o/oo.
DÍAS DE INFECCIÓN
Nº
DE
PECES
CON PORCENTAJE
DE
SIGNOS CLÍNICOS
INFECTADOS
1
0/12
0%
2
0/12
0%
3
1/12
8.3%
4
1/12
8.3%
TOTAL
2/12
16.6%
En el cuarto tratamiento los organismos con peso promedio de 35,11g se les observaron un cambio en el cuarto día de infección en dos de sus doce organismos presentándose una coloración rojiza en sus aletas pectorales. Sin embargo luego se le aplicó nuevamente la profilaxis al momento de la disección, a los organismos que estaban sanos se les observó el hígado ligeramente opaco pero los otros órganos estaban aparentemente sanos.
6. Conclusiones: Según nuestros resultados obtenidos en el presente estudio nos muestran los niveles de mortalidad que pueden alcanzar la acción de la bacteria Pseudomona sp en el Dormitator latifrons el 33% de nuestro Tratamiento sin
Profilaxis
murieron en la experimentación, que llevado a escala productiva a nivel comercial es un porcentaje considerable; dejamos establecidos los signos clínicos que provoca esta la acción patógena de esta peligrosa bacteria como letargo en el pez infectado, pigmentación rojas en las aletas, anorexia, inflamación y palidez del hígado, vaso hinchado con pigmentaciones oscuras y ano rojo; teniendo como resultado en nuestro tratamiento sin probióticos presentó el 100% de los organismos estos signos. Llegamos a la conclusión de que la acción conjunta de los ácidos orgánicos mas los probióticos son una alternativa efectiva para controlar las enfermedades causadas por patógenos porque aunque en los tratamientos #3 y #4 se presentaron el 8.3% y 16.6% de los signos clínicos logrando recuperarse, pero en nuestro caso el tratamiento #3 existió ganancia de peso de 4.27g durante los 21 días de prueba mayor
en comparación con los demás
los tratamientos
considerando que se debe aplicar un buen manejo en la adición de este tipo de tratamientos preventivos, afirmando nuestra hipótesis que es efectiva acción antagónica de los ácidos orgánicos mas probióticos inhibiendo el ataque las Pseudomonas sp.
7. Recomendaciones: •
Disponer
de
microbiológicos.
un
espacio
adecuado
para
desarrollar
los
análisis
•
Se recomienda realizar un nuevo estudio en otra época del año ya que esta temporada tiene las temperaturas mas bajas del año, comparando las acciones que generen las profilaxis.
•
Este estudio se debe aplicar en organismos más pequeños de Dormitator latifrons y en otros organismos de cultivo acuícola con menos resistencia inmunológica para comprobar que los ácidos orgánicos y los probióticos inhiben a los patógenos oportunistas.
•
Al momento de la disección conservar los tejidos y hacerle un cultivo microbiológico a las especies infectadas para cuantificar las colonias presentes en los organismos.
•
Deben aplicarse los ácidos orgánicos y los probióticos como mecanismo preventivo en un cultivo acuícola tomando en consideración nuestros resultados obtenidos pueden generar menor perdidas de la producción a nivel comercial.
8. Anexos:
PESO EN (g) ANTES DEL BIOENSAYO T#1 T#2 T#3 T#4 80 48,2 54,8 59,5 63 32,2
27,2 46
PROMEDIO
63,5 67,1 61,1 57,2 68 58,1 86,7 65,3 76 65,9 67,37
84,8 71,3 58,5 54,4 52,5 47,5 80,8 77,2 43,2 78,1 63,29
31,8 33,5 44 23,8 28,5 23,3 34,7 29 41,3 27 31,74
44,2 27 61,2 29,1 34,2 25 24,1 40,1 36,8 28,5 35,28
PESO EN (g) DESPUÉS DEL BIOENSAYO
T#1
T#2 54,21 63,8 62,2 74,2 77,62 55,4 78,78 80,98 60,78 60,7 61,61 65 66,27
T#3 45,9 58,6 48,5 53,6 79 77 63,2 71 51,4 75,3 52,2 39,8 59,63
T#4 40,92 32,37 43,44 34,6 56,67 36,75 30,9 27,9 33,04 39,11 39,54 21,8 36,01
33,68 24,46 40,96 26,56 28,25 60,5 38,33 33,8 32,9 40 27,42 34,4 35,11
Fotos 1y 2.Resembrado de la Pseudomona sp en Agar TSA
Fotos 3 y 4. Infecci贸n de la bacteria a los organismos de experimentaci贸n
Fotos 5 y 6. Animales muertos por la Pseudomona sp, muestra de caracter铆sticas de los signos cl铆nicos
Foto 7. Disección de los animales del Tratamiento #2 (sin profilaxis) mostrando hinchazón y despigmentación del hígado
Foto 11. Organismo de Tratamiento #3
Fotos 8 y 9. Comparación de órganos internos del Tratamiento control con el Tratamiento #2
Foto 10. Tamaño y pigmentación del hígado de un organismo enfermo •
9. Bibliografías:
Dirección General de Pesca y Fomento Pesquero;
Consideraciones
generales y realidad del cultivo del Dormitator Latifrons - Chame – en el Ecuador; Revista Latinoamericana de Acuicultura, Lima Perú. •
Yánez Arancibia,A y Díaz González, g; Ecología trofodinámica Dormitator latifrons ( Richardson) en nueve lagunas costeras del Pacífico de México.
Centro de Ciencias del mar y Limnología; Unidad Nacional Autónoma de México; 1977.
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Subramanian S, Ross NW, MacKinnon SL. Comparación de la actividad antimicrobiana en extractos de las mucosas de la epidermis de los peces. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. De mayo de 2008, 150 (1): 8592.
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Kuppulakshmi C, M Prakash, Gunasekaran G, Manimegalai G, Sarojini propiedades antibacterianas de S. mucus de pescado Channa punctatus y mrigala Cirrhinus. Eur. Rev Med Sci Pharmacol. 2008 May-Jun; 12 (3): 14953.
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Kitami Y, Tsukamoto C, Zhang G, H Nagai, Ishida M, Ishizaki S, Shimakura K, Shiomi K, Nagashima Y. identificación de una proteína antibacteriana como la oxidasa del ácido L-amino en el mucus de la piel de pescado de roca Sebastes schlegeli. FEBS J.2007 Jan; 274 (1) :125-36.
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Alexander M. Cole, Peddrick Weis, y Diamond Gill (1997) Aislamiento y caracterización
de
Pleurocidin,
un
péptido
antimicrobiano
en
las
secreciones de la piel de la platija de invierno. The Journal of Biological Chemistry. 2pp 12008-12013. •
Jorge MO FERNANDES, Nathalie SAINT, Graham D. Kemp y Valerie J. SMITH (2003) Oncorhyncin III: un potente péptido antimicrobiano derivado de la proteína H6 cromosómico no histona de la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss. Bioquímica Journal. 373, 621-628.
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Xavier Lauth, Shike Hiroko, Jane C. Burns, Mark E. Westerman, Vaughn E. Ostland, James M. Carlberg, Jon C. Van Olst, Victor Nizet, Steven W. Taylor, Chisato Shimizu, y Philippe Bulet (2002) Descubrimiento y caracterización de dos isoformas de Moronecidin, un nuevo péptido antimicrobiano de lobina rayada híbrida. The Journal of Biological Chemistry. 15pp 5030-5039.