Prácticas hematología by Iratxe

Laboratorio Clínico y Biomédico Hematología

Prácticas de Hematología

2LACB

Itxaso Abaunza Iratxe Sierra

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Unidad 1. La sangre y la Hematopoyesis 1. Diferenciar suero-plasma 2. Bandas de sedimentación y determinación del pH sanguíneo

Unidad 2. Estudio morfológico de células sanguíneas en sangre periférica 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Realización de extensiones Tinción supravital con azul de metileno Tinción de Giemsa Tinción de Wright Tinción panóptico rápido Contaje de reticulocitos

Unidad 3. Recuentos celulares. El Hemograma 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Determinación de hemoglobina en sangre Visualización de una cámara de recuento Recuento manual de hematíes Determinación de hematocrito Determinación de sideremia Determinación de TIBC Determinación de ferritina

Unidad 4. Serie Roja 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Determinación de Cuerpos de Heinz Determinación de la velocidad de sedimentación globular (VSG) Prueba de resistencia osmótica globular Determinación de la Bilirrubina Determinación de LDH Prueba de la sacarosa

Unidad 5. Serie Blanca 1. Recuento manual de leucocitos 2. Fórmula leucocitaria 3. Detección de crioglobulinas

Unidad 6. Serie plaquetar. Hemostasia 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Determinación de grupo sanguíneo AB0 y Rh en porta Determinación de grupo sanguíneo y Rh en tubo Determinación sérica de grupo sanguíneo. Método indirecto en tubo Coombs directo en tubo Coombs indirecto Prueba cruzada de urgencia

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Unidad 1. La sangre y la hematopoyesis

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Diferenciar Suero-Plasma Objetivo de la práctica Observar la diferencia entre suero y plasma Muestra Suero y plasma Preparación de la muestra Extraer sangre con los tubos rojo y lila para la obtención de suero y plasma, respectivamente. Material    

Tubos de hemólisis Tubos eppendorf Pipetas Pasteur Gradillas

Aparataje  

Baño maría Centrífuga

Reactivo 

Cloruro cálcico

Normas de seguridad e higiene     

Ponerse la bata Ponerse los guantes Recogerse el cabello Tener cuidado con el manejo de reactivos Desechar los materiales adecuadamente

Desarrollo o procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Rotular los tubos de hemólisis como A (suero) y B (plasma). Poner los tubos en el baño maría durante 5 minutos a 37ºC. Centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 5 minutos. Reservar el sobrenadante. Depositar 0,2 ml de muestra A en un tubo eppendorf y 0,2 ml de muestra B en otro. Añadir a cada tubo 0,2 ml de cloruro cálcico. Mezclar y poner los tubos en el baño maría durante 5 minutos. Observar el resultado

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Resultados e interpretación A partir del tubo Eppendorf con la muestra, por el procedimiento anteriormente mostrado, no obtenemos ningún coágulo, lo que nos hace deducir que se trata de suero.

Resultado Presencia de coágulo Ausencia de coágulo

Plasma Suero

Cuestiones ¿Qué es el plasma y qué es el suero? El plasma es la parte líquida de la sangre donde flotan los elementos formes y contiene factores de coagulación. El suero al contrario no tiene factores de coagulación. ¿Con qué tubo se obtiene plasma y con qué suero? Con tubo rojo obtendremos suero y con el tubo lila plasma A la vista de los resultados obtenidos, ¿cuál creéis que es la causa de que el suero no coagule y el plasma sí? El suero no coagula porque al contrario del plasma, carece de factores de coagulación. ¿Qué función tiene el cloruro cálcico en este caso? En este caso, la función del cloruro cálcico era la de formar el coágulo.

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Bandas de sedimentación y determinación del pH sanguíneo Objetivo de la práctica Observar las bandas de sedimentación de una muestra de sangre Determinar el pH de la sangre Muestra Plasma Preparación de la muestra Extraer sangre en el tubo rojo para obtener plasma Material        

Tubo rojo. Eppendorf. Gradilla. Pipeta Pasteur. Palomilla. Vacutainer. Tortor. Tubos de ensayo.

Aparataje   

Tiras de pH. Micropipeta. Centrífuga.

Reactivos  

Vinagre Lejía.

Normas de seguridad e higiene    

Bata atada. Guantes. Pelo recogido. Manipular con seguridad.

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Desarrollo o procedimiento 1. Introducir una tira de pH en el tubo de sangre anteriormente centrifugada (o medir directamente empleando el pH-metro, en este caso se debe calibrar previamente). 2. Anotar el pH 3. Rotular dos tubos A y B 4. Separar el plasma de la muestra anterior (plasma patrón) con una micropipeta y añadir 0’5 ml en cada uno de los tubos A y B. 5. Añadir al tubo A 1 ml de vinagre o ácido acético y al tubo B añadir 1 ml de lejía o hidróxido sódico. 6. Introducir en cada tubo una tira de pH. 7. Anotar los resultados. 8. Medir con una regla lo que mide cada una de las bandas que aparecen en el tubo y señálalo sobre el dibujo. Resultado e interpretación

2,8 cm plasma

0,1 cm plaquetas

2,5 cm leucocitos y hematíes

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Cuestiones 1. Al realizar la centrifugación de la muestra se observan tres bandas de sedimentación. ¿Con qué elementos formes o células sanguíneas se corresponde cada banda? Respuesta en resultado e interpretación. 2. ¿Cómo se denomina el proceso de formación de células sanguíneas? ¿Qué tejidos son los responsables de este proceso y qué órganos lo constituyen? El proceso de formación de células sanguíneas se denomina hematopoyesis y se da en médula ósea. 3. Si realiza la centrifugación de tres muestras diferentes y se observa los siguientes resultados, ¿qué pensarías?   

Tubo A: se corresponde con el paciente Ander Bajeneta Tubo B: sangre patrón (normal) Tubo C: se corresponde con el paciente Juan Vázquez

Observamos que el tubo C, que se corresponde con el paciente Juan Vázquez tiene una gran cantidad de plaquetas y pocos hematíes. En el tubo B podemos observar que son las cantidades normales que tiene que tener (55%-45%). En el tubo A, podemos observar que tiene una gran cantidad de hematíes y células.

Tubo A Tubo B Tubo C

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Unidad 2. Estudio morfológico de células sanguíneas en sangre periférica

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Realización de extensiones Objetivo Realizar una extensión sanguínea y observar las distintas partes de esta en el microscopio. Respetar las normas de seguridad Muestra Sangre venosa adecuadamente anticoagulada. Preparación de la muestra Extracción sanguínea Material   

Portaobjetos Pipeta Pasteur Guantes

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Con los dedos índice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta normal (porta soporte), a nivel de sus bordes, y situarlo sobre la mesa. También puede apoyarse simplemente, el porta soporte sobre el extremo del dedo corazón de la mano que lo sujeta. De esta forma, el porta soporte forma un ángulo con la mesa. 2. Con una pipeta Pasteur, depositar una pequeña gota de sangre (de unos 5 l) en la cara superior de ese porta, a no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano. 3. Colocar un extremo del porta esmerilado (porta difusor o extensor) un poco por delante de la gota de sangre y formando un ángulo de 45º con el porta soporte. Es conveniente utilizar siempre el mismo porta extensor, para adaptarlo a esta función. 4. Desplazar suavemente hacia atrás el porta extensor, hasta que alcance la gota de sangre. 5. Deja que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del porta soporte. 6. Antes de que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media. Este deslizamiento debe acabar, aproximadamente, a 1 cm del extremo final del porta soporte, con un movimiento de ascensión del porta extensor. 7. Secar rápidamente la extensión, agitándola al aire, para que sus células no se distorsionen. 8. Escribir el nombre del enfermo en el porta que soporta la extensión.

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Resultados e interpretación

Cuestiones 1. ¿Cuáles son los principales problemas que nos podemos encontrar al realizar una extensión sanguínea?

2. Indica cómo se denominan las diferentes partes de una extensión sanguínea, cuales son los tipos celulares predominantes en cada parte y cuál es la zona ideal para la observación de la extensión.

En una extensión sanguínea se diferencian 3 partes:   

Cabeza: zona inicial más gruesa. Más de una capa sanguínea. Linfocitos. Cuerpo: zona media. Solo una capa de células. Su parte final es la zona ideal de observación. Leucocitos. Cola: zona más fina. Mayor proporción de leucocitos grandes. 11

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Tinción supravital con azul de metileno Objetivo de la práctica Observar los componentes de las células de sangre vivas Muestra Sangre venosa anticoagulada con EDTA Material    

Tubos de ensayo Pipeta Pasteur Portaobjetos Cubreobjetos

Aparataje 

Microscopio óptico

Reactivos   

Agua destilada Azul de metileno Aceite de inmersión

Normas de seguridad e higiene    

Bata Guantes Pelo recogido Manipular con cuidado los reactivos

Desarrollo o procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Echar 2 gotas de sangre en un tubo de ensayo Añadir 2 gotas de azul de metileno y mezclar bien Dejar reposar el tubo durante 10 minutos Pasados los 10 minutos, colocar una gota de la mezcla sobre un portaobjetos Colocar el cubreobjetos Observar el microscopio

Resultados e interpretación

El azul de metileno, es un colorante que tiñe el núcleo de las células por lo que como podemos observar en la foto, los glóbulos rojos no están teñidos porque carecen de núcleo y la única célula que se observa teñida es un leucocito ya que tiene núcleo.

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Tinción de Giemsa Objetivo de la práctica Observar la coloración de las células teñidas con la tinción May-Grunwald-Giemsa Muestra Sangre Material  2 portaobjetos  Pipeta Pasteur  Tubos de ensayo  Gradilla  Cubreobjetos  Papel de filtro Aparataje  

Cristalizador Microscopio óptico

Reactivos    

Colorante Giemsa Solución tampón pH 7,2 Etanol Agua destilada

Pictograma de los reactivos

Frases R y S R11 R23/24/25 R39/23/24/25 S16 S33 S36/37/39 S38 S4 S45 S9 Preparación de los reactivos Como el colorante Giemsa tiene grumos, hay que filtrarlo con un papel de filtro

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Normas de seguridad e higiene    

Bata Guantes Pelo recogido Manipular con cuidado los reactivos

Desarrollo o procedimiento 1. Realizar un frotis sanguíneo y dejarlo secar 2. Una vez seco, cubrir con etanol durante 3 minutos para deshidratar la muestra y que esta se fije bien al portaobjetos 3. En un tubo de ensayo preparar la tinción con 0,2 ml de Giemsa + 2 ml de solución tampón pH 7,2 4. Retirar el etanol 5. Cubrir la extensión con la tinción y dejar actuar 25 minutos. 6. Pasado este tiempo, retirar el exceso de tinte y lavar la muestra con agua destilada hasta que deje de salir tinte de ella. No verter el chorro de agua directamente sobre la muestra para evitar que esta se desprenda 7. Lavar con solución tampón 8. Dejar escurrir en posición vertical hasta que se seque 9. Observar al microscopio 10. Poner una gota de aceite de inmersión y observar con el objetivo de 100x

Resultados e interpretación

Como se puede observar, los glóbulos rojos quedan teñidos de un color rosado y los leucos de un color morado.

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Tinción de Wright Objetivo de la práctica Observar cómo se ven las células sanguíneas con los distintos colorantes según la tinción de Wright Muestra Sangre venosa Material      

Tubos de ensayo Pipeta Pasteur Cristalizador Portaobjetos Cubreobjetos Puente de tinción

Aparataje 

Microscopio óptico

Reactivos    

Agua destilada Colorante Wright Solución tampón pH 7,2 Aceite de inmersión

Pictogramas

Frases R y Frases S / Frases H y Frases P R11

R23/24/25

S16

S33

R39/23/24/25

S36/37/39

S38

S45

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Normas de seguridad e higiene    

Bata Guantes Pelo recogido Manipular con cuidado los reactivos

Desarrollo o procedimiento 1. Realizar un frotis sanguíneo y dejarlo secar 2. Colocar la extensión en el cristalizador sobre el puente de tinción y añadir el colorante Wright son una pipeta Pasteur 3. Dejar actuar 5-8 minutos 4. Escurrir y enjuagar la solución tampón 5. Colocar el portaobjetos en posición vertical hasta que se escurra y se seque 6. En un tubo de ensayo mezclar 0,5 ml de Wright + 0,5 ml de solución tampón 7. Mezclar y aplicar la dilución sobre la muestra 8. Dejar actuar 10 minutos 9. Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua destilada 10. Lavar la muestra con disolución tampón 11. Escurrir y colocar otra vez en posición vertical el portaobjetos 12. Una vez seca, colocar un cubreobjetos y observar con aceite de inmersión en el objetivo de 100x

Resultados e interpretación

Esto es lo que hemos podido observar en el microscopio con el objetivo de 100x

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Tinción panóptico rápido Objetivo de la práctica Observar la coloración de las células, teñidas con la tinción de panóptico Muestra Sangre capilar o sangre venosa Material    

Portaobjetos Lanceta Capilar Cubreobjetos

Aparataje 

Microscopio óptico

Reactivos    

Colorante 1: solución alcohólica de triarilmetano Colorante 2: solución tamponada de xanteno Colorante 3: solución tamponada de tiazina Aceite de inmersión

Pictogramas

Frases R y Frases S / Frases H y Frases P No tienen

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Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Realizar un frotis sanguíneo y dejarlo secar 2. Una vez que esté seca, introducir 5 veces en el primer colorante, una vez por cada segundo.

3. Inmediatamente, repetir lo mismo con el segundo colorante

4. Por último, repetir una vez más el proceso con el tercer y último bote

5. Lavar con agua destilada y dejar secar 6. Cuando esté seca, observar al microscopio los resultados

Resultados e interpretación

A continuación, adjuntamos una foto con la visión que no da haber realizado la tinción mediante panóptico.

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Contaje de Reticulocitos Objetivo de la práctica Cumplir con las normas de seguridad e higiene. Realizar la tinción de azul de cresil brillante Identificar reticulocitos en diferentes frotis sanguíneos Realizar el recuento de reticulocitos en diferentes muestras sanguíneas Validar los resultados e interpretarlos Muestra Sangre anticoagulada con EDTA Preparación de la muestra La muestra ya venía preparada Material  Tubos de hemólisis  Pipetas Pasteur  Portaobjetos Aparataje  Microscopio óptico  Baño María  Micropipetas Reactivos  Azul de cresil brillante  Aceite de inmersión Normas de seguridad e higiene  Bata  Guantes  Pelo recogido  Desarrollo o procedimiento 1. Añadir 3 gotas de sangre al tubo que contiene 100 ul de colorante 2. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente 3. Pasado este tiempo volver a homogeneizar y tomar una gota de la suspensión para depositarla en un portaobjetos. 4. Realizar una extensión y dejar secar al aire 5. Con una gota de aceite de inmersión observar la extensión con el objetivo de 100x

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Resultado e interpretación

No ha sido fácil identificar reticulocitos, ya que su presencia no suele ser muy abundante, pero si hemos podido identificar uno y sacarle una foto. Cuestiones ¿Qué son los reticulocitos? Son eritrocitos (glóbulos rojos) inmaduros que contienen un retículo o red cromatínica formada por restos de ARN, mitocondrias y otros órganos celulares. Indica 2 patologías donde aparezcan los reticulocitos aumentados. Anemia hemolítica y Trastorno sanguíneo en un feto o recién nacido. ¿Cómo se denomina el aumento y la disminución de reticulocitos? Aumento de reticulocitos: Reticulocitosis Disminución de reticulocitos: Reticulocitopenia

¿Qué tipo de tinción estamos realizando? Estamos realizando una tinción supravital ¿Cómo se denomina el colorante empleado? Azul de cresil brillante. ¿Qué estructuras del reticulocito se tiñen con este colorante? Las estructuras que se tiñen son los precipitados de restos de ARN.

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Unidad 3. Recuentos celulares. El Hemograma

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Determinación de hemoglobina en sangre Objetivo de la práctica Cumplir con las normas de seguridad e higiene. Realizar la determinación de hemoglobina con diferentes muestras, siguiendo el protocolo Validar los resultados e interpretarlos Muestra Sangre total anticoagulada con heparina o EDTA Preparación de la muestra La muestra ya viene preparada Material  Pipeta de cristal  Micropipeta  Puntas de pipeta  Pera  Tubos de ensayo  Cubeta Aparataje  Espectrofotómetro Reactivos  Reactivo de Drabkin Preparación de reactivos Mezclar el reactivo de Drabkin con agua destilada 100 ml reactivo --------- 900 ml de H2O destilada = 90 ml de H2O destilada 10 ml reactivo --------------- X ml de H2O destilada Frases R y Frases S/ Frases H y Frases P R20/21/22

R52/53

S36/37 S57

S59

S60

S61

Normas de seguridad e higiene  Bata  Guantes  Pelo recogido 22

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Desarrollo o procedimiento 1. Rotular 2 tubos de ensayo, uno con BL (blanco) y otro con PR (problema) 2. Añadir en el tubo PR 20 ul de muestra 3. Añadir 5 ml de reactivo en cada tubo, BL y PR. 4. Mezclar bien y dejar incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20-25ºC) 5. Leer los resultados Cálculo Abs (absorbancia) de la muestra X 37 = gr Hemoglobina / dl 0,548 X 37 = 20,276 g/dl Valores normales Hombres: 13-18 gr/dl Mujeres: 11-16 gr/dl Resultado e interpretación Teniendo en cuenta que el paciente es un chico y tras el análisis de la muestra, se podría decir que el paciente tiene la hemoglobina alta, ya que los valores normales están entre 13-18 gr/dl y este se encuentra en 20,276 gr/dl. Cuestiones ¿Cuál es la función de la hemoglobina? Transporta el oxígeno desde los órganos respiratorios hasta los tejidos, el dióxido de carbono desde los tejidos hasta los pulmones ¿En que se basan los métodos de determinación de la hemoglobina? Existen varios métodos para su determinación, aunque todos ellos se basan en las propiedades fisicoquímicas de la molécula de hemoglobina. Los más utilizados se fundamentan en la capacidad para absorber luz de la hemoglobina o alguno de sus derivados, como la oxihemoglobina o la cianmetahemoglobina. ¿Cuál es el método recomendado por el Comité Internacional para la estandarización de la Hematología? El comité internacional para la estandarización de la Hematología recomienda el método colorimétrico de la cianmetahemoglobina por su exactitud y precisión, y por la posibilidad de utilizar un patrón de referencia internacional muy estable que sirve para verificar los resultados obtenidos en el laboratorio, y elaborar curvas de calibración Suponiendo que un paciente tiene un Hto de 39% ¿qué concentración de hemoglobina tendrá? Hemoglobina X 2,8 =Hto Hemoglobina = Hto / 2,8  Hemoglobina = 39 / 2,8 => 13,92 % 23

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Visualización de una cámara de recuento Objetivo Identificar las diferentes partes de una cámara de recuento y familiarizarse con esta. Material Una cámara de recuento con un retículo de Neubauer mejorado. Aparataje Microscopio Procedimiento 1. Observar con el microscopio el retículo de la cámara de recuento. a. Primero, con el objetivo de pequeño aumento (4x) b. Luego, con el objetivo de mediano aumento (10x) c. Después, con el objetivo de gran aumento (40x) 2. Enfocar, con el objetivo de 10x, uno de los cuadrados grandes situados en las cuatro esquinas del retículo. 3. Contar el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande periférico. 4. Enfocar, con el objetivo de 10x, el cuadrado grande central. 5. Contar el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadro grande central. 6. Contar el número de cuadrados pequeños englobados en cada uno de esos cuadros. Cuestiones Dibuja cómo es la cámara de recuento de Neubauer e indica donde se realiza el recuento de los diferentes tipos celulares: hematíes, leucocitos y plaquetas.

En los bordes de este cuadrado central se cuentan los hematíes, utilizando sólo los cuadrados de los bordes del terciario central y uno de los centrales. En los secundarios de los bordes superiores e inferiores de la cámara se hace el recuento leucocitario.

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¿Cuántos cuadros medianos tiene el cuadrado grande periférico? El cuadrado grande periférico consta de 16 cuadrados medianos. ¿Cuál es la longitud de los lados del cuadrado grande periférico? Los lados del cuadrado grande periférico miden 3 mm. ¿Cuál es la longitud de los lados de cada uno de los cuadros medianos que contiene el cuadrado grande? La longitud del lado del cuadrado mediano es de 0.25 mm. ¿Cuál es el volumen de sangre diluida que hay en un cuadrado grande periférico? 1mm largo x 1mm ancho x 0,1mm alto = 0,1mm cúbicos de sangre diluida ¿Cuál es el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada (sabiendo que entre el porta y la cuadrícula de recuento quedan 0.1 mm)? 3mm largo x 3mm ancho x 0,1mm alto = 0,9mm cúbicos de sangre diluida ¿Cuál es el volumen de sangre diluida que hay en un cuadrado mediano incluido en un cuadrado grande periférico? 0,25mm largo x 0,25mm ancho x 0,1mm alto = 0,00625mm de sangre diluida ¿Cuántos cuadrados medianos hay en el cuadrado grande central? El cuadrado grande central contiene 25 cuadrados medianos. ¿Cuántos cuadrados pequeños hay en cada uno de los cuadrados medianos del cuadrado central? Cada cuadrado mediano está subdividido en 16 cuadrados pequeños. ¿Cuál es la longitud de los lados del cuadrado grande central? 3 mm / 3 cuadros grandes = 1mm cada cuadro grande ¿Cuál es la longitud de cada uno de los lados de los cuadrados medianos del cuadro grande central? El cuadrado grande central contiene 5 cuadrados medianos por lado. 1mm total / 5 cuadrados medianos = 0,2mm cada cuadro mediano ¿Cuál es la longitud de los lados de cada uno de los cuadrados pequeños englobados en los cuadros medianos del cuadro grande central? Cada cuadro mediano central tiene 4 cuadrados pequeños por lado. 0,2mm / 4 cuadrados pequeños = 0,05mm cada cuadrado pequeño

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Recuento manual de hematíes Objetivo de la práctica Realizar el recuento de hematíes siguiendo el protocolo Cumplir con las normas de seguridad e higiene Realizar los cálculos adecuados y validar los resultados Muestra Sangre venosa anticoagulada con EDTA Material   

Pipeta de Thoma Tubo de goma con boquilla Cámara de Neubauer

Aparataje 

Microscopio óptico

Reactivos 

Reactivo de Hayem

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Situar un cubre sobre el retículo de la cámara. 2. Aspirar la sangre hasta la señal de 0’5 3. En el caso de que se sobrepase algo del enrase, se hace descender la columna de sangre tocando la punta de la pipeta con un algodón. 4. Limpiar cuidadosamente el exterior de la pipeta con un algodón y sin hacer bajar el nivel de sangre. 5. Aspirar líquido diluyente hasta la señal 101. 6. Desenganchar el tubo de goma de la pipeta y homogeneizar el contenido de la ampolla. Para ello se sujeta la pipeta por sus extremos, con los dedos pulgar e índice, y se agita suavemente en sentido horizontal durante 2 o 3 minutos. 7. Desechar las 4 primeras gotas emitidas por la pipeta. 8. Depositar la siguiente gota entre la cámara y el cubre. Esto se realiza ubicándola en uno de 26

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los bordes no adheridos del cubre y dejándola que penetre por capilaridad, en el espacio existente entre ambas estructuras. Durante esta operación hay que evitar que se formen burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre. 9. Para ello se coloca la pipeta en posición casi vertical, se sitúa la punta de la pipeta en el borde apropiado, se disminuye algo de presión ejercida por el dedo índice sobre el otro extremo de la pipeta y se retira esta justo antes de que se llene completamente el espacio comprendido entre el cubre y la cámara. 10. Dejar reposar la sangre diluida, contenida en la cámara, durante unos minutos, para que las células presentes en ella puedan sedimentarse. 11. Enfocar el retículo con el objetivo de 40x y con el condensador a baja altura, y verificar que la distribución de los hematíes es homogénea. 12. Contar los hematíes presentes en 80 cuadrados pequeños del cuadrado grande central. Esto se logra, por ejemplo, contando los hematíes que hay en los 4 cuadrados medianos de las esquinas y en el del centro. Resultados e interpretación

Hemos contado los hematíes contenidos en 5 cuadrados medianos contenidos en el cuadrado grande y nos dan 960 hematíes. RBC= Hx5x10xD H= hematíes contados en 5 cuadrados. D= factor de dilución (en nuestro caso 100) RBC= 960x5x10x100= 4,8 millones El dato obtenido es correcto ya que está dentro de los valores normales en las mujeres 4-5,5 millones.

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Cuestiones Indica las características que presenta el líquido de Hayem El líquido debe ser isotónico con el plasma, para evitar la alteración morfológica e incluso la lisis de los hematíes. El líquido Hayem, que está compuesto por:    

2,5g de sulfato sódico 0,5g de cloruro sódico 0,25g de cloruro mercúrico 100ml de agua destilada

Si la sangre se diluyera a 1/200 y se cuentan 450 hematíes en 5 cuadrados medianos ¿cuál es el RBC obtenido? RBC= 450x5x10x200= 4.5 millones

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Determinación de hematocrito Objetivo de la práctica Cumplir con las normas de seguridad e higiene Realizar la determinación de hematocrito con precisión y cumpliendo el protocolo Validar los resultados obtenidos e interpretar los resultados Muestra Sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA Si se utiliza sangre capilar, desechar la primera gota obtenida tras la punción Material   

Tubos capilares Plastilina Lancetas

Aparataje 

Microcentrífuga

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Llenar cada tubo capilar con la sangre, hasta las 3/4 partes de su longitud. El llenado se efectúa por capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo capilar con la gota de sangre, o introduciéndolo en el tubo de sangre e inclinando este, posteriormente, para facilitar el proceso. 2. Limpiar el exterior de cada tubo con un trozo de algodón o con una gasa. 3. Sellar el extremo de cada tubo por el que ha entrado la sangre con plastilina. Para ello, se hace penetrar el tubo en la plastilina, o incluso se atraviesa esta con el capilar. 4. Colocar, debidamente equilibrados, los tubos en la centrífuga. En ella los tubos se sitúan con su extremo tapado hacia fuera, ajustados al borde exterior y adecuadamente encajados en sus surcos.

5. Centrifugar los tubos a unas 12.000 g durante 5 minutos. 6. Realizar la lectura comparando el resultado obtenido con el lector de hematocrito 29

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Resultados e interpretación Volumen total: 5,3 mm (T) Volumen eritrocitos: 1,8 mm (E) E x 100

1,8 x 100

HCT= ----------------  HCT = --------------- = 33,96 % T

5,3

Teniendo en cuenta que la sangre utilizada es de una mujer, podemos decir que su hematocrito está por debajo de los valores normales y que puede ser debido a que la persona a la que se le ha realizado la prueba es anémica. Cuestiones ¿Cuál es el valor normal de HCT? Hombres: de 40.7% a 50.3% Mujeres: de 36.1% a 44.3% ¿En qué condiciones se produce un aumento o una disminución de HCT? Los valores bajos de hematocrito pueden deberse a: • Anemia • Sangrado • Destrucción de los glóbulos rojos • Leucemia • Desnutrición • Deficiencias nutricionales de hierro, folato, vitaminas B12 y B6 • Mucha agua en el organismo Los valores altos de hematocrito pueden deberse a: • Cardiopatía congénita • Poca agua en el organismo (deshidratación) • Niveles bajos de oxígeno en la sangre Si la medida de la columna de eritrocitos es de 20 mm y la de la columna total es de 50 mm ¿cuál es el valor del HCT? 20 x 100 HTC= ----------------- = 40 % 50

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Determinación de sideremia Objetivo de la práctica Determinar la concentración de hierro en sangre Cumplir con las normas de seguridad e higiene Muestra Suero exento de hemólisis Preparación de la muestra Tras la extracción de sangre mediante punción venosa en tubo rojo, centrifugamos el tubo 5 minutos a 3500 rpm para la obtención del suero. Material  Tubos de ensayo  Cubetas para espectrofotómetro  Puntas de Micropipeta  Gradilla Aparataje   

Vortex Espectrofotómetro Centrifugadora

Reactivos Kit QCA de Hierro -CAB Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Primero, encendemos el espectrofotómetro. 2. Cogemos 3 tubos de ensayo y los rotulamos, poniéndole al primer tubo BL, al segundo ST y al tercero PR. 3. Después, comenzaremos a añadir la muestra y los reactivos. Primero añadimos 50 ul de muestra (suero) al tubo PR, seguido añadimos otros 50 ul de reactivo estándar al tubo ST y por último añadimos 1ml de reactivo en los 3 tubos. 4. Con ayuda del vortex, mezclamos bien los tubos y los dejamos incubar 10-15 minutos a temperatura ambiente (20-25º). 5. Durante ese tiempo, ajustamos la longitud de onda que se nos indica, que son 620 nm. 31

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6. Pasados los 10-15 minutos, vertemos el líquido de los tubos de ensayo en las cubetas para espectrofotómetro que previamente habrán sido rotulados con BL, PR y ST. 7. Por último, medimos las absorbancias en el espectrofotómetro y apuntamos los resultados. Valores normales Hombres: 55-175 ug/dl Mujeres: 40-145 ug/dl Recién nacidos: 150-220 ug/dl Cálculo Abs PR

- 0,10

------------- x 200 → ------------- x 200 = 57,14 ug/dl Abs ST

- 0,35

Resultados e interpretación En nuestro caso, sabiendo que la paciente era una mujer, podemos decir que sus niveles de hierro en sangre están dentro de los valores normales.

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Determinación de TIBC Objetivo de la práctica El objetivo de la muestra es la determinación de TIBC en sangre. Muestra Suero no hemolizado. En caso de que se demore el ensayo, (más de 8 horas), refrigerar la muestra a 2-8ºC. Si el ensayo se tiene que realizar después de 24 horas, es recomendable congelar la muestra. Preparación de la muestra Extracción sanguínea en tubo rojo. Centrifugación 5 min a 3500 rpm y recoger el suero en un tubo Eppendorf. Material      

Gradilla Micropipeta Tubos de ensayo Eppendorf Pipeta Pasteur Microcubetas

Aparataje 

Espectrofotómetro

Normas de seguridad e higiene Manipular con precaución. La eliminación de residuos debe hacerse según la normativa legal vigente.   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento

1. Preparar la muestra indicada en la tabla

Suero

1 ml

Disolución Fe Cl3

2 ml

2. Mezclar y dejar 10 minutos a temperatura ambiente (25ºC) 33

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3. Añadir una dosis de Mg CO2 4. Tapar el tubo y agitar fuertemente durante 15 - 20 seg. Dejar el tubo en reposo unos 30 minutos agitándolo 4 o 5 veces durante este tiempo 5. Centrifugar y separar el sobrenadante 6. Determinar la concentración de hierro sérico en el sobrenadante con el método utilizado para la determinación del hierro.

Cálculo Los resultados del espectrofotómetro para la determinación de hierro sérico han sido: Absorbancia PB 0.091 Absorbancia ST 0.186 [Hierro] = (0.091/0.186)*200= 97.84 µg/dl

1. Capacidad de fijación de hierro (TIBC) TIBC= 97.84 *3 = 293 µg/dl

2. Capacidad latente de fijación de hierro UIBC = 293 - 97.84 = 195.16 µg/dl

3. Transferrina Transferrina = 293 / 2 = 146.5 µg/dl

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Valores normales TIBC: 250 - 400 µg/dl UIBC: 160 - 280 µl/dl Transferrina: 210 - 360 mg/dl

Resultado e interpretación Según los resultados obtenidos, la TIBC del paciente (293 µg/dl) está dentro de los valores normales. Esto mismo sucede con la UIBC (195.16 µg/dl). Los valores de la Transferrina nos han dado por debajo de los valores normales 146.5 µg/dl, esto nos indicaría que el paciente tiene déficit de hierro.

Cuestiones ¿De qué depende la saturación de la Transferrina? La saturación de transferrina depende la de concentración de hierro. Esta disminuye en las deficiencias de hierro y aumenta cuando el hierro se acumula en exceso.

Si el valor de transferrina de un paciente es de 200, ¿por qué hay que multiplicar para obtener la capacidad de saturación? Saturación de transferrina (%) = (concentración de hierro sérico x 100%) / TIBC

¿Qué diferencia hay entre la capacidad de saturación y el índice de saturación? Capacidad total de fijación del hierro o TIBC es un análisis de sangre que muestra si hay demasiado o muy poco hierro en el suero. El hierro es transportado en la sangre adherido a la proteína transferrina. El índice de saturación nos dice cuánto de llena va esa proteína durante el transporte.

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Unidad 4. Serie Roja

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Determinación de cuerpos de Heinz Objetivo de la práctica Cumplir las normas de seguridad e higiene Realizar la tinción de cristal violeta Identificar cuerpos de Heinz en diferentes frotis sanguíneos Validar los resultados e interpretarlos Muestra Sangre total anticoagulada Material  Tubos cónicos de centrífuga  Pipetas Pasteur  Portas Aparataje  Microscopio óptico  Baño o termobloque  Micropipetas Reactivos  

Cristal violeta Aceite de inmersión

Normas de seguridad e higiene:   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Mezclar en un tubo de ensayo, volúmenes iguales de la solución de cristal violeta y de la sangre problema. 2. Incubar la mezcla a 37ºC durante 5 minutos 3. Hacer una extensión fina de la mezcla 4. Dejar secar la extensión 5. Observar la extensión con el microscopio, utilizando para ello el objetivo de inmersión.

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Resultado e interpretación Tras la realización del frotis sanguíneo y su posterior análisis al microscopio, hemos podido ver que no había cuerpos de Heinz por lo que eso indica que no padecemos ninguna patología relacionada con ellos. Cuestiones 1. ¿Qué son los cuerpos de Heinz? Son glóbulos rojos que contienen precipitados de hemoglobina en su interior. Consisten en una serie de pequeñas granulaciones que se sitúan en la periferia (extremos) de los hematíes y que se tiñen de color púrpura con una solución de cristal violeta. 2. ¿Cuándo se produce un aumento de estos cuerpos? El aumento de estas se produce en anemias hemolíticas, talasemias y cirrosis.

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Determinación de la velocidad de sedimentación globular (VSG) Objetivo de la práctica Determinar la velocidad de sedimentación globular (VSG) Muestra Sangre total anticoagulada con citrato sódico al 3,8% Material  Pipetas V.S.G  Gradilla  Cronómetro Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Realizar la extracción sanguínea con el tubo negro para la medición de VSG. No retirar el tubo hasta que se haya agotado el vacío del mismo. 2. Mezclar suavemente la sangre y el anticoagulante contenidos en el tubo 3. Introducir en el tubo la pipeta de VSG hasta el fondo 4. Anotar la altura a la que se encuentra la sangre 5. Dejar reposar la sangre en una superficie completamente plana y que no sea afectada por vibraciones 6. Anotar los mm que han recorrido los glóbulos rojos a la primera y a la segunda hora

Cálculo VSG 1ª hora + VSG 2ª hora / 2 Índice de Katz = ------------------------------------------2 Valores normales VSG

1ª hora

2ª hora

Hombres

2-7 mm

8-15 mm

Mujeres

3-10 mm

12-20 mm 39

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Resultados e interpretación Como podemos observar en los resultados obtenidos, en este caso al ser chica, está fuera de los valores normales establecidos. Los valores normales son de 3-10 mm la primera hora, y a nosotras nos ha dado 15 mm, y de 12-20 mm en la segunda, y a nosotras nos ha dado 30mm.

VSG

1ª hora

2ª hora

Itxaso

15 mm

30 mm

Cuestiones

¿Qué patologías producen un aumento de la VSG? La VSG se encuentra elevada en prácticamente todos los procesos que cursan con inflamación (enfermedades inflamatorias reumáticas o no, infecciones) y en algunas neoplasias, por lo que es totalmente inespecífica. Se eleva a las 24 h de iniciado el estímulo inflamatorio y no suele normalizarse hasta al cabo de cinco a diez días de su resolución. En general se puede afirmar que cualquier situación que aumente el fibrinógeno puede elevar la velocidad de sedimentación (p. ej., el embarazo, la diabetes, la insuficiencia renal en su fase terminal, la insuficiencia coronaria, las anemias macrocíticas y por supuesto las enfermedades del colágeno y las neoplasias). ¿En qué patologías se producen una disminución de la VSG? Existen diversas situaciones capaces de ocasionar una disminución de la VSG, que incluso puede llegar a ser de 0 mm. Las más importantes son: síndromes de hiperviscosidad, poliglobulias, hábito tabáquico, insuficiencia cardíaca y leucocitosis extrema.

¿De qué factores depende la VSG? La VSG depende de varios factores: ● ● ● ●

Temperatura ambiente. La diferencia de densidad entre hematíes y plasma. Concentración y tamaño de los hematíes. Viscosidad del plasma.

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¿Qué es el potencial zeta? Es la carga eléctrica (-) que rodea a los eritrocitos. El potencial Zeta es el potencial eléctrico que existe en el plano de corte de la partícula, con una distancia corta de la superficie. ¿Por qué no puede utilizarse la heparina como anticoagulante para medir la VSG? La heparina altera el potencial zeta de la membrana y no puede utilizarse como anticoagulante en esta prueba. La heparina, produce una velocidad de sedimentación elevada falsa. ¿Cómo afecta la temperatura a la VSG? Hay que realizarla a temperatura ambiente, ya que a mayor temperatura asciende la VSG y a menor temperatura disminuye.

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Prueba de la resistencia osmótica globular Objetivo de la práctica Cumplir con las normas de seguridad e higiene Realizar pruebas para la determinación de anemias Validar los resultados e interpretarlos Muestra Sangre venosa completa y adecuadamente anticoagulada Precauciones No debe de haber pasado más de 2 horas desde la extracción de la sangre hasta su utilización. En el caso de que la muestra se haya conservado a 4ºC, puede prolongarse ese tiempo a seis horas. Material  Pipetas Pasteur  Tubos de centrífuga iguales entre sí  Un reloj  Una gradilla Aparataje  Una centrífuga Reactivos  Suero fisiológico, preferiblemente, tamponado a pH fisiológico (7,4)  Agua destilada Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

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Desarrollo o procedimiento 1. Preparar una batería de soluciones de cloruro sódico, a concentraciones decrecientes, de la forma que se indica a continuación:

2. Añadir a cada tubo 1 gota (0,05 ml) de sangre completa 3. Dejar los tubos en reposo, al menos 30 minutos, a temperatura ambiente (unos 25ºC) 4. Centrifugar los tubos a 2000 rpm, durante 5 minutos. En vez de centrifugar los tubos, también se pueden dejar simplemente en reposo durante 3 horas. Resultado e interpretación Tras realizar la prueba 3 veces, y cambiar de suero fisiológico, este es el resultado que hemos obtenido. No hemos podido saber si el fallo se encuentra en alguno de los materiales y reactivos que hemos utilizado o simplemente los glóbulos rojos del paciente no son nada resistentes. Cuestiones ¿Qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico? El suero fisiológico contiene un 0.9 % de NaCl ¿Qué es la ROE? La ROE es la resistencia osmótica eritrocitaria ¿En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin que estos se rompan? Normalmente el volumen de un hematíe se puede incrementar en un 70 % como máximo sin que se rompa En condiciones normales, ¿a qué concentración salina suele producirse una hemólisis del 50%? En condiciones normales suele producirse una hemólisis del 50 % a una concentración de 4,5 4 g/L.. ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE? La disminución de la ROE se produce en enfermedades como la esferocitosis hereditaria, Eliptocitosis y estomatocitosis hereditaria. 43

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Determinación de la Bilirrubina Objetivo de la práctica Obtener los niveles de bilirrubina total en sangre Muestra Suero o plasma exentos de hemólisis Precauciones La bilirrubina sérica disminuye en un 50 % después de 1 hora a temperatura ambiente y expuesta a la luz solar. Material  Tubos de ensayo  Micropipetas  Puntas de Micropipeta  Cubeta de espectrofotómetro Aparataje  Centrífuga  Vortex  Espectrofotómetro Reactivos    

Ácido sulfanílico Cafeína Tartrato potásico Nitrito de sodio

Preparación de reactivos Los reactivos ya venían preparados Etiqueta de los reactivos Corrosivo Dibujo

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Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Primero, encendemos el espectrofotómetro. 2. Cogemos 2 tubos y rotulamos uno de ellos con el nombre PR y el otro con el nombre BL. 3. A continuación, añadimos los líquidos correspondientes en los tubos. Primero añadimos 200 ul de Ac. sulfanílico en los dos tubos. A continuación, añadimos 1 gota de Nitrito sódico en el tubo PR y 1 ml de Cafeína en cada tubo. Por último, añadimos 200 ul de muestra en cada tubo. 4. Mezclamos bien y dejamos reposar 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Transcurrido ese tiempo, añadimos 1 ml de Tartrato en cada tubo, y mezclamos y dejamos reposar otros 5 minutos a temperatura ambiente. 6. En ese tiempo ajustamos la longitud de onda correspondiente, que son 578 nm. 7. Transcurridos los 5 minutos, calibramos el espectrofotómetro con el tubo BL y medimos la absorbancia del tubo PR Cálculo PR x 10,8 = mg de Bilirrubina total /dl 0,075 x 10,8 = 0,81 mg de Bilirrubina Valores normales Adultos: hasta 1,1 mg/dl Resultado e interpretación El resultado que he hemos obtenido, 0,81 entra dentro de los valores normales de bilirrubina en sangre. Cuestiones Busca en internet como se hace el metabolismo de la bilirrubina  La membrana de los hematíes se rompe y la hemoglobina contenida dentro de esos hematíes se degrada en globina y grupo hemo.  La globina se descompone en aminoácidos y se reutiliza para formar nuevas proteínas.  El grupo hemo se descompone en hierro ferroso (Fe2+) y en biliverdina.  El Fe2+ se transforma en Fe3+, se une a la transferrina y se transporta a M.O para la formación de nuevos hematíes.  La biliverdina por acción de la biliverdina reductasa se convierte en bilirrubina no conjugada. ¿Qué patologías provocan un aumento de la concentración de bilirrubina en sangre?   

Hepatitis agudas Obstrucción de la vía biliar Cirrosis 45

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Determinación de LDH líquida Objetivo La prueba que permite medir la lactato deshidrogenasa (LDH) es inespecífica pero útil en la evaluación de diversos trastornos y enfermedades. La LDH es una enzima que está presente en prácticamente todas las células del organismo (así como en bacterias) y se libera de estas células hacia la sangre cuando existe lesión o destrucción celular o tisular. Muestra Suero o plasma con heparina como anticoagulante. Utilizar muestras exentas de hemólisis. La enzima en suero es estable durante 2 días a 2-8ºC. Material  Microcubetas  Micropipeta  Tubos de ensayo  Gradilla Aparataje  Espectrofotómetro Normas de seguridad e higiene  Bata  Guantes  Pelo recogido Procedimiento Llevar reactivo de trabajo y el instrumento a la temperatura de trabajo (30ºC/37ºC)

1. 2. 3. 4.

Mezclar y poner en marcha el cronómetro Transferir a la cubeta de lectura y leer las absorbancias después de 1, 2, 3 min. Longitud de onda: 340 nm Blanco: agua

Cálculo U/L=

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Valores normales Adultos (37ºC) 200 - 400 U/L Resultados e interpretación

Cuestiones ¿Qué significan las siglas LDH? Estas siglas significan Lactato Deshidrogenasa ¿Cuándo aumentan sus niveles en sangre? Un nivel superior a lo normal puede ser indicio de:            

Deficiencia de flujo sanguíneo (isquemia) Ataque cardíaco Anemia hemolítica Mononucleosis infecciosa Leucemia o linfoma Enfermedad hepática (por ejemplo, hepatitis) Presión arterial baja Lesión muscular Debilidad muscular y pérdida del tejido muscular (distrofia muscular) Formación anormal de nuevos tejidos (generalmente cáncer. Pancreatitis Accidente cardiovascular

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Prueba de la sacarosa Objetivo de la práctica Cumplir las normas de seguridad e higiene Valorar la resistencia de los hematíes problema sometidos a un medio de baja fuerza iónica (solución sacarosa) Muestra Sangre venosa, completa y anticoagulada con oxalato cálcico, EDTA o ACD (ácido cítricodextrosa). Preparación de la muestra Extracción de sangre en tubo lila con EDTA. Material  Tubos cónicos  Rotulador  Gradilla  Pipeta Pasteur  Pipetas graduadas  Reloj  Cubetas de electroforesis Aparataje  Micropipetas y puntas desechables  Centrífuga  Espectrofotómetro Reactivos  Solución acuosa de sacarosa a una concentración del 9,2%.  Suero fisiológico Preparación de reactivos En nuestro caso solo prepararemos la solución de sacarosa, para ello pesar 9,2 gramos de azúcar común, y disolverlo en 100 ml de agua destilada. El resto de reactivos están preparados Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

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Procedimiento 1. Rotular tres tubos. Uno con las siglas SF (de suero fisiológico) y otro con las siglas SP (sangre problema). 2. Rellenar estos tubos según las indicaciones del cuadro siguiente:

Tubo SF Suero fisiológico (ml)

1.8

Solución en sacarosa (ml) Sangre problema (ml)

Tubo SP

1.8 0.5

0.5

3. Agitar suavemente los tubos. 4. Dejar los tubos en reposo, a temperatura ambiente durante 30 minutos. 5. Centrifugar los tubos a 2.000 rpm durante 5 minutos.

Valores normales Negativo → no hemólisis. Se considera que no hay hemólisis cuando se observa un botón sedimentario rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente. En el tubo SF no tiene que haber hemólisis, ya que este tubo funciona como control negativo.

Resultados e interpretación La lectura de los resultados puede ser visual o espectrofotométrica. En nuestro caso la hemos realizado visual. A la vista de los resultados podemos hablar de negativo, ya que no hay hemólisis aparente en el tubo.

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Cuestiones ¿Qué significa HPN? Investiga en qué condiciones aparece este fenómeno Hemoglubinuria Paroxística Nocturna (HPN). ¿En qué consiste la prueba de Ham Dacie? La prueba de Ham es un examen de sangre para diagnosticar hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). Este raro trastorno hace que los glóbulos rojos mueran antes de lo que debieran. El examen verifica si los glóbulos rojos se vuelven más frágiles cuando se colocan en un ácido suave.

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Unidad 5. Serie Blanca

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Recuento manual de leucocitos Objetivo de la práctica Realizar el recuento de leucocitos (WBC) presentes en un determinado volumen de sangre (generalmente 1 mm3) Cumplir las normas de seguridad e higiene Realizar los cálculos adecuados y validar los resultados Sangre venosa anticoagulada con EDTA

Material        

Una pipeta diluidora de Thoma, para recuento de glóbulos blancos Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora Una cámara de recuento, con un retículo tipo Neubauer mejorado Un cubre Pipeta de toma Tubo de goma con boquilla Cámara de Neubauer Cubreobjetos

Aparataje 

Microscopio óptico

Reactivos  

Líquido de Turck Líquido de dilución. El más utilizado es el líquido de Turck que se compone de las siguientes sustancias: o 2 ml de ácido acético glacial o 1 ml de solución acuosa de violeta de genciana al 1% o 100 ml de agua destilada

Muestra 

Sangre venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA.

Precauciones  



Si el líquido diluyente contiene precipitados, antes de usarlo debe ser filtrado. Para evitar contar repetidamente los mismos leucocitos, sólo se cuentan los que están contenidos dentro del cuadrado y los que están en contacto con sus líneas de demarcación superior a derecha. A la hora de observar los cuadrados, se sigue un orden en “zig-zag”.

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Normas de seguridad   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Situar un cubre sobre el retículo de la cámara. 2. Aspirar la sangre hasta la señal de 0’5 (o hasta el 1, según el caso) 3. En el caso de que se sobrepase algo del enrase, se hace descender la columna de sangre tocando la punta de la pipeta con un algodón. 4. Limpiar cuidadosamente el exterior de la pipeta con un algodón y sin hacer bajar el nivel de sangre. 5. Aspirar líquido diluyente hasta la señal 11. 6. Desenganchar el tubo de goma de la pipeta y homogeneizar el contenido de la ampolla. Para ello se sujeta la pipeta por sus extremos, con los dedos pulgar e índice, y se agita suavemente en sentido horizontal durante 2 o 3 minutos. 7. Desechar las 2 primeras gotas emitidas por la pipeta. 8. Depositar la siguiente gota entre la cámara y el cubre. Esto se realiza ubicándola en uno de los bordes no adheridos del cubre y dejándola que penetre por capilaridad, en el espacio existente entre ambas estructuras. Durante esta operación hay que evitar que se formen burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre. 9. Para ello se coloca la pipeta en posición casi vertical, se sitúa la punta de la pipeta en el borde apropiado, se disminuye algo de presión ejercida por el dedo índice sobre el otro extremo de la pipeta y se retira esta justo antes de que se llene completamente el espacio comprendido entre el cubre y la cámara. 10. Dejar reposar la sangre diluida, contenida en la cámara, durante unos minutos, para que las células presentes en ella puedan sedimentarse 11. Enfocar el retículo con el objetivo de 40x y con el condensador a baja altura. Si los leucocitos se distinguen fácilmente se pueden contar con el objetivo de 10x. 12. Contar los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes de las esquinas.

Valores normales La disminución de WBC se produce en leucopenias y su aumento se da en las leucocitosis. Se considera normal un WBC comprendido entre 5000 y 11000 leucocitos / mm3

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Resultado e interpretación Como se cuentan los leucocitos presentes en 4 cuadrados grandes, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en un cuadrado grande.

Como la sangre previamente al recuento propiamente dicho se diluye, hay que multiplicar el resultado anterior por 10 si se ha partido de 1 o por 20 si se ha partido de 0’5.

WBC = L/4 x 10 x D L: nº de leucocitos contados en los 4 cuadrados grandes D: factor de dilución: 10 (si partimos de 1) o 20 (si partimos de 0’5) El valor final sería nº de leucocitos /mm3

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Tras realizar la práctica hemos contado 138 leucos, presentes en 4 cuadrados grandes, por lo que aplicando la fórmula nos salen un total de 6.900 leucos. La paciente está dentro de los valores normales, ya que estos van de 5.000 a 11.000.

Cuestiones ¿Cuál es el líquido de dilución utilizado en el WBC? El líquido usado en la dilución es el líquido de Turck ¿Para qué sirve el violeta de genciana que contiene el líquido de dilución? El violeta de metilo tiene también la habilidad de conectarse al ADN. Por lo tanto, en ciencias biomédicas, es usado para ensayos de viabilidad celular. ¿Con que objetivo se pueden contar los leucocitos? Los leucocitos son las células sanguíneas que dentro del organismo participan desarrollando diferentes funciones como son: fagocitosis, defensa inmunológica específica o inespecífica. Debido a esto un aumento o una carencia nos puede dar indicios de diferentes enfermedades. Si la sangre se diluye 1/10 y se cuentan 100 leucocitos en 2 cuadrados grandes periféricos, ¿cuál es el WBC obtenido?

WBC= L/2x10xD WBC= 100/2x10x10= 5000 leucos.

Indica 2 patologías en las que se produzcan leucocitosis y otras 2 en las que se produzcan leucopenias La leucocitosis es el aumento en el número de células de glóbulos blancos de la sangre (leucocitos).1 Se dice que hay leucocitosis cuando la cifra de glóbulos blancos es superior a 11 000 por mm³. Distintas patologías asociadas a la leucocitosis pueden ser alteraciones hepáticas obstrucciones intestinales. La leucopenia es un trastorno de la sangre caracterizado por la disminución del número de leucocitos (glóbulos blancos) en la sangre. Algunas de las patologías asociadas a leucopenia son leucemia, lupus, quimioterapia, el tratamiento con radiación y el sida. 55

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Fórmula leucocitaria Objetivo de la práctica Realizar la fórmula leucocitaria o recuento diferencial leucocitario (RDL) consistente en la determinación del porcentaje que representa cada uno de los tipos de leucocitos con respecto al total de ellos. Cumplir con las normas de seguridad e higiene Muestra Sangre venosa anticoagulada con EDTA Material  Portaobjetos Aparataje  Microscopio óptico  Registrador automático de célula Reactivos  

Aceite de inmersión Colorantes panópticos

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Realizar una extensión sanguínea y teñirla con panóptico rápido 2. Preparar el microscopio para que tenga el condensador alto y el diafragma abierto 3. Enfocar la preparación con el objetivo de 10x 4. Comprobar que la preparación es buena y elegir una zona en la que los hematíes no estén superpuestos y los leucocitos se encuentren uniformemente distribuidos (zona ideal de observación) 5. Enfocar esa zona de la preparación con el objetivo de inmersión 6. Observar esa zona de la preparación mientras se describe un recorrido en forma de almenas o de greca 7. Simultáneamente a esto se clasifican y se cuentan los leucocitos que se van encontrando a lo largo de ese recorrido

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Resultados e interpretación Tras realizar el contaje de glóbulos blancos, el resultado obtenido es el siguiente: Basófilos : 0 Cayados :0 Eosinófilos : 6

 6%

Linfocitos : 44  44% Monocitos : 9

 9%

Mielocitos : 0 Segmentados : 40  40% Meta : 1

 1%

Según los valores normales de referencia vemos que tiene los linfocitos, monocitos y eosinófilos levemente elevados, mientras que los neutrófilos segmentados están dentro de los valores considerados normales.

Cuestiones ¿Con qué objetivo se observan los leucocitos cuando se determina una fórmula leucocitaria? Con el objetivo de 100 ¿Cómo se denomina el aumento de monocitos? Monocitosis

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3. Completa el siguiente cuadro:

Valor normal

% Normal

Neutrófilos segmentados

1,4-6,34 x 109/L

40-60 %

Neutrófilos en cayados

0-0,45 x 109/L

0-3 %

Eosinófilos

0-0,54 x 109/L

1-4 %

Basófilos

0-0,18 x 109/L

0-3 %

Monocitos

0,14-0,72 x 109/L

2-8 %

Linfocitos

0,71-4,53 x 109/L

20-40 %

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Detección de crioglobulinas Objetivo de la práctica Detectar la presencia de crioglobulinas en una muestra Muestra Suero transparente obtenido de sangre coagulada completamente a temperatura corporal, y separado del coágulo en un ambiente cálido Material   

Pipeta Pasteur Tubo de ensayo Gradilla

Aparataje  

Nevera Microcentrífuga

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Depositar el suero problema en un tubo de ensayo 2. Colocar el tubo que contiene el suero problema en una nevera, a una temperatura de entre los 4° C y loa 6° C 3. Examinar el tubo a los 30 minutos y después cada día durante 6 días

Valores normales ASPECTO DEL SUERO

GRADO DE POSITIVIDAD

Discretamente turbio

Francamente turbio

Lechoso

+++

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Resultados e interpretación

Como puede observarse, el resultado fue negativo.

Cuestiones ¿En qué patologías aumentan las crioglobulinas? Pueden aumentar en:  Hepatitis  Mononucleosis infecciosa  Leucemia  Linfoma  Mieloma múltiple  Artritis reumatoide  LES Si el precipitado no se reabsorbe con el calor, ¿de qué sustancia está formado? De restos de fibrina. Si se diese el caso de que sí se reabsorbiera, se estimaría de crioglobulinas precipitadas Indica los principales tipos de crioglobulinas y sus características.   

Tipo I Tipo II Tipo III

La crioglobulinemia tipo I está relacionada con el cáncer de sangre o del sistema inmune. En cambio, los tipos II y III se encuentran en personas que tienen una afección inflamatoria crónica prolongada, como una enfermedad autoinmunitaria o hepatitis C.

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Unidad 6. Serie plaquetar. Hemostasia

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Determinación de grupo sanguíneo AB0 y Rh en porta Objetivo de la práctica Determinar el grupo sanguíneo del sistema AB0 mediante la búsqueda de Ag Determinar el grupo Rh mediante búsqueda de Ag Observar la aglutinación en portaobjetos Muestra Sangre anticoagulada con EDTA Material  Portaobjetos  Rotulador  Pipeta Pasteur Reactivos  Anti A  Anti B  Anti D Normas de seguridad e higiene     

Bata Guantes Pelo recogido Atemperar los reactivos Esperar 2 minutos para comprobar posibles reacciones débiles

Desarrollo o procedimiento 1. Depositar una gota de cada uno de los sueros Anti A, Anti B y Anti D en el portaobjetos, de izquierda a derecha 2. Situar una pequeña gota de la sangre problema junto a cada una de las gotas de los reactivos anteriores 3. Mezclar las gotas utilizando las diferentes esquinas de un porta 4. Hacer oscilar el portaobjetos suavemente hacia delante, hacia atrás y en círculo durante 2 minutos 5. Observar la presencia o ausencia de aglutinación Resultados e interpretación Tras la realización de la prueba. hemos podido observar aglutinación en las gotas de sangre donde habíamos añadido Anti A y Anti D, por lo que podemos decir, que el paciente es A+

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Cuestiones Si al realizar la prueba el resultado obtenido es: Anti A

Anti B

Anti D

Resultado

Aglutina

No aglutina

AB -

Si fuese el grupo sanguíneo de un donante, ¿a qué personas podría donar? Razona la respuesta Puede donar a AB+ y AB-. El grupo sanguíneo A no tiene antígeno B por lo que no puede recibir de AB y el grupo sanguíneo B no tiene antígeno A por lo que tampoco puede recibir de AB. EL grupo 0 no tiene ni antígeno A ni B por lo que tampoco puede recibir su sangre. Y si fuese un receptor ¿qué personas le podrían donar sangre a él? Razona la respuesta Podrían donarle los grupos sanguíneos A-, 0-, B- y AB-. Porque el AB- tiene antígeno A y antígeno B, y además como es Rh - puede donarle todo grupo sanguíneo que sea negativo. ¿Qué es un antígeno? Sustancia que al introducirse en el organismo induce una respuesta inmunitaria, provocando la formación de anticuerpos ¿Qué es un anticuerpo? Sustancia segregada por los linfocitos de la sangre para combatir una infección de virus o bacterias que afecta al organismo. ¿En qué consiste la reacción de aglutinación? Consiste en la reacción que se da tras la unión de Antígeno y Anticuerpo Una persona A- ¿qué antígenos y qué anticuerpos presenta? Antígenos: A Anticuerpos: B y D Una persona 0+ ¿qué antígenos y qué anticuerpos presenta? Antígenos: D Anticuerpos: A y B ¿Quién es el donante universal? ¿Por qué? El donante universal es el 0 -, porque no posee ningún anticuerpo Anti-A, ni Anti-B ni Anti-D ¿Quién es el receptor universal? ¿Porqué? El receptor universal es el AB+, porque no presenta ni antígeno A, ni antígeno B, ni antígeno D en sus eritrocitos.

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Determinación de grupo sanguíneo AB0 y Rh en tubo Objetivo de la práctica Determinar el grupo sanguíneo del sistema AB0 Determinar el grupo Rh Observar la aglutinación en tubo Muestra Sangre anticoagulada con EDTA Material  Tubos cónicos  Rotulador  Pipeta Pasteur  Puntas de micropipeta Aparataje  Centrífuga  Micropipetas Reactivos    

Anti A Anti B Anti D NaCl al 0,9% o suero fisiológico

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento

PROCEDIMIENTO 1: LAVADO DE HEMATÍES 1. 2. 3. 4. 5.

Poner en un tubo de hemólisis 2 gotas de sangre problema Añadir 2 ml de suero fisiológico y agitar bien Centrifugar 5 minutos a 2500 rpm Decantar el sobrenadante Repetir los 3 pasos anteriores dos veces más

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PROCEDIMIENTO 2: REALIZACIÓN DE LA DILUCIÓN DE HEMATÍES AL 5% 1. Del sedimento de hematíes obtenido del último lavado y centrifugación, coger con una micropipeta 0,1 ml de hematíes y depositarlas en un tubo 2. Añadir 1,9 ml de suero fisiológico PROCEDIMIENTO 3: DETERMINACIÓN DE GRUPO AB0 Y Rh 1. Rotular 3 tubos con A, B y D 2. Depositar en cada uno de ellos dos o tres gotas de la dilución de hematíes al 5% 3. Depositar en el tubo correspondiente dos o tres gotas de cada uno de los sueros Anti A, Anti B y Anti D 4. Agitar cada uno de los tubos para que se mezclen bien los reactivos con lo hematíes 5. Centrifugar los 3 tubos a 1000 rpm durante 1 minuto 6. Resuspender el sedimento de hematíes dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo 7. Observar la presencia o ausencia de aglutinación Resultado e interpretación

Tras la centrifugación y haber resuspendido el sedimento de hematíes hemos observado aglutinación en el tubo donde hemos añadido Anti A, por lo que el paciente es del grupo sanguíneo A -.

Cuestiones ¿Por qué es necesario realizar previamente un lavado de hematíes? Es necesario realizar el lavado de hematíes para evitar interferencias que puedan causar falsos positivos. Si no dispusieras de suero fisiológico preparado en el laboratorio, ¿cómo prepararías 100 ml? Conocemos la concentración y peso molecular del NaCl y el volumen que deseamos preparar por lo que calculamos: []=5M Pm NaCl = 58,5 V= 100 ml = 0,1L g / PM M= -------------V

g / 58,5 → 5 = -------------- ; g = 29,25 g de NaCl 0,1

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Si en lugar de 2 ml de hematíes diluidos al 5% necesitarás 3 ml, ¿qué cantidad de hematíes lavados y de cloruro sódico tendrías que coger? 2 mL ----------------------- 0,1 ml hematíes = 0,15 ml hematíes 3 mL ------------------------

2 mL -------------------- 1,9 ml NaCl = 2,85 ml NaCl 3 mL ---------------------- X

Si al realizar la prueba el resultado obtenido fuera el siguiente, ¿a qué personas podría donar?

Anti A

Anti B

Anti D

Resultado

No aglutina

Aglutina

No aglutina

B-

Podría donar a los grupos sanguíneos B +, B -, AB + y AB –

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Determinación del grupo sanguíneo. Método indirecto en tubo Objetivo de la práctica Determinar el grupo sérico del sistema AB0 Determinar anticuerpos dirigidos contra los antígenos del sistema AB0 presentes en el suero Observar la aglutinación en tubo Muestra Suero problema Material  Tubos cónicos  Rotulador  Gradilla  Pipeta Pasteur Aparataje  Centrífuga  Micropipetas y puntas Reactivos    

Hematíes del grupo A Hematíes del grupo B Hematíes procedentes de la sangre problema para control negativo © NaCl al 0,9% o suero fisiológico

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento 1. Seleccionar dos muestras de sangre pertenecientes a los grupos A y B 2. Identificar dos tubos con las letras A y B, poner en los tubos de hemólisis 2 gotas de cada una de las muestras A y B. 3. Añadir 2 ml de suero fisiológico en cada tubo A y B, y agitar bien. 4. Centrifugar 5 minutos a 2500 rpm 5. Decantar el sobrenadante 6. Repetir los tres pasos anteriores dos veces más. 7. Después del último lavado coger con una micropipeta 0,1 ml del sedimento de hematíes de cada uno de los tubos A y B y depositarlos en dos tubos identificados como A y B. 8. Añadir a cada uno de los tubos 1,9 ml de suero fisiológico (se pueden mantener en la nevera hasta su utilización tapados con parafilm, se mantienen estables 3 o 4 días)

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Cuestiones 1. Si al realizar la prueba el resultado obtenido es:

Tubo A

Tubo B

Anti D

Resultado

No aglutina

Aglutina

No aglutina

B-

¿Qué pensarías? Habrá anticuerpos contra el antígeno B

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Coombs directo en tubo Objetivo de la práctica Determinar si existen o no anticuerpos irregulares fijados en la membrana de los hematíes del paciente, enfrentando estos a la antiglobulina humana o reactivo de Coombs específico para ello. Muestra Sangre anticoagulada con EDTA Material  Tubos de ensayo  Gradilla  Pipeta Pasteur  Puntas de micropipeta Aparataje  Centrífuga  Micropipeta Reactivos  

Antiglobulina humana (AGH) Suero fisiológico

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo o procedimiento PROCEDIMIENTO 1: LAVADO DE HEMATÍES 1. 2. 3. 4. 5.

Pones en un tubo de hemólisis 2 gotas de sangre problema Añadir 2 ml de suero fisiológico y agitar bien Centrifugar 5 minutos a 2500 rpm Decantar el sobrenadante Repetir los 3 pasos anteriores dos veces más PROCEDIMIENTO 2: REALIZACIÓN DE LA DILUCIÓN DE HEMATÍES AL 5%

1. Del sedimento de hematíes obtenido del último lavado y centrifugación, coger con una micropipeta 0,1 ml de hematíes y depositarlas en un tubo 2. Añadir 1,9 ml de suero fisiológico

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PROCEDIMIENTO 3: DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES EN TUBO 1. Depositar 1 o 2 gotas de AGH en un tubo 2. Depositar una pequeña gota de la suspensión de hematíes de la muestra problema junto a la gota de AGH en el tubo 3. Mezclar ambas gotas 4. Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto 5. Resuspender el sedimento de hematíes dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo 6. Observar la presencia o ausencia de aglutinación Resultado e interpretación

COOMBS NEGATIVO

El resultado a la aglutinación ha sido negativo, por lo que eso quiere decir que no hay anticuerpos irregulares en la membrana de los hematíes. Cuestiones 1. ¿Qué es la antiglobulina humana? Es una mezcla de anti-IgG humana policlonal y C3d monoclonal 2. Si realizaras la prueba a una persona recién transfundida y el resultado es +, ¿qué pensarías? Que el receptor tiene Ac irregulares frente a la sangre del donante 3. ¿Qué son los anticuerpos irregulares? Son anticuerpos anti glóbulos rojos. 4. Si al realizar la prueba a un bebé ésta resulta positiva, diríamos que el bebé tiene eritroblastosis fetal. ¿Qué significa esto? Que el feto tiene una anemia hemolítica debido a que la madre a través de la placenta le ha transferido anticuerpos contra sus propios glóbulos rojos.

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Coombs indirecto Objetivo de la práctica Investigar la presencia de anticuerpos irregulares en el suero del paciente Muestra Sangre anticoagulada con EDTA Material  Tubos de ensayo  Gradilla  Pipeta Pasteur  Puntas de micropipeta Aparataje  Centrífuga  Termobloque  Micropipetas Reactivos  

Antiglobulina humana (AGH) Suero fisiológico

Normas de seguridad e higiene   

Bata Guantes Pelo recogido

Desarrollo y procedimiento 1. Preparar una suspensión de hematíes test (0+) en disolución salina (realizar 3 lavados) 2. Colocar en un tubo de hemólisis rotulado dos gotas de hematíes lavados y dos gotas de suero del paciente 3. Mezclar e incubar a 37º durante 30 minutos 4. Lavar 3 veces la mezcla con disolución salina 5. Tras el último lavado decantar el sobrenadante y añadir una gota de AGH 6. Mezclar y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto 7. Agitar el tubo y examinar la presencia o ausencia de aglutinación

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Resultado e interpretación

NEGATIVO

El resultado a la aglutinación ha sido negativo, por lo que eso quiere decir que no hay anticuerpos irregulares en el suero del paciente.

Cuestiones 1. ¿Qué ocurre en el caso de que aparezca aglutinación? Que hay anticuerpos que actúan contra los glóbulos rojos del paciente

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Prueba cruzada de urgencia Objetivo Asegurarnos de que los hematíes del donante son compatibles con el paciente. Muestra Sangre anticoagulada con EDTA. Preparación de la muestra PROCEDIMIENTO 1: LAVADO DE HEMATÍES 1. 2. 3. 4. 5.

Material  Tubos cónicos  Rotulador  Gradilla  Pipeta Pasteur Aparataje  Centrífuga  Baño maría  Micropipetas y puntas de plástico desechables Reactivos  Antiglobulina Humana (AGH)  Suero fisiológico Normas de seguridad   

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Desarrollo o procedimiento 1. Preparar una suspensión de hematíes del donante de forma semejante a la descrita anteriormente. 2. Mezclar en un tubo de hemólisis rotulado una gota de los hematíes del donante con dos gotas del suero del receptor. 3. Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto y leer. 4. Incubar a 37ºC durante 15 minutos. 5. Lavar la mezcla 3 veces con disolución salina. 6. Tras el último lavado decantar el sobrenadante y añadir dos gotas de AGH. 7. Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. 73

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8. Observar la ausencia o presencia de aglutinación. Valores normales Ausencia de aglutinación.

Resultado e interpretación

Tras la realización de la práctica y analizando el resultado, como se puede observar en la foto, no hay aglutinación, esto nos indica que nos hay anticuerpos contra las células del paciente. Son compatibles.

Cuestiones 1. ¿Cuándo se realiza esta prueba? La prueba cruzada es necesaria para asegurar la compatibilidad de la sangre antes de una transfusión. Generalmente esta prueba se pide cuando su médico o cirujano quiere tener sangre reservada como precaución ante una cirugía mayor, o bien está previsto que se necesite una transfusión. Se trata de mezclar la sangre del paciente con la sangre que se va a transfundir para ver si hay alguna incompatibilidad

2. ¿Porque crees que la incubación se realiza a 37ºC y no a temperatura ambiente? Se incuba a 37ºC ya que la reacción antígeno-anticuerpo se acelera con la temperatura. .