UNIVERSIDAD VERACRUZANA
UNIDAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
FACULTAD DE BIOANÁLISIS CAMPUS XALAPA
E.E. Inmunología Básica
Manual de Prácticas de Laboratorio
Académica: Héctor Escobar Henrriquez
Xalapa, Ver., Enero 2012
UNIVERSIDAD VERACRUZANA UNIDAD DE CIENCIAS DE LA SALUD FACULTAD DE BIOANÁLISIS LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA PRÁCTICA No. 1
“SANGRADO DE CONTROL” OBJETIVO: Obtener un suero control a partir de la sangre del conejo extraída del corazón.
FUNDAMENTO: Los animales de laboratorio utilizados en la practica deben ser sangrados antes del protocolo de inmunización para contar con el suero testigo, el cual servirá posteriormente en la practica para detectar la producción de anticuerpos al compararlo con el suero extraído después de haber concluido el esquema de inmunización, Los sitios más comunes para la obtención de muestras de estos animales es la punción capilar y la punción venosa la cual puede llevarse a cabo en la vena marginal de la oreja o por punción cardiaca.
MATERIAL: Jeringa Desechable de 20 ml. Agujas de 21x32 Torundas con alcohol Tubos de ensaye Centrifuga
TECNICA: a)
VENA MARGINAL DE LA OREJA.
1. Mantener inmóvil al animal de frente al operador. 2. Rasurar la oreja y frotar bruscamente con una torunda con alcohol 3. Hacer un corte pequeño longitudinal en la vena de la oreja con una hoja de afeitar o una lanceta. 4. Recoger la sangre en un tubo de ensaye (por medio de esta técnica so obtiene hasta 5 ml.).
b)
PUNCION CARDIACA.
1. 2. 3. 4.
Descansar al conejo con el pecho hacia arriba. Localizar el esternon y cortar el pelo que lo cubre. Localizar la zona de pulsación máxima y desinfectar. Insertar la aguja a través del espacio intercostal avanzando en línea recta hacia el hombro derecho, empujando suavemente hasta que el latido del corazón se sienta contra la punta de la aguja, entonces se da un pinchazo fuerte hacia delante para que entre al corazón. 5. recoger la sangre en un tubo de ensaye (20 ml.)
NOTA: Evitar los movimientos de la aguja dentro de la cavidad pericárdica ya que tiene peligro de desgarrar el corazón y causar la muerte inmediata. c. PARA LA OBTENCION DEL SUERO. 1. 2. 3. 4.
Esperar que se coagule la sangre. Remover el coagulo Centrifugar 5 min. A 3500 rpm. Separar el suero y agregarle a cada tubo 1 ml. De merthiolate blanco para su conservación.
NOTA: Se deben de tomar las precauciones necesarias para evitar la hemólisis. Un suero bemolizado no sirve para las prácticas posteriores.
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“PREPARACIÒN DE ANTÌGENOS PARA INMUNIZACIÒN Y ESQUEMAS DE INOCULACIÓN” OBJETIVOS: Preparar antígenos (solubles y particulados) para la inmunización. Diseñar los esquemas de inoculación para cada uno de los diferentes antígenos.
FUNDAMENTO: Cuando se desea obtener suero inmune experimentalmente deben de tomarse en consideración las características del antígeno: Cuando se inoculan antígenos particulados se obtienen sueros aglutinantes. Cuando se inoculan antígenos solubles se obtienen sueros precipitantes.
MATERIAL Y EQUIPO: Frascos pequeños vacíos y limpios. Material de venopunción. Tubos d ensaye de 13x100 mm. Centrifuga. Pipetas Pasteur con bulbo. Pipetas graduadas. Solución salina fisiológica.
MATERIAL BIÓLOGICO: Eritrocitos tipo A y B. Suero Plasma.
TECNICAS: 1. Antígenos particulados (eritrocitos) Se inmunizarán conejos con suspensiones al 50% de eritrocitos lavados por centrifugación con solución salina isotónica de acuerdo al siguiente protocolo.(tipo sanguíneo Ay B).
INYECCIÓN 1 2 3 4 5 SANGRADO
TIEMPO Día 0 Día 4 Día 8 Día 12 Día 16 Día 20
DOSIS 1.0. ml. 1.0. m 1.0. m 1.0. m 1.0. m
VIA DE INOC. I.V. I.V. I.V. I.V. I.V.
2. Antígenos solubles. a) Suero Humano. Se inoculará al conejo con suero Humano de acuerdo al siguiente protocolo de inmunización INYECCIÓN 1 2 3 4 SANGRADO
TIEMPO Día 0 Día 3 Día 6 Día 9 Día 14
DOSIS 0.5 ml. 1.0. ml. 1.5 ml. 2.0 ml.
VIA DE INOC. I.V. I.V. I.V. I.V.
b) Plasma Humano. Prepara una dilución 1:2 del plasma en solución salina. Este antígeno es inoculado con aceite mineral de acuerdo al siguiente protocolo de inmunización. INYECCIÓN 1 2
TIEMPO Día 0 Día 6
DOSIS 2.0 ml. 3.0 ml.
3 SANGRADO
Día 13 Día 19
2.0 ml.
VIA DE INOC. I.M 1 ml. En cada pierna I.D. 1 ml. Por 3 veces a lo largo de la columna I.M. 1 ml. En cada pierna
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FAGOCITOSIS DE ESTAFILOCOCOS OPSONIZADOS Objetivo: Estimular a las células fagocitarias para que ingieran estafilococos opsonizados con suero inmune. Fundamento: La fagocitosis se ve incrementada por la acción opsonizante de los anticuerpos específicos.
Material Biológico: 10 ml. De sangre obtenida con citrato de sodio 20 ml. De suspensión de estafilococos aureus. 3 a 5 ml. De suero humano.
Técnica. 1. Recoger 10 ml. De sangre con citrato de sodio (2 ml. Por cada 8 ml. De sangre). Homogeneizar la mezcla. 2. Vaciar la sangre a tubos siliconizados o mantenerla en la jeringa en posición vertical e incubarla 30 mn. A 37C. 3. Separar el plasma rico en leucocitos y recibirlo en un tubo de ensaye siliconizado, centrifugar a 500 rpm/3 min. Y descartar el sobrenadante. 4. Resuspender el sedimento celular en 5 ml. De solución de Hanks. 5. colocar en un tubo de ensaye 2 ml. De la suspensión de estafilococos y agregar 2 ml. De suero humano o suero inmune obtenido en conejos, e incubar a 37C durante 30 min. 6. En un tubo de ensaye siliconizado mezclar 0.2 ml. Del sedimento celular resuspendido y 0.2 ml. De la suspensión de estafilococos opsonizados. 7. Incubar en baño maría a 37durante 30 a 60 min. 8. Transferir gotas a los extremos de varios portaobjetos, preparar frotis y teñir con colorante de Wrigth. Examinar con aceite de inmersión y observar las bacterias ingeridas por los polimorfonucleares. 9. Reportar las observaciones.
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FAGOCITOSIS DE CANDIDA ALBICANS Objetivo: Demostrar la capacidad fagocítica y microbicida de los polimorfonucleares, utilizando Candida albicans como antígeno. Fundamento: Los microorganismos opsonizados incrementan la acción fagocitaria de los polimorfonucleares.
Material Biológico: 10 ml. De sangre desfibrinada. 5 ml. De suero. Suspensión de Candida albicans (aprox. 5 millones por ml.)
Técnica: 1. Obtener 10 ml. De sangre y pasarla a un matraz con perlas de vidrio (estéril), tapando y sujetando. 2. Al iniciar la coagulación agitar 20 veces fuertemente, extrayendo la sangre desfibrinada con una pipeta Pasteur y colocándola en un tubo de ensaye. 3. Depositar dos gotas de sangre desfibrinada sobre dos portaobjetos respectivamente e incubar en cámara húmeda a 37C por 30 minutos. 4. Centrifugar el resto de la sangre a 1000 rpm/10 minutos. 5. Separar el suero y agregar 2 ml. De la suspensión de candida albicans. 6. Tirar el excedente de los portaobjetos incubados y sin dejar secar, enjuagar a goteo suave y constante con solución de Hanks a 37C. 7. Sin dejar secar las preparaciones, cubrirlas con 12 gotas de suero con Candida albicans e incubar a 37C por 30 min. En cámara húmeda. 8. Secar al aire y teñir los portaobjetos con colorante de Wrigth. 9. Observar al microscopio y contar el número promedio de Candida albicans fagocitadas por los polimorfonucleares.
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“IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS INMUNITARIAS EN EXTENDIDO SANGUÍNEO” OBJETIVO: a) Cuantificar el total de células inmunitarias en una muestra de sangre b) B) Identificar los diferentes tipos de células inmunitarias en un extendido sanguíneo, de un total de 100.
MATERIAL: Biológico: de 2 a 3 ml. de sangre con anticoagulante. De laboratorio: 7 tubos de ensaye de 13x100 2 pipetas Pasteur con bulbo 1 pipeta para leucocitos 1 cámara de Newbauer 7 portaobjetos 1 microscopio agitador electrico. Reactivos: Aceite de inmersión Diluyente de Turk Colorante para tinción de Wrigth.
TÉCNICA: 1. Extraer de 2 a 3 ml. de sangre con anticoagulante 2. Aspirar sangre con la pipeta de leucocitos hasta la marca de 0.5 y llenar con diluyente de Turk. 3. Poner la pipeta en el agitador de pipetas por un minuto. 4. Desechar lasa primeras 3 gotas y llenar la cámara de newbauer y contar. 5. Leer con objetivo seco fuerte 40x a) b) c) d)
Hacer un frotis con la sangre extraida. Teñirlo con colorante de wrigth según la técnica. Observar al microscopio con objetivo de inmersión Identificar las células inmunitarias y contar 100 células haciendo la diferenciación de cada una de ellas. e) Reportar de un total de 100 células contadas cuantas corresponden a cada tipo.
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“HEMOLISIS RADIAL SIMPLE” Objetivo: Demostrar la actividad lítica del complemento. Fundamento: Si en un pozo horadado en una placa de gel-EA se coloca complemento activo, se desarrolla alrededor de el una zona de hemólisis, cuyo tamaño es proporcional a la cantidad de complemento en el pozo.
Material Biológico:
1 ml. de suero Humano o de cobayo 1 ml. de eritrocitos tipo “O” Rh positivos. Suero anti-RH comercial.
Técnica: 1. Preparar una solución de agar al 1% con buffer PO4 salina 0.15 M pH 7.2, hervir hasta disolución total del agar, reponiendo el volumen de agua evaporada con solución buffer. Añadir 1 ml. de merthiolate al 1%. 2. Dejar enfriar entre 50-55ºC. 3. En una caja petri chica colocar 0.5 ml. de eritrocitos sensibilizados preparados de la siguiente manera: En un tubo de hemólisis poner 0.2 ml. de eritrocitos O RH positivos, 0.8 ml. de solución salina y 0.2 ml. de suero anti-Rh, Incubar a 37ºC/30 min. Y posteriormente lavar 3 veces con solución salina y resuspender el sedimento en i ml. de buffer. 4. Aplicar rápidamente 4 ml. de agar mezclándolo suavemente con la suspensión de eritrocitos sensibilizados hasta obtener una capa homogénea. Mantener caliente la pipeta para evitar que se gelifique el agar. 5. Dejar gelificar el agar a temperatura ambiente. 6. Hacer diluciones dobles del suero con buffer 1:2, 1:4, 1:8. 7. Llenar cada pozo con un volumen medido exactamente de las diferentes diluciones de suero siguiendo el esquema. 8. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente/24-48 hrs. 9. Medir los halos de hemólisis formados.
Esquema Utilizado: Pozo 1 suero sin diluir. Pozo 2 dilución 1:2 Pozo 3 dilución 1:4 Pozo 4 dilución 1:8
Pozo 1 Pozo 4
Pozo 2
Pozo 3
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“HEMOLISIS POR COMPLEMENTO” Fundamento: la activación del complemento por la vía clásica se inicia por la presencia de complejos Ag-Ac en solución o sobre la superficie de una célula.
Objetivo:
Demostrar la inestabilidad del complemento. Activar el complemento por la vía clásica para producir lisis de los eritrocitos.
Material:
Suspensión de eritrocitos al 5% tipo A. Suspensión de eritrocitos al 5% tipo B Suero Humano Plasma Humano
Técnica: 1. Recoger sangre de los tipos A y B en tubos de ensaye con anticoagulante y homogeneizar la mezcla por inversión. Utilizar 0.1 ml. de EDTA al 10% por cada 5 ml. de sangre. 2. Recoger sangre de cualquier tipo en dos tubos de ensaye; uno con anticoagulante y otro sin anticoagulante para obtener plasma y suero respectivamente. 3. Preparar una suspensión al 5% de eritrocitos A y B en solución salina al 0.85%. 4. Tomar 0.5 ml. de suero y calentar a 63ºC por 3 min. 5. Preparar una dilución 1:10 del suero restante con un volumen final de 2 ml. y agitar violentamente durante 10 a 15 min. 6. Marcar 4 series de 2 tubos de la siguiente manera: A1B1, A2B2, A3B3 y A4B4 TUBOS A1 B1 A2 B2 A3 B3 A4 B4 0.2 ml. 0.2 ml. 0.2 ml. Eritrocitos A 0.2 ml 0.2 ml. 0.2 ml. 0.2 ml. 0.2 ml Eritrocitos B 0.2 ml. 0.2 ml. Suero calentado 0.2 ml. 0.2 ml. Suero Agitado 0.2 ml. 0.2 ml. Suero 0.2 ml. 0.2 ml plasma Mezclar e incubar a 37ºC/30 min.
7. Centrifugar tofdos los tubos a 2500 rpm/1 min. 8. Observar si existe aglutinación y/o hemólisis. 9. Anotar los resultados y las observaciones. 10. Discusión de los resultados.
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“OBTENCIÓN DE SUEROS INMUNES EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN” OBJETIVO: Obtener sueros con alto contenido de anticuerpos de animales previamente inmunizados. FUNDAMENTO: Los anticuerpos de un suero inmune reaccionarán con su antígeno especifico, formando una red de moléculas que puede ser visualizada en forma de precipitado o aglutinado.
MATERIAL BIÓLOGICO: Suero de conejo previamente inmunizado. Solución antigénica correspondiente.
TECNICA: 1. Sangrar al conejo por punción cardiaca (ver practica de sangrado de control), obtener 20 ml. De sangre . Dejar coagular. 2. Remover el coagulo con un aplicador, centrifugar y transferir el suero a tubos de ensaye. Adicionar merthiolate. 3. Efectuar diluciones dobles del antígeno a partir de la dilución 1:8 hasta la dilución 1:32. 4. Numerar 4 tubos de ensaye y colocar en los 3 primeros una gota del suero del conejo inmunizado y en el cuarto colocar una gota de suero control de conejo. 5. Añadir a cada tubo una gota de las diferentes diluciones antigénicas, mezclar e incubar a 37°C/30 min. 6. Observar cada 5 min. Si en alguno de los tubos se forma un precipitado blanco o un aglutinado de particulas.
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“PRECIPITACIÓN EN MEDIOS LÍQUIDOS” (MÉTODO DEL ANILLO)
OBJETIVO:
Aplicar una reacción de precipitación para identificar antígenos proteicos.
FUNDAMENTO:
El método se basa en la reacción interfasica que se produce cuando en un pequeño tubo se colocan sucesivamente, y evitado que se mezclen, las soluciones de antígenos y anticuerpos que se corresponde.
MATERIAL BIOLÓGICO:
Suero precipitante clarificado por centrifugación solución antigénica correspondiente
TÉCNICA: 1. antes de la prueba, el antisuero y la solución antigénica deben centrifugarse a 3500 rpm/3 min. Para remover cualquier partícula. 2. Colocar en una serie de tubos de hemólisis 0.2 ml. del suero precipitante (5tubos). 3. En una serie separada de tubos de ensaye preparar diluciones 1:10, 1:50, 1:100, 1:150 y 1:200 del antígeno. 4. Con una pipeta añadir por las paredes 0.2 ml. de cada dilución a los tubos que contienen el suero evitando que se mezclen. 5. Llevar a baño de agua a 37ºC y observar a los 15,30 y 60 min., si en alguno de ellos aparece un precipitado anular blanco. En caso de no presentarse esta reacción, dejar los tubos en refrigeración toda la noche y observar de nuevo. 6. Preparar al mismo tiempo un tubo control negativo con el suero del conejo obtenido antes de la inmunización.
RESULTADOS:
POSITIVO: Formación de precipitado blanco anular en la interfase que gradualmente se va ensanchando y aumenta de intensidad. NEGATIVO: No hay formación de precipitado en la interfase.
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“DIFUSION SIMPLE EN TUBO MÉTODO DE OUDIN” OBJETIVO: Aplicar un método de Inmunodifusión para identificar un Ag prsente en una mezcla de los mismos.
FUNDAMENTO: Si se coloca un Ag sobre una capa de agar-Ac específico se formarán bandas en el agar como consecuencia de la precipitación que tiene lugar conforme el Ag va difundiendo hacia la capa de gel, a medida que la concentración de este aumenta se produce la reacción Ag-Ac, formando diferentes bandas de precipitación dependiendo de los diferentes Ags que se hayan puesto en la mezcla.
MATERIAL: A) Biológico Antisuero precipitante de conejo Suero control de conejo Antígenos solubles a estudiar
TÉCNICA 1. Marcar dos tubos de hemólisis como 1 y 2 2. En el tubo No. 1 mezclar 0.5 ml. De agar al 1% y enfriado a 50°C y 0.3 ml de antisuero precipitante. Las pipetas y los tubos utilizados deben mantenerse tibios y efectuar la operación rápidamente. Dejar enfriar para que gelifique. 3. En el tubo No. 2 mezclar el agar de la misma manera con 0.2 ml. De suero control de conejo o con sol. Salina. Este es el tubo control negativo. 4. Preparar una mezcla con los antígenos solubles y dejar escurrir 0.5 ml. So nre la superficie del agar en ambos tubos. 5. tapar los tubos con papel parafilm para evitar evaporaciones y dejarlos a temperatura ambiente durante 24-48 hrs. Observar y anotar los resultados
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INMUNODIFUSIÓN RADIAL OBJETIVO: Identificar antígenos solubles utilizando un método de Inmunodifusión . FUNDAMENTO Se basa en el principio de que existe una relación cuantitativa entre la cantidad de antígeno colocado en un pozo horadado sobre la plazca de agar-anticuerpo y el anillo resultante de precipitación. MATERIAL BIOLÓGICO: Solución de antígeno soluble Antisuero precipitante homólogo.
TECNICA: 1. En un vaso de 250 ml. Colocar 1 gr. De agar y agregar 100 ml. De solución buffer PO4 salina 0.15 M pH 7.2, hervir hasta disolución total del agar. El volumen de agua evaporada se repone con solución buffer. Añadir 1 ml. De merthiolate al 1%. 2. En una caja de petri chica colocar 0.5 ml. De Antisuero distribuyéndolo homogéneamente en el fondo. 3. Aplicar rápidamente 4 ml. De agar mezclándolo con el Antisuero con movimientos circulares suaves hasta obtener una capa homogénea. Mantener caliente la pipeta para evitar que se gelifique el agar en la misma. 4. Dejar melificar el agar a temperatura ambiente. 5. Hacer 4 perforaciones equidistantes de un diámetro de 3 mm. Removiendo el agar residual con un aplicador. 6. Hacer diluciones del antígeno al doble con solución buffer PO4 salina o.15 M pH 7.2-7.6, 1:2, 1:4 y 1:8. 7. Llenar cada pozo con volumen medido exactamente de las diluciones de antígeno de diferente concentración, colocando en el restante el antígeno sin diluir. 8. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 24-48 horas. 9. Medir los diámetros de los halos de precipitación obtenidos.
Esquema utilizado:
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“DOBLE INMUNODIFUSIÓN (MÉTODO DE OUCHTERLONY)” OBJETIVO: a) Realizar un análisis semicuantitativo de un antígeno soluble b) Identificar una reacción de identidad de una de no identidad.
FUNDAMENTO: Cuando un antígeno y un anticuerpo se introducen en un medio semisólido en puntos diferentes y al encontrarse en proporciones óptimas forman precipitados. MATERIAL:
Suero Control de conejo Antígenos solubles a estudiar. Antisuero precipitante de conejo. Solución salina. Tubos de ensaye. Gradilla Pipetas.
TÉCNICA: 1. En un vaso de 250 ml. colocar 1 gr. De agar y agregar 100 ml. de solución buffer PO4 salina 0.15 M pH 7.2 , hervir hasta disolución total del agar. El volumen de agua evaporada se repone con solución buffer. Añadir 1 ml. de merthiolate al 1%. 2. Verter el agar en la caja de petri hasta formar una capa de 5 ml. de espesor. Dejar solidificar y confeccionar los orificios de 5 mm. De diámetro . 3. Las perforaciones en el gel se hacen siguiendo los esquemas indicados y el agar residual se remueve con un aplicador. 4. La distribución de los antígenos y de los antisueros en los orificios se hace de acuerdo a los esquemas. 5. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente/24 a 48 hrs. buscando bandas de precipitación. Caja petri grande
Caja Petri chica 6. En la caja petri chica se coloca: En el pozo central (1) antisuero contra A y contra B En el pozo 2, 3 y 5 antígeno A En el pozo 4 antígeno B 7. En la caja petri grande se coloca: Pozo No 1 central Antisuero homologo Pozo No 2 Antígeno sin diluir. Pozo No 3 antígeno diluido 1:2 Pozo No 3 antígeno diluido 1:4 Pozo No 3 antígeno diluido 1:8 Pozo No 3 antígeno diluido 1:16
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“INMUNOELECTROFORESIS” OBJETIVO: Analizar una mezcla antigénica por separación electroforética e inmunodifusión. FUNDAMENTO: Si se separan electroforeticamente los constituyentes de una mezcla antigénica en gel de agar como soporte y se hace difundir lateralmente un inmunosuero específico para los constituyentes de l mezcla, en las zonas correspondientes a la interacción de cada antígeno con su anticuerpo aparecerá una banda de precipitación.
MATERIAL BIOLÓGICO: Solución antigénica soluble Antisuero especifico de conejo
TÉCNICA. 1. Colocar 150 ml. de agua destilada en un vaso de precipitado de 250 ml. 2. Agregar 150 ml. de agar y hervir hasta disolución total. El volumen de agua evaporado se repone con agua destilada. 3. En la solución de agar aun caliente, sumergir los portaobjetos limpios, posteriormente sacarlos y colocarlos en un horno precalentado a 100ºC hasta que se sequen. 4. En forma semejante a la indicada en los pasos 1 y 2 preparar 100 ml. de una solución de agar al 1% en buffer de barbital 0.15 M, pH 8.6, añadir 1 ml. de merthiolate. 5. Acomodar los portaobjetos secos sobre una superficie horizontal y con una pipeta añadir 4 ml. de agar al 1% en caliente. Dejar gelificar. 6. Perforar el agar de acuerdo al esquema seleccionado, sin extraer el agar del canal. 7. Colocar la solución antigénica en el pozo horadado, evitando que se derrame sobre la superficie de la placa. (teñir el antígeno con azul de metileno para observar el desplazamiento. 8. Colocar 50 ml. de buffer de barbital en cada uno de los recipientes laterales de la cámara electroforética. Acomodar los portaobjetos en los soportes y establecer contacto entre la placa de agar y el buffer mediante tiras de papel filtro. Un extremo de cada tira de papel debe cubrir unos 0.5 cm del agar y el otro extremo debe colgar dentro del amortiguador.
9. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y ajustar la corriente a 810 volts/cm de gel. 10. Suspender la corriente y desconectar la cámara. 11. Eliminar el agar del canal y llenarlo con el Antisuero. 12. Dejar las placas en cámara húmeda por 24 a 48 hrs. A temperatura ambiente y hacer las lecturas.
RESULTADOS: Se formarán bandas de precipitación entre los constituyentes de la mezcla antigenica y sus respectivos anticuerpos. ESQUEMA DE LOS ORIFICIOS Y EL CANAL.
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“IDENTIFICACIÓN DE ANTIGENOS A Y B DE GRUPO SANGUÍNEO, CON ANTISUERO DE CONEJO Y CON ANTISUEROS COMERCIALES” OBJETIVO: Identificar los antígenos de superficie de los eritrocitos con sus antisueros homólogos obtenidos en el suero de los conejos los cuales fueron inmunizados previamente.
FUNDAMENTO: Los sueros ricos en anticuerpos, obtenidos en un conejo el cual fue inmunizado previamente con eritrocitos A y B, va a contener una diversidad muy grande de los mismos, por lo tanto el suero se considerara como antisuero policlonal, por lo tanto se procederá a convertir el mismo en un suero monoclonal adsorbiendo los anticuerpos que no nos interesan con soluciones concentradas de eritrocitos diferentes a el tipo sanguíneo que se le inoculo al conejo.
MATERIAL BIOLÓGICO: Suero de conejo anti-A o anti-B según sea el caso. Suspensión al 5 % de eritrocitos problema de cualquier tipo Suspensión de eritrocitos al 50% A y B Rh positivos.
TÉCNICA: 1. A partir del suero aglutinante del conejo preparar un suero monoespecífico (ver técnica) 2. Marcar seis tubos, 2 como A1 y A2, 2 como B1 y B2 y 2 como AB1 y AB2 y colocar en cada uno de ellos una gota de la suspensión de eritrocitos a estudiar 3. Agregar a los tubos 1 una gota de antisuero comercial anti-A, Anti-B y anti AB. 4. Agregar a los tubos 2 una gota del antisuero producido en el conejo 5. Centrifugar inmediatamente buscando aglutinación (anotar resultados)
OBTENCIÓN DE SUEROS MONOESPECIFÍCOS Se obtiene por adsorción del suero con suspensiones o soluciones antigénicas, que contengan los determinantes antigénicos específicos para los anticuerpos que se quieran eliminar y carezcan de aquel cuyos anticuerpos se deseen conservar en el suero. Si los antígenos son particulados se deberán adsorver con suspensiones antigénicas lo mas concentradas posibles a temperatura ambiente durante 18 horas. Con la finalidad de optimizar la práctica, se procederá de la siguiente manera. a) Descomplementar el suero por medio de calentamiento durante 3 min. b) Agregar una suspensión al 50% de los eritrocitos que se vayan a utilizar en la misma proporción que la cantidad del suero que se tenga. c) Incubar a 37°C durante 20 min. y probar nuevamente con la suspensión de los eritrocitos problema, siguiendo la técnica numérica en sus 5 pasos. d) En caso de presentar nuevamente aglutinación en todos los tubos repetir la técnica alfabética las veces que sea necesario.