5. Tﾃｩcnicas de Anﾃ｡lisis y Manipulaciﾃｳn de ﾃ…idos Nucleicos.
OBTENCION Y PREPARACIÓN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS. La muestra celular se obtiene y prepara a partir de: Órganos tejidos fluidos biológicos
En función del objetivo perseguido: Clínico Identificación de individuos
Tipo de célula: Somática Germinal
Tipo de genoma: Nuclear Mitocondrial
Tipo de estudio a realizar: Secuencia del genoma Genes Productos génicos
En cualquiera de los caso, deben emplearse condiciones que garanticen Ia calidad de Ia muestra frente a las diversas variables que afectan a Ia fase preanalitica Recolección Anticoagulante empleado Manipulaciones para Ia conservación Transporte, etc.
En general, la preparación preliminar se hace rápidamente tras la obtención (dentro de 1 hora, como máximo 24 h), o la muestra se mantiene congelada hasta que llega al laboratorio.
Muestras de tejidos sólidos.
Normalmente se obtienen mediante biopsia (método invasivo de recogida, bajo condiciones quirúrgicas, de células o porciones de tejido de un organismo vivo, con fines diagnósticos).
Se liberan de restos de sangre, grasa o tejidos acompañantes por lavados con disolución salina fisiológica fría y se envían al laboratorio, según los casos, refrigeradas o congeladas, protegidas con hielo, nieve carbónica o nitrógeno líquido.
Muestras de suspensiones celulares. Células embrionarias (diagnóstico pre-implantación). EI óvulo fertilizado origina en el útero por sucesivas mitosis estructuras de 2, 4 y 8 células totipotentes (8 blastómeros, que forman la mérula) y luego de 16, 32 y 64 células pluripotentes; esta última estructura se llama blastocisto o blastodermo, y a partir de ella se inicia el desarrollo. Para observar si el embrión es portador de un trastorno genético se puede obtener DNA extrayendo 1 ó 2 blastómeros (que no afecta al desarrollo de las otras células de la mórula).
Líquido o fluido amniótico A partir de la primera semana de gestación, el embrión queda protegido al estar inmerso en el líquido amniótico, contenido dentro de una membrana llamada saco amniótico o amnios. La composición del líquido amniótico, cuyo volumen llega hasta 1.100 ml a término, depende de un equilibrio dinámico de intercambios con el feto y la madre, y contiene células epiteliales que aportan unos 65 ng DNA/ml. La obtención de una muestra, mediante punción abdominal a través de la pared del útero, se denomina amniocentesis.
Células de tejidos o sangre fetales
Como alternativa al líquido amniótico se utilizan muestras de vellosidades coriónicas, tejido fetal procedente del corion (membrana más externa del embrión, que contacta con la placenta). Estas constituyen la mejor fuente de DNA fetal.
Células de sangre o médula ósea adultas Las muestras de sangre periférica son las más empleadas, comúnmente de sangre venosa (unos 40 ug DNA/ml) recogida sobre anticoagulante. Se utilizan también manchas de sangre, que se obtienen de sangre fisiológica (talón, dedo...) secada sobre un papel o cartón, o bien de origen accidental (prendas, vehículos, utensilios...). La mancha se raspa y extrae por lavado con disolución salina.
Muestras bucales Los raspados y enjuagues bucales, obtenidos por métodos no invasivos, con cepillo suave o algodón y disolución salina, contienen células epiteliales de descamación con suficiente DNA genómico para su detección, previa amplificación por PCR. La saliva es de uso creciente por su facilidad de obtención (toma directa o presencia sobre la piel, sellos, colilla de cigarrillo, etc.)
Semen Contiene millones de espermatozoides (5-7% del volumen total, con 1,3 pg DNA por célula) formados en los testículos, en suspensión en una fracción liquida de secreciones de las vesículas seminales (50% en volumen), la próstata (20% en volumen), las glándulas bulborrectales y el epidídimo.
Se recoge de varias maneras: a) En preservativo, para estudios de funcionamiento del tracto genital masculino, marcadores de fertilidad, etc. b) Por aspiración directa de la vagina, para investigación criminal por agresión sexual c) Por lavado salino de manchas secas en ropa, piel, pelo, etc.
Las muestras frescas se deben analizar antes de 1h de su recogida, manteniéndolas a temperatura corporal durante su transporte. Los espermatozoides se pueden separar del resto de células (que incluyen las de la víctima, en casos de asalto sexual) mediante lisis diferencial de éstas con SDS (dodecilsulfato sódico) y proteinasa K.
Células en cultivo Las células aisladas o procedentes de tejidos u órganos disgregados se pueden cultivar en medios especiales. El cultivo celular constituye per se un área de estudio independiente, con requerimientos especializados en cuanto a equipo, procedimientos, sustratos, nutrientes y factores de crecimiento, etc.
Muestras celulares de líquidos biológicos extravasculares. Líquido cefalorraquídeo Es un fluido resultante de Ia ultrafiltración del plasma (de ahí su analogía en composición) y que recoge los productos de desecho del metabolismo cerebral. Se encuentra en dos compartimentos que recubren el cerebro y la medula espinal, comunicados entre sí: el sistema ventricular (30 ml) y el espacio subaracnoideo.
L铆quidos o derrames serosos
Se localizan en las cavidades del cuerpo que rodean los 贸rganos, delimitadas por dos membranas, la parietal (externa) y Ia visceral (interna, superficie del 贸rgano).
Liquido articular o sinovial
Es un ultrafiltrado del plasma, viscoso, con un alto contenido en proteínas y ácido hialurónico, localizado en la cavidad articular para conferir un carácter lubricante frente a la fricción propia de las articulaciones durante el movimiento.
Muestras biológicas menos habituales Pueden contener células y, por tanto, DNA, una serie de muestras de interés en casos concretos: Humor acuoso (cámara anterior del ojo) Humor vítreo (detrás del iris) Lagrimas Endolinfa (tubo espiral del oído interno) Perilinfa (canales del equilibrio) Moco cervical Líquidos folicular, oviductal y vaginal Heces Secreciones nasales Uñas, etc.
DISOCIACION DE LA MUESTRA TISULAR
En los tejidos, las células se encuentran atrapadas en una organización tridimensional, con interacciones o adhesiones tanto entre ellas como con la matriz extracelular (gel hidratado formado por fibras proteicas, como colágeno, y cadenas glucídicas complejas).
El mejor rendimiento en cuanto a disociación de células pueden señalarse tres estrategias: Fragmentación mecánica: Mediante corte, troceado o triturado de la muestra. Disgregación química: La rotura de la matriz extracelular y de las uniones intercelulares se suele realizar por homogeneización isotónica o por sonicación (exposición a ultrasonidos, ondas sonoras o acústicas no percibidas por el oído humano por poseer una frecuencia superior a 20 kHz), generalmente en presencia de detergentes (iónicos, como el dodecilsulfato sódico o SDS, o no iónicos, como Tween-20 y Triton X-100). La eliminación de cationes divalentes, en especial el Ca2+ (con agentes quelantes como EDTA). Digestión enzimática: Las proteínas de la matriz se digieren con proteasas como colagenasa, proteinasa K, pepsina o tripsina. Dependiendo del tipo de muestra, esta digestión puede requerir largos tiempos de incubación (por ejemplo, células en cultivo o raíces de pelo).
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR SOLUBILIDAD EN FASES INMISCIBLES En general, dada su complejidad macromolecular, los ácidos nucleicos son difíciles de separar de los componentes de membrana, proteína residual o añadida (tales como las enzimas de restricción) y otras moléculas solubles (por ejemplo, polisacáridos), Los métodos drásticos alteran sus estructuras y sus características. De ahí que sean muchos los métodos suaves elaborados para eliminar la impureza de las preparaciones, todos ellos basados en las propiedades físico-químicas del ácido nucleico. Para la eliminación de proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas, como la proteinasa K.
Los métodos drásticos alteran sus estructuras y sus características. De ahí que sean muchos los métodos suaves elaborados para eliminar la impureza de las preparaciones, todos ellos basados en las propiedades físico-químicas del ácido nucleico. Para la eliminación de proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas, como la proteinasa K. Extracción del DNA El protocolo básico consiste en el tratamiento del homogenado con disolventes orgánicos (fenol, cloroformo o ambos).
ANALISIS DIRECTOS DEL DNA
Electroforesis Esta técnica se basa en la capacidad de las macromoléculas cargadas para desplazarse en un campo eléctrico, con velocidad proporcional a su carga e inversamente proporcional a su tamaño. Las moléculas de DNA poseen, al pH alcalino habitual, una carga negativa uniforme por unidad de masa, lo que hace que su movilidad hacia el ánodo (+) solo venga determinada por el tamaño de la molécula (número de pares de bases, si es lineal).
Detección del DNA tras su separación (“revelado”)
Una vez separadas, las moléculas de DNA se visualizan normalmente por la fluorescencia de distintos compuestos que se unen a ellas. Aunque el más utilizado es el bromuro de etidio, va siendo sustituido por otros fluorocromos con mayor poder de detección o menor toxicidad.
Tecnología del DNA recombinante (Clonación celular) El método clásico de clonación de ácidos nucleicos es el que aprovecha la capacidad de las células para replicar el DNA. Surge gracias a la aparición de una serie de técnicas que permiten el aislamiento del DNA y al descubrimiento en los años 70 de las enzimas de restricción, que hace posible en el laboratorio clonar el DNA e incorporar los fragmentos a vectores, que a su vez se introducen en células anfitrionas, donde tiene lugar su replicación.
ENZIMAS DE RESTRICCION Aunque estas enzimas desempeñan una función propia en las células procariotas en las que se descubrieron, son particularmente importantes por su empleo experimental en varias áreas de la Biología Molecular, de interés tanto básico como aplicado al diagnóstico clínico. En especial, se utilizan en el proceso de la clonación molecular del DNA, Además, tienen aplicación en otras técnicas, como la secuenciación del genoma y el estudio de los polimorfismos. Se inicia el estudio de estas enzimas con un breve recordatorio de las nucleasas en general.
Nucleasas Se denomina de forma genérica nucleasa a cualquier enzima con capacidad de escindir los enlaces fosfodiéster de Ia cadena polinucleotidica de los ácidos nucleicos; son, por tanto, fosfodiesterasas. Su especificidad puede analizarse con respecto a tres criterios:
1. Escisión en posiciones internas o terminales en la estructura primaria (endonucleasas y exonucleasas, respectivamente):
1. Escisi贸n en posiciones internas o terminales en la estructura primaria (endonucleasas y exonucleasas, respectivamente):
2. Actuaci贸n sobre uno de los dos tipos de enlace fosfo茅ster:
3. Reconocimiento de nucle贸sidos, bien por Ia pentosa o bien por Ia base nitrogenada (solo en algunas nucleasas) desoxirribonucleasas o DNasas, que act煤an solo sobre DNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RNA finalmente, algunas nucleasas distinguen entre nucle贸sidos purinicos y pirimidinicos:
Enzimas de restricción. Las enzimas de restricción se Ilaman también nucleasas de restricción, endonucleasas de restricción y, en ocasiones, enzimas restrictivas o restrictasas.
Se nombran con tres letras tomadas del género y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria), y finalmente por un número romano que las identifican en el caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad:
La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad de reconocimiento de una secuencia corta de DNA dúplex y la consiguiente hidrólisis de un enlace fosfodiéster en cada hebra, justamente en secuencias concretas del DNA llamadas sitios de reconocimiento o de restricción. Los fragmentos de DNA originados son útiles para iniciar la clonación celular o acelular, para el análisis de DNA, para elaborar mapas físicos de restricción, para la detección de polimorfismos, etc.
Las diversas enzimas de restricci贸n se agrupan normalmente en tres familias, de acuerdo con sus propiedades:
Acción de las enzimas de restricción de tipo II
Las enzimas de tipo II, son las mas usadas pues, al clonar en secuencias muy definidas, son las utilizadas como herramientas en ingeniería genética.
Son éstas las restrictasas estructuralmente más simples y las mejor estudiadas por su utilidad en Ingeniería Genética, a modo de “tijeras” para el corte del DNA.
EI sitio de restricción es a Ia vez Iugar de reconocimiento y de hidrolisis.
Se hidrolizan de forma muy específica enlaces fosfoéster del DNA, uno en cada hebra, generándose dos fragmentos de restricción. EI enlace hidrolizado es siempre el 3'-P, por lo que el fosfato queda unido a 5’, dejando en ambos fragmentos extremes 3'-OH y 5’-P. La reacción no necesita ATP, lo que la diferencia de la catalizada por las enzimas de tipo I y III.
CLONACION CELULAR DE MOLECULAS DE DNA EI objetivo central de esta clonación es la producción de un gran número de copias de una región de DNA. Se trata, por tanto, de un proceso de clonación de tipo celular (pues se consigue gracias al empleo de células) que, por contraposición a la clonación acelular por PCR, in vitro, se puede considerar que se realiza in vivo (estrictamente hablando, en cultivo).
Se basa esta clonación, al igual que Ia PCR, en Ia realización de múltiples rondas de replicación, pero en este caso catalizadas por la DNA polimerasa propia de la célula en la que se lleva a cabo el proceso, célula “anfitriona”. Para ello, el fragmento de DNA a clonar (llamado inserto) se une a otro DNA (vector de clonación), y la molécula de DNA recombinante formada se incorpora a Ia célula anfitriona donde tiene lugar la amplificación por replicación.
Una vez detectada la presencia del DNA de interés y seleccionados los clones que lo han amplificado, se aísla el gen o fragmento de DNA, que se emplea con distintos fines, esencialmente el estudio de características físicas, secuencia, estructura, propiedades funcionales, expresión génica a proteínas, etc. (muchos de estos objetivos pueden ser aplicables también a la PCR o clonación acelular).
Tipos de vectores.
Plásmidos.
Son moléculas de DNA de doble hebra, de pequeño tamaño (2-5 kb) y forma circular, presentes en forma libre en el citosol de muchas bacterias (de 1 a 3.000 plásmidos/célula) y de algunos eucariotas unicelulares.
Bacteriófagos. Los bacteriófagos (también llamados fagos) son virus que infectan exclusivamente a bacterias. Los virus en general se replican mediante la introducción de su genoma en células procariotas o eucariotas (infección). Esta propiedad resulta útil para conseguir una alta eficiencia de clonación, empleando como vectores virus mordicados. Cada tipo de virus infecta a células específicas y, dependiendo del tamaño del genoma vírico, admite insertos más o menos grandes, pero en general mayores que los que se pueden insertar en plásmidos.
Así, para clonar en bacterias se usan bacteriófagos.
Cósmidos
Son vectores sintéticos, quimeras que combinan características de plásmidos y fagos para combinar las ventajas de ambos tipos de vectores. EI fragmento plasmídico proporciona las características de tamaño pequeño (5-7 kb). Del fago se toman las secuencias “cos” (del inglés cohesive sites), que proporcionan al cósmido la capacidad, propia del DNA del fago, de ser empaquetado en cápsidas víricas in vitro.
Cromosomas artificiales Este tipo de vectores se han diseñado en especial para adaptarse al gran tamaño de insertos requeridos en el caso del genoma humano y de otros mamíferos, y para la clonación en células eucariotas.
a) Cromosomas artificiales bacterianos: Se les llama comúnmente BACS (bacteriaI artificial chromosomes). Se trata de vectores sintéticos derivados del plásmido F o el fago P1. Se caracterizan, en primer lugar, por aceptar grandes insertos de DNA, entre 100 y 300 kb.
b) Cromosomas artificiales de levadura:
Los YACs (yeast artificial chromosomes) son vectores sint茅ticos que contienen las tres regiones relacionadas con la funcionalidad de un cromosoma; secuencias constituyentes de un centr贸mero, de dos tel贸meros y de un origen de replicaci贸n.
GENOTECAS
Se llama gen茅ricamente genoteca o biblioteca de DNA a una colecci贸n de clones formados a partir de todos los fragmentos de DNA obtenidos previamente por escisi贸n del genoma de una especie o de un tejido.
PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)
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KARY MULLIS,1985.
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ESTA TÉCNICA PERMITE AMPLIFICAR, A GRAN ESCALA, REGIONES ESPECIFICAS DEL ADN.
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SE BASA EN EL USO DE OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS QUE SON COMPLEMENTARIOS A SECUENCIAS QUE FLANQUEAN UNA REGIÓN ESPECIFICA DEL ADN MOLDE
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POR MEDIO DE CICLOS DE AMPLIFICACIÓN REPETIDOS, ES POSIBLE OBTENER REGIONES DISCRETAS DEL ADN.
PASOS FUNDAMENTALES DE LA PCR • DESNATURALIZACIÓN: 94° C. • APAREAMIENTO: INICIADOR O PRIMER Y ES UN OLIGONUCLEÓTIDO DE 15 A 30 BASES NUCLEOTÍDICAS. 4565°C.
• EXTENSIÓN: POLIMERIZACIÓN, EN DIRECCIÓN 5’ A 3’ POR MEDIO DE UNA ADN POLIMERASA Y DESOXIRRIBONUCLEÓSIDOS TRIFOSFATADOS (dNTPs). 72° C.
COMPONENTES DE LA PCR •
ADN BLANCO (MOLDE, OBJETIVO O PLANTILLA).
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INICIADORES (PRIMERS): SON FRAGMENTOS DE ADN SINTÉTICOS (OLIGONUCLEÓTIDOS) QUE SON HOMÓLOGOS COMPLEMENTARIOS A UNA REGIÓN DEL ADN MOLDE.
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ENZIMAS POLIMERASAS TERMOESTABLES: THERMUS AQUATICUS (TAQ) Y T. TERMOPHYLLUS (TTH).
COMPONENTES DE LA PCR •
DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS DE TRIFOSFATO (dNTPs): LA ADN POLIMERASA INCORPORA DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS AL FORMAR UN ENLACE FOSFODIÉSTER ENTRE EL GRUPO –OH LIBRE EN EL EXTREMO 3’ DE LA CADENA NACIENTE Y EL GRUPO FOSFATO 5’ DEL dNTP.
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EL AMORTIGUADOR: LA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA ESTÁNDAR PARA LA PCR CONTIENE KCl 50 mM, TRIS-HCL 10 mM, PH 8.4, MgCl2 1.5 mM Y GELATINA EN CONCENTRACIÓN DE 100 g/ml.