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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias ABREVIATURAS - Aβ: péptido beta-Amiloide - ApoE: Apolipoproteína E - BSA: Albúmina Bovina Sérica - CV: Coeficiente de Variación - DCL: Deterioro cognitivo leve - DSM: Manual Estadístico y Diagnóstico de los Trastornos Mentales (The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) - EA: Enfermedad de Alzheimer - ELISA: Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay - hk6: human Kallikrein 6 - HUCA: Hospital Universitario Central de Asturias - Da: Daltons - LCR: Líquido Cefalorraquídeo - MBP: Proteína Básica de la Mielina - NIA: Instituto Nacional del Envejecimiento, USA (National Institute on Aging) - PARs: Receptores Activados por Proteasas (Protease-activated receptors) - PPA: Proteína Precursora del Amiloide - PSA: Antígeno Prostático Específico, hk3 (Prostate specific antigen) - RM: Resonancia Magnética - RR: Riesgo Relativo - ROC: Curva de Rendimiento Diagnóstico (Receiver Operating Characteristic curve) - SNC: Sistema Nervioso Central - STARD: Standards para la precisión diagnóstica (Standards for Reporting Diagnostic Accuracy)

Utilidad de la cuantificaci贸n plasm谩tica de neurosina en el diagn贸stico diferencial de las demencias

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias I. INTRODUCCIÓN: 1. El “Síndrome Demencia” 1.1 Definición y prevalencia Las demencia es un síndrome clínico caracterizado por deterioro cognitivo adquirido. De acuerdo con los Criterios DSM IV [1], para su diagnóstico requiere la presencia de deterioro mnésico y al menos otra alteración cognitiva (afasia, apraxia, agnosia o disfunción ejecutiva) con repercusión significativa de estos trastornos en la vida social y/o laboral del paciente. La demencia es un síndrome común en los adultos de más edad, afectando al 10% de los individuos mayores de 65 años. Además la prevalencia se duplica cada cinco años hasta alcanzar casi al 50% de los individuos mayores de 85 años. Se estima que en la actualidad más de 24 millones de personas en el mundo padecen demencia, cifra que previsiblemente se duplicará cada 20 años hasta superar los 80 millones en el año 2040 [2]. Este síndrome puede ser de origen secundario o neurodegenerativo. Las demencias de origen secundario son debidas a causas metabólicas, vasculares o estructurales. En las demencias de origen neurodegenerativo el depósito cerebral de ciertas proteínas da lugar a pérdida neuronal y disfunción sináptica. En muchos casos las alteraciones histológicas y fisiopatológicas comienzan tiempo antes de la aparición de los síntomas clínicos, pero el diagnóstico en fases presintomáticas es difícil de alcanzar. El deterioro cognitivo leve (DCL) es una condición considerada como un estadio transicional desde el estado de salud al de demencia, en el que el paciente presenta un mayor deterioro cognitivo que el esperado para su edad, pero sin ser de suficiente intensidad aún como para alterar su capacidad funcional [3]. 1.2 Diagnóstico y Diagnóstico diferencial de las Demencias La información clave para diagnosticar una demencia procede de la historia clínica, a través de la cual se trata de determinar de si existe o no deterioro cognitivo de intensidad tal capaz de interferir con las actividades habituales del paciente. Ello implica evaluar detenidamente la evolución clínica del caso basándose, además de en los síntomas referidos por el paciente, en la información que puedan aportar los acompañantes. También es fundamental realizar una evaluación neuropsicológica adecuada para determinar las funciones alteradas y el grado de deterioro existente y una exploración neurológica y general completa. Una vez alcanzado el diagnóstico de “Síndrome demencia” el siguiente objetivo es tratar de determinar qué enfermedad o proceso es la causa del mismo. Para ello, la fase de anamnesis y exploración debe completarse con la realización de una serie de pruebas complementarias con el fin de descartar en primer lugar

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias las denominadas “demencias secundarias” o “demencias tratables” que, en ocasiones, disponen de tratamiento específico que puede resultar curativo. La Demencia Vascular, o Demencia con Componente Vascular tal como últimamente ha convenido en denominarse, puede considerarse una forma de demencia secundaria, en este caso a un proceso isquémico de una o varias regiones cerebrales que puede cursar con déficits cognitivos de muy diversa índole por lo que a pesar de poseer unos factores de riesgo, curso evolutivo y hallazgos de neuroimagen sugestivos suele ser causa frecuente de diagnóstico diferencial con las demencias de origen neurodegenerativo. También es importante identificar cuadros de origen psiquiátrico con síntomas cognitivos. En estos pacientes los síntomas cognitivos, como pérdida de memoria, pueden constituir el motivo de consulta. Por tanto, a este diagnóstico se llega cuando en el contexto de un cuadro psiquiátrico se ha excluido la existencia de un verdadero deterioro cognitivo de origen orgánico; son las denominadas “Pseudodemencias”. Cuando se han descartado causas secundarias el siguiente paso es tratar de determinar

qué

proceso

degenerativo

puede

ser

causa

subyacente.

Enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa de demencia más frecuente y la mejor conocida, aunque existen otras enfermedades neurodegenerativas que pueden causar demencia. Así, puede plantearse el diagnóstico diferencial entre las siguientes demencias de origen neurodegenerativo: EA, Demencia por Cuerpos de Lewy o Complejo Parkinson-Demencia, Demencia Frontotemporal, Enfermedad de Huntington, Afasia Progresiva Primaria y Degeneración Córticobasal. Para tratar de distinguirlas es clave la información de la historia clínica y disponer de una buena evaluación neuropsicológica, ya que el perfil neuropsicológico de las distintas demencias

neurodegenerativas

suele

diferir

(Tabla

1).

Enfermedad

Creutzfeldt-Jakob es una enfermedad muy infrecuente causada por priones, de curso rápidamente progresivo y de clínica muy variada, por lo que en su inicio también puede plantear diagnóstico diferencial con otras causas de demencia. Para apoyar los hallazgos clínicos sería muy beneficioso poder contar con pruebas diagnósticas que más allá de descartar causas secundarias puedan ayudar a identificar los procesos neurodegenerativos. Estas pruebas se denominan biomarcadores.

Los

marcadores

biológicos

biomarcadores

son

por

tanto

parámetros mensurables, ya sean bioquímicos, fisiológicos o morfológicos, que se asocian a un determinado proceso mórbido y que por tanto pueden resultar de utilidad para su diagnóstico. Aunque en el momento actual no existen aún pruebas diagnósticas estandarizadas que se puedan aplicar en la práctica clínica rutinaria para diferenciar fiablemente las distintas formas de demencia, en los últimos años

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias se

han

multiplicado

los

esfuerzos

por

encontrar

biomarcadores,

tanto

neuroimagen, como bioquímicos, para la EA y otras demencias. Destacan los estudios de neuroimagen, tanto volumétricos como de neuroimagen funcional mediante RM y pruebas de Medicina Nuclear, en los que se ha logrado demostrar asociación con algunas formas de demencia. No obstante, por su complejidad técnica o por falta de disponibilidad de equipos, su aplicación permanece aún restringida al ámbito de la investigación. Respecto a la búsqueda de marcadores bioquímicos, su búsqueda se ha visto marcada por el hecho de que la neuropatología de estas enfermedades afecta fundamentalmente al SNC, por lo que el fluido en el que se han encontrado datos más significativos es el LCR, que si bien puede obtenerse mediante punción lumbar, no es el fluido ideal para el estudio sistemático de los pacientes con deterioro cognitivo. Es prioritario, por tanto, hallar una molécula cuyos niveles medidos en fluidos periféricos (sangre u orina), se asocien con alguno de los procesos neurodegenerativos. De acuerdo con el Informe de Consenso del Grupo de Trabajo para la búsqueda de biomarcadores para la EA (Molecular and Biochemical Markers of AD) de [4], el marcador ideal de la EA debería “detectar una característica fundamental de la neuropatología de la enfermedad, ser validado en casos confirmados mediante estudio neuropatológico, tener una especificidad superior al 80% para detectar EA y una especificidad superior al 80% para distinguir los casos de EA de otras demencias. Además debería ser fiable, reproducible, no invasivo, fácil de determinar y económico.” Algunos de estos biomarcadores ya han comenzado a proponerse como apoyo diagnóstico para la realización de ensayos clínicos en la EA [5] y en los criterios diagnósticos más recientes de la EA [6].

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Entidad clínica

Historia clínica (inicial)

Exploración neurológica

Exploración neuropsicológica

Demencia tipo Alzheimer

Pérdida de memoria para hechos reciente con preservación de la memoria remota. Cambios en la personalidad. Síntomas psiquiátricos. Síntomas conductuales.

Bradicinesia, hipertonía, mioclonías (tardío). Reflejos de liberación: prensión, palmomentoniano, glabelar... (tardío).

Alteración en la memoria reciente. Desorientación espacial. Lenguaje alterado por dificultad para encontrar las palabras. Alteración de la autoconciencia.

Demencia Frontal

Síntomas principales: Pérdida de la higiene y cuidado personal, transgresión de las normas sociales, conducta desinhibida, sexualidad incontrolada, esterotipias, vagabundeo, hiperoralidad, falta de flexibilidad mental, distractibilidad, impulsividad.

Reflejos de liberación frontal: Signos de liberación piramidal Parkinsonismo rígidoacinético (tardío). Alteración en la mirada vertical. Apraxia de la apertura palpebral.

Alteración prominente en las pruebas atencionales y en las funciones ejecutivas que requieran planificación, secuenciación, abstracción y flexibilidad mental. Alteración de la autoconciencia.

Afasia Progresiva Fluente o Demencia Semántica

Alteración en la comprensión Acinesia, rigidez, temblor del significado de las palabras. (tardío) Lenguaje espontáneo aparentemente normal o con pausas y circunloquios. Parafasias semánticas.

Afasia Progresiva No Fluente

Suele comenzar con tartamudeos o dificultar para pronunciar alguna palabra y pausas en el lenguaje oral. Anomia y Parafasias fonémicas. Dificultad creciente para la lectura y escritura. Relativa preservación funcional.

Acinesia, rigidez, temblor (tardío)

Se alteran los componentes fonológicos y gramaticales con preservación inicial de los aspectos semánticos. Anomia. Repetición alterada. Alexia, agrafia. Mutismo tardío.

Complejo DemenciaParkinson y Demencia con Cuerpos de Lewy

Fluctuaciones acusadas en el rendimiento cognitivo. Cuadros confusionales. Alucinaciones (visuales), ideas de perjuicio. Hipersensibilidad a neurolépticos. Caídas frecuentes. Hipotensión ortostática. Trastorno del sueño REM.

Signos parkinsonianos: rigidez, bradicinesia, amimia, trastornos posturales y de la marcha. Hipofonía y temblor.

Déficit atencional. Lentitud de pensamiento. Defectos ejecutivos. Defectos visuoespaciales. Defectos visuoconstructivos.

Degeneración córticobasal

Parkinsonismo rígidoacinético con distonía y mioclonías focales. Deterioro cognitivo subcortical Escasa respuesta a levodopa.

Parkinsonismo rígidoacinético asimétrico. Hiperflexión distónica espontánea con negligencia motora y apraxia. Temblor de actitud Mioclonías reflejas Alteración supranuclear de la mirada. Piramidalismo Discinesias bucolinguales. Síndrome pseudobulbar

Variable, deterioro subcorticofrontal Negligencia motora Apraxias focales Desinhibición cortical Disminución de la fluencia verbal fonológica.

Corea Alteraciones de la motilidad ocular Distonía, rigidez, bradicinesia Alteración de la marcha.

Déficit atencional Disfunción ejecutiva Alteraciones visuoespaciales Bradipsiquia Déficits mnésicos.

Enfermedad de Lentamente progresiva Autosómica dominante Huntington Trastorno motor Deterioro cognitivo Alteraciones psiquiátricas: cambio de la personalidad Trastorno del comportamiento: apatía, mutismo.

Se alteran los componentes semánticos con preservación inicial de los aspectos fonológicos y gramaticales. Agnosia visual.

Tabla 1. Principales demencias de origen neurodegenerativo con sus características clínicas y hallazgos en la exploración neurológica y neuropsicológica más típicos [7].

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Biomarcador

Fluido biológico

Método

Proteína Tau Fosforilada

LCR

ELISA

Aβ total 1-42

Plasma y LCR

ELISA

Proteína C Reactiva

Plasma y LCR

ELISA

Factor del Complemento C1q

Plasma y LCR

ELISA

Complejo Receptor de la Interleukina 6

Plasma y LCR

ELISA

Homocisteína

Plasma

ELISA

PPA

LCR

ELISA

Nitrotirosina

LCR

Cromatografía Líquida

Anticuerpos anti-Aβ

Plasma y LCR

ELISA

Glutamina Sintetasa

Plasma y LCR

ELISA

Proteína Ácida Fibrilar Glial

LCR

ELISA

Sulfátidos

LCR

Espectrometría de Masas

Proteína de la Cadena Neural AD7C

Plasma y LCR

ELISA

Neurosina

Plasma y LCR

ELISA

Aβ 1-40

Plasma y LCR

ELISA

CD59

Plasma y LCR

ELISA

Melanotransferrina

Plasma y LCR

Inmunoblot

Isoformas plaquetarias de PPA

Plaquetas

Inmunoblot

Proteína S100

Plasma y LCR

ELISA

Factibles y Principales

Factibles y Secundarios

Factibilidad incierta

Tabla 2. Clasificación de los biomarcadores bioquímicos para la EA en función del grado de evidencia propuesta para su utilización en ensayos clínicos. Se recoge el fluido fuente y el método analítico empleado. Realizada en el año 2003 por el grupo de estudio de la Agencia Americana para el Envejecimiento. La neurosina plasmática (flecha) se encuentra en el grupo de los biomarcadores “factibles secundarios”. Traducido de “Biological markers for therapeutic trials in Alzheimer’s disease Proceedings of the biological markers working group” [5].

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 2. Neurosina 2.1 La Familia de las Kalikreínas La Kalikreína tipo 6 (hk6), también conocida como neurosina, zyme o proteasa M, fue identificada en el año 1997 como una nueva serín-proteasa que se expresa principalmente en el cerebro [8,9]. Esta molécula es una de las que está aportando datos más prometedores como biomarcador de la EA ya que se ha demostrado que su concentración tanto en tejido cerebral, como en LCR y sangre se encuentra alterada en pacientes con EA. No obstante los estudios realizados hasta el momento incluyen un número escaso de pacientes y no se han incluido pacientes con otros tipos de demencia, por lo que no se ha podido estimar la sensibilidad y especificidad de esta prueba, ni se ha estudiado su concentración plasmática en individuos sanos, y por tanto, es aún desconocida su utilidad como prueba diagnóstica. Las Kalikreínas son una familia de serín-proteasas cuyo peso molecular oscila entre 27 y 40 kDa. cuyo locus se está situado en el brazo largo del cromosoma 19 en la región 13.4 [Figura 1]. Se dividen en dos grupos: las plasmáticas y las tisulares, que difieren tanto en peso molecular como en especificidad de substrato, características inmunológicas y estructura génica. Las Kalikreínas plasmáticas son sintetizadas exclusivamente en el hígado y están implicadas en coagulación, fibrinolisis, regulación de la presión arterial y reacciones inflamatorias [10] y su centro activo adopta la conformación típica de la tripsina [11]. Las Kalikreínas tisulares son una subfamilia de 15 serín-proteasas con un alto grado de especificidad de substrato y variada expresión en diversos tejidos y fluidos biológicos (Figura 2).

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Figura 1. Características de la estructura del locus (a), gen (b) y proteína (c) de las kalikreínas. a. El locus KLK se expande ~300 kb en el brazo largo del cromosoma 19 en la región 13.4. Los genes de las Kalikreínas clásicas (KLK1, KLK2 y KLK3/PSA) están representados por flechas rojas, las Kalikreínas 4-16 por flechas azules y el pseudogen de la kalikreína 1 por una flecha amarilla. La dirección de transcripción es desde telómero a centrómero con excepción de KLK2 y KLK3. b. Los genes KLK tienen una longitud variable de entre 4 y 10 kb y en todos ellos consisten en 5 exons codificantes y 4 intrones con una fase patrón conservada (I, II, I, 0). La longitud de los exones codificantes (rectángulos amarillos) son similares en los distintos genes KLK si bien la longitud de los intrones varía considerablemente. Las posiciones de los codones para los residuos catalíticos del centro activo se encuentran muy conservadas, con el codón de la Histidina (H) próximo al final del segundo exón, el codón del ácido aspártico (D) en centro del tercer exón y el codón de la serina (S) al comienzo del quinto exón. La mayor parte de los genes KLK, con excepción de los genes de las kalikreínas clásicas, también tienen uno o dos exones no codificantes (rectángulos rojos) en la región 5’ no transcrita (UTR). La región no transcrita 3′ varía en longitud. c. Las kalikreínas son proteínas de cadena simple sintetizadas como preproenzimas que contienen una secuencia aminoterminal (Pre) que las dirige al retículo endoplásmico para su secreción y un propéptido (Pro) que las mantiene como precursores inactivos (zymógenos). Modificado de Borgoño [12].

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Figura 2. Representación esquemática de la expresión tisular de las kalikreínas en varios tejidos humanos. Los niveles más altos se señalan en negrita. Tomado de Yousef [13].

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 2.2 Expresión de la neurosina La neurosina es una serín-proteasa de 244 aminoácidos y un peso molecular de 26856 Da “similar a tripsina” como demuestran los datos de cristalización [14] [15] (Figura 3).

Figura 3: Representación tridimensional de la neurosina. A. Los residuos catalíticos se muestran como bolas y barras. La histidina 57 en azul, el ácido aspártico 102 en rosa y la serina 195 en naranja. B. Regiones en bucle que rodean el sitio activo: 92–102 (azul), 141– 152 (rosa) y 172–178 (verde). Tomado de Bernett [9].

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias El

gen

neurosina

encuentra localizado en el cromosoma 19q13.3-q13.4, y está compuesto de 7 exones de los cuales los dos primeros no se transcriben [16]. Tiene una pauta abierta de lectura de 732 pares de bases que codifican una proteína de 244 aminoácidos sintetizada como prepro-hK6. Una vez el péptido señal es liberado la pro-hK6 es secretada al medio extracelular, donde un nuevo corte produce la forma activa de 223 aminoácidos. Se ha señalado que la

Figura 4. Representación esquemática de los 2 autoproteolíticos que llevan a la maduración de pro-hk6 (activación) y la propia activación e inactivación [14, 17, subsecuente autoinactivación de la misma 18] (Figura 4). Sin embargo la (Modificado de Bayés).

propia neurosina puede provocar su pasos

capacidad de la propia neurosina de ejecutar estos pasos se ha puesto en duda y es objeto de debate [14, 18, 19]. La neurosina se expresa en el sistema nervioso central, epitelio glandular de mama, próstata, riñón, endometrio, colon, apéndice, glándulas salivares, conductos biliares y vejiga, intestino delgado, estómago, endocervix, trompa de Falopio, epidídimo, bronquios, tracto respiratorio superior y en células endoteliales, nervios periféricos y algunas células neuroendocrinas (incluyendo los islotes de Langerhans, células de la porción anterior de la hipófisis y la médula adrenal) [20, 21] (Figuras 2 y 5). El órgano donde más neurosina se expresa es el cerebro; en concreto se ha encontrado en el epitelio del plexo coroideo, en la corteza cerebral, en el cerebelo y en el hipocampo [20].

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Figura 5. Intenso inmunomarcaje de neurosina (cabezas de flecha) en el epitelio del plexo coroideo (A) y (B). Inmunoexpresión de neurosina en neuronas (C). Inmunoexpresión de neurosina en nervio periférico (D). Anticuerpo policlonal, magnificación x200. Tomado de Petraki [21].

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 2.3 Actividad enzimática de la neurosina Como se ha dicho, la neurosina es una de las kalikreínas tisulares y por tanto su presencia en los fluidos biológicos se debe a difusión a éstos desde los tejidos. La neurosina presente en liquido cefalorraquídeo corresponde a la proteína completa (proenzima) sin procesamiento de la región pro como lo demuestra el hecho de que su secuencia N-terminal sea Glu-Glu-Gln-Asn-Lys y por lo tanto presumiblemente inactiva [15, 22]. Algunas de las proteínas descritas como sustratos de la neurosina son la proteína básica de la mielina (MBP) [19], el plasminógeno [17], la α1-antitripsina, la proteína precursora del amiloide (PPA) [19] y el receptor ionotrópico del glutamato [23]. La neurosina posee la actividad proteolítica propia de las kalikreínas. En las secuencias de substrato existe exclusividad para la Arginina en P1 y alta especificidad para Serina en P1’ [23]. Las principales secuencias sustrato de la neurosina se recogen en la Tabla 3.

Sustrato

Punto de Corte

Boc-Gln-Ala-Arg-NHMec

Boc-Gln-Ala-Arg+NHMec

Boc-Phe-Ser-Arg-NHMec

Boc-Phe-Ser-Arg+NHMec

Boc-Val-Pro-Arg-NHMec

Boc-Val-Pro-Arg+NHMec

Bz-Arg-NHMec

Bz-Arg+NHMec

Tos-Gly-Pro-Arg-NHMec

Tos-Gly-Pro-Arg+NHMec

Tos-Gly-Pro-Lys-NHMec

Tos-Gly-Pro-Lys+NHMec

Tabla 3: Secuencias de algunos de los puntos de corte conocidos de la neurosina. Fuente: MEROPS. Identificador Peplist PL00322. La unión al sustrato se produce en la proximidad del centro activo de la neurosina. Para ello, la Arginina forma puentes de Hidrógeno con los residuos Asp189, Ser190 y Asn217 [14, 23, 24] (Figuras 6 y 7).

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Figura 6. Diagrama propuesto mediante simulación para la unión de la neurosina al sustrato alrededor del centro activo. A. La Arginina es responsable de realizar puentes de Hidrógeno con los residuos Asp189, Ser190 y Asn217 que constituyen el principal dominio activo de la neurosina. A. Tomado de Li [23]. B. Tomado de Bernett [9].

Figura 7. Unión del péptido al sustrato en orientación standard. A, sitio activo de corte junto a un sustrato hexapeptídico (P4-Val-P3-Ala-P2-Arg-P1-Arg- -P1'-Ala-P2'-Ala). B, sitio activo de corte, representado como superficie sólida coloreada de acuerdo con los potenciales electroestáticos de superficie (azul estremo positivo y rojo extremo negativo), junto al hexapéptido VARRAA que se une a los sitios S4 a S2'. Tomado de Debela [24]

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 2.4 Neurosina y PARs Recientemente se ha descubierto la relación de las Kalikreínas con los PARs (receptores activados por proteasas). Los PARs constituyen una familia de receptores acoplados a proteína G que funcionan a través de un mecanismo único de activación mediante corte proteolítico de su extremo amino terminal exponiendo así un ligando peptídico [25] (Figura 8). Se sabía que los PARs 1-4 son activados por hidrólisis de la trombina (PAR-1 y PAR-3), de la tripsina (PAR-2) o tanto por la tripsina como por la trombina (PAR-4) [26], pero recientemente se ha demostrado que las kalikreínas también activan los PAR [27, 28] y por tanto deben considerarse como importantes reguladores “hormonales” de la función tisular.

Figura 8. Estructura y mecanismo de activación de los PARs por las tripsinas cerebrales. Los PARs tienen siete dominios transmembrana en hélice y una hélice adicinal C-terminal intracelular. El corte proteolítico mediante serín-proteasas, tales como la neurosina, se expone un nuevo dominio N-Terminal que actúa como ligando proteico (segmento en caja) que puede intereactuar con el segundo bucle extracelular (línea de puntos) alterando la conformación del receptor, lo que facilita el acoplamiento de los bucles intracelulares 2 y 3 del PAR con la proteína G que transmite las señales intracelularmente. Tomado de Wang [29].

La neurosina hidroliza PAR 1 y 2 en una secuencia de su extremo amino terminal [19] produciendo su activación o inactivación dependiendo del punto exacto de corte [26]. Los PARs 1-4 se expresan ampliamente en el SNC y de forma similar a lo que sucede con la neurosina, las mayores densidades de PAR-2 se encuentran en hipocampo, córtex, amígdala, tálamo, hipotálamo y estriado [26] asociada en ocasiones a áreas de neurodegeneración [30].

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias La

PAR2

implicado

inflamación

mediante

mecanismos

neurogénicos [31, 32] y contribuye a la regulación del tono vascular [32, 33] siendo un potente mecanismo vasodilatador en las arterias cerebrales mediante la producción endotelial de óxido nítrico [34, 35]. 2.5 Implicación de la neurosina en las enfermedades neurodegenerativas Diversos estudios han estudiado los mecanismos fisiopatológicos por los que la neurosina podría estar implicada en algunas enfermedades neurodegenerativas: Sinucleínpatías: La acumulación de agregados de alpha-sinucleína en el cerebro es característica de la Enfermedad de Parkinson, la Demencia con cuerpos de Lewy y la Atrofia multisistema. En estas enfermedades la neurosina parece colocalizarse con la sinucleína (Figura 9) [36]. En condiciones basales la neurosina se localiza intracelularmente en las mitocondrias y microsomas, siendo la localización nuclear y citosólica baja. Se ha demostrado que cuando las células son expuestas a estímulos estresantes se produce una liberación de fragmentos de alpha-sinucleína y neurosina hacia el citosol [36]. Estudios in vitro muestran que la neurosina previene la polimerización de esta proteína gracias a que reduce la cantidad de monómeros y genera fragmentos con capacidad de inhibir la polimerización [36, 37]. Mas interesante aún, otro estudio in vitro muestra que ciertas formas mutantes y fosforiladas de la alpha-sinucleína que se expresan en la Enfermedad de Parkinson son resistentes a la actividad de la neurosina [38].

Figura 9. Colocalización de inmunoreactividad para neurosina y alpha-sinucleína en el cerebro de ratón en la región azonal terminal. Las flechas señalan uno de los muchos puntos de colocalización de ambas proteínas. Bar=20 µm Tomado de Iwata [36].

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias Amiloidopatías: Cuando el gen de la neurosina se coexpresa con el de la PPA (Proteína Precursora del Amiloide) en células de la línea 293 (riñón de embrión humano), se detectan fragmentos amiloidogénicos y las células liberan gran cantidad de péptido Aβ truncado con disminución de los residuos 17-42 [8] (Figura 10). Además, la neurosina es capaz de cortar el dominio N-terminal de la PPA en tres sitios distintos [18], por lo que podría

contribuir

acumulación

cerebral de Aβ en la EA. Parece

confirmado

que

existe

disminución de la expresión de neurosina en las áreas parénquima cerebral con neuropatología EA [37, 38]. De acuerdo con

los

estudios

Zhang

[40]

prekalikreína6 está aumentada en el LCR de pacientes con EA (el doble que en controles de la misma edad), y no así en Figura 10. Detección de fragmentos amiloidogénicos en células transfectadas con fragmentos de cDNAs de PPA y neurosina. Western blot: línea a, control; línea b, neurosina; línea c, PPA 695; línea d, PPA 695 y neurosina, línea e, PPA 751 y línea f, PPA 751 y neurosina. Tomado de Little [8].

pacientes con PD ni con Demencia por cuerpos de Lewy, lo que podría indicar que en la EA puede existir una alteración de la conversión de prehk6 a hk6 [41, 42], ya que la hk6 está disminuida en LCR [22].

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 3. Justificación del tema A la luz de lo expuesto en las páginas precedentes es evidente el beneficio que supondría poder contar con pruebas diagnósticas que puedan asistir en el diagnóstico de alguna de las enfermedades que causa demencia y/o predecir la progresión de DCL a demencia. Como

marcadores

bioquímicos

han

sido

muchas

las

moléculas

estudiadas, algunas con resultados favorables (Tabla 2). Sin embargo, por diversos motivos ninguna de ellas ha sido trasladada aún del ámbito de investigación a la práctica clínica rutinaria. Hasta el momento actual el marcador bioquímico que mayor utilidad ha demostrado para el diagnóstico de una enfermedad causante de demencia es la cuantificación conjunta de proteína Aβ y proteína tau fosforilada en LCR; que ofrece una sensibilidad y especificidad próxima al 90% para el diagnóstico de EA. Sin embargo, la necesidad de realizar una técnica cruenta como es una punción lumbar ha condicionado que este método no sea de uso rutinario en la práctica clínica habitual. Otras moléculas cuantificadas en plasma u orina no disponen de estudios completos de validación como prueba diagnóstica para el diagnóstico diferencial de las demencias, ya que no disponen de resultados en un número suficiente de controles y de pacientes con demencias de diverso origen. Éste era el caso de la neurosina. El planteamiento de este estudio parte de un escenario real, en el que el screening de los pacientes se realiza a partir de la detección de la clínica que tienen en común todos estos ellos: la presencia síntomas cognitivos. Es a partir de la detección de estos síntomas cuando se plantea el problema del diagnóstico diferencial de la enfermedad subyacente y la situación donde se percibe el vacío actual de pruebas diagnósticas que sirvan de apoyo para lograr este objetivo. Animados por los resultados de estudios previos, nos propusimos evaluar la utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial del deterioro cognitivo. Como hemos visto, la neurosina es una proteasa de expresión tisular, preferentemente cerebral, a la que tanto los estudios de investigación básicos como los estudios clínicos iniciales adjudican un papel en las demencias neurodegenerativas. De este modo otros grupos señalan diferencias en la concentración de esta proteína en tejido cerebral, sangre y LCR de pacientes con EA respecto a controles. En todo caso permanecían sin estudiar la variación con la edad de la concentración plasmática de neurosina en individuos sanos, las diferencias de concentración en las distintas entidades causantes de deterioro cognitivo y la validez de la medición de concentración de neurosina como prueba para la predicción evolutiva de pacientes con DCL y para el diagnóstico diferencial de las demencias.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias Tomando como hipótesis de trabajo que la cuantificación plasmática de neurosina podría variar entre algunas de las enfermedades causantes de demencia investigamos de modo prospectivo la correlación entre los niveles de esta molécula y el diagnóstico final de un grupo de pacientes con síntomas cognitivos con diversos diagnósticos clínicos. Los conocimientos derivados de estas investigaciones determinarán en qué situaciones clínicas la cuantificación plasmática de neurosina puede ser de utilidad en el diagnóstico diferencial entre entidades causantes de deterioro cognitivo y por tanto si puede ser una variable más a añadir en los protocolos diagnósticos del síndrome demencia.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias II. OBJETIVOS En el presente trabajo de investigación y una vez analizado en profundidad el estado actual del problema, nos hemos planteado los siguientes objetivos: Objetivos generales 1. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial del deterioro cognitivo de origen vascular, degenerativo o psiquiátrico. 2. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de neurosina

como

factor

pronóstico

pacientes

con

Deterioro

Cognitivo Leve. Objetivos específicos Objetivos específicos para el objetivo general número 1 a. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía con la edad en individuos sanos. b. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen y controles. c. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen. d. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía en las distintas fases evolutivas de la Enfermedad de Alzheimer. e. Determinar en qué situaciones clínicas la cuantificación plasmática de neurosina puede ser de utilidad en el diagnóstico diferencial entre entidades distintas causantes de deterioro cognitivo. Objetivos específicos para el objetivo general número 2 a. Determinar si una única medición de la concentración plasmática de neurosina es de utilidad como factor pronóstico en pacientes con Deterioro Cognitivo Leve. b. Determinar si la evolución de la concentración plasmática de neurosina es un parámetro de utilidad para establecer el pronóstico de pacientes con Deterioro Cognitivo Leve.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias METODOLOGÍA 1. Diseño: No experimental (observacional), prospectivo, cuantitativo, casos y controles no pareados. Se han seguido los estándares y recomendaciones de la iniciativa STARD [43, 44] para la validación de pruebas diagnósticas. 2. Sujetos de estudio: 2.1 Muestreo, reclutamiento y selección de pacientes: Se siguió un método de muestreo y reclutamiento consecutivo; en el que a partir de la fecha de inicio del estudio (Enero 2003) a todos los pacientes estudiados por Unidad de Demencias del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA) que cumplían el criterio de screening y ningún criterio de exclusión se les propuso participar en el estudio (Tabla 4). El periodo de reclutamiento fue de 36 meses. 2.2 Criterio de screening: Pacientes con síntomas cognitivos en los que se sospecha origen vascular, degenerativo o psiquiátrico. 2.3 Criterios de inclusión: Se incluyeron directamente tras el screening todos los pacientes con Deterioro Cognitivo Leve sin criterios de exclusión. Pacientes en los que tras al menos un año de seguimiento se establece el diagnóstico de EA, Demencia por Cuerpos de Lewy o Parkinson-Demencia, Demencia Frontotemporal, Enfermedad de Huntington, Afasia Progresiva Primaria, Degeneración Córticobasal, Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob o Enfermedad Psiquiátrica con síntomas cognitivos. 2.4 Criterios diagnósticos y de estadiaje: El diagnóstico de las enfermedades se estableció según los siguientes criterios: Criterios NINCDS-ADRDA [45] para la enfermedad de Alzheimer, criterios del Consortium on Dementia with Lewy Bodies [46] para la demencia por cuerpos de Lewy, criterios de Manchester y Lund [47] para la demencia frontotemporal, Criterios NINCDS-AIREN [48] para el diagnostico de Demencia Vascular (Demencia con Componente Vascular), criterios de la OMS para Enfermedad de CreutzfeldtJakob [49], Criterios DSM-IV para el diagnóstico de los cuadros psiquiátricos con síntomas cognitivos (Pseudodemencia) [1], criterios de Petersen para DCL [3]. El diagnóstico de enfermedad de Huntington se realizó por confirmación genética.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias El estadiaje de la enfermedad de Alzheimer (1-6) se realizó según los criterios GDS-FAST-BCRS [50]. Controles: GDS1, DCL: GDS3, EA leve: GDS4, EA moderada: GDS5, EA severa: GDS6. 2.5 Criterios de exclusión: •

Pacientes

con

algún

tipo

“demencia

tratable”

(tumoral,

hidrocefalia, carencial, tóxica o asociada a otras enfermedades). •

Pacientes con enfermedad oncológica conocida.

•

Pacientes con alteración de la función hepática o renal (en los que puede alterarse la metabolización o aclaramiento de proteínas plasmáticas).

•

No obtención del consentimiento informado por el paciente o tutor del mismo.

2.6 Muestras procedentes de otros centros: Ante la previsión de reclutar un número muy escaso de muestras de Enfermedad

Creutzfeldt-Jakob,

conscientes

que

trata

procedimiento de reclutamiento con menor validez metodológica ya que estos sujetos no siguieron el protocolo general del estudio, solicitamos a un centro de referencia (Hospital Clinic i Universitari de Barcelona) muestras de sujetos con esta enfermedad, de las que nos facilitaron 29 muestras procedentes de pacientes que habían sido diagnosticados con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob probable (n=11) o definitiva (n=18). 2.7 Fuentes de controles Los controles se obtuvieron de dos fuentes distintas: a) individuos sanos o pacientes estudiados en consulta de Neurología del HUCA por patología del sistema nervioso periférico, sin evidencia de patología del sistema nervioso central o acompañantes sanos (esposos) de los pacientes de edad superior a 60 años, b) muestras procedentes del Centro Comunitario de Sangre y Tejidos (HUCA), de edad entre 18 y 60 años.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias Controles Consulta de Neurología (HUCA) (> 60 años) 70 Centro Comunitario de Sangre (< 60 años) 158 Total de controles incluidos 228 Pacientes Screening en consulta de neurología (HUCA) 633 Perdidos / No reclutables 186 Pacientes incluidos desde consulta (HUCA) 418 Muestras del Hospital Clinic 29 Total de pacientes incluidos 447 Tabla 4. Resumen de las fuentes y número de controles y pacientes reclutados.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 3. Metodología clínica: Para el estudio de pacientes con deterioro cognitivo se siguieron las recomendaciones de la Academia Americana de Neurología [51]. El diagnóstico se estableció en todos los casos, excepto en los pacientes con DCL, a los 12 meses de la inclusión del sujeto en el estudio. En los pacientes con DCL el diagnóstico se estableció en cuanto se realizó la evaluación y las pruebas complementarias. 3.1 Estudio clínico de los pacientes Se empleó un protocolo que incluye: anamnesis completa, exploración física general y neurológica, evaluación neuropsicológica con Test Generales (MMSE de Folstein [52], Subtest de Memoria del Test Barcelona Abreviado [53]) y específicos (orientados en función de la sospecha diagnóstica); evaluación funcional: Escala de Blessed

[54];

test

despistaje

enfermedad

psiquiátrica:

Inventario

Neuropsiquiátrico de Cummings [55] y Escala de depresión geriátrica de Yesavage [56]. 3.2 Pruebas complementarias realizadas A

todos

los

pacientes

les

realizaron

las

siguientes

pruebas

complementarias: hemograma, bioquímica general, TSH, acido fólico, vitamina B12, serología lúes y Lyme (realizados en los servicios de Bioquímica, Microbiología del HUCA) y prueba de neuroimagen: Tomografía computerizada y/o Resonancia Magnética Craneal (en el Servicio de Radiología del HUCA). En casos seleccionados se realizaron otras pruebas que se consideraron necesarias para alcanzar el diagnóstico, tales como genética para Enfermedad de Huntington, medición de niveles de homocisteína, vitamina A, ceruloplasmina y electroencefalografía. A todos los pacientes con el diagnóstico de EA se les determinó el genotipo ApoE en el laboratorio de Genética Molecular del HUCA. 3.3 Seguimiento de pacientes con DCL Los pacientes con DCL fueron seguidos durante 18 meses con visitas cada 6 meses en las que se realizaba una reevaluación funcional. Al final del seguimiento se repitió el estudio de neuroimagen y evaluación neuropsicológica completa. Con todos estos datos, junto a la valoración clínica, se reconsideró el diagnóstico del paciente.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 4. Obtención de muestras y metodología de laboratorio para la cuantificación de neurosina: La

obtención

las

muestras

sangre

las

condiciones

almacenamiento fueron idénticas para todos los sujetos incluidos en el estudio excepto para las muestras remitidas desde el Hospital Clinic de Barcelona. Las muestras de sangre se obtuvieron en el servicio de extracciones del Hospital Universitario Central de Asturias, en tubo de tapón rojo (sangre coagulada) y en cantidad de 10 ml.

Las muestras se procesaron para obtener el suero en el

laboratorio de nuestro hospital del modo siguiente: se permitió la coagulación durante 30 minutos, se centrifugó la muestra durante 10 minutos a 3,500 g. Se recogió el sobrenadante y se hicieron varias alícuotas de la muestra de 5 ml que se congelaron a -80º C. Se obtuvo una segunda muestra a los 18 meses de la primera en 36 pacientes con DCL de los 66 a los que se les realizó seguimiento. La determinación de las concentraciones séricas de neurosina se realizó en el Servicio de Inmunología del HUCA. Se utilizó un inmunoensayo comercializado (Kit para hk6) de IBEX (human kallikrein 6 research ELISA, IBEX, Canada) con dos anticuerpos monoclonales de ratón siguiendo las instrucciones del proveedor. Este inmunoensayo no presenta inmunoreactividad cruzada con otras kallikreínas y tiene una precisión con un margen de error inferior al 4%. El kit está basado en un inmunoensayo previamente descrito por Diamandis y cols. [57]. Consiste en un inmunoensayo tipo “sandwich” en el que se utiliza neurosina recombinante standard, un anticuerpo monoclonal antineurosina de ratón y un segundo anticuerpo monoclonal antineurosina conjugado con biotina; ambos dentro de una matriz estabilizante con BSA. La unión del anticuerpo biotinilado se detectó mediante la unión de un conjugado de estreptavidina con el enzima peroxidasa y la adición de tetrametilbenzidina. Los dos anticuerpos monoclonales de neurosina de ratón usados en este inmunoensayo son específicos para la neurosina y no muestran inmunoreactividad cruzada contra las kalikreínas recombinantes humanas purificadas 2, 3 (PSA), 5, 8, 10 y 13. La precisión intra-ensayo de este ELISA es CV<3.97 y la precisión interensayo es CV< 7.22. La curva standard se generó con diluciones standard de neurosina recombinante entre 0.2 y 20 ng/ml. 5. Recogida de Datos y Variables Los datos de los pacientes se ordenaron consecutivamente por orden de inclusión en forma de doble registro anonimizado mediante bases de datos disociadas: una con número de historia y código y otra con código y datos.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias Los datos de los resultados de laboratorio se recogieron inicialmente en cuaderno y posteriormente se introdujeron en el programa informático SPSS 14.1 junto al código del paciente. 5.1 Variables Primarias: •

Diagnóstico: para todos los individuos incluidos en el estudio se realizó un diagnóstico (único y excluyente) que representa una variable cualitativa nominal que se codificó numéricamente. En los pacientes con DCL además del diagnóstico inicial se recogió el diagnóstico a los 18 meses de seguimiento.

•

Valor de la concentración sérica de neurosina: variable cuantitativa continua. Se ha recogido su valor incluyendo dos decimales

5.2 Variables Secundarias: •

Edad: variable cuantitativa discontinua, su valor se ha recogido en números enteros (sin decimales ni fracciones).

•

Sexo: variable dicotómica que se codificó: 1:hombres, 2:mujeres

•

Genotipo ApoE: es el genotipo Apo E, que representa una variable cualitativa nominal que permite 6 posibilidades genotípicas como combinación de 2 alelos de 3 tipos, se codificó: 1:2,2; 2:2,3; 3:2,4; 4:3,3; 5:3,4 y 6:4,4

6. Análisis estadístico Para el análisis estadístico se ha utilizado el programa informático SPSS, versión 14.1 bajo el asesoramiento de la unidad de investigación y estadística de la Oficina de Investigación Biosanitaria del Principado de Asturias. Mediante T de Student para comparación de medias se comparó la edad media de controles y pacientes con EA. Se realizaron test Chi-cuadrado para evaluar las diferencias en la distribución por sexo en controles y pacientes con EA. Mediante el test de Kolmogorov-Smirnov se comprobó que la concentración plasmática de neurosina sigue una distribución normal en pacientes y controles. Mediante el coeficiente de correlación de Pearson se estudió la correlación de la concentración plasmática de neurosina y la edad de pacientes y controles. Mediante test T de Student se comparó si existen diferencias en la concentración media de neurosina entre controles mayores y menores de 60 años y entre sexo masculino y femenino tanto en controles como en pacientes con EA, también se comparó la media en pacientes con EA portadores de un alelo E4 con los no portadores de alelo

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias E4. Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias de las concentraciones plasmáticas de neurosina entre todos los grupos. Se calculó la sensibilidad, especificidad y valores predictivo positivo y negativo de la prueba en el diagnóstico diferencial entre aquellos grupos diagnósticos cuyas medias mostraron diferencias significativas. El valor de corte óptimo se ha determinado hallando el punto con mejor valor promedio de sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de EA. Se crearon curvas ROC con ayuda del programa Rockit 09.1beta y se calculó el área bajo la curva de esta prueba para la EA. Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias de concentración de neurosina entre los distintos grupos de DCL tras el seguimiento. Se realizaron tests Chi-cuadrado con dos grados de libertad para determinar si hay relación entre la existencia de progresión clínica y los niveles plasmáticos de neurosina dicotomizados en “altos” y “bajos”. Se realizó un análisis de regresión logística para determinar la probabilidad de cada diagnóstico en función de los niveles dicotomizados de neurosina corrigiendo los resultados para las variables demográficas sexo y edad. Finalmente se correlacionó, mediante el coeficiente de correlación de Pearson, los niveles de neurosina con el estadio evolutivo de EA. 7. Consideraciones éticas y legales Este

proyecto

investigación

fue

aprobado

por

los

Comités

Investigación y Ético del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA). Este estudio se ha regido por las bases éticas del Convenio de Oviedo siguiendo sus normas de información y consentimiento informado, y por los principios de la

Declaración de Helsinki, del Consejo de Europa relativo a los

derechos humanos y la biomedicina, de la Declaración Universal de la UNESCO sobre los derechos humanos y los requisitos de la legislación española incluyendo la “Ley de investigación con seres humanos”. Los datos se han tratado con carácter confidencial. La identidad de los pacientes se ha salvaguardado mediante la creación de un registro disociado y se ha cumplido la normativa de la Ley de Protección de Datos.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias II. RESULTADOS 1. Descripción de la muestra 1.1 Características de los individuos incluidos Inicialmente se incluyeron 633 individuos en el screening del estudio, de los cuales 186 no cumplieron finalmente los criterios de inclusión o fueron perdidos durante el seguimiento inicial (Tabla 4). Además se incluyeron las muestras de 228 controles y muestras de 27 pacientes con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob procedentes del Hospital Clínico de Barcelona. Por lo tanto se estudiaron muestras de 675 individuos, 423 mujeres y 252 hombres repartidos en los grupos diagnósticos descritos en la Tabla 5.

Frecuencia N

Edad

Media

Sexo

Desviación

Femenino

Masculino

Standard

Controles

228

33.8

50.24

17.77

143

21.18

12.59

•

Mayores de 60 años

10,3

77,84

7,88

6,07

4,29

•

Menores de 60 años

158

23,4

38,05

21,54

102

15,11

8,29

199

29.4

80.01

6.76

130

19.25

10.22

Enfermedad de Alzheimer •

EA leve

12.4

79.02

6.99

7.11

5.33

•

EA moderada

11.7

80.50

6.57

8.59

3.11

•

EA severa

5.3

81.25

6.50

3.55

1.77

Deterioro Cognitivo Leve

10.1

76.30

8.30

6.96

3.11

Demencia con comp. Vasc.

11.8

75,36

8,67

5,62

6,22

•

Demencia mixta

4.1

77.14

7.97

2.66

1.48

•

Demencia vasc.

7.7

74.40

10.72

2.96

4.74

Demencia Frontotemporal

3.0

75.00

9.52

1.48

Pseudodemencia

2.7

73.11

9.00

1.92

0.74

Afasia Progresiva Primaria

0.9

73.83

6.79

0.59

0.29

Demencia con C. de Lewy

2.7

75.72

12.56

1.62

1.03

Enfer. de Creutzfeldt-Jakob

4.3

64.89

10.89

3.11

1.18

Degeneración Corticobasal

0.3

74.00

15.55

0.14

Enfermedad de Huntington

0.1

70.00

0.14

Otras

0.8

80.33

6.47

0.59

0.29

Total

675

100.0

67.85

17.92

423

62.66

252

37.33

Tabla 5. Distribución de la muestra en grupos diagnósticos y variables demográficas.

En el grupo “otras” se incluyen 6 pacientes en los que inicialmente se había diagnosticado enfermedad psiquiátrica pero cuyo curso evolutivo fue hacia demencia que no se ha podido clasificar en el momento de finalizar el estudio.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 1.2 Diferencias de edad y sexo entre controles y pacientes Para evaluar si existen diferencias en la edad y el sexo de pacientes con EA y controles comparamos en ellos la distribución de estas variables. Los resultados demuestran que no hay diferencias significativas en el sexo entre controles y ningún tipo de demencia (para grupos diagnósticos con n≥25). Sin embargo, sí hay diferencias significativas en la edad entre controles y todos los grupos de pacientes (p=0.014) lo que podría ser fuente de sesgos. Por ello, para las comparaciones de niveles de neurosina entre casos y controles, se tomaron como controles el grupo de controles mayores de 60 años. 1.3 Evolución diagnóstica de los pacientes con DCL De los 68 pacientes con DCL incluidos se consiguió seguir a 66 hasta 18 meses tras el diagnóstico. Se mantuvieron estables 30 casos (45,4%). Veintitrés pacientes (34,8%) desarrollaron EA (de acuerdo con los criterios NINCDS-ADRDA [45]) y 13 (19,7%) desarrollaron Demencia con Componente Vascular (de acuerdo con los criterios NINCDS-AIREN [48]). Por tanto, la tasa global de conversión anual (porcentaje de pacientes que evolucionan de DCL a demencia en un año) fue 36,4%. 2. Neurosina en controles 2.1 Correlación de los niveles de neurosina con la edad en controles El valor medio de neurosina en el grupo control fue 4,44 ng/ml. Dado que las demencias son un trastorno asociado a la edad, valoramos si en los sujetos sanos la concentración de neurosina también variaba con la edad. Efectivamente, existe una correlación positiva entre estas variables (Factor de correlación de Pearson: 0,362, RSQ= 0,131, significación bilateral p<0,001). Tal como se muestra en la Figura 12, a mayor edad de los controles, mayor nivel de neurosina. Las diferencias en los niveles de neurosina en los controles mayores de 60 años (valor medio de neurosina 5,52 ng/ml) y en los menores de 60 años (valor medio 3,97 ng/ml) difieren significativamente (p=0,027) (Figura 11).

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

Figura 11. Diagrama de cajas representando la comparación de valores medios de neurosina entre el grupo de controles menores de 60 años y el de controles mayores de 60 años. Existen diferencias significativas (p=0,027).

2.2 Influencia del sexo sobre los niveles de neurosina Los valores medios de neurosina en controles, tanto en mayores como en menores de 60 años fueron muy similares en hombres y mujeres (Tabla 6) y no existieron diferencias significativas (p=0,681 para menores de 60 años y p=0,772 para mayores de 60 años), por lo que el sexo no es una variable que influya sobre los niveles de neurosina en controles en ningún rango de edad. Menores de 60 años Mayores de 60 años n media Desv. Std. n media Desv. Std. 56 4,01 2,06 29 5,55 1,01 102 3,95 2,01 41 5,48 1,23 Total 158 3,97 2,02 70 5,52 1,21 Tabla 6. Valores medios de neurosina en los controles en función del sexo.

Sexo Masculino Femenino

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

Figura 12. Correlación entre los niveles de neurosina y la edad en controles. Correlación significativamente positiva con (Correlación de Pearson= 0,362 RSQ=0,131).

Figura 13. Correlación entre los niveles de neurosina y la edad en pacientes con Enfermedad de Alzheimer. No hay correlación significativa (Correlación de Pearson = 0,137, RSQ=0,019).

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

3. Neurosina en pacientes con EA 3.1 Correlación de los niveles de neurosina con la edad en pacientes con EA Al contrario de lo que sucede en controles, en los pacientes con EA no hay correlación entre los niveles de neurosina y la edad. Factor de correlación de Pearson= 0,137, RSQ=0,019, significación bilateral=0,231 (Figura 13). Este dato puede interpretarse como que la natural tendencia ascendente de los niveles plasmáticos

neurosina

rompe

caso

iniciarse

proceso

neurodegenerativo tipo EA. 3.2 Influencia del sexo sobre los niveles de neurosina en pacientes con EA Tal como cabía esperar, dado que se sabe que la incidencia de EA es superior en mujeres que en hombres, nosotros también encontramos diferencias significativas en el número de pacientes de cada sexo: 69 hombres, 130 mujeres (p=0,017). Sin embargo, el valor medio de neurosina en cada grupo no difiere significativamente: 4,93 en mujeres y 4,87 en hombres (p=0,834) por lo que el sexo no es una variable que influya sobre los niveles de neurosina en pacientes con EA. 3.3 Influencia del genotipo ApoE en los niveles de neurosina en pacientes con EA Dado que la presencia genotipo ApoE4 es un conocido factor de riesgo de la EA determinamos si el genotipo ApoE es un factor que pueda influir sobre los niveles plasmáticos de neurosina en pacientes con EA. Todos los pacientes con EA fueron genotipados y divididos en a) portadores de 1 o 2 alelos ApoE4 y b) no portadores del alelo E4. Ochenta y seis pacientes (43,21%) eran portadores de al menos un alelo E4. La media en el grupo a) fue 5,04 ng/ml, mientras que en grupo b) fue 4,76 ng/ml. La comparación de medias no resultó significativa (p=0,453), con lo que puede concluirse que el genotipo ApoE no afecta los niveles plasmáticos de neurosina en pacientes con EA.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 4. Valor diagnóstico de la cuantificación plasmática de neurosina 4.1 Diferencias de los niveles de neurosina entre los distintos grupos diagnósticos Una vez conocidos los valores de neurosina en los dos grupos más importantes –controles y EA-. El paso siguiente fue evaluar las diferencias en la concentración plasmática de neurosina entre grupos diagnósticos (Tabla 7). Diagnóstico

Media

Des. Std.

Controles

4,450

1,630

•

Controles mayores de 60 años

5,523

1,215

•

Controles menores de 60 años

3,972

2,020

Deterioro Cognitivo Leve

5,965

1,890

Enfermedad de Alzheimer

4,909

2,011

•

EA leve

5,191

2,252

•

EA moderada

5,082

1,858

•

EA severa

3,882

1,786

5,772

2,453

Demencia con componente vascular •

Demencia mixta

5,721

2,886

•

Demencia vascular

5,806

1,713

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

4,779

1,494

Pseudodemencia

6,517

2,833

Otras demencias neurodegenerativas

5,704

1,253

•

Demencia frontotemporal

5,342

2,348

•

Afasia Progresiva Primaria

4,975

1,813

•

Demencia con Cuerpos de Lewy

6,039

1,116

•

Enfermedad de Huntington

0,486

•

Degeneración Córticobasal

8,818

3,132

Tabla 7. Valores medios de la neurosina y desviación standard por grupo diagnóstico. Unidades: ng/ml.

Los niveles más altos fueron encontrados en pacientes diagnosticados de Degeneración corticobasal (8,818 ng/ml), Pseudodemencia (6,517 ng/ml), y demencia con cuerpos de Lewy (6,039 ng/ml). Resulta interesante que en el único paciente diagnosticado con Enfermedad de Huntington, la concentración de neurosina resultó muy disminuida (unas 10 veces) respecto a los controles (0.486 ng/ml respecto a 4.44 ng/ml), si bien este dato no puede tomarse en consideración por proceder de un único paciente. La comparación de las medias de concentración de neurosina entre los distintos grupos arrojó varios resultados remarcables. La ANOVA muestra que existen diferencias significativas entre algunos de los grupos (p=0,042). Las

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias significaciones estadísticas recogidas en la Tabla 8 muestran que hay diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de neurosina encontrados en pacientes con EA respecto a controles mayores de > 60 años (p=0.042). Sin embargo la comparación de los datos procedentes de otros tipos de demencia o deterioro cognitivo con el grupo control (mayor de 60 años) no mostraron diferencias significativas. Sí se encontraron diferencias significativas entre los pacientes con EA y Pseudodemencia (p=0.039) y entre los pacientes con EA y Demencia con Componente Vascular (p=0.040). No hubo diferencias significativas entre los controles mayores de 60 años y la Demencia con Componente Vascular (p=0,277)

entre

los

controles

mayores

años

(p=0,140)

Pseudodemencia. No hubo diferencias significativas entre DCL y controles o entre DCL y cualquier tipo de demencia. DCL

EA leve

Controles

0,461

0,359

0,512

Controles >60 años

0,348

0,042

0,372

0,724

0,212

DCL Demencia Frontotemporal

0,313

0,197

0,497

Demencia con Cuerpos de Lewy

0,157

0,097

0,251

Afasia Progresiva Primaria

0,462

0,308

0,652

Pseudodemencia

0,092

0,039

0,241

Demencia Mixta

0,452

0,143

0,351

0,451

0,040

0,244

0,234

0,245

0,292

Demencia

con

componente

vascular Enfermedad

Creutzfeldt-

Jakob

Tabla 8. Diferencias entre grupos (con n>25) en la media de concentración plasmática de neurosina. Los datos indican el valor p. Se han incluido los grupos diagnósticos con más de 25 individuos. En negrita los valores significativos.

Las

muestras

pacientes

con

Enfermedad

Creutzfeldt-Jakob,

procedentes de otro centro, tampoco mostraron diferencias significativas con controles (p=0,241), pacientes con DCL (0,341) o EA (0,195). Para

Degeneración

Córticobasal

aunque

las

diferencias

parecen

importantes, el bajo número de individuos en estos grupos no permite hacer comparaciones estadísticas. Cuando se comparó selectivamente el grupo de pacientes con EA en grado leve no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de neurosina en estos pacientes respecto a controles o respecto a cualquier otro tipo de demencia (Tabla 8). Como se aprecia en la Figura 14, las diferencias entre controles y el conjunto global de pacientes con EA se debe a las diferencias existentes entre los

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias primeros y los pacientes con EA en estadio severo (p=0,022). Sin embargo, como se muestra mejor en el apartado 5.4 de los resultados, los niveles de neurosina sí presentan una clara tendencia descendente a lo largo de toda la evolución de la enfermedad.

Figura 14. Diagrama de cajas con la comparación de valores medios de neurosina entre el grupo de controles mayores de 60 años y los tres estadios de la EA. Las diferencias sólo son significativas entre controles y EA en estadio severo (p=0,022).

4.2 Evaluación de la cuantificación de neurosina como prueba para el diagnóstico diferencial de la Enfermedad de Alzheimer Dado que existen diferencias en la concentración plasmática de neurosina entre pacientes con EA y controles mayores de 60 años, pacientes con Pseudodemencia y Pacientes con Demencia con Componente Vascular; tratamos de evaluar la validez de este parámetro como prueba para el diagnóstico diferencial de la EA con estas entidades. Para ello, en primer lugar determinamos el mejor punto de corte de neurosina para detectar EA. Calculamos la sensibilidad y la especificidad de la prueba en varios puntos y seleccionamos el que ofrecía mejor valor promedio, que resultó 5,25 ng/ml (Tabla 9).

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

Punto de corte

Sensibilidad

Especificidad

Sens. + Espe.

5,21

0,62

0,65

1,27

5,23

0,66

0,62

1,28

5,25

0,70

0,59

1,29

5,27

0,73

0,54

1,27

5,29

0,75

0,52

1,27

Tabla 9. Valores de sensibilidad y especificidad de la prueba en varios puntos para el diagnóstico de EA y suma de ambos valores.

A continuación clasificamos los sujetos como “bajos” cuando tenían valores ≤5,25 ng/ml o como “altos” cuando eran >5,25 ng/ml. El paso siguiente fue calcular la sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo (aceptando la prueba como negativa cuando resulta >5,25) y valor predictivo positivo (aceptando la prueba como positiva cuando es ≤5,25) en el diagnóstico diferencial entre los grupos

que

mostraron

diferencias

significativas

(EA

frente

controles,

Pseudodemencia y Demencia con Componente Vascular) (Tabla 10). En todos los casos la sensibilidad y especificidad mostró datos modestos (entre 0,59 y 0,70) y los valores predictivos negativos fueron bajos en todos los casos. Sin embargo, los valores predictivos positivos fueron altos (entre 0,85 y 0,95).

Estos resultados

sugieren que en casos de duda en la práctica clínica, la obtención de un resultado positivo (≤5,25 ng/ml) ante un paciente que consulta por deterioro cognitivo orienta el diagnóstico más hacia EA que hacia Pseudodemencia o Demencia con Componente Vascular. EA frente a controles

EA frente a

EA frente a Demencia

mayores de 60 años

Pseudodemencia

con Comp. Vascular

Valor

Intervalo

Valor

Intervalo

Valor

Intervalo

estimado

confianza

estimado

confianza

estimado

confianza

del 95 %

Sensibilidad

0,59

0,53-0,65

0,59

0,53-0,65

0,59

0,53-0,65

Especificidad

0,70

0,65-0,75

0,66

0,59-0,73

0,59

0,52-0,66

VPP

0,85

0,80-0,90

0,95

0,92-0,98

0,85

0,79-0,91

VPN

0,38

0,30-0,46

0,13

0,09-0,17

0,28

0,22-0,34

Tabla 10. Valores de sensibilidad, especificidad y predictivos para el diagnóstico de EA frente a controles mayores de 60 años (tomando el resultado como positivo si ≤5,25 ng/ml), EA frente a Pseudodemencia (tomando el resultado a favor de EA si ≤5,25) y de EA frente a Demencia con componente vascular (tomando el resultado a favor de EA si ≤5,25). VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias Finalmente, para proporcionar información dirigida a la toma de decisiones, se obtuvieron curvas ROC de los niveles plasmáticos de neurosina en el diagnóstico de EA frente a controles, Pseudodemencia y Demencia Vascular (Figura 15).

Figura 15. Curvas ROC para la determinación de la neurosina plasmática como prueba en el diagnóstico diferencial de EA frente a controles, Pseudodemencia y Demencia con Componente Vascular.

Las áreas bajo las curvas fueron: 0,677 (con un intervalo de confianza 0,582-0,719 para una probabilidad del 95%) en EA frente a controles, 0.703 (0,591-0,799) para EA frente a Pseudodemencia y 0,691 (0,583-0,752) para EA frente a Demencia con Componente Vascular.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 5. Valor pronóstico de la cuantificación de neurosina 5.1 Diferencias de los niveles de neurosina en pacientes con DCL en función de la evolución diagnóstica. El análisis retrospectivo de datos del grupo de pacientes con DCL (n=66) en el que se realizó seguimiento durante 18 meses muestra resultados de interés (Tabla 12). Existen diferencias significativas entre los grupos (p=0,024). Los valores iniciales de neurosina plasmática fueron significativamente distintos en el grupo de DCL que convirtió a Demencia con Componente Vascular (media: 7,17 ng/ml, intervalo de confianza 95%: 6,12-8,22) respecto al grupo que convirtió a EA (media: 4,96 ng/ml, intervalo de confianza 95%: 4,08-5,84) (p=0,015) y al del grupo que se mantuvo en el diagnóstico DCL (media: 5,03 ng/ml, intervalo de confianza 95%:4,06-6,00) (p=0,036) (Figura 16). No hubo diferencias entre los que se mantuvieron en DCL y los que convirtieron a EA (p=0,617). Dicho de otro modo, en función de los intervalos de confianza, los pacientes con DCL que presentan un valor de neurosina superior a 6,1 probablemente evolucionarán a Demencia con Componente Vascular, mientras que los que presentan niveles entre 4 y 6 pueden no convertir a demencia o convertir a EA.

Figura 16. Diagrama de cajas representando la comparación de valores iniciales de neurosina en los grupos diagnósticos de pacientes con DCL tras el seguimiento.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 5.2 Valor pronóstico de los niveles neurosina en pacientes con DCL Para calcular el riesgo de conversión de pacientes con DCL en función de su concentración plasmática inicial de neurosina clasificamos a los pacientes en aquellos con concentración baja (≤5,25) o alta (>5,25) (Tabla 11) y calculamos si existe asociación entre los grupos por niveles y los grupos diagnósticos así como la probabilidad de cada diagnóstico en función de los niveles de neurosina. P (χ2 test) >5.25 ≤5.25 DCL 12 (40%) 18 (60%) 0.437 EA 7 (30%) 16 (70%) 0.004 DCV 12 (93%) 1 (7%) <0.001 Tabla 11. Asociación entre los niveles dicotomizados de neurosina en pacientes con DCL y su diagnóstico a los 18 meses.

pacientes

inicialmente

diagnosticados

DCL

existe

asociación

significativa entre el desarrollo de Demencia con Componente Vascular y la presencia de concentración plasmática de neurosina superior a 5,25 ng/ml (p<0,001) así como entre el desarrollo de EA y una concentración plasmática inferior a 5,25 ng/ml (p=0,004). La “no conversión” no se asocia significativamente con ninguno de los grupos de niveles dicotomizados de neurosina. La probabilidad o riesgo (Odds Ratio) de desarrollar Demencia con Componente Vascular en pacientes con neurosina superiores a 5,25 ng/ml es 13,10 (con un intervalo de confianza 12,75-14,87 para una probabilidad del 95%) (Tabla 12).

Diagnóstico final Riesgo neurosina DC Vascular otros OR (95%CI) p ≤5.25 1 (7%) 34 (64 %) 1 >5.25 12 (93 %) 19 (36 %) 13.10 (11.92-14.32) 0.001 Tabla 12. Riesgo de desarrollar DCV en pacientes con DCL que presentan niveles altos de neurosina. La OR está corregida por sexo y edad.

El riesgo (Odds Ratio) de desarrollar EA en pacientes con DCL y niveles de neurosina menores de 5,25 ng/ml fue 2,1 (con un intervalo de confianza 1,32-2,92 para una probabilidad del 95%) (Tabla 13).

Diagnóstico final Riesgo neurosina EA otros OR (95%CI) p >5.25 7 (30%) 24 (56%) 1 ≤5.25 16 (70%) 19 (44%) 2.10 (1.32 -2.92) 0.013 Tabla 13. Riesgo de desarrollar EA en pacientes con DCL que presentan niveles bajos (≤5.25) de neurosina. La OR está corregida por sexo y edad.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias 5.3 Variación temporal de los niveles de neurosina en pacientes con DCL durante el seguimiento. Para determinar si existe variación en el tiempo de los niveles plasmáticos de neurosina en pacientes diagnosticados con DCL y si tal variación tiene valor predictivo del diagnóstico final, también se midió la concentración plasmática de neurosina en 36 pacientes con DCL al final del periodo de seguimiento (Tabla 14). Los resultados muestran que en tan sólo 18 meses los niveles de neurosina se elevaron significativamente (desde 7,17 ng/ml a 8,79 ng/ml) en los pacientes que progresaron a Demencia con Componente Vascular (p=0,043) mientras que el descenso observado en este periodo en los pacientes que evolucionaron a EA (de 4,96 ng/ml a 4,87 ng/ml) no fue significativo (p=0,747). Por tanto, la elevación de los niveles de neurosina en un paciente con DCL orienta a progresión hacia Demencia con Componente Vascular.

Diagnóstico final

Valor inicial (ng/ml) N

media

intervalo

Valor final (ng/ml) de

media

confianza 95%

intervalo

confianza 95%

DCL

5,03

(4,06-6,00)

5,56

(4,69-6,43)

4,96

(4,08-5,84)

4,87

(4,42-5,32)

Demencia con

7,17

(6,12-8,22)

8,79

(8,28-9,30)

Componente Vascular Tabla 14: Valores (medios e intervalo de confianza) iniciales y tras el seguimiento en pacientes con DCL desglosados por diagnóstico tras el seguimiento.

5.4 Correlación entre el estadio evolutivo en Enfermedad de Alzheimer y los niveles de neurosina Finalmente nos propusimos hacer una estimación de cuál podría ser la evolución teórica que seguirían los niveles de neurosina a lo largo de la evolución de la EA, partiendo del estado de salud (controles) hasta la fase más avanzada de la enfermedad. Para ello se tomaron los valores medios de neurosina en controles mayores de 60 años (GDS 1), retrospectivamente se seleccionaron los pacientes con DCL (GDS 3) que evolucionaron a EA (valor medio de neurosina 4,96) y se añadieron los de la EA en sus distintos estadios evolutivos (GDS 4, 5 y 6) (Figura 17). Existe correlación significativa entre el grado de severidad y la concentración de neurosina. (Factor de correlación de Pearson: -0,362, RSQ= 0,381, significación bilateral p=0,041). Así puede decirse que a mayor severidad de la enfermedad, menor concentración plasmática de neurosina. Como ya habíamos visto en el apartado 4.1, la mayor caída en la concentración se produce en el estadio final (GDS 6) de la enfermedad.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias Por otro lado, en la Figura 17 puede observarse cómo el punto 5,25, que previamente había sido seleccionado como el mejor punto de corte para el diagnóstico de EA efectivamente parece separar los individuos aún sanos de los ya enfermos.

Figura 17. Evolución de los niveles plasmáticos de neurosina en pacientes con EA a lo largo de los distintos estadios evolutivos. Se han tomado los valores medios de controles mayores de 60 años, pacientes con DCL que evolucionaron a EA y pacientes con EA en los distintos estadios. La línea discontinua en azul representa la correlación entre los niveles y el estadio evolutivo. La línea roja de puntos indica el nivel 5,25 ng/ml que previamente había sido seleccionado como el mejor punto de corte para el diagnóstico de EA.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias V. DISCUSIÓN Como hemos visto, la neurosina es una proteasa de expresión tisular, preferentemente cerebral, a la que tanto los estudios de investigación básicos como los

estudios

clínicos

iniciales

adjudican

papel

las

demencias

neurodegenerativas. En todo caso permanecían sin estudiar la variación de la concentración plasmática de neurosina en individuos sanos con la edad, las diferencias de concentración en las distintas entidades causantes de deterioro cognitivo y el comportamiento de la medición de neurosina en plasma como prueba para la predicción evolutiva de pacientes con DCL y para el diagnóstico diferencial de las demencias. Nuestro estudio abordó todos estos aspectos. Discutimos a continuación los resultados más importantes. La concentración plasmática de neurosina aumenta con la edad en individuos sanos. Si bien ya se había señalado que la expresión cerebral de neurosina aumenta de forma fisiológica con la edad [40] se desconocía cuál era su comportamiento en plasma. Nuestro estudio confirma que paralelamente a lo que ocurre en el cerebro, la concentración plasmática de neurosina aumenta con la edad en individuos sanos. Así, en números redondos, a los 20 años los valores son próximos a 2 ng/ml mientras que a los 80 años tienden a situarse por encima de de 6 ng/ml. La concentración plasmática de neurosina disminuye en pacientes con EA Al contrario de lo que sucede en controles, en los pacientes con EA no hay correlación entre los niveles plasmáticos de neurosina y la edad. De hecho, nuestro estudio confirma que los niveles plasmáticos de neurosina descienden en pacientes con EA paralelamente a lo que sucede en el cerebro de estos pacientes [39]. Este resultado coincide con el resultado encontrado por otros grupos en plasma y LCR [22, 58, 59] y parece indicar que la tendencia natural al aumento con la edad se rompe en caso de aparición de EA. Este hecho podría interpretarse como una de las causas -o una de las consecuencias- de la fisiopatología de la EA. Si bien los mecanismos por los que la neurosina puede estar implicada en la EA son desconocidos, la relación más directa podría ser mediante la facilitación directa de formación de Aβ ya que a). en condiciones normales el Aβ estimula la expresión de kalikreínas [22] y b) la neurosina es una proteasa capaz de hidrolizar este péptido [32] favoreciendo su eliminación. Así, un descenso en la expresión de neurosina podría contribuir a la acumulación de Aβ en la EA.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias La concentración plasmática de neurosina no difiere entre pacientes con EA y pacientes con otras demencias neurodegenerativas, pero sí difiere entre EA y demencia no neurodegenerativa. Los

pacientes

con

demencia

origen

neurodegenerativo

(Pseudodemencia o Demencia con Componente Vascular) tienen niveles más altos de neurosina que los encontrados en pacientes con EA. Así, la medición de niveles de neurosina puede resultar útil para diferenciar tanto entre individuos sanos y EA como entre EA y pacientes con Pseudodemencia o Demencia con Componente Vascular. No obstante, las curvas ROC de la neurosina plasmática revelan que la EA puede ser distinguida de la Demencia Vascular y de la Pseudodemencia con una precisión “regular” en términos generales aunque el valor predictivo positivo alcanza cifras de 85-95%, por lo que una concentración plasmática disminuida en un paciente con demencia apoya la opción de EA frente a Demencia con Componente Vascular o Pseudodemencia (Tablas 15 y 16). Los pacientes con enfermedad psiquiátrica pueden presentar clínica cognitiva y trastorno del comportamiento similar al presente en pacientes con diversas formas de demencia, como la Frontotemporal o la EA. En ocasiones resulta difícil discernir si un paciente con quejas cognitivas y clínica psiquiátrica incluyendo trastorno del comportamiento presentan una enfermedad puramente psiquiátrica o una demencia con clínica psiquiátrica. La evaluación neuropsicológica suele arrojar luz sobre este dilema. Como vemos, la determinación de la concentración de neurosina también puede ser de utilidad, ya que en los pacientes con enfermedad psiquiátrica (Pseudodemencia) la concentración es más elevada que en los pacientes con EA. En la Demencia con Componente Vascular, un daño isquémico, único o múltiple, da lugar a los déficits neuropsicológicos. Si bien puede coexistir con un proceso neurodegenerativo, detectar el componente vascular es importante dado que supone una oportunidad de poder actuar sobre los factores de riesgo y permite instaurar tratamientos farmacológicos dirigidos a la profilaxis secundaria. El mecanismo fisiopatológico por el que la Demencia con Componente Vascular se asocia con incremento de la concentración plasmática de neurosina tampoco es conocido. Una posible explicación es la interacción de la neurosina con los PARs (Receptores Activados por Proteasas). Los PARs comprenden una familia de receptores acoplados a la proteína G que se activan por la trombina u otros factores de la coagulación o proteasas inflamatorias liberadas en los puntos de daño tisular [60]. Los PARs están ampliamente distribuidos en el SNC, y de forma similar a la neurosina las densidades más importantes se encuentran en el hipocampo, córtex, amígdala, tálamo, hipotálamo y estriado [26]. El PAR2 puede ser activado por la

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias neurosina [19, 27]. Entre otras acciones, PAR2 induce dilatación arterial y venosa favoreciendo la desregulación de la presión arterial, que a su vez puede contribuir de forma importante al desarrollo del daño vascular asociado a la Demencia con Componente Vascular [61, 62]. Existe una clara superposición en la concentración de neurosina entre la EA y otras demencias degenerativas (Demencia Frontotempolar, Demencia con Cuerpos de Lewy y Afasia progresiva), lo que sugiere que la neurosina podría participar en algún mecanismo común a varios procesos neurodegenerativos. Por tanto, la medición de la concentración plasmática de neurosina no es un buen parámetro para ayudar a discernir entre estos procesos (Tabla 15). La concentración plasmática de neurosina no difiere entre pacientes con DCL y pacientes con demencia. No se encontraron diferencias entre ninguna forma de demencia y el DCL, por lo que este parámetro no resulta de ayuda para clasificar a los individuos en sanos/DCL/demencia (Tabla 15). Actualmente el DCL se entiende como un estado transicional, de duración variable –varios años en general-, por el que pasan algunos pacientes al comienzo de su enfermedad que finalmente les llevará a sufrir demencia, bien degenerativa bien de otro origen como la vascular; aunque también incluye pacientes que no padecen ninguna enfermedad progresiva y que por tanto nunca desarrollarán una demencia. El paciente muestra alteraciones cognitivas de intensidad leve, no suficientes para alterar su funcionamiento global [3]. Es lógico, por tanto, que la media de neurosina en este grupo no difiera significativamente de la de controles ni pacientes con EA leve. La concentración plasmática de neurosina tiene valor pronóstico Aún más interesantes fueron los resultados del seguimiento de un subgrupo de pacientes con DCL durante un periodo de 18 meses, al final del cual se volvió a medir la concentración plasmática de neurosina en alguno de ellos. El valor medio de

neurosina

plasmática

difiere

significativamente

entre

los

evolucionaron a Demencia con Componente Vascular y los

pacientes

que

pacientes que

evolucionaron a EA o que se mantuvieron en DCL, por lo que el valor de neurosina en pacientes con DCL tiene valor pronóstico (Tablas 15 y 16). Además hemos podido estimar el riesgo de conversión hacia los distintos trastornos en función de los niveles de neurosina: así unos niveles inferiores a 5,25 ng/ml hacen muy improbable la evolución hacia Demencia con Componente Vascular mientras que el riesgo relativo de evolucionar a EA es 2; y viceversa, unos niveles superiores a 5,25

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias ng/ml elevan de forma muy importante la probabilidad de evolucionar a Demencia con Componente Vascular (Odds ratio de 13). Por último, las mediciones seriadas de la concentración plasmática de neurosina también son un buen indicador de la evolución de la enfermedad, ya que un ascenso en las mismas se asocia con evolución hacia Demencia con Componente vascular. Estos resultados pronósticos tienen gran trascendencia clínica, ya que ofrecen una oportunidad para instaurar medidas preventivas dirigidas a tratar de limitar la evolución natural de la enfermedad. Por ejemplo, ante un paciente con DCL y neurosina superior a 5,25 sería razonable indicar un control estricto de los factores

riesgo

vascular

quizás

podría

indicarse

también

profilaxis

farmacológica con antiagregantes. Por otro lado, el hecho de que la concentración de neurosina se correlacione con el grado de severidad en pacientes con EA supone que su determinación seriada podría resultar de utilidad para ayudar a monitorizar la progresión de la enfermedad, lo que a su vez podría ayudar a valorar, junto a los parámetros clínicos, la respuesta a los medicamentos “anti-Alzheimer”. La medición de la concentración plasmática de neurosina...: srve para ayudar a: Diferenciar entre individuos sanos.

no sirve para: demencia

Diferenciar entre EA leve / individuos sanos / pacientes con DCL.

Diferenciar entre demencia por EA Demencia con componente vascular.

Diferenciar entre demencias neurodegenerativo.

Diferenciar entre Pseudodemencia.

Diferenciar entre EA y Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

demencia

por

origen

Monitorizar la progresión de la enfermedad en pacientes con EA y pacientes con DCL. Predecir la evolución de pacientes con DCL. Estimar el riesgo de conversión a demencia en pacientes con DCL. Tabla 15. Situaciones para las que puede resultar de utilidad la medición de la concentración plasmática de neurosina y situaciones para las que no es de utilidad.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias En caso de

Un valor de neurosina...

Orienta a

Valor estadístico

–

Menor de 5,25 ng/ml

VPP: 0,85

Duda entre EAPseudodemencia

Menor de 5,25 ng/ml

VPP: 0,95

Duda entre EADemencia con componente vascular

Menor de 5,25 ng/ml

VPP: 0,85

DCL

Mayor de 6,1 ng/ml

Evolución a Demencia Comp. Vasc.

Probabilidad 95%

DCL

Menor de 6 ng/ml

Evolución a EA o No Conversión

Probabilidad 95%

DCL

Elevación de los niveles respecto a valor previo

Evolución a Demencia Comp. Vasc.

p=0,043

Estimación de Riesgo de conversión en pacientes con DCL

Menor de 5,25 ng/ml

conversión EA

OR: 2,1

Duda entre EA individuo sano

Conversión a OR: 13,1 Demencia con Componente Vascular Tabla 16. Resumen de las principales situaciones clínicas de utilidad de la prueba y orientación diagnóstica en función del resultado. Estimación del Riesgo de conversión en pacientes con DCL

Mayor de 5,25 ng/ml

Así pues, se puede concluir afirmando que la determinación plasmática de neurosina no ofrece rendimiento en el diagnóstico diferencial de las distintas formas de

demencia

origen

neurodegenerativo

–incluyendo

Enfermedad

Creutzfeldt-Jakob- pero sí es útil para diferenciar la EA de otras entidades no degenerativas que también cursan con síntomas cognitivos –Demencia con Componente Vascular y Pseudodemencia- y para estimar el riesgo de evolución a algunas formas de demencia desde la fase de DCL. Se confirma, por tanto, la utilidad de la prueba como parámetro de ayuda ante determinados diagnósticos diferenciales en la práctica clínica habitual.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias VI. CONCLUSIONES •

Paralelamente a lo que ocurre en el tejido cerebral, los resultados de este estudio demuestran que la concentración plasmática de neurosina se incrementa de forma fisiológica con la edad.

•

La concentración plasmática de neurosina disminuye significativamente en pacientes con Enfermedad de Alzheimer respecto a controles.

•

La disminución más importante en la Enfermedad de Alzheimer se produce en fases avanzadas mientras que los niveles en fase leve no difieren significativamente de los controles o de los individuos con Deterioro Cognitivo Leve.

•

La cuantificación de la concentración plasmática de neurosina puede resultar de utilizad para ayudar a diferenciar entre demencia por Enfermedad de Alzheimer y Demencia con Componente Vascular.

•

La cuantificación de la concentración plasmática de neurosina puede resultar de utilizad para ayudar a diferenciar entre demencia por Enfermedad de Alzheimer y Pseudodemencia.

•

La concentración plasmática de neurosina en pacientes con Deterioro Cognitivo Leve es útil para estimar el riesgo de conversión a distintas formas de demencia: un nivel alto (superior a 5,25 ng/ml) aumenta de forma importante el riesgo de evolución a Demencia con Componente Vascular (Odds Ratio: 13) mientras que un nivel bajo (inferior a 5,25) aumenta moderadamente el riesgo de evolución a EA (Odds Ratio: 2).

•

El seguimiento de los niveles de neurosina en un paciente con Deterioro Cognitivo Leve tiene valor pronóstico: una elevación de los mismos orienta la evolución hacia Demencia con Componente vascular.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias VII. BIBLIOGRAFÍA 1. American Psychiatric Association (2001) Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales. DSM-IV TR. Barcelona: Masson 2. Ferri CP, Prince M, Brayne C, Brodaty H, Fratiglioni L, Ganguli M, Hall K, Hasegawa K, Hendrie H, Huang Y, Jorm A, Mathers C, Menezes PR, Rimmer E, Scazufca M; Alzheimer's Disease International. Global prevalence of dementia: a Delphi consensus study. Lancet. 2005;366(9503):2112-7 3. Petersen RC, Smith GE, Waring SC, Ivnik RJ, Tangalos EG, Kokmen E. Mild cognitive

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regulated

via

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Utilidad de la cuantificaci贸n plasm谩tica de neurosina en el diagn贸stico diferencial de las demencias Group. Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: the STARD initiative. The Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy Group. Croat Med J. 2003;44(5):635-8 45. Tierney MC, Fisher RH, Lewis AJ, Zorzitto ML, Snow WG, Reid DW, Nieuwstraten P. The NINCDS-ADRDA Work Group criteria for the clinical diagnosis of probable Alzheimer's disease: a clinicopathologic study of 57 cases. Neurology.38(3):359-64. 46. McKeith IG, Dickson DW, Lowe J, Emre M, O'Brien JT, Feldman H, Cummings J, Duda JE, Lippa C, Perry EK, Aarsland D, Arai H, Ballard CG, Boeve B, Burn DJ, Costa D, Del Ser T, Dubois B, Galasko D, Gauthier S, Goetz CG, Gomez-Tortosa E, Halliday G, Hansen LA, Hardy J, Iwatsubo T, Kalaria RN, Kaufer D, Kenny RA, Korczyn A, Kosaka K, Lee VM, Lees A, Litvan I, Londos E, Lopez OL, Minoshima S, Mizuno Y, Molina JA, Mukaetova-Ladinska EB, Pasquier F, Perry RH, Schulz JB, Trojanowski JQ, Yamada M; Consortium on DLB. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology. 2005;65(12):1863-72 47. The Lund and Manchester groups. Clinical and Neuropathological Criteria for Frontotemporal Dementia. JNNP.1994;57:416-8 48. Roman GC, Tatemichi TK, Erkinjuntti T, Cummings JL, Masdeu JC, Garcia JH, Amaducci L, Orgogozo JM, Brun A, Hofman A, et al. Vascular dementia: diagnostic criteria for research studies. Report of the NINDS-AIREN International Workshop. Neurology 1993;43(2):250-60. 49. WHO. Public health issues related to animals and human spongiform encephalopathies: Memorandum from a WHO meeting. Bulletin of the WHO 1992;70:183-190 50. Auer S, Reisberg B. The GDS/FAST staging system. Int Psychogeriatr. 1997;9:167-71 44. 51. Knopman DS, DeKosky ST, Cummings JL, Chui H, Corey-Bloom J, Relkin N, Small GW, Miller B, Stevens JC. Practice parameter: diagnosis of dementia (an evidence-based review): report of the quality standards subcommittee of the American Academy of Neurology. Neurology.2001;56(9):1143-53

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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias VIII. ENGLISH SUMMARY Dementia is one of the most common causes of institutionalization, morbidity, and mortality among the elderly. As life expectancy increases, the number of people affected by dementia also increases. The diagnosis of the different causes of dementia remains based on clinical criteria which allow a “probabilistic” diagnosis once other causes of cognitive impairment have been discarded. Furthermore, symptoms of different dementias overlap with each other and

even

with

some

psychiatric

disorders

with

cognitive

symptoms

thus

complicating differential diagnosis. It is estimated that by the time a patient is diagnosed with any neurodegenerative dementia, the disease has been progressing for many years. Mild Cognitive Impairment (MCI) is a disorder considered to be a transitional stage from health to dementia. Diagnosis of dementias at these early stages is always troublesome because the pathophysiologic events leading to dementia precede clinical symptoms. For these reasons the search for molecular biomarkers that allow classifying different types of dementias is of high importance. During recent years the number of studies that describe the potential value of several proteins to diagnose or predict outcome of different types of dementias have increased exponentially. One of such markers is neurosin (Kallikrein 6). Neurosin is a “trypsin like” serine-protease expressed mainly in the brain. Previous studies suggested that neurosin is a potential biomarker for Alzheimer’s disease (AD) since its levels in brain tissue, CSF, and blood appear to be altered in AD. However, the sensitivity and specificity of plasmatic neurosin in AD and other dementias remain to be determined. To address this gap in knowledge and test the value of measuring the levels of neurosin as a diagnosis tool for MCI, AD and other dementias, we investigated the correlation between plasmatic levels of neurosin and the final diagnosis of patients with cognitive symptoms. Thus we measured plasmatic levels of neurosin in healthy individuals and patients with cognitive symptoms independently of what the final diagnosis was. We collected plasma samples from 228 controls and 447 patients diagnosed with either AD, Mild Cognitive Impairment MCI), Dementia with Lewy Bodies or Parkinson-Dementia, Frontotemporal Dementia, Huntington’s disease, Primary Progressive Aphasia, Corticobasal degeneration, Creutzfeldt-Jakob’s disease and Pseudodementia. Sixty six MCI patients were observed for 18 months and then plasmatic neurosin was measured again in 36. Plasmatic levels of neurosin increase with age in healthy individuals and decrease in patients with AD. Plasmatic levels of neurosin differ significantly between AD and Dementia with Vascular Component, Pseudodementia and the

Utilidad de la cuantificaci贸n plasm谩tica de neurosina en el diagn贸stico diferencial de las demencias control group. Analyses comparing any other form of neurodegenerative dementia to the AD group did not show significant differences. The mean value of plasmatic neurosin concentration differs significantly between MCI patients who converted to Dementia with Vascular Component, those who converted to AD, and those who remained at MCI stage. The risk of developing Dementia with Vascular Component when neurosin levels are higher than 5.25 ng/ml is very high (Odds ratio 13) while the risk of developing mild AD when neurosin levels are lower than 5.25 ng/ml is 2. Increases in the levels of neurosin suggest progression to Dementia with Vascular Component. In conclusion, the measurement of plasmatic levels of neurosin is a useful diagnostic tool to assist in distinguishing AD patients from subjects without neurodegenerative controls)

although

neurodegenerative

dementia it

(either not

dementias.

Pseudodementia,

useful The

Vascular

distinguish

measurement

Dementia

different plasmatic

types

or of

neurosin

concentration in patients diagnosed with MCI may predict conversion from MCI to Dementia with Vascular Component. A single measurement may be useful to estimate the risk of developing AD and Dementia with vascular component. Finally, repeated measurement of plasmatic neurosin might be a useful test to predict outcome in patients with MCI.

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias IX. ANEXO Los estudios de esta tesis doctoral han dado lugar a la publicación de dos artículos científicos en revistas internacionales, centrados en las entidades donde los resultados han mostrado mayor utilidad: la Enfermedad de Alzheimer y el Deterioro Cognitivo Leve. Las referencias se citan a continuación: •

Menendez-Gonzalez M, Castro P, Suarez A, Calatayud MT, Perez-Pinera P, Martinez M, Ribacoba R, Gutierrez C. Value of measuring plasmatic levels of neurosin in the diagnosis of Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s disease. 2008;14(1):59-67.

•

Menendez-Gonzalez M, Castro-Santos P, Calatayud MT, Perez-Pinera P, Ribacoba R,

Martinez-Rivera R, Gutierrez C, Lopez-Muñiz A, Suarez A.

Plasmatic level of neurosin predicts outcome of Mild Cognitive Impairment. Int Arch Med. 2008;1:11.