Inactivación de Salmonella en semilla de alfalfa mediante la aplicación de agua electrolizada neutra Ricardo E. Ahumada Cota1*, Anabel Cruz Rivera1 y Montserrat Hernández Iturriaga1 1Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos (DIPA), Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro. Centro Universitario, Cerro de Las Campanas S/N Col. Las Campanas. C.P. 76010. Querétaro, Qro. Tel. 442 192 1200 ext. 5507. *Dirigir correspondencia a este autor al Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos (DIPA), Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro. Centro Universitario, Cerro de Las Campanas S/N Col. Las Campanas. C.P. 76000; e-mail: ricardo.noan@gmail.com
Resumen
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Introducción: El consumo de germinado de alfalfa crudo como alimento nutritivo ha crecido recientemente en México. Sin embargo, se considera un alimento de alto riesgo ya que se ha asociado a brotes de enfermedad en los cuales el empleo de semillas contaminadas con microorganismos patógenos como Salmonella es el principal factor implicado. Diversas investigaciones se han llevado a cabo buscando alternativas efectivas para la descontaminación de la semilla. El propósito de este trabajo fue evaluar el efecto del agua electrolizada neutra (AEN) en la inactivación de Salmonella inoculada en semilla de alfalfa. Resultados: La semilla de alfalfa se sometió a tratamientos de desinfección con AEN e hipoclorito de sodio (HS). El índice de
germinación para todos los tratamientos superó el 90% y no se observó diferencia significativa entre ellos (P≤ 0.05). La reducción de la población de Salmonella se vio influenciada por el tipo de germicida y la concentración de cloro libre (P≤0.05) solamente cuando se aplicaron dos tratamientos de desinfección; mientras que el factor de tiempo de contacto no resultó relevante. El mejor tratamiento germicida fue el AEN a 200 ppm (de cloro libre) con un tiempo de contacto de 5 minutos, aplicado antes y después de las 4 horas de remojo previas a la germinación de la semilla, logrando reducir la población del patógeno en 3.11 Log UFC/g. Conclusiones: El AEN tuvo mayor eficacia que el HS para la inactivación de Salmonella en semilla de alfalfa bajo nuestro modelo de germinación. La combinación del AEN, compuesto estable en presencia de materia orgánica, no corrosivo ni tóxico, con otros tratamientos puede
ser una alternativa real para la eliminación de patógenos en semilla de alfalfa. Palabras clave: agua electrolizada Salmonella.
neutra,
alfalfa,
Introducción La popularidad de los germinados como alimentos nutritivos ha crecido en los últimos años en los países desarrollados y algunos subsdesarrollados, como es el caso de México. Los germinados se utilizan en la preparación de emparedados, licuados y en comidas de tipo oriental. En la mayoría de los casos, se consumen crudos, condición que los convierte en alimento de alto riesgo, sobre todo para ciertos grupos hipersensibles de la población.
Uno de los germinados más populares es el de alfalfa (Medicago sativa), el cual se obtiene aproximadamente a los seis días germinación [3]. Diversas investigaciones se han realizado buscando mejoras en los tratamientos para eliminar patógenos en la semilla y el germinado de alfalfa [1]. Desafortunadamente en años recientes se han reportado brotes de salmonelosis por germinado de alfalfa (Cuadro 1).
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Lamentablemente, el consumo de germinados ha generado varios brotes de enfermedades gastrointestinales, siendo Salmonella uno de los microorganismos patógenos mayormente
implicados [1]. La contaminación de germinados puede ocurrir en cualquier punto de su producción, desde la semilla (materia prima) hasta su cosecha, pasando por la germinación, transporte y colocación en el punto de venta. Prevenir la contaminación de la semilla evitando el uso de agua de riego contaminada y tomando medidas contra la contaminación cruzada que pueden ocurrir durante el proceso de germinación es de vital importancia ya que los germinados son un substrato idóneo para el crecimiento de microorganismos [2].
Cuadro 1. Brotes de Salmonella asociados al consumo de germinado de alfalfa.
Uno de los germicidas más novedosos utilizados en la industria de los alimentos es el agua electrolizada, producto de la electrólisis de la dilución de una solución de NaCl o KCl-MgCl2 en una celda de electrólisis que puede contener una membrana que separa el ánodo del cátodo. La solución del ánodo es llamada agua electrolizada ácida y la solución del cátodo es conocida como agua electrolizada básica. El agua electrolizada neutra (AEN) se encuentre en un pH de 7 a 8 y tiene un potencial óxido-reducción de 750 mV, es producida por la mezcla de la solución de ánodo con iones hidroxilo (OH-) o por la utilización de una cámara sin membrana. El agua electrolizada tiene una amplia gama de aplicaciones: superficies de equipo, utensilios o herramientas y alimentos que se consumen
crudos o poco procesados, como es el caso de las frutas y hortalizas [4]. El propósito de este trabajo fue implementar el uso AEN, como agente germicida, en la semilla de alfalfa, como una alternativa para la eliminación de Salmonella spp. que no afecte la germinación de la semilla. Resultados y discusión Determinación del vehículo y método de inoculación Para evaluar la efectividad del AEN se estableció un modelo de inoculación de Salmonella en semilla de alfalfa el cual logró un inóculo inicial de la bacteria de aproximadamente 6 Log UFC/gr después de la etapa de secado de semilla. Debido a que al contar con una
9 Campana 8
Temperatura ambiente
B
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Log UFC/gr *
6
5
A
A
7
C
D
D
4
3
2
1
0 Diluyente de peptona
Suero de caballo Vehículo de inoculación
Agua potable
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población elevada de microorganismos permitiría apreciar reducciones que reflejen la capacidad germicida que el AEN y el hipoclorito de sodio (HS) tienen contra Salmonella en semilla de alfalfa. Para esto se evaluaron dos métodos de secado: 3 horas de secado en campana de flujo laminar y 24 horas a temperatura ambiente (~25°C) con tres vehículos de inoculación de Salmonella en la semilla: 1) diluyente de peptona al 0.01%, 2) suero de caballo al 5% y 3) agua potable estéril. Todos los vehículos de inoculación que se probaron mostraron una mayor recuperación de Salmonella en el secado a temperatura ambiente (Fig. 1). Esto muestra concordancia con la literatura en donde los tiempos de secado prolongados (desde 8 a 24 horas) a temperatura ambiente (20 ± 2°C) son los utilizados para inocular semilla en campana de flujo laminar [5,6,7,8]. A pesar de que las mayores recuperaciones se vieron en el diluyente de peptona al 0.01% y en el suero de caballo al 5% (sin diferencias significativas), se eligió la combinación de agua potable como vehículo de inoculación (temperatura ambiente), pues se obtuvieron recuperaciones de ~6 Log de UFC/gr de Salmonella y debido a su fidelidad como modelo, ya que los productores de germinados de alfalfa suelen utilizar agua potable para remojar la semilla antes de la germinación [9]. Determinación del índice de germinación de semillas tratadas con AEN y HS El efecto adverso que los tratamientos germicidas pudiera tener sobre el
índice de germinación de la semilla (parámetro que sirve para evaluar la calidad de la semilla de alfalfa) fue evaluado para establecer las condiciones de tiempo y concentración de los tratamientos germicidas. Se observó que los diversos tratamientos a los que se sometió la semilla de alfalfa no afectaron significativamente el índice de germinación (Fig. 2). Estos resultados son distintos a los que reportaron autores en donde muestran que la viabilidad de la semilla se reduce sí se aplican tiempos más prolongados (mayores a 10 minutos) de exposición a diversos tratamientos germicidas [5,6,1]. Una explicación a las diferencias observadas puede ser la que reportan Kim et al. [7], en su estudio atribuyen los altos índices de germinación obtenidos a diferencias en el cultivar y al lote de la semilla empleada.
100
A
A
A
A A
A
A AA
A AA
A
A A
A
A A
A
A
A
A
A
A
A
A A
90
80 5 min
Índice de germinación*
70 10 min 60 15 min
50
40
30
20
10
0 Control ADE
50
100
200
300
50
AEN (ppm)
100
200
300
HS (ppm)
Germicida
Figura 2. Evaluación del índice de germinación de semillas tratadas con AEN e HS. Se muestra el porcentaje de germinación al someter a la semilla durante tres diferentes tiempos (5, 10 ó 15 min) a las concentraciones (50, 100, 200 ó 300 ppm) de AEN o HS. *Se realizó una prueba de Tukey, los valores que no comparten la misma letra son estadísticamente distintos entre sí (P≤0.05). El experimento es el resultado con3 repeticiones técnicas cada una.
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Efecto antimicrobiano sobre Salmonella inoculada en semilla de alfalfa Habiendo determinado que las concentraciones utilizadas no afectaron el índice de germinación de la semilla de alfalfa, se seleccionó la concentración más baja (50 ppm) y la que se utiliza con mayor frecuencia en semillas (200 ppm). Los tiempos de contacto de los germicidas con la semilla fueron de 5 y 15 minutos. La prueba de Tukey no mostró diferencias significativas entre el tipo de germicida, la concentración empleada en la desinfección y el tiempo de contacto (Cuadro 2). El hecho de que el tiempo de contacto de cinco minutos no sea significativamente diferente al tiempo de contacto de 15 minutos, puede atribuirse a la inacti-
vación de los compuestos con toda la materia orgánica que la semilla de alfalfa contiene. Resultados diferentes fueron reportados por Jaquette et al. [10], quienes observaron que a mayores concentraciones de cloro se reduce más la población de Salmonella en semilla de alfalfa, nosotros observamos que la reducción no está directamente relacionada con la concentración. La falta de diferencia entre los germicidas en la semilla de alfalfa es notable, ya que nos indica que el AEN tienen las mismas capacidades antimicrobianas que el cloro en la semilla. Dado lo anterior, se estableció como el mejor tratamiento al AEN a 200 ppm durante 5 minutos, ya que los tiempos cortos son lo que mejor se adecuan a la industria de procesamiento de alimentos.
Cuadro 2. Reducciones de Salmonella con distintos tratamientos germicidas. Se muestra el porcentaje de germinación al someter a la semilla durante tres diferentes tiempos (5, 10 ó 15 min) a las concentraciones (50, 100, 200 ó 300 ppm) de AEN o HS. *Se realizó una prueba de Tukey, los valores que no comparten la misma letra son estadísticamente distintos entre sí (P≤0.05). El experimento es el resultado de 3 repeticiones biológicas con 3 repeticiones técnicas cada una.
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Efecto antimicrobiano de desinfecciones consecutivas sobre Salmonella en semilla de alfalfa En concordancia con el modelo de germinación de la semilla de alfalfa establecido en el laboratorio y una vez que se determinó que el mejor tratamiento era el de AEN a 200 ppm durante 5 minutos, se decidió aplicar este tratamiento en la semilla de alfalfa antes (desinfección sencilla) y después (desinfección doble) de las 4 horas de remojo a las que es sometida la semilla previo a su germinación. La finalidad fue tratar de incrementar la reducción en población de Salmonella observada al aplicar solamente una desinfección, en especial después de un punto tan crítico como es el remojo de la semilla, en dónde se ha visto que la población
bacteriana [2].
crece
exponencialmente
Como en el caso anterior, antes de realizar el diseño del experimento, se decidió evaluar la calidad de la semilla que es sometida a la desinfección simple y doble, usando como parámetro el índice de germinación. Al igual que en el experimento de índice de germinación anterior, tampoco se encontró una diferencia significativa en el índice de germinación entre la semilla que fue desinfectada una o dos veces (Fig. 3).
100
90
A
A A
A A
Desinfección simple Desinfección doble
80
Índice de germinación*
70
60
50
40
30
20
10
0 ADE
AEN 200 ppm
HS 200 ppm
Tratamiento
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Figura 3. Índice de germinación de semilla de alfalfa después de la aplicación de la desinfección sencilla y doble con AEN e HS. Se muestra el porcentaje de germinación al someter a la semilla durante 5 min a 200 ppm de AEN o HS. *Se realizó una prueba de Tukey, los valores que no comparten la misma letra son estadísticamente distintos entre sí (P≤0.05). El experimento es el resultado con 3 repeticiones técnicas cada una.
La prueba de Tukey muestra que existe una diferencia significativa entre el AEN y el HS solamente cuando se realiza una doble desinfección, siendo el tratamiento con AEN el que elimina más células de Salmonella en la semilla de alfalfa (Cuadro 3). Cabe señalar que no se encontró en la literatura ningún reporte donde se realice una desinfección antes y después del remojo de 4 horas previas a la germinación. Usualmente los productores de germinados solo desinfectan la semilla antes de someterla al remojo previo a la germinación [9].
Cuadro 3. Reducciones de Salmonella con simple o doble desinfección. Se muestran las concentraciones recuperadas y las reducciones de Salmonella para la desinfección simple y doble con el tratamiento de 200 ppm de cloro libre durante 5 minutos. *Se realizó una prueba de Tukey, los valores que no comparten la misma letra son estadísticamente distintos entre sí (P≤0.05). El experimento es el resultado de 3 repeticiones biológicas con 3 repeticiones técnicas cada una.
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Conclusiones En el presente trabajo se estableció un modelo de laboratorio para la inoculación de Salmonella en semilla de alfalfa que incluye el uso de agua potable estéril como vehículo y un secado a temperatura ambiente durante 24 horas. Esta estrategia permitió la recuperación de poblaciones de Salmonella de ~ 6 Log UFC/gr, que permitieron evaluar el efecto germicida del AEN y del HS. Al haber evaluado los dos tipos de germicida, se observó que no existieron diferencias significativas entre el AEN y el HS, éste último comúnmente usado en la industria productora de germinados. También se observó que
prolongar los tiempos de exposición del germicida hasta 15 minutos no reduce significativamente la concentración del patógeno. Lo anterior es un punto importante, ya que los tiempos cortos, como el tiempo de 5 minutos, son preferidos en la cadena de producción de germinados. Finalmente, el desinfectar la semilla con AEN (200 ppm) no solo antes de ponerla a germinar, sino también después de las 4 horas de remojo (primer paso en el proceso de germinación) demostró ser un tratamiento más efectivo que aplicar solamente una desinfección para la reducción de Salmonella en la semilla de alfalfa. Nosotros presumimos que esta novedosa estrategia ofrecerá
mayores posibilidades al productor de germinado de alfalfa para eliminar patógenos, no sólo Salmonella, en la semilla de alfalfa y que estudios probando diferentes microorganismos son requeridos para ampliar el espectro de acción de este nuevo método. Material y Métodos
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Preparación de los inóculos de Salmonella Se utilizaron cinco cepas de Salmonella: Salmonella Typhimurium, Salmonella Montevideo, Salmonella Agona y dos cepas de Salmonella enterica, todas resistentes a 400 ppm de rifampicina. Cada una de las cepas fue inoculada por separado en un tubo con 12 mL de caldo soya trpiticaseína (suplementado con 400 ppm de rifampicina) y se incubaron a 35°C por 18 h. Posteriormente se centrifugaron a 4,500 rpm durante 15 minutos, se retiró el sobrenadante y se resuspendieron en 6 mL de SSI. Este procedimiento se repitió dos veces más. Se tomó todo el volumen de cada suspensión celular de Salmonella y se transfirió a un tubo estéril conteniendo un volumen final de 30 mL. Esta última mezcla se homogenizó durante 20 segundos. El recuento de la población inicial se realizó por el método de vaciado en placa con agar soya tripicaseína (AST) (suplementado con 400 ppm de rifampicina y 10,000 ppm de pimaricina) durante 24 h a 35°C. Selección del vehículo y método de secado para la inoculación de Salmonella en semilla de alfalfa.
En bolsas estériles con 190 mL de los vehículos a probar (agua peptonada al 0.01%, suero de caballo al 5% y agua potable), se les agregaron 10 mL de la mezcla de Salmonella (concentración celular de ~8 Log/mL) y se homogenizó. Posteriormente se añadieron 160 g de semilla de alfalfa y se dejaron reposar en la solución durante 20 minutos. Posteriormente se decantó el líquido de la suspensión y se tomaron tres muestras de 10 g de semilla y se realizaron diluciones decimales seriadas para los recuentos por el método de vaciado en placa en AST suplementado con 400 ppm de rifampicina y 10,000 ppm de pimaricina a una temperatura de incubación de 35°C durante 24 h. La semilla se sometió a dos procedimientos de secado: 1) secado de 3 h dentro de una campana de flujo laminar encendida (de acuerdo con el modelo de germinación de semilla de alfalfa utilizado en el laboratorio en un trabajo previo); 2) secado durante 24 h a temperatura ambiente (~25°C). La semilla drenada después de ser inoculada con Salmonella suspendida en los vehículos ya descritos se secó sobre una malla de contacto (tul). Después del secado, para cada método, se homogenizó la semilla y se tomaron tres muestras de 10 g para realizar el recuento de Salmonella de la manera descrita arriba. Al finalizar, la semilla se colocó en bolsas de polietileno para su almacenamiento y manejo. Preparación de las soluciones germicidas
Los germicidas AEN e HS fueron preparados a las concentraciones deseadas empleando agua destilada estéril (ADE). La preparación se hizo el mismo día en que se realizaron los experimentos. Para determinar la presencia de cloro activo en ambos germicidas, se utilizó el método de titulación yodométrica descrito por Greenberg et al. [11]. Evaluación del porcentaje de germinación de semillas de alfalfa Después de la aplicación del tratamiento se tomarón 100 semillas de cada tratamiento y se germinaron en bases de cajas Petri con papel filtro (Ahlstrom, 610 de 12.5 cm de diámetro) cubiertas con papel parafilm. A cada caja se les agregaron 2 mL de ADE y se incubaron a 22°C durante 48 h. Posteriormente se contaron las semillas que no germinaron y se determinó el porcentaje de germinación con la siguiente fórmula: % de germinación: [(Número inicial de semillas – Semillas que no mostraron germinación) / Número inicial de semillas] x 100.
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Aplicación de tratamientos de desinfección de Salmonella en semilla de alfalfa La semilla se inoculó con Salmonella tomando como vehículo de inoculación al agua potable estéril como se describió previamente. El lote fue homogenizado y almacenado en bolsas de polietileno de 10 g de semilla, cada bolsa se consideró una unidad experimental independiente (UEI). Se añadieron 50 mL del germicida (AEN o
HS) por UEI a las concentraciones y durante los tiempos de contacto elegidos. Inmediatamente después de aplicar cada uno de los tratamientos germicidas y el control, se decantó el líquido y se agregaron 90 mL de caldo neutralizador a cada UEI tratada con algún germicida y 90 mL de diluyente de peptona, en el caso del control agua. El recuento de Salmonella se realizó de la forma previamente descrita. Para el ensayo de la doble desinfección, después de haber aplicado la primera desinfección la semilla decantada se colocó en una bolsa de polietileno y se puso a remojar en agua potable durante 4 horas. Después se procedió a retirarle el sobrenadante y las UEI fueron sometidas a los mismos tratamientos y procesadas como ya se ha descrito. Análisis estadístico Se utilizó el paquete estadístico JMP 8 para todas las pruebas estadísticas. Para la variables respuesta no paramétrica como lo fue el índice de germinación se transformó el valor utilizando la raíz cuadrada del valor original. Con este valor transformado se realizó la prueba de comparación de medias de Tukey (p≤0.05). La prueba estadística utilizada para la evaluación del método de secado y la evaluación de los distintos tratamientos germicidas también fue por la prueba de comparación de medias de Tukey (p≤0.05). Lista de abreviaturas AEN: agua electrolizada neutral; HS: hipoclorito de sodio; AST: agar soya
tripticaseína; ADE: agua destilada estéril; UEI: unidad experimental independiente. Conflicto de intereses
a/Produccion%20de%20Alfalfa.pdf] 4. Hricova D, Stephan R, Zweifel C: Electrolyzed water and its application in the food industry. J Food Prot 2008, 71:1934–1947.
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. Contribución de los autores
5. Beuchat LR: Comparison of chemical treatments to kill Salmonella on alfalfa seeds destined for sprout production. Int J Food Microbiol 1997, 34:329–333.
Todos los autores contribuyeron de la misma manera a este estudio.
6. Beuchat LR, Scouten AJ: Combined effects of water activity, temperature and chemical treatments on the survival of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. J Appl Microbiol 2002, 92:382–395.
Detalles de los autores Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos (DIPA), Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro. Centro Universitario, Cerro de Las Campanas S/N Col. Las Campanas. C.P. 76010. Querétaro, Qro. Te. 442 192 1200 ext. 5507.
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