CBEIH - Relatório Soft Tissues by Gabriela Rabelo

2013

Relatórios técnicos Soft Tissues: Pé e Bisso

I. Caracterização biológica II. Caracterização físico-química III. Coleta e preparo de amostras

GT343 Controle do mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas.

(pรกgina deixada em branco intencionalmente)

RELATÓRIOS TÉCNICOS SOFT TISSUES: PÉ E BISSO

Este documento constitui um conjunto com três relatórios técnicos sobre o conjunto de tecidos moles do mexilhãodourado, referentes ao Projeto “GT343 – Controle do Mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas”, realizada durante os anos de 2012 e 2013.

BELO HORIZONTE, 11 DE NOVEMBRO DE 2013

2013 Relatório técnico Soft Tissues

CENTRO DE BIOENGENHARIA DE ESPÉCIES INVASORAS DE HIDRELÉTRICAS (CBEIH)

través de uma rede que conecta empresas e o governo, sob a liderança da Cemig, o Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas busca soluções para amenizar os impactos ecológicos, industriais e econômicos causados por espécies invasoras. A proliferação descontrolada destes organismos acaba eliminando outras espécies nativas e comprometendo atividades humanas que dependem de recursos naturais, como agricultura, pecuária e geração de energia hidrelétrica.

Por que o CBEIH foi criado?

Como o CBEIH funciona? Atuando nas frentes de Bioengenharia, Modelagem e Monitoramento Ambiental, o CBEIH tem por objetivo amenizar e combater os impactos ecológicos, industriais e econômicos causados por espécies invasoras.

Quem são os parceiros do CBEIH? O CBEIH é o resultado de uma união entre o CETEC e a Cemig, com a gestão financeira da Fundep.

A proliferação descontrolada destes organismos acaba eliminando outras espécies nativas e comprometendo atividades humanas que dependem de recursos naturais, como agricultura, pecuária e geração de energia hidrelétrica.

Av. José Cândido da Silveira, 2000 Horto - Belo Horizonte (MG) www.cbeih.org / contato@cbeih.org

UFMG | CENTRO DE MICROSCOPIA

CONHECER ESPÉCIE

MICROSCOPIA

bioengenharia comunicação científica

DIVULGAÇÃO CIENTÍFICA

EXPERIMENTOS

LABORATÓRIO

CULTIVO DE MEXILHÕES

COLETA EM CAMPO

CONVERGIR PESQUISADORES

modelagem

MODELOS DE DISTRIBUIÇÃO

WEBSITE

base colaborativa de dados

monitoramento

ÁREAS INFESTADAS

ÁREAS DE RISCO

UHE CEMIG

CONTROLE E ERRADICAÇÃO

PREVENÇÃO E CONTENÇÃO

Fig. A Diagrama das áreas de atuação do CBEIH. Para saber mais, acesse www.cbeih.org. Fig. B Mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei) aderido ao substrato natural. Esta espécie de molusco bivalve é invasora nos ecossistemas brasileiros e é causador de diversos problemas de ordem ecológica, econômica e social e tornou-se especialmente danoso para o funcionamento das hidrelétricas.

INTRODUÇÃO O mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei), molusco bivalve da família Mytilidae, é originário dos dois maiores rios da China, o Yantsé e o Pearl. Introduzido no Japão e em Hong Kong, foi disseminado por grande parte do sudeste asiático. Possui características de colonizador invasivo bem sucedido: curto período de vida, crescimento acelerado, altas taxas de fecundidade e ampla tolerância fisiológica aos fatores abióticos. Sua introdução no continente sul americano se deu provavelmente na água de lastro de navios cargueiros. Observado inicialmente na Argentina em 1991 (Pastorino et al 1993), entra no Brasil pelo rio Paraguai, na região do Pantanal, em 1998 (Oliveira et al 2003). Segundo Barbosa (2009), a competição com as comunidades nativas, a diminuição da turbidez da água, alterações na ciclagem de nutrientes, redução do fitoplâncton e o aumento das macrófitas aquáticas foram alguns dos problemas que surgiram com a introdução do mexilhãodourado no ecossistema. Além desses fatores relacionados à ecologia, esse bivalve tem uma importância econômica muito grande para o país. Ele obstrui tubulações e motores de usinas hidrelétricas, adere às grades que permitem a passagem de água e reduz o fluxo da mesma. Os custos anuais para a remoção de tais animais são muito elevados e cerca de R$ 10 milhões de reais já foram investidos em pesquisas pela Cemig (PASINI, M., 2011).

1 Fig. 1 - Mexilhão-dourado jovem (3mm) com o pé exposto (imagem obtida com Lupa óptica). O pé se revelou uma importante estrutura na constituição do bisso

Inicialmente, o projeto propôs estudos compartimentalizados de cada estrutura componente do organismo Limnoperna fortunei. Porém, na medida em que avançamos na compreensão destas estruturas, a relação intrínseca entre estas se mostrou patente. Impossível compreender a construção do bisso como estrutura isolada; sem relacioná-la à organização cito-histológica do pé e as propriedades morfo-fisiológicas deste, perde-se todo o vasto universo de informações definidas pelo contexto. Da mesma forma, o pé conecta-se ao sistema muscular e nervoso do mexilhão dourado, atuando não só como membro locomotor (como o nome “pé” sugere) mas também como órgão táctil, cuja sensibilidade aos estímulos físicos e químicos funciona como interface sensória entre o organismo e o meio ambiente. Estes estudos também revelaram o papel fundamental desta estrutura na formação do bisso: através de um canal na porção ventral do pé encontra-se um canal por onde migram secreções mucosas ali produzidas para que seja formado o bisso. Assim, frente aos resultados parciais do projeto, e às mais recentes pesquisas em âmbito internacional, o CBEIH optou por dividir o mexilhão dourado em duas grandes categorias de materiais: • SOFT TISSUES: termo utilizado na Engenharia de Materiais e de Tecidos para designar aqueles tecidos orgânicos tidos como “macios”, devido à sua constituição, organização e à acentuada presença de água. No caso do mexilhão-dourado, soft tissues compreende pé (e naturalmente o bisso), tecido muscular, nervoso, brânquias, gônadas, glândulas, tecidos de armazenamento e metabolismo, etc. • HARD TISSUES: como esperado, abrange aqueles tecidos cuja composição se dá, majoritariamente, por componentes biomineralizados, como fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, derivados do silício, do ferro, etc. No mexilhão-dourado, essa categoria é representada pela concha, composta quase exclusivamente por polimorfos de carbonato de cálcio (calcita e aragonita), organizados em camadas com diferentes organizações arquitetônicas. Entretanto, é importante ressaltar, que mesmo dentro da categoria hard tissues, encontramos, em porcentagens pequenas (1 a 5%) matriz orgânica, composta principalmente por água (na forma de géis) e proteínas. A matriz orgânica atua como scaffold, onde a matriz mineral é depositada por meio de processos celulares e físico-químicos. A importância deste estudo reside no fato de que compreendendo a relação e a atuação das estruturas, estudos posteriores podem buscar estratégias efetivas para controlar processos como o de adesão, e interromper o biofouling por L. fortunei.

FORMAÇÃO E CONSTITUIÇÃO DO BISSO Os membros da família Mytilidae são capazes de secretar uma estrutura chamada bisso, estrutura de fixação formada por um apêndice muscular conhecido como pé (BRAZEE e CARRINGTON, 2006). Dentre várias possibilidades, o processo de formação do bisso mais bem aceito, foi proposto, inicialmente, por Brown, em 1952, para o mexilhão Mytilus edulis. Porém, avanços na Ciência dos Materiais, somados auma compreensão aguçada dos mercanismos biológicos, proporcionam um ponto de vista inovador, onde os processo são observados e inferidos no contexto ambiental e orgânico. As estruturas fazem parte de um todo, e funcionam em consonância neste; uma ótica reducionista limitaria a apreensão desse todo. Percebemos, hoje, que a produção do bisso é um processo complexo, onde processos menores acontecem simultaneamente em locais distintos do pé. E que esses processos menores também são desencadeados em etapas, reguladas por mecanismos físicos (tensão superficial, diferença entre densidades, polaridade) e químicos (ação enzimática, polimerização, oxi-redução, etc.).

Fig. 2 - Filamentos de bisso observados através de microscopia óptica.

Fig. 3 - Mexilhão-azul Mytilus edulis FONTE: www.wikipedia.com.br

O bisso é um conjunto de polímeros secretados pelas glândulas do pé, e pode ser divido em três partes: uma raiz fibrosa ligada aos músculos retratores do bisso; uma haste que se extende da raiz, composta por bainhas sobrepostas; emaranhados fibrosos que se projetam individualmente de cada bainha. Os fios de bisso, por sua vez, são produzidos na canaleta ventral do órgão podal do mexilhão. Eles são compostos por um eixo interior flexível de colágeno revestido por uma proteína polifenólica curada e endurecida, que compõe a cutícula bissal. Acredita-se que a proteína em questão envolva um processo de quinonatanagem com uma enzima catecol oxidase específica. O tipo proteico depende do gênero e da espécie do animal, por exemplo, a Mefp-1 (Mytilus edulis foot protein-1) para o mexilhão-azul, Mytilus edulis, e a Lffp-1 (Limnoperna fortunei foot protein-1) para o mexilhão dourado Limnoperna fortunei (BROWN, 1952; SILVERMAN, ROBERTO, 2007). Todo o conjunto é coberto por uma cutícula polimérica que evita a degradação por fungos e bactérias. A adesão entre o bisso e o substrato se dá em escala nanométrica, por interações do tipo capilaridade e forças de van der Waals (MEYERS, 2009), permitindo que o mexilhão se fixe em praticamente qualquer substrato sólido, de pedras, troncos e conchas de outros moluscos a cascos de barco, redes de pesca e placas de vidro.

ALGUNS GÊNEROS DE MOLUSCOS PERTENCENTES À FAMÍLIA MYTILIDAE Amygdalum (pearly-mussels) (a) Arcuatula (bag-mussels) (b) Austromytilus (beaked-mussels) (c) Brachidontes (mussels) (d) Gibbomodiola (horse-mussels) (e) Gregariella (mussels) (f) Limnoperna (mussels) (g-i) Modiolus (horse-mussels) (j) Musculus (mussels) (k-l) Mytilus (mussels) (m) Fig. 4 - Alguns gêneros de moluscos da família Mytilidae. FONTE: www.molluscsoftasmania.net / Copyright Simon Grove

1.0 mm

Fig. 5 - Pé do mexilhão-dourado com bissos em sua base (MEV, 50X)

UNIDADE I

Coleta e Preparo

de Amostras

OBJETIVOS

• Coletar e manter, em laboratório de cultivo, indivíduos saudáveis, para realização períódica de testes diversos;

• Coletar amostras de bisso para a realização de análises estruturais, de composição, de natureza físico-química e biológica;

• Coletar e preparar amostras de pé, com todas as estruturas preservadas e fixadas por diferentes técnicas, para observação;

• Produzir artigos e relatórios para publicação em periódicos especializados e divulgação científica.

Mexilh達o aderido ao substrato natural.

MÉTODO COLETA E MANUTENÇÃO DOS INDIVíDUOS A coleta se dá periodicamente, durante as atividades de monitoramento, nas represas das UHE de São Simão e Volta Grande. Os indivíduos encontrados em substratos diversos (bóias de sinalização, pedras e estruturas de concreto) são retirados manualmente, por raspagem com espátula ou arranque, de forma a preservar, o quanto possível, os agregados de organismos. Estes agregados são imediatamente lavados no mesmo local de coleta, a fim de retirar o restante de substrato acumulado entre os indivíduos. A metodologia utilizada implica na destruição de muitos fios de bisso, mas quantidade suficiente é preservada ao manter os agregados. Os mexilhões são então acomodados em caixas plásticas aeradas, contendo água do local da coleta. Para aumentar a taxa de sobrevivência dos mexilhões durante a viagem de volta ao CETEC (Belo Horizonte, MG), a temperatura da água é reduzida pela adição de escamas de gelo. O objetivo é reduzir as taxas metabólicas dos organismos transportados, diminuindo a liberação de metabólitos na água e o estresse relacionado à remoção e o transporte.

Fig. 6 e 7 - Os mexilhões-dourados são coletados em substratos artificiais e naturais, como bóias de navegação (Fig. 6) e paliteiros (Fig. 6).

Fig.9 Alimentação dos Mexilhões por técnico de laboratório capacitada. Fig. 10 Aquários de cultivo da espécie.

No CETEC, os mexilhões são novamente lavados e distribuídos em aquários previamente preparados, com água declorada, temperatura aproximada de 19 oC e pH semelhante àquele do ambiente natural onde foram coletados. O laboratório é monitorado a fim de manter as propriedades físicas da água semelhantes àquelas encontradas na natureza. O bisso produzido pelos mexilhões-dourados

nos aquários também foi utilizado nos referidos testes e apresentou, por motivos desconhecidos, diferenças significativas na cor, espessura e resistência à tração. Os mexilhões foram mantidos em aquário no laboratório de cultivo do CBEIH e alimentados com ração e algas, com aeração constante e temperatura controlada.

a partir da experiÊncia adqUirida no cUltiVo em laboratÓrio do mexilHÃo-doUrado neSte p&d, Foi elaborado Um proJeto de laboratÓrio de cUltiVo aUtomatiZado, capaZ de oFerecer condiÇÕeS ainda melHoreS para oS experimentoS Já realiZadoS pelo cbeiH, alÉm de permitir qUe noVoS experimentoS qUe medirÃo, por exemplo, a inFlUÊncia do FlUxo, do material daS tUbUlaÇÕeS e doS SUbStratoS na FixaÇÃo do mexilHÃo-doUrado.

Fig. 11, 12 E 13 - Mexilhões-dourados jovens, com pé e outros tecidos moles expostos, vistos por meio de Lupa óptica.

SELEÇÃO DE ANIMAIS E RETIRADA DO BISSO Foi realizada uma seleção aleatória para a dissecação, processo que consiste na abertura das valvas e retirada do bisso. Com o auxílio de um bisturi, duas seringas e também uma pinça para a abertura da concha do animal, foi possível coletar 14 bissos inteiros; essas amostras foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5ml, identificadas e refrigeradas. Alguns bissos foram retirados de animais vivos, outros de animais mortos e alguns foram coletados de emaranhados soltos no aquário. Esse processo não alterou na qualidade das amostras selecionadas. Iniciou-se então a observação das amostras na Lupa - Estereomicroscópio Motic - para a verificação da integridade e nível de limpeza das 14 amostras.

COLETA DE BISSO E TECIDOS MOLES Várias amostras de bisso foram utilizadas nos testes realizados. Fios de bisso preservados produzidos em condições naturais foram coletados nos animais trazidos de campo. Quando comparados qualitativamente com os fios de bisso produzidos em laboratório, o bisso produzido em condições naturais se mostra mais escuro e mais resistente, com maior diâmetro na secção transversal do fio. Em laboratório, dois métodos de coleta de bisso foram empregados: o primeiro consistiu em coletar amostras produzidas espontaneamente pelos organismos nos aquários. Nesse método, pode-se perder a placa adesiva ou a raiz do feixe de bissos, já que a retirada do indivíduo se dá abruptamente, sem controle apropriado; o segundo método empregou o uso de indivíduos aleatoriamente selecionados, depositados em béqueres aerados, cuja parede foi coberta com lâminas de vidro, usualmente empregadas em microscopia ótica. O espaço limitado e a aeração ostensiva acentuaram o comportamento padrão dos organismos mantidos em cativeiro, que tendem a se deslocar ao longo das paredes dos aquários, fixando-se por meio dos bisso na linha d’água, preferencialmente perto do aerador.

PRESERVAÇÃO E FIXAÇÃO DAS ESTRUTURAS Após a extração, os soft tissues foram fixados em solução de karnoviski ou glutaraldeído, desidratadas em banhos sucessivos de álcool em diferentes concentrações. Os protocolos de produção e uso das soluções de fixação são descritos nas páginas seguintes.

CONTAGEM DOS FIOS DE BISSO Com as 14 amostras identificadas, foi realizada a contagem dos fios de cada bisso, com o auxilio de uma lupa, de seringas para separar os fios e de água para mergulhar as amostras e retirar assim resíduos das estruturas. As 14 amostras foram contadas totalizando 4.402 fios, que foram separados em uma tabela pelos seguintes critérios: 1. fios inteiros: aqueles que estavam completos, ou seja, com placas adesivas e foram cortados bem próximos da haste. 2. fios sem placa adesiva: aqueles que estavam arrebentados, porém não muito próximos à haste. 3. fios muito arrebentados: aqueles que estavam arrebentados próximos da haste.

Fig. 14 Fotomicrografia de fios do bisso, parte próxima à haste. Pode-se visualizar a disposição dos fios agrupados com diferentes diâmetros.

Fig. 15 Fotomicrografia de fios do bisso, parte próxima à placa adesiva. Pode-se visualizar a disposição dos fios agrupados com diferentes diâmetros.

CONCLUSÃO A remoção e o protocolo de transporte possibilitaram a sobrevivência da grande maioria dos indivíduos coletados. Assim, amostras variadas de bisso permaneceram viáveis mesmo após a viagem e o período de adaptação aos aquários. Além disso, novas amostras de bisso foram produzidas no laboratório de cultivo. Os indivíduos produzem bisso para se fixarem nos aquários, principalmente próximos à lâmina d’água e na região do aerador, mas também produziram bisso em situações induzidas, dentro de béqueres previamente revestidos com lâminas de microscopia.

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500 Âľm

Fig. 16 Bisso e placa adesivo produzidos pelo mexilhĂŁo-dourado em MEV

UNIDADE II

Caracterização

Biológica

OBJETIVO â&#x20AC;˘ Caracterizar biologicamente as amostras de bisso de L. fortunei, obtidas anteriormente pelo grupo.

métodos Seleção de bissos para registro das imagens Após a limpeza dos bissos coletados para retiradas de resíduos aderidos principalmente nas placas adesivas, foram selecionadas três unidades para a aquisição das imagens, escolhidas devido o nível de limpeza e integridade das estruturas do bisso. Para isso foi realizada uma criteriosa verificação nas amostras para que a qualidade das imagens fosse a melhor possível.

Obtenção das micrografias ópticas e eletromicrografias de varredura A aquisição das imagens foi realizada por meio de lupa e do programa de captura de imagens MOTIC Imagens® que permite a análise completa da amostra através de ferramentas de medidas que podem ser alteradas e adaptadas para o tipo de trabalho desejado. Os bissos foram registrados primeiramente inteiros em um aumento de 10x, para visualização da estrutura íntegra. Em seguida, foram cortados todos os fios de cada bisso e colocados em ordem crescente, para melhor visualização das estruturas. Esses fios foram distribuídos no máximo em 11 grupos e identificados. Para cada parte do bisso, foram adquiridas duas imagens: uma próxima a haste e a outra próxima a placa adesiva. Essas imagens foram registradas em um aumento que variou entre 30x a 50x de maneira a facilitar o momento da mensuração dos fios. Durante o processo de captura das imagens, foi necessário adicionar gotas de água na amostra para diminuir a repulsão eletrostática entre os fios e a pinça utilizada para manusear a estrutura. Após a aquisição das imagens, iniciouse o processo para realizar a medida do diâmetro de cada fio. Em cada imagem, procurou-se contar o maior número de fios possíveis, quando foi registrado um total de 708 fios entre próximos a haste e próximos da placa adesiva. É importante salientar que o número atribuído a cada fio de bisso na parte próxima da haste não corresponde ao número do fio de bisso da parte próxima da placa adesiva. Isso ocorreu porque cada grupo foi dividido em duas partes diferentes. Para as eletromicrografias de varredura, as amostras foram devidamente preparadas seguindo protocolos padrões do CM-UFMG: fixação em solução Karnovisk, desidratadas, impregnação com tetróxido de ósmio e secagem em ponto crítico (CPD). Em seguida foram montadas nos porta-amostras e pulverizadas com ouro. As imagens foram obtidas por microscopia eletrônica de varredura, no Centro de Microscopia da UFMG e no CBEIH.

Mensuração dos registros Para iniciar a mensuração foi necessário determinar uma distância de 0,85mm a partir da placa adesiva, pois o fio de bisso de Limnoperna fortunei possui regiões morfologicamente distintas. A região próxima da placa adesiva tende a apresentar maior diâmetro de secção transversal que a região próxima da haste. Para medir o diâmetro foram utilizadas as imagens capturadas pelo programa de aquisição MOTIC Imagens®, procurando medir o maior número possível de fios. Fios e placas adesivas também foram mensuradas através de eletromicrografias de varredura com auxílio do software que acompanha o MEV Tescan Vega III.

RAIZ E HASTE A raiz (Fig. 20, 22, 23) é uma estrutura originária da glândula do bisso, a qual se abre na junção do pé com a massa visceral. Ela é composta de um material fino disposto em lâminas que, ao ser secretado por essa glândula, passa por um processo de compressão e dobramento (BROWN, 1952). Esse processo resulta em um cilindro, a haste (Fig. 17, 18, 19, 21, 22). Um eixo recém-moldado de lâminas empacotadas é, então, revestido por um material produzido no topo da glândula em questão (mouth of the gland). A partir desse ponto, a raiz muda de nome, passando agora a ser conhecida por haste (BROWN, 1952). Conforme mais material é secretado e forçado a sair da glândula bissal, o diâmetro e o comprimento da haste aumentam. Desse modo, conclui-se que a parte mais antiga dessa estrutura é a que está mais longe do corpo do animal (BROWN, 1952).

Fig. 17 - Fotomicrografia de um corte transvesal do pé do mexilhão dourado. É possível visualizar a inserção do pé nos músculos, os fios do bisso, a haste e a raiz. Fonte: CBEIH.

500 µm

Fig. 18 - Complexo bissal (raiz, haste, fios e placas adesivas) inserido no pé de Limnoperna fortunei. FONTE: CBEIH.

Fig. 19 - Detalhes do corte transversal do pé do Limnoperna fortunei evidenciando a raiz e a haste e como estão inseridas na estrutura podal. FONTE: CBEIH.

Fig. 20 - Micrografia destacando a raiz da haste. FONTE: CBEIH.

500 µm Fig. 21 Complexo bissal de Limnoperna fortunei (MEV, 275X). FONTE: CBEIH Fig. 22 Detalhe da junção raiz-haste do mexilhão dourado (MEV, 1,49kx). FONTE: CBEIH Fig. 23 Detalhe da raiz do bisso do Limnoperna fortunei (MEV, 912X). FONTE:CBEIH

100 µm 22

100 µm 23

1.0 mm

24 Fig. 24 Bissos (MEV, 141X). FONTE: CBEIH Fig. 25 Detalhe de placas adesivas fusionadas (microscopia óptica). FONTE: CBEIH. Fig. 26 Discos adesivos em detalhe na porção distal dos fios (MEV, 160X). FONTE: CBEIH Fig. 27 Medida de discos adesivo na porção distal dos fios (MEV, 790X). FONTE: CBEIH

FIOS FIBROSOS E PLACAS ADESIVAS Os fios de bisso são produzidos em um sulco ventral presente no órgão do pé do mexilhão (Fig. 21, 24, 25 e 26). Já as placas adesivas são formadas na região mais distal do pé, a qual se assemelha a uma ventosa (Fig. 25, 26, 27). Eles são compostos por um eixo interior flexível de colágeno revestido por uma proteína polifenólica curada e endurecida. Acredita-se que a proteína em questão envolve um processo de quinonatanagem com uma enzima catecol oxidase específica e seu tipo depende do gênero e da espécie do animal, sendo a Mefp-1 (Mytilus edulis foot protein-1) para o mexilhão azul Mytilus edulis e Lffp-1 (Limnoperna fortunei foot protein-1) para o mexilhão dourado (BROWN, 1952; SILVERMAN e ROBERTO, 2007). Ao serem formados, os fios devem ser unidos a haste e conforme a raiz e a haste aumentam de tamanho, os fios vão sendo levados para mais longe da base dessas estruturas. Com isso, conclui-se que a porção mais distal do bisso é também o local mais antigo desse complexo (BROWN, 1952) (Fig. 26 e 27). A placas adesivas são formadas por um acúmulo de proteínas no órgão do pé. Uma série desses proteínas foi identificada para Mytilus edulis, como Mefp-1, Mefp-2 (exclusiva dos discos adesivos), Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, Mefp-6. Todas elas apresentaram L-DOPA (L-diidroxifenilalanina), seja em maiores ou menores quantidades (SILVERMAN e ROBERTO, 2007).

500 µm

200 µm

1.0 mm

Fig. 28 Bisso e disco adesivo com cutícula (MEV, 1040X). FONTE: CBEIH

Fig. 29 Superfície aderente do discos adesivo (MEV, 486X). FONTE: CBEIH

Fig. 30 Detalhe da cutícula (MEV 3880X). FONTE: CBEIH.

CUTÍCULA Segundo Andersen-Holten (2005), a cutícula apresenta diferenças estruturais ao longo dos fios de bisso, o que a confere propriedades específicas. Na extremidade distal dos fios, fora da concha do molusco, ela se configura em um arranjo granular. Isso possibilita ao mexilhão uma proteção contra o fenômeno de “sand blasting”, ou seja, a abrasão provocada pela areia dispersa na água do mar, o que sugere dureza e rigidez. Apesar dessa última característica, ela é capaz de acomodar tensões de até 70% por parte das fibrilas subjacentes no núcleo distal sem delaminação, o que torna essa capa protetora um revestimento altamente extensível. Sabe-se principal proteína dessa capa protetora é a proteína do pé -1 (foot protein -1), tal como foi descrito anteriormente na seção anterior (ANDERSEN-HOLTEN, 2005).

100 µm

20 µm

RESULTADOS E DISCUSSÃO Quantificação dos fios de bisso A divisão das amostras em grupos facilitou a visualização e a análise de um maior número de fios. Permitiu também observar detalhes como a variação de comprimento e largura dos fios da parte próxima à haste (Fig. 21) e também das placas adesivas (Fig. 26, 27, 29). No período de dissecação foram escolhidas 14 amostras de bisso, limpos e contados, utilizando os critérios de classificação descritos anteriormente: fios muito danificados, fios sem placa adesiva e fios inteiros. A partir da montagem de uma tabela foi possível definir as três amostras que seriam direcionadas para a aquisição e mensuração. Foi contado um total de 4.402 fios de bisso nas 14 amostras e, o número de fios por bisso variou entre 169 e 675. Em seguida, foram selecionadas 03 amostras que continham o maior número de fios limpos e íntegros. Os dados são apresentados na Tabela 01. Observa-se que a variação entre a quantidade de fios por bisso foi grande, por exemplo, o bisso de número 10 com 120 fios e o bisso de número 09 com um total de 675 fios. Isso demonstra que a quantidade de fios não é limitada e que cada animal pode desenvolver inúmeros fios. Os bissos selecionados foram divididos em partes para facilitar a mensuração, pois eles continham muitos fios e não seria possível registrar as imagens em um aumento maior. O número de fios medidos não corresponde ao valor total de fios, pois, alguns fios ficaram muito próximos uns dos outros ou a iluminação da lupa não os favoreceu. Logo, no bisso 03 foram medidos 159 fios sendo que a estrutura foi dividida em 7 partes e continha um total de 169 fios; o bisso 04 foi dividido em 6 partes e foram medidos 194 fios de um total de 522 fios; por fim, o bisso 09 que possuía um total de 675 fios foi agrupado em 10 partes e foram medidos 297 fios. Ao contrário do que foi descrito por Carrington (2002), que descreveu a região proximal do bisso relativamente espessa e ondulada e a região distal afilada e lisa para as espécies de Mytilus edulis, durante a análise das amostras de L. fortunei, foi possível observar em sua morfologia que a porção proximal é mais afilada e a porção distal, à medida que se aproxima da placa adesiva, torna-se mais grossa (Fig. 25, 26). Essa característica foi fundamental para a execução da medida do diâmetro dos fios, pois devido a essa observação foi necessário estabelecer uma distância mínima de pelo menos 0,80mm para iniciar a mensuração. Os resultados da análise morfométrica dos fios do bisso são apresentados na tabela 02. Cada bisso secretado pelo mexilhão pode ser morfologicamente separado em três partes distintas: a placa adesiva, o filamento e a haste (BAIRATI, 1991). Foi possível verificar a variação de comprimento entre essas estruturas, sendo a haste bem menor que os fios, que possuem tamanhos diversos. Esta amostra foi medida utilizando o mesmo programa anterior e foram verificados três comprimentos diferentes para três regiões distintas. Na porção superior esquerda foi encontrado um valor de 1,79mm de comprimento; na porção superior direita 1,74mm; e por fim, na porção inferior central foi verificado um valor de 1,02mm. A haste também foi medida e com o valor de 0,27mm podemos verificar a diferença de comprimento entre essas estruturas, todas essas informações contidas na figura (Fig. 17).

Medidas dos tamanhos das placas adesivas As placas adesivas de L. fortunei foram medidas por meio da ferramenta Measurement do microscópio eletrônico de varredura (MEV-TESCAN III) do Cbeih. Utilizou-se um n amostral de 12 discos adesivos e, para cada um deles, mediu-se o diâmetro. Como essas estruturas não são círculos exatos, diferenças entre o diâmetro mensurado na vertical e na horizontal foram observadas. A soma de ambos os diâmetros, para cada placa, é dada pela figura (Fig. 27).

Constituição Resumida Cutícula: revestimento protetor presente em todo o bisso, composto basicamente de Dopa (L-b-3,4diidroxifenil-a-alanina) e foot protein-1;

Raiz: estrutura ligada aos músculos retratores de bisso, inserida dentro da cavidade glandular na base do pé; Haste: estrutura presente no pé do mexilhão, da qual emergem os fios do bisso, revestida pela cutícula e formada por um eixo interno fibroso de colágeno.

Fios: compostos de colágeno tipo P, presente na porção proximal, e D, na porção distal. A extremidade proximal é caracterizada por ser menos rígida que a distal.

Placa adesiva (disco adesivo): composta de proteínas polifenólicas do pé (foot proteins) e DOPA.

Fig. 31 - Cílios encontrados na superfície do pé do mexilhão-dourado (MEV, 5000X)

1 µm

CONCLUSÕES

A análise dos resultados, contagem e mensuração do diâmetro dos fios analisados permitiram a caracterização morfométrica do bisso de Limnoperna fortunei. Foi possível observar as diferenças entre comprimento e tamanho de cada fio estudado, bem como sua morfologia. A partir dos resultados obtidos, somados a conceitos de Engenharia de Materiais que permeiam todas as discussões de Materiais Biológicos desenvolvidas no projeto, uma nova visão sobre a formação do bisso foi proposta: a de que sua formação não se daria somente em gradiente cronológico, mas principalmente geográfico, dentro da canaleta principal formada no interior do pé. A visão que prevalece na literatura divide a formação da haste, do fio do bisso e da placa adesiva em momentos temporais distintos. Porém as experiências acumuladas pelo projeto, dentro da visão multidisciplinar que orienta os trabalhos, sugerem que as estruturas que compõe todo o conjunto bissal devem ser construídas simultâneamente, em locais distintos do pé, por atuação de complexos glandulares distintos. E na medida em que essas estruturas crescessem por deposição de compósitos monoméricos, elas se fundiriam e sofreriam polimerização e cura. Essa visão pode ser justificada pela ausência de emendas no complexo bissal, pela velocidade de produção desse complexo e pela natureza estrutural desse, onde são observadas camadas não tão distintas e nenhuma estrutura ancorada (como ferragens no concreto armado - organização que seria encontrada se os fios do bisso fossem, de fato, produzidos antes da placa adesiva). Tais observações revelam o bisso como estrutura complexa, com hierarquia molecular e estrutural. A composição dos seus componentes, somada à sua arquitetura, conferem ao bisso consideráveis propriedades mecânicas e biológicas. Essencial à fixação do mexilhão-dourado, a compreensão da mecânica do bisso, assim como os processos envolvidos na formação e montagem dos seus componentes (self-assembly), pode fornecer a chave para o controle deste organismo, minimizando o impacto econômico gerado pela sua adesão em estruturas de captação e transporte de água. Os mecanismos de formação do bisso podem, ainda, inspirar a criação de novos materiais, como adesivos que funcionem em ambientes aquáticos, colas cirúrgicas, curativos bactericidas e fungicidas. Cabe salientar que estudos complementares continuam sendo realizados, a fim de elucidar dúvidas levantadas nos testes acima citados. Umas das linhas busca, por exemplo, compreender o processo de cura dos polímeros constituintes do bisso, a cronologia de liberação das diferentes enzimas e o desenvolvimento estrutural das diferentes partes do conjunto bissal.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDERSEN-HOLTEN, N. et al. Nano-mechanical Investigation of the Byssal Cuticle, a Protective Coating of a Bioelastomer. Materials Research Society, v. 844, p. Y3.7.1/R3.7.1-Y3.7.6/R3.7.6, 2005. Disponível em: <http://www. materials.ucsb.edu/~zok/PDF/Nano-MechanicalHolten-Andersen.pdf> Acesso 08/08/2012 BAIRATI, A. The byssus of the mussel Mytilus from the molecules to the organ: functional performence resides in the ultrastructural assembly. In Form and Function in Zoology ( ed. G. Lanzavecchia and R. Valvassori ), pp. 163-177. Moderna: Mucchi. 1991 BARNES, Robert. Zoologia dos invertebrados. 4. Ed. São Paulo: Roca, 1990. 1179p. BRADY, R. F.; SINGER I. L., Mechanical Factor Favoring Release from Fouling Release Coatings. Biofouling, v.15(13), p. 111-116, 1995. BOLTOVSKOY, D., CATALDO, H.D. Population dynamics of Limnoperna fortunei, an invasive fouling mollusk, in the Lower Paraná River (Argentina), Biofouling, 14(3), p.255-263. 1999 BRAZEE, S. L.; CARRINGTON, E. Interspecific Comparison of the Mechanical Properties of Mussel Byssus. Biological Bulletin, v. 211, p. 263-274, Dec, 2006. Disponível em: <http://www.biolbull.org/content/211/3/263.full> Acesso 16/08/2012 CARRINGTON, E.; The ecomechanics of Mussel Attachment: From Molecules to Ecosystems, from the Symposium Physiological Ecology of Rocky Interdial Organisms: From Molecules to Ecosystems presented at the Annual Meeting of the Society Compartive and Integrative Biology, 2-7, AT Anahein. California, v.42, p.846-852. 2002. CLARKE, M., Mc MAHON, R. F. Comparison of byssal attachment in dreissenid and mytilid mussels: mechanicsms, morphology, secretion, biochemistry, mechanics and environmental influences. Malacological Rreview.p.29.1-16, 1996. DARRIGRAN, G. Potential impact of filter-feeding invaders on temperate in land, a. freshwater environments. Biological Invasions 4: 145-156. 2002 DARRIGRAN, G.; DAMBORENEA, C.; GRECO, N.. An evaluation pattern for antimacrofouling procedures: Limnoperna fortunei larvae study in a hydroelectric power plant in South America. Ambio. 2007 Nov; 36(7):575-9.

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50 µm

Fig. 32 Cutícula do bisso do mexilhãodourado (MEV, 5000X)

UNIDADE III

Caracterização

Físico-Química

OBJETIVOS Objetivo geral • Análise das propriedades térmicas do bisso do molusco bivalve Limnoperna fortunei por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).

Objetivos específicos • Desenvolver protocolo para a caracterização das fibras e da placa adesiva do bisso por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).

• Caracterizar as mudanças de fase como a temperatura de transição vítrea (Tg) e de desnaturação das fibras protéicas (Td) do bisso de Limnoperna fortunei.

• Avaliar a alteração das propriedades mecânicas e adesivas do bisso após o tratamento com diferentes agentes químicos e físicos.

CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC): ANÁLISE TÉRMICA Análise térmica é um termo que abrange um grupo de técnicas na qual uma propriedade física ou química de uma substância, ou de seus produtos de reação, é monitorada em função do tempo ou temperatura, enquanto a temperatura da amostra, sob uma atmosfera específica, é submetida a uma programação controlada. Existem vários tipos de analise térmica, entre eles está a DSC (Differential Scanning Calorimetry). A DSC é uma ferramenta de grande valor para a caracterização de materiais e até de estruturas biológicas. Sua utilização abrange análises de proteínas, enzimas, ácidos nucléicos, células como hemácias e até qualidade de alimentos (GARCIA, 2004). A DSC é uma técnica muito utilizada no estudo de transição de fase (CARDOSO, 2004) no estudo da estabilidade de enzimas (ROGANA, 2003) e desnaturação de colágeno (MILES, 1995). As medidas calorimétricas fornecem informações quantitativas e qualitativas sobre processos endotérmicos e exotérmicos associados a variações químicas e físicas, ou a variações na capacidade calorífica. Com esta técnica, a determinação da temperatura de desnaturação e de transição vítrea do bisso in natura ou após o tratamento com agentes físico-químicos pode ser avaliada quanto ao tempo (t) e temperatura (T). A desnaturação é entendida como qualquer modificação da estrutura da molécula, esta pode acontecer por agentes físicos (calor, frio, tratamentos mecânicos, irradiação, etc.) e/ou químicos (ácidos, álcalis, metais, solventes orgânicos, etc.) e pode ser considerada como uma transição irreversível que inclui um calor endotérmico de desnaturação, quantificada mediante o uso da técnica aqui abordada. Como a desnaturação das fibras de colágeno do bisso causa a perda de suas propriedades mecânicas e bioadesivas. A determinação das condições dessa desnaturação juntamente com a análise do bisso e de suas características morfométrica já realizadas, nos fornecerá parâmetros para procedimentos práticos aplicados com potencial de redução ou até mesmo de impedimento de adesão do mexilhão em superfícies como plástico, vidros e metais.

Caracterização física dos fios do bisso e da placa adesiva A caracterização física envolve ensaios de análise térmica das amostras de bisso e placa adesiva em calorimetria diferencial de varredura (DSC). Os ensaios permitem a análise das mudanças no estado físico das moléculas por meio das variações das propriedades termodinâmicas. Assim, a temperatura de desnaturação (Td) e da transição vítrea (Tg) das proteínas das fibras do bisso e das moléculas da placa adesiva, in natura e, em presença de agentes físicos (calor, frio, tratamentos mecânicos, irradiação) e químicos (ácidos, bases, solventes orgânicos, variação do pH e força-iônica) podem ser medidas. Também foram realizados testes em DSC separadamente para cada parte do bisso.

materiais e métodos PARA Materiais Calorimetria Exploratoria Diferencial (Diamond DSC Perkin Elmer)

A seleção dos exemplares se deu de modo aleatório. Cada indivíduo teve seu complexo bissal retirado e foram armazenados em microtubos (1,5mL) Essa preparação já havia sido realizada previamente. O ensaio, portanto, não utilizou amostras de bisso frescas. O procedimento preparatório para a Calorimetria Exploratoria Diferencial (Diamond DSC Perkin Elmer) se deu com o auxílio de seringas, uma pinça de ponta fina curvada, pinças de pontas grossas retas, um bisturi e uma placa de Petri. Isolou-se de todas as partes do bisso: raiz, haste, filamentos e placa adesiva. Cada uma das partes separadas foi armazenada em microtubos (1,5mL). Os exemplares de bisso inteiros, em boas condições, mas não utilizados, foram armazenados em uma placa de Petri em água deionizada para uso em futuros experimentos com o DSC. A refrigeração de todas as amostras foi feita em um refrigerador apropriado a 15°C. Os filamentos bissais foram separados uns dos outros com o auxílio das seringas e os cortes realizados com o bisturi. Após a remoção dos filamentos da haste, os mesmos foram seccionados em extremidades proximais (próximas da haste) e distais (perto das placas adesivas) e armazenados em microtubos (1,5mL) separados, com água deionizada. Os procedimentos acima descritos foram feitos sob um esteromicroscópio óptico Motic e imagens produzidas a partir do software Motic 2.0. Diferenças qualitativas na espessura, na coloração e no arranjo das raízes, das hastes, dos filamentos bissais e das placas adesivas foram avaliadas. O modo de inserção de tais filamentos na haste também foi estudado.

reSUltadoS O termograma do bisso do mexilhão dourado, sem tratamento prévio, está apresentado no Gráfico 1. Pode-se observar na curva a ocorrência de uma endotermia com inflexão no início do pico. A endotermia está associada à desnaturação das fibrilas de colágeno do bisso, com temperatura de desnaturação (Td) de 52,12ºC e entalpia de transformação (DHd) de 576,7 J/g. Cabe mencionar que os valores determinados foram para amostra de bisso úmido, valores diferentes são esperados para análises realizadas considerando somente o peso seco do bisso. Em experimentos de análise térmica com o tratamento prévio com diferentes agentes físicos e químicos, à alteração dos valores de calor endotérmico de desnaturação do bisso previamente tratado pode ser quantificado. A alteração da estrutura molecular do bisso causa a perda de suas propriedades mecânicas e bioadesivas, portanto, a determinação das condições dessa desnaturação, nos fornecerá parâmetros para procedimentos práticos, com potencial de redução ou até mesmo de impedimento de adesão do mexilhão dourado. A temperatura (Td) e entalpia (DHd) de desnaturação, foram consideradas como a temperatura onde ocorreu o pico e a área sobre a endotermia, respectivamente. Os valores foram calculados com o emprego do software original do equipamento.

Gráfico 1 - Termograma do bisso do mexilhão dourado (L. fortunei) sem tratamento prévio.

corrida 2: haSteS No dia 17 de julho de 2012 foi realizado o primeiro ensaio com a haste do complexo bissal de L. fortunei. A amostra ficou alguns minutos à temperatura ambiente antes do ensaio para a evaporação da água de sua estrutura. Posteriormente, ela (4,17mg) foi alocada em cadinhos de aço inox com vedação em rosca (299,97mg). O programa escolhido variou de 10˚C a 150˚C. Após a corrida, o total obtido foi de 625,48mg. O cadinho de referência utilizado no processo, incluindo as tampas de vedação do mesmo, apresentaram massa de 632,74mg. No Gráfico 2, na análise térmica das hastes do mexilhão dourado, obteve-se um pico endotérmico significativo entre 100°C e 150°C aproximadamente para uma amostra de 4,17mg de amostra. Kittur et al. (2002) conseguiu resultados semelhantes em seus estudos com polissacarídeos. Nas análises dos derivados carboximetilados da quitina/quitosana amostras com um mínimo de 2,0mg foram necessárias para detectar esse evento. Ele atribuiu esse pico como sendo a evaporação da água. Isso é condizente com os resultados gerados aqui, já que a água da amostra provavelmente não foi removida totalmente por evaporação natural. E importante notar que o equipamento da Perkin Elmer não realiza análises termogravimetricas associadas e os picos provenientes pelo calorimetro da marca indica os picos endotermicos para cima, ao contrario da maioria dos equipamentos de DSC, por exemplo, os da Shimadzu.

Gráfico 2 - Termograma da haste do bisso do mexilhão dourado (L. fortunei) sem tratamento prévio.

corrida 3: raízeS Amostras com massa de 2,90mg foram obtidas e colocadas sobre cadinhos de aço inox com vedação em rosca (288,93mg). A amostra total, antes da corrida, foi de 623,44mg e após a mesma, 620,95mg.

Gráfico 3 - Termograma da raíz do bisso do mexilhão dourado (L. fortunei) sem tratamento prévio.

Novamente, um grande pico endotérmico foi gerado no intervalo aproximado de 100°C-150°C, podendo ser devido à evaporação da água. Contudo, a amostra apresentava 2,90mg, o que também pode indicar a transformação química de algum outro material. As pequenas transições endotérmicas podem ser ruídos presentes na amostra. Em outras palavras, fatores não relacionados à análise que por ventura interferiram e foram expressos no gráfico. Segundo a informação verbal concedida pela Profª Dra. Maria Irene Yoshida do Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais em avaliação do presente trabalho, elas também podem ser pequenas frações de água que, aos poucos, foram sendo evaporadas por poros presentes nas raízes.

CONCLUSÕES A análise dos resultados, contagem e mensuração do diâmetro dos fios analisados, anteriormente realizadas permitiram a caracterização morfométrica parcial do bisso de Limnoperna fortunei. Foi possível observar as diferenças entre comprimento e tamanho de cada fio estudado, bem como sua morfologia. Já a análise térmica pelo DSC pode contribuir para entender os mecanismos de adesão do Limnoperna fortunei a diferentes superfícies e resolver problemas relacionados aos impactos ambientais e econômicos. A análise térmica elucida o comportamento molecular do bisso em função da temperatura, e auxilia na compreensão da sua composição, fornecendo conceitos chaves imprescindíveis para a obtenção de novos materiais, de interesse biomédico e de engenharia. Cabe salientar que estudos complementares continuam sendo realizados, a fim de elucidar dúvidas levantadas nos testes acima citados. Umas das linhas busca, por exemplo, compreender o processo de cura dos polímeros constituintes do bisso, a cronologia de liberação das diferentes enzimas e o desenvolvimento estrutural das diferentes partes do conjunto bissal.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVES, A. C. V. Relatório semestral da ETAPA 3 do projeto: Adesão de bivalves em superfícies: Mecanismos físicos e influência de macromoléculas nativas do muco. BARNES, R. Zoologia dos invertebrados. 4. Ed. São Paulo: Roca, 1990. 1179p. BOLTOVSKOY, D., CATALDO, H.D. Population dynamics of Limnoperna fortunei, an invasive fouling mollusk, in the Lower Paraná River (Argentina), Biofouling, 14(3), p.255-263. (1999) BRADY, R. F.; e SINGER I. L. Mechanical Factor Favoring Release from Fouling Release Coatings. Biofouling, v.15(1-3), p. 111-116, 1995. CARDOSO, A. V., ABREU W. M. Water and the glass transition temperature of organic (caramel) glasses. Journal of Non-Crystalline solids, V.348, P. 51-58, 2004. CLARKE, M., Mc MAHON, R. F. Comparison of byssal attachment in dreissenid and mytilid mussels: mechanicsms, morphology, secretion, biochemistry, mechanics and environmental influences. Malacological Rreview.p. 29.1-16. (1996) DARRIGRAN, G. Potential impact of filter-feeding invaders on temperate in land freshwater environments. Biological Invasions 4: 145-156.2002. FARIA, E. A. Caracterização de Superfícies Antiincrustantes para o “Limnoperna fortunei” - Mexilhão Dourado. 2005. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Ouro Preto. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Materiais. Ouro Preto. GARCIA,J. U. Estudo da estabilidade térmica de óleos de peixes em atmosfera de nitrogênio. Eclética Química, V. 29, nº 2,P.41-46, 2004. MANSUR, M. C. D.; SANTOS C. P. dos; DARRIGRAN, G. et al. Primeiros dados quali-quantitativos do Mexilhao Dourado, Limnoperna fortunei (Dunker), no Delta do Jacuí, no Lago Guaíba e na Laguna dos Patos, Rio Grande do Sul, Brasil e alguns aspectos de sua invasão no ambiente. Ver. Bras. Zool., vol 20, n.1, p.75-84. ISSN 0101-8175, mar.2003. MILES, A C. et al. The kinetics of the thermal denaturation of collagen in unrestrained rat tail tendon determined by differential scanning calorimetry. J. Mol. Biol. v. 245, p. 437-446, 1995. Ricciardi, A. Global range expansion of the Asian mussel Limnoperna fortunei. (Mytilidae): Another fouling threat to freshwater systems. Biofouling v.13 n.2. p.97-100. 1998. ROGANA, E. Characterization of beta-trypsin at acid pH by differential scanning calorimetry. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, Brasil, v. 36, n. 12, p. 1621-1627, 2003

CRÉDITOS Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas | CBEIH.org

Endereço Av. José Cândido da Silveira, 2000 Horto - Belo Horizonte (MG) Telefone: +55 31 3489 2320 Web: www.cbeih.org / contato@cbeih.org

Equipe CBEIH

Coordenador Antônio Valadão Cardoso Pesquisadores Antônio Valadão Cardoso Arnaldo Nakamura Filho Arthur Corrêa de Almeida Fabiano Alcísio e Silva Gabriela Rabelo Andrade Hélen Regina Mota Hernan Roberto Espinoza Riera Mônica de Cássia Souza Campos Estagiários de Iniciação Científica Anna Carolina Guañabens Frederico Magalhães Vieira Gabriel Cardoso Salgado João Locke Ferreira De Araujo Vinicius Sergio Rodrigues Diniz Técnico de Laboratório Kelly Carneiro de Souza Lima

Revisão: Arthur Corrêa de Almeida Design Gráfico: Gabriela Rabelo Andrade Data: Novembro de 2012

Expediente

2013 Relatório técnico Soft Tissues

Piscicultura entre as UHEs Igarapava e Jaguara (MG)

anexo i

Protocolos

Tampão fosfato 0,2 M No preparo da solução tampão deve-se atentar para o número de moléculas de água presente nos sais, caso contrário a solução resultante apresentará molaridade incorreta.

Solução A: fosfato de sódio monobásico a 0,2 M (baseado no peso molecular de produtos Merck) (NaH2.PO4.H2O)............2,76 g/100 ml água destilada ou (NaH2.PO4.2H2O)...........3,12 g/100 ml água destilada

Solução B: fosfato de sódio dibásico a 0,2 M (Na2H.PO4.2H2O)...........3,56 g/100 ml água destilada ou (Na2H.PO4.7H2O)...........5,37 g/100 ml água destilada ou (Na2H.PO4.12H2O)..........7,17 g/100 ml água destilada Misturar as soluções A e B (0,2 M), segundo a proporção da tabela a seguir, para obter o pH desejado.

pH (25° C)

A (ml) B (ml) pH (25° C)

A (ml) B (ml)

5,8 92,0 8,0 6,8 51,0 49,0 5,9 90,0 10,0 6,9 45,0 55,0 6,0 88,0 12,0 7,0 39,0 61,0 6,1 85,0 15,0 7,1 33,0 67,0 6,2 81,5 18,5 7,2 28,0 72,0 6,3 77,0 23,0 7,3 23,0 77,0 6,4 73,5 26,5 7,4 19,0 81,0 6,5 68,0 32,0 7,5 16,0 84,0 6,6 62,5 37,5 7,6 13,0 87,0 6,7 57,0 43,0 7,7 10,0 90,0

Tampão cacodilato 0,2 M Baseado no peso molecular de produto Sigma (160,0) sem moléculas de H2O Solução A: (0,2 M) Cacodilato de sódio 3,2 g água destilada 100 ml Solução B: (1,0 M) HCl concentrado (36-38%) 8,3 ml água destilada 100 ml Baseado no peso molecular de produto Serva ou Polysciences ou EMS (214,0) com 3 moléculas de H2O Solução A: (0,2 M) Cacodilato de sódio 4,28 g água destilada 100 ml Solução B: (1,0 M) HCl concentrado (36-38%) 8,3 ml água destilada 100 ml

SOLUÇÃO FINAL (é a mesma para 2a e 2b): Solução A Solução B

100 ml até atingir pH 7,2 a 7,4

Para melhor preservação de membranas biológicas, pode-se adicionar CaCl2 na proporção de 10mM para solução de tampão cacodilato a 0,2M. Adiciona-se 0,147 g de CaCl2 (Sigma, PM 147,02 g) para cada 100 ml de tampão 0,2M *ATENÇÃO: Cuidado ao manuseio do cacodilato. O mesmo contém aproximadamente 30% de arsênico por peso (0=AsCH3-O-Na), de modo que seu manuseio deve ser feito com precaução, evitando-se a inalação do produto ou seu contato com pele e mucosas. Evitar descarte na pia. Além disso, a reação de cacodilato com ácidos produz gás arsênico. A exposição crônica ao arsênico pode causar dermatite, inflamação de mucosas, paralisia e câncer de pele, fígado e pulmão.

Glutaraldeído em tampão fosfato ou cacodilato 0,1M a) Prepare a solução tampão 0,2 M no pH desejado. b) Prepare o fixador com:

Tampão 0,2 M (ml) Aldeído glutárico 25% em solução aquosa (ml) Água destilada (ml) até Concentração final de aldeído glutárico

50 50 50 50 50 4 6 8 10 12 100 100 100 100 100 1% 1,5% 2% 2,5% 3%

· Se necessário, ajuste a osmolaridade com sacarose, glicose ou cloreto de sódio. · Quando utiliza-se glutaraldeído a 50%, o volume a ser adicionado à solução deve ser reduzido à metade. · Para maior contrastação de membranas celulares e de fibras colágenas e elásticas, pode-se acrescentar à solução fixadora de glutaraldeído, no momento do uso, 1 a 2% de ácido tânico.

Paraformaldeído 10% para Estoque:

1. Adicionar 10,0 g de paraformaldeído em um Béquer e completar para 100mL de água destilada. 2. Aquecer solução em chapa quente sob agitação, até a temperatura de 60-65°C. 3. Quando a solução atingir a temperatura adequada, adicionar algumas gotas de solução NaOH 1,0M. Adicionar gota a gota até que o paraformaldeído dissolva totalmente e a solução fique transparente.

4. Deixar a solução esfriar. Se necessário completar o volume final para 100mL com água destilada. 5. Filtrar solução. 6. Após resfriamento, congelar solução em tubos/garrafas sem ar à temperaturas menores que -15ºC. *ATENÇÃO: Trabalhar em capela de exaustão durante toda preparação. O paraformaldeído é cancerígeno. Observação: A solução estoque pode ser feita em outras concentrações.

Solução fixadora de Karnovsky em tampão 0,1 M (Paraformaldeído 4% e Glutaraldeído a 5%) • 50 mL de tampão (cacodilato ou fosfato) 0,2 M • 10 mL de Glutaraldeído 50% • 40 mL de Paraformaldeído 10% Misturar bem as soluções, alcançando volume final de 100 mL de volume final.

Solução fixadora de Karnovsky modificado em tampão 0,1 M (2,5% Glutaraldeído, 2% Paraformaldeído) • 50 mL de tampão (cacodilato ou fosfato) 0,2 M • 5 mL de Glutaraldeído 50% • 20 mL de Paraformaldeído 10% • 25 mL de água destilada Misturar bem as soluções, alcançando volume final de 100 mL de volume final. *ATENÇÃO: • Ao usar tampão fosfato, não se deve adicionar CaCl2, pois formam-se cristais de fosfato de cálcio. • Deve-se utilizar solução de paraformaldeído nascente (recém-preparada), • Quando a armazenagem é necessária, armazenar apenas a solução de paraformaldeído e não a solução fixadora completa.

Tetróxido de ósmio (OsO4)

Baseado no peso molecular de produto Sigma (160,0) sem moléculas de H2O Solução A: (0,2 M) Cacodilato de sódio 3,2 g água destilada 100 ml Solução B: (1,0 M) HCl concentrado (36-38%) 8,3 ml água destilada 100 ml Baseado no peso molecular de produto Serva ou Polysciences ou EMS (214,0) com 3 moléculas de H2O Solução A: (0,2 M) Cacodilato de sódio 4,28 g água destilada 100 ml Solução B: (1,0 M) HCl concentrado (36-38%) 8,3 ml água destilada 100 ml

Tetróxido de ósmio (OsO4) REDUZIDO

(por ferrocianeto de potássio a 3% ou a 1,6%) *ATENÇÃO: para maior contrastação de membranas celulares pode-se utilizar ósmio reduzido por ferrocianeto de potássio a 3% ou a 1,6%. • Preparar solução de ferrocianeto de potássio a 3% ou a 1,6% e misturar (somente no momento do uso) na proporção de 1:1 com solução tamponada de OsO4 a 2%, 0,2 M, pH 7.2-7.4. • O ósmio reduzido apresenta coloração marrom e após a fixação o material adquire tonalidade marrom escura, e não negra como na fixação apenas com OsO4. • Normalmente fixar o material por 30 minutos a 4ºC. • A associação com ferrocianeto também favorece a preservação de glicogênio.

Seleção e preparo das amostras para MEV e microscopia ótica

Preparação de Resinas EPON Epon 812 NMA DDSA DMP-30

Opção 1 (mais macia)

Opção 2 (mais dura)

13 ml ou 15,4 g

25 ml ou 30,8 g

9 ml ou 10,1 g

17 ml ou 20,2 g

8 ml ou 6,4 g

8 ml ou 12,8 g

0,6 ml (± 27-30 gotas)

32 gotas

• Após a adição de NMA e de DDSA, a mistura deve ser agitada por 10-15 minutos. • Após adição de DMP-30, agitar por 20 minutos ou até que todo o meio adquira aparência homogênea. • Não é necessário colocar DMP-30 na fórmula utilizada na primeira infiltração (com acetona) OBSERVAÇÕES: • Maior proporção de DMP-30 torna os blocos mais duros, mas também mais difíceis de cortar. • Lave toda a vidraria e instrumentos usados com acetona, imediatamente depois de usá-los. • Evite a formação de bolhas de ar durante agitação.

ARALDITE Misturar, na ordem: Araldite 502 54 g DDSA 46 g DMP-30 2,5-3,0 g (Adicionar o acelerador no momento do uso) * Agitar por 20 min, até que a mistura se torne homogênea.

SPURR VCD (polímero) 10,0 g DER 736 (flexibilizador) 6,0 g NSA (endurecedor) 26,0 g DMAE (acelerador) 0,4 g 1. Adicionar o acelerador (DMAE) após misturar gentilmente, os três primeiros ingredientes. Agitar, sem formar bolhas de ar, até ficar homogênea. 2. Usar meio completo para infiltração. 3. Colocar recipiente com meio pronto no dessecador, caso não vá utilizar imediatamente. Observação: Pode-se obter meio Spurr com diferentes graus de consistência, variando a concentração de alguns dos componentes:

VCD DER 736 NSA DMAE

Meio Duro

Meio Macio

Meio de Curagem Rápida*

10.0 10.0 10.0 4.0 7.0 6.0 26.0 26.0 26.0 0.4 0.4 1.0

* 3 horas na estufa a 70ºC.

PROTOCOLOS DE INCLUSÃO EM RESINA Inclusão de material em Araldite – Infiltração curta Fixação por perfusão ou imersão, de acordo com o objetivo Fixação Karnovisky modificado Lavagem em tampão fosfato/cacodilato 0,1M .............................................. 30 min (2x) OsO4 2% : (KFeCN 1,5%, opcional) em tampão ............................................. 1 hora H2O destilada ............................................................................................. 5 minutos (3x) Álcool 50% Álcool 70% Álcool 85% Álcool 95% Álcool absoluto

............................................................................................. 10 minutos ............................................................................................. 15 minutos ............................................................................................. 15 minutos ............................................................................................. 15 minutos (2x) ............................................................................................. 20 minutos (2x)

Acetona ............................................................................................. 20 minutos (2x) 1 Acetona : 1 Araldite (recipiente fechado) .............................................. 1 hora 1 Acetona : 3 Araldite (recipiente fechado) .............................................. 1 hora 1 Acetona : 4 Araldite (recipiente fechado) .............................................. Overnight Araldite pura (recipiente fechado) Estufa 40°C Estufa 60°C

.............................................................. 2 horas

............................................................................................. 2 horas ............................................................................................. 48 horas

Resina: • 54g (mL) resina Araldite, no 502 • 46g (mL) DDSA – Anidro Dodecenilsuccínico (endurecedor) • 2,5 – 3,0g (mL) BDMA – Benzildimetilamina (ou DMP-30) ATENÇÃO: Não homogeneizar com o Becker aberto para evitar umidade

Inclusão de material em Araldite – Tecidos animais e células Fixação por perfusão ou imersão, de acordo com o objetivo Lavagem em tampão fosfato/cacodilato 0,1M ............................................................. 15-30 min (3x) OsO4 2% : (KFeCN 1,5%, opcional) em tampão (a 4ºC ou temperatura ambiente) ... 30-60 min Álcool 35%........................................................................................................................ 10 minutos (2x) Álcool 50%........................................................................................................................ 10 minutos (2x) Álcool 70%........................................................................................................................ 10 minutos (2x) Álcool 85%........................................................................................................................ 10 minutos (2x) Álcool 95%........................................................................................................................ 10 minutos (2x) Álcool absoluto ................................................................................................................ 10 minutos (3x) Acetona............................................................................................................................. 20 minutos (2x) 1 Acetona : 1 Araldite (recipiente fechado).................................................................... 1 hora ou mais 1 Acetona : 3 Araldite (recipiente fechado)................................................................... Overnight 1 Acetona : 4 Araldite (recipiente fechado)................................................................... 1 hora ou mais Araldite pura (recipiente fechado)................................................................................. 1 hora ou mais Estufa 35°C (opcional).................................................................................................... Overnight Estufa 45°C (opcional).................................................................................................... Overnight Estufa 60°C..................................................................................................................... Overnight ou mais Observação: É aconselhado usar na infiltração tempos superiores a 1 hora (entre 4 a 8 horas) mantendo o tecido sob agitação constante em aparelho giratório.

Resina: 54g (mL) resina Araldite, no 502 46g (mL) DDSA – Anidro Dodecenilsuccínico (endurecedor) · 2,5 – 3,0g (mL) BDMA – Benzildimetilamina (ou DMP-30) ATENÇÃO: Não homogeneizar com o Becker aberto para evitar umidade

Inclusão de material em Epon – Tecidos animais e células Fixação Lavagem em tampão fosfato 0,1M.................................................................................. 15-30 min (3x) OsO4 2%: (KFeCN 1,5%, opcional) em tampão (a 4ºC ou temperatura ambiente) .... 30-60 min Álcool 35% Álcool 50% Álcool 70% Álcool 85% Álcool 95% Álcool absoluto

............................................................................................. 10 minutos (2x) ............................................................................................. 10 minutos (2x) ............................................................................................. 10 minutos (2x) ............................................................................................. 10 minutos (2x) ............................................................................................. 10 minutos (2x) .............................................................................. .............. 10 minutos (3x)

Acetona ............................................................................................................. 20 minutos (2x) 2 Acetona : 1 Epon (recipiente fechado) ......................................................... 1 hora ou mais 1 Acetona : 1 Epon (recipiente fechado) ........................................................ 1 hora ou mais 1 Acetona : 2 Epon (recipiente fechado) ........................................................ Overnight Epon puro (trocar de recipiente - fechado) .................................................... 1 hora ou mais Estufa 40-45°C ................................................................................................ Mínino 1h Estufa 60°C ...................................................................................................... 48 horas

Resina: Epon 812 NMA DDSA DMP-30

Opção 1 (mais macia)

Opção 2 (mais dura)

13 ml ou 15,4 g

25 ml ou 30,8 g

9 ml ou 10,1 g

17 ml ou 20,2 g

8 ml ou 6,4 g

8 ml ou 12,8 g

0,6 ml (± 27-30 gotas)

32 gotas

ATENÇÃO: Não homogeneizar com o Becker aberto para evitar umidade

Coloração de cortes semi-finos com Azul de Toluidina/ Borato de Sódio 01. Cortar secções semi-finas (entre 0,5 a 1 mm; cor violeta). 02. Pescar as secções com aro de metal, com pincel, bastão de vidro ou de madeira com ponta afilada. 03. Transferir para uma lâmina de vidro limpa contendo uma gota de água destilada. 04. Deixar secar completamente em chapa quente (58ºC aproximadamente). 05. Cobrir os cortes com uma gota grande do corante. 06. Aquecer na chapa até a borda da gota começar a secar (torna-se metálica). 07. Lavar em água e secar em chapa quente ou ao ar. 08. Montar em lamínula (opcional).

CORANTES PARA CORTES SEMIFINOS • Solução de Azul de Toluidina/Borato de Sódio 01. Dissolver 1g de borato de sódio em 99 ml de água destilada. 02. Acrescentar 0,5 g de azul de toluidina. Agitar. 03. Filtrar em papel de filtro. 04. Conservar em vidro escuro.

• Solução de Azul de Metileno/Azur Solução A: Solução B:

Tetraborato de sódio - 1% Azul de Metileno - 1% Azur II - 1%

Misturar A + B na proporção de 1:1.

• Azul de toluidina/Fucsina Básica Solução estoque 1: azul de toluidina a 1% em solução de borato a 1%. Solução estoque 2: solução de borato a 1% Solução estoque 3: fucsina básica a 0,1% Aquecer água destilada a 100° C, misturar o corante e filtrar. Modo de corar: Para o azul de toluidina, o modo usual descrito anteriormente e secar. Misturar partes iguais das soluções estoques 2 e 3. Corar na chapa quente rapidamente, lavar e secar. Montar em meio Polymount (Polysciences) que impede esmaecimento da coloração.

• Citrato de chumbo

Reynolds, J. Cell Biology, 17:208 (1963)

a) Misture num balão volumétrico de 50 ml: 1,33 g de nitrato de chumbo Pb(NO3)2 1,76 g de citrato de sódio Na3(C6H5O7).2H2O 30 ml de água destilada isenta de CO2 (fervida e resfriada) Para fazer água isenta de CO2, ferva água destilada por 10 minutos e tampe-a ainda quente. b) Agite intermitentemente por meia hora (a solução torna-se leitosa). Junte então 8 ml de NaOH 1N (a solução torna-se transparente). A soda deve ser fresca, isenta de CO2. Dilua até 50 ml com água isenta de CO2. O pH deverá estar em torno de 12.0. c) Tempo de coloração: 5 a 10 minutos. OBSERVAÇÕES: A solução de Reynolds deve ser filtrada (filtro milipore) ou centrifugada (15000 g por 5 minutos) antes do uso. Não agite o corante no momento de usá-lo. Procure pipetar apenas a parte central do líquido, evitando o contato da pipeta com os precipitados do fundo da solução. Na contrastação feita à base de citrato de chumbo (Reynolds) deve-se empregar pastilhas de NaOH (5 em média) no recipiente de coloração, a fim de diminuir a precipitação causada pela formação de carbonato de chumbo em contato com o CO2 atmosférico. Utilize vidraria absolutamente limpa. Evite respirar sobre os cortes ou corante no momento da coloração, o que poderia ocasionar a formação de precipitados. Mantenha os cortes protegidos da poeira durante a coloração. Mantenha os vidros de corantes sempre fechados. Retire toda a poeira do balcão antes de iniciar a coloração. Renove a água destilada entre as duas etapas da coloração.

• Acetato de uranila a 2%

M.L. Watson, J.B.B.C., 4: 475 (1958).

a) Faça uma solução a 2% de acetato de uranila com água destilada. Filtre e conserve em frasco escuro. b) Tempo de coloração: 30-40 minutos à temperatura ambiente ou 8-10 minutos a 60 °C

• Acetato de uranila a 8%

Inst. Anat., Mainz, Alemanha

a) Solução a 8% em água bidestilada. Filtre e conserve em frasco escuro. b) Tempo de coloração: 5 minutos a temperatura ambiente. OBSERVAÇÕES: A solução de uranila deve ser filtrada no momento de uso. Não agite o corante no momento de usá-lo. Procure pipetar apenas a parte central do líquido, evitando o contato da pipeta com os precipitados do fundo da solução. Utilize vidraria absolutamente limpa. Mantenha os cortes protegidos da poeira durante a coloração. Mantenha os vidros de corantes sempre fechados. Retire toda a poeira do balcão antes de iniciar a coloração. Renove a água destilada entre as duas etapas da coloração.

• Contrastação com uranila 01. Filtre algumas gotas da solução de uranila a 2% utilizando uma seringa com filtro millipore 0,22 µm e pingue algumas gotas em uma placa de Petri forrada com parafilm. 02. Coloque cada tela sobre a gota de corante, com os cortes voltados para a mesma. 03. Cubra a placa com a tampa de vidro limpa e leve-a à estufa a 60 °C, por 8-10 minutos. Para vegetais, deixe 15 min. 04. Lave as telas em água destilada isenta de CO2, mergulhando a tela no Becker 20X.

Contrastação com Citrato de chumbo 01. Coloque em uma placa de Petri previamente revestida com cera de dentista ou parafilm, 5 a 10 pastilhas de NaOH e aguarde alguns segundos 02. com a placa tampada. 03. Filtre algumas gotas da solução de Reynolds, utilizando uma seringa com filtro millipore 0,22 µm e pingue algumas gotas na placa de Petri. 04. Alternativamente, pode-se centrifugar a solução de Reynolds (15000 g por 5 minutos) antes de filtrá-la.

Relatórios Técnicos 2013: Soft Tissues GT343: Controle do Mexilhão-dourado:

+55 31 3489-2320

Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas, realizado em

www.cbeih.org

Julho de 2011.

contato@cbeih.org

2013

Relatórios técnicos Soft Tissues: Pé e Bisso

I. Caracterização biológica II. Caracterização físico-química III. Coleta e preparo de amostras

GT343 Controle do mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas.