Pruebas bioquímicas El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios bacteriológicos es posible gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que llevan a cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con productos útiles para el metabolismo celular, los cuales además contienen algún indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos microorganismos sus funciones. Los organismos varían en su capacidad para utilizar diferentes compuestos (por ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan en su identificación en el laboratorio. De acuerdo a los productos de su actividad química, las bacterias se pueden clasificar como: 1. Zimógenas: Las que fermentan los carbohidratos, desdoblándolos en alcohol, acido láctico o acético. 2. Aerógenas: Las que producen gas como hidrogeno y dióxido de carbono como resultado de su actividad metabólica. 3. Anaerógenas: No producen cantidades visibles de gas durante su actividad metabólica. 4. Cromógenas: Producen pigmentos solubles o insolubles. 5. Fotógenas: Las que causan putrefacción y producen una débil fosforescencia (algunas bacterias marinas).
Pruebas bioquímicas para la identificación de
Enterobacterias
Las Enterobacterias son bacterias Gram negativas que contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología de cocos o bacilos. Los miembros de este grupo forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos.
Escherichia coli, el microorganismo más prevalente de esta familia, es una de las bacterias prototípicas sometidas a estudio. Enterobacterias importantes Genero Escherichia Klebsiella Salmonella Enterobacter Serratia Hafnia Citrobacter Yersinia Proteus Providencia Morganella Shigella Plesiomonas Edwarsiella Ewingella
Especies coli, alberti, alvei pneumoniae, oxytoca, granulomatis choleraesuis aerogenes, cloacae, aglomerans marcencens alves freundii, amalonaticus, diversus pestis, enterocolitica, pseudotuberculosis mirabilis, vulgaris rettgeri, stuartii morganii dysenterii, flexneri, sonnei, boydei shigelloides tarda americana
Estructura del genero Enterobacteriaceae.
Agar de hierro y triple azúcar (TSI) El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias posibilidades de fermentación de acuerdo a las características metabólicas del Al fermentar algunos microorganismo como son: carbohidratos, muchas Utilización de glucosa sola: Los bacterias producirán acido, y microorganismos que fermentan solo la con un medio con pH original glucosa provocan en este medio una alrededor de 7.4 al bajar este reacción alcalina en la superficie a 6.8 por el acido que (roja) sobre un fondo acido produce un cambio de color (amarillo) debido a que realizan una gracias a la incorporación de degradación aeróbica de la glucosa en un indicador de pH como es la superficie, convirtiendo el piruvato el rojo de fenol. en agua y dióxido de carbono. Después de 18 a 24 horas de incubación como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberación de amoniaco y produciendo un pH alcalino (rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxigenó, se realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH acido (amarillo).
Bacterias que fermentan K/A P. mirabilis + producción de gas + H2S S. typhimurium + H2S S. enteritidis + producción de gas + H2S S. flexneri
Utilización de lactosa y/o sacarosa: Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reacción acida en la superficie (amarilla) y acida en el fondo (amarilla). En este caso después de 18 a 24 hrs como la concentración de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces más que la de la glucosa presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el
fondo como en la superficie. En el caso de usar sacarosa la reacción seria la misma.
Bacterias que fermentan A /A E. coli + producción de gas
Sin utilización de ninguna de las anteriores: En el caso de no utilizar ninguno de los carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usaría serian las peptonas, ya sea aeróbicamente o anaeróbicamente. Solo utilizándolas aeróbicamente daría una superficie alcalina (roja) sobre un fondo sin cambio. Si las usara aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo). En este medio también es posible detectar la producción de gas por la formación de burbujas dentro del medio, y la producción de ácido sulfhídrico, el cual reaccionará con un indicador con base de fierro dando un color negro debido al sulfuro de hierro formado.
Bacterias que fermentan K/K P. aeruginosa
Agar de hierro y lisina (LIA) Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilacion de los aminoácidos por inducción de enzimas especificas, el resultado de esta descarboxilacion es la producción de una amina y dióxido de carbono. Tal es el caso de la producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina.
En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará́ lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así́ pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida. Los resultados pueden ser los siguientes: 1. Decarboxilación de la lisina: Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2. Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3. Producción de ácido sulfhídrico: Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)
Agar citrato de Simmons En el medio de cultivo, el fosfato monoamĂłnico es la Ăşnica fuente de nitrĂłgeno y el citrato de sodio es la Ăşnica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimĂĄtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmĂłtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como Ăşnica fuente de carbono, usan sales de amonio como Ăşnica fuente de nitrĂłgeno, con la consiguiente producciĂłn de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travĂŠs del ciclo del ĂĄcido tricarboxĂlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este Ăşltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a ĂĄcidos orgĂĄnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producciĂłn de citrato permeasa. Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato como Ăşnica fuente de carbono en una serie de reacciones como sigue: đ??śđ?‘–đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ đ?‘œđ?‘Ľđ?‘Žđ?‘™đ?‘Žđ?‘?đ?‘’đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ + đ?‘Žđ?‘?đ?‘’đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ đ?‘‚đ?‘Ľđ?‘Žđ?‘™đ?‘Žđ?‘?đ?‘’đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ đ?‘?đ?‘–đ?‘&#x;đ?‘˘đ?‘Łđ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ + đ??śđ?‘‚ đ?‘ƒđ?‘–đ?‘&#x;đ?‘˘đ?‘Łđ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ đ?‘Žđ?‘?đ?‘’đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ + đ?‘™đ?‘Žđ?‘?đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ + đ??śđ?‘‚ Los ĂĄcidos orgĂĄnicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino asĂĚ logrado hace que el indicador de pH en el medio, el azul de bromotimol vire de su color verde original a un azul intenso. Microorganismo K. pneumoniae S. typhimurium E. coli S. flexneri
Citrato permeasa Positivo Positivo Negativo Negativo
Color del medio Azul Azul Verde Verde
Agar urea La hidrolisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima especifica, la ureasa, dando lugar a dos molĂŠculas de amonio, agua y diĂłxido de carbono. Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del medio (amarillo) a un color En el medio de cultivo, rojo bugambilia por el indicador rojo de la tripteĂna y la glucosa, fenol. De acuerdo a la degradaciĂłn de la urea aportan los nutrientes el color serĂĄĚ mĂĄs o menos intenso. para el desarrollo de microorganismos. đ?‘ đ??ť! ! đ??ś = đ?‘‚ + 2đ??ť! đ?‘‚ → đ??śđ?‘‚! + 2đ?‘ đ??ť! + đ??ť! đ?‘‚ đ?‘ đ??ť! ! đ??śđ?‘‚!
Bacterias positivas: P. mirabilis K. pneumoniae
Agar MIO (Movilidad, Indol y Ornitina) Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina descarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculación.
El Indol se formará si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que desdoblará el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es incoloro pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs; que se adiciona después de que creció́ la bacteria, dará́ un color rojo violeta.
La descarboxilación de la Ornitina como el medio tiene púrpura de bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un color
amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo al descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez dada por la fermentaciรณn de las glucosa resultando en un color morado en el fondo.
Microorganismo E. coli P. pneumoniae P. mirabilis
Movilidad Positivo Negativo Positivo
Indol Positivo Negativo Negativo
Ornitina Positivo Negativo Positivo
Pruebas bioquímicas para la identificación de
Staphylococcus
Dentro del genero Staphylococcus hay 52 especies, siendo las mas importantes desde el punto de vista clínico: “Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus” Los Staphylococcus que se asocian con infecciones humanas son colonizadores principalmente de superficies cutáneas y mucosas. El crecimiento de las colonias bacterianas son visibles casi sobre todos los medios de cultivo, en especial en agar sangre. Son bacterias en forma de coco Gram positivas producen catalasa, son aerobios facultativos. Temperatura ideal de crecimiento 37 grados Celsius, temperatura de crecimiento 10-46 grados Celsius. Se observa asociación en racimos irregulares (similar aún racimo de uvas), carecen de flagelos, no producen esporas y rara ves pueden tener cápsula.
Tinción de Gram
Microfotografía
No son exigentes con sus requerimientos nutricionales, son aerobios facultativos y son capaces de crecer en medios altamente salinos (7.5-10% NaCl). Habitan en: S. aureus, Flora normal de las narinas(fosas nasales), nasofaringe, región perineal(en mujer en hombre) y piel. Puede colonizar diversas superficies epiteliales y mucosas. S. saprophyticus, flora normal de la mucosa del aparato genitourinario(en hombre y mujer). S. epidermidis, Flora normal de piel y mucosas humanas, ampliamente distribuido sobre toda la superficie corporal. Para identificar el género usamos las pruebas bioquímicas primarias. Tinción de Gram: Cocos Gram positivos, agrupados en racimos. Catalasa: positiva. Coagulasa: diferenciar los géneros
Tinción de Gram El método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología es la tinción de Gram, llamada así́ en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Grampositivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. Las bacterias Grampositivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o mureína, mientras que esta capa es más fina en las Gram-negativas y está rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es un polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-acetilglucosamina y acido N- acetilmurámico. Se divide en 4 etapas: Tinción Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tiñe todas las células moradas. Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido. Agente decolorante: Se utiliza alcohol etílico al 95%. El etanol tiene doble función: deshidratante de proteínas y solvente de lípidos. El alcohol disuelve los lípidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared más porosa. De esta manera, el complejo Cristal violetayodo es removido de la capa de mureína más fina de las bacterias Gramnegativas, mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior. Tinción de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teñir de rojo las células previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.
Prueba de catalasa La descomposición del peróxido de hidrogeno se produce a través de la acción de dos enzimas: Catalasa Peroxidasa En la descomposición del peróxido de hidrogeno una molécula actúa como un sustrato y la otra como un dador; el sustrato reducido por los átomos de hidrogeno cedidos por el dador, da como resultado un sustrato reducido y un dador oxidado. Técnica: Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
NOTA: Podemos agregar al tubo con la bacteria H2O2 para ver si hay producción de gas, pero la sepa ya no va a servir.
Prueba de coagulasa La coagulasa es una enzima producida por Staphylococcus (S. aureus), es relativamente termoestable, ya que resiste temperaturas de hasta 60 °C durante 30 min. Es fácilmente inactivada por las enzimas proteolíticas y estimula la conversión de fibrógeno en fibrina (coágulo). Comprueba la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por acción de esta enzima. La prueba coagulasa se utiliza de manera especifica en la diferenciación de especies pertenecientes al género Staphylococcus: S. aureus (Generalmente de reacción positiva) y S. epidermis (-). Por lo general una prueba de la coagulasa positiva es el criterio de diagnostico final para la identificación de Staphylococcus. Frecuentemente esta prueba es utilizada como índice de virulencia o patogenicidad. Mecanismo de acción de la coagulasa libre: procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo análogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en ausencia de Ca2+. La coagulasa ligada o factor de agregación actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmáticos.
S. epidermidis
S. aureus
Control
Pruebas bioquímicas para la identificación de
Streptococcus
El género Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos gram positivos pertenecientes al filo firmicutes y al grupo de las bacterias ácido lácticas. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular ocurre a lo largo de un eje. Los Streptococcus son oxidasa y catalasa negativos. Las especies conocidas de streptococcus que producen enfermedades a humanos son: Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e impétigo. Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en neonatos y trastornos del embarazo en la mujer. Neumococo: Streptococcus pneumoniae es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad. Streptococcus viridans es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales. Streptococcus mutans causa importante de caries dental. Pertenece al grupo de estreptococos viridans. La mayoría de las especies de Streptococcus son anaerobios facultativos, y algunos crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono (crecimiento capnofílico). Sus exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar carbohidratos produciendo ácido láctico y también son catalasa negativos a diferencia de los estafilococos. Streptococcus mas comunes: S. afermentans S. aureus S. auricularis S. capitis S. caprae S. epidermidis S. felis S. haemolyticus S. hominis
A parte de realizar las pruebas bioquímicas de LIA, MIO, TSI, Urea, Citrato y catalasa, antes mencionadas, se pueden cultivar en agares específicos para su identificación.
S. intermedius S. lugdunensis S. pettenkoferi S. saprophyticus S. schleiferi S. vitulus S. warneri S. xylosus
Tradicionalmente la clasificación se ha basado en la reacción hemolítica de la cepa y en el grupo serológico. Este último está determinado por el tipo de polisacárido C presente en la pared celular del microorganismo, denominado antígeno de Lancefield. Para distinguir las especies se utilizan varias metodologías como: Grupo serológico de Lancefield A, B, C, D Y E. Tipo de hemólisis alfa, beta y gamma. Pruebas bioquímicas y medios de cultivo. Identificación molecular (ADN). La identificación mas usada es grupo serológico y pruebas bioquímicas, una combinación de estas da resultados muy precisos. La identificación molecular todavía es una técnica costosa por lo que no es factible usarla (exceptuando los centros de investigación y algunos hospitales). Prueba de Lancefield La clasificación de los streptococcus 𝛽 −hemoliticos del grupo A o grupo B merece ser explicado para que podamos comprender mejor la clasificación de las especies. Hace tiempo se tenía la necesidad de identificar las especies de forma confiable. Rebecca Craighill Lancefield y su grupo de investigación realizo una investigación para resolver esto. A groso modo así es como se realizo su experimento, Lancefield y su grupo de trabajo obtuvo anticuerpos de suero de conejos previamente inmunizados con cultivos estandarizados de Streptococcus spp. El procedimiento simplificado fue el siguiente: se pone el suero de conejo en capilares de vidrio, posteriormente se agrega el extracto del antígeno y se observa si hay o no presencia de precipitación (reacción antígeno-anticuerpo), de esta manera se empieza a clasificar a las especies de Streptococcus spp. que generan precipitado con un mismo tipo de antígeno en grupos, Grupo A, B, C, D y E.
𝛽-hemolisis de Streptococcus del grupo A y B
Medios de cultivo Agar /caldo infusión cerebro corazón (BHI) Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. El agar es el agente solidificante. El agar cerebro corazón mantiene los mismos principios que el caldo para el cultivo de estreptococos y otras bacterias exigentes. Por tratarse de un medio que contiene glucosa, no es un agar sangre apropiado para la observación de reacciones de hemólisis.
Agar/caldo soya tripcaseina (TSA) La tripteína y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta también carbohidratos que estimulan el crecimiento de muchos microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Adicionado con 5-10 % sangre , se logra un medio enriquecido y adecuado para observar reacciones de hemólisis.
Agar sangre (AS) El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 % de sangre ovina, también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee: Alfa 𝜶: halos verdosos (reducción de la hemoglobina de los glóbulos rojos a metahemoglobina en el medio)
Beta 𝜷: halos incoloros (hemolisis total)
Gamma 𝜸: inexistencia de halos (sin hemolisis)
Pruebas bioquímicas para la identificación de
Pseudomona
Este género está constituido por bacilos Gram-negativos, rectos o ligeramente curvos, no formadores de esporas, no encapsulados, siempre móviles con flagelación polar monotrica o lofotrica, oxidan glucosa, son oxidasa positiva. Su metabolismo es siempre aerobio (la mayoría usa como aceptor de electrones al O2) o anaerobio (algunos usan NO3). Presentan una versatilidad metabólica muy grande que se traduce en su capacidad de utilizar como fuente de carbono substratos muy variados. Existen numerosas especies, sin embargo, las que con mayor frecuencia se aíslan de muestras clínicas son: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri. Las tres primeras especies se caracterizan por producir pigmento fluorescente verde limón. Características del genero Pseudomonas
A parte de realizar las pruebas bioquímicas de LIA, MIO, TSI, Urea, Citrato y catalasa, antes mencionadas, se pueden cultivar en agares específicos para su identificación y se realiza la prueba de OXIDASA y O/F
Prueba de oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.
Por lo general, el sistema citocromo oxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para: Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las Enterobacterias.
Prueba O/F Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulación de ácidos con un indicador ácido-base (azul de bromotimol). La bacteria se inocula con el hilo recto (por picadura ) y se incuba en condiciones de aerobiosis (sin parafina) y de anaerobiosis (con parafina, tubo cerrado), simultáneamente. Las bacterias que respiran aerobiamente crecen en la superficie del medio del tubo abierto. Transforman la glucosa en CO2, la superficie del medio se verá ligeramente amarilla (por la formación de ácido carbónico originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio). En el tubo cerrado el cultivo se mantiene azulverdoso. Las bacterias fermentadoras producen ácidos a partir de la glucosa. Viran el cultivo del tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el fondo, pero transcurridas 24 horas los ácidos pueden difundir por todo el medio virándolo a amarillo.
Agar nutritivo Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.
Agar MacConkey En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Agar Sangre La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis.