Genetyka i prawo
KWARTALNIK NAUKOWY ZAKŁADU GENETYKI MOLEKULARNEJ I SĄDOWEJ numer 1 | Wiosna 2008
Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum Katedra Medycyny Sądowej
Wiodące laboratoria O znaczeniu atestacji laboratoriów genetyczno-sądowych oraz atestach na badania DNA przyznanych na lata 2008-2009 opowiada prof. dr hab. Zofia Szczerkowska
> www.zgms.cm.umk.pl
Drodzy Czytelnicy Analizy genetyczne na stałe zagościły wśród badań wykonywanych na potrzeby wymiaru sprawiedliwości i organów ścigania. Zakres spraw, w których można wykorzystać bada-
*
Spis treści
4-5
NASZA DZIAŁALNOŚĆ
nia DNA, stale się powiększa, a warsztat badawczy genetyki
Fiat iustitia, et pereat mundus...
molekularnej staje się coraz doskonalszy. W swojej pracy
Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej dysponuje kilkunastoletnim doświadczeniem
prokuratorzy, policja, sędziowie czy adwokaci na ogół chęt-
w badaniach genetycznych wykonywanych dla potrzeb wymiaru sprawiedliwości.
nie korzystają z narzędzi, jakimi dysponuje współczesna genetyka.
Solidny fundament Przekształcając Pracownię Serohematologii Sądowo-Lekarskiej w Zakład Genetyki Molekularnej
Czy jednak w naszym kraju zwraca się należytą uwagę
i Sądowej, za cel postawiliśmy sobie nieustanny i możliwie wszechstronny rozwój.
na merytoryczne przygotowanie biegłych – genetyków oraz poziom ich ośrodków? Konieczność ich weryfikacji
6-7
staje się coraz bardziej nagląca. Wiąże się ona jednak ze
WYWIAD NUMERU
znajomością podstaw warsztatu genetyki sądowej oraz
EMPOP – przełom w analizach mtDNA
podstaw prawa, co wymaga szerszej wymiany myśli pomię-
Na temat EMPOP, nowej bazy danych sekwencji mtDNA, rozmawiamy z profesorem Waltherem
dzy zleceniodawcami a laboratoriami wykonującymi bada-
Parsonem, światowej klasy specjalistą w dziedzinie genetyki sądowej.
nia. Tymczasem wydaje się, że brakuje u nas stałego kanału komunikacji pomiędzy przedstawicielami wymiaru spra-
8-10
wiedliwości a genetykami sądowymi.
CIEKAWE PRZYPADKI Mężczyzna czy kobieta?
W naszym zamyśle magazyn „Genetyka i Prawo”, którego
Ustalanie płci na podstawie analizy DNA weszło do repertuaru badań wykonywanych
pierwszy numer oddajemy w Państwa ręce, ma być przy-
w laboratoriach zajmujących się genetyką sądową, choć bywa ono problematyczne.
stępnym przewodnikiem po zastosowaniach genetyki w procesie sądowym. Na jego łamach zamierzamy przybli-
11
żać Państwu istotę naszych metod badawczych, prezento-
PIĘĆ PYTAŃ DO...
wać ciekawe przypadki, poruszać istotne kwestie kontroli jakości badań genetycznych. Nasz kwartalnik redagowany jest przede wszystkim przez pracowników Zakładu Genetyki Molekularnej i Sądowej Katedry Medycyny Sądowej Collegium Medicum UMK, instytucji dysponującej kilkunastoletnim doświadczeniem w badaniach genetycznych dla celów sądowych. Współtworzyć go będą jednak również
Biegli genetycy docenieni Michał Szułczyński – Rzecznik Prasowy i Naczelnik Wydziału Śledczego Prokuratury Okręgowej w Gliwicach – mówi o znaczeniu badań genetycznych dla potrzeb śledztwa.
12-13
METODY BADAWCZE
genetycy sądowi z innych krajów, cieszący się autorytetem
MtDNA kluczem identyfikacyjnym
w międzynarodowym środowisku naukowym.
Metoda badania mitochondrialnego DNA jest niezastąpiona, gdy standardowe techniki badawcze nie pozwalają na określenie tożsamości osoby.
W pierwszym numerze znajdą Państwo m.in. wywiad z prof. Waltherem Parsonem z Uniwersytetu Medycznego
14-15
w Innsbrucku (Austria), laureatem nagrody Międzynarodo-
STANDARDY I ATESTACJE
wego Towarzystwa Genetyki Sądowej (ISFG) i ekspertem
Wiodące laboratoria
w głośnych sprawach identyfikacyjnych. Mając na względzie
O znaczeniu atestacji oraz atestach na badania DNA przyznanych na lata 2008-2009 opowiada
kluczową kwestię jakości ekspertyz, przedstawiamy również
prof. dr hab. Zofia Szczerkowska.
istotę tzw. atestacji laboratoriów genetycznych. W tej sprawie oddajemy głos prof. dr hab. Zofii Szczerkowskiej, Prze-
Dążenie do doskonałości
wodniczącej Komisji Genetyki Sądowej Polskiego
Atestacje są skutecznym sposobem na podniesienie jakości ekspertyz genetyczno-sądowych.
Towarzystwa Medycyny Sądowej i Kryminologii (PTMSiK),
Atest nie jest jednak równoznaczny z patentem na nieomylność.
która przedstawia listę laboratoriów posiadających atesty na wykonywanie badań genetycznych w sprawach o ustalenie spornego ojcostwa i identyfikacji śladów biologicznych w latach 2008-2009.
NA OKŁADCE:
Mamy nadzieję, że nasz magazyn popularyzujący wiedzę ge-
Przeprowadzane w Zakładzie Genetyki Molekularnej i Sądowej CM UMK badanie śladów biologicznych pozostawionych na narzędziu zbrodni.
netyczną przyczyni się do szerszego niż dotychczas wykorzystania osiągnięć biologii molekularnej w sprawach sądowych.
Prof. dr hab. Karol Śliwka kierownik Katedry Medycyny Sądowej Collegium Medicum UMK
Dr hab. Tomasz Grzybowski
NOWOŚCI W GENETYCE SĄDOWEJ
WYDAWCA: Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum
KONCEPCJA, PROJEKT, EDYCJA: NOVIMEDIA Custom Publishing www.novimedia.pl
REDAKTOR WYDANIA: Tomasz Grzybowski ZESPÓŁ REDAKCYJNY Urszula Rogalla, Marcin Woźniak, Karol Śliwka, Marta Gorzkiewicz
kierownik Zakładu Genetyki Molekularnej i Sądowej Katedry Medycyny Sądowej Collegium Medicum UMK Zostały podjęte wszelkie środki, aby zawarte w publikacji informacje były dokładne i aktualne w dniu oddania do druku. Rozpowszechnianie materiałów redakcyjnych bez pisemnej zgody wydawcy jest zabronione. Copyright © 2008 ZGMiS, wszelkie prawa zastrzeżone.
*
DNA a przynależność etniczna
Wiedza o pochodzeniu pozwala na pośrednie wnioskowanie o wyglądzie każdej nieznanej osoby. Warto wiedzieć, że możliwe jest określenie przynależności etnicznej również za pomocą badania DNA pochodzącego na przykład z miejsca przestępstwa.
W
tym celu wykorzystuje się informacje o tzw. polimorfizmach jednonukleotydowych (SNPs), pozyskane dzięki analizie 178 spośród około 25 000 markerów mających związek z cechami fenotypowymi charakterystycznymi dla czterech podstawowych grup: Europejczyków, rdzennych Amerykanów, mieszkańców Azji Wschodniej oraz Afryki okołosaharyjskiej. I tak na przykład, wiedząc, że w badanym materiale 95 proc. SNPs uznano za typowe dla fenotypu europejskiego, raczej nie należy spodziewać się, że poszukiwana osoba jest ciemnoskóra. Konieczne jest oczywiście zachowanie dużej dozy ostrożności, ponieważ wyniki bywają niejednoznaczne. Jednak mimo tego mogą okazać się one bardzo pomocne, kiedy materiał biologiczny jest jedynym dowodem, jakim dysponujemy. Urszula Rogalla
*
Odkodowanie wyglądu
Dryf genetyczny, selekcja naturalna czy wreszcie pojawianie się mutacji to czynniki, które przez tysiące lat kształtowały zmienność genetyczną człowieka. I choć wielu chciałoby, aby różnic między nami nie było wcale, z punktu widzenia genetyki sądowej są one ze wszech miar pożądane.
W
nioskowanie o wyglądzie na podstawie DNA nie jest już tylko fikcją literacką. Prowadzone są intensywne prace nad ustaleniem korelacji genotypu z charakterystycznymi cechami fenotypowymi, m.in. pigmentacją skóry, tęczówki i włosów, sylwetką, kształtem oka czy twarzy, a nawet owłosieniem. Analizy tego typu nie należą oczywiście do najłatwiejszych, choćby ze względu na dziedziczenie wielogenowe czy subiektywną ocenę rysów twarzy.
*
Owady w służbie prawa Entomologia zajmuje szczególne miejsce w badaniach z zakresu medycyny sądowej. Jej podstawowym zadaniem jest określanie czasu zgonu w oparciu o pozostające na ciele ofiary owady.
D
oświadczony entomolog jest w stanie odpowiedzieć także na pytania o miejsce zgonu, a czasem również okoliczności. Zwykle anali-
zy tego rodzaju bazują na pomiarach cech morfologicznych owadów, co jednak bywa kłopotliwe, chociażby w przypadku gdy badacz ma do czynienia ze stadium larwalnym czy osobnikami, których cechy charakterystyczne uległy uszkodzeniu. Ustalenie gatunku jest w tym przypadku elementem kluczowym, stąd zwrot w kierunku genetyki. W tym celu opracowywane są metody identyfikacji
Odnotowano już jednak pierwsze sukcesy, np. znaleziono geny, które w głównej mierze odpowiadają za zależny od stężenia melaniny kolor włosów, skóry czy oka. Innymi słowy, wydaje się, że dzięki dostępności bardziej rzetelnych informacji o podejrzanym już wkrótce będzie możliwe ograniczenie roli naocznych świadków w postępowaniu! Urszula Rogalla
gatunkowej owadów – głównie na podstawie fragmentów sekwencji ich mtDNA. Przykładem jest sekwencjonowanie genu COI, które umożliwia rozróżnianie poszczególnych gatunków plujkowatych. Zaletą takich badań jest szybkość przeprowadzenia, a co ważniejsze – niezależność od stadium rozwoju czy żywotności owada. Urszula Rogalla
Copyright © 2008 Novimedia CP, wszelkie prawa zastrzeżone.
Genetyka i Prawo 3
NASZA DZIAŁALNOŚĆ
Fiat iustitia, et pereat mundus... Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej dysponuje kilkunastoletnim doświadczeniem w badaniach genetycznych wykonywanych dla potrzeb wymiaru sprawiedliwości. Stosując najnowsze techniki biologii i genetyki molekularnej, przeprowadzamy wszystkie rodzaje analiz genetycznych, które mogą być wykorzystane w procesie sądowym.
K
ażda zbrodnia w momencie ujawnienia choćby najdrobniejszego jej śladu nie jest już „zbrodnią doskonałą”. Nawet jeśli śladem jest tylko fragment włosa, kilka komórek nabłonka czy roztarta kropla krwi, sprawca niejako pozostawia nam swoją wizytówkę. A stąd już tylko krok do bezpowrotnej utraty anonimowości... – zwłaszcza jeśli w rozwiązywanie zagadki, prócz śledczych, zaangażowany będzie genetyk sądowy, który dla odkrycia prawdy nie zawaha się skorzystać z szerokiego wachlarza nowoczesnych metod biologii molekularnej.
Nasza codzienna praca. Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej Katedry Medycyny Sądowej CM UMK od wielu lat prowadzi owocną współpracę z organami wymiaru sprawiedliwości. W jej ramach przeprowadzamy analizy szeroko pojętej zmienności genetycznej, w tym polimorfizmu mikrostatelitów chromosomów autosomalnych i płciowych (STRs) oraz mitochondrialnego DNA. Metody te są przydatne nie tylko w identyfikacji osób podejrzanych o udział w przestępstwie, ale także ludzi zaginionych, ofiar zamachów czy masowych katastrof. Od
Po nitce do kłębka. Zautomatyzowane techniki analizy DNA są istotną częścią układanki, jednak dopiero dostęp do wielu stale rozbudowywanych populacyjnych baz danych daje nam możliwość poddania danych eksperymentalnych właściwej interpretacji statystycznej. To z kolei – w połączeniu z wykorzystaniem różnorodnych narzędzi filogenetycznych służących weryfikacji wyników badania – pozwala postawić przysłowiową kropkę nad„i”. Tak opracowany rezultat umożliwia stuprocentowe wykluczenie tożsamości osób, od których pochodzą poddawane badaniom ślady biologiczne, bądź też jej potwierdzenie z prawdopodobieństwem graniczącym z pewnością.
Siła w doświadczeniu. Doświadczenie... – to nie tylko tysiące różnorodnych spraw, w których rozwiązaniu pomagaliśmy sądom, prokuraturom i policji. To także znacznie szersze przedsięwzięcia, takie jak udział w identyfikacji szczątków ludzkich z masowych grobów w byłej
Prof. dr hab. Karol Śliwka
Dr hab. Tomasz Grzybowski
kierownik Katedry Medycyny Sądowej
kierownik ZGMiS
Stworzyliśmy laboratorium, które dorównuje renomowanym światowym ośrodkom o podobnym profilu. Dysponujemy najwyższej klasy sprzętem, w tym m.in. czterema automatycznymi analizatorami DNA, co pozwala na skrócenie czasu oczekiwania na wynik do niezbędnego minimum przy zachowaniu wysokiej jakości.
4 Genetyka i Prawo
kilkunastu lat prowadzimy również genetyczne badania pokrewieństwa, najczęściej zajmując się dochodzeniem spornego ojcostwa.
Zdarza się, że z zabezpieczonego materiału dowodowego trudno uzyskać DNA o jakości odpowiedniej do badań. Wtedy uciekamy się do innych metod – analiz mitochondrialnego DNA. Dzięki tej małej cząsteczce identyfikacja jest możliwa nawet kiedy materiału jest niewiele, dysponujemy jedynie włosem pozbawionym cebulki lub niewielkim fragmentem kości.
Jugosławii – największym tego typu projekcie na świecie. Byliśmy jednym z zaledwie dwóch laboratoriów spoza krajów byłej Jugosławii, które zostały zaproszone do współpracy przez Międzynarodową Komisję ds. Osób Zaginionych (ICMP), instytucję powołaną w roku 1996 na szczycie państw G7 w Lionie. Badania nie należały do łatwych ze względu na znaczną degradację materiału genetycznego i konieczność stosowania kombinacji wielu różnych metod, dlatego nikt nie spodziewał się, że zdołamy określić profil ponad 90 proc. powierzonych nam próbek. Przykłady takie, jak choćby zwieńczona sukcesem identyfikacja ciał 23 ofiar katastrofy w kopalni „Halemba”, pozwoliły nam dobrze przygotować się do zmierzenia z innymi wymagającymi sprawami – zarówno pod względem merytorycznym, jak i technicznym.
Jakość, której można zaufać. Pomimo że nierzadko pracujemy pod silną presją czasu, staramy się unikać nawet drobnych błędów czy wątpliwości. Stąd pojawia się konieczność rygorystycznego przestrzegania zasady przestrzennego i czasowego rozdziału procedur
Dr Marcin Woźniak
Wieloletnie doświadczenie sprawia, że nie dajemy się zaskoczyć. Każdą wątpliwość traktujemy jak wyzwanie. Modyfikujemy na przykład stosowane standardowo metody badawcze, jeśli tylko zachodzi taka konieczność, co umożliwia rzetelną identyfikację nawet nietypowego materiału, w tym również pochodzenia zwierzęcego.
badania DNA świeżego i zdegradowanego, wykonywania podwójnych analiz, jak i stałego monitorowania czystości materiału. Bardzo istotne jest, by w parze z doświadczeniem szła także jakość. Dlatego, by zapewnić jak największą wiarygodność naszych wyników, dwukrotnie w ciągu roku poddajemy przeprowadzane przez nas analizy genetyczne międzylaboratoryjnej weryfikacji przez Niemiecką Grupę Profilowania DNA (GEDNAP), uzyskując pozytywne wyniki. Posiadamy także aktualne atesty wydawane przez Polskie Towarzystwo Medycyny Sądowej i Kryminologii (PTMSiK) w zakresie badania śladów biologicznych i dochodzenia ojcostwa. Potwierdzeniem naszej renomy jest także uczestnictwo we współtworzeniu ogólnoświatowej bazy danych sekwencji mtDNA dla celów identyfikacyjnych. Stało się to możliwe po pozytywnym przejściu kontroli w zakresie wykonywania badań polimorfizmu mitochondrialnego DNA, przeprowadzonej przez laboratorium genetyczne FBI (Waszyngton, USA). W następstwie innych eksperymentów międzynarodowych uzyskaliśmy kwalifikacje i zaproszenia do tworzenia ogólnoświatowej bazy danych haplotypów loci STR chromosomu Y (Y-HRD), jak i Populacyjnej Bazy Danych mtDNA (EMPOP).
* * * W rozważaniach dotyczących przydatności analiz DNA warto mieć na uwadze wyniki badań przeprowadzonych przez „The Innocence Project”. Określają one wiarygodność zeznań naocznych świadków, a zatem najczęściej wykorzystywanego w postępowaniach materiału dowodowego. Wynosi ona zaledwie 50 proc., podczas gdy wykonywane w naszym zakładzie testy pozwalają rozstrzygać choćby kwestie spornego ojcostwa z pewnością przekraczającą 99,9999 proc.! Tomasz Grzybowski
Dr Marta Gorzkiewicz
Zaawansowane technologie oraz duże doświadczenie zespołu pozwalają nam na podejmowanie się rozwiązania niezwykle trudnych i skomplikowanych przypadków. Jesteśmy w stanie ustalić ojcostwo nawet w sytuacji, gdy domniemany ojciec nie żyje – na podstawie badań jego krewnych.
*
Solidny fundament
Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej ZGMiS wykorzystuje w swojej pracy najnowsze zdobycze nauki
Kiedy w 2002 roku zdecydowaliśmy się przekształcić Pracownię Serohematologii Sądowo-Lekarskiej w Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej, za cel postawiliśmy sobie nieustanny i możliwie wszechstronny rozwój. Cóż w tym oryginalnego, spytają niektórzy... Odpowiedź jest prosta – tym, co odróżnia nas od wielu innych, jest zamiłowanie do nauki. Śledzimy na bieżąco najświeższe doniesienia naukowe, wobec czego łatwiej nam pracować nad trudnymi czy z pozoru niemożliwymi do rozstrzygnięcia sprawami. Prawdziwą korzyścią dla nas jest współpraca z czołowymi światowymi ośrodkami o podobnym profilu, między innymi przy współtworzeniu populacyjnych baz danych. Zawartość takich baz stanowi zresztą nieocenione źródło wiedzy, kluczowe dla przeprowadzenia właściwej analizy statystycznej niezbędnej przy opiniowaniu. Dzięki rozległym projektom, takim jak np. badania zróżnicowania genetycznego populacji Eurazji, jesteśmy w stanie spojrzeć nieco szerzej na niektóre aspekty analizowanych spraw. Publikacje Zakładu Genetyki Molekularnej i Sądowej dotyczą nie tylko metodyki badań polimorfizmu jądrowego czy mitochondrialnego DNA, ale również ich praktycznych zastosowań. Chętnie sięgamy po najnowsze zdobycze bioinformatyki czy filogenetyki molekularnej – są nam one doskonale znane z codziennej praktyki naukowej. Przez lata wypracowaliśmy odpowiedni warsztat umożliwiający rozwijanie, doskonalenie i dostosowywanie do naszych potrzeb dostępnych metod analitycznych. To innowacyjność w parze z doświadczeniem zdają się być cechami pozwalającymi mierzyć się z najtrudniejszymi zadaniami. Karol Śliwka
Genetyka i Prawo 5
WYWIAD NUMERU
dawcy śladu biologicznego z miejsca zbrodni. Wykluczenie to jest zazwyczaj absolutne. Wiele innych dowodów przyjmowanych w orzecznictwie sądowym nie daje tak jasnej odpowiedzi. Jeśli jednak nie mamy do czynienia z wykluczeniem, tj. występuje zgodność profilu mtDNA podejrzanego z profilem uzyskanym ze śladu ujawnionego na miejscu zbrodni, trzeba dokonać statystycznej interpretacji tego potwierdzenia.
Profesor Walther Parson, ekspert w dziedzinie genetyki sądowej oraz kierownik projektu sądowej bazy danych EMPOP
EMPOP – przełom w analizach mtDNA Statystyczna interpretacja wyników jest jednym z największych wyzwań w badaniach mitochondrialnego DNA dla celów sądowych. EMPOP, nowa baza danych sekwencji mtDNA, stanowi w tej kwestii zupełnie nową jakość.
Wyniki badania mtDNA należy tu traktować inaczej niż dane uzyskane z analizy DNA jądrowego, gdyż mtDNA odznacza się innym sposobem dziedziczenia. Jest on przekazywany wyłącznie w linii matczynej i dlatego, pomijając mutacje, jest identyczny u matki i jej potomstwa. Każdy wynik badania mtDNA należy zatem traktować jako tzw. haplotyp, który jest taki sam u osób spokrewnionych w linii matczynej. Aby dokonać oceny częstości takiego haplotypu, należy go porównać ze zbiorem innych haplotypów, zdeponowanych zwykle w tzw. bazach danych mtDNA. Bazy takie mogą zawierać błędy wynikające z przyczyn technicznych i organizacyjnych. Wiąże się to z dużym stopniem złożoności analizy mtDNA, a także z pomyłkami popełnianymi przez człowieka podczas kopiowania danych. Ponieważ większość błędów ma charakter losowy, skutkują one zazwyczaj pojawieniem się w bazie nowych, nieobserwowanych dotąd haplotypów. W konsekwencji częstość jakiegokolwiek autentycznego haplotypu mtDNA maleje wraz ze wzrostem liczby błędnych haplotypów w bazie – częstość profilu mtDNA podejrzanego staje się niższa, a stąd zgodność pomiędzy profilami podejrzanego a śladem pozostawionym na miejscu przestępstwa nabiera większego znaczenia. Stawia to podejrzanego w niekorzystnej sytuacji i nie da się pogodzić z naszymi systemami prawnymi.
Urszula Rogalla
Rozmowa z profesorem Waltherem Parsonem Urszula Rogalla Panie Profesorze, co sprawia, że mitochondrialny DNA jest użytecznym narzędziem w badaniach sądowych?
Prof. Walther Parson Genom mitochondrialny jest obecny w komórce w znacznie większej liczbie kopii niż genom jądrowy. W zależności od rodzaju tkanki jest to od kilkudziesięciu do kilku tysięcy cząsteczek mtDNA. Dlatego też jego analiza odznacza się większą czułością. Oczywiste jest zatem, że badania mtDNA mogą dostarczyć istotnych infor6 Genetyka i Prawo
macji w przypadkach, w których zawodzą metody analizy jądrowego DNA.
Urszula Rogalla Interpretacja statystyczna jest nieodłącznym elementem badań mtDNA. Co może być źródłem najczęstszych błędów w statystycznej kwalifikacji wyników?
Prof. Walther Parson Największy potencjał jakiegokolwiek testu DNA, a szczególnie DNA mitochondrialnego, tkwi w możliwości wykluczenia podejrzanego jako
W ciągu ostatnich lat powstało kilka baz danych mtDNA funkcjonujących do dziś. Co tkwi u podstaw założenia kolejnej bazy?
Prof. Walther Parson Czas rozkwitu analiz mtDNA dla potrzeb sądowych przypada na wczesne lata 90. Przeprowadzono wtedy szereg badań populacyjnych, których wyniki znalazły się w bazach danych. W tym początkowym okresie błędy popełniano częściej niż dziś, posługiwano się bowiem niedoskonałą aparaturą oraz słabiej zoptymalizowanymi procedurami badań biochemicznych. Mniejsza była również świadomość popełnianych błędów. Niektóre bazy danych powstałe w tym czasie już nie istnieją.
Dostępne obecnie sądowe bazy zawierają około 12 000 haplotypów. Niektóre populacje są w nich licznie reprezentowane, inne wręcz przeciwnie. Musimy podjąć wysiłki zmierzające do powiększenia zasobu informacji, zwłaszcza dla populacji słabiej rozpoznanych. W większo-
Prof. Walther Parson Haplotypy przechowywane w bazie powstały we współpracy z innymi ośrodkami uniwersyteckimi i rządowymi. Czasami naukowcy przywozili ze sobą próbki do Innsbrucku, aby tam poznawać technologię badań mtDNA i analizo-
„ EMPOP jest sądową bazą profili mtDNA, której przyświeca idea niespotykanej dotąd ścisłej kontroli jakości danych, centralnego zarządzania oraz spójności nomenklatury ” ści baz danych mtDNA znajdują się nieścisłości dotyczące nomenklatury haplotypów. Dzieje się tak dlatego, że sekwencje mtDNA można wzajemnie porównywać i opisywać w różny sposób. Przeszukiwanie takich baz może dawać niejednoznaczne wyniki. Istotny jest fakt, że środowisko genetyków sądowych dostrzega ten problem, dążąc do ujednolicenia nomenklatury. Są więc powody, dla których w przyszłości nie zabraknie nam pracy i nowych projektów.
Urszula Rogalla Sądowa baza danych EMPOP stanowi całkiem nową jakość. Co w sposób istotny odróżnia ją od innych baz danych?
wać swoje próbki razem z naszymi ekspertami. Dane są publikowane i (lub) deponowane w bazie EMPOP. Inne instytucje współtworzą bazę, przysyłając swoje surowe dane eksperymentalne, które są następnie weryfikowane w Innsbrucku. W pierwszym wydaniu bazy dostępnym online znalazły się 5173 haplotypy z różnych populacji. Niebawem środowisku naukowemu przedstawione zostanie drugie wydanie, z większą liczbą haplotypów i nowymi narzędziami do analizy danych.
Urszula Rogalla Jaki jest wkład polskich laboratoriów do bazy, skoro większość danych pochodzi od współpracujących ośrodków?
Prof. Walther Parson Polska jest bardzo aktywnym współtwórcą EMPOP-u. Do tej pory gośćmi naszego laboratorium byli członkowie dwóch zespołów badawczych: z Bydgoszczy i z Krakowa. W ramach projektu dostarczyli swoje dane i podzielili się doświadczeniem. Wzbogacili bazę haplotypami pochodzącymi również spoza Polski, uzyskanymi w ramach pracy naukowej. Bardzo aktywnym współpracownikiem EMPOP-u od najwcześniejszych etapów projektu jest dr hab. Tomasz Grzybowski z Zakładu Genetyki Molekularnej i Sądowej w Bydgoszczy. Wniósł on istotny wkład do bazy, dzieląc się danymi i doświadczeniem naukowym.
Urszula Rogalla Jakie dostrzega Pan kierunki dalszego rozwoju bazy EMPOP?
Prof. Walther Parson Konieczne jest zwiększenie liczby próbek z niektórych światowych populacji. Potrzebujemy również ujednolicenia sposobu porównywania sekwencji mtDNA i ich nomenklatury. W kwestiach statystycznych – dowody z badań mtDNA przedstawiane były do tej pory za pomocą „zliczania haplotypów”, tj. określania, jak często dany haplotyp obserwowany jest w bazie danych. Potrzebne są bardziej zaawansowane metody, dające lepszą orientację co do rzeczywistej częstości występowania haplotypu w populacji. W przyszłości jednym z celów będzie połączenie dowodów z analizy DNA mitochondrialnego i jądrowego za pomocą zaawansowanych rozwiązań informatycznych.
Prof. Walther Parson EMPOP jest bazą, której przyświeca idea niespotykanej dotąd ścisłej kontroli jakości danych, centralnego zarządzania oraz wspomnianej wcześniej spójności nomenklatury. Wszystkie haplotypy znajdujące się w„sądowej” części EMPOP-u zostały zweryfikowane z największą możliwą starannością. Każdy haplotyp został potwierdzony poprzez sekwencjonowanie obu nici DNA, sekwencje zostały sprawdzone przez trzy niezależne zespoły oraz poddane analizie filogenetycznej a posteriori. Haplotyp umieszczony w bazie ma swoje pokrycie w wynikach badań eksperymentalnych, które są przechowywane w naszym instytucie, co umożliwia późniejszą weryfikację danych. EMPOP jest bazą zarządzaną centralnie, lecz jednocześnie otwartą i opracowywaną zespołowo. Do jej powstania w obecnym kształcie przyczynili się nasi współpracownicy z wielu krajów, którzy nie ustają w wysiłkach, by zwiększyć jej użyteczność.
*
BIOGRAM PROFESOR WALTHER PARSON Jest kierownikiem laboratorium biologii molekularnej i sądowej w Instytucie Medycyny Sądowej Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku (Austria). Ekspert w dziedzinie genetyki sądowej i autorytet w skali międzynarodowej. W roku 2004 otrzymał nagrodę Niemieckiego Towarzystwa Medycyny Sądowej, a rok później stał się laureatem nagrody Międzynarodowego Stowarzyszenia Genetyki Sądowej (ISFG) za osiągnięcia w dziedzinie analizy mtDNA, zwłaszcza za kierowanie projektem sądowej bazy danych EMPOP.
Uznanie dla doświadczenia naukowego prof. Parsona znalazło wyraz m.in. w zaproszeniu go do rady naukowej Międzynarodowej Komisji ds. Osób Zaginionych (ICMP). Jego zespół wykonywał analizy DNA w głośnych sprawach identyfikacyjnych, m.in. przy ustalaniu tożsamości ofiar tsunami w Sri Lance, identyfikacji szczątków brata znanego alpinisty Reinholda Messnera czy też przy analizie domniemanej czaszki Mozarta. Laboratorium prof. Parsona zarządza Narodową Bazą Danych Profili DNA austriackiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.
Urszula Rogalla Jak rozwijana jest baza – skąd pochodzą haplotypy, których liczba ciągle wzrasta? Genetyka i Prawo 7
CIEKAWE PRZYPADKI
Czynnik ekonomiczny w przypadku identyfikacji genetycznej jest szczególnie istotny, gdyż takie badania są najczęściej zlecane przez instytucje rządowe, dysponujące ograniczonym budżetem i kierujące się tzw. „ekonomiką procesową”. Warunki te muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu systemów identyfikacji genetycznej, których wytwarzanie stało się domeną kilku dostawców komercyjnych – głównie z USA i Europy Zachodniej. Kraje bogatego Zachodu są również głównym miejscem zbytu dla systemów identyfikacji genetycznej, dlatego też systemy takie są przygotowywane i testowane głównie pod kątem ich wykorzystania do identyfikacji DNA osób z populacji zamieszkujących USA i Europę. Oczywiście możliwe jest wykorzystywanie tych samych systemów identyfikacji genetycznej do badania populacji innych regionów świata, jednak w tym przypadku należy zachować daleko posuniętą ostrożność – nieuwzględnienie pochodzenia etnicznego badanych osób może prowadzić do poważnych błędów w opiniowaniu.
Namnożenie fragmentu genu amelogeniny to najczęściej stosowana metoda określania płci
Chromosomy X i Y czy X i X? Jedną
Mężczyzna czy kobieta? Ustalanie płci na podstawie analizy DNA weszło na stałe do repertuaru badań wykonywanych w laboratoriach zajmujących się genetyką sądową. Czasem jednak genetyczne oznaczanie płci bywa problematyczne.
z metod najpowszechniej stosowanych w identyfikacji genetycznej jest analiza płci osoby, od której pochodzi badana próbka. Technika ta wykorzystuje fakt, iż genom mężczyzny różni się od genomu kobiety obecnością odmiennych chromosomów płciowych – oznaczanych literami X i Y, podczas gdy w genomie kobiety występują dwie praktycznie identyczne kopie chromosomu X. Metody identyfikacji płci opierają się na wykrywaniu obecności chromosomów płciowych poprzez namnożenie krótkiego fragmentu każdego z tych chromosomów – metodą znaną jako PCR (patrz: słowniczek) i poprzez analizę obecności produktów charakterystycznych dla każdego z chromosomów płciowych. W tego typu analizie – w przypadku DNA pochodzącego od kobiety – powinien zostać wykryty wyłącznie odcinek DNA pochodzący z chromosomu X, a w przypadku DNA mężczyzny – zarówno DNA chromosomu X, jak i DNA chromosomu Y.
stosunkowo prostego testu, podczas którego namnaża się fragment genu amelogeniny, a następnie analizuje się długość powstałych produktów reakcji namnożenia: • obecność jednego, krótszego fragmentu DNA oznacza w tym teście, że w danej próbce występuje gen amelogeniny obecny tylko w chromosomie X, próbka zawiera więc tylko chromosom X – pochodzi zatem od kobiety; • obecność w teście zarówno krótszego, jak i dłuższego fragmentu genu amelogeniny oznacza, że zawiera ona zarówno chromosom X, jak i chromosom Y – pochodzi zatem od mężczyzny.
B
8 Genetyka i Prawo
dzi. Dopiero przemyślane rozszerzenie zakresu prowadzonych analiz pozwala na prawidłowe ustalenia.
Rozwój identyfikacji genetycznej. Wprowadzenie metod genetyki molekularnej do medycyny sądowej – a w szczególności zastosowanie ich do identyfikacji pochodzenia materiału biologicznego od konkretnych osób – stanowiło ogromny przełom w dziedzinie identyfikacji osobniczej. Techniki identyfikacji osob-
niczej powstałe w połowie lat 80. ubiegłego wieku były z początku domeną niewielkiej grupy wysoce wyspecjalizowanych naukowców. Rodzące się zapotrzebowanie na badania tego typu spowodowało gwałtowny rozwój dziedziny wiedzy, którą nazywamy identyfikacją genetyczną. Główne kierunki tego rozwoju to: • zwiększenie siły dowodowej prowadzonych analiz, • zwiększenie ich czułości, • redukcja czasu i kosztów badań.
stosuje się namnożenie krótkiego fragmentu genu amelogeniny (patrz: słowniczek). Gen ten obecny jest zarówno w chromosomie X, jak i w chromosomie Y, przy czym jego kopie w tych chromosomach różnią się od siebie w kilku miejscach. Wykazano między innymi, że na pewnym odcinku DNA genu amelogeniny – w jego kopii znajdującej się w chromosomie Y – występuje sześć dodatkowych par zasad. Innymi słowy, ten odcinek genu jest w chromosomie Y nieco dłuższy niż w chromosomie X. Obserwacja ta doprowadziła do opracowania
Wyniki standardowego testu amelogeniny, określającego płeć osoby, od której pochodzi badany materiał. Na osi poziomej oznaczono wielkość otrzymanych produktów w parach zasad (p.z.). W przypadku DNA kobiety widoczny jest jeden produkt namnażania, pochodzący z pary chromosomów X, liczący 105 p.z. (ilustracja 1).
Test ten stał się swego rodzaju standardem w dziedzinie genetyki sądowej i jest stosowany praktycznie we wszystkich systemach identyfikacji genetycznej dostępnych komercyjnie.
W przypadku DNA mężczyzny widoczne są dwa produkty: krótszy, liczący 105 p.z. z chromosomu X i dłuższy, liczący 111 p.z., z chromosomu Y (ilustracja 2).
Mężczyzna czy kobieta? Standardowy test na obecność fragmentów genu amelogeniny został również zastosowany w jednej ze spraw prowadzonych w naszym zakładzie. Dotyczyła ona zabójstwa osoby pochodzenia hinduskiego, którą dla potrzeb niniejszej publikacji będziemy określać jako J.P. Ślady z miejsca zabójstwa, jak również materiał porównawczy od tej osoby zostały do nas dostarczone w celu określenia, czy ujawnione na miejscu zabójstwa ślady pochodzą od J.P. Imię denata nie wskazywało jednoznacznie na jego płeć, lecz z informacji otrzymanych przez zakład wynikało, że był on mężczyzną. Wyniki badań genetycznych śladów zabezpieczonych na miejscu zabójstwa sugerowały, że wszystkie one pochodzą od kobiety – we wszystkich stwierdzono bowiem obecność tylko jednego krótkiego produktu genu amelogeniny, charakterystycznego dla chromosomu X. Po zakończeniu analizy śladów biologicznych przeprowadzono badania profilu DNA materiału porównawczego i okazało się, że również w DNA denata występował jedynie fragment genu amelogeniny charakterystyczny dla kobiety!
Standardowy test. W praktyce najczęściej adanie płci polega na określeniu, czy w próbce DNA występuje charakterystyczna mutacja, obecna w genie amelogeniny. Mutacja ta obecna jest tylko w chromosomie Y, czyli wyłącznie u mężczyzn. Kopia tego genu obecna w chromosomie X nie posiada wspomnianej mutacji. Taki sposób oznaczania płci jest stosunkowo prosty i tani, ale czy zawsze skuteczny...? Opisany przypadek pokazuje, że w praktyce spotykamy się z sytuacjami, w których rutynowe metody dają błędne odpowie-
*
OKREŚLANIE PŁCI
ILUSTRACJA 1 DNA kobiety
ILUSTRACJA 2 DNA mężczyzny
ILUSTRACJA 3 Wyniki badań amelogeniny próbki DNA od J.P.
Profil genetyczny J.P. ustalony w zakresie 15 innych układów DNA oraz profil amelogeniny były zgodne z profilami oznaczonymi dla śladów zabezpieczonych z miejsca zabójstwa. Prawdopodobieństwo przypadkowego powtórzenia się takiego profilu w populacji polskiej wynosi dla badanych układów zaledwie ok. 1 na 11 040 939 579 177 900, a w populacji hinduskiej ok. 1 na 10 081 882 055 888 osób, zatem nie wchodziła w grę możliwość pomyłki przy wysyłaniu materiału porównawczego do badań. Genetyka i Prawo 9
CIEKAWE PRZYPADKI
PIĘĆ PYTAŃ DO...
„Konkluzje z badań genetycznych powinny uwzględniać informacje o pochodzeniu etnicznym osób związanych ze sprawą” „Europocentryzm” metod identyfikacji. Wyjaśnienie zjawiska musiało zatem mieć związek z testem wykorzystanym do oznaczenia płci. Analiza literatury naukowej poświęconej zmienności genu amelogeniny pozwala wysnuć wniosek, iż możliwa jest sytuacja, w której fragment genu amelogeniny charakterystyczny dla chromosomu Y nie ulega namnożeniu w standardowym teście. Wynika to najczęściej z tzw. delecji – drobnych ubytków w DNA chromosomu Y, które obejmują również część chromosomu zawierającą gen amelogeniny. Chromosom Y z ubytkiem funkcjonuje najczęściej prawidłowo, jednak próba wykrycia w nim obecności genu amelogeniny daje wyniki ujemne. W populacjach pochodzenia europejskiego takie ubytki są
* SŁOWNICZEK Amelogenina – białko biorące udział w tworzeniu szkliwa nazębnego. Kodowane jest przez gen znajdujący się w chromosomie X, ale nieczynna, zmutowana kopia tego genu obecna jest również w chromosomie Y, w tzw. regionie pseudoautosomalnym.
niezwykle rzadkie, występują bowiem u jednego mężczyzny na kilka tysięcy. Jednak w populacjach innych regionów świata, szczególnie w populacjach Azji Południowej, występują o wiele częściej – nawet z częstością ok. 2 proc., czyli u jednego na 50 mężczyzn. Wynika z tego, że rezultat badań genu amelogeniny, wskazujący, iż J.P jest kobietą – podczas gdy w rzeczywistości był on mężczyzną – jest wynikiem nietypowym dla populacji europejskich, ale dość częstym w populacjach Azji, z których wywodził się J.P. Otrzymany rezultat obrazuje zatem swego rodzaju „europocentryzm” dostępnych na rynku systemów identyfikacji osobniczej.
Dalsze kroki badawcze. Analiza materiału dowodowego dostępnego w sprawie J.P. nie zakończyła się oczywiście domniemaniami ewentualnych ubytków w jego chromosomie Y – ustalenia płci osoby muszą mieć charakter kategoryczny. W dalszych badaniach oparliśmy się na założeniu, że w chromosomie Y denata faktycznie występuje drobny ubytek obejmujący gen amelogeniny. Próba namnożenia innych fragmentów chromosomu Y w częściach tej cząsteczki DNA oddalonych od miejsca, gdzie zlokalizowany jest gen amelogeniny, powinna dać zatem wynik dodatni. Uzyskanie produktów namnażania innych fragmentów chromosomu Y stanowiłoby potwierdzenie, iż badana próbka DNA rzeczywiście pochodzi od mężczyzny.
PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) – reakcja biochemiczna wykorzystująca enzymy i substraty biorące udział w replikacji DNA i umożliwiająca otrzymanie in vitro niemal dowolnej liczby kopii wybranego, stosunkowo krótkiego odcinka DNA. Tę reakcję można porównać do wykonania wielu kserokopii pojedynczej kartki z grubej książki, gdzie książka to całkowity DNA danej próbki, a kartka to wybrany odcinek tego DNA. Zastosowanie PCR pozwala na otrzymanie z niewielkiej ilości materiału wyjściowego dużych ilości wybranych fragmentów DNA, wystarczających do przeprowadzenia dalszych analiz.
10 Genetyka i Prawo
Aby uzyskać takie potwierdzenie, wykorzystaliśmy komercyjnie dostępny system pozwalający na jednoczesne namnożenie 17 fragmentów chromosomu Y rozrzuconych na całej jego długości. Reakcja ta pozwoliła na otrzymanie produktów namnażania ze wszystkich 17 miejsc w chromosomie Y, co potwierdziło domniemanie, że ubytek DNA w tym chromosomie obejmuje stosunkowo niewielki jego odcinek. Dodatkowe analizy wykazały, że profil genetyczny chromosomu Y denata jest zgodny w obrębie namnożonych fragmentów z profilem chromosomów Y innych mężczyzn wywodzących się z populacji hinduskiej, u których stwierdzono ubytek w obrębie genu amelogeniny. Ostateczna konkluzja zawarta w opinii wydanej przez
nasz zakład wskazywała, iż ślady ujawnione na miejscu zabójstwa pochodzą od mężczyzny posiadającego mutację w obrębie genu amelogeniny i że tym mężczyzną – z prawdopodobieństwem graniczącym z pewnością – jest J.P.
Prokuratura często wykorzystuje w swojej pracy wyniki analiz genetycznych
Podsumowując powyższe rozważania, warto pamiętać, że konkluzje wyciągane z wyników badań genetycznych powinny być uzależnione od całościowej analizy sprawy, a w szczególności powinny uwzględniać informacje dotyczące pochodzenia etnicznego osób związanych ze sprawą. Brak takich informacji może prowadzić do błędów w opiniowaniu, włącznie z błędnym określeniem płci osoby, od której pochodzą badane ślady. Stosunkowo często w toku analizy śladów biologicznych z miejsca zdarzenia ujawniany jest nie tylko materiał genetyczny osób, których związek z danym zdarzeniem jest znany, ale również osób postronnych lub takich, o których obecności w danym miejscu nie było wcześniej wiadomo. W takich przypadkach prawidłowe oznaczenie płci jest szczególnie istotne, gdyż jego wynik może ukierunkować dalsze czynności śledcze. Dodatkowym utrudnieniem w analizie śladów pochodzących od osób niewiązanych wcześniej ze sprawą jest brak informacji o ich przynależności etnicznej. W świetle przytoczonych wcześniej danych oraz biorąc pod uwagę panującą obecnie na świecie dużą łatwość przekraczania granic i zmiany miejsca pobytu, nie można wykluczyć, że wśród osób związanych ze śladami biologicznymi ujawnionymi w miejscu przestępstwa mogą znaleźć się i takie, które wywodzą się z populacji o specyficznych cechach DNA, utrudniających prawidłową interpretację wyników standardowych testów genetycznych prowadzonych dla potrzeb identyfikacji osobniczej.
Biegli genetycy docenieni „Pozycja biegłych genetyków jest wysoka i stale rośnie”, twierdzi prokurator Michał Szułczyński – Rzecznik Prasowy i Naczelnik Wydziału Śledczego Prokuratury Okręgowej w Gliwicach – w rozmowie z Tomaszem Grzybowskim. Michał Szułczyński
* PROFIL
MICHAŁ SZUŁCZYŃSKI Kieruje pracą Działu do Spraw Przestępczości Kryminalnej. Podejmuje inicjatywy na odcinku współdziałania prokuratury z organami kontroli, czuwa nad rytmiką i terminowością postępowań przygotowawczych Działu do Spraw Przestępczości Kryminalnej. Sprawuje też nadzór nad pracą pracowników sekretariatu realizujących zadania na rzecz
W przypadku konkretnych mutacji, takich jak mutacje w genie amelogeniny, skutecznym sposobem uniknięcia błędów w ustalaniu płci jest rozszerzenie zakresu analizowanych fragmentów chromosomu Y. Można więc przyjąć, że zastosowanie rozszerzonej analizy chromosomu Y we wszystkich przypadkach, w których ujawniany jest ślad pochodzący od niezidentyfikowanej osoby o profilu amelogeniny wskazującym na kobietę, praktycznie wyklucza możliwość błędnego określenia płci. Regułę taką wprowadzono w Zakładzie Genetyki Molekularnej i Sądowej CM UMK w Bydgoszczy. Marcin Woźniak
Już w kilkanaście godzin po wybuchu metanu – po ustaleniu liczby pokrzywdzonych – zdecydowaliśmy, że dla pewnej identyfikacji ofiar niezbędne będą badania DNA. Z perspektywy czasu mogę powiedzieć, że gdyby nie identyfikacja poprzez DNA, mogłoby dojść do wielu przykrych konsekwencji, również dla osób prowadzących śledztwo. Dzisiaj mogę stwierdzić, że podczas identyfikacji ciał ofiar wybuchu, po sekcji zwłok przeprowadzonej w Zakładzie Medycyny Sądowej w Katowicach, kilka rodzin rozpoznało te same zwłoki jako członków swojej rodziny.
Wydziału V.
Panie Prokuratorze, katastrofa w kopalni „Halemba” w Rudzie Śląskiej jest do dzisiaj przedmiotem śledztwa Prokuratury Okręgowej w Gliwicach. Bezpośrednio po wybuchu metanu 21 listopada 2006 r. kluczową kwestią wydawała się jednak identyfikacja ciał dwudziestu trzech górników, ofiar katastrofy. Jak z dzisiejszej perspektywy ocenia Pan użyteczność badań DNA, które posłużyły do identyfikacji?
Czas, w którym otrzymaliśmy 23 ekspertyzy, był zadowalający. Wyniki dotarły do nas w przeciągu kilku dni. Przypomnę, że pracowaliście Państwo także w dni wolne od pracy, a więc w sobotę i niedzielę.
Tomasz Grzybowski Czy raporty z badań były zrozumiałe dla rodzin ofiar?
Michał Szułczyński Tak. Kilka rodzin po zapoznaniu się z ekspertyzami poprosiło nawet o ich kopie.
Tomasz Grzybowski Co zadecydowało o wyborze ośrodka naukowego, w którym przeprowadzono badania identyfikacyjne?
Michał Szułczyński Tomasz Grzybowski
Michał Szułczyński
Przede wszystkim znakomite osiągnięcia naukowe pracujących tam osób, renoma ośrodka naukowego, a także szybkość wykonania identyfikacji i przedstawienia śledczym opinii.
Tomasz Grzybowski Prokuratura działała pod ogromną presją czasu, gdyż rodziny górników chciały jak najszybciej dokonać pochówku swoich bliskich. Czy czas wykonania ekspertyz genetycznych był zadowalający?
Tomasz Grzybowski Jakie miejsce zajmują genetycy wśród biegłych wykonujących badania dla prokuratury? Czy w swojej pracy prokuratorzy chętnie korzystają z możliwości, jakie oferuje współczesny warsztat genetyki molekularnej?
Michał Szułczyński Genetycy zajmują wśród biegłych bardzo wysoką pozycję, która od kilku lat stale rośnie. Prokuratorzy w swojej pracy bardzo często zasięgają opinii biegłych genetyków i korzystają z ich wiedzy – i to nie tylko w sytuacjach, gdy dochodzi do takiej tragedii, jaka miała miejsce w Rudzie Śląskiej w listopadzie 2006 r. Genetyka i Prawo 11
METODY BADAWCZE
MtDNA kluczem identyfikacyjnym Metoda badania mitochondrialnego DNA jest niezastąpiona w sytuacji, gdy standardowe techniki badawcze nie pozwalają na określenie poszukiwanej tożsamości. MtDNA jest więc kluczem do rozwiązania najtrudniejszych zagadek identyfikacyjnych.
A
naliza mitochondrialnego DNA służy przede wszystkim do ustalania tożsamości ofiar masowych katastrof, identyfikacji pojedynczych włosów pozbawionych cebulki włosowej oraz identyfikacji starych lub zniszczonych szczątków ludzkich.
1. IDENTYFIKACJA WŁOSÓW POZBAWIONYCH CEBULKI WŁOSOWEJ Pojedyncze włosy ludzkie są częstymi dowodami biologicznymi w sprawach kryminalnych. Jednak analizy sekwencji mtDNA z włosów, zwłaszcza pozbawionych cebulki włosowej, są jednymi z najbardziej skomplikowanych badań w genetyce sądowej. Mają z nimi problemy nawet najbardziej renomowane ośrodki badawcze na świecie. W łodydze włosa nie ma bowiem jądrowego DNA. Jest za to mtDNA, lecz w niewielkich ilościach. Podczas analizy takich próbek
istnieje duże ryzyko wprowadzenia kontaminacji pochodzących z zewnątrz – np. z laboratorium lub od badaczy. W konsekwencji wynik nie jest autentyczny. Laboratorium musi umieć sobie radzić z zanieczyszczeniami. W Zakładzie Genetyki Molekularnej i Sądowej CM UMK, gdzie takie badania wykonywane są od ponad dziesięciu lat, istnieje odrębny ciąg pomieszczeń laboratoryjnych, w których wykonuje się wyłącznie analizy z materiału genetycznego dostępnego w niewielkich ilościach. Ogranicza to ryzyko powstawania zanieczyszczeń do minimum.
Dzielenie włosa na czworo. Przypadek, jaki miał miejsce w naszym zakładzie, wydawał się typowy – włos pozbawiony cebulki włosowej pozostawiony na ciele ofiary zabójstwa był jedynym biologicznym dowodem w sprawie. Długość łodygi włosa wynosiła około 4 cm.
Analiza mtDNA włosa pozwala na wskazanie sprawcy przestępstwa
12 Genetyka i Prawo
Jako materiał porównawczy zabezpieczono wymaz ze śluzówki policzka podejrzanego. Materiał dowodowy (włos) i porównawczy (wymaz) zostały poddane analizie przez dwa odrębne zespoły, pracujące w innych pomieszczeniach i w różnym czasie. „Po dokonaniu oględzin mikroskopowych sugerowałem, aby podzielić włos na dwie części i przeprowadzić dwie odrębne analizy mtDNA dla obu części łodygi”, mówi dr Jarosław Bednarek, antropolog odpowiedzialny za morfologiczno-porównawcze analizy włosów.
Badawcza niespodzianka. Wynik okazał się zaskakujący. Z pierwszego fragmentu łodygi uzyskaliśmy profil mtDNA charakterystyczny dla osoby pochodzenia azjatyckiego. W interpretacji pomogła nam wiedza na temat ewolucji ludzkiego mitochondrialnego DNA. Pulę mtDNA populacji ludzkich można podzielić na tzw. haplogrupy, czyli zbiory cząsteczek pochodzących od wspólnego przodka w linii żeńskiej. Dowodowy włos reprezentował haplogrupę C5, właściwą dla populacji wschodniej Eurazji. Analiza drugiego fragmentu łodygi dała identyczny wynik. W napięciu czekaliśmy na wyniki analizy materiału porównawczego prowadzone przez odrębny zespół. Nie pozostawiły one wątpliwości – podejrzany miał profil mtDNA taki sam jak odnaleziony włos. „Czy podejrzany jest pochodzenia azjatyckiego?”, zapytaliśmy policjantów prowadzących sprawę. Nic o tym nie wiedzieli. Podejrzany wcale nie musiał pochodzić z Azji. Haplogrupa C występuje również w populacjach słowiańskich, lecz bardzo rzadko. Jej udział w puli mtDNA ogólnej populacji Polski wynosi niespełna 0,0058%... Reprezentowana jest ona wyłącznie przez profile należące do podgrupy C5. W tym przypadku dowód z badania mtDNA silnie przemawiał za pochodzeniem włosa od podejrzanego – uzyskany profil nie był dotąd obserwowany w żadnej populacji słowiańskiej.
2. BADANIE EKSHUMOWANYCH SZCZĄTKÓW LUDZKICH We wrześniu 2001 r. Theodore Anderson z Międzynarodowej Komisji ds. Osób Zaginionych (ICMP) przywiózł do Bydgoszczy fragmenty kilkudziesięciu dziecięcych szkieletów. Zostały one ekshumowane z grobów masowych przez dr Ewę Klonowski, polskiego antropologa sądowego pracującego w Bośni i Hercegowinie. Wraz z nimi do bydgoskiej Katedry Medycyny Sądowej trafiło kilkadziesiąt próbek krwi, pobranych głównie od matek, które utraciły swoje dzieci podczas konfliktów zbrojnych na Bałkanach w latach 1992-1995. Dokumentacja oznaczona została klauzulą „Out of country testing”. Tak rozpoczął się największy na świecie projekt badania ludzkich szczątków za pomocą technologii DNA, który zakładał identyfikację blisko 20 000 szkieletów w ciągu zaledwie kilku lat. To stanowi dopiero początek. Komisja ICMP chciała docelowo stworzyć nowe laboratoria genetyczne na terenie Bośni. Przedtem zamierzała jednak dokonać identyfikacji genetycznej pierwszych kilkuset szkieletów, aby pomóc rodzinom zaginionych. Pierwsze próbki trafiły więc za granicę, do laboratorium Identyfikacji DNA Amerykańskich Sił Zbrojnych, oraz do nas – do bydgoskiego ZGMiS.
Tożsamość ofiar można określić nawet na podstawie zniszczonych szczątków ludzkich
dury ekstrakcji, nieco zbliżone do tych, które wykorzystywano do izolacji tzw. starego DNA, liczącego od kilku do kilkudziesięciu tysięcy lat. Przydały się nam doświadczenia z wcześniejszych analiz, które dotyczyły mumii egipskiej kapłanki Aset-iri-khet-es sprzed około 2500 lat.
99-proc. skuteczność analizy. Dwa oddzielne zespoły pracowały niezależnie nad tym samym fragmentem kości. ICMP wymaga dwukrotnego przeprowadzenia badań – gdy nie jest to możliwe z uwagi na niedostateczną ilość materiału, należy to zaznaczyć w raporcie. Materiału było bardzo niewiele, a na dodatek był mocno zdegradowany. W takich sytuacjach sięga się po analizy sekwencji mtDNA, choć
dzieci. W przypadku zbieżności profili przedstawialiśmy kwalifikację statystyczną w postaci przeszukania populacyjnych baz danych mtDNA. Im rzadszy profil, tym silniejsze potwierdzenie tożsamości szczątków. Dla kobiet z Bośni jedyną pociechą pozostała możliwość pogrzebania swoich najbliższych… Tomasz Grzybowski
LIZY * ANA MITOCHONDRIALNEGO DNA (mtDNA) Wykonuje się je w przypadkach, kiedy zawodzą standardowe metody badawcze – np. do identyfikacji starych i zniszczonych
„Dzięki analizie mitochondrialnego DNA możliwe jest określanie pokrewieństwa w linii żeńskiej. W wielu przypadkach jest to jedyna skuteczna metoda identyfikacyjna”
szczątków ludzkich czy pojedynczych włosów pozbawionych cebulki włosowej. MtDNA jest również często stosowanym narzędziem służącym do ustalania tożsamości ofiar masowych katastrof. Badania mtDNA należą do najtrudniejszych w praktyce genetyki sądowej – wymagają odpowiedniego przygotowania laboratorium oraz dużego doświadczenia biegłych.
MtDNA jest cząsteczką występującą w komór-
Pomocne doświadczenie. Rok wcześniej do Bydgoszczy przyjechał prof. Walther Parson, światowy autorytet w dziedzinie genetyki sądowej. W imieniu Rady Naukowej ICMP wizytował laboratoria, które miały uczestniczyć w projekcie bośniackim. Weryfikacja przebiegła pomyślnie. Rozpoczęliśmy badania kości, którym przyglądało się kilkoro bośniackich naukowców. ICMP przysłała ich na szkolenie w zakresie analizy mtDNA. Badania dziecięcych kości należały do najtrudniejszych w ramach projektu ICMP. Dysponowaliśmy bardzo małymi fragmentami kości płaskich, głównie z czaszek. Nie jest to idealne źródło DNA. Aby wyizolować DNA z takiego materiału, musieliśmy zastosować specjalne proce-
w przypadku niewielkich dziecięcych kosteczek i one wymagają specjalnego podejścia metodycznego. Sekwencję mtDNA „składa” się z wielu krótkich fragmentów, uzyskiwanych niezależnie z próbki. Jest to szalenie pracochłonne.
ce w dużej liczbie kopii, odporną na działanie czynników zewnętrznych degradujących materiał genetyczny. Dziedziczy się w linii żeńskiej, tj. bez udziału ojca – dlatego pozwala tylko na określanie pokrewieństwa w linii żeńskiej. Wykazuje zmienność w populacji.
Zakład jest dobrze przygotowany do tego rodzaju analiz – posiada cztery sekwenatory DNA, instrumenty do automatycznej analizy produktów sekwencjonowania. E-mailowe raporty z postępu badań wysyłaliśmy do ICMP dwa razy w tygodniu. Udało nam się uzyskać wyniki dla ogromnej większości dziecięcych kości. Skuteczność analizy mtDNA przekroczyła 99 proc. Raporty zawierały porównania profili mtDNA z materiału kostnego z sekwencjami właściwymi dla rodzin zaginionych
W przypadku potwierdzenia – czyli zgodności profilu mtDNA pomiędzy materiałem dowodowym i porównawczym – przedstawia się kwalifikację statystyczną wyniku. Wykorzystuje się do tego bazy danych złożone z tysięcy profili mtDNA z różnych populacji ludzkich. Im profil jest rzadziej obserwowany w bazach danych, tym większe prawdopodobieństwo, że pochodzi z tej samej linii żeńskiej.
Genetyka i Prawo 13
STANDARDY I ATESTACJE
Wiodące laboratoria
Prof. dr hab. Zofia Szczerkowska, Przewodnicząca Komisji Genetyki Sądowej Polskiego Towarzystwa Medycyny Sądowej i Kryminologii
Na temat atestacji i wyłaniania najlepszych laboratoriów – z prof. dr hab. Zofią Szczerkowską, Przewodniczącą Komisji Genetyki Sądowej Polskiego Towarzystwa Medycyny Sądowej i Kryminologii (PTMSiK) – rozmawia Tomasz Grzybowski. Tomasz Grzybowski Pani Profesor, czy może Pani krótko przedstawić Komisję Genetyki Sądowej PTMSiK?
i organów ścigania. Jednym ze środków prowadzących do tego celu jest atestacja laboratoriów genetycznych wykonujących analizy na zlecenie tych organów.
Prof. dr hab. Zofia Szczerkowska Komisja jest organem powołanym przez PTMSiK dla zapewnienia jak najwyższego poziomu ekspertyz z zakresu genetyki sądowej, sporządzanych na potrzeby wymiaru sprawiedliwości
Atestacje prowadzone są w dwuletnich cyklach. Uczestniczą w nich placówki stowarzyszone w PTMSiK: laboratoria genetyczne zakładów medycyny sądowej przy uniwersytetach i akade-
miach medycznych oraz laboratorium Instytutu Ekspertyz Sądowych w Krakowie. Atestacji mogą być również poddane laboratoria genetyczne spoza tych jednostek. Warunkiem poddania się atestacji jest umiejscowienie laboratorium na terenie Polski i możliwość samodzielnego przeprowadzenia wszystkich procedur badawczych niezbędnych do prawidłowego wykonania analizy i właściwego wnioskowania.
„Atestacja jest skutecznym sposobem oceny wyników i rekomendacji wiodących laboratoriów”
Tomasz Grzybowski
*
Atestacje
Dążenie do doskonałości Atestacje są skutecznym sposobem na podniesienie jakości ekspertyz genetyczno-sądowych. Posiadanie jakiegokolwiek atestu nie jest jednak równoznaczne z otrzymaniem patentu na nieomylność.
Atestacja, czyli ćwiczenie. Atestacje są dla genetyków tym, czym treningi dla sportowców – podejmowanymi regularnie ćwiczeniami podnoszącymi skuteczność i kompetencje poszczególnych osób jako biegłych, a także weryfikującymi warsztat badawczy. Są one eksperymentami o zasięgu krajowym lub międzynarodowym, podczas których uczestniczące laboratoria samodzielnie rozwiązują problem badawczy – podobny do tych, które występują w praktyce. Organ przygotowujący atestację dokonuje oceny wyników i przyznaje laboratorium atest, w przypadku kiedy rozwiązało ono problem w sposób prawidłowy. Atestacje organizowane są cyklicznie, toteż nadawane certyfikaty tracą ważność po upływie wskazanego czasu. Organy przygotowujące atestacje są bardzo różne – od prywatnych firm oferujących bardzo szeroki wachlarz programów z różnych dziedzin po towarzystwa naukowe wyspecjalizowane w konkretnych dziedzinach genetyki sądowej.
Atest atestowi nierówny. Na łamach następnych numerów magazynu będziemy się starali wykazać, że treści różnych programów atestacyjnych można wartościować pod względem merytorycznym. Istnieją atesty, które można uzyskać stosunkowo łatwo, inne wymagają od laboratoriów i biegłych dużego doświadczenia oraz perfekcyjnie zoptymalizowanego warsztatu badawczego. Najbardziej zaawansowanymi atestacjami wydają się te, które są organizowane przez towarzystwa naukowe. Są to ćwiczenia przygotowywane przez naukowców dla naukowców, a stopień ich trudności jest niekiedy nieporównywalny ze „zwykłymi” problemami napotykanymi w codziennej praktyce laboratorium. Takim programem jest atestacja Niemieckiej Grupy ds. Profilowania DNA (GEDNAP), w której Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej CM UMK uczestniczy dwa razy w roku. W naszym kraju atestację laboratoriów genetyczno-sądowych prowadzi Komisja Genetyki Sądowej Polskiego Towarzystwa Medycyny Sądowej i Kryminologii (PTMSiK). Tomasz Grzybowski 14 Genetyka i Prawo
Komisja zakończyła atestację laboratoriów genetycznych i udzieliła atestów na lata 2008-2009. Jakie rodzaje badań podlegały ocenie?
Prof. dr hab. Zofia Szczerkowska Atestacja była przeprowadzana dwukierunkowo – w zakresie śladów biologicznych oraz ustalania ojcostwa. Aby uzyskać atest na badania śladów biologicznych, laboratoria były zobowiązane do prawidłowego oznaczenia 10 wskazanych układów DNA i locus amelogeniny w próbkach przesłanych przez laboratorium referencyjne. Zakres badań mógł być poszerzony o inne, dodatkowe układy. Laboratoria mogły również wnioskować o uzyskanie atestu poszerzonego o markery chromosomu Y i mtDNA. Podstawą oceny były wyniki badań laboratorium referencyjnego, które przygotowało próbki atestacyjne. Warunkiem uzyskania atestu w zakresie ustalenia ojcostwa było prawidłowe genotypowanie próbek materiału biologicznego stron przesłanych przez laboratorium referencyjne. Przyjęto, że prawidłowy wynik dotyczył konkluzji zgodnych z wynikami próbek referencyjnych przy uzyskaniu szansy ojcostwa PI ≥ 1 000 000 (wynik wskazujący na potwierdzenie ojcostwa) lub przy uzyskaniu niezgodności w czterech układach (wynik wykluczający ojcostwo).
Tomasz Grzybowski Niektóre laboratoria otrzymały tzw. rozszerzone atesty na badania śladów biologicznych, inne – na badania w ograniczonym zakresie, tj. z wyłączeniem pewnych markerów genetycznych. Co było podstawą przydzielenia różnych typów atestów?
Prof. dr hab. Zofia Szczerkowska Atestacji w zakresie badań śladów biologicznych i w zakresie ustalania ojcostwa poddało się 13 laboratoriów. Atest na badanie śladów biologicznych na lata 2008-2009 uzyskało 12 laboratoriów, z czego niektóre w ograniczonym zakresie. Atest w rozszerzonym zakresie, obejmującym wszystkie metody analiz genetyczno-sądowych, tj. rutynowo stosowane mikrosatelity autosomalne, markery chromosomu Y i mtDNA, otrzymały 4 laboratoria: Zakład Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Gdańsku, Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej Katedry Medycyny Sądowej CM UMK w Bydgoszczy, Pracownia Genetyki Sądowej Katedry Medycyny Sądowej AM w Warszawie oraz Zakład Technik Molekularnych Katedry Medycyny Sądowej AM we Wrocławiu. Atesty na badania śladów biologicznych w zakresie autosomalnych loci DNA i chromosomu Y otrzymały 3 laboratoria: Zakłady Medycyny Sądowej AM w Lublinie i Poznaniu oraz Zakład Medycyny Sądowej UM w Łodzi. Instytut Ekspertyz Sądowych w Krakowie otrzymał atest na badania DNA loci autosomalnych. Komisja szczegółowo zapoznała się z raportowanymi wynikami atestacji. Przypadki wykazania m.in. kontaminacji, złej matrycy, nadmiaru DNA bądź nieuwzględnienia obecności fragmentu DNA eliminowały z atestu nieprawidłowo określony marker i skutkowały przyznaniem atestu w ograniczonym zakresie. Atest tego rodzaju otrzymały 4 laboratoria: Zakład Medycyny Sądowej AM w Białymstoku, Katedra
Medycyny Sądowej Śląskiej AM w Katowicach, Zakład Medycyny Sądowej CM UJ w Krakowie i prywatny Instytut Genetyki Sądowej w Bydgoszczy.
Tomasz Grzybowski Jakie znaczenie ma posiadanie atestu PTMSiK? Czy zleceniodawcy badań genetyczno-sądowych mają wiedzę na temat wyników atestacji?
dacji wiodących laboratoriów. O wynikach atestacji informowane są: Ministerstwo Sprawiedliwości, Ministerstwo Spraw Wewnętrznych i Administracji, prokuratury okręgowe, prezesi sądów okręgowych i dziekani izb adwokackich.
Tomasz Grzybowski Czy Komisja planuje wprowadzenie zmian w kolejnych programach atestacji?
Prof. dr hab. Zofia Szczerkowska Atestacja służy z jednej strony przyjęciu wspólnej strategii badawczej, standaryzacji metod analitycznych, ujednoliceniu nazewnictwa, ustaleniu norm, ocenie prawidłowości genotypowania i wnioskowania. Z drugiej – zwraca uwagę na nieprawidłowości, przyczyniając się do eliminacji błędów mogących prowadzić do niewłaściwego opiniowania. Jest także skutecznym sposobem międzylaboratoryjnej oceny wyników i rekomen-
* USTALANIE OJCOSTWA
„Atest na badania DNA w ustalaniu ojcostwa na lata 2008-2009 otrzymało 11 laboratoriów:
• Zakład Medycyny Sądowej AM w Białymstoku, • Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej Katedry
Prof. dr hab. Zofia Szczerkowska Ostatnio daje się zauważyć rosnące zainteresowanie przeprowadzanymi przez nas atestacjami, również ze strony laboratoriów spoza PTMSiK. Jesteśmy otwarci na włączanie tych laboratoriów do kolejnej atestacji na lata 2010-2011. Komisja pracuje obecnie nad uściśleniem niektórych punktów regulaminu, chociaż jego ogólny kształt się nie zmieni.
• • • •
Zakład Medycyny Sądowej UM w Łodzi, Zakład Medycyny Sądowej AM w Poznaniu, Zakład Medycyny Sądowej AM w Warszawie, Zakład Technik Molekularnych Katedry Medycyny Sądowej AM we Wrocławiu.
Medycyny Sądowej CM UMK w Bydgoszczy,
• • • • •
Zakład Medycyny Sądowej AM w Gdańsku,
Atestu tego nie otrzymały dwa laboratoria – Pra-
Zakład Medycyny Sądowej Śląskiej AM w Katowicach,
cownia Hemogenetyczna Zakładu Medycyny
Zakład Medycyny Sądowej CM UJ w Krakowie,
Sądowej AM w Szczecinie oraz prywatny Instytut
Instytut Ekspertyz Sądowych w Krakowie,
Genetyki Sądowej w Bydgoszczy”, wymienia
Zakład Medycyny Sądowej AM w Lublinie,
profesor Zofia Szczerkowska.
Genetyka i Prawo 15
KONTAKT: Prof. dr hab. med. Karol Śliwka kierownik Katedry Medycyny Sądowej > kizmedsad@cm.umk.pl
Dr hab. Tomasz Grzybowski kierownik Zakładu Genetyki Molekularnej i Sądowej genetyczne badania ojcostwa i inne badania pokrewieństwa, identyfikacja szczątków ludzkich, badania pokrewieństwa w linii żeńskiej (mtDNA), badania pochodzenia ewolucyjnego linii żeńskiej
> tgrzyb@cm.umk.pl
Dr Marcin Woźniak genetyczna identyfikacja śladów biologicznych, badania pokrewieństwa w linii męskiej (chromosom Y), badania pochodzenia ewolucyjnego linii męskiej
> marcinw@cm.umk.pl
Dr Jarosław Bednarek badania morfologiczno-porównawcze włosów, antropologia sądowa
> bednarek@cm.umk.pl
Katedra Medycyny Sądowej Collegium Medicum UMK Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej ul. Marii Skłodowskiej-Curie 9, 85-094 Bydgoszcz tel. 052. 585.35.52 fax 052. 585.35.53 > kizmedsad@cm.umk.pl