UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA CONTROL DE MEDICAMENTOS ALUMNO: MARCO ROBLES; LISSETH ESPINOSA DOCENTE: BQF. CARLOS GARCÍA CURSO: QUINTO “A”
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS INTRODUCCIÓN La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. La fase estacionaria y la móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes (picos) se separan cuando el pico que sale después es retardado lo suficiente para impedir la sobreposición con el pico que emergió antes. Hoy en día casi no hay campo de la química, biología, medicina, etc. en el que no se utilice la cromatografía en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como en la analítica; por otra parte el desarrollo sobre el uso conjunto de la cromatografía con otras técnicas analíticas, así como el desarrollo de otros tipos de cromatografía, como es por ejemplo la de fluidos supercríticos, hace previsible una extensión aún mayor de su uso (1) A pesar de que el método cromatográfico prometía simplificar la separación desustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la década de los 30 y principio de los 40 cuando se empezó a desarrollar la técnica teniendo este métododiversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografía se emplea principalmente paraseparar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier técnica que se base en los mismos principios (2)
CONCEPTOS Y DEFINICIONES (3) a) Cromatografía La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria o lecho estacionario) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. El proceso cromatográfico se da como resultado de la mayor o menor capacidad para ser retenidos los diferentes componentes de una muestra por la fase estacionaria, es decir, se basa en los repetidos procesos de interacción durante el movimiento de los componentes de una mezcla arrastrados por la fase móvil a lo largo de la fase estacionaria (elución), produciéndose la separación debido a las diferencias en las constantes de distribución de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la móvil.
b) Fase estacionaria Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un líquido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también estar químicamente unido al sólido (fase ligada) o inmovilizado sobre él (fase inmovilizada). La expresión lecho cromatográfico o sorbente se puede usar como término general para designar cualquiera de las formas diferentes en que se use la fase estacionaria. En particular, en la cromatografía de gases se usa el término fase líquida, caso más común de fase estacionaria, frente a fase gaseosa para la fase móvil. Sin embargo, en el desarrollo inicial de la cromatografía líquida se usó el término "fase líquida" para referirse a la fase móvil, frente a la "fase sólida", es decir, la estacionaria. Debido a esta ambigüedad, se desaconseja utilizar el término "fase liquida". Si se debe expresar el estado físico de la fase estacionaria, se propone el uso de adjetivos, tales como fase estacionaria líquida, fase estacionaria sólida, fase ligada sólida o fase inmovilizada sólida.
c) Fase ligada Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna (lugar donde se produce la separación).
d) Fase inmovilizada Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.
e) Fase móvil Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía cíquida, LC), un gas (cromatografía de gases, GC) o un fluido supercrítico (cromatografía con fluido supercrítico). En la cromatografía de gases se puede usar la expresión gas portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión eluyente.
f) Eluir Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar. El proceso de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado (se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas anteriores de cromatografía plana).
g) Efluente La fase móvil que abandona la columna.
h) Muestra Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.
i) Componentes de la Muestra Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos eluito y analito para un componente de la muestra.
j) Soluto Término que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografía de reparto.
k) Disolvente Término que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria líquida en la cromatografía de reparto. Nota: En la cromatografía líquida, el término "disolvente" se ha usado a menudo para la fase móvil. Este uso no se recomienda.
l) Zona Región del lecho cromatográfico donde se localizan uno o más componentes de la muestra. Se puede usar para ello también el término banda.
m) Cromatograma Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector (la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la
concentración en el efluente) frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatograma" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.
n) Cromatografiar Separar por cromatografía.
o) Cromatógrafo El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica
MECANISMOS DE SEPARACIÓN a. Cromatografía de adsorción Que es un fenómeno de interacción superficial por el cual átomos, iones o moléculas son retenidas en la superficie de un material. Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo. La adsorción es la capacidad de las superficies para fijar moléculas. La Fase Estacionaria. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice, carbón activo, fosfato cálcico, hidroxiapatito. La cromatografía de adsorción, es una técnica particularmente útil para separar compuestos de polaridad baja o media. La separación de compuestos muy polares mediante cromatografía de adsorción requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la utilización de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos a fin de reducir su polaridad (3) (4) b. Cromatografía de Reparto La separación se basa principalmente en la diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatogafía de gases), o en las diferentes solubilidades de los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso de la cromatografía líquida). La mayor o menor migración de un componente en este tipo de cromatografía será función del coeficiente de reparto de éste entre la fase estacionaria y la fase móvil:
K d=
Concentración de A en Fase Móvil Concentración de Aen Fase Estacionaria
La cromatografía de reparto se utiliza para la separación de mezclas de compuestos de polaridad media y alta. Algunos ejemplos de este tipo de cromatografía son las cromatografías sobre papel, sílice hidratada y fase inversa en la cromatografía líquida de alta eficacia (5)
c. Cromatografía de Exclusión La separación se basa principalmente en efectos de exclusión, tales como las diferencias de tamaño molecular o de forma, o las diferencias de carga. Se puede usar también el término cromatografía de exclusión por tamaños, SEC, cuando la separación se basa en el tamaño molecular. Anteriormente se usaban para esto los términos filtración en gel y cromatografía de permeación en gel (GPC), cuando la fase estacionaria es un gel hinchado. El término cromatografía de exclusión de iones se usa específicamente para la separación de iones en una fase acuosa (6)
d. Cromatografía de Intercambio Iónico La separación se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. Actualmente, cuando se lleva a cabo sobre columnas de partículas pequeñas y elevada eficiencia, y empleando habitualmente detectores conductimétricos o espectroscópicos, se denomina cromatografía de iones (IC) (3)
e. Cromatografía de Afinidad Esta expresión caracteriza una variedad particular de cromatografía en la que se utiliza para la separación la especificidad biológica singular respecto a la interacción entre analito y ligando (3)
CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA La cromatografía se puede clasificar de acuerdo con la forma del Lecho Cromatográfico: Cromatografía Plana y Cromatografía en Columna; y de acuerdo con el Estado Físico de las Fases: Cromatografía de gases y Cromatografía líquida.
Cromatografía Plana La cromatografía plana es aquella técnica de separación en la que la fase estacionaria se presenta en un plano. Se distingue entre la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina. En el primer caso, la fase estacionaria es una lámina de papel que puede estar impregnada de otra sustancia, y en el caso de la cromatografía de capa fina consiste en una capa de partículas sólidas distribuidas en un soporte plano (7)
Cromatografía en Columna Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al 2O3), Sílica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria está constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separación, y por tanto la resolución,
aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la resolución (8)
Cromatografía de Gases La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras la otra se mueve en una dirección definida. Los componentes son separados por sus diferentes tazas de migración (IUPAC). La cromatografía puede ser clasificada por su utilidad y en base al material que se utilice como eluyente para separar los solutos. De acuerdo a su utilidad la cromatografía se clasifica en: analítica, utilizada para determinar los químicos presentes en una mezcla y en que concentración; y preparativa, utilizada para purificar grandes cantidades de químicos (9)
Cromatografía líquida
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación (10)
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. García. Curso de Métodos: Cromatografía México [en linea] ; 2002. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cromatografia.pdf 2. Chicharro. CROMATOGRAFÍA principios y aplicaciones [en linea] ; 2009. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/19050563/Cromatografia-Principios-y-Aplicaciones#scribd 3. Malave. Principios de Croamtografía Ecuador; 2014. 4. BIOMODEL. Cromatografía [en linea] España; 2015. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en: http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm 5. Gonzáles. Cromatografía Líquida ; 2014. 6. González J. Técnicas de Separación Cromatográfica [en linea] ; 2012. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en: http://ocw.usal.es/cienciasexperimentales/analisis-aplicado-a-la-ingenieriaquimica/contenidos/course_files/Tema_12.pdf 7. Fuentes. Bioquímica Clínica y Patología Molecular Barcelona [en linea] : REVERTÉ ; 1998. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en: https://www.google.com.ec/#q=cromatografia&tbm=bks 8. García. SEPARACIÓN DE FERROCENO Y 4,6,8-TRIMETILAZULENO POR
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA [en linea] España ; 2014. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en:https://sites.google.com/site/grupodepolimeros/cromatografia-en-columna 9. Olguín , Rodríguez. Cromatografía de Gases [en linea]. México ; 2004. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_gases.pdf 10. Ozores. Laboratorio de Técnicas Instrumentales UVA [en linea] [Online].; 2015. [acceso: 12 de Enero de 2016]. Disponible en: http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisisqumicos/cromatografa-delquidos-hplc
MARCO ROBLES
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LISSETH ESPINOZA
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