Texto traduzido e impresso com a autorizaçao do Blackwell Science LTD. de Journal of Applied Bacteriology 1995, 79, 432-438
Indicadores Biológicos para esterilização por formaldeído e vapor a baixa temperatura: o efeito dos meios definidos sobre a esporulação, índice de crescimento e resistência ao formaldeído dos esporos da cepa de Bacillus stearothermophilus A.M. Wright1, E.V. Hoxey2, C.J. Soper* e D.J.G Davies 1
2
School of Pharmacy and Pharmacology, University of Bath, Bath, Zeneca Pharmaceuticals, Macciesfield e Medical Devices Agency, Ministério da Saúde, Londres, Reino Unido 5221/01/95: recebido em 31 de janeiro de 1995, revisado e aceito em 21 de abril de 1995 A.M. WRIGHT, E. V. HOXEY, C.J. SOPER E D.J.G. DAVIES,
1995. Foi realizada uma seleção preliminar nos esporos de 29 cepas de Bacillus
stearothermophilus, a fim de determinar seu potencial como organismos indicadores biológicos para esterilização por formaldeído e a vapor a baixa temperatura. Cada cepa foi esporulada em quatro meios quimicamente definidos. Quatorze cepas produziram uma esporulação satisfatória em um ou mais meios, porém houve uma considerável variação no grau de esporulação. O índice de crescimento dos esporos, que dependia da cepa do organismo e do meio de esporulação, variou de 1 a 90%. Os esporos foram avaliados tendo como base a sua resistência à inativação pelo formaldeído a 0,5% p/v em solução aquosa a 70 ºC. As curvas de sobrevivência obtidas podem ser caracterizadas em cinco tipos, com base no formato da curva. Somente cinco cepas de Bacillus stearothermophilus produziram esporos com as características de alta resistência, curva de sobrevivência semilogarítmica linear e alto índice de crescimento, necessárias para um organismo indicador biológico em potencial.
INTRODUÇÃO As questões toxicológicas e ambientais, com relação à esterilização por óxido de etileno, estimularam o interesse por métodos alternativos de esterilização de itens nãodescartáveis e sensíveis ao calor nos serviços de saúde. A esterilização por formaldeído e vapor a baixa temperatura (LTSF), que utiliza pulsações de vapor subatmosférico em combinação com formaldeído gasoso, tem sido usada com sucesso no Reino Unido e na Europa. No Reino Unido, os ciclos mais comumente empregados utilizam 8 mg 1-1 de formaldeído a 73 ºC. A validação e a monitoração rotineira dos ciclos de LTSF requerem a monitoração da temperatura, pressão, concentração de formaldeído e distribuição e penetração do formaldeído. Atualmente, não é viável monitorar todas essas variáveis de processo através de procedimentos químicos ou físicos. A liberação paramétrica, a liberação do produto da quarentena de esterilização, com base na conformidade demonstrada e registrada com a especificação física, não é, por essa razão, aplicável à esterilização por LTSF, e a monitoração biológica do processo torna-se essencial.
Não há nenhum indicador biológico atualmente disponível, projetado especificamente para o uso com a esterilização por LTSF. Os indicadores biológicos para a monitoração da esterilização por óxido de etileno utilizam esporos de Bacillus subtilis var. niger, que são sensíveis ao teor de calor do processo de LTSF, e os indicadores biológicos formados por esporos de Bacillus stearothermophilus, usados nos processos de calor úmido, demonstraram falta de segurança para a monitoração da esterilização com LTSF (Cripps et al. 1976; Blake et al. 1977; Mecke et al. 1991). O Comité Européan de Normalization está preparando um Padrão Europeu para os indicadores biológicos para a esterilização por LTSF e, por essa razão, há uma necessidade de selecionar organismos indicadores adequados. O organismo indicador ideal deve ser aeróbico, prontamente identificado e caracterizado e ter uma resistência maior à inativação, através dos processos de esterilização, que a maioria dos organismos resistentes com probabilidade de contaminar os produtos em esterilização. A exposição a condições esterilizantes deve
Correspondência para: Professor D.J.G. Davies, School of Pharmacy and Pharmacology, University of Bath, Cleverton Down, Bath B A2 1 A Y, RU. * Falecido
II – 12.1
resultar em curvas de sobrevivência reprodutíveis e, de preferência, semilogarítmicas lineares. A produção e a recuperação de organismos deve ser simples e capaz de uma padronização, como também ser adequada para o manuseio sem a necessidade de uma instalação de refreamento especial. As características dos organismos não devem ser alteradas pelo armazenamento sob condições simples e definidas. Esses requisitos criam obstáculos consideráveis para a escolha do organismo e, consequentemente, os indicadores biológicos têm, por tradição, de ser preparados com endosporos bacterianos, em particular esporos de Bacillus. Uma característica dos esporos de Bacillus é que em quase todas as populações, uma porcentagem apresenta uma resistência à germinação (Gould et al. 1968). O índice de crescimento (GI - Growth Index) é usado como uma medida desse fenômeno e é a porcentagem do número total de esporos formadores de colônia, sob condições específicas de recuperação. Se o GI for baixo, haverá potencial para uma ativação considerável na exposição ao calor e talvez seja difícil distinguir entre os esporos inativados e os latentes. Os esporos bacterianos para serem usados como indicadores biológicos devem ter, idealmente, um GI alto. Neste estudo, os autores relatam a seleção dos esporos de 29 cepas de Bacillus stearothermophilus, para escolher organismos indicadores biológicos potenciais para a esterilização por LTSF. Há ênfase para as cepas de Bacillus stearothermophilus porque o LTSF é um procedimento por calor e essas cepas demonstram uma alta resistência aos processos de esterilização por calor (Kelsey 1958; Kauppinen 1982; Russel 1982). Em estudos preliminares, essas cepas demonstraram ser bastante promissoras (Hoxey et al. 1985). Waites e Bayliss (1980) recomendaram que os esporos bacterianos, para utilização como indicadores biológicos, devem ser preparados em meios quimicamente definidos. Uma menor variação na resistência aos agentes hostis foi reportada com os esporos de B. subtilis produzidos em meio definidos, em vez de meios complexos (Forsyth 1975; Hodges et al. 1980; Gorman et al. 1985). A natureza do nutriente específico em tais meios, cuja depleção limita o crescimento exponencial e induz à esporulação, pode modificar as propriedades do esporo (Brown e Hodges 1974; Lee e Brown 1975; Jones e Pflug 1981) e, portanto, a seleção do meio mais apropriado é importante. Neste estudo, quatro meios de esporulação quimicamente definidos foram avaliados.
Os esporos das diferentes cepas de Bacillus stearothermophilus foram avaliados, tendo como base a resistência à inativação através do formaldeído a 0,5% p/v em solução aquosa a 70 ºC. Essa concentração é equivalente ao limite superior de concentração, atualmente usado na esterilização por LTSF, e é suficientemente baixa para assegurar que o metilenoglicol e o monômero de formaldeído sejam as espécies químicas predominantes presentes. A temperatura a 70 ºC está dentro da faixa utilizada na esterilização por LTSF. Além disso, ficou demonstrado que os esporos que apresentam uma alta resistência e uma cinética de inativação linear, quando expostos a essas condições, também apresentarão características similares quando expostos ao LTSF (Wright 1991).
MATERIAIS E MÉTODOS Cepas bacterianas As cepa de Bacillus stearothermophilus NCIMB 8157, NCIMB 8222, NCIMB 8223, NCIMB 8224, NCIMB 8547, NCIMB 8919, NCIMB 8920, NCIMB 8921, NCIMB 8922, NCIMB 8923 e NCIMB 10814 foram obtidas do National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Reino Unido; as cepas ATCC 7953, ATCC 10149, ATCC 12016, ATCC 15951, ATCC 15952, ATCC 21365 e ATCC 29609 foram obtidas do American Type Culture Collection, Rockville, MD, Estados Unidos da América; as cepas DSM 456, DSM 457, DSM 458, DSM 1550, DSM 2334 e DSM 2349 foram obtidas do Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Göttingen, Alemanha; as cepas Col 2447, Col 2801, Col 2802, Col 2848 e Col 3037 foram obtidas do Unilever Research Laboratories, Colworth, Reino Unido e a cepa NCTC 10003 foi obtida do National Collection of Type Cultures, Londres, Reino Unido. Meios Quatro meios de esporulação quimicamente definidos foram usados: (1) meio SSMAVIT, desenvolvido por Hobbs (1975) a partir de um meio descrito por Larazzini e Santangelo (1967) com adições para o Bacillus stearothermophilus de Campbell e Williams (1953a, b) e Baker et al. (1960). O meio SSMAVIT foi usado como um meio liquido e, como sólido, com a adição de ágar a 1,5%. (2)
II – 12.2
meio sólido de De Guzman, desenvolvido por De Guzman et al. (1972) para B. stearothermophilus NCA 1518 (variante regular) a partir do meio de Campbell e Williams (1953a, b).
(3)
meio líquido de Anderson, stearothermophilus NCTC 10003 Anderson e Friesen (1972).
(4)
meio sólido de carbono limitado, desenvolvido por Steele (comunicação pessoal) para B. stearothermophilus NCTC 10003 de um meio descrito por Lee e Brown (1975). A composição -1 desse meio (em mol 1 ) é de ácido glutâmico, 2,40 x
Tabela 1:
para originado
10-3; glicose, 1,00 x 10-3; metionina, 4,50 x 10-5; 5 cloreto de magnésio (6H2O), 1,80 x 10 ; cloreto de -5 magnésio (4H2O), 1,50 x 10 ; cloreto de cálcio -5 (2H2O), 5,50 x 10 ; sulfato ferroso (7H2O), 1,00 x -5 -7 10 ; ácido nicotínico (sal H2), 6,00 x 10 ; cloridrato -8 -10 de tiamina, 2,50 x 10 ; biotina, 8,00 x 10 ; fosfato de hidrogênio dissódico, 1,76 x 10-2; fosfato de -3 diidrogênio de potássio, 7,30 x 10 .
B. de
Efeito dos meios definidos sobre a esporulação e índice de crescimento de cepas de Bacillus stearothermophilus
Cepa n° NCIMB 8222 NCIMB 8224
Meio de Esporulação
Crescimento
% Máxima
Tempo de
Facilidade de
% Índice de
Esporulação (d)
Limpeza
Crescimento
de De Guzman
+++
60
10
I
3
Carbono limitado
++
50
13
I
2
SSMAVIT líquido
+++
40
6
I
9
SSMAVIT sólido
++
70
7
II
25 65
Carbono limitado
++++
85
2
I
NCIMB 8919
de Anderson
+++
50
10
II
1
NCIMB 8920
Carbono limitado
++
60
6
II
23
NCIMB 10814
SSMAVIT sólido
+++
80
7
I
17
Carbono limitado
++
45
4
II
3
ATCC 7953
SSMAVIT sólido
++
40
6
II
28
ATCC 12016
SSMAVIT sólido
++++
95
6
I
40
Carbono limitado
++
90
9
II
16
SSMAVIT líquido
++
90
6
III
63
SSMAVIT sólido
++++
90
3
I
64
de Anderson
++
90
4
II
53
SSMAVIT sólido
++++
95
3
I
3
Carbono limitado
++
90
6
II
74
de De Guzman
+++
90
6
I
48
SSMAVIT líquido
++
50
13
III
2
SSMAVIT sólido
+++
60
11
I
46
DSM 2334
SSMAVIT sólido
++
60
11
I
90
DSM 2349
de De Guzman
++
50
11
I
90
Col 2848
SSMAVIT líquido
+++
50
8
II
5
NCTC 10003
SSMAVIT sólido Carbono limitado
++ +++
50 90
3 2
II I
83 78
ATCC 15952
ATCC 21365
DSM 458
+ + + +, Abundante; + + +, bom; + + ruim; I, 1-3 lavagens; II, 4-8 lavagens; III, > 8 lavagens.
Os meios de esporulação foram preparados imediatamente antes do uso, diluindo soluções estoque estéreis de concentração dupla com água estéril, para os meios líquidos, ou fundidos e com diluição em ágar estéril a 3% (Lab M, Reino Unido) para os meios sólidos. A composição e preparação das soluções estoque foram feitas de tal maneira que a precipitação dos ingredientes incompatíveis das soluções concentradas foi evitada. As soluções estoque foram esterilizadas através da filtragem por uma membrana de 0,22 µm (Sartorius, Reino Unido) e armazenadas a 4 ºC em ambiente escuro. As soluções estéreis de vitamina foram armazenadas a -20 ºC em
ambiente escuro. O Tryptone Soy Broth e o Nutrient Agar foram preparados em conformidade com as instruções do fabricante (Lab. M) e esterilizados por autoclave a 121 ºC durante 15 min. Esporulação das cepas As culturas de cada cepa foram cultivadas em Tryptone Soy Broth, sem serem agitadas, por 18 horas a 55 ºC, centrifugadas em 1500 g por 15 minutos (MSE Chilspin), lavadas por duas vezes e ressuspensas em um meio líquido de esporulação. Volumes de um mililitro (células de
II – 12.3
8
9
10 a 10 ) dessas suspensões foram utilizados para inocular um volume de 50 ml do meio líquido de esporulação em frascos Erlenmeyer de 250 ml com tampões de lã de algodão/gaze, ou volumes de 20 ml de meios sólidos de esporulação em placas de Petri de poliestireno de 9 cm (Sterilin, Reino Unido). Os meios de esporulação inoculados foram incubados a 55 ºC. O SSMAVIT líquido foi incubado sem ser agitado; o meio de Anderson foi agitado continuamente (100 rev. por -1 min. ). Todos os meios sólidos foram incubados em umidade elevada para evitar que secassem. As culturas foram examinadas diariamente quanto ao grau de crescimento e esporulação. A incubação foi feita até que não houvesse mais aumento na esporulação ou por 14 dias, quando o crescimento e/ou esporulação fosse deficiente.
semeada na superfície de cinco placas repetidas de Nutrient Agar. As colônias foram contadas, após uma incubação de 5 dias a 55 ºC. As contagens totais foram realizadas conforme recomendado por Cook e Lund (1962), utilizando um hemocitômetro com o princípio de Neubatier melhorado (Hawksley) e um microscópio de fase de contraste (Wild, Suiça). O índice de crescimento (GI) é a contagem viável expressa como a porcentagem da contagem total. O GI de cada cepa foi determinado dentro dos 5 dias de colheita dos esporos. Formaldeído Uma solução de formaldeído de grau analar foi obtida de Aldrich Chemicals, como uma solução a 37-40% p/v com metanol a 15% como estabilizante (formalina).
Colheita e limpeza Ensaio do formaldeído Foram colhidas somente as cepas com esporulação maior que 40% em qualquer meio. Os esporos foram coletados dos meios sólidos e colocados em água destilada fria e estéril (4 ºC), por meio de agitação suave com uma espátula estéril de vidro, para separar e suspender os esporos. Os esporos dos meios líquidos foram centrifugados (12000 g por 20 minutos a 4 ºC em MSE HS18) e ressuspensos em água destilada estéril e fria. Foi feita uma lavagem preliminar dos esporos, para remover os componentes residuais dos meios de esporulação, centrifugando em 12000 g por 20 minutos a 4 ºC. As suspensões dos esporos foram armazenadas a 4 ºC por 3 dias, para permitir a lise das células vegetativas. Uma segunda lavagem, para separar as células vegetativas restantes dos esporos, foi realizada através da centrifugação repetida em 1000 g por 20 minutos a 4 ºC (MSE Chilspin) (Long e Williams, 1958). As suspensões -1 8 dos esporos (ml de esporos 10 ; >99% esporos brilhantes) foram armazenadas a 4 ºC em ambiente escuro. Determinação do índice de crescimento As contagens viáveis foram determinadas através da técnica de semeadura em superfícies. Um volume (0,2 ml) da diluição adequada da suspensão de esporo foi
As soluções de formaldeído foram padronizadas através do método de sulfito de sódio (Walker 1953). Avaliação da resistência ao formaldeído a 0,5% em uma solução aquosa a 70 ºC. A solução padronizada de formaldeído foi diluída em 5,05 -1 g 1 de formaldeído. Dessa solução, 19,8 ml foram colocados em um frasco de 100 ml de fundo redondo, acoplado a um condensador, e deixados para descansar a 70 ºC por 24 horas, para permitir o equilíbrio entre o monômero e os polímeros; 0,2 ml de suspensão de esporos foi então adicionado, e a suspensão resultante, misturada com um agitador magnético (Rank Bros Ltd, Reino Unido). As amostras (1 ml) foram retiradas em intervalos e transferidas para 9 ml de um meio inativante de formaldeído (solução estéril de glicina a 10% p/v). Após 2 minutos de contato, essa amostra foi diluída, em série, em água destilada estéril e volumes triplicados de 2 ml de diluições adequadas foram filtrados em membranas estéreis de 0,45 µm, por 47 mm de diâmetro, em aparelhos de filtragem de pressão negativa. Os filtros foram lavados com três volume de 5 ml de água destilada estéril e transferidos para a superfície das placas de Nutrient Agar. As colônias foram contadas após 5 dias de incubação a 55 ºC.
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RESULTADOS
% Sobreviventes
Foi observada uma variação considerável na capacidade de crescimento e esporulação das cepas de Bacillus stearothermophilus, nos quatros meios de esporulação quimicamente definidos. O critério para uma esporulação satisfatória foi de, no mínimo, 40% de esporos brilhantes da população das células em 14 dias de incubação a 55 ºC. As cepas que atenderam a esse critério e os meios de esporulação envolvidos encontram-se listados na Tabela 1. O GI dos esporos determinados no Nutrient Agar também encontra-se registrado na Tabela 1. As cepas NCIMB 8157, NCIMB 8223, NCIMB 8921, NCIMB 8922, NCIMB 8923, ATCC 10149, ATCC 15951, ATCC 29609, DSM 456, DSM 457, DSM 1550, Col 2447, Col 2801, Col 2802 e Col 3037 não apresentaram crescimento e/ou esporulação ou atingiram uma esporulação menor que 40%, após 14 dias de incubação.
Figura 1:
Como base para a comparação das cepas, foi determinada a resistência dos esporos ao formaldeído a 0,5% p/v em solução aquosa a 70 ºC. As curvas de sobrevivência obtidas podem ser categorizadas em cinco tipos, com base no formato da curvas. Em todos os casos, onde não foi observada nenhuma cauda, ou seja, nas curvas tipo A, B e D, a sobrevivência não estava muito abaixo dos ciclos de 2 ou 3 log e, com isso, a possibilidade de cauda a níveis mais baixos de sobrevivência não pode ser excluída. Os exemplos dos cinco tipos encontram-se ilustrados na Figura 1; cada curva é a média das determinações triplicadas. O tipo de curva de sobrevivência, demonstrada pelos esporos de cepas diferentes de Bacillus stearothermophilus, encontrase na Tabela 2. O valor t3 - tempo de exposição necessário para produzir uma diminuição de 3 log na curva de sobrevivência - também é indicado na Tabela 2 para cada tipo de esporo; cada valor é a média das determinações triplicadas.
DISCUSSÃO Essa variação da capacidade das diferentes cepas de Bacillus stearothermophilus em apresentar crescimento e esporulação nos quatro meios testados não foi inesperada, em vista da diversidade e heterogeneidade relacionadas à taxonomia que ocorre com as espécies de Bacillus stearothermophilus (Wolf e Sharp 1981). Entretanto, a não-esporulação adequada das cepas NCIMB 8157 e Col 2447 foi uma surpresa, já que essas cepas também são designadas NCIMB 7953, uma cepa que obteve uma esporulação satisfatória no SSMAVIT
Tempo de Exposição (minutos) Diferentes tipos de formatos da curva de sobrevivência obtidos com os esporos das cepas de Bacillus stearothermophilus expostos ao formaldeído a 0,5% p/v em solução aquosa a 70 °C.
sólido. Uma grande variedade de aminoácidos é necessária para promover o crescimento de Bacillus sp. termofílicos, como o B. stearothermophilus (Campbell e Williams 1953b; O'Brien e Campbell 1957; Baker et al. 1960), e aminoácidos e minerais específicos são necessários para a produção de esporos (Anderson e Friesen 1972). O meio SSMAVIT, que é o mais complexo dos quatro meios, foi considerado superior em termos de variedade de cepas, que exibiram um bom crescimento e esporulação satisfatória. Entretanto, a preparação do meio SSMAVIT é trabalhoso e consome tempo, sendo, provavelmente, inadequado para a produção comercial de esporos. O meio de De Guzman, enquanto promovia o crescimento abundante, produziu uma esporulação pequena ou nenhuma com a maioria das cepas. A falta de esporulação pode ser devido a esse meio ter uma deficiência de ácido glutâmico I. O ácido glutâmico foi considerado importante no estímulo da esporulação no Bacillus sp. (Murrell 1969; Anderson e Friesen 1972). Uma esporulação satisfatória foi obtida com mais cepas em meios sólidos que em líquidos. Quando uma cepa apresenta uma esporulação satisfatória nos meios sólido e líquido, a esporulação máxima nos meios líquidos é menor e/ou obtida somente após um longo período de incubação que nos meios sólidos. Ordal (1961) e Halvorson (1962)
II – 12.5
relataram o aumento da demanda para oxigênio como esporulação aeróbica de células de Bacillus. Os meios sólidos fornecem uma área de superfície maior para a troca gasosa que os meios líquidos. A 55 ºC, a baixa solubilidade do oxigênio e sua depleção nos meios líquidos pode ser considerada para a esporulação reduzida. Além disso, a limpeza dos esporos, para a remoção das células vegetativas, resíduos de esporângios e esporos imaturos foi, em geral, mais difícil com os esporos produzidos em meios líquidos. O meio de Anderson foi desenvolvido especificamente para a esporulação de B. stearothermophilus NCTC 10003, embora, neste estudo, este meio não tenha produzido uma esporulação satisfatória com essa cepa. A natureza muito pequena do meio e o fato de ser líquido podem Tabela 2:
explicar seu medíocre desempenho como um meio de esporulação para outras cepas de B. stearothermophilus. A variação no GI, determinada no meio de recuperação de Nutrient Agar, também foi aparente entre as cepas e em uma cepa em particular, com esporulação em diferentes meios. Os valores indicados na Tabela 1 são as médias das determinações triplicadas. Não foi observado nenhum padrão definido, porém está claro que o GI alto e ideal, ou seja, >90%, é raramente obtido com os esporos das cepas de B. stearothermophilus. Os coeficientes de variação nos lotes e entre lotes para os valores de GI foram de 5 e 7%, respectivamente, confirmando o alto grau de reprodutibilidade que pode ser obtido quando os esporos são produzidos em meios de esporulação quimicamente definidos.
Efeito dos meios definidos de esporulação sobre a resistência dos esporos das cepas de Bacillus stearothermophilus ao formaldeído a 0,5% em solução aquosa a 70 °C. % Índice de
Tipo de Curva de
Crescimento
Sobrevivência
Valor t3 (min)
Cepa n°
Meio de Esporulação
NCIMB 8222
de De Guzman
3
D
75
Carbono limitado
2
C
50
SSMAVIT líquido
9
E
60
SSMAVIT sólido
25
C
68
Carbono limitado
65
A
95
NCIMB 8224
NCIMB 8919
de Anderson
NCIMB 8920
Carbono limitado
23
A
45
NCIMB 10814
SSMAVIT sólido
17
C
84
Carbono limitado
3
A
43
ATCC 7953
SSMAVIT sólido
28
B
24
ATCC 12016
SSMAVIT sólido
40
B
34
Carbono limitado
16
A
29
SSMAVIT líquido
63
E
25
SSMAVIT sólido
64
A
39
de Anderson
53
C
35
SSMAVIT sólido
3
A
32
Carbono limitado
74
A
21
de De Guzman
48
A
25
SSMAVIT líquido
2
B
80
SSMAVIT sólido
46
B
47
DSM 2334
SSMAVIT sólido
90
A
35
DSM 2349
de De Guzman
90
C
20
Col 2848
SSMAVIT líquido
5
E
25
NCTC 10003
SSMAVIT sólido
83
A
30
Carbono limitado
78
B
20
ATCC 15952
ATCC 21365
DSM 458
1
D/E
Quando os esporos são expostos ao formaldeído a 0,5% p/v em solução aquosa a 70 ºC, a curva linear de log (Tipo A) foi observada em nove das 25 combinações de cepas e meios apresentados neste estudo. A curva Tipo B, que compreende uma curva inicial, é geralmente observada na
3
resposta dos esporos aos agentes hostis e é atribuída a uma combinação de alguns mecanismos de ativação/reparo com inativação. Quando o índice de ativação/reparo for maior que o índice de inativação, durante a exposição inicial ao agente mortal, tem-se um resultado de uma curva Tipo D, na qual um aumento
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inicial no número de organismos recuperados é seguido de um declínio logarítmico. Os esporos, que apresentam curvas de sobrevivência Tipo B ou D, embora não sejam ideais, podem ser usados como organismos indicadores biológicos, contanto que a resposta seja reprodutível e possa ser quantificada. A curva Tipo C pode demonstrar uma pequena ou nenhuma linearidade e possui uma cauda proeminente, enquanto que a curva Tipo E é uma combinação da curva Tipo B e C. Os esporos que apresentam curvas Tipo C ou E são inadequados para serem usados como organismos indicadores biológicos, pois a cauda impossibilita uma extrapolação e um cálculo dos níveis de garantia de esterilidade significativos. Na elaboração dos protocolos de esterilização, o valor D é habitualmente usado como uma medida da resistência de um microorganismo ao esterilizante e para comparar a resistência de microorganismos diferentes ao protocolo de esterilização. O valor D é o tempo de exposição (ou dose) que produz uma diminuição de ciclo de 1 log na curva de sobrevivência. Já que seu cálculo admite uma curva de sobrevivência linear, o valor D somente é relevante para a curva de sobrevivência Tipo A e não consegue, por si próprio, descrever as curvas de sobrevivência que desviam da linearidade. Essa limitação no uso do valor D pode ser direcionada ao aplicarmos o tempo de mortalidade de 99,9%, inicialmente proposto por White (1953). Essa é a extensão do tratamento necessário para reduzir o nível de sobrevivência para 0,1%, ou seja, uma diminuição de ciclos de 3 log na curva de sobrevivência e é denominado de valor t3. Para curvas de sobrevivência Tipo A, o valor t3 é igual a três vezes o valor D. Embora não forneça uma descrição matemática verdadeira da curva de sobrevivência não-linear, o valor t3 leva, entretanto, em consideração a curva e a cauda de tais curvas. Quando considerado em conjunto com o tipo de curva de sobrevivência, o valor t3 fornece meios úteis de comparação da resistência dos organismos ao tratamento de inativação, quando as curvas de sobrevivência forem de tipos diferentes (Chinyanganya 1989). Os valores registrados na Tabela 2 indicam uma faixa de resistência ao formaldeído bastante ampla entre os esporos das cepas de B. stearothermophilus. Em contraste à resistência ao calor úmido (Hoxey et al. 1985), não há nenhum padrão definido que relacione o GI com a resistência ao formaldeído. Podemos adiantar que os esporos com GI baixo têm um maior potencial para ativação e, com isso, exibem consistentemente curvas de sobrevivência não-lineares. Isso não é colocado em prática, já que as curvas de sobrevivência Tipo A são
observadas em alguns esporos com GI baixo e curvas de sobrevivência não-lineares, em esporos com GI alto. Do ponto de vista comercial, um organismo indicador biológico deve ser capaz de uma produção em grande volume em um meio simples e, de preferência, em um curto tempo de produção, bem como ser fácil de colher e limpar. Embora possa haver alguma tolerância nesses requisitos, as características de desempenho do organismo, ou seja, GI alto, alta resistência e curvas de sobrevivência semilogarítmicas e lineares, quanto à estabilidade e reprodutibilidade, não podem ser comprometidas. Os resultados apresentados ilustram a grande variação nas características, dependendo não somente da cepa do organismo, mas também das condições de esporulação. Das 29 cepas de B. stearothermophilus examinadas, os esporos de apenas cinco, NCIMB 8224, ATCC 15952, ATCC 21365, DSM 2334 e NCTC 10003 demonstraram potencial como organismos indicadores biológicos para esterilização por LTSF. Esses esporos, quando são expostos ao formaldeído em solução aquosa, exibem curvas de sobrevivência semilogarítmicas lineares e valores D entre 7 e 32 minutos, que oferecem uma grande faixa de sensibilidade aceitável. Devemos considerar que essas conclusões são preliminares, já que em nenhum caso a sobrevivência foi seguida por menos que uma inativação de ciclos de 3 log. Para ser usado como um indicador biológico, os esporos devem exibir uma curva de sobrevivência Tipo A por, no mínimo, ciclos de 5 a 6 logs. As amostras de esporos para a monitoração dos ciclos de esterilização devem conter, considerando esse grupo, 6 esporos de aproximadamente 10 por amostra de teste. Conhecendo o valor D ou k, os ciclos de LTSF, que levam 6 a um fator de inativação de, no mínimo, 10 , podem ser projetados, o que resultaria em uma inativação completa dos esporos nas amostras de teste. Além disso, estudos envolvendo o formaldeído gasoso e vapor serão necessários para determinar as cepas mais adequadas.
REFERÊNCIAS Anderson, R.A. and Frieson, W.T. (1972) Growth and sporulation of Bacillus stearothermophilus in chemically defined media. Australian Journal of Pharmaceutical Sciences NSI, 1-6. Baker, H., Frank, O., Pasher, I., Block, B., Hunter, S.H. and Sobotka, H. (1960) Growth requirements of 94 strains of thermophilic Bacilli. Canadian Journal of Microbiology 6, 557-563.
II – 12.7
Blake, G.C., Cornick, D.E.R. and Vidic, J. (1977) Testing low temperature steam formaldehyde with B. stearothermophilus spores. Hospital Engineering 31, 19-21. Brown, M.R.W. and Hodges, N.A. (1974) Growth and sporulation characteristics of Bacillus megaterium under different conditions of nuttrient limitation. Journal of Pharmacy and Pharmacology 26, 217-227. Campbell, L.L. and Williams, O.B. (1953a) The effect of temperature on the nutritional requirements of facultative and obligate thermophilic bacteria. Journal of Bacteriology 65, 141-145. Campbell, L.L. and Williams, O.B. (1953b) Observations on the biotin requirements of thermophilic bacteria. Journal of Bacteriology 65, 46. Chinyanganya, F.W. (1989) Studies on potential biological indicator organisms for low temperature steam and formaldehyde (LTSF) sterilization. PhD Thesis, University of Bath. Cook, A.M. and Lund, B.L. (1962) Total counts of bacteral spores using counting slides. Journal of General Microbiology 29, 97-104. Cripps, N., Deverill, C.E.A. and Ayliffe, G.A.J. (1976) Problems with low temperature steam and formaldehyde sterilizers. Hospital Engineering 19, 9-10. De Guzman, A., Fields, M.L., Humbert, R.D. and Kazanan, N. (1972) Sporulation and heat resistance of Bacillus stearothermophilus produced in chemically defined media. Journal of Bacteriology 110, 775-776. Forsyth, M.P. (1975) A rate of kill test for measuring sporicidal properties of liquid sterilizers. Developments in Industrial Microbiology 16, 37-47. Gorman, S.P., Scott, E.M. and Hutchinson, E.P. (1985) Effects of aqueous and alcoholic providone-iodine on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Bacteriology 59, 99-105. Gould, G.W., Jones. A. and Wrighton. C. (1968) Limitation of the initiation and germination of bacterial spores as a spore control procedure. Journal of Applied Bacteriology 31, 357-366. Halvorson, H.O. (1962) Physiology of sporulation. In The Bacteria IV ed. Gunsalus, I.C. and Stanier, R.T. pp. 223-259. London, New York: Academic Press. Hobbs, R.J. (1975) Activation and germination studies on Bacillus brevis spores. MSc Thesis, University of Bath. Hodges, N.A., Melling, J. and Parker, S.J. (1980) A comparison of chemically defined and complex media for the production of Bacillus subtilis spores having reproducible resistance and germination characteristics. Journal of Pharmacy and Pharmacology 32, 126-130.
Hoxey, E.A., Soper, C.J. and Davies, D.J.G. (1985) Biological indicators for low temperature steam and formaldehyde sterilization: Effect of defined media on sporulation, germination index and moist heat resistance at 110 °C of Bacillus strains. Journal of Applied Bacteriology 58, 207-214. Jones, A.T. and Pflug, I.J. (1981) Bacillus coagulans FRR B666 as a potential biological indicator organism. Journal of Parenteral Science and Technology 35, 8287. Kauppinen, V. (1982) Some improvements in the production of Bacillus stearothermophilus apores for sterilization control. Acta Pharmaceutica Fennica 91, 87-93. Kelsey, J.C. (1958) The testing of sterilisers. Lancet i, 306309. Lazzarini, R.A. and Santangelo, E. (1967) Mediumdependent alteration of lysine transfer ribonucleic acid in sporulating B. subtilis cells. Journal of Bacteriology 94, 125-130. Lee, Y.H. and Brown, M.R.W. (1975) Effect of nutrient limitation on sporulation of Bacillus stearothermophilus. Journal of Pharmacy and Pharmacology 27, Suppl. 22P. Long, S.K. and Williams, O.B. (1958) Method for removal of vegetative cells from bacterial spore preparations. Journal of Bacteriology 76, 332. Mecke, P., Christiansen, B. and Pirk, A. (1991) The suitability of commercial bioindicators with spores of B. stearothermophilus for testing the efficiency of formaldehyde sterilizers. Zentralblatt für Hygiene und Unmeltmedizin 192, 25-32. Murrell, W.G. (1969) Chemical composition of spores and spore structures. In The Bacterial Spore ed. Gould, G.W. and Hurst. A. pp. 214-273. New York: Academic Press. O’Brien, R.J. and Campbell, L.L. (1957) The nutritional requirements for germination and outgrowth of spores and vegetative cell growth of some aerobic spore forming bacteria. Journal of Bacteriology 73, 522-525. Ordal, Z.J. (1961) Spores II ed. Halvorson, H.A. Ann Arbor, USA: Burgess Publishing Co. Russell, A.D. (1982) The Destruction of the Bacterial Spore. London: Academic Press. Waites, W.M. and Bayliss, C.E. (1980) The preparation of bacterial spores for evaluation of the sporicidal activity of chemicals. In Microbial Growth and Survival in Extremes of Environment ed. Gould, G.W. and Corry, J.E.L. Society for Applied Bacteriology Technical Series N° 15, pp. 159-172. London: Academic Press.
II – 12.8
Walker, J.F. (1953) Formaldehyde. ACS Monograph N° 120. New York: Rheinhold. White, H.R. (1953) The heat resistance of Streptococcus faecalis, Journal of General Microbiology 8, 27-37. Wolf, J. and Sharp, R.J. (1981) Taxonomic and related aspects of thermophiles within the genus Bacillus. In The Aerobic Endo-spore Forming Bacteria ed. Berkeley, R.C.W. and Goodfellow, M.Ch. 11, pp. 251296. London: Academic Press. Wright, A.M. (1991) Selection, production and characterisation of a biological indicator organism for low temperature steam and formaldehyde (LTSF) sterilisation. PhD Thesis, University of Bath.
II – 12.9