Aponte y Guadarrama / Proteínas en maduración de parchita
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Rev. Fac. Agron. (Maracay) 29:221-232. 2003.
Obtención de patrones de proteinas durante la maduración de frutos de parchita maracuyá (Passiflora edulis f. flavicarpa Degener)
Laura Aponte* Angel Guadarrama*
ABSTRACT
Passionfruits (Passiflora edulis f. flavicarpa Degener) were harvested at different ripening states. Physical analysis (fresh weight and firmness) and chemical analysis (total soluble solids, pH, carotenoids content, and total chlorophyll) were carried out to determine protein patterns for electrophoresis – SDS in polyacrylamide gel and gel filtration chromatography. Protein patterns with different distributions were obtained for different ripeness states. This indicated changes in concentration as well as in protein profile during fruit ripening, which suggested that synthesis of new proteins and/or catalysis of pre-existent proteins is active and different for each passionfruit ripeness state. It can serve as biochemical index of fruit physiological ripeness. Key words: Electrophoresis, ripening, passionfruit, pattern, proteins
Aceptado: julio, 2003 * Departamento de Botánica Agrícola. Laboratorio de Fisiología Postcosecha, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Apdo. 4579. Maracay 2101. Aragua, Venezuela. E-mail: guadarramaa@agr.ucv.ve
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COMP ENDIO
Fueron cosechados frutos de parchita maracuyá (Passiflora edulis f. flavicarpa Degener) en diferentes estados de maduración. Para cada uno fue necesario establecer adicionalmente análisis físicos (peso fresco y firmeza) y químicos (sólidos solubles totales, pH, contenido de carotenoides y clorofila total) para así establecer con exactitud el grado de madurez del fruto y con esto enfocar la determinación de los patrones de proteínas por electroforesis SDS en gel de poliacrilamida y cromatografía por filtración en gel. Obteniendo patrones de proteínas con diferentes distribuciones en los distintos estados de madurez, indicando así la presencia de cambios tanto en la concentración como en el perfil proteico durante la maduración de este fruto, lo cual señala que la síntesis de nuevas proteínas y/o catálisis de proteínas preexistentes es activa y diferencial en cada estado de madurez del fruto de la parchita maracuyá y puede servir de índice bioquímico de la madurez fisiológica del fruto. Palabras clave: electroforesis, maduración, maracuyá, parchita, patrón, proteínas
INTRODUCCION
La maracuyá es una planta de origen tropical cuyos frutos (tipo bayas) presentan un sabor particular intenso y una alta acidez, muy apreciado en los países americanos y europeos que lo demandan con gran interés (Serna y Chacón, 1995). La gran aceptación en los mercados internacionales, hacen de este cultivo uno de los más promisorios y rentables en el renglón de los frutales en Venezuela, lo cual resalta la importancia e interés de investigar y ahondar aún más sobre sus características, ya que en el presente no se cuenta con suficiente información. Los frutos, en la generalidad de los casos, presentan cambios visibles en sus características externas por efecto del proceso de maduración y senescencia (Proctor y Peng, 1989). Ahora para que haya una maduración adecuada, la síntesis de proteínas es requerida y de hecho, esta síntesis al inicio del proceso son enzimas necesarias para la maduración de los frutos (Frenkel et al., 1986). Han habido, pocos estudios referidos a la síntesis proteica y ácidos nucleicos durante la maduración en frutos de tomate; en tal sentido, se han involucrado la utilización de aminoácidos radioactivos en el tejido del fruto y se han medido a través de su incorporación total dentro de la proteína, para proveer de este modo evidencias del aumento en la síntesis de las mismas durante la maduración (Grierson, 1986).
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Los incrementos en las enzimas que catabolizan procesos en la pared celular durante la maduración, resultan del incremento en la expresión de genes y de la acumulación de proteínas enzimáticas (Downs et al., 1992). La maduración en manzanas Golden Delicious involucra cambios en la expresión de los genes los cuales se confirmaron con los resultados obtenidos por Lay-Yee et al. (1990) en electroforesis bidimensional, indicando la presencia de cambios tanto en el ARNm como en los niveles proteicos, coincidiendo con incrementos en la concentración interna del etileno y el descenso de la firmeza. Tales estudios pueden proveer las bases para futuros análisis y la modificación de los procesos de maduración y el comportamiento de este fruto en almacenamiento. MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron frutos de Passiflora edulis f. flavicarpa Degener (maracuyá) procedentes del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), estos se cosecharon en cuatro estados de madurez, directamente de las plantas, la selección se hizo sobre la base de una escala de coloración en donde el estado verde presentaba 0% de coloración amarilla, el de madurez fisiológico con un 25% de coloración amarilla, el maduro con un 75% de coloración amarilla y por último el sobremaduro con un 100% de coloración amarilla hacia marrón. Esta clasificación fue respaldada a nivel de laboratorio a través de análisis físicos con la medición de la firmeza (por medio de un penetrómetro) y peso fresco (a través de una balanza) ambos en el fruto entero y químicos por medio de la medición de los sólidos solubles totales (uso de un refractómetro manual ATAGO N1), pH (uso de un pH metro 420A Orion) ambos en la pulpa del fruto, determinación del contenido de clorofila total (método propuesto por Hiscox e Israelstam, 1979) en el epicarpio del fruto y contenido de carotenoides totales (método propuesto por McCollum, 1953) medido en la pulpa del fruto. Se realizaron los análisis bioquímicos con la determinación de los patrones proteicos para los estados de madurez ya establecidos, aplicándose un procedimiento común en la obtención de muestras para los patrones que se obtuvieron con las metodologías señaladas a continuación. Se utilizaron 50 g de pulpa de parchita maracuyá en sus diferentes estados y se homogeneizaron con 50 ml de buffer fosfato 0.1M; pH 6.2 por un minuto. Se colocó en una centrífuga refrigerada a 15000 rpm por 30 minutos. Se colectó el sobrenadante y se dializó con polietilenglicol 6000 hasta la obtención de un volumen de 10 ml. Se le midió la cantidad de proteínas presentes
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utilizando el método de Bradford (1976); conservándose a -20ºC. La electroforesis se realizó en el Centro de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Carabobo (BIOMED), según el método de Laemli (1970), con las siguientes modificaciones: la concentración del buffer tris-HCl fue duplicada y la concentración del gel de 3% fue sustituida por una de 5%. La cantidad de muestras por carril fue de 10 µl, para cada estado de maduración; las muestras contenían 250 µl de muestra dializada en 50 µl de glicerol al 85%, se les añadió 250 µl de buffer tris-HCl 0.125 M a pH 6.8 y 5 µl de azul de bromofenol y calentadas a 90ºC por cinco minutos, también se colocaron muestras patrones conformadas por proteínas obtenidas comercialmente con sus respectivos pesos moleculares. Las concentraciones en gel separador fueron las siguientes 10% de acrilamida, 0.1% bisacrilamida, urea 5 M, TEMED 0.033%, persulfato de amonio 0.33 mg/ml, tris-HCl 0.375 M, pH 8.8 y SDS al 0.1% y para el gel concentrador: 5% de acrilamida, 0.13% de bisacrilamida, urea 5M, TEMED 0.05%, persulfato de amonio 0.5mg/ml, tris-HCl 0.125M, pH 6.8 y SDS 0.1%. La corrida se llevó a cabo a temperatura de refrigeración con solución amortiguadora de tris-glicina a pH 8.3 y SDS 0.1% a una corriente constante de 25 mA por 3 a 4 horas; los geles se colorearon con azul brillante de coomasie y el desteñido se hizo en varios pasos, con soluciones de etanol al 20% y ácido acético al 10%. Para la cromatografía por filtración en gel, se utilizó la metodología propuesta por el manual de Pharmacia-LKB (1987) y el procedimiento indicado por Guadarrama (1994), con modificaciones: se utilizaron 5 ml de extracto dializado y se aplicaron en una columna de Sephadex G-100 (3.5 x 40 cm), previamente equilibrada con buffer fosfato 0.1M, pH 6.2; este buffer también fue utilizado como medio de elusión. En un colector automático (Facc-100 Pharmacia LKB), se tomaron fracciones de 5ml durante tres minutos, recolectando aproximadamente 42 fracciones por muestra de estado de madurez. Para cada fracción se leyó la absobancia a 595 nm en un espectrofotómetro, según el método de Bradford (1976).
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RESULTADOS Y DISCUSION
Los frutos de parchita maracuyá tienden a perder peso hacia el estado sobremaduro; mientras que del verde al maduro se concentran los mayores valores de peso fresco. Estos frutos cuando verdes son muy firmes, perdiendo firmeza a medida que llega a la madurez, y ésta se reduce progresivamente hasta el estado sobremaduro cuando los mismos se arrugan y resecan como consecuencia de la pérdida de humedad; el contenido de sólidos solubles totales se va incrementando gradualmente, obteniendo su pico al estar maduro, para luego disminuir en el sobre maduro. Se observó un pH más ácido cuando está verde, aumentando ligeramente hacia el sobremaduro. El contenido de carotenoides totales se incrementó desde verde hasta el maduro luego disminuyó hacia el sobremaduro, en cambio el contenido de clorofila total disminuyó notoriamente a medida que se avanzó en el estado de madurez. Todos estos análisis permitieron evidenciar la separación entre cada uno de los estados tratados y proceder a determinar los diferentes patrones proteicos (Cuadro 1). Cuadro 1. Tendencias promedio de los análisis físicos y químicos en los
diferentes estados de madurez del fruto de parchita maracuyá (Passiflora edulis f. flavicarpa) Estados de Madurez Verde Análisis físicos Firmeza (mm) Peso fresco (g) Análisis químicos Sólidos solubles (ºBrix) pH Carotenoides totales (mg/100 ml de jugo) Clorofila total (mg/l de solución)
Madurez fisiológica
Maduro
Sobremaduro
0 121.50
1.38 115.51
134.22
76.93
13.38 3.14
17.70 3.22
18.23 3.32
15.30 3.74
0.27
0.64
0.65
0.48
7.36
3.73
2.92
0.99
1.75
-
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En las Figuras 1 y 2, el estado de madurez se encuentra indicado por la letra T y un subíndice como se indica: T1 verde, T2 madurez fisiológica, T3 maduro y T4 sobremaduro. El carril que no corresponde a ningún tratamiento (estado de madurez), está conformado por patrones estándares de proteínas con sus respectivos pesos moleculares; Albúmina bovina (66 KDa), Albúmina de huevo (45 KDa), Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (36 KDa), Anhidrasa carbónica (29 KDa), Tripsinógeno (24 KDa), Inhibidor de tripsina (20.1 KDa) y a-Lactoalbúmina (14.2 KDa).
Patrón
T1
T2
T3
T4
T1
T2
T3
T4
66KDa
45KDa 36KDa 29KDa 24KDa 20.1KDa
14.2KDa
Figura 1. Patrones de proteínas por electroforesis SDS-PAGE en los diferentes
estados de madurez del fruto de parchita maracuyá. Cada banda en la Figura 1, se corresponde con una cadena polipéptica, es así como se encuentra una distribución específica de ellos para cada estado. Por ejemplo, para el verde (T1) se presentan polipéptidos de pesos moleculares aproximados entre 36 y 29 KDa, con una concentración acentuada (lo cual se notó por lo intenso de las bandas en el gel) que disminuye en los dos estados siguientes y aparece de nuevo con la misma intensidad en el sobremaduro, indicando que estos polipéptidos se mantienen presentes en todos los estados. En el de madurez fisiológica (T2), se observó un polipéptido de poca concentración con peso molecular superior 66 KDa, de igual forma se encontró
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para el maduro (T3), desapareciendo en el último estado. Igualmente, se observó en este estado, la presencia de dos polipéptidos de pesos moleculares aproximados de 29 KDa y 24 KDa, los cuales están sólo en este y en baja concentración. En forma generalizada, se observó una mayor cantidad de polipéptidos en el estado T3, lo que sugiere cambios en el contenido de proteínas en el fruto de parchita maracuyá durante su maduración. Estos cambios están referidos a la expresión del polipéptido en un estado y luego en otro, la expresión del polipéptido en un solo estado, la variación en la concentración del mismo y mayor cúmulo de polipéptido en un estado. Patrón
T1
T2
T3
T4
T1
T2
T3
T4
66KDa 45KDa 36KDa 29KDa 24KDa 20.1KDa
14.2KDa
Figura 2. Diagrama de patrones de proteínas por electroforesis SDS-PAGE
en los diferentes estados de madurez del fruto de parchita maracuyá.
Las Figuras 3, 4, 5 y 6, representan patrones cromatográficos obtenidos por filtración en gel de Sephadex correspondientes cada uno con un estado de madurez. Estos patrones cromatográficos permitieron observar las diferentes distribuciones de las proteínas según el estado de maduración del fruto. Debido a esto se decidió, con fines enteramente prácticos para facilitar el análisis de los resultados, dividir cada cromatograma en tres partes, las cuales representan tres grupos de proteínas según sus pesos moleculares, características éstas en la que se fundamenta la técnica de filtración en gel; en ella se obtienen fracciones
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en las cuales han eluido diferentes conjuntos de proteínas de altos pesos moleculares, seguido por las proteínas de pesos moleculares intermedios y por último las que tienen bajos pesos moleculares. Los contenidos de proteínas en ellos, han sido medidas indirectamente, por el nivel de absorbancia mostrado y cada pico obtenido representa un conjunto de proteínas de un peso molecular semejante. De esta manera, se encuentra una distribución específica similar para cada estado igual que en los patrones de proteínas obtenidos por electroforesis. 0,06 Grupo I
0.06
Grupo II
Grupo III
0,05
0,04
0.04 Absorbancia (595 nm)
Absorbancia (595 mm)
0.05
0,03
0.03 0,02
0.02 0,01
0.01 0
00
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Fracción
Fracción Figura 3. Patrón de proteínas mediante cromatografía de filtración en gel
Sephadex G-100 en frutos de parchita en el estado verde. Los conjuntos de proteínas presentes en el grupo I, de acuerdo a la división realizada, muestran en su mayoría un comportamiento constante con un ligero aumento en su contenido desde el estado verde (Figura 3) hacia el de madurez fisiológica (Figura 4), manteniéndose sus niveles en el estado maduro (Figura 5) y en el sobremaduro (Figura 6). Estas proteínas de alto peso molecular aparentemente se exhiben en todos los estados y sobretodo en el sobremaduro, en comparación con los otros grupos de la división. De allí, se podría considerar que esas proteínas de alto peso molecular son necesarias en el desarrollo y senescencia del fruto.
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0,06
Grupo I
Grupo II
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Grupo III
Absorbancia (595 nm)
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0 0
5
10
15
20 25 Fracción
30
35
40
45
Figura 4. Patrón de proteínas mediante cromatografía de filtración en gel Sephadex
G-100 en frutos de parchita en el estado de madurez fisiológica. 0,06
Grupo I
Grupo II
Grupo III
0,05
Absorbancia (595 nm)
0,04
0,03
0,02
0,01
0 0
5
10
15
20 25 Fracción
30
35
40
45
Figura 5. Patrón de proteínas mediante cromatografía de filtración en gel
Sephadex G-100 en frutos de parchita en el estado maduro.
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230 0,06 0.06
Grupo I
Grupo I
Grupo II
Grupo II
Grupo III
Grupo III
Absorbancia (595 nm)mm) Absorbancia (595
0,05 0.05
0,04 0.04
0,03 0.03
0,02 0.02
0,01 0.01
00 00
55
10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 Fracción Fracción
35 40 45 35 40 45
Figura 6. Patrón de proteínas mediante cromatografía de filtración en gel
Sephadex G-100 en frutos de parchita en el estado sobremaduro. El conjunto de proteínas del grupo II, el cual corresponde a las de peso molecular intermedio, se presenta en un alto contenido desde el estado verde hasta el maduro, hallazgo que permite inferir que este tipo de proteínas son las más necesarias hacia el proceso de maduración del fruto; ya que, en el sobremaduro, un estado que conduce al deterioro de los mismos, las proteínas de este grupo tienden a sufrir una disminución considerable. Las proteínas del grupo III, consideradas las de pesos moleculares bajos presentaron fluctuaciones en su contenido, observados estos entre el estado verde y el maduro ya que, para el maduro exhibió un aumento para todo el conjunto proteico observado en los cromatogramas. Al igual que el grupo anterior (grupo II), en el sobremaduro se evidenció una disminución en el contenido de este conjunto proteico. Combinando los patrones por ambas metodologías se pueden visualizar las diferentes distribuciones particulares que adquieren las proteínas en cada estado de madurez del fruto de parchita maracuyá.
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Cambios proteicos similares durante la maduración han sido encontrados por Tucker y Grierson (1982) en frutos de tomates, evidenciados por la síntesis de proteínas que son necesarias en la maduración de este fruto, incluyendo enzimas tales como la Poligalacturonasa. También en frutos de tomates, analizando las proteínas presentes en el pericarpo a varios estados de maduración, Biggs et al. (1986) encontraron incrementos, disminuciones y fluctuaciones en los niveles de muchos polipéptidos y además sugirieron que tanto la síntesis como la degradación de proteínas estaban involucradas con el proceso de maduración, resultados similares fueron señalados por Domínguez et al. (1992) en la pulpa de banana. Biggs et al. (1986), evidenciaron los cambios que experimenta el fruto de tomate con respecto a los polipéptidos de diferentes pesos moleculares durante el desarrollo del fruto, así ellos mencionan como ejemplo que, en el desarrollo se observó el aumento de algunos polipéptidos como también la disminución de otros. Partiendo de este hecho, se hace referencia que este cambio diferencial en la expresión y concentración de proteína está referida aparentemente a la actuación sincronizada de un conjunto de genes que determinan la ausencia o aparición de proteínas estructurales, transporte, ribosomales, catalíticas, que en forma coordinada determinan un patrón específico del fruto, que podría ser utilizado como un índice bioquímico de la madurez fisiológica. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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