Revista de Toxicología. Volumen 34 Número 2 (2017) by Jorge Calpe Ruano

Volumen 34 Número 2 (2017)

SEMESTRAL

INDEX

ÍNDICE

EDITORIAL ...........................................................................................................................83

EDITORIAL.........................................................................................................................83

Gil L, Ruiz P, Escrivá L, Font G, Manyes L A decade of Food Safety Management System based on ISO 22000: A GLOBAL overview.......................................... 84

Gil L, Ruiz P, Escrivá L, Font G, Manyes L Una década del Sistema de gestión de la seguridad alimentaria basado en ISO 22000: VISIÓN GENERAL…. 84

Espín S, Sánchez-Virosta P, García-Fernández A.J, Eeva T. A microplate adaptation of the thiobarbituric acid reactive substances assay to determine lipid peroxidation fluorometrically in small sample volumes........................... 94

Espín S, Sánchez-Virosta P, García-Fernández A.J, Eeva T. Una adaptación de microplacas del ensayo de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico para determinar la peroxidación lipídica fluorométricamente en pequeños volúmenes de muestra………………………………………………………....94

Oropesa AL, Moreno JJ, Gómez LJ. Histopathological lesions in fish caused by exposure to emerging pollutants: collecting and analysing data....................... 99 Pelechá M, Gómez-Lechón MJ, Tolosa L, Donato MT. Human Hepatocytes Upcytes® as in vitro experimental model to study long-term drug-induced liver injury....................................................................................................................109 Hernández Martínez E.M, Carrazana García D.I, González González R, García López A, Marrero Chang O, Águila Jiménez E, Morales Monteagudo A, López Hernández Y. Acute toxicity in Physa cubensis P. and Artemia salina L. of 8 antibiotics with environmental risk...................................................................118 Chaves JJ, Soler F, Perez-Lopez M, Oropesa AL. In vivo and in vitro effects of the organophosphorus insecticide diazinon on the cholinesterase activity of the rabbit (Orictolagus cuniculus) nervous system................................................124 Borello J.S, Cañas A.I, Lucero P.A. Validation of analytical methodology based on dispersive liquid-liquid microextraction combined with liquid chromatography for determination of urine dichlorophenoxyacetic acid.....130 Dafouz Ramírez R, Valcárcel Rivera Y. Caffeine as an environmental pollutant…………………………………….......................................................136 Vozmediano A, León J, Peña F, Castillo R, Cavieres MF. Estrogenicity of corn and almond oils in rodent models......................................................................143 Villagrán M, Muñoz M, del Pozo M, Maldonado M, Mardones L.Catalase is more sensible to the inhibitory effect of soluble component of tobacco smoke than Glutathione Peroxidase and Superoxide Dismutase.........................................148 Torres Wilches M.A. Evaluation of hepatotoxic activity the acetaminophen in vivo in rat and in vitro in rat liver slices, searching for correlation between both models in such a way that it allows the substitution in vivo model..........153 Proceedings of the Workshop on Education in Toxicology 2017...................................................................................................................... 161 Proceedings of the Sientific Workshop of Environmental Toxicology and Ecotoxicology 2017..............................................................................................167

Oropesa AL, Moreno JJ, Gómez LJ. Lesiones histopatológicas en peces originadas por la exposición a contaminantes emergentes: recopilando y analizando datos.................................................................................................99 Pelechá M, Gómez-Lechón MJ, Tolosa L, Donato MT. Hepatocitos Humanos Upcytes como modelo experimental in vitro para el estudio del daño hepático inducido por fármacos a largo plazo…………………………………….......109 Hernández Martínez E.M, Carrazana García D.I, González González R, García López A, Marrero Chang O, Águila Jiménez E, Morales Monteagudo A, López Hernández Y. Ecotoxicidad aguda en Physa cubensis P. y Artemia salina L. de 8 antibacterianos con riesgo ambiental.....................................................118 Chaves JJ, Soler F, Perez-Lopez M, Oropesa AL. Efectos in vivo e in vitro del insecticida organofosforado diazinón en la actividad colinesterasa del sistema nervioso de conejos (Orictolagus cuniculus) .................................................124 Borello J.S, Cañas A.I, Lucero P.A. Validación de la metodología analítica basada en micro-extracción dispersiva líquido-líquido combinada con cromatografía líquida para la determinación del ácido diclorofenoxiacético en orina..............................................................................................................130 Dafouz Ramírez R, Valcárcel Rivera Y. Cafeína como contaminante ambiental……………………………………………………………………...136 Vozmediano A, León J, Peña F, Castillo R, Cavieres MF. Estrogenicidad de los aceites de maíz y de almendras en modelos roedores....................................143 Villagrán M, Muñoz M, del Pozo M, Maldonado M, Mardones L. Catalasa es más sensible a los efectos inhibitorios de los componentes solubles del humo de tabaco que Glutatión Peroxidasa y Superóxido Dismutasa………….....148 Torres Wilches M.A. Evaluación de la actividad hepatotóxica del acetaminofén in vivo en rata e in vitro en cortes de hígado de rata, en búsqueda de la correlación entre ambos modelos de tal forma que permita la sustitución del método in vivo…………………………………….………….153 Actas de las Jornadas de Formación en Toxicología 2017............................ 161 Actas de las jornadas científicas de toxicología ambiental y ecotoxicología toxecotox 2017.................................................................................................. 167

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ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE TOXICOLOGÍA Rev. Toxicol. 34 (2), 83-172 (2017) ISSN 0212-7113 Certificado de Excelencia (2016-2019)

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Toxicología ÓRGANO OFICIAL DE LA ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE TOXICOLOGIA

La Revista de Toxicología de la Asociación Española de Toxicología tiene el objetivo de publicar información actualizada sobre investigaciones originales en Toxicología en castellano o en inglés y revisada por pares. Se publican artículos experimentales y de revisión de cualquier especialidad de la Toxicología, como Toxicología Alimentaria, Ambiental, Clínica, Forense, Veterinaria, Experimental y Métodos Alternativos así como en Educación en Toxicología. La revista aborda los aspectos de desarrollo y validación de nuevos métodos incluyendo estudios in vivo y estudios in vitro. Se publican así mismo las actas de congresos de la Asociación Española de Toxicología y Jornadas de Toxicología. El alcance de la revista abarca desde mecanismos moleculares y celulares hasta las consideraciones de las evidencias experimentales para la evaluación de riesgos. Es una revista electrónica, aunque periódicamente publique una selección de artículos en papel, que está diseñada para facilitar la divulgación de la investigación actual en el campo de la Toxicología.

Copyright El envío de un manuscrito implica: que no ha sido publicado anteriormente (excepto como abstract, o como parte de una conferencia o tesis); que no está considerándose su publicación en otra revista, libro, etc.; que su publicación ha sido aprobada por todos los coautores, si los hay; que, cuando y si el manuscrito es aceptado para su publicación, los autores están de acuerdo en la cesión automática del Copyright a la editorial y que el manuscrito no será publicado en ninguna otra parte ni en ningún otro idioma sin permiso de la editorial. Todos los artículos publicados en esta revista están protegidos por Copyright, que cubre los derechos exclusivos de reproducción y distribución del artículo (p. ej. como separatas) y también los derechos de traducción, Ningún contenido de la revista puede ser reproducido, fotocopiado, microfilmado o almacenado en bases de datos electrónicas, videodiscos, etc., sin el permiso escrito de los titulares del Copyright. El uso de nombres descriptivos, de marcas, marcas registradas, etc., incluso si no se identifican especialmente, no implica que estos nombres no estén protegidos por las leyes y regulaciones correspondientes.

ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE TOXICOLOGÍA Resumen actual de características y normativas El objetivo fundamental de la Asociación Española de Toxicología es el de propiciar la relación y cooperación entre sus miembros, y coordinar sus esfuerzos a fin de contribuir al desarrollo y difusión de los conocimientos en las diferentes áreas de la toxicología. Su Estatuto fundacional fue aprobado oficialmente el 15 de enero de 1980. Toda persona interesada en pertenecer a esta Asociación deberá cumplimentar una ficha de inscripción, refrendada por la Junta Directiva. La cuota anual (60 €) se abona por domiciliación bancaria, Esta cuota da derecho a la recepción de la Revista de Toxicología cuando se publique una versión impresa, y a la reducción de la cuota de inscripción en los congresos y jornadas organizados por la asociación. Una vez admitidos los nuevos asociados recibirán un titulo y, periódicamente, las actas de las reuniones y comunicación de actividades con carácter nacional e internacional que pueden ser de interés. La asociación promueve la celebración, cada dos años, del Congreso Español de Toxicología, cuya organización puede delegar. Además se ha establecido la celebración periódica de seminarios o mesas redondas organizadas por grupos de trabajo. Cada reunión de este tipo será monotemática y abierta a personas no pertenecientes a la Asociación, y se desarrollará en diferentes ciudades españolas.

Los trabajos se enviarán a través de la plataforma de la revista: http://rev.aetox.es/wp/index.php/envio-articulo/ El Equipo Editorial: revista@aetox.es Editora: Dra. Guillermina Font Pérez. Universitat de València. Dpto. de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina Legal. Avda. Vicente Andrés Estellés s/n 46100 Burjassot. Valencia Editores adjuntos: Dra. Emilia Ferrer García. Universitat de València Dra. María P. Míguez Santiyán. Universidad de Extremadura Dr. Juan Carlos Rios Bustamante. Pontificia Universidad Católica de Chile

Asociación Española de Toxicología Secretaría de la AETOX Emma Martín López Área de Toxicología Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia. Tel: 86888 7022/9311 e-mail: emmaml@um.es

D.L.:C0-723-83. S.V.: 91051 R. IiSSN: 0212-7113

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Volumen 34 Número 2 (2017)

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EDITORIAL ...........................................................................................................................83

EDITORIAL.........................................................................................................................83

Gil L, Ruiz P, Escrivá L, Font G, Manyes L A decade of Food Safety Management System based on ISO 22000: A GLOBAL overview.......................................... 84

Gil L, Ruiz P, Escrivá L, Font G, Manyes L Una década del Sistema de gestión de la seguridad alimentaria basado en ISO 22000: VISIÓN GENERAL…. 84

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Toxicología ÓRGANO OFICIAL DE LA ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE TOXICOLOGÍA COMITÉ DE REDACCIÓN Editora Dra. GUILLERMINA FONT PÉREZ Universitat de València. VALENCIA E-mail: Guillermina.font@uv.es Editores Adjuntos Dra. EMILIA FERRER GARCÍA Universitat de València. VALENCIA E-mail: Emilia.ferrer@uv.es Dra. Mª DEL PRADO MÍGUEZ SANTIYÁN Universidad de Extremadura. CÁCERES E-mail: mpmiguez@unex.es Dr. JUAN CARLOS RÍOS BUSTAMANTE Pontificia Universidad Católica. CHILE E-mail:jcrios@med.puc.cl Comité Editorial Dr. RAFAEL BALAÑA FAUCE Universidad de León. LEÓN E-mail: rbalf@unileon.es Dra. HOUDA BERRADA RAMDAMI Universitat de València. VALENCIA E-mail: houda.berrada@uv.es Dr. ANGEL TOMÁS CAMACHO GARCÍA Laboratorios Lema & Bandín. VIGO E-mail: atcamacho@lemabandin.com Dra. ANA MARÍA CAMEÁN FERNÁNDEZ Universidad de Sevilla. SEVILLA E-mail: camean@us.es Dr. ANTONIO JUAN GARCÍA FERNÁNDEZ Universidad de Murcia. MURCIA E-mail: ajgf@um.es Dr. FERNANDO GIL HERNÁNDEZ Universidad de Granada. GRANADA E-mail: fgil@ugr.es

Dr. DIEGO GONZÁLEZ MACHÍN CEPIS/OPS. LIMA (PERÚ) E-mail: dgonzale@cepis.ops-oms.org Dr. CARLOS GOTELLI Centro de Investigaciones Toxicológicas BUENOS AIRES (ARGENTINA) E-mail: dgotelli@impsatl.com.ar Dr. ARTURO HARDISSON DE LA TORRE Universidad de La Laguna. TENERIFE E-mail: atorre@ull.es Dra. ÁNGELES JOS GALLEGO Universidad de Sevilla. SEVILLA E-mail: angelesjos@us.es Dra. Mª ARÁNZAZU MARTÍNEZ CABALLERO Universidad Complutense de Madrid. MADRID E-mail: arantxam@vet.ucm.es Dra. EMMA MARTÍNEZ LÓPEZ Universidad de Murcia. MURCIA E-mail: emmaml@um.es Dra. ROSARIO MOYANO SALVAGO Universidad de Córdoba. CÓRDOBA E-mail: r.moyano@uco.es Dr. JOSÉ RUEFF Universidad Libre de Lisboa. LISBOA (PORTUGAL) E-mail: rueff.gene@fcm.unl.pt Dra. MARÍA JOSÉ RUIZ LEAL Universitat de València. VALENCIA E-mail: m.jose.ruiz@uv.es Dra. MARÍA LUISA SORIA SÁNCHEZ Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. SEVILLA E-mail: luisa.soria@mju.es Dra. MARÍA JESÚS TABERNERO DUQUE Universidad de Santiago de Compostela. LA CORUÑA E-mail: mj.tabernero@usc.es

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Editorial

EDITORIAL

Estimadas y estimados colegas, con este nuevo número queremos agradecer a todas las personas que han hecho posible su publicación. En primer lugar a los autores que han confiado en que sus resultados verían la luz y también a los revisores que gentilmente ponen su saber para que las publicaciones sean científicamente revisadas. Es para nosotros una satisfacción el observar que el interés de nuestros colegas de Iberoamérica no decae y así en este número hay artículos de Argentina, Chile, Colombia, Cuba y España. Queremos recordaros la conveniencia de citar los artículos de la Revista de Toxicología y como no, de nuevo a compartir con la comunidad científica vuestros hallazgos.

Equipo editorial

Rev. Toxicol (2017) 34 (2)

Rev. Toxicol (2017) 34: 84 - 93

A decade of Food Safety Management System based on ISO 22000: A GLOBAL overview. Gil L, Ruiz P, Escrivá L, Font G, Manyes L* Laboratory of Food Chemistry and Toxicology. Faculty of Pharmacy. University of Valencia. Burjassot. Spain.

Abstract: The worldwide implementation and certification of food safety management systems (FSMS) have significantly increased during the last decade, reflecting the importance of assuming these standards in activity sectors involved in the food chain. Companies of all types and sizes worldwide have made several efforts for implementing a FSMS based on International Organization for Standardization (ISO) 22000. Certification system and quality management tools development in international context, are analyzed in food processing and food service sectors. Studies of food safety, performance of ISO 22000 implemented in food companies and hurdles of context characteristics wherein operate were reviewed. To summarize, improved product quality and safety has been identified as the major benefit of implementing ISO 22000. Other benefits highlighted include enhanced employee skills, improved company image, increased product sales, increased market share and access to new markets. Keywords: Food safety, ISO 22000, HACCP, food processing, food services. Resumen: Una década del Sistema de gestión de la seguridad alimentaria basado en ISO 22000: VISIÓN GENERAL. La implementación y certificación mundial de los sistemas de gestión de la seguridad alimentaria (SGSA) se han incrementado significativamente durante la última década, lo que refleja la importancia de asumir estos estándares en los sectores de actividad involucrados en la cadena alimentaria. Empresas de todos los tipos y tamaños han realizado esfuerzos para implementar un SGSA basado en la Organización Internacional de Normalización (ISO) 22000. El sistema de certificación y el desarrollo de herramientas de gestión de calidad en el contexto internacional se analizan en los sectores de procesamiento de alimentos y servicios de alimentos. Se revisaron los estudios de inocuidad de los alimentos, el desarrollo de ISO 22000 implementado en las empresas de alimentos y los problemas según las características del contexto en donde opera. En resumen, la mejora en la calidad y seguridad del producto ha sido identificada como el principal beneficio de implementar ISO 22000. Otros beneficios destacados incluyen mejoras en las habilidades de los empleados, en la imagen de la compañía, mayores ventas de productos, mayor participación de mercado y acceso a nuevos mercados. Palabras clave: Seguridad alimentaria, ISO 22000, HACCP, procesamiento de alimentos, servicios de alimentos.

Introduction In the last ten years, the quality of food products, especially regarding safety, has become one of the most important aspects to influence food industry, food market, governments and nongovernmental organizations (NGOs), as well as consumers, national and international business and economical patterns. Globalization of food production and procurement makes food chains longer and more complex, in addition to increasing the risk of food safety incidents. Certainly, food products are sourced from all over the world, transported over long distances, produced under different cultivation practices and climatic conditions, and are manufactured using several processing techniques, extending the probability of a higher risk of incidences in food safety hazards. Millions of people around the globe are hospitalized and even die *e-mail: lara.manyes@uv.es 84

every year from foodborne diseases and illnesses caused by the consumption of contaminated food. Hygiene in the food sector is of capital importance in food services, especially in health facilities. In fact, microorganisms can proliferate and reach dangerous levels in kitchens where growing conditions are optimal. Due to their condition, patients are more sensible to foodborne illnesses than other people. Therefore, foods prepared in unhygienic conditions may infect or intoxicate people. In less developed countries, the underreporting of foodborne illnesses and diseases aggravates the situation. In the absence of any published studies assessing consumer’s food safety preferences, along with relevant awareness campaigns, it is expected a minimum consumer’s knowledge and attentiveness of proper food handling practices. This is in turn linked to an increase in the risk of contracting foodborne illnesses (Abouda et al., 2014). Worldwide economic globalization processes and the development of international trade have needed rapid quality standardization processes, as they are crucial in defining the quality of a product and the trustworthy of a company. These processes mean that more countries are into keeping with unified standards and technical regulations, quality and environmental management systems (EMS), quality satisfaction evaluation and certification procedures. The attempt of regulation reveals that food safety remains to be one of the major public health issues worldwide. The use of these rules and recommendations along the food chain will allow not only to be assured the quality of goods and services on an international scale, but also their implementation will lead to the elimination of technical trade barriers which are becoming increasingly pervasive. There are great variations between regions and countries in how these technical rules are applied in manufacturing and agriculture. In order to guarantee the production of pure and healthy food products, many countries have come up with especially strict and restrictive rules. Given the existing complicated and non-uniform rules, their systematization is hardly achievable (Kussaga et al., 2014). In 2005, the international standard from the International Organization for Standardization (ISO) 22000 was published in order to fill the managerial gap in the FSMS hazard analysis and critical control points (HACCP). ISO 22000 is an international standard that specifies requirements for a guaranteed food security system with the incorporation of good manufacturing practices and HACCP with an adequate organization system, that enables a company to demonstrate that the products supplied meet the requirements of customers as well as those of application related to the food safety. The standard is based on the Codex Alimentarius HACCP principles and it was developed by lining up with the ISO 9001 standard in order to improve the compatibility and integration with the quality management standard. It is designed to cover all processes by food safety systems (easy to understand, implement and audit), along the supply chain that affect directly or indirectly the food products. In the ISO 22000, the hazards that require control are managed at the critical control points (CCPs) but also through prerequisite programs (PRPs). The purpose of the food safety system ISO 22000 is to provide a practical approach to ensure the elimination and reduction of food safety risks to protect consumers (Fernandez-Segovia et al., 2014). As ISO 22000 is a generic food safety management standard, it can be used by any organization directly or indirectly involved in the food chain including farms, fisheries, dairies, meat processors, manufacturers of soups, snacks, bread, cereal, beverages, canned and frozen food, etc. together with food service providers such as restaurants, fast food chains, hospitals and hotels. It is the only

Rev. Toxicol (2016) 33: 2 - 11

A decade of Food Safety Management System based on ISO 22000: A GLOBAL overview

standard that encompasses both consumer and market needs (Wang et al., 2011). Since the publication of ISO 22000 in different countries, efforts were made to integrate these regulations. In that sense, there are several studies about rigorous assessments of the costs and benefits associated with the implementation of FSMSs in various industries. The results reflect the particular characteristics of different industrial sectors and provide some indication of the incentives, costs and benefits of HACCP implementation by food processing enterprises in general (Bilalis et al., 2009). Up to the end of December 2014, at least 30 500 ISO 22000:2005 certificates, a growth of 13,6 %, had been issued in 152 countries and economies, ten more than the previous year. The top three countries for the total number of certificates and proportional growth in number of certificates in 2014 were China, India and Greece. Even it expansion has decreased compared to 20% and 15% increases in previous years, ISO’s food management standard nevertheless clocks in a respectable 14% (or 30500 certificates issued) as pointed out previously – its dented progress offset by it breaking the 30000 certificate threshold for the first time this year. In particular, North America experienced a spectacular growth rate of 70%, remarkably in the USA, where a new certification body joined the survey and a major existing contributor reported more certificates than usual. On European shores, Greece – one of the countries boasting the largest number of certificates – plummeted this year due to an important certification body not participating in the survey. Conversely, Australia’s remarkable progression can be linked to a significant contributor reporting more certificates than usual (ISO survey, 2014). Overall, worldwide implementation and certification of food safety management systems (FSMS) have increased significantly during the last decade, reflecting the importance of assuming these standards in different activity sectors. The aim of this review is to contextualize and assess the understanding of the implementation advances and the level of satisfaction reached by consumers and producers based on the literature found on the ISO 22000 standard, including surveys, interviews and reported cases (Escanciano & Santos-Vijande, 2014).

Method A systematic literature search was made including clinical trials and reviews related to ISO 22000 standard, using databases such as Web of Science and Pubmed with the following search criteria: Timespan: 2005-2016. Research domains: Science technology Document type: article Search word: "ISO 22000”: 56 articles. Finally, 30 articles were chosen to be reviewed, selecting those that were original articles assessing ISO 22000 standard implementation in any company or sector involved in the food chain.

ISO 22000 in European food processing companies In European countries ISO 22000 regional share is 34,9%, with 10654 certificates in 47 economies in 2014 (ISO survey, 2014). In table 1 there is a summary of the studies conducted in this geographical area in the last ten years. Some countries as Denmark started to regulate using the standard DS 3027 E: 2002. It was published by the Danish Standard Institute indicating the requirements for a management system in order to standardize control of food safety. Those requirements were imbedded in ISO 22000: 2005 in aim to simplify the data interpretation, especially for small businesses, and facilitate the food safety system implementation (Sheps, 2007). Other countries, as Lithuania, revealed problems at the implementation of FSMSs. The Lithuanian certification system involves products, organizations and employees conformity assessment. Apart from "traditional" quality (ISO 9001) and

Table 1. Studies of ISO 22000 in European food processing companies.

European countries

Food Processing

Denmark

Danish Standard Institute

Greek

Organic Industry

Lithuania

Activities

Reference

Journal

Sheps, 2007

J Environ Protec Ecol

Surveys

Bilalis et al, 2009

Food Agric Environ

Lithuanian enterprises

Certification systems

Ruzevicius, 2008

Engi Economics

120 firms

Surveys

Mensah & Julien 2011

Food Control

Poland

4 Enterprises

Interviews

Kafel P et al., 2013

ZywnoscNauka Technologia Jakosc

Portugal

Companies

Surveys

Teixeira & Sampaio, 2013

Total Quality Mana&Busi Excel

Spain

198 firms

Surveys

Escanciano & SantosVijande, 2014a, b.

Food Control

Cyprus

50 small food businesses

Interviews

Charalambo us et al., 2015

Food Control

Requirements

environment (ISO 14001) management systems, Lithuanian companies use other systems as ISO 22000. It must be highlighted that Lithuania should improve all certification system and introduce the providences of quality management science development (Ruzevicius, 2008). Also, evaluations of the differences between two FSMSs, HACCP and ISO 22000 which are used in the Greek organic food industry, are herein reviewed. The results of the survey indicated that food enterprises/industries are influenced by various factors concerning certification. Surprisingly, the survey showed that businesses face this matter superficially. Moreover, a high percentage within human resources cannot understand the functional principles underlying these systems. However, it should be mentioned that systems cannot guarantee absolute food safety and quality of the end product for itselfs; food enterprises must take additional measures towards improvement and responsibility and compromise of the board is crucial to maintain the standards required. It was concluded that certification with a FSMS could exert pressure on farmers to provide more quality raw materials, although they may face problems in implementing the processes needed to support the system (Bilalis et al., 2009). In UK, Mensah & Julien (2011) examined the response of food manufacturing enterprises to food safety regulation, and used statistical techniques to investigate the effects of enterprise size on the drivers for, benefits of, and challenges to compliance. The survey was answered by 120 food manufacturing enterprises, representing approximately 26% of the final sample (463). The majority (97.5%) of enterprises that responded to the survey had an integrated food safety management system (FSMS) in place. Three enterprises (2.5%) did not have any FSMS; nonetheless, these enterprises had one of the ISO 9000 series implemented. Approximately 81% of companies claimed that their motivations for compliance were driven by the prospects of product safety improvement, 76% were driven by customer requirements and 60% were driven by regulatory requirements. The survey also revealed that 59% of enterprises were driven by the expected marketing advantage that could be derived from implementing the standard, others, 54% saw the potential for improved corporate image and 38% claimed that their certification was motivated by the fact that their competitors were certified. Only 35% of enterprises complied because of potential liability claim. 30%

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were driven by the prospect of operational cost reductions. Approximately 18% of the enterprises claimed that they complied to avoid potential export barriers from overseas customers, and because it was an insurance requirement. Regarding benefits of compliance, 85% of the respondents enjoyed the benefit of increased customer satisfaction. 83% of respondents claimed improved internal procedures and 82% of the respondents also claimed improvements in product quality. Finally, the study identified five topmost challenges: lack of technical knowledge and skill of employees (58%), employee resistance to change (58%), lack of awareness of the requirement (40%), high cost of development and implementation (26%) and inappropriate infrastructural capabilities for validating and verifying FSMS (30%). There are study attempts to fill the gap in the literature on FSMS by providing quantitative empirical evidence about the reasons for implementing a FSMS based on ISO 22000, as well as by analyzing the main constraints that may prevent the adoption of the standard in the food industry. On this topic, a survey based on a sample of 189 Spanish firms with ISO 22000 certification distributed at all levels of the food chain, matched our criteria. The profile of the ISO 22000 certified company in Spain is an SME food producer with presence in foreign markets, and with two or more management systems implemented. While external pressures that lead companies to adopt a FSMS based on ISO 22000 exist, the most determinant reasons in their decision to implant it are internal in nature, specifically the desire to improve efficiency, productivity and quality. Results also identify major constraints limiting the dissemination and use of ISO 22000: it is not a well-known standard and many food companies are unaware of its potential (Escanciano & Santos-Vijande, 2014a; Escanciano & Santos-Vijande, 2014b). Concerning the main motivations of ISO 22000, it was observed that Portuguese companies became ISO 22000 certified mainly to improve consumer confidence and because this kind of registration is a requirement for satisfying other interested parties. Regarding the benefits achieved, the surveyed companies had reported an improvement in food safety methodologies and practices. As verified for the ISO 22000 certification motivations, the most important benefit stated by the respondent companies was of internal nature. Regarding the implementation barriers, two main difficulties were reported: internal resistance to change and FSMS implementation costs (Teixeira & Sampaio, 2013). Integrating management systems in food sector enterprises in Poland was examined. A planning phase as described in the Publicly Available Specifications (PAS) with 99 specifications was studied as one of the elements of the joint systems constituting an integrated management system. Four organizations were selected for the study, where at least two standardized management systems were introduced and certified. It was assumed that the investigated organizations should have an implemented HACCP system. The research study was a case study. In every organization, the employees responsible for the operation of management systems in the enterprise were interviewed. The study was performed in the form of in-depth interviews based on a pre-developed scheme according to the PAS 99 guidelines. Based on the research results, it was found that all the organizations surveyed were aware of the fact that in the case of emergency situations, risk management was a must. In three enterprises, the risk management procedures were implemented and in operation; in the fourth organization, the employees worked at implementing those procedures. In all the organizations, there was one person responsible for all the implemented management systems. The objectives linked with food safety constituted a minority compared to all other objectives adopted in the organization within the scope of management systems in operation therein. In addition, it was proved that the implementation of the system and the ISO 22000 certification did not cause any significant changes in the map of processes or in the type of actions taken by the organizations surveyed. Impediments to the integration of systems (including the planning element) were mainly associated with the fact that those organizations operated within international groups where some rules 86

were established top-down with no possibility of change (Kafel P., 2013). An assessment of FSMS implementation in a sample of 50 small food businesses in Cyprus demonstrated an improvement in premises hygiene, with the most significant improvements occurring after the implementation of PRP's and a bespoke HACCP plan. Increasing the system complexity by imposing the Cyprus standard (CYS 244) or ISO 22000 resulted in hygiene deterioration as measured by the audit and some sampling results. However, the final standard was generally higher than at the start of the study, suggesting the premises usually had better hygiene after the study period. This may have been due to the improved hygiene knowledge demonstrated by the food handling staff. The attitude of the Food Business Operators was generally in favor of FSMSs at the start of the study, but became less positive after the imposition of the CYS 244 and ISO 22000 standards. Because of the difficulties faced by Food Business Operators in trying to implement these more complex systems, 90% wished to stop using them, and by 2014, 75% of them were no longer using even a formal HACCP system. A further 10% had closed. All the Food Business Operators reported substantial costs related to the implementation of the systems (Charalambous M, 2015). To summarize, the major problem to solve in Europe in order to implement satisfactorily ISO 22000 or other FSMS in companies is the employees’ commitment with the daily standard monitoring and its usefulness.

ISO 22000 in African food-processing companies In African countries ISO 22000 regional shares is 3,7%, with 1130 certificates in 32 economies in 2014. In table 2, there are three studies found about ISO 22000 in this geographical area in the last ten years. Table 2. Studies of ISO 22000 in African food processing companies.

African countries African countries

Food processing Companies

Togo

4 small and medium food businesses Companies

Zimbabwe

Activities

Reference

Journal

40 Reported cases Authors’ research

Kussaga et al., 2009

J Sci Agric

Lamboni & Azouma, 2013

Environ Ris Sante

Surveys

Macheka L et al 2013

Food Control

The first study was performed to provide insight into current deficiencies in FSMS in African food-processing companies and to identify possible strategies for improvement so as to contribute to African countries’ efforts to deliver safe food to both local and international markets. As a result, it was found that most African food products had high microbiological and chemical contamination levels exceeding the set (legal) limits. Relative to industrialized countries, the study identified various deficiencies at government, sector/branch, retail and company levels, which affected performance of FSMS in Africa (Kussaga et al., 2014) . Very few companies, except exporting and large ones, had implemented HACCP and ISO 22000:2005. Various measures were proposed to be suggested to the different governments, for instance, the construction of risk-based legislative frameworks, strengthening of food safety authorities, using ISO 22000:2005 and consumers’ food safety training. For each branch/sector it were recommended sector-specific guidelines and third-party certification and for retail, developing stringent certification standards and imposing product specifications. At company levels it was suggested improving hygiene, strict raw material control, production process efficacy, and enhancing monitoring systems, assurance activities and supportive administrative structures. The conclusion was that by working on those four levels, FSMS of African food-processing companies could improve and be better designed and tailored towards their production processes and specific needs to ensure food safety (Kussaga et al.,

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2014).

Table 3. Studies of ISO 22000 in the agricultural sector.

An approach that integrates the FSMS and the West African Economic and Monetary Union (WAEMU) directives to small and medium food businesses (SMFBs) design has been proposed. The quality of food produced by SMFBs and their practices in relation to environment protection and consumer health often do not meet ISO norms, although these are an important factor for competitiveness on the national and particularly the international market. Many existing SMFBs fail to meet these norms and will require new or redesigned plants to do so. These solutions involve significant investments that delay or discourage SMFBs from obtaining certification, in view of their limited financial capacity. In an attempt to enable ISO certification, it is examined how FSMSs could be integrated into new SMFB designs. Firstly, it is conducted a diagnostic investigation of four SMFBs in the maritime region of Togo. Consequently, the authors found various extents of failure to conform the FSMS requirements of the ISO 22000:2005 as environment relative to the plant site: 33 to 67%; buildings: 29 to 86%; equipment and workspace: 0 to 67%; air, water, and energy supply systems: 75 to 81%; waste disposal: 22 to 100%; suitable equipment: 14 to 86%; prevention of cross-contamination (forward planning): 33 to 100%; and finally, pest control: 67%. Dissemination of information and upto-date clear training materials for the food industries and their workers remain insufficient. To these challenges must be added the fact that SMFBs do not receive adequate technical assistance (Lamboni & Azouma, 2013). In a similar way, small-scale companies dominate the foodmanufacturing sector in Zimbabwe and most of these companies do not have FSMSs. The barriers and motivation factors towards the implementation of FSMS such as HACCP and ISO 22000 in the foodmanufacturing sector in Zimbabwe have not yet been explored, so a survey was realized in order to determine factors that influence the implementation of FSMS by food manufacturing companies in Zimbabwe. For that purpose, fifty-five questionnaires were distributed to different food companies in Harare Province in Zimbabwe: thirty of which were fully completed and returned. The questionnaires elicited information on the barriers hindering implementation of FSMS and factors that motivate foodmanufacturing companies to implement an FSMS. The survey revealed that the main barriers for the implementation of an FSMS included lack of financial resources, size of organization, inadequate infrastructure and facilities, and lack of top management commitment. Improved product quality and safety was identified as the major benefit of implementing an FSMS. Other benefits highlighted included increased employees’ skills, improved company image, increased product sales, increased market share and access to new markets (Macheka L et al. 2013). To sum up this section, African countries need governmental economical and technical support to implement ISO 22000 or any other FSMS in SMEs and increase their competitive potential. On the other hand, consumers must acquire better food safety education to fully appreciate the standard implementation.

ISO 22000 implementation in agricultural sector Agricultural practices are a consumers’ concern, for instance plaguicide contamination, whereas for producers product quality but also quantity are major worries. Table 3 shows four reports about ISO 22000 standard use in the agricultural branch in the last ten years. With the intention of approaching quality, control and management, ISO 22000 deployment in a grain storage unit, one of the largest cooperatives in the region of Parana state, Midwest of Brazil, was revised. Technological advances in agricultural production methods, new food preparation techniques, packaging of the products, the growing concern for the environment and sustainable development are aspects enclosed in the discussions on the issue of quality and food safety for the consumer. As it was demonstrated, it is important

Country Brazil

Product Grain

Action Study

Authors Furlan & Morozini, 2013

Journal Custos e Agronegocio on line

Iran

Pistachios

Aflatoxins

Fallah et al 2013

Journal of Food Safety

Tunisia

Flour

Study

Gaaloul et al 2011

Food Control

South Africa

Sugar

Managemen t survey

Ramphal & Simelane, 2010

International Sugar Journal

to be acknowledged along the whole food chain, with its main links, which serve as control points that facilitates the current monitoring and the identification of problems, their location and possible cause. The installation and operation of these mechanisms necessarily imply increased transaction costs for the system as a whole. However, given the importance of food and its impact on health and environment, it is assumed that such costs are lower than those that would result if these mechanisms would not operate (Furlan & Morozini, 2013). Iran is the largest producer and exporter of pistachios in the world (FAO Consultant 2009). Because of the importance and usage of pistachios, it is necessary to improve their agricultural situation by establishing good processing equipment and packaging units near pistachio farms. It is possible to supply a large quantity of high quality products for foreign and domestic markets but one major problem in this field is the production of aflatoxin, which is one Aspergillus metabolite produced in adequate humidity and temperature conditions. A study employing FSMS based on ISO 22000:2005 model to prepare safe pistachios with less aflatoxin content has been performed. The results obtained in this study indicate that the stages immersing pool, wet sorting and dry sorting had significant effect on aflatoxin B1 reduction while washing of pistachio nuts did not have a significant effect on decrement of aflatoxin B1. The stages temporary sorting and drying even increased the concentration of aflatoxin B1 in the product. Adverse effect of these stages could be attributed to biological activity of molds and reducing moisture content of the product, respectively. Overall, it is concluded that operational PRPs (OPRPs) and CCPs have no important differences regarding to hazard control but they are dissimilar from a type of control measure aspect. For the effective implementing of FSMS, suitable PRP are necessary. It is not true to say that maximum hazard control is achieved with CCP, but CCP is the last point for hazard control and therefore must be concentrated upon for most monitoring actions (Fallah A et al., 2013). In Tunisia, a corporation of various industries of flour, the Société des Minoteries et des Industries Diverses (SMID) launched the study of ISO 22000 implementation during wheat grinding process. Various methods and procedures have been developed to monitor cereal products safety issues at an early stage, including early detection, warning systems, vulnerability assessment and corrective actions. The PRPs implementation allowed them to control the likelihood of incidence of physical, chemical and microbiological hazards. The HACCP established plan enabled to monitor the real hazards which make up five CCPs: the survival of cereal insects during wheat storage operation, the presence of foreign bodies during cleaning, the contagion and proliferation of mushrooms during moistening, the proliferation of mushrooms and insects during transfer and storage of the finished products and, finally, the presence of foreign bodies during packaging (Gaaloul et al., 2011). Another topic of investigation was the choice of standards attending to management preferences, consisting of comparative analyses of the standards, an empirical determination of management's preferred choices of standards or combinations of standards and the study of

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the implementation of ISO 22000 at the Mhlume Sugar Factory in Swaziland (Royal Swazi Sugar Corporation, South Africa). The findings showed that an ISO 9001 certified organization can add some requirements and be equivalent to ISO 22000 depending on customer and market demands. It was also shown that management have the least preference for ISO 9001 only, and prefer both ISO 9001 and ISO 22000 certificates. The benefit of this contribution is to inform the management of the similarities and differences between quality, HACCP and food safety systems and the possibility of combining both (Ramphal & Simelane, 2010). Finally, Varzakas et al. (2010) applied the Failure Mode and Effect Analysis (FMEA) model to the risk assessment of almond manufacturing. The main emphasis was put on the quantification of risk assessment by determining the Risk Priority Number (RPN) per identified processing hazard. Pasteurization, fumigation with propylene oxide, packaging, storage and distribution and hulling/shelling were the processes identified as the ones with the highest RPN (240, 225, 180, 144, respectively) and corrective actions were undertaken. Following the application of corrective actions, a second calculation of RPN values was carried out leading to considerably lower values (below the upper acceptable limit of 130). It is noteworthy that the application of Ishikawa (Cause and Effect or Tree diagram) led to converging results thus corroborating the validity of conclusions derived from risk assessment and FMEA. Therefore, the incorporation of FMEA analysis within the ISO 22000 system of an almond processing plant was considered imperative. To conclude, agricultural sector companies are aware of the benefits of HACCP and ISO 22000 standard implementation and use during all the processes that commodities suffer.

ISO 22000 implementation in dairy products sector Providing 'on-farm food safety' programs which address the daily management of the production unit with regard to animal health and well-being, public health and environmental health must be a top priority for agriculturalists and veterinarians. In table 4, are cited the five articles found about ISO 22000 standard in the dairy sector in the last ten years. Table 4. ISO 22000 implementation in dairy products sector

Country Greece

Product Yoghurt

Action Microbiolo gical hazard HAPPC analysis

Authors Chountalas P et al 2009 GonzálezGonzález et al 2012

Journal British Food J Ingeniería Industrial

Cuba

Ice cream

Kenya

Dairy

Microbiolo gical hazard

Opiyo BA et al 2013

Greece

74 dairy companies

Psomas et al 2015

Serbia

27 dairy companies

Levels of the HACCP FSS effectivenes s Survey

Journal of Food Protection Food control

Tomašević et al 2016

Mljekarstvo

Several types of companies have made efforts to implement the ISO 22000 in Greece including the application of these requirements, as interpreted, to industrial yoghurt manufacture, considering all major varieties (set, stirred and strained) and types (with or without flavorings) (Chountalas P et al., 2009). A research study was carried out in 74 Greek dairy companies using a structured questionnaire showing that the ISO 22000 certified ones significantly outperform the non-certified with regard to the HACCP Food Safety System (FSS) effectiveness. Thus, managers of dairy SMEs, taking advantage of the structured organization and the documented procedures provided by the ISO 22000 standard, can increase the level of the HACCP FSS achieved objectives, meaning 88

HACCP effectiveness. In doing so, dairy SMEs can set the foundations in order to optimize the conditions under which safe food is provided, minimize the possibility of food non-conformities and scandals, rise in market share and consequently withstand the current downturn (Psomas et al. 2015). In Cuba a procedure was designed for the application of HACCP in the small Icy Lark factory in order to guarantee the innocuousness of the product. This work allowed to evaluate the sanitary state of the food areas related with the ice cream production. The results obtained implementing the procedure were satisfactory during the three years in which compliance was checked. The product was suitable for consumption, which gave confidence to management and customers, both tourism workers and consumers (González-González et al. 2012). In Kenya, the effects of existing FSMS and size of the production facility on microbiological quality in the dairy industry were studied. A microbial assessment scheme was used to evaluate 14 dairies in Nairobi and its environs, and their performance was compared based on their size and on whether they were implementing HACCP systems and ISO 22000 recommendations. Environmental samples from critical sampling locations, i.e., workers' hands, food contact surfaces and from end products were analyzed for microbial quality, including hygiene indicators and pathogens. Microbial safety level profiles (MSLPs) were constructed from the microbiological data to obtain an overview of contamination. The maximum MSLP score for environmental samples was 18 (six microbiological parameters, each with a maximum MSLP score of 3) and for end products was 15 (five microbiological parameters). Three dairies (two large scale and one medium scale; 21% of total) achieved the maximum MSLP scores of 18 for environmental samples and 15 for the end product. Escherichia coli was detected on food contact surfaces in three dairies, all of which were small scale dairies, and the microorganism was also present in end product samples from two of these dairies, an indication of cross-contamination. To summarize, microbial quality was poorest in small-scale dairies in Nairobi. Most operations in these dairies were manual, with minimal system documentation. Noncompliance with hygienic practices such as hand washing, cleaning and disinfection procedures, which is common in small dairies, directly affects the microbial quality of the end products. Dairies implementing HACCP systems or ISO 22000 recommendations achieved maximum MSLP scores and hence produced safer products (Opiyo BA et al., 2013). Recently, a Serbian dairy industry survey about food safety management systems implementation was published (Tomašević et al., 2016). It involved 27 food business operators with the national milk and dairy market share of 65 %. Indeed, in most of the cases, the investigated dairy producers (70.4 %) indicated that they had an entirely operational and certified HACCP system in place, while 29.6 % implemented HACCP, but had no third party certification. ISO 22000 was implemented and certified in 29.6 % of the companies, while only 11.1 % had IFS standard. The initial set-up of food safety management system was the cost of product investigation/analysis and hiring external consultants. Important conclusions extracted from this survey are the identification of the attitudes and the motivation of the food production staff as the most important barrier for the development and implementation of HACCP. The most important recognized benefit was increased safety of dairy products. Moreover, the increased customer confidence and working discipline of staff employed in food processing were also found as essential benefits of implementing/operating HACCP. In conclusion, this section reveals similar findings than the first results section. Workers must be involved in ISO 22000 or other FSMS standard implementation in order to feel responsible of consumers’ health during their daily work.

ISO 22000 in fish sector

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Consumers and regulatory officials are aware of the human health risk of the presence of microorganisms and/or chemicals in fish. Studies from three countries have been found discussing ISO 22000 and are cited in table 5. Table 5. ISO 22000 implementation in fish products sector.

Country Greece

Product Salmon

Action Risk Assessment

Greece

Trout

Risk Assessment

Greece

Octopus

Risk Assessment

Portugal & Spain

5 Seafood processing

Study

Authors Arvanitoya nnis & Varzakas, 2008 Arvanitoya nnis et al, 2009 Arvanitoya nnis & Varzakas, 2009 Weyandt et al, 2011

Journal Rev Food Sci Nut

Critical Rev Food Sci Nut Inter J Food Sci Technol

Procedia Food Sci

interpretation of the standards, the empowerment and valuing of people and industry sensitivity towards the implantation of the IMS. Considering the importance of standards ISO 14001 and ISO 22000 and the results observed, it can be concluded that the integrated implementation of these standards allied to the measures for overcoming the critical factors, presents great potential for the increase of competitiveness of fish processing plants (Weyandt et al., 2011). To summarize this section, in fish sector industries implementation of ISO 22000 or at least a FSMS is highly recommended. After implementation, benefits have been found in all cases reported.

ISO 22000 in meat products sector Quality and safety are key for the meat industries. Quality assurance of the whole process is significant for the consumer acceptability, while safety assurance is obligatory for protection of public health. The studies that address this issue are compiled in table 6. Table 5. ISO 22000 implementation in meat products sector.

A comparison of ISO 22000 with HACCP was carried out over salmon processing and packaging in Greece. However, the main emphasis was put on the quantification of risk assessment by determining the risk priority. Fish receiving, casing/marking, blood removal, evisceration, filet-making cooling/freezing, and distribution were the processes identified as the ones with the highest risk and corrective actions were undertaken. After the application of these actions, a second calculation of risk was carried out resulting in substantially lower result comparing to the first one. Therefore, the incorporation of failure mode and effect analysis (FMEA) within the ISO 22000 system of a salmon processing industry is anticipated to prove advantageous to industrialists, state food inspectors, and consumers (Arvanitoyannis & Varzakas, 2008). Furthermore, the FMEA was applied to the smoked trout manufacturing process in an attempt to calculate quantitatively the Risk Priority Number (RPN) and to find out whether it can be effectively correlated to ISO 22000 and/or HACCP. RPN was found to be in close agreement with HACCP, thereby indicating that corrective actions will have to be undertaken (Arvanitoyannis et al., 2009). In the next study, comparison of ISO 22000 analysis with HACCP was carried out over octopus processing and packaging. CCPs were identified in the risk assessment of octopus (Octopus vulgaris) processing and implemented in the HACCP plan. In the hazard analysis worksheet the different hazards were identified at each processing stage, whereas in the HACCP plan each CCP was identified and accompanied with the relevant significant hazard, critical limit, monitoring of the CCP and corrective actions. ISO 22000 Analysis Worksheet was employed for determination of some PRPs. Comparison between the two systems was carried out using the hazard analysis worksheet with the result that the PRPs were the main difference between the two systems. In conclusion, the incorporation of PRPs in the ISO 22000 made the system more flexible as a smaller number of CCPs were introduced (Arvanitoyannis & Varzakas, 2009). In another study, five seafood processing plants located in Portugal and Spain were chosen for their prominence in the fishing industry, their certifications, and their reputation for remarkable performance with integrated management systems (IMS) already implanted. The results showed that all of the five analyzed plants have set quality and FSMSs; however only three of them have IMS. These companies showed good practices aimed at the preservation of the environment as opposed to the plants that did not have IMS as well as it was observed a greater gain in time with simultaneous implementation. As benefits of the adoption of the IMS, the plants identified an increase in sales and satisfaction on the part of their employees. Regarding the critical factors, the analyzed plants pointed to:

Country UK

Product Poultry

Action Risk assessment

Authors Manning et al. 2006

Australia

Meat (13 firms)

Study

Greece

Snails

Study

Turkish

Poultry (18 producers)

Survey

Khatri & Collins, 2007 Arvanitoya nnis & Varzakas, 2009 Kรถk, 2009

France

Pate

Microbiolo gical hazard

Cyprus

Meat delicatessen

Risk assessment

Serbia

Meat (9 industries)

Survey

Poumeyrol G et al, 2010 Zorpas et al, 2010 Tomasevic et al, 2013

Journal British Food Journal British Food Journal Critical Rev Food Sci Nut Journal of Food Protection Food Control Open Food Science J Food Control

In the UK, Manning et al. (2006) analyzed how a PRP and key performance indicators for food safety can be developed in the poultry meat supply chain. They reviewed the legislative and market externalities and the key food safety hazards associated with the broiler growing stage of production. Among the results, they included the requirement to reduce the level of Campylobacter spp. contamination, and the use of antimicrobial products in the food industry. One of the first studies found evaluating food safety management in meat industry was performed in Australia. It might be possible that the unwillingness of small firms to participate in the research had repercussions on the outcome, because the 13 participant firms (out of a total of 42 possible) own the 80% of Australian meat processing throughput. Nevertheless, results show that the benefits of food safety systems incorporating HACCP within the meat industry in Australia have been widespread and significant. In particular, Australian firms reported a reduction in rejects/rework/out of specification products, reduction in customer complaints, improved product hygiene, improved morale and an increase in overseas markets. However, this has been at the cost of refurbishment for small businesses, training and the exiting of firms that have not complied/been able to comply with the HACCP requirements. Most of the costs involved with HACCP could not be recouped in the short-term (Khatri & Collins, 2007). A bacterial hazard analysis methodology, based on the ISO 22000 standard, which could be adopted by small food manufacturers, was provided for meat pate prepared by pork butchers in France. The

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results of the hazard analysis showed that many bacterial hazards, particularly Listeria monocytogenes, Salmonella and Staphylococcus aureus could be effectively controlled by good hygiene practices. For the three microbial hazards Bacillus cereus, Clostridium botulinum and Clostridium perfringens, specific control measures must be implemented. Hazard analysis provided the necessary basis for a rational choice of these specific control measures (Poumeyrol G et al., 2010). FMEA has been applied for the risk assessment of snails manufacturing. An approach of FMEA application to the snails industry was attempted in conjunction with ISO 22000. Preliminary Hazard Analysis was used to study and predict the occurring failure modes in a food chain system (snails processing plant), based on the functions, characteristics, and/or interactions of the ingredients or the processes, upon which the system depends. CCPs have been identified and implemented in the cause and effect diagram (also known as Ishikawa, tree diagram, and fishbone diagram). The processes identified as the ones with the highest RPN were sterilization of tins, bioaccumulation of heavy metals, packaging of shells and poisonous mushrooms. Following the application of corrective actions, a second calculation of RPN values was carried out leading to considerably lower values. It is noteworthy that the application of Ishikawa (Cause and Effect or Tree diagram) led to converging results thus corroborating the validity of conclusions derived from risk assessment and FMEA. Therefore, the incorporation of FMEA analysis within the ISO 22000 system of a snails processing industry is considered imperative (Arvanitoyannis & Varzakas, 2009). In Cyprus, a risk profiling work has been carried out according to the standard ISO 22000:2005 in a meat delicatessen industry. The verification activities in food industries encompass sampling for monitoring CCPs and determination of microbiological variables, review of records, flow diagrams and HACCP plan. However, regarding the implementation of such a safety assurance system and hygiene, programs are also required. The detailed analysis of the safety and hygiene factors affecting the quality and safety in the whole processing of the examined meat delicatessen products (bacon, lountza, hiromeri, ham, sausages), evidenced that the control of CCPs relative to raw materials’ specifications or temperatures in retaining or thermal processing steps, as well as the PRPs relative to the hygienic conditions during production, should be satisfied (Zorpas et al., 2010). A survey was performed in the Serbian meat industry, involving 77 producers out of which 93.5% claimed that they had a fully operational and certified HACCP system in place, while 6.5% implemented HACCP, but without third party certification. ISO 22000 was implemented and certified in 9.1% of the companies, while only 1.3% had implemented and certified IFS standard. The most important incentive for implementing FSMSs for Serbian meat producers was to increase and improve safety and quality of meat products. Investment in the new equipment, civil work in the plant including redesign of production facilities were the costs related to the initial set-up with the greatest importance. The results indicated that the major difficulty encountered during HACCP implementation and operation was associated with the finance, namely the fact that companies were not able to recoup costs related to the implementation/operation of HACCP system. The most important identified benefit was increased safety of food products with mean rank scores 6.45. The increased quality of food products and working discipline of staff employed in food processing, were also found as important benefits of implementing/operating HACCP in Serbian meat industry (Tomasevic et al. 2013). Another survey was conducted to determine the extent of FSMSs (ISO 22000/HACCP) implementation in the Turkish poultry industry, with 25 major poultry meat producers, which meant close to 90% of national production. Then a comparison was made between 90

the procedures of small-to-medium enterprises (SMEs) and large firms (LFs). The survey revealed that there is a high level of application of ISO 22000 (72%), which is seen to aid the export market. It was shown to adopt more stringent schemes and make better use of governmental support services for SMEs and be also more aware of, and able to deal with, risks from a greater range of contaminants (Kök, 2009). In this section the financial issue has been brought out, although the benefits of FSMS implementation are the same than in other sectors.

ISO 22000 in Food Supplement Industry A methodology is proposed to carry out hazard and control measures assessments to properly establish OPRPs and an HACCP plan in the food supplement industry according to the ISO 22000 standard. This study focused on the manufacture of propolis, royal jelly and vitamin C ampoules, sold as energy boosters. Seven of the 13 hazards identified in this study were significant: two hazards were in the reception step (residues of pesticides, antibiotics and/or heavy metals and contamination by pathogens), two in the ingredients weighing step (cross-contamination by metabisulphite and contamination by pathogens, one in the mixture preparation step (contamination by pathogens and/or proliferation of microorganisms) and two in the ampoule-filling and -sealing step (cross-contamination by metabisulphite and contamination by pathogens). After assessing the control measures, CCPs were determined in the hazards with codes 2, 9 and 12, which could be managed by an HACCP plan. The remaining hazards were managed by establishing OPRPs. It can be concluded, that implementation of the ISO 22000 standard in the food supplement industry guarantees food safety and helps to improve their competitiveness in the global market. In this study, the company in Spain achieved the ISO 22000 certification, thus guaranteeing food safety, which may contribute to increase its share market and to enter new markets (Fernández-Segovia et al., 2014).

ISO 22000 in Food Service providers In several articles ISO 22000 was assessed after implemented in bars and restaurants (Brazil), catering services (Poland), hotels (Taiwan) and in hospitals (Tunisia & Turkey). Food environmental service and FSMSs according to two checklists, based on Brazilian Technical Standards Association ISO 22000 and 14001, were assessed. This exploratory and descriptive study investigated food services of the Federal District in Brazil. A total of 37 food services were selected from the list of the Brazilian Association of Bars and Restaurants by simple random sampling. Only five food services employed dietitians to supervise meal production. These establishments achieved the highest ISO compliance, even though no establishment had more than 50% ISO 14001 or 22000 compliance. Restaurants showed little concern for the environment and disobeyed waste disposal laws by not separating recyclables from non-recyclables. Moreover, these food services did not have safe meal production systems, evidenced by non-conformity with the reference standards. In conclusion, food services supervised by dietitians are better prepared to produce safe foods, but the implantation and consciousness of employees on the system is still a great challenge in this sector (Santos et al., 2012). It is clearly noticed that prestige and trustworthiness are the benefits that may motivate hoteliers to obtain the accreditation of quality. A firm could lose its competitive position in the international market as well as the domestic one by failing to pay attention to food safety management issues. A survey investigation of three types of stakeholders in 29 hotels across Taiwan was performed. The officials and team leaders of hotel inspection and supervision center from government tourism bureau, the hotel front and back of the top hotel managers and first line managers plus employees, participated in the study. It was concluded that successful ISO 22000 implementation requires changes within a structural organization with clearly defined

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A decade of Food Safety Management System based on ISO 22000: A GLOBAL overview

responsibilities and authorities, besides well-defined training goals and measurable objectives to overcome the obstacle. These findings of the study suggested that ISO 22000 can be an effective strategy to improve managerial efficiencies and maintain competitiveness (Wang et al., 2011). The goal of the study, was to analyze the effectiveness of training provided to employees in a catering company in Poland with implemented FSMS pursuant to ISO standard of 22000 series and to determine the risk of making mistakes by those employees, when fulfilling their on-the-job duties owing to insufficient assimilation of the knowledge introduced during the training. The study allowed the verification of the level of employees' knowledge in the company prior to and after the training. The acceptable risk of errors made by the employees in the catering company with the implemented FSMS pursuant to the ISO standard of 22000 series, was proved exclusively referring to the employees hired as cooks. The statistical analysis using a chi-square test, confirmed the statistically significant relation that exists between the increase in knowledge and the job position in the company. The applied risk assessment proved to be a useful method to analyze the results of staff training effectiveness, leading to enhance conclusions by means of statistical methods. It was confirmed that staff trainings played a significant role in the upskilling of the catering employees and in minimizing the risk of making mistakes (Trafialek J and Pawlowska J, 2013). Abouda el al. (2014) studied the bacteriological quality of food served to patients in the Sousse Hospital (Tunisia) and they recommended the application of good hygiene practices to work towards the implementation of the food safety preventive system (ISO 22000) based on the principles of HACCP. Patients' satisfaction before and after HACCP/ISO 22000 implementation was studied at hospital food service in the Ankara University Hospital (Turkey). The subjects were 466 patients consisting in 191 males and 275 females from different clinics in one university hospital. The questionnaire of food and food service satisfaction of patients were filled by an intern dietician. The results showed that the satisfaction of patients was increased after HACCP and ISO 22000 implementation not only for food quality but also related to organoleptic quality, menu and service specifications (Uyar et al., 2012).

ISO 22000 related with consumers’ attitudes In the region of South-East Poland it was found that, when choosing food, the consumers checked, in the first place, the expiration date (93.7 % of the responses), next price (63.6 %), and at last composition of food product (62.2 %). The level of consumer interest in information on whether or not the product was produced in accordance with the principles of HACCP/ISO 22000 (11.9%) was very low. Women were interested in the composition of food more often than men: 69% of all women participating in the survey. The graduates of universities (51.1%) paid attention to that particular element shown on the food label more often than other respondents. The composition of food was more important for the city residents surveyed than for the rural residents. The composition of a food product was particularly important for the persons living in the households with a monthly income of more than net 1,600zl per person. The respondents from the households with incomes not exceeding 800zl regarded this element on the food label as the least important for them. For those consumers, the most important factor that affected their food purchase was the price in the first place. The women surveyed (76.5 %) paid more attention to the information on whether the product was produced in accordance with the principles of HACCP/ISO 22000. The respondents aged above 40 (38.2%) reported this information to be important for them (Niewczas M, 2013). Consumers’ attitudes, knowledge and practices governing food safety in the Middle East and North Africa (MENA) are understudied. There

are no studies investigating the food marketing implications of these factors in the context of eating out or ordering delivery. In this study, a choice experiment (CE) was conducted to study consumers’ preferences and purchasing behavior governing shawarma sandwiches, a high risk Lebanese fast food, purchased from quality management (ISO 9001) and safety (ISO 22000 and ServSafe) certified food shops in Beirut, Lebanon. Moreover, the study looked at the effectiveness of information provision on each type of certificate in influencing consumers’ purchasing decisions. Estimation of data revealed a strong overall preference for all types of certified shawarma sandwiches and a strong heterogeneity in the degree of this preference in the Beirut population. These results also suggested that once informed about the role of each certificate, preference for each food certificates increased significantly, but more and in a much more variegated manner for the food safety certificates, ISO 22000 and ServSafe than for ISO 9001. The determinants of preference shift (mostly increase) that are affected by information provision, are herein studied. Results suggested consumers’ mental conception of food safety revealed by their knowledge, perceptions, attitudes, preventive behavior and purchasing habits, are more important respect to objectively measured sociodemographic characteristics. This poses a challenge for food safety marketing research, not to mention the difficulty of collecting this type of data (Chalak A and Abiad M, 2012).

Conclusions In conclusion, the ISO 22000 in the last decade has demonstrated to be a useful tool for food safety management and specifies the system requirements needed for monitoring and mastering hazards to ensure food suitability for human and animal consumption as proved by its application growth around the world. In addition, ISO 22000 implementation is an effective strategy to improve managerial efficiencies and maintain competitiveness at food services as catering, hotels, restaurants, bars and hospitals. On one hand, attending to developing countries, Public Administration should make an economical effort to implement this standard in SMEs, in order to improve consumers’ health and international market competitiveness. On the other hand, food safety knowledge should be included in children and adults education. Improved product quality and safety have been identified as the major benefits of implementing ISO 22000. Other benefits highlighted include enhanced employee skills, improved company image, increased product sales, increased market share and access to new markets. As a result, consumers’ attitudes and preferences tend towards preferring food from companies that have implemented ISO 22000 as they gain a higher position in the trust of their clients. ISO 22000 is a standard which its main characteristic is that is specifically focused on food safety and not quality, giving the highest priority to consumers’ health. This relatively new sight on the whole food chain industry is becoming more and more the greater concern for public administrations, as the globalization has brought new issues on food safety which will be increasing in the following years, due to the internalization of the market and the high variability on countries legislation. In all likelihood, during the 21st century, ISO 22000 will continue taking a leading international role ensuring consumers’ health and food economies’ benefits.

Conflict of Interest The authors declare that there are no conflicts of interest.

Acknowledgements This work has been supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (AGL2013-43194-P).

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A microplate adaptation of the thiobarbituric acid reactive substances assay to determine lipid peroxidation fluorometrically in small sample volumes Espín S.1,2 a*, Sánchez-Virosta P.1,2 a, García-Fernández A.J.2, Eeva T.1 1 Department of Biology, University of Turku, 20014 Turku, Finland. 2 Area of Toxicology, Department of Health Sciences, University of Murcia, Campus de Espinardo, 30100 Murcia, Spain. a Note: S. Espín and P. Sánchez-Virosta have equal contribution to the article.

Abstract: A simple, fast, reproducible and low-cost assay for thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) has been adapted for use with a microplate spectrofluorometer. The technique allows rapid analysis of multiple samples and requires a very small sample volume (50 µl of red cell homogenates from passerine birds at protein concentrations of 3.4-8.9 mg/ml in this study), what is of special interest for biomonitoring studies working with small-sized animals from which a limited amount of sample can be obtained. The TBARS test involves the reaction of thiobarbituric acid (TBA) with malondialdehyde (MDA) under heating (90°C), leading to the formation of products that can be measured fluorometrically using black 384-well plates at excitation/emission wavelength of 532/553 nm. The concentrations of peroxidized lipids in samples were determined by extrapolation from a MDA standard curve. Two different excitation/emission combinations (532/553 and 530/550 nm) were used and both pairs were suitable for this technique. Intraand inter-plate variability was < 20% and a good linearity of the standard curve was observed (R2 > 0.99). The research use of this microplate adaptation of the TBARS assay will provide further data and understanding of lipid peroxidation reducing the limitation of small sample volume. Keywords: lipid peroxidation; TBARS; malondialdehyde; oxidative stress; erythrocytes. Resumen: Una adaptación de microplacas del ensayo de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico para determinar la peroxidación lipídica fluorométricamente en pequeños volúmenes de muestra. El presente trabajo adapta un ensayo sencillo, rápido, reproducible y económico de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) para su uso en espectrofluorómetro para microplacas. La técnica permite un análisis rápido de múltiples muestras y requiere un mínimo volumen de muestra (50 µl de un homogeneizado de eritrocitos de aves paseriformes a una concentración proteica de 3.48.9 mg/ml en este estudio), lo cual resulta de especial interés en estudios de biomonitorización que trabajan con animales de pequeño tamaño de los que se puede obtener una cantidad de muestra limitada. El ensayo TBARS consiste en la reacción del ácido tiobarbitúrico (TBA) con malondialdehído (MDA) en condiciones de calor (90°C), formando productos que pueden medirse fluorométricamente usando microplacas negras de 384 pocillos a 532/553 nm de excitación/emisión. La concentración de peróxidos lipídicos en la muestra se determinó por extrapolación de una curva de MDA. Se utilizaron dos combinaciones diferentes de excitación/emisión (532/553 and 530/550 nm) y ambas fueron apropiadas para la técnica. La variabilidad intra- e inter-placa fue < 20% y se observó una buena linealidad de la curva estándar (R2 > 0.99). El uso científico de la adaptación a microplaca del ensayo TBARS proporcionará más datos y comprensión sobre la peroxidación lipídica reduciendo la limitación que supone los pequeños volúmenes de muestra. Palabras clave: peroxidación lipídica; TBARS; malondialdehído; estrés oxidativo; eritrocitos.

Introduction *e-mail: silvia.espin@um.es 94

Oxidative processes and the subsequent generation of free radicals are normal in the cellular metabolism (Finkel and Holbrook, 2000). In response to this processes, organisms are equipped with an antioxidant defense system able to inhibit the generation of reactive oxygen species (ROS) and reduce the oxidation and the consequent cellular damage (McGraw, 2011). However, different exogenous factors such as the exposure to environmental pollutants, radiation or infections can deplete the major antioxidants of cells and induce ROS generation leading to oxidative stress (imbalance between the antioxidant and pro-oxidant levels in favor of the latter; Halliwell and Gutteridge, 2007), which may cause oxidative damage to membrane lipids (Ahmad, 1995; Schwarz, 1996; Bayoumi et al., 2001; Ercal et al., 2001; García-Fernández et al., 2002; Azzam et al., 2012). Lipids are essential to maintain the structure of cell membranes and control the function of cells, and they are the primary targets of the attack by ROS (Yin et al., 2011). The process in which oxidants attack lipids containing carbon-carbon double bond(s), especially polyunsaturated fatty acids (PUFAs), is called lipid peroxidation (Ayala et al., 2014). This process results in a wide variety of oxidation products, the main primary products being the lipid hydroperoxides (LOOH), and two secondary products extensively studied the aldehydes malondialdehyde (MDA) and 4-hydroxynonenal (4-HNE) (see references in Ayala et al., 2014). Malondialdehyde and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) have been widely used as standard biomarkers of lipid peroxidation for many years because of its reaction with thiobarbituric acid (TBA) and its simplicity and low cost (Ayala et al., 2014; Niki, 2014). The TBARS test involves the reaction of MDA with TBA under acidic condition and heating, leading to the formation of pink-colored and fluorescent products that can be measured by colorimetric and fluorometric methods. Although originally it was accepted that the TBARS assay measured MDA, it is not exclusively measuring MDA, but also other aldehydes and decomposition products from hydroperoxides. However, even though there remains a controversy regarding the specificity of TBARS and artefactual production during analytical processes, it still remains among the most popular and commonly applied assays to determine lipid peroxidation (Niki, 2014). In the field of toxicology, numerous studies have observed an increase in TBARS values as a response to pollutant-related oxidative stress in different organisms (e.g. Howlett and Avery, 1997; Oakes and Van Der Kraak, 2003; Stepić et al., 2012; Espín et al., 2014a; Osičková et al., 2014). Particularly in avian ecotoxicology, the number of studies evaluating the effects of pollutants such as metals on oxidative stress biomarkers (including TBARS) has significantly increased in the last years (Mateo and Hoffman, 2001; Mateo et al., 2003; Koivula and Eeva, 2010; Martínez-Haro et al., 2011; López-Antia et al., 2013; Espín et al., 2014a; 2014b; Ortiz-Santaliestra et al., 2015; Espín et al., 2016a), and results suggest that TBARS is a convenient, simple and low-cost method that may function as a useful biomarker of pollutantinduced lipid peroxidation in birds. When working with wild species and particularly with small animals (e.g. passerine birds), only minimal volumes of sample are available for the analysis of a battery of biomarkers. Therefore, adaptations of techniques to minimize the sample volume are needed in order to be able to evaluate those biomarkers in a wide range of species (Koivula et al., 2011; Espín et al., 2016b). The main aim of this study is to describe a microplate TBARS assay to determine lipid peroxidation in small sample

A microplate adaptation of the thiobarbituric acid reactive substances assay to determine lipid peroxidation fluorometrically in small sample volumes

volumes using red blood cells (RBC) from nestlings of a passerine bird species (great tit, Parus major). For this purpose, we developed an adaptation of the TBARS technique described by Alonso-Álvarez et al. (2008) following the technique by Aust (1985) with different modifications to minimize the sample volume and by using fluorometry. The principle of the assay is based on the fact that different tissues contain a mixture of TBARS, including lipid hydroperoxides and aldehydes, and their concentrations increase due to oxidative stress (Alonso-Álvarez et al., 2008).

Reagent preparation The sodium chloride (NaCl, 0.9%) was prepared by dissolving 0.9 g NaCl (27810.295, PROLABO, VWR Chemicals™) in 100 ml milliQ-water. For TBARS reagent preparation (15% trichloroacetic acid, TCA; 0.25 N hydrochloric acid, HCl; 0.375% 2-thiobarbituric acid, TBA), 7.5 g TCA (1.00807.0100, EMSURE, Merck™), 0.1875 g TBA (T-5500, Sigma™) and 1.035 ml HCl (37%; 30721, Riedelde Haën™) were dissolved in 50 ml milliQ-water. The butylated hydroxytoluene (BHT, 2%) was prepared by dissolving 0.2 g BHT (B-1378, Sigma™) in 10 ml ethanol (99.5%, ALTIA Oyj™). Finally, the stock malonaldehyde solution (MDA, 417 µM) for the standard curve was prepared by dissolving 17.25µl MDA (malonaldehyde bis (dimethyl acetal) or 1,1,3,3Tetramethoxypropan 99%; 10,838-3, Aldrich™) in 250 ml ethanol. All the reagents were stored at 4ºC.

Method procedure

standard dilution, control (salmon liver) or sample is pipetted in a transparent 384-well plate in triplicate. Then, 50 µl of BCA reaction mix are added to each well with a multichannel pipette and briefly mixed using a plate shaker. Then the plate is incubated at 37 ºC for 30 min. Finally, the protein concentration is measured spectrophotometrically at an absorbance of 562 nm. Fifty µl of each homogenate was split in a 1.5-ml microcentrifuge tube for TBARS assay, and the remaining was divided into different microcentrifuge tubes for other oxidative stress measurements. For 5 of the samples, 250 µl of homogenate was divided in 5 tubes (50 µl per tube) in order to use them as controls in the different plates and evaluate the inter-assay precision. All measurements (standards, controls and samples) were done in triplicate in each plate to evaluate the intra-assay variability. Seven standard dilutions of MDA (from 0 to 0.5 nmol/ml) were prepared using the stock MDA solution (417 µM) and milliQ-water according to the instructions provided in Table 1. Firstly, 100 µl from the stock MDA solution were dissolved in 900 µl of millliQ-water to prepare solution C, 100 µl from solution C were dissolved in 900 µl of milliQ-water to prepare solution B, and 149.9 µl from solution B were dissolved in 850.1 µl of milliQ-water to prepare solution A. The standard point number 7 was prepared by dissolving 800 µl from solution A in 200 µl of millliQ-water, the standard point number 6 was prepared by dissolving 500 µl from standard 7 in 500 µl of milliQwater, etc., following the process shown in Table 1.

TBARS assay description

Sample collection This method is described for bird erythrocytes, but it can be applicable to other biological sample types. Blood samples from great tit nestlings (14 days old) were collected during the breeding season 2015 in southwestern Finland. Blood samples (approximately 75 µl) were collected by venipuncture of the brachial vein with a needle and using sodium-heparinized microhematocrit capillary tubes (80 iu/ml, Marienfeld™). Tubes were centrifuged in the field (4400 g, 5 min) and RBCs were split in 200-µl microcentrifuge tubes and kept in liquid nitrogen and then conserved at −80°C in the laboratory. A total of 100 RBC samples were used in this study.

Sample and MDA standard curve preparation RBC were homogenized in 0.9% NaCl to maximize the volume and to get protein concentrations between 3.4 and 8.9 mg/ml, working on ice to avoid oxidation. The protein concentration (mg/ml) was measured using the Pierce™ BCA Protein Assay Kit from ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. In brief, the BCA reaction mix is made according to the kit instructions (50:1, BCA Reagent A:B). A serial dilution of bovine serum albumin (BSA, 10 mg/ml) is used as protein standard. One µl of each BSA

This method is described to work in sets of 19 different unknown samples, 5 control samples and a standard curve of 7 points. Therefore, 95 unknown samples were analyzed in 5 different assays, and the other 5 unknown samples were used as control samples in all the assays. Several sets can be done the same day, and a standard curve should always be included in each assay in order to calculate the final MDA concentration. Before starting the assay, a set of 1.5-ml microcentrifuge tubes containing 500 µl of water is prepared (31 tubes in total, one per standard point, sample and control). Tubes are labelled with the standard number or sample identification code and a glass insert (with conical base and plastic bottom spring, 6 x 29 mm) is introduced inside each tube (the water will facilitate the heat transfer to the sample that will be inside the glass insert). The standard curve and a 1:100 mix of BHT 2% and TBARS reagent (a mix of 40 µl BHT and 4 ml TBARS reagent will be needed for each set of 19 samples, 5 controls and the standard curve) are prepared daily. All reagents except samples, controls and standards must be equilibrated to room temperature before beginning the assay. A diagram summarizing the assay protocol is shown in Figure 1.

Table 1: Standard curve preparation (7 points) for a microplate adaptation of the TBARS assay.

MDA concentration (nmol/ml) Standard number MilliQ-water (µl) MDA (µl)

0 1 1000 0

0.03125 2 500 500 from 3

0.0625 3 500 500 from 5

0.09375 4 977.52 22,48 from B

0.125 5 500 500 from 6

0.25 6 500 500 from 7

0.5 7 200 800 from A

0.625 A 850.1 149.9 from B

4.17 B 900 100 from C

41.7 C 900 100 from Stock

417 Stock

MDA: malondialdehyde Table reading: 100 µl from the stock MDA solution were dissolved in 900 µl of millliQ-water to prepare solution C, 100 µl from solution C were dissolved in 900 µl of milliQwater to prepare solution B, and 149.9 µl from solution B were dissolved in 850.1 µl of milliQ-water to prepare solution A. The standard points (1-7) were prepared by dissolving X µl from solution X in X µl of millliQ-water as shown in the table.

Figure 1 Diagram summarizing the microplate TBARS assay protocol.

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Espín S, Sánchez-Virosta P, García-Fernández A.J, Eeva T. Table 2: Validation parameters (i.e. intra/inter-assay coefficient of variability and linearity of the standard curve) for a microplate adaptation of the TBARS assay.

Excitation/emission Sample type wavelength

Intra-assay CV (%)a

Inter-assay CV (%, global)b

Inter-assay CV (%, different days)c

532/553 nm

2.73 (1.78-4.02) 4.13 (2.70-5.35) 2.66 (1.86-3.15) 4.13 (3.29-5.44)

15.95 (11.66-19.36) 12.03 (3.34-27.03) 15.38 (10.94-20.24) 11.03 (1.31-22.51)

14.38 (13.34-16.05) 4.85 (0.53-16.19) 13.99 (10.80-17.04) 3.87 (0.06-15.04)

530/550 nm

Control Standard curve Control Standard curve

Inter-assay CV (%, different researchers)d 5.89 (1.67-8.59) 8.40 (0.76-26.00) 4.98 (0.55-7.99) 7.30 (0.72-21.65)

Linearity (R2)e

0.995 (0.991-0.999) 0.994 (0.991-0.998)

Intra-assay precision reflects variability among triplicates within the same assay run (same microplate) (mean, min and max CV for 5 control samples or 7 standard points in the 5 plates) b Inter-assay precision (global) reflects variability among microplates for the same sample/standard (mean, min and max CV for 5 control samples or 7 standard points) c Inter-assay precision (different days) reflects variability with time (mean, min and max CV for 5 control samples or 7 standard points) d Inter-assay precision (different researchers) reflects variability among researchers (mean, min and max CV for 5 control samples or 7 standard points) e Linearity calculated using 7 different standard points from 0 to 0.5 nmol MDA/ml (mean, min and max R2 for 5 standard curves)

The tubes with 50 µl of the RBC homogenates and 7 tubes with 50 µl of each standard point are kept on ice and mixed with 100 µl of the mix TBARS reagent plus BHT. The whole mix is transferred to glass inserts kept inside appropriately labelled 1.5-ml microcentrifuge tubes with 500 µl of water, and then warmed for 30 min at 90ºC in a thermoblock. During the incubation in the thermoblock, keep the microcentrifuge tubes open and place stainless steel balls (6 mm) covering all the glass inserts. The steel balls prevent the sample evaporation but allow the escape of excess gas. After the incubation, the steel balls are removed, the tubes are closed carefully with the inserts inside, and the samples are cooled in ice-water for 10 min to stop the reaction. The tubes are centrifuged for 15 min at 6ºC and 2100 g. Subsequently, the 7 standard points, samples and controls are pipetted in the microplate in triplicate (a total of 93 wells are used). A volume of 30 µl of supernatant in triplicate (30 µl per well) is pipetted in black 384-well plates (OptiPlate, PerkinElmer), keeping the plate on ice while pipetting. There is no specific pattern for using the wells on the microplate and it is not necessary to use all the wells on the microplate at one time. Supernatant has to be taken with caution while pipetting it in the microplate to avoid the pellet-supernatant mixture after centrifugation. Glass inserts with conical base and plastic bottom spring (6 x 29 mm) are recommended since the conical base will help to keep the pellet at the bottom of the insert after centrifugation. Some trials were done using glass inserts with flat base and there were pellet-supernatant mixture problems. It is also possible to filter the sample before pipetting. However, part of the sample can be lost during this process and it should be done carefully in order to have enough volume for the triplicates (90 µl in total). Finally, the fluorescence intensity (FI) is measured at an excitation/emission wavelength of 532/553 and 530/550 nm with the microplate spectrofluorometer (EnSpire 2300 Multilabel Reader, PerkinElmer™).

Calculations After calculating the mean fluorescence for triplicate measurements of each standard, control and sample, the coefficient of variability (CV) for triplicates is determined as follows (equation 1): CV (%) = (SD/M) x 100

(1)

where SD is the standard deviation and M is the arithmetic mean value for the repeated measurements. If a high dispersion of triplicates is observed (CV values > 20%), this may be due to pipetting errors or presence of bubbles in the well. A meticulous pipetting is recommended to prevent sample splash from the wells and the plate can be carefully tapped with the fingers to remove bubbles before the FI measurement. The fluorescence values of each standard are plotted as a function of the MDA concentration by linear regression analysis [y = (slope) x + y-intercept]. The concentrations of peroxidized lipids in samples and controls are determined by extrapolation from the MDA standard curve from each assay. This way, we will obtain the nmol of MDA per ml of homogenate (equation 2). 96

MDA (nmol/ml homogenate) = [(FI – y-intercept) / slope] (2) If MDA is not detected in the samples, this may be due to a low MDA concentration or the sample being too diluted, thus a lower RBC dilution in order to have a more concentrated homogenate may help to detect MDA. As explained before, the total protein concentrations were analyzed in the same homogenates and were expressed as mg per ml of homogenate. The final MDA concentration can be expressed in relation to the mg of protein in RBC homogenates (nmol of MDA per mg of protein). Alternatively, the final MDA concentration can be expressed in relation to the amount or volume of the original tissue (e.g. nmol of MDA per mg of RBC, nmol of MDA per ml of blood). In this case, the sample values must be corrected for any dilutions performed during sample preparation, and the original sample amount/volume must be recorded.

Fluorescence measurement (excitation and emission wavelengths) In fluorometric determination of TBARS, discrepant data for excitation and emission wavelengths have been reported in literature (Yin, 1995). Although TBARS assay can be measured by colorimetric methods (absorbance at 535 nm), higher volumes of sample are needed to obtain reliable data. However, fluorometric assays may be more sensitive and, therefore, more suitable for small amount of sample and samples containing low lipid peroxidation products (Yagi, 1976; Jo and Ahn, 1998). According to Yagi (1976), the excitation/emission maxima of the MDA-TBA reaction product were observed at 532/553 nm, while Yin (1995) found an excitation/emission maxima of the MDA-TBA product at 536/549 nm. The latter recommends excitation/emission wavelengths as close as possible to these values in order to obtain the greatest sensitivity. In the present study, the fluorescence excitation/emission spectrum was studied on a microplate spectrofluorometer (EnSpire 2300 Multilabel Reader, PerkinElmer™) by scanning wavelengths of an excitation light while a wavelength in the emission detector was fixed and vice versa, and the highest fluorescence intensity was observed at an excitation wavelength of 530-535 nm and an emission wavelength of 550-555 nm. Therefore, the fluorometric measurement at excitation/emission wavelengths of 532/553 nm reported by Yagi (1976) was used. This was possible because of the ability of our instrument to select any specific wavelength; however, some instruments do not have this flexibility. Therefore, all the plates were also measured at 530/550 nm according to other methods described in the literature. The excitation/emission wavelength of 536/549 nm could not be tested since a minimum distance of 20 nm between excitation and emission wavelengths is needed in our instrument. Figure 2 shows the mean standard curves plotting fluorescence and MDA concentration (nmol/ml) obtained at 532/553 nm and 530/550 nm. Measurements at excitation/emission wavelengths of 532/553 nm and 530/550 nm provided very similar intra- and inter-assay CV and fluorescence intensity for control samples and standards, and the linearity of the standard curve showed R2 values > 0.99 (Table 2), thus both excitation/emission pairs seem to be suitable for this technique.

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A microplate adaptation of the thiobarbituric acid reactive substances assay to determine lipid peroxidation fluorometrically in small sample volumes

Figure 2: Standard curves plotting fluorescence intensity (FI) and MDA concentration (nmol/ml) at 532/553 nm and 530/550 nm of excitation/emission wavelengths. Each standard point corresponds to the mean value ± SD of 5 different curves (in each curve all the standard points were measured in triplicate).

Method validation The precision of an assay can be described using repeatability and reproducibility tests. Repeatability is used to prove the ability to provide similar results when the measurement is repeated in the same sample under the same operating conditions and by the same operator. It is also called intra-assay precision. Reproducibility expresses the ability to provide similar results when the technique is repeated in the same sample but by different operators or different laboratories. The effect of random events on the precision of the assay can be also tested, and a typical variation to be studied is the inter-assay precision in different days. The precision of the analytical procedure is usually expressed as the CV of a series of measurements. Repeatability and reproducibility acceptance criterion was set at CV ≤ 20%. To validate the repeatability and reproducibility of the method, standards, samples and aliquots of a subset of 5 different samples (control samples) were analyzed in the 5 assays developed by 2 different researchers (S.E. and P.S-V.) in 2 different days. All measurements (standards, samples and controls) in each plate were done in triplicates to evaluate the intra-assay precision, reflecting the variability among triplicate determinations within the same assay run. The intra-assay CV was < 10% for the 100 samples/controls and the standards analyzed. The inter-assay variation when comparing assays done at different days was < 20% for both the standard curve and the control samples, and the variation when the standards and control samples were analyzed by different researchers was < 10% (Table 2). These results indicate that the method can be considered acceptable for the analysis of TBARS. The linearity of the standard curve is evaluated to determine the proportionality between the concentration of MDA in the standard points and the FI. In the present study, the linearity was calculated using 7 different standard points (from 0 to 0.5 nmol MDA/ml, Table 1). Each standard point was analyzed in triplicate and a different standard curve was analyzed in each assay. Linear regression of data to a calibration curve was performed, and the linearity was accepted when R2 > 0.95. A good linearity was found in all the assays, since R2 was above 0.99 (Table 2).

Conclusiones The microplate assay herein described is a simple, fast, reproducible and economical fluorometric method for TBARS determination in small sample volumes. Only 50 µl of diluted RBC homogenates are needed, what is of special interest for biomonitoring studies working with animals of small size from which a limited amount of sample can be obtained non-destructively. In addition, multiple samples may be analyzed simultaneously. This TBARS microplate assay format may be easily adapted to measure TBARS in different sample types and species using the appropriate concentrations in the standard curve. The research use of this microplate adaptation of the

TBARS assay will provide further data and understanding of lipid peroxidation in different organisms reducing the limitation of small sample volumes.

Acknowledgments This work was supported by the Academy of Finland under project 265859 to T. Eeva and by Séneca Foundation (CARM) under MASCA’2014 Project (19481/PI/14) to A.J. García-Fernández. S. Espín is financially supported by the Academy of Finland and by the Consejería de Educación y Universidades de la CARM through Fundación Séneca-Agencia de Ciencia y Tecnología de la Región de Murcia (Project 20031/SF/16 to S. Espín). P. Sánchez-Virosta is funded by the University of Turku Graduate School – UTUGS. Thanks to M.P. Aldeguer and A. Salas for their help during the first trials of the technique, M. Kanerva for her help with the fluorometric measurements, and S. Ruiz, L. Winder, M. Rainio, and J. Nurmi for their help during sample collection. Special thanks to R. Mateo, M.E. Ortiz-Santaliestra and M. Martínez-Haro for their collaboration in teaching the original technique for higher sample volumes.

Declaration of interest statement The authors declare that they have no conflict of interest.

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Lesiones histopatológicas en peces originadas por la exposición a contaminantes emergentes: recopilando y analizando datos Oropesa AL*1,2, Moreno JJ1,3, Gómez LJ2,3 1

Área de Toxicología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Avda. de la Universidad, s/n, 10003 Cáceres, Spain. INBIO G+C Research Institute, University of Extremadura, Avda. de la Universidad, s/n, 10003 Cáceres, Spain. 3 Área de Anatomía Patológica, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Avda. de la Universidad, s/n, 10003 Cáceres, Spain. 2

Resumen: Los contaminantes emergentes son compuestos de diferente origen y naturaleza química cuya presencia en el medio ambiente, o las posibles consecuencias de la misma, han pasado en gran parte inadvertidas. Son compuestos de los cuales se posee poca información sobre su impacto en los distintos compartimentos ambientales y que, por tanto, precisan investigación. El creciente énfasis en la evaluación y monitoreo de los contaminantes en los ecosistemas acuáticos ha revelado la necesidad de utilizar biomarcadores apropiados, siendo las lesiones histopatológicas una herramienta cada vez más utilizada. El presente trabajo recoge una revisión bibliográfica sobre la presencia de contaminantes emergentes en el medio acuático, así como, de las lesiones histopatológicas originadas en peces como consecuencia de la exposición a estos compuestos. Se puede indicar que los fármacos son el grupo de contaminantes emergentes mayoritariamente detectado en el compartimento acuático (incluyendo aguas superficiales y sedimentos). Son el 17α-etinilestradiol (estrógeno sintético) y el nonilfenol (surfactante) los contaminantes emergentes más ampliamente estudiados en peces desde el punto de vista Histopatológico; y también se observa que existe predominancia de ciertas lesiones en cuanto al órgano estudiado y la exposición a determinados grupos de contaminantes emergentes. Por todo ello, se puede considerar a las lesiones histopatológicas como un buen biomarcador de exposición a contaminantes emergentes y de los efectos originados por ellos. Las lesiones histopatológicas pueden: alterar las funciones reguladas por los órganos afectados, las cuales están relacionadas con procesos biológicos importantes; reflejar cambios subclínicos originados por la exposición a bajas concentraciones de tóxicos (particularmente importante en el caso de los contaminantes emergentes) así como permanecer en el tiempo si las condiciones ambientales no varían. Palabras claves: Contaminantes emergentes; Histopatología; Peces; Toxicidad. Abstract: Histopathological lesions in fish caused by exposure to emerging pollutants: collecting and analysing data.

as a good biomarker of exposure and effects of emerging pollutants. Histopathological lesions can: disturb functions regulated by the affected organs that can be related with important biological processes; reflect subclinical changes caused by exposure to low concentrations of toxics (paticularly important in the case of emerging pollutants) as well as remain in time if the environmental conditions do not vary. Key words: Emergent pollutants; Fish; Histopathology; Toxicity.

Introducción La presencia y los efectos tóxicos originados por los contaminantes emergentes (CEs) en el medio acuático constituyen un aspecto de interés global. El término “contaminantes emergentes” se refiere a aquellas sustancias químicas, naturales o sintéticas, que están liberándose continuamente a bajas concentraciones (generalmente del orden de μg/L o ng/L) al medio acuático, fundamentalmente a través de los efluentes de las estaciones de tratamiento de aguas residuales (ETARs), como consecuencia de su amplio uso humano, así como de su dificultad de degradación por los tratamientos aplicados en las ETARs. Se trata de sustancias que, por lo general, son ubicuas así como persistentes en el medio acuático, no existiendo en la actualidad criterios para su regulación destinados a proteger la salud humana y ambiental (Li et al., 2015). Como indicábamos anteriormente, estos compuestos entran en el compartimento acuático principalmente a través de los efluentes de las ETARs, ya que son excretados por la orina o por las heces, también algunos de ellos son productos de uso doméstico, otros tienen origen hospitalario o incluso industrial y algunos son utilizados en acuicultura (Li et al., 2015). Siguiendo las consideraciones realizadas por Blinova et al. (2010), Stuart et al. (2012) y Valcárcel et al. (2012), los CEs pueden clasificarse en los siguientes grupos: productos farmacéuticos, productos relacionados con el estilo de vida, productos de cuidado personal, surfactantes y drogas de abuso.

Emerging pollutants are compounds of different origin a chemical nature, which a presence in the environment, or their posible consequences, have largely gone unnoticed. They are compounds of which relatively little is known about their impact in the different environmental compartments, therefore, they need investigation. The increasing emphasis on the assessment and monitoring of contaminants in the aquatic ecosystems has revealed the need to use appropiate biomarkers, being the histopathological lesions a tool increasingly used. In the current work a review of the literatura on the presence of the emerging pollutants in the aquatic compartment, as well as, of the histopathological lesions caused by exposure to these compounds in fish was performed. It can be indicated that pharmaceutical compounds are the group of emerging pollutants mainly detected in the quatic environment (including superficial water and sediments). 17α-ethinylestradiol (synthetic estrogen) and nonylphenol (surfactant) are the most widely emerging pollutants studied in fish from a Histopathological point of view; and also it is observed that there is a predominance of certain lesions in terms of the organ studied and exposure to certain groups of emerging pollutants. For all that, histopathological lesions can be considered

Metodología: estrategia de recolección de datos

*e-mail: aoropesa@unex.es

Concentración de contaminantes emergentes en aguas

Se realizó una revisión sistemática de la literatura científica relacionada hasta Febrero de 2017 en las principales bases de datos: ISI Web of Knowledge, PubMed, Scopus y Google®Scholar. En relación a los parámetros de búsqueda, las palabras clave (keywords) empleadas durante la adquisición de datos incluyeron las siguientes: concentration, surface water, sediment, emerging pollutants y cada uno de los grupos (incluyendo los nombres de los compuestos) de CEs descritos en la clasificación (para elaborar el apartado de Concentración de contaminantes emergentes en aguas superficiales y sedimentos); cada uno de los tipos de CEs descritos en la clasificación, histology y fish (para elaborar el apartado de Lesiones histopatológicas en peces originadas por la exposición a contaminantes emergentes). Estos términos fueron empleados en tándem usando operadores Boleanos. Se siguió el criterio de seguridad y relevancia de las fuentes consultadas. Se revisó literatura perteneciente a autores de países de los diferentes continentes, lo que indica el interés por esta temática. A pesar de haber realizado una búsqueda extensa, al tratarse de una temática tan amplia, puede haber artículos cuya información no haya sido recogida.

Oropesa AL, Moreno JJ, Gómez LJ.

superficiales y sedimentos La mejora en la sensibilidad de las técnicas analíticas ha permitido que los CEs, que anteriormente eran indetectables, estén siendo actualmente detectados en el ambiente acuático. En esta revisión nos centramos en la contaminación por estas sustancias en el ambiente acuático, aguas superficiales y sedimentos, por tratarse dichas matrices de los principales reservorios de CEs, así como de las principales fuentes de exposición a ellos por parte de los organismos acuáticos. En el material suplementario proporcionamos una tabla (Tabla S.1) que recoge las concentraciones de CEs detectadas en el medio acuático incluyendo aguas superficiales y sedimentos. A partir de la Tabla S.1 se ha elaborado la Figura 1 donde podemos indicar que el grupo de los fármacos constituye el tipo de CE más frecuentemente detectado en el medio acuático. Dentro de ellos, el grupo de fármacos con mayor frecuencia de detección en aguas superficiales son las hormonas, seguido de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), antibacterianos y antilipémicos. En sedimentos también las hormonas constituyen el grupo mayoritario de CEs detectados más frecuentemente, seguido de los antibacterianos, AINEs y analgésicos. En relación al nivel de hormonas detectadas en el medio acuático

encontramos que el 17α-etinilestradiol es el compuesto hormonal más frecuentemente detectado, habiéndose encontrado una concentración máxima de 0.83 μg/L en agua en el arroyo Itchepackesassa, Florida, USA (Kolpin et al., 2002) y 22.8 ng/g en sedimentos del río Anoia, España, (López de Alda et al., 2002). La estrona, otra hormona ampliamente detectada en el medio acuático, ha sido encontrada a una concentración máxima de 0.11 μg/L en agua por Kolpin et al. (2002) y 21.6 ng/g en sedimentos del río Dagu, China, (Lei et al. 2009). Dentro de la clase terapeútica de los AINEs se han detectado en el medio acuático ibuprofeno, diclofenaco, naproxeno y ketoprofeno. El diclofenaco ha sido el compuesto detectado a la concentración más elevada, 18.74 μg/L en agua del río Llobregat, España, (Ginebreda et al., 2010), siendo el ibuprofeno el AINE detectado a una concentración más alta en sedimentos, 41.41 ng/g en el río Umgeni en Sudáfrica (Matongo et al., 2015). En cuanto a los antibacterianos, el compuesto detectado con mayor frecuencia es el sulfametoxazol, encontrándose a una concentración máxima de 11.92 μg/L en agua del río Llobregat, España, (Ginebreda et al., 2010) y de 59 ng/g en sedimentos del río Haihe en China (Bu et al., 2013). Analgésicos como el paracetamol han sido detectados a una máxima concentración de 10 μg/L en el río Santa Cruz en USA (Kolpin et al., 2002) y a 29 ng/g en sedimentos del lago Míchigan, USA, (Blair et al.,

Grupos de CEs en aguas superficiales (%)

AINEs

Surfactantes Estimulantes Drogas de abuso

Fármacos

Antidepresivos Antiepilépticos Ansiolíticos Antihistamínicos Antilipémicos Antineoplásicos ß-bloqueantes Broncodilatadores

Antibacterianos

PCPs

Hormonas

F. gastrointestinales Anestésicos

Analgésicos

Grupos de CEs en sedimentos (%) AINEs

Estimulantes

Antibacterianos Fármacos PCPs

Hormonas

Figura 1: Grupos de Contaminantes Emergentes en aguas superficiales y sedimentos.

100

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Antidepresivos Antiepilépticos ß-bloqueantes F. gastrointestinales Analgésicos

Lesiones histopatológicas en peces originadas por la exposición a contaminantes emergentes: recopilando y analizando datos

2013).

Zumbro, USA, (Fairbairn et al., 2015).

El principal antilipémico detectado en aguas superficiales es el gemfibrozilo, mostrando su máxima concentración (7.78 μg/L) en el río Llobregat, España, (Ginebreda et al., 2010).

A partir de los datos recopilados sobre concentración de CEs en el medio acuático queda patente su presencia ubicua, estando asociados generalmente con la proximidad a grandes núcleos de población. Por ello, la detección de éstos se está utilizando como marcador químico de procesos de contaminación de origen antropogénico (Martinez Bueno et al., 2010).

Respecto a los antiepilépticos, el compuesto que encontramos en mayor proporción es la carbamazepina. La máxima concentración (3.09 μg/L) en aguas para este antiepiléptico se ha detectado en el río Llobregat, España, (Ginebreda et al., 2010) y en sedimentos (2.32 ng/g) en el río Umgeni en Sudáfrica (Matongo et al., 2015). En relación con los β-bloqueantes, centramos nuestra atención sobre el atenolol, alcanzando una concentración máxima de 0.67 μg/L en aguas de los ríos Llobregat y Jarama, España, (Ginebreda et al., 2010; Martínez Bueno et al., 2010). Las concentraciones más elevadas de antidepresivos en aguas superficiales se han detectado en ríos españoles, destacando la fluoxetina (0.07 μg/L) en el río Jarama (Fernández et al., 2010) y para el caso de los sedimentos se ha encontrado una concentración máxima de 20 ng/g en sedimentos del lago Míchigan, USA, (Blair et al., 2013). Con respecto a los fármacos gastrointestinales, la ranitidina es el compuesto que se ha detectado con más frecuencia y a una concentración máxima de 1.94 μg/L en el río Jarama, España, (Valcárcel et al., 2011). El principal representante del grupo de los fármacos ansiolíticos encontrado en el medio acuático es el diazepam, habiéndose detectado con una alta frecuencia y a una concentración máxima de 0.09 μg/L en el río Jarama, España, (Valcárcel et al., 2011). El broncodilatador salbutamol ha sido encontrado a una concentración máxima de 0.03 μg/L en el río Guadarrama, España, (Valcárcel et al., 2011). La loratadina, perteneciente al grupo terapeútico de los antihistamínicos, ha sido encontrada a una concentración máxima de 0.02 μg/L en los ríos Ebro y Jarama, España, (Gros et al. 2006, 2007; Valcárcel et al., 2011). El antineoplásico ifosfamida ha sido detectado por Valcárcel et al. (2011) a una concentración máxima de 0.04 μg/L en el río Guadarrama, España. La mepivacaína es un anestésico local con una elevada frecuencia de presentación en el río Jarama, España, habiéndose medido una concentración máxima de 0.35 μg/L (Valcárcel et al., 2011). Resulta preocupante, desde el punto de vista de su consumo y consecuentes efectos en la salud humana, el elevado porcentaje de drogas de abuso detectadas en aguas superficiales, destacando especialmente los cocaínicos (cocaína y su metabolito principal benzoilecgonina). Se han detectado unas concentraciones máximas de 1.90 μg/L de benzoilecgonina y 0.67 μg/L de cocaína en el río Grote Molenbeek, Bélgica, (Gheorghe et al., 2007). Dentro del grupo de los estimulantes (nicotina y cafeína y sus respectivos metabolitos cotinina y paraxantina) es la cafeína la que se ha detectado de una forma más frecuente y a una concentración máxima de 13.17 μg/L en aguas del río Manzanares, España, (Valcárcel et al., 2011) y 224.35 ng/g en sedimentos del río Umgeni en Sudáfrica (Matongo et al., 2015). En cuanto a los surfactantes es el nonilfenol el compuesto que aparece de una forma más frecuente y a una concentración máxima de 40 μg/L en el río Santa Cruz, USA, (Kolpin et al., 2002). Por último, dentro del grupo de los productos destinados al cuidado personal aparece de una forma frecuente en el medio acuático el repelente de insectos N,N-diethyl-toluamide (DEET) con una concentración máxima de 1.61 μg/L en agua en el río Big Blue, USA, (Bartelt-Hunt et al., 2009) y de 3.5 ng/g en sedimentos del río

Problemática ambiental de la presencia de contaminantes emergentes en el medio acuático La presencia, el destino y comportamiento de los CEs en el medio acuático ha sido reconocido como uno de los temas emergentes en Toxicología Ambiental (Hereber 2002; Fent et al., 2006; Kümmerer 2009; Ortiz de García et al., 2013). La problemática ambiental de estas sustancias se deriva de algunas de sus características tales como su persistencia ambiental, consecuencia de su resistencia a la degradación por métodos bióticos o abióticos, su continua introducción en el medio acuático a través de los efluentes de las ETARs ya que en éstas no están implantados tratamientos físico-químicos y biológicos eficaces para su degradación (Hereber 2002; Gaffney et al. 2015). Algunos CEs poseen log Kow (coeficiente de partición octanol-agua) elevados con lo cual pueden bioacumularse en los tejidos de los organismos acuáticos (Hereber 2002; Fent et al., 2006; Santos et al., 2007; Gros et al., 2010). Por otra parte, los CEs están constituidos por sustancias activas que poseen actividad biológica y, por lo tanto, pueden originar efectos tóxicos en los organismos acuáticos. Actualmente existe poca información en la literatura científica sobre los efectos tóxicos originados por estas sustancias, especialmente en lo que se refiere a los efectos subletales que son los que más probablemente se originen al estar sometidos los organismos a bajas concentraciones de CEs y de una forma continuada. Estos compuestos pueden causar alteraciones endocrinas, inmunes, metabólicas, histopatológicas, genéticas, alteraciones en los sistemas de defensa antioxidante, etc (Petrović et al., 2004; Abdelkader et al., 2012; Oropesa et al., 2013; Oropesa et al., 2014; Cuñat Zaira y Ruiz, 2016; Obimakinde et al., 2016; Oropesa et al., 2016; Oropesa et al., 2017). Por ello, es necesario investigar en este campo con el fin de que se pueda realizar una correcta evaluación de riesgo para la salud humana y ambiental. El resultado de estas evaluaciones permitirán a las agencias reguladoras establecer normas para la prevención o control de los riesgos originados por los CEs.

Lesiones histopatológicas en peces originadas por la exposición a contaminantes emergentes Los peces representan uno de los elementos clave para evaluar el estado ecológico del medio acuático ya que son unos buenos bioindicadores de la contaminación de dicho compartimento ambiental (Hermoso et al., 2010). Estos organismos pueden absorber los tóxicos directamente del medio que les rodea o bien ingerirlos a través del alimento. En peces teleósteos las branquias reflejan las concentraciones de tóxicos presentes en el agua, mientras que el hígado y el riñón son tejidos metabólicamente activos y pueden acumular estas sustancias. La Histopatología es una ciencia que está basada en el examen microscópico de las células y los tejidos de un organismo, así como en la determinación cualitativa y cuantitativa de lesiones histológicas. Por ello, los estudios histopatológicos de los diferentes órganos de vertebrados e invertebrados son útiles para caracterizar su estado de salud y también para investigar los efectos adversos de los contaminantes ambientales sobre los mismos (Triebskorn et al., 1991; Braunbeck y Appelbaum, 1999; Schramm et al., 1999). Las características histopatológicas de órganos específicos expresan el impacto integrado a lo largo del tiempo provocado por los tóxicos en los organismos animales (Stebbing, 1985). Los cambios histopatológicos aparecen como una respuesta de medio plazo a factores estresantes subletales, como puede ser la exposición

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a tóxicos, y la Histología proporciona un método rápido para detectar los efectos de los contaminantes, especialmente los crónicos, en diversos tejidos y órganos (Johnson y Finley, 1980). Por todo lo indicado anteriormente, la Toxicología encuentra en la Histopatología una aliada ideal para caracterizar los procesos toxicológicos. De hecho, en la Estrategia Europea de Detección de Sustancias Activas Disruptoras Endocrinas se utiliza la Guía estandarizada (OECD nº 123, 2010) fundamentada en el examen histopatológico de las gónadas en peces como complemento a la evaluación de otros efectos originados por este tipo de sustancias. Algunos agentes disruptores endocrinos también son considerados CEs. Basado en la relación entre ambas ciencias, en el presente trabajo realizamos una recopilación de las lesiones histopatológicas en diferentes órganos de peces originadas por la exposición a CEs. Tal información se encuentra recogida en la Tabla S.2 proporcionada en el material suplementario. A partir de dicha tabla se han elaborado diversas figuras (2-6) que sintetizan e interpretan la información recogida en la misma. Podemos observar como el surfactante nonilfenol, compuesto orgánico relacionado con la familia de los alquilfenoles, y el 17αetinilestradiol, estrógeno derivado del estradiol utilizado como anticonceptivo y como terapia de reemplazamiento estrogénico, son los CEs que originan lesiones histopatológicas en diferentes órganos de peces que, hasta la fecha, han sido los más ampliamente estudiados (Gray et al., 1997; Schwaiger et al., 2000; Kwak et al., 2001; Weber et al., 2002; Örn et al., 2003; Weber et al., 2003; Pawlowski et al., 2004; Zha et al., 2007; Kaptaner et al., 2010; Velasco-Santa María et al., 2010; Sridevi et al., 2013; Oropesa et al., 2013; Depiereux et al., 2014; Oropesa et al., 2014; Traversi et al., 2014; El-Sayed Ali et al., 2014; Liu et al., 2014; Abdel-Moneim et al., 2015; Luzio et al., 2016; Shirdel et al., 2016). Tras estos compuestos aparece el diclofenaco, fármaco perteneciente a la familia de los AINEs, como uno de los CEs más frecuentemente estudiados (Schwaiger et al., 2004; Hoeger et al., 2005; Triebskorn et al., 2007; Mehinto et al., 2010; Memmert et al., 2013; Gröner et al., 2016). En la figura 2 podemos observar cómo afectan los grupos de CEs a los diferentes órganos en los peces, comprobando como los compuestos hormonales y los surfactantes alteran de forma importante a las gónadas (testículos y ovarios) (Gray et al., 1997; Kwak et al., 2001; Zaroongian et al., 2001; Weber et al., 2002; Örn et al., 2003; Weber et al., 2003; Pawlowski et al., 2004; Zha et al., 2007; Cripe et al., 2010; Kaptaner et al., 2010; Velasco-Santa María et al., 2010; Blüthgen et al., 2013; Sridevi et al., 2013; El-Sayed Ali et al., 2014; Depiereux et al., 2014; Liu et al., 2014; Oropesa et al., 18 16

Número de estudios

Fármacos Surfactantes Hormonas

PCPs

Drogas de abuso

8 6 4 2 0

Figura 2: Afección de órganos en peces por exposición a diferentes grupos de contaminantes emergentes.

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2014; Abdel-Moneim et al., 2015; Shen et al., 2015; Zhao et al., 2015; Luzio et al., 2016). El resultado es lógico en el caso de los compuestos hormonales pero resulta más sorprendente en el caso de los surfactantes. Este hecho se debe a que surfactantes tales como el nonilfenol y octilfenol han sido catalogados como compuestos disruptores endocrinos que actúan como análogos hormonales (Traversi et al., 2014). En cuanto al grupo de los fármacos, los órganos diana son el hígado, riñón y las branquias (Schwaiger et al., 2004; Hoeger et al., 2005; Khalil et al., 2007; Triebskorn et al., 2007; Mehinto et al., 2010; Galus et al., 2013; Memmert et al., 2013; Gröner et al., 2016; Steinbach et al., 2016). Centrándonos en las lesiones observadas en los peces podemos concluir que existe cierto predominio de algunas patologías a nivel de determinados órganos originadas por diferentes grupos de CEs (Figs. 3–6). A partir de la Fig. 3 podemos indicar que las lesiones que aparecen más frecuentemente en los testículos como consecuencia de la exposición de peces a CEs son fenómenos de ovo-testis (presencia de ovocitos en el tejido testicular) (Zha et al., 2007; Cripe et al., 2010; Kaptaner et al., 2010; Depiereux et al., 2014; Abdel-Moneim et al., 2015; Shen et al., 2015), desarrollo de quistes espermáticos (colección de células espermáticas en localizaciones no habituales) (Zaroongian et al., 2001; Velasco-Santa María et al., 2010; Oropesa et al., 2014), necrosis (conjunto de cambios celulares tras la muerte celular por digestión de sus componentes) de células germinales (Kwak et al., 2001; Mehinto et al., 2010; Velasco-Santa María et al., 2010) y fenómenos de fibrosis (reemplazamiento del tejido necrótico por tejido conectivo fibroso) (Weber et al., 2002; Weber et al., 2003; Kaptaner et al., 2010; Velasco-Santa María et al., 2010). Se observa una mayor afectación en los testículos como consecuencia de la exposición a surfactantes y hormonas (Gray et al., 1997; Kwak et al., 2001; Zaroongian et al., 2001; Weber et al., 2002; Örn et al., 2003; Weber et al., 2003; Pawlowski et al., 2004; Zha et al., 2007; Cripe et al., 2010; Kaptaner et al., 2010; Velasco-Santa María et al., 2010; Depiereux et al., 2014; El-Sayed Ali et al., 2014; Liu et al., 2014; Oropesa et al., 2014; Abdel-Moneim et al., 2015; Shen et al., 2015; Zhao et al., 2015; Luzio et al., 2016). En los ovarios la lesión predominante es la atresia folicular (cambio patológico consistente en destrucción del folículo y muerte del ovocito, normalmente por falta de estimulación hormonal) (Blüthgen et al., 2013; Sridevi et al., 2013) seguida de variaciones en el tamaño de los mismos (Cripe et al., 2010; Zhao et al., 2015), siendo las hormonas los CEs que originan el mayor número de lesiones en este órgano (Örn et al., 2003; Weber et al., 2003; Zha et al., 2007; Cripe et al., 2010; Kaptaner et al., 2010; Blüthgen et al., 2013; Sridevi et al., 2013; Liu et al., 2014; Zhao et al., 2015; Luzio et al., 2016) (Fig. 4). Las lesiones en las gónadas pueden originar disturbios en la reproducción tales como alteración en la espermatogénesis y ovogénesis que a su vez pueden repercutir en la fertilización y también producir cambios en el ratio sexual. Todo ello podría generar a largo plazo un efecto negativo en la dinámica poblacional de las especies expuestas. La exposición de peces a CEs origina una presencia importante de material de membrana en el citoplasma de los hepatocitos (restos de membrana en el interior de los hepatocitos para su posterior digestión) (Triebskorn et al., 2007), necrosis (Zaroogian et al.,2001; Khalil et al., 2007; Du et al., 2008), degeneración glucogénica (alteración de la célula debido a una anormal acumulación de glucógeno) (Schwaiger et al., 2000; Pawlowski et al., 2004; Triebskorn et al., 2007; Zha et al., 2007; Galus et al., 2013) e hipertrofia (aumento del tamaño celular) de los hepatocitos (Schwaiger et al., 2000; Zaroogian et al., 2001; Zha et al., 2007; Du et al., 2008), además de aumento en el número de macrófagos (Triebskorn et al., 2007; Traversi et al., 2014) (Fig. 5). Se observa una mayor afectación en hígado como consecuencia de la exposición a fármacos y hormonas (Schwaiger et al., 2000; Zaroogian et al., 2001; Weber et al., 2003; Pawlowski et al., 2004; Hoeger et al., 2005; Khalil et al., 2007; Triebskorn et al., 2007; Zha et al., 2007; Galus et al., 2013). El hígado es un órgano que recibe un gran aporte sanguíneo, lo que supone una alta exposición a tóxicos

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Fármac os

Hormonas

Lesiones histopatológicas en peces originadas por la exposición a contaminantes emergentes: recopilando y analizando datos Escasas espermatogonias Vacuolización tisular Atrofia testicular Inhibición del crecimiento testicular Fibrosis intersticial Degeneración células germinales Necrosis células germinales Reducción del número de espermatocitos Quistes espermáticos Incremento en el número de túbulos Hermafroditismo Desprendimiento de la membrana basal Dilatación de los conductos espermáticos Infiltración de adipocitos Desarrollo asincrónico testicular Presencia de fluido proteináceo intersticial Ovo-testis Tejido testicular inmaduro Túbulos revestidos por células de Sertoli Escasas espermatogonias Degeneración testicular 0

7 8 Número de estudios

Surfactantes

PC Ps

Figura 3: Lesiones en testículos de peces ocasionadas por la exposición a hormonas y fármacos.

Reducción del número de espermatocitos Aumento tamaño túbulos No espermatocitos maduros Hiperplasia tejido conectivo interlobular Presencia de quistes espermáticos Pérdida sincronización espermatogénesis Aumento de espermatocitos con núcleos picnóticos Necrosis de los túbulos seminíferos Degeneración células germinales Ovo-testis Fibrosis Presencia de células apoptóticas Disminución de tamaño testicular Desorganización celular Retraso en el desarrollo 0

4 Número de estudios

Surfactantes

Hormonas

Fá rm ac PC os Ps

Figura 3 (continuación). Lesiones en testículos de peces ocasionadas por la exposición a productos de cuidado personal y surfactantes.

Disminución en el número de ovocitos vitelogénicos Ovocitos atrésicos Infiltración celular eosinofílica Proliferación epitelio germinal Degeneración folicular Ruptura de la capa folicular Aglutinación carioplásmica Aumento ovocitos perinucleares Desarrollo precoz de ovocitos Atresia folicular Fibrosis Disminución en el número de ovocitos vitelogénicos Inflamación con depósitos basofílicos Presencia de fluido proteináceo intersticial Variación tamaño ovario Folículos en estadíos tempranos Ovarios inmaduros Variación de tamaño Folículos en estadíos tempranos Fibrosis Disminución número de ovocitos vitelogénicos Incremento número folículos atrésicos 0

6 7 Número de estudios

Figura 4. Lesiones en ovarios de peces ocasionadas por la exposición a contaminantes emergentes (PCPs, fármacos, hormonas y surfactantes). .

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Hormonas

Fármacos

(Mohamed, 2009). Desde el punto de vista funcional, este órgano Degeneración vacuolar Dilatación vasos sanguíneos Presencia de material de membrana en citoplasma hepatocitos Aumento número de macrófagos Infiltración monocítica Disminución almacenamiento de glucógeno Presencia de depósitos hialinos Esteatosis Necrosis Desorganización celular Proliferación de macrófagos en machos Acumulación de material eosinofílico Núcleos aumentados de tamaño Degeneración glucogénica Hipertrofia de los hepatocitos Inflamación Disminución hepatocitos Aumento núcleos picnóticos 0

3 4 Número de estudios

Surfactantes

Figura 5: Lesiones en hígado de peces ocasionadas por la exposición a contaminantes emergentes (fármacos y hormonas).

Aumento núcleos picnóticos Disminución número hepatocitos Inflamación Cambios hidrópicos celulares Hemorragias Desorganización celular Presencia de melanomacrófagos Esteatosis Necrosis Acumulación de material eosinofílico Reducción de depósitos de glucógeno Aumento tamaño nuclear Hipertrofia de los hepatocitos 0

4 Número de estudios

Fármacos

Hormonas

Figura 5 (continuación). Lesiones en hígado de peces ocasionadas por la exposición a contaminantes emergentes (fármacos y hormonas). .

Destrucción células mesangiales Pequeña disminución cápsula de Bowman Disminución número de túbulos proximales renales Aumento área corpuscular Aumento número de núcleos picnóticos Degeneración hialina Fibrosis capsular renal severa Incremento tamaño glomérulos Incremento número de células intersticiales Acumulación de material eosinofílico Degeneración epitelio tubular Necrosis epitelio tubular Hipertrofia del epitelio tubular Hemorragias Engrosamiento membrana basal Proliferación de macrófagos Acortamiento pedicelos Glomerulonefritis Gran desarrollo de nefronas Pérdida del espacio intersticial Proliferación tejido intersticial renal Necrosis células epiteliales tubulares Vacuolización Acumulación de fluidos proteináceos y eosinofílicos Alteración de la estructura tubular Degeneración hialina Hiperplasia del epitelio renal Hipertrofia del epitelio renal 0

Figura 6: Lesiones en riñón de peces ocasionadas por la exposición a contaminantes emergentes (hormonas y fármacos)

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4 Número de estudios

Surfactantes

Lesiones histopatológicas en peces originadas por la exposición a contaminantes emergentes: recopilando y analizando datos Necrosis del epitelio tubular Aumento número de núcleos picnóticos Degeneración hialina Fibrosis capsular renal severa Incremento tamaño glomérulos Incremento en el número de células intersticiales Acumulación de material eosinofílico Degeneración epitelio renal Hipertrofia del epitelio renal Hemorragias 0

Número de estudios

Figura 6 (continuación): Lesiones en riñón de peces ocasionadas por la exposición a contaminantes emergentes (surfactantes).

interviene en la metabolización y detoxificación de las sustancias químicas (Salamat y Zarie, 2012); por tanto, tales funciones pueden verse afectadas como consecuencia de las lesiones originadas tras la exposición a CEs. De hecho, Olufayo y Alade (2012) consideran que los fenómenos de necrosis pueden ser el resultado del excesivo trabajo de detoxificación realizado por el hígado. Otras funciones que también podrían verse alteradas son la síntesis de proteínas y el metabolismo de las grasas (Arellano et al,. 1999). El riñón, al igual que el hígado, recibe un gran aporte de sangre postbranquial que vehicula los tóxicos. Por lo tanto, las lesiones renales pueden ser un buen biomarcador de la polución ambiental. Las principales lesiones encontradas en riñón de peces tras la exposición a CEs son: necrosis celular en los epitelios tubulares (Schwaiger et al., 2000; Schwaiger et al., 2004; Hoeger et al., 2005; Triebskorn et al., 2007; Zha et al., 2007; Mehinto et al., 2010; Oropesa et al., 2013), degeneración hialina (alteración patológica de diferentes elementos tisulares adquiriendo un aspecto homogéneo y eosinófilo) (Weber et al., 2003; Schwaiger et al., 2004; Triebskorn et al., 2007; Oropesa et al., 2013), acumulación de fluidos proteináceos y eosinófilos (Galus et al., 2013), así como hemorragias (Schwaiger et al., 2000; Oropesa et al., 2013) (Fig. 6). Se observa una mayor afectación en riñón como consecuencia de la exposición a fármacos y hormonas (Schwaiger et al., 2000; Zaroogian et al., 2001; Weber et al., 2003; Schwaiger et al., 2004; Hoeger et al., 2005; Triebskorn et al., 2007; Zha et al., 2007; Mehinto et al., 2010; Galus et al., 2013; Oropesa et al., 2013; Villeret et al., 2013). El riñón, junto con las branquias y el intestino, participa en el mantenimiento de la homeostasis de los fluidos corporales (Cengiz, 2006) y, además de producir orina, interviene en la excreción de los tóxicos y sus metabolitos (Hinton et al., 1992). Tales funciones de osmorregulación y de excreción pueden verse alteradas como consecuencia de las lesiones originadas en este órgano debido a la exposición de los peces a CEs. En cuanto a las branquias, las lesiones que aparecen de una forma más frecuente son: descamación epitelial (Triebskorn et al., 2007; Gröner et al., 2016; Shirdel et al., 2016), hipertrofia e hiperplasia (aumento del número de células) de células cloruro y mucosas (Hoeger et al., 2005; Triebskorn et al., 2007; Memmert et al., 2013; Gröner et al., 2016; Shirdel et al., 2016) que conducen a un incremento en el área interlamelar y a la fusión de las laminillas branquiales (siendo éste un mecanismo de defensa para incrementar la barrera de contacto de los tóxicos con el torrente sanguíneo, Cengiz, 2006), telangiectasia (severa alteración en el sistema venoso como resultado de la vasodilatación, colapso de las células pilares y ruptura de la integridad vascular) (Schwaiger et al., 2004; Hoeger et al., 2005) y necrosis (Schwaiger et al., 2004; Triebskorn et al., 2007). Los fármacos constituyen el grupo de CEs que originan mayoritariamente las lesiones citadas (Schwaiger et al., 2004; Hoeger et al., 2005; Triebskorn et al., 2007; Memmert et al., 2013; Gröner et al., 2016; Shirdel et al., 2016). Por tanto, la función respiratoria y de mantenimiento del equilibrio hidroelectrolítico pueden verse seriamente afectadas en peces tras la exposición a estos compuestos.

Las lesiones en otros órganos como bazo (hipertrofia e hiperplasia de células retículoendoteliales, hemorragias, presencia de material eosinófilo) (Rosety et al., 1997; Schwaiger et al., 2000; Du et al., 2008) corazón (inflamación y procesos edematosos, hemorragias, necrosis de células endoteliales) (Steinbach et al., 2016), intestino (hiperplasia e hipertrofia de las células caliciformes; hiperplasia, fusión y necrosis de vellosidades) (Ribelles et al., 1995; Khalil et al., 2007; Mehinto et al., 2010; El-Sayed Ali et al., 2014; Gay et al., 2016; Gürcü et al., 2016; Shirdel et al., 2016), piel (incremento en el espesor de la dermis, disminución del número y tamaño de las células mucosas) (Zeni y Caligiuri, 1992; Gay et al., 2016) y vasos sanguíneos (dilatación y elongación) (Zeni y Caligiuri, 1992) no pueden considerarse representativas desde un punto de vista lesional debido a los escasos artículos que encontramos en relación a este tema. En la mayoría de los estudios revisados los ensayos de toxicidad realizados son sub-crónicos originando por tanto efectos sub-letales, en este caso lesiones, que si bien no originan la muerte de los peces, sí que se considera que ciertas funciones fisiológicas reguladas por los órganos lesionados se pueden ver afectadas.

Conclusiones Podemos considerar a las lesiones histopatológicas como un buen biomarcador de exposición a CEs y de los efectos originados por ellos. Las lesiones histopatológicas pueden: alterar las funciones reguladas por los órganos afectados, las cuales están relacionadas con procesos biológicos importantes; reflejar cambios subclínicos originados por la exposición a bajas concentraciones de tóxicos (particularmente importante en el caso de los CEs) así como permanecer en el tiempo si las condiciones ambientales no varían.

Apéndice A. Datos suplementarios Los datos suplementarios (Tabla S.1 y Tabla S.2) relacionados con este artículo pueden ser encontrados en el archivo DS_Oropesa et al.

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Hepatocitos Humanos Upcytes como modelo experimental in vitro para el estudio del daño hepático inducido por fármacos a largo plazo Pelechá M1, Gómez-Lechón MJ1,2, Tolosa L1, Donato MT1,2,3,* 1

Unidad de Hepatología Experimental. Instituto de Investigación Sanitaria La Fe (IIS La Fe). Avda. Fernando Abril Martorell, nº 106, Torre A, 46026 Valencia, Spain. 2 CIBEREHD, FIS, Spain. 3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, Spain.

Resumen: La determinación de la hepatotoxicidad a largo plazo de nuevos fármacos es esencial para el desarrollo farmacéutico pero está limitada por la falta de modelos celulares adecuados que mantengan una expresión prolongada de la funcionalidad hepática. En el presente trabajo se ha explorado la idoneidad de un nuevo modelo celular llamado Hepatocitos Humanos Upcytes (HHU) cuyas células preservan funciones hepáticas y capacidad replicativa. La caracterización exhaustiva de los principales enzimas de Fase I y II implicados en el metabolismo hepático de fármacos en HHU de tres donantes independientes a diferentes tiempos de cultivo (hasta 21 días) reveló que estas células muestran perfiles de expresión (mRNA) y niveles de actividades enzimáticas más cercanos a los hepatocitos humanos que las células HepG2. Dada la estabilidad fenotípica de los HHU, tanto a nivel transcripcional como a nivel funcional, se exploró su utilidad potencial para evaluar la hepatotoxicidad a largo plazo. Para ello las células se trataron durante diferentes periodos (hasta 21 días) con varias concentraciones de tres fármacos modelo y se evaluaron los efectos sobre la viabilidad celular, la acumulación de lípidos y fosfolípidos, el calcio intracelular y los niveles de GSH. Nuestro estudio permitió detectar efectos tóxicos crónicos, como la esteatosis o la fosfolipidosis, a concentraciones en las que la viabilidad celular no estaba comprometida, confirmando la idoneidad de este nuevo modelo celular para el estudio de la hepatotoxicidad tras tratamientos prolongados con los fármacos.

El daño hepático inducido por fármacos o DILI —drug-induced liver injury— es uno de los aspectos más relevantes en el desarrollo de fármacos, pudiendo conducir a la retirada del fármaco de los ensayos clínicos e incluso del mercado si éste ha llegado a ser comercializado (Schiodt et al., 2002; Guengerich, 2011; Gómez-Lechón et al., 2014a).

Palabras clave: Hepatocitos Humanos Upcytes; hepatotoxicidad inducida por fármacos; citocromo P450; enzimas de Fase I y II.

Para evitar los casos de DILI, la hepatotoxicidad de los fármacos en desarrollo es testada en animales de experimentación durante las fases preclínicas; sin embargo, estos ensayos han mostrado ser poco predictivos debido, entre otras razones, a que el metabolismo de fármacos en el hombre es diferente al de los animales de experimentación (Robinson et al., 2000). Es por ello que se hacen necesarias otras aproximaciones que mejoren la predicción de la hepatotoxicidad en el hombre.

Abstract: Human Hepatocytes Upcytes® as in vitro experimental model to study long-term drug-induced liver injury. Determining long-term hepatotoxicity of new drugs is essential for the pharmaceutical industry development; however, it is limited by the lack of suitable cell-based models able to maintain hepatic functions over time. In the present work we explored the suitability of a new cellular model called Human Hepatocytes Upcytes (HHU) which preserves liver functions and replicative capacity. The exhaustive characterization of the major Phase I and II enzymes involved in hepatic drug metabolism in HHU from three independent donors at different culture times (up to 21 days) revealed that these cells show expression profiles (mRNA) and activity levels enzymes that are closer to human hepatocytes than those of HepG2 cells. Given the phenotypic stability of HHU, both at the transcriptional and functional level, their potential utility to assess long-term hepatotoxicity was explored. Cells were treated for various periods (up to 21 days) with several concentrations of three model drugs and the effects on cell viability, lipid and phospholipid accumulation, intracellular calcium and GSH levels were evaluated. Our study allowed us to detect chronic toxic effects, such as steatosis or phospholipidosis, at concentrations that did not compromise cellular viability, confirming the suitability of this new cellular model for the study of long-term drug-induced hepatotoxicity. Keywords: Human Hepatocytes Upcytes, drug-induced liver injury, cytochrome P450, Phase I and II enzymes.

Introducción *e-mail:donato_mte@gva.es

El metabolismo de los fármacos puede ejercer un papel clave en la aparición de DILI. Si bien en muchos casos la biotransformación del fármaco conduce a su detoxificación, en algunas ocasiones se produce su bioactivación, un fenómeno en el que se generan metabolitos reactivos que, si no son neutralizados con suficiente eficiencia, pueden ser más tóxicos que el fármaco original. Estos metabolitos reactivos reaccionan con el glutatión (GSH), deplecionan sus niveles y provocan un aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS). El aumento del estrés oxidativo, junto con la propia reactividad de estos metabolitos, provoca daño en el DNA e induce genotoxicidad, mutaciones y carcinogénesis. Además, la modificación covalente de proteínas puede dar lugar a alteraciones estructurales y funcionales de las mismas que pueden alterar el metabolismo y la homeostasis celular, desencadenar reacciones inmunitarias o inducir la producción de citoquinas proinflamatorias. El estrés oxidativo, además, provoca la peroxidación de lípidos que compromete las membranas celulares. Como consecuencia de estas alteraciones, los hepatocitos mueren por apoptosis y necrosis causando toxicidad y daño hepático (GómezLechón et al., 2014a; Gómez-Lechón et al., 2016) (Figura 1).

Un aspecto no suficientemente explorado es el estudio de la toxicidad inducida tras exposiciones prolongadas a fármacos. Aún hoy en día, la información sobre la toxicidad crónica depende en gran medida de los estudios en animales, por lo que desde la industria farmacéutica y las autoridades regulatorias se está promoviendo el desarrollo de modelos celulares que posibiliten su predicción in vitro. Son muchos los modelos celulares propuestos, incluyendo los hepatocitos primarios humanos, líneas celulares de hepatoma como HepG2 o HepaRG, progenitores hepáticos o células pluripotentes (Godoy et al., 2013; Gómez-Lechón et al., 2014a; Gómez-Lechón et al., 2014b; Gómez-Lechón et al., 2016). Los ensayos in vitro de toxicidad basados en células tienen el potencial de proporcionar información rápida y económicamente viable durante las fases tempranas del desarrollo farmacéutico. Sin embargo, su capacidad predictiva depende de forma crítica del comportamiento funcional de las células utilizadas. Entre las aproximaciones in vitro, los hepatocitos humanos en cultivo primario constituyen la primera alternativa (gold standard), al ser el modelo celular más cercano al hígado humano. Sin embargo, presentan algunas desventajas, incluida la pérdida de gran parte de fenotipo hepático en un corto periodo de cultivo (Godoy et al., 2013; Vernetti et al., 2017), lo cual imposibilita su aplicación a estudios de hepatotoxicidad a largo plazo. Por ello, en los últimos años se están realizando esfuerzos importantes encaminados al diseño de técnicas optimizadas de cultivo para evitar la pérdida funcional de los 109

Pelechá M, Gómez-Lechón MJ, Tolosa L, Donato MT

Figura 1: Mecanismos implicados en la hepatotoxicidad por fármacos. El metabolismo de fármacos puede conducir a la formación de metabolitos estables/inactivos o metabolitos reactivos (bioactivación). La hepatotoxicidad se puede producir por la interacción del fármaco/metabolito reactivo, con las macromoléculas o por el daño oxidativo inducido por un exceso de formación de ROS. Adaptado de (Gómez-Lechón et al., 2014a).

hepatocitos y se han propuesto también nuevos modelos celulares hepáticos que soslayen algunas de sus limitaciones. Recientemente, se han propuesto los HHU como un nuevo modelo celular alternativo a los hepatocitos primarios (Tolosa et al., 2016). Los HHU son células derivadas de hepatocitos humanos que han sido sometidas a un proceso de transducción lentiviral utilizando los genes del virus del papiloma humano (HPV) E6 y E7 junto con el factor de proliferación Oncostatina M (Burkard et al.,2012; Levy et al., 2015). Con la aplicación de esta tecnología se obtienen células con capacidad proliferativa controlada, al tiempo que mantienen un fenotipo diferenciado, con un perfil transcripcional, metabólico y toxicológico similar a los hepatocitos de los que derivan (Norenberg et al., 2013; Levy et al., 2015; Tolosa et al., 2016). Los HHU parecen ser una aproximación innovadora y prometedora para los estudios de hepatotoxicidad. Sin embargo, los estudios realizados hasta el momento con este nuevo modelo celular son escasos y la información disponible sobre su comportamiento funcional es insuficiente, por lo que es necesario profundizar en su caracterización y constatar su capacidad para reproducir el fenotipo hepático adulto. De obtenerse resultados satisfactorios, los HHU podrían convertirse en el futuro modelo con el que aplicar los ensayos de rutina para la investigación del DILI y, en especial, de la toxicidad hepática a largo plazo. En base a ello, el objetivo principal de este trabajo ha sido determinar la idoneidad de las HHU para estudios de toxicidad hepática a largo plazo. Con este fin, se ha realizado una exhaustiva caracterización de los enzimas de biotransformación de fase I y II, tanto a nivel transcripcional como funcional, durante varias semanas de cultivo. Como enzimas de fase I se han analizado diferentes citocromo P450 (CYP450) implicados en el metabolismo de fármacos y la citocromo P450 oxidoreductasa (POR). Como enzimas de fase II o conjugación se han analizado los principales isoenzimas hepáticos de UDPglucuroniltransferesa (UGT) y glutation-S-transferasa (GST). A modo de prueba de concepto, el modelo celular se aplicó al estudio de la toxicidad de la dexametasona, ketoconazol y valproato, tres fármacos que con frecuencia se administran de forma crónica y que fueron elegidos de acuerdo a la información disponible sobre su

110

hepatotoxicidad (Tolosa et al., 2012; Haegler et al., 2017).

Material y métodos Cultivo de células Hepatocitos Humanos Upcytes® (HHU) de tres donantes diferentes (donante 1: niña caucásica, 9 años; donante 2: mujer caucásica, 48 años y donante 3: mujer caucásica, 43 años) y los medios usados para su cultivo: i) medio de descongelación (thawing medium, TM) y ii) medio de alto rendimiento (high performance medium, HPM) fueron obtenidos de Upcyte Technologies GmbH (Hamburgo, Alemania). HHU fueron descongelados en medio TM y se sembraron en frascos T75 cubiertos de colágeno Tipo I (Corning, Nueva York) a una densidad de 5000 cél/cm2. Las células se cultivaron en medio HPM suplementado según las recomendaciones del proveedor hasta el 7080% de confluencia, reemplazando el medio cada 2-3 días. A continuación, el pase de células se realizó con 0,25% tripsina/0,02% EDTA (Gibco BRL, Paisley, Escocia) y éstas se sembraron en placas de 24 pocillos (ensayos de actividad y de expresión génica) o de 96 pocillos (ensayos de toxicidad) recubiertas con fibronectina y colágeno Tipo I (Sigma Aldrich, Madrid, España) a una densidad de 5000 cél/cm2 y se mantuvieron en HPM al menos durante 3 días. Transcurrido este tiempo, se realizó un cambio de medio con HPM fresco y se inició el tratamiento con los fármacos (Día 0). En paralelo, las células cultivadas en placas de 24 pocillos se mantuvieron en condiciones control (no tratadas). En todos los casos el medio se renovó cada 2-3 días. Extracción de RNA y qPCR La extracción y cuantificación de mRNA de los HHU se realizó a día 0, 3, 7, 14 y 21 de cultivo. El mRNA se extrajo manualmente usando RNeasy® Mini Kit de Qiagen siguiendo el protocolo del kit para células animales, <5x106 cél/pocillo. En la extracción se usó 10 µl βmercaptoetanol/ml de tampón RLT del kit. La cuantificación de RNA se realizó a través del espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Se obtuvo la OD260 y la relación OD260/280 para cuantificar y determinar la pureza de las muestras respectivamente.

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Hepatocitos Humanos Upcytes como modelo experimental in vitro para el estudio del daño hepático inducido por fármacos a largo plazo

Un total de 1 µg de RNA de cada muestra se retrotranscribió utilizando la retrotranscriptasa M-MLV (Invitrogen, España). Posteriormente, se llevó a cabo la qPCR usando SYBR Green I Master (Roche Applied Sciences, Barcelona, España) y el Light Cycler 480 (Roche Applied Sciences, Barcelona, España) como instrumento. Cebadores específicos (Tabla 1) se utilizaron para cuantificar la expresión de los genes codificantes de enzimas de fase I y II: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, CYP2D6, CYP3A4, UGT2B7, UGT1A1, GSTM1, GSTA1, GSTA2 y POR, midiendo la expresión del gen constitutivo y normalizador PBGD. En paralelo se midieron también los niveles de mRNA de todos los genes en preparaciones de células HepG2 y de hepatocitos humanos en cultivo primario disponibles en el laboratorio. Tabla 1. Cebadores utilizados para la RT-qPCR

Cebador

Directoa

Reversoa

CYP1A2

ATCCCCAAGAAATGCTGTGT

GCCAGGACTTCCCCGATACA

CYP2A6

GCCCGCAGAGTCAAAAAGGA

CCCCTTCTCATTCAGGAAGTGCT

CYP2B6

GTGTGGAGAAGCACCGTGAAAC

GAGAGCGTGTTGAGGTTGAGGT

CYP2C9

TCAAGATTTTGAGCAGCCCC

AGTCAACTGCAGTGTTTTCCAAG

CYP2C19 ACGGATTTGTGTGGGAGA GGG

GTGAAATTTGGACCAGA

CYP2D6

AAGTACAGGGCTTCCGCATCC

GGGCTCACCAGGAAAGCAA

CYP3A4

AGAAAGTCGCCTCGAAGATACAC

CAGAGCTTTGTGGGACTCAGTT

CYP2E1

AAGCAACCCGAGACACCATT

GAAACAACTCCATGCGAGCC

UGT1A1

TGCGACGTGGTTTATTCCCC

AGGCTTCAAATTCCTGGGATAGTG

UGT2B7

AGCTGTTAGAGTGGACTTCAAC

AATCTCAGATATAACTAATCAT

GSTA1

CCTGAGGAAAAAGATGCCAA

GACTGGAGTCAAGCTCCTCG

GSTA2

TCCTTCTTCTGCCCTTTAGTC

GCTGGAAATAAGGCTAGAGTCAA

GSTM1

GTCCTTGACCTCCACCGTAT

CCCCAGACAGCCATCTTTGA

POR

AGCTACGAGAACCAGAAGCC

CTGGTTGACGAGAGCAGAGT

PBGD

CGGAAGAAAACAGCCCAAAGA

TGAAGCCAGGAGGAAGCACAGT

Secuencias en sentido 5’3’

La cuantificación se realizó mediante el software de análisis de cuantificación relativa (Roche Applied Sciences, Barcelona, España) en el que se cuantifica la expresión en la fase exponencial de la curva de amplificación. Todos los resultados fueron normalizados en base a la expresión del gen constitutivo PBDG (normalización interna) y a una muestra control que siempre corresponde a hepatocitos primarios.

Tabla 2. Sustratos selectivos para diferentes enzimas CYP450

Enzima

Sustrato

Concentración de ensayo (µM)

CYP1A2

Fenacetina

Acetominofeno

CYP2A6

Cumarina

7-Hidroxicumarina

CYP2B6

Bupropión

Hidroxibupropión

CYP2C19

Mefenitoína

4’Hidroximefenitoína

CYP2C9

Diclofenac

4’Hidroxidiclofenac

CYP2D6

Bufuralol

Hidroxibufuralol

CYP3A4

Midazolam

1’-Midazolam

CYP2E1

Clorzoxazona

6-Hidroxiclorzoxazona

eligieron tres fármacos: dexametasona, ketoconazol y valproato. La dexametasona es un glucocorticoide sintético que se usó como control negativo ya que no induce hepatotoxicidad (Tolosa et al., 2016). El ketoconazol es un fármaco antifúngico que induce daño hepático y, aunque no se sabe con seguridad su mecanismo citotóxico, se sabe que está relacionado con la disfuncionalidad de la mitocondria (Haegler et al., 2017). El valproato es un fármaco antiepiléptico que induce hepatotoxicidad por esteatosis (Schumacher y Guo, 2015). Para cada fármaco, los HHU fueron tratados de forma independiente con tres concentraciones (Tabla 3). En todos los casos las concentraciones se seleccionaron teniendo en cuenta la Cmax del fármaco (Tolosa et al., 2016). Las disoluciones stock de dexametasona y ketoconazol se prepararon en DMSO y el valproato se preparó en PBS (tampón fosfato 0,1M pH7) y posteriormente se diluyeron en medio de cultivo hasta alcanzar las concentraciones deseadas. La concentración final del solvente (DMSO o PBS) en el medio de cultivo no excedió de 0,5% (v/v) y las células control (no tratadas con el fármaco) fueron incubadas con la misma concentración de solvente. Las células fueron tratadas con los fármacos durante varios periodos (1, 3, 7, 14 y 21 días) mediante una pauta de dosis repetidas, en la que el fármaco se renueva cada dos días coincidiendo con el cambio de medio. Tabla 3. Fármacos utilizados en el estudio de toxicidad

Fármaco

Actividades enzimáticas Las actividades CYP450 se evaluaron por incubación de las monocapas de HHU con 300 µl de solución HEPES salino (10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgCl2, 10 mM glucosa; pH 7,4) con un cóctel de sustratos específicos para los diferentes enzimas CYP450 (Tabla 2) durante 1 hora a 37oC y 5% CO2. A continuación, el volumen de incubación recogido se centrifugó 5 min a 500 x g y el sobrenadante se conservó a -80ºC hasta su uso. En la valoración (volúmenes de incubación ya atemperados), los correspondientes productos fueron detectados y cuantificados mediante espectrometría de masas en tándem HPLC (HPLC-MS/MS) (Waters, Milford, MA, USA) tal y como se describió previamente (Gómez-Lechón et al., 2012). Las actividades se midieron a día 0, 1, 3, 7, 14 y 21. Los datos de actividad de los HHU se compararon con los correspondientes en células HepG2 que se encuentran registrados en la base de datos interna del propio laboratorio. Compuestos hepatotóxicos Para llevar a cabo los estudios de hepatotoxicidad a largo plazo se

Producto

Concentración (µM) Cmax/5

Cmax

5xCmax

Dexametasona

0,046

0,23

1,15

Ketoconazol

1,4

Valproato

92,2

481

2405

High-Content Screening (HCS) La toxicidad inducida por los fármacos se analizó mediante HCS. Tras los tratamientos, las células se incubaron con una combinación de sondas fluorescentes (Tabla 4) durante 30 min a 37ºC, con el objetivo de evaluar los cambios producidos por el fármaco sobre diferentes parámetros indicativos de toxicidad celular. En el caso de la sonda para la fosfolipidosis, se incorporó junto con el fármaco 24 h antes de finalizar el tratamiento. A continuación, los resultados fueron analizados con un INCELL Analyser 6000 (GE, Healthcare, USA). Para la excitación y monitorización de la fluorescencia se utilizaron las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para cada fluorocromo. Las imágenes obtenidas se analizaron mediante la estación de trabajo INCELL que permite la cuantificación simultánea de la fluorescencia emitida por estructuras subcelulares teñidas con diferentes marcadores fluorescentes; la intensidad de fluorescencia medida se asoció con los compartimentos nucleares y citoplasmáticos

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Pelechá M, Gómez-Lechón MJ, Tolosa L, Donato MT Tabla 4. Sondas utilizadas en HCS para el análisis de parámetros citotóxicos

Concentración

λex-λem (nm)

Hoescht 3342

2,7 µM

361486

Contaje celular

Yoduro de Propidio

2,2 µM

536617

Viabilidad celular

BODIPY 493/503

14,3 nM

493503

Acumulación de lípidos (esteatosis)

LipidTOX Red Phospholipidosis

1/1000 (comercial)

595615

Acumulación de fosfolípidos (fosfolipidosis)

Fluo4 AM

0,25 µM

494516

Calcio citoplasmático

Monochlorobimane

50 µM

390478

Concentración de GSH (estrés oxidativo)

Sonda

Parámetro citotóxico

predefinidos (Tolosa et al., 2012). La cuantificación de las intensidades de fluorescencia se realizó en células individuales y se promediaron los valores obtenidos para todos los pocillos con el mismo tratamiento. Los resultados se normalizaron con respecto al valor en las células control (Tolosa et al., 2012; Donato et al., 2012). Análisis de datos Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Las diferencias entre grupos fueron calculadas mediante el test de la t de Student’s, considerándose como significativas con p <0,05.

Resultados Expresión génica Para facilitar el análisis de los perfiles de expresión de los genes de los enzimas de fase I y fase II analizados, todos los valores de mRNA se muestran en las figuras como veces con respecto a los niveles medidos en hepatocitos humanos en cultivo primario. Los análisis de expresión génica para los enzimas de fase I muestran perfiles de expresión dispares entre donantes (Figura 2). Así, el donante 1 mostró mayor expresión para CYP2C9 y el donante 3 mayor expresión para CYP3A4 y CYP2A6 que el resto de donantes. En términos generales, en todas las preparaciones de HHU los niveles de mRNA de CYP2E1, CYP1A2, CYP2C19 y CYP2D6 fueron muy inferiores a los de los hepatocitos, mientras que los niveles de mRNA de CYP2B6 y CYP2A6 fueron comparables a los de los hepatocitos. Cabe destacar la elevada expresión de POR en los HHU, con niveles mayores que los hepatocitos. También se observaron diferencias en el perfil temporal de mRNAs entre los diferentes donantes. Los HHU del donante 1 mostraron un aumento gradual con el tiempo de cultivo de los niveles de todos los mRNAs de enzimas CYP450, observándose los niveles máximos para todos ellos el día 21 de cultivo. Por el contrario, esta tendencia no se observó en los otros donantes y los diferentes mRNAs muestran ciertas fluctuaciones (subidas y bajadas) a lo largo del tiempo de cultivo. A pesar de las diferencias observadas entre donantes, los niveles de mRNAs de enzimas de fase I en los HHU fueron mayores que los medidos en células HepG2 y se mostraron más cercanos a los niveles de los hepatocitos humanos, incluso superándolos en algunas ocasiones. Esto nos indicaría que, a nivel transcripcional, los HHU tendrían un perfil más similar al de los hepatocitos en cultivo primario que las HepG2, el modelo celular más utilizado para los estudios de hepatotoxicidad. El perfil de expresión de enzimas de fase II, también varía en función del donante (Figura 3). Los niveles de mRNA de GSTM1, 112

GSTA1 y GSTA2 de HHU del donante 1 fueron similares o mayores a los de los hepatocitos humanos y se mostraron bastante estables hasta los 21 días de cultivo, lo que contrasta con los bajos niveles de mRNA de todas las GSTs medidos en el donante 2. Por su parte, el donante 3 presentó niveles de mRNA prácticamente indetectables para GSTM1 y niveles elevados para GSTA1 y GSTA2 (incluso mayores que los hepatocitos humanos) que fueron disminuyendo de forma progresiva con el tiempo de cultivo. A pesar de las diferencias observadas entre los HHU de los tres donantes analizados, los niveles de mRNA de enzimas GST fueron siempre iguales o superiores a los de las células HepG2. Con respecto a las UGTs, los niveles de mRNA de UGT2B7 en HHU fueron más elevados que en hepatocitos, mientras que la expresión de UGT1A1 fue menor. Para ambos enzimas, los niveles de mRNA de los HHU fueron mayores que en células HepG2. De nuevo el perfil temporal fue diferente dependiendo del donante, con un aumento continuado de los niveles de mRNA en el donante 1 y una disminución progresiva en los otros dos donantes. Desde un punto de vista global, la expresión de genes de enzimas de Fase I y II en los HHU se mantiene con el tiempo de cultivo y aquellos genes que se expresan desde los primeros días de cultivo siguen expresándose a día 21. Actividad de los enzimas CYP450 La Figura 4 muestra los resultados obtenidos tras evaluar las actividades CYP450 en las diferentes preparaciones celulares. Tal y como se observó previamente en el estudio del mRNA, los valores más bajos de actividad en las HHU correspondían a CYP1A2, CYP2C19 y CYP2D6. Por el contrario, CYP2E1 presentó una actividad elevada que contrasta con su escasa expresión génica. Así mismo, se observaron ciertas diferencias entre donantes, destacando la elevada actividad CYP2C9 en el donante 1 y de las actividades CYP2A6 y CYP3A4 en el donante 3 (en ambos casos estos resultados se corresponden con lo observado en los niveles de mRNA). Con respecto a la evolución temporal de las actividades también se observaron diferencias entre donantes. Al igual que en los mRNAs, las actividades CYP450 de los HHU del donante 1 mostraron una tendencia a aumentar con los días de cultivo, no observándose un patrón definido de evolución para los otros donantes. A día 0 de cultivo, las actividades CYP450 en los donantes 2 y 3 fueron, en general, más elevadas que en el donante 1; sin embargo, en este último las actividades aumentaron progresivamente con el tiempo de manera que, a días 14 y 21 presentaron niveles de actividad similares, o incluso superiores, a los de los otros dos donantes. Destacamos que, a excepción de CYP1A2, CYP2C19 y CYP2D6, el resto de enzimas presentaban mayor actividad en HHU que en HepG2. Ensayos de toxicidad Como prueba de concepto de la utilidad de los HHU como modelo in vitro para el estudio de la hepatotoxicidad a largo plazo inducida por fármacos, se midieron los efectos producidos por ketoconazol y valproato, dos fármacos hepatotóxicos modelo, y dexametasona, para la que no se han descrito efectos tóxicos y que se seleccionó como control negativo. El estudio se realizó en HHU del donante 2, dado que estas células son las que, en general, habían mostrado los niveles más bajos de mRNAs y/o actividades de enzimas de biotransformación a los tiempos más largo de cultivo (días 14 y 21). Las células se trataron con 3 concentraciones de cada fármaco y la toxicidad se determinó tras 1, 3, 7, 14 y 21 días de tratamiento mediante la medida de los efectos sobre la viabilidad celular, la acumulación de lípidos y fosfolípidos, la concentración intracelular de calcio y los niveles de GSH. Los resultados obtenidos para cada fármaco y parámetros se resumen en la Figura 5, relativizados a las células no tratadas, cuyo valor corresponde al 100%. La dexametasona no produjo efectos en los parámetros analizados, a ninguno de los tiempos de tratamiento (días 1 a 21) ni concentraciones del fármaco estudiadas (Figura 5A-E respectivamente). En el caso del ketoconazol, se observó una disminución de la viabilidad celular a

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Figura 2: Perfiles de expresión génica para enzimas de fase I en HHU de tres donantes. Los niveles de mRNA correspondientes a cada enzima se midieron en HHU a diferentes tiempos de cultivo: 0, 3, 7, 14 y 21 días. También se muestran los niveles de mRNA en hepatocitos humanos en cultivo primario (PHH) y en la línea celular de hepatoma HepG2. Los resultados se expresan como veces sobre el correspondiente valor en PHH. Obsérvese las diferencias de expresión para un mismo gen entre los diferentes donantes y dentro de un mismo donante y gen. Nótese que la expresión génica en los HHU es superior a la de las células HepG2.

Figura 3: Perfiles de expresión génica para los enzimas de fase II en HHU de tres donantes. Los niveles de mRNA correspondientes a cada enzima se midieron en HHU a diferentes tiempos de cultivo: 0, 3, 7, 14 y 21 días. También se muestran los niveles de mRNA en hepatocitos humanos en cultivo primario (PHH) y en la línea celular de hepatoma HepG2. Los resultados se expresan como veces sobre el correspondiente valor en PHH. Obsérvese las diferencias de expresión para un mismo gen entre los diferentes donantes y dentro de un mismo donante y gen.

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Figura 4: Perfiles de actividad para los enzimas de fase I CYP450 en HHU de tres donantes (1, 2 y 3). Se midieron actividades correspondientes a tiempo 0, 1, 3, 7, 14 y 21 días. Los resultados se expresan como picomoles de metabolito formado por minuto y por miligramo de proteína celular. Obsérvese las diferencias de actividad para un mismo gen entre los diferentes donantes de la misma manera que esta expresión también varía dentro de un mismo donante y enzima.

Figura 5: Ensayo de toxicidad HCS en células HHU del donante 2 tratadas con dosis repetidas de fármacos modelo. Representación gráfica del porcentaje de viabilidad celular (A-C), esteatosis (D-F), fosfolipidosis (G-I), Ca2+ citoplasmático (J-L) y GSH (M-O) para los fármacos Dexametasona, Ketoconazol y Valproato y sus correspondientes concentraciones Cmax/5, Cmax y 5xCmax en los HHU del donante 2. Todos los valores se han comparado con el control de células no tratadas (línea discontinua) usando tstudent como test estadístico (n=3). Las diferencias significativas se representan con asterisco(s): *** p_valor<0,001, ** p_valor<0,01 y * p_valor<0,05.

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partir del día 3 para los HHU tratados con la concentración más alta del fármaco, acompañada de un aumento del Ca2+ citoplasmático y una disminución de la concentración de GSH (Figura 5F, I y J). No obstante, también se observaron efectos esteatósicos a concentraciones del fármaco que no comprometen la viabilidad celular (1,4 y 7 µM) (Figura 5G). Cabe destacar el aumento de la fosfolipidosis para la concentración de 35 µM del fármaco (Figura 5H). El tratamiento con valproato sólo indujo cambios significativos en la viabilidad celular a día 21 y a la concentración más elevada (Figura 5K). Sin embargo, se pudo observar un aumento de la esteatosis (Figura 5L) para las tres concentraciones del fármaco, incluso a tiempos cortos de exposición. También advertimos un aumento significativo en la concentración de Ca2+ citosólico a partir de 3 días de tratamiento con las concentraciones 481 µM y 2405 µM y a tiempos más largos en el caso de la mínima concentración testada (Figura 5N). En contraste, no se apreciaron cambios destacables en el contenido de fosfolípidos. Finalmente, detectamos una progresiva disminución en la concentración de GSH a partir del día 3 de tratamiento con el fármaco (Figura 5O).

Discusión Los HHU constituyen un modelo celular generado recientemente que se ha propuesto como alternativa a los hepatocitos primarios y las líneas de hepatoma, los modelos celulares hepáticos de uso habitual en los estudios de metabolismo y hepatotoxicidad por fármacos (Burkard et al., 2012, Ramachandran et al., 2015, Schaefer et al., 2016). En el presente trabajo hemos abordado la caracterización de los enzimas de metabolización de fármacos en los HHU y la idoneidad de este nuevo modelo para abordar estudios de hepatotoxicidad a largo plazo. Para ello, hemos analizado la expresión y/o actividad de un amplio número de enzimas de biotransformación en HHU de tres donantes diferentes. En términos generales, los HHU presentan niveles de mRNA de enzimas de biotransformación más elevados que las células de hepatoma HepG2, la línea celular de origen humano más utilizada para el estudio de la hepatotoxicidad. Del mismo modo, las actividades de los enzimas CYP450 muestran, en general, valores más altos en HHU que en HepG2, destacando las actividades CYP2C9, CYP3A4, CYP2B6, CYP2E1 o CYP2A6 como las que muestran mayores diferencias entre ambos tipos de células. En comparación con los hepatocitos humanos, los niveles de los diferentes mRNA son cercanos a los de los hepatocitos humanos, e incluso superándolos en algunas ocasiones (p.e. para CYP2A6, CYP2B6, POR, GSTs y UGT2B7). No obstante, los niveles de mRNA y actividad de CYP1A2 son muy bajos en todas las preparaciones de HHU, tal y como se ha descrito en estudios previos realizados con HHU de otros donantes (Burkard et al., 2012; Tolosa et al., 2016). Cabe destacar la elevada actividad CYP2E1 observada en HHU, frente a los niveles bajos de mRNA, confirmando que su regulación se da por estabilización del enzima y no por su síntesis de novo (Burkard et al., 2012). Los niveles de mRNA y/o de actividad para un determinado enzima varían de un donante a otro y, dentro de un mismo donante el perfil temporal de expresión también varía. Estas diferencias pueden ser reflejo de la variabilidad interindividual característica del hígado humano, pues estamos comparando células procedentes de donantes diferentes. Es bien conocido que la población humana presenta grandes variaciones en la capacidad de metabolización de fármacos y estas diferencias, particularmente elevadas en los enzimas CYP450, se atribuyen a diversos factores genéticos o de otra índole (estado fisiológico u hormonal, enfermedades hepáticas o inflamatorias, exposición a agentes químicos, nutrición etc.) (Gómez-Lechón et al., 2003). Algunos enzimas (CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9) son altamente polimórficos en la población humana, lo que determina grandes diferencias tanto a nivel de su expresión como de su actividad; mientras que la variabilidad

observada para otros enzimas (CYP3A4, CYP2B6) se atribuye fundamentalmente a su inducibilidad por fármacos y otros xenobióticos. Así mismo, las diferencias observadas podrían deberse también a la edad del donante (Hines et al., 2013). De hecho, los niveles de mRNA de los CYP450 del donante 1 (niña caucásica, 9 años) aumentan progresivamente con el tiempo de cultivo, mientras que esta evolución no se observa en los donantes adultos 2 y 3 en los que predomina un perfil oscilante de expresión (p.e. para CYP3A4) o, en algunos casos, un perfil estable con el tiempo (CYP2B6). Por último, las diferencias que hemos observado entre los diferentes donantes también pueden estar relacionadas con el propio procedimiento de generación de las HHU, que puede condicionar el grado de diferenciación de los hepatocitos proliferantes obtenidos para cada donante y su adaptación a la condiciones de cultivo in vitro (Schaefer et al., 2016). Un aspecto interesante de los resultados obtenidos es que, independientemente de las variaciones entre donantes, los HHU cultivados durante varias semanas muestran niveles detectables de mRNA y de actividades enzimáticas de los CYP450, observándose un cierto nivel de estabilidad funcional entre los días 14 y 21. Estos resultados contrastan con la inestabilidad de los hepatocitos humanos en cultivo primario, que muestran una expresión génica menguada y un progresivo deterioro funcional a lo largo de cultivo con niveles de actividad prácticamente indetectables a partir de 7 días en cultivo (Richert et al., 2006; Godoy et al., 2013). Nuestros resultados muestran la capacidad funcional de los HHU cultivados durante periodos prolongados de cultivo y avalan su potencial como modelo in vitro para el estudio de la hepatotoxicidad inducida por fármacos a largo plazo. Una vez constatada la capacidad funcional de los HHU tras varias semanas de cultivo, se exploró su idoneidad como modelo in vitro para evaluar la hepatotoxicidad crónica. Se estudiaron los efectos tóxicos tras la exposición de las células durante diferentes periodos de tiempo con dosis repetidas de valproato y ketoconazol, simulando los tratamientos farmacológicos de larga duración con estos fármacos para los que se han descrito casos de DILI (Greenblatt y Greenblatt, 2014; Siramolpiwat y Sakonlaya, 2017). Tal y como se observa en la Figura 5, con el uso de HCS es posible detectar cambios sutiles en las células relacionados con la toxicidad aunque la viabilidad celular permanezca íntegra. Así, en el caso del valproato observamos efectos esteatósicos incluso a una concentración cinco veces menor que la Cmax. Estos efectos esteatósicos ya se han descrito previamente y son debidos a la capacidad del valproato para entrar en la mitocondria, unirse a acetil-CoA y deplecionar sus niveles, de manera que se inhibe la ß-oxidación de ácidos grasos, que se acumulan en los hepatocitos y se inhibe la fosforilación oxidativa, con formación de ROS (Schumacher y Guo, 2015). Por ello, también se observa la disminución de GSH, indicativo del aumento del estrés oxidativo (Gómez-Lechón, 2016). La afectación de la mitocondria por valproato genera una desregulación en la síntesis de ATP y la disminución de los niveles de ATP que afecta, entre otros sistemas, al transporte activo mediado por la ATPasa-PMCA, necesaria para expulsar Ca2+ al medio extracelular y la ATPasa SERCA, necesaria para introducir el Ca2+ en el retículo endoplasmático. Como consecuencia, la expulsión del Ca2+ del citoplasma se ve mermada y este se acumula en el citoplasma tal y como podemos observar en nuestros resultados (Figura 5N). Un aumento del Ca2+ implica la activación de rutas de señalización en ausencia de los estímulos correspondientes así como la activación de la apoptosis celular llevando a la célula a la muerte (Bruce, 2017). Los resultados obtenidos con el ketoconazol confirman su papel inductor de la esteatosis a largo plazo a concentraciones que no afectan a la viabilidad celular (Tarantino et al., 2009) (Figura 5G) y sugieren su capacidad para afectar negativamente a la mitocondria, tal y como se ha descrito anteriormente (Tolosa et al., 2012). Es posible, por tanto, que valproato y ketoconazol compartan dianas comunes en su mecanismo de hepatotoxicidad, lo que debería ser estudiado con mayor profundidad. Además, destacamos el aumento del Ca2+ citoplasmático y una disminución de la GSH a concentraciones

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elevadas del fármaco, así como su capacidad fosfolipidósica, la cual ya se había descrito en HepG2 (Nioi et al., 2007). El conjunto de los resultados obtenidos con estos fármacos avala la utilidad del ensayo para analizar los cambios celulares que se dan en las fases iniciales de un proceso tóxico, previas a la muerte celular, permitiendo obtener información acerca de los mecanismos de hepatotoxicidad implicados. En definitiva, los HHU representan una nueva aproximación que aventaja a otras herramientas in vitro utilizadas hasta el momento para estudios de hepatotoxicidad, pues aúnan un fenotipo cercano a los hepatocitos humanos y una capacidad replicativa controlada. Además, dada su estabilidad fenotípica a largo plazo, los HHU posibilitan la realización de estudios prolongados con dosis repetidas de los fármacos, lo que supone una ventaja respecto a los hepatocitos primarios y líneas celulares como HepG2, que no pueden ser utilizados en estudios que requieren tiempos prolongados de cultivo. Por otro lado, su fácil manejo y mantenimiento, así como su corto protocolo de diferenciación, hacen que los HHU cobren ventaja frente a otros modelos celulares con mayores exigencias técnicas (p.e., línea celular HepaRG), permitiendo llevar a cabo los estudios en menor tiempo. Consideramos que el uso combinado de células HHU y de tecnologías innovadoras de análisis celular, como es el HCS, puede hacer posible el desarrollo y aplicación de ensayos adecuados para el estudio de la toxicidad hepática crónica. Con ello se podría dar respuesta a la necesidad actual de disponer de una estrategia in vitro adecuada para anticipar la hepatotoxicidad crónica durante las primeras etapas del desarrollo farmacéutico. No obstante, es necesario profundizar en el estudio y caracterización de los HHU para aprovechar todo su potencial en el campo de la hepatología, toxicología y descubrimiento de fármacos.

Agradecimientos

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Las autoras agradecen la financiación recibida por parte del Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I+D+I 2013-2016) y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) a través de la ayuda PI16/00333 y el contrato CP16/00097 Miguel Servet I recibido por L. Tolosa.

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Hepatocitos Humanos Upcytes como modelo experimental in vitro para el estudio del daño hepático inducido por fármacos a largo plazo

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Ecotoxicidad aguda en Physa cubensis P. y Artemia salina L. de 8 antibacterianos con riesgo ambiental Hernández Martínez E.M.a*, Carrazana García D.I.b, González González R.b, García López A.b, Marrero Chang O.a, Águila Jiménez E.a, Morales Monteagudo A.a y López Hernández Y.a a b

Centro de Bioactivos Químicos. Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas. Carretera a Camajuaní Km 5 ½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas. Carretera a Camajuaní Km 5 ½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba.

Resumen: Los productos farmacéuticos son ampliamente utilizados en todo el planeta. Existe una creciente preocupación por los efectos que los medicamentos consumidos y los desechos de estos producen en el ambiente. A pesar del gran uso de los antibacterianos no son muy investigados como contaminantes, prestándose mayor atención a la antibioresistencia por lo que el objetivo de la investigación fue evaluar la ecotoxicidad aguda de antibacterianos. Teniendo en cuenta el consumo de los antibacterianos y la predicción de sus concentraciones ambientales así como su ecoxicidad en Lactuca sativa L ya previamente determinados en anteriores investigaciones se determinó el riesgo ecotoxicológico en Artemia salina L. y Physa cubensis P. En el ensayo de Artemia salina la Ceftazidima se clasifica como muy tóxico con valor de CL50 de 0,060773 g/L, la Cefepima con valor de 0,993731 g/L como moderadamente tóxica y el resto de los antibacterianos evaluados se clasifican como no tóxicos. En los bioensayos en Physa cubensis Cefepima y Cefazolina ocasionaron la mayor mortalidad con CL50 de 0,000270 y 0,025684 g/L respectivamente y los que indujeron menor mortalidad fueron Vancomicina y Amoxicilina/Sulbactam con CL50 de 1,528440 y 1,055492 g/L. El vertimiento de residuos de antibacterianos puede ser causa de contaminación ambiental perjudicial para algunas especies. Palabras clave: antibacterianos; Artemia salina L., ecotoxicidad aguda; Physa cubensis P. Abstract: Acute toxicity in Physa cubensis P. and Artemia salina L. of 8 antibiotics with environmental risk. Pharmaceuticals are widely used all over the planet. There is growing concern about the effects that drugs and its residues produce in the environment. Despite the wide use of antibacterial, they are not very investigated as pollutants, paying greater attention to the antibiotic resistance, so the objective of this research was to evaluate the antibacterial acute ecotoxicity. Taking into account the antibacterial consumption and the prediction of their environmental concentrations as well as their ecotoxicity in Lactuca sativa L already determined in previous research, the ecotoxicological risk was determined in Artemia salina L. and Physa cubensis P. In the Artemia salina trial Ceftazidime is classified as very toxic with LC50 value of 0.060773g/L, Cefepime with value of 0.993731g/L is classified as moderately toxic and the rest of antibacterial evaluated are classified as non-toxic. In bio trials of Physa cubensis, Cefepime and Cefazolin caused the greatest mortality with LC50 0.000270 and 0.025684g/L respectively, and the ones that led lower mortality were Vancomycin and Amoxicillin/Sulbactam with LC50 of 1.528440 and 1.055492 g/L. The dumping of antibiotics residues can be the cause of environmental pollution, detrimental to some species. Keywords: acute toxicity, antibacterial, Artemia salina L., Physa cubensis P.

Introducción Los Fármacos y Productos de Cuidado Personal (Pharmaceuticals and Personal Care Products, PPCPs), constituyen un grupo diverso de químicos que han sido recientemente reconocidos como contaminantes del medio ambiente acuático, especialmente en áreas urbanizadas. Los PPCPs comprenden todas las drogas *e-mail: emaria@uclv.cu 118

(medicamentos o fármacos) prescritas y de venta libre, los agentes de diagnóstico y otros químicos que son consumidos en grandes cantidades, como las fragancias en perfumes y otros productos del hogar (Gil et al., 2012). En los últimos 15 años, diferentes reportes demuestran que los fármacos representan una nueva clase de contaminantes del medio ambiente que presentan las propiedades necesarias para su bioacumulación, provocando efectos desconocidos en los ecosistemas acuáticos o terrestres. Por lo que los medicamentos se han convertido en un problema medio ambiental de envergadura (Carmona et al., 2014; Esteban et al., 2014). Los antibacterianos constituyen uno de los grupos de compuestos farmacéuticos que se han encontrado en lagos y corrientes a través del mundo, la presencia de estos compuestos en el ambiente ha aumentado los efectos tóxicos en los organismos y la presencia de especies de bacterias con resistencia antibiótica (Ramos y Pellón, 2006; Jiménez, 2011; Passos et al., 2011). Entre los antibacterianos con mayor reporte en los cuerpos de agua están las tetraciclinas (Dang et al., 2007), los aminoglucósidos (Shakil et al., 2008), los macrólidos, los betalactámicos y la vancomicina (Jiménez, 2011). El problema de la resistencia a los antibacterianos es ecológico y nunca antes se había visto que los organismos infecciosos fueran resistentes a tan alto número de antibacterianos (Márquez, 2008). La aplicación indiscriminada y el uso irracional de antibacterianos ha provocado que estos se encuentren en cantidades cada vez mayores en el medio ambiente, amplificando las consecuencias ecológicas y poniendo en peligro la salud del ser humano. Actualmente en Europa hay más de 3 000 ingredientes activos permitidos para su uso en el cuidado de la salud. Sin embargo, desde que se detectara el primer residuo de ácido clofíbrico hasta el momento, únicamente unos 100 de ellos han sido alguna vez analizados en diferentes compartimentos medioambientales. La necesidad de seguir trabajando en esta línea de investigación, en la que se debe incluir el estudio de los metabolitos y los productos de transformación, es, por tanto, evidente (Barceló y López de Alda, 2008). Los medicamentos son producidos y usados en grandes volúmenes que se incrementan cada año. Con este crecimiento se comienza a hacer referencia sobre el destino y efectos de estos compuestos en el medioambiente (Bound y Voulvoulis, 2005; Iannacone y Alvariño, 2009). Cabe destacar que los productos farmacéuticos son formulaciones complejas y que sus coadyuvantes también generan productos de transformación, que interactúan con la materia orgánica y bajo las condiciones propias del ecosistema, pueden ser potencialmente más tóxicos e incluso más bioacumulables (Jiménez, 2011). El descubrimiento de los medicamentos en los ecosistemas acuáticos, ha estimulado la investigación de estos en la década pasada y el principal problema radica, en que son los contaminantes emergentes más importantes puesto que aún no se conoce bien el riesgo ambiental que suponen. El objetivo de esta investigación fue evaluar la ecotoxicidad aguda en Artemia salina L. y Physa cubensis P. de diversos compuestos antibacterianos vertidos por el Hospital Provincial Universitario ‘‘Dr. Celestino Hernández Robau’’ en un área del río Bélico en Santa Clara,

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Ecotoxicidad aguda en Physa cubensis P. y Artemia salina L. de 8 antibacterianos con riesgo ambiental

Cuba.

Material y métodos Evaluación ecotoxicológica del riesgo ambiental Los bioensayos toxicológicos agudos de exposición a los antibacterianos se realizaron en el Centro de Bioactivos Químicos (CBQ), ubicado en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, bajo la asesoría de especialistas. Para el desarrollo de las técnicas y procedimientos toxicológicos se utilizaron las guías aprobadas por la US-EPA (United States-Environmental Protection Agency) (EPA, 1996). Se realizaron los siguientes ensayos: toxicidad aguda en Artemia salina Linnaeus, 1758 (Laboratory of Ecotoxicology, ICT. Prague) (Artoxkit, 1990; Persoone y Wells, 1987), y toxicidad aguda en Physa cubensis Pfeiffer, 1839 (Iannacone y Alvariño, 1998; Iannacone y Alvariño, 2002). Según la predicción (Hernández et al., 2016) y teniendo en cuenta el elevado número de antibacterianos que podían considerarse peligrosos para el ambiente se hizo una selección preliminar de aquellos de mayor consumo y carencia de datos toxicológicos como ceftriaxona, cefazolina y cefuroxima para evaluar su toxicidad, se seleccionaron otros de alto consumo como ceftazidima y meropenem, y otros con carencia de datos toxicológicos como vancomicina, cefepima y amoxicilina más sulbactam. Se consideró un ensayo del tipo estático donde no hay renovación de la solución durante el estudio. Los antibacterianos empleados en el ensayo fueron: cefazolina, ceftriaxona, cefuroxima, ceftazidima, cefepima, amoxicilina más sulbactam, vancomicina y meropenem; comercializados por los Laboratorios de producción del Grupo Empresarial Químico Farmacéutico (QUIMEFA). Ensayo de toxicidad aguda en larvas de Artemia salina L. Para el ensayo de toxicidad aguda en larvas de A salina se consideraron cinco concentraciones de cada antibacteriano y un grupo control, con tres réplicas cada tratamiento. Se prepararon diluciones seriadas (10; 1; 0.1; 0.01; 0.001 g/L) que permitieran establecer el intervalo de concentración conveniente para obtener valores de efecto entre 0 y 100 % necesarios para calcular la CL50 (Concentración Letal Media). Se realizó simultáneamente la evaluación de la toxicidad de las muestras empleando un grupo control utilizando agua destilada. Se utilizaron larvas de A salina provenientes de la Empresa para el Cultivo del Camarón UEB Yaguacán. Se colocó en cada placa de Petri de 100 mm de diámetro 4.95 mL de agua de mar artificial (AMA) previamente preparada, se añadió una alícuota de 100µL conteniendo al menos 10 larvas, luego se añadieron 4.95 mL de la dilución con el antibacteriano. Se incubaron durante 48 horas a una temperatura de 25± 2 ºC en completa oscuridad. Ensayo de toxicidad aguda en Physa cubensis P. Se realizó según se describe en acápite anterior. Se utilizaron ejemplares de Physa cubensis P. (Moluscos) obtenidos de la cría artificial bajo estándares de calidad procedentes del CBQ. Se seleccionaron y aleatorizaron los moluscos, se colocaron 10 moluscos en cada frasco verificándose que estuvieran en movimiento continuo, se agregó 15 mL de la dilución con el antibacteriano en el frasco de ensayo. Se incubaron durante 96 horas a una temperatura de 22± 2 ºC con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

LSD y una prueba de Dunett para los resultados obtenidos. Para verificar las diferencias con respecto al grupo control, los resultados con un p < 0.05 se consideraron como diferencias estadísticas. Se utilizó el programa StatSoft, Inc. Ver. 8.0 (2007) realizando ajustes de modelos de curvas sigmoides para estimar la CL50 utilizando la ecuación y=E0+Emax*x^n/(x^n+DE50^n). La toxicidad se interpretó en función del porcentaje de letalidad: 0-10 % no tóxico, 11-50 % moderadamente tóxico, 51-90 % altamente tóxico y 100 % extremadamente tóxico. El grado de toxicidad se definió en función del rango en que se encontraron los valores de CL50 de acuerdo con las categorías siguientes: extremadamente tóxico (CL50< 10 µg/mL), muy tóxico (10< CL50 <100), moderadamente tóxico (100< CL50 <1 000) y no tóxico (CL50> 1 000 µg/mL) (Valdés et al., 2003).

Resultados y discusión Evaluación ecotoxicológica del riesgo ambiental Los resultados de los antibacterianos que mostraron un efecto tóxico frente a los bioensayos se muestran en la Tabla 1, en los subacápites se desglosan estos resultados. El antibacteriano que provocó más efecto tóxico fue la Cefepima pues sus efectos se observaron en todos los bioensayos. Tabla 1. Antibacterianos con mayor efecto tóxico sobre las especies estudiadas.

Antibacterianos

Especies

Cefazolina

Physa cubensis

Ceftazidima

Physa cubensis y Artemia salina

Cefepima

Physa cubensis y Artemia salina

Ensayo de toxicidad aguda en larvas de Artemia salina L. Los resultados del ensayo se muestran en las Figuras 1 y 2. De los cincos antibacterianos pertenecientes al grupo de las cefalosporinas (Fig. 1), Ceftriaxona y Cefazolina presentaron la menor toxicidad con valores por debajo del 50%, Ceftazidima y Cefuroxima mostraron 100% de mortalidad a las 48h a la mayor concentración evaluada, manteniéndose Ceftazidima como altamente tóxico a la concentración de 1g/L obteniendo la menor CL50 de todas las sustancias ensayadas y siendo así el más tóxico de los nueve antibacterianos evaluados (Tabla 2), Cefepima tuvo alta toxicidad a la concentración más alta y de moderada a no tóxica en las demás. Tabla 2. Concentración Letal Media de los antibacterianos estudiados en Artemia salina L.

Antibacterianos

CL50 24h (g/L)

CL50 48h (g/L)

Cefazolina

Cefuroxima

1,097360

Ceftazidima

0,060773 0,993731

Cefepima

Ceftriaxona

Vancomicina

1,326802

1,701808

Amoxicilina/Sulbactam

2,173923

Meropenem

1,702266

Expresión de los resultados

La Vancomicina (glucopéptido) mostró ser extremadamente tóxico a la concentración de 10g/L con un 100% de mortalidad tanto a las 24 como a las 48 horas, en las concentraciones decrecientes se comporta como moderadamente tóxico a no tóxico (Fig. 2).

Se determinó el porcentaje de mortalidad para cada concentración y el grupo control mediante la ecuación: %Mortalidad = Total Muertos/ Total x 100. Estos se compararon con un análisis de ANOVA (One-way; p < 0.001) para verificar diferencias y para detectar la diferencia entre los grupos se utilizaron los intervalos

La Amoxicilina más Sulbactam que es una combinación de ingredientes activos pertenecientes al grupo de las Aminopenicilinas e inhibidores de las β-lactamasas, mostró alta toxicidad en la concentración de 10g/L y de moderada a no tóxica en las otras concentraciones ensayadas (Fig. 2). El Meropenem tuvo un

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Hernández Martínez E.M, Carrazana García D.I, González González R, García López A, Marrero Chang O, Águila Jiménez E, Morales Monteagudo A, López Hernández Y.

Figura 1: Evaluación de cinco antibacterianos pertenecientes al grupo de las cefalosporinas sobre Artemia salina L

Figura 2: Evaluación de tres antibacterianos sobre Artemia salina L.

comportamiento similar al Amoxicilina más Sulbactam (Fig. 2). Los valores de la CL50 calculada para los antibacterianos que mostraron una mortalidad por encima del 50% se muestran en la Tabla 2. Teniendo en cuenta la clasificación de toxicidad seis de los antibacterianos evaluados se clasifican como no tóxicos, solo Cefepima como moderadamente tóxico y la Ceftazidima como muy tóxico. Aunque estas clasificaciones poseen variaciones entre sí, todas coinciden en agrupar las sustancias con CL50 inferiores a 100 µg/mL en las categorías de mayor toxicidad, mientras, los que muestran valores superiores a 1 000 µg/mL se clasifican como no tóxicos (Valdés et al., 2003). Ensayo de toxicidad aguda en Physa cubensis P. Los resultados del ensayo se muestran en las Figuras 3 y 4.

120

De los cinco antibacterianos pertenecientes al grupo de las cefalosporinas (Fig. 3), Ceftriaxona y Cefuroxima se comportaron de manera similar con alta y extrema toxicidad a las concentraciones de 10g/L y 1 g/L, Cefazolina mostró toxicidad extrema a 48 h y 96 h en las mayores concentraciones, siendo altamente tóxico a las 96 h con la concentración de 0,1 g/L, Cefepima mostró 100% de mortalidad en todas las lecturas a 1g/L y 10g/L, a la concentración de 0,1g/L se comportó como altamente tóxico a las 24 y 48 h y a las 96 h como extremadamente tóxico; en el resto de las concentraciones a las 48 y 96h mostró alta toxicidad. Ceftazidima solo tuvo 100% de mortalidad a la mayor concentración a las 96h y de moderada a no tóxica en las restantes concentraciones ensayadas. La Vancomicina mostró ser extremadamente tóxico a la concentración de 10g/L con un 100% de mortalidad tanto a las 24, 48 como a las 96 horas, en las concentraciones decrecientes se comporta como moderadamente tóxico a no tóxico (Fig. 4).

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Ecotoxicidad aguda en Physa cubensis P. y Artemia salina L. de 8 antibacterianos con riesgo ambiental

La Amoxicilina más Sulbactam mostró toxicidad extrema en la concentración de 10g/L en todas las lecturas y de moderada a no tóxica en las otras concentraciones ensayadas (Fig. 4). El Meropenem a la concentración de 10 g/L a las 24h se comportó como moderadamente tóxico, a las 48h altamente tóxico y en las 96h como extremadamente tóxico, al ir disminuyendo las concentraciones ensayadas su toxicidad también disminuyo (Fig. 4). Los valores de CL50 calculados para todos los antibacterianos se muestran en la Tabla 3. Teniendo en cuenta la clasificación de toxicidad la mayoría de los antibacterianos evaluados se clasifican como no tóxicos y moderadamente tóxicos, solo Cefepima como extremadamente tóxico tanto a las 24, 48 como 96 h y Cefazolina como altamente tóxico a las 96 h de exposición.

Tabla 2. Concentración Letal Media de los antibacterianos estudiados en Physa cubensis P.

Antibacterianos

CL50 24h (g/L) CL50 48h (g/L) CL50 96h (g/L)

Cefazolina

0,914167

0,275027

0,025684

Cefuroxima

6,015467

0,362968

0,125221

Ceftazidima

10,52863

0,900942

Cefepima

0,006134

0,000909

0,000270

Ceftriaxona

6,568923

1,586198

0,243479

Vancomicina

1,314643

1,199507

1,528440

Amoxicilina/Sulbactam

1,635832

1,635289

1,055492

Meropenem

12,16852

0,619982

0,165002

Figura 3: Evaluación de cinco antibacterianos pertenecientes al grupo de las cefalosporinas sobre Physa cubensis P.

Figura 4: Evaluación de tres antibacterianos sobre Physa cubensis P.

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Hernández Martínez E.M, Carrazana García D.I, González González R, García López A, Marrero Chang O, Águila Jiménez E, Morales Monteagudo A, López Hernández Y

es, la probabilidad de ocurrencia de efectos negativos en el ecosistema marino (Ong y Din, 2001; Iannacone y Alvariño, 2003).

Discusión Evaluación ecotoxicológica del riesgo ambiental Es importante tener en cuenta que las investigaciones del efecto tóxico de los fármacos (en particular antibacterianos) son limitadas, la mayoría de los estudios están enfocados en la evaluación de metales pesados, biocidas y detergentes de diferentes orígenes. El ensayo utilizado es de toxicidad aguda por lo que en ensayos de toxicidad subcrónica y crónica pudieran obtenerse otros resultados. También debido a que las aguas residuales de los hospitales pueden contener diferentes compuestos químicos que afecten de manera indirecta a los ecosistemas acuáticos, es esperable que la mezcla compleja de compuestos farmacéuticos dentro de los cuales se pueden encontrar los antibacterianos, pueda presentar efectos tóxicos y/o genotóxicos sobre el ambiente, aunque dichos compuestos se encuentren en pequeñas cantidades (Magdaleno et al., 2012). Ensayo de toxicidad aguda en larvas de Artemia salina L. Artemia salina es un invertebrado que forma parte de la fauna de los ecosistemas de aguas salobres. Este organismo posee una importante función dentro de la cadena alimenticia pues son fuente de alimentación para otras especies (Singh, 2007). Actualmente, Artemia salina se utiliza como especie de bioensayo para: investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias químicas, detección de toxinas naturales en comestibles y farmacéuticos, estudios de modelos de acción tóxica de sustancias, y estudios de la transferencia trófica de contaminantes. Este ha probado ser un organismo versátil y valioso en pruebas de toxicidad, particularmente si es estudiado con otras especies endémicas (Pino y Jorge, 2010). Los resultados del presente estudio coinciden con los reportados en un estudio preliminar (Hernández et al., 2014) donde se evaluaron los mismos compuestos a las concentraciones de 10 y 100 mg/L a las 24 horas, y encontraron que estos se comportan como no tóxicos. Estos resultados coinciden con los reportados por Irahola y Giménez, 2000 donde evaluaron un grupo de fármacos dentro de los que se encuentran antibacterianos como: Cloranfenicol, Estreptomicina, Ampicilina, Eritromicina, Rifampicina y Amoxicilina (componente de Amoxicilina más Sulbactam) con muy baja toxicidad (valor de CL50 por encima de 1000 mg/L), excepto para la Tetraciclina que mostró una CL50 de 26 mg/L. En otro estudio los resultados de la CL50 para Cefalexina y Amoxicilina se encuentran por encima de 1000 mg/L corroborando nuestros resultados (Pérez, 2003). Todos los antibacterianos presentaron valores de PEC/PNEC inferiores a 0,1 (riesgo insignificante) con excepción de Ceftazidima cuyo valor fue de 0,5 (riesgo bajo), coincidiendo con lo reportado internacionalmente (Stockholm County Council, 2014) para este antibacteriano, no obstante todos los valores inferiores a 1 indican que el medicamento no presenta riesgo de bioacumulación o toxicidad.

Los resultados del presente estudio concuerdan con los reportados en un estudio preliminar donde se evaluaron los mismos compuestos a la concentración de 1g/L a las 24 y 96 h, y encontraron que estos se comportan como moderadamente tóxicos, solo Cefepima y Cefazolina se comportaron como altamente tóxicos a las 96 horas con mortalidad superior al 50% (Hernández et al., 2013). Todos los antibacterianos presentaron valores de PEC/PNEC inferiores a 0,1 (riesgo insignificante) a las 24 horas de exposición con excepción de Cefepima cuyo valor fue de 0,9 (riesgo bajo) y a las 48 horas Cefazolina con valor de 0,2 presentó riesgo bajo mientras que Cefepima riesgo moderado con 5,8. A las 96 horas de exposición Cefuroxima y Ceftriaxona con valores de 0,2 y 0,4 se clasificaron de riesgo bajo mientras que Cefazolina y Cefepima con valores de 2,6 y 19,7 de riesgo moderado y alto respectivamente. Lo reportado internacionalmente por Stockholm County Council, 2014 no concuerda con los resultados obtenidos en la investigación como vemos para Cefepima que en la literatura aparece con riesgo insignificante. En el caso de Cefepima como el valor es superior a 1 se recomienda pasar a la Fase II nivel B y obtener dato específicos sobre toxicidad crónica, en microorganismos, y estudios de bioacumulación (Lobo et al., 2012).

Conclusiones En Artemia salina L. se determinó que la Ceftazidima se clasifica como muy tóxico, la Cefepima y Cefotaxima como moderadamente tóxicos y el resto de los antibacterianos evaluados como no tóxicos. En Physa cubensis P. se determinó que Cefepima y Cefazolina se clasifican como muy tóxicos y Vancomicina y Amoxicilina más Sulbactam como no tóxicos. El vertimiento de residuos de antibacterianos puede ser causa de contaminación ambiental perjudicial para algunas especies.

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Ecotoxicidad aguda en Physa cubensis P. y Artemia salina L. de 8 antibacterianos con riesgo ambiental

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Efectos in vivo e in vitro del insecticida organofosforado diazinón en la actividad colinesterasa del sistema nervioso de conejos (Orictolagus cuniculus) Chaves JJ1, Soler F1,3, Perez-Lopez M1,2, Oropesa AL*1,2 1

Area de Toxicología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Avda. de la Universidad, s/n, 10003 Cáceres, Spain. INBIO G+C Research Institute, University of Extremadura, Avda. de la Universidad, s/n, 10003 Cáceres, Spain. 3 IPROCAR Research Institute, University of Extremadura, Avda. de la Universidad, s/n, 10003 Cáceres, Spain. 2

Resumen: En el presente estudio se investigó la sensibilidad de la actividad colinesterasa del sistema nervioso del conejo (Orictolagus cuniculus) al insecticida diazinón tanto in vivo como in vitro. En el ensayo in vivo, los animales fueron expuestos oralmente a dosis únicas de diazinón (25 o 125 mg/kg) y tras 10 días fueron sacrificados para obtener el cerebro, el cerebelo y la médula espinal. En ellos se determinó la actividad colinesterasa con el fin de conocer sus valores basales en conejo (grupo control) al igual que el potencial de inhibición in vivo originado por exposición a este pesticida (grupos expuestos). Los valores basales de actividad colinesterasa, usando la acetiltiocolina como sustrato, fueron 258.5 ± 38.0, 242.4 ± 32.0 y 235.1 ± 27.2 nmol/min.mg proteínas para el cerebro, el cerebelo y la médula espinal, respectivamente. En los grupos expuestos a diazinón no se observó inhibición de la actividad colinesterasa en comparación con la actividad del grupo control. En el ensayo in vitro se expusieron homogeneizados de los tres tejidos nerviosos de conejos control a distintas concentraciones de diazinón (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/l). La actividad colinesterasa permaneció constantemente deprimida en relación concentración y tiempo dependiente a lo largo del periodo experimental (30 minutos, 9, 24 y 48 horas) en todos los tejidos evaluados. La Concentración Inhibitoria Media (CI50) de la actividad AChE para el diazinón se estimó en 0.154, 0.138 y 0.159 mg/l para el cerebro, el cerebelo y la médula espinal, respectivamente. Se concluye la necesidad de establecimiento de una actividad basal o de referencia en cada laboratorio cuando se pretenda utilizar esta actividad con fines diagnósticos de exposición a plaguicidas anticolinesterásicos. Palabras clave: Colinesterasa, conejos, diazinón, sistema nervioso. Abstract: In vivo and in vitro effects of the organophosphorus insecticide diazinon on the cholinesterase activity of the rabbit (Orictolagus cuniculus) nervous system. In the current study, the in vivo and in vitro sensitivity of nervous system cholinesterase activity to pesticide diazinon in rabbits (Orictolagus cuniculus) was investigated. In the in vivo assay, animals were orally exposed to single doses of diazinon (25 or 125 mg/kg) and after 10 days were sacrificed to obtain the brain, cerebellum and spinal cord. The cholinesterase activity in these tissues was determined to know its basal values in rabbits (control group) as well as the potential in vivo inhibition caused by exposure to this pesticide (exposed groups). The basal values of cholinesterase activity were 258.5 ± 38.0, 242.4 ± 32.0 and 235.1 ± 27.2 nmol/min.mg protein to brain, cerebellum and spinal cord, respectively, using acetylthiocholine as substrate. No inhibition of cholinesterase activity in the exposed groups compared with the control group was observed at the end of the assay. In the in vitro assay, the supernatants of the homogenized of tissues were exposed to 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4 mg/l of diazinon. The cholinesterase activity remained steadily depressed in a concentration and time dependent relationship throughout the experimental period (30 minutes, 9, 24 and 48 hours) in all tissues assessed. The Mean Inhibitory Concentration (IC50) of cholinesterase activity to diazinon was estimated in 0.154, 0.138 and 0.159 mg/l to brain, cerebellum and spinal cord, respectively. To determine a basal activity in each laboratory is necessary to use this enzymatic activity for diagnostic purposes of exposure to anticholinesterase pesticides. *e-mail: aoropesa@unex.es 124

Keywords: Cholinesterase, diazinon, nervous system, rabbits.

Introducción El diazinón (0,0-dietil 0-2-isopropil-6-metilpirimidin-4-il fosforotioato; no. CAS 60-51-5) es un plaguicida organofosforado (OF) de amplio espectro, perteneciente al grupo de los tiofosfatos, utilizado como insecticida, nematicida y acaricida (Aggarwal et al., 2013). Este plaguicida experimenta un proceso de bioactivación en el organismo transformándose en su forma oxón, diazoxón, que posee una fuerte acción tóxica (Zhang y Pehkonen, 1999). Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la actividad enzimática acetilcolinesterasa (AChE), que es una B esterasa que hidroliza el neurotransmisor acetilcolina (Eto, 1974). Como consecuencia de ello, se produce una acumulación de dicho neurotransmisor en las sinapsis colinérgicas originándose una alteración en la función nerviosa y la correspondiente intoxicación (Peakall, 1992). Los plaguicidas OFs son rápidamente degradados y excretados del organismo, por lo que no es fácil detectarlos utilizando análisis químico, existiendo la posibilidad de obtener falsos resultados negativos en el diagnóstico de exposición a los mismos (Hill y Fleming, 1982; Hill 2003; Fairbrother 1996). De aquí se deriva la importancia del empleo de la determinación de la actividad AChE, ya que esta enzima permanece inhibida a pesar de que el OF se haya eliminado del organismo. Los valores de esta actividad enzimática constituyen un indicador idóneo del estado funcional del sistema nervioso. Por ello, este parámetro bioquímico es considerado como un biomarcador de exposición y de efecto de los denominados plaguicidas “anticolinesterásicos” que incluye tanto a los OFs como a los carbamatos (Walker et al., 1996). Su determinación es empleada habitualmente para diagnosticar la exposición a estos plaguicidas en mamíferos (Davies y Holub, 1980; Westlake et al., 1983; de Blaquière et al., 2000; Farag et al., 2006; Ueyama et al., 2007; Čolović et al., 2015). Sin embargo, su aplicación en conejos ha sido, en general, muy escasa (Takahashi et al., 1994; Al-Sarar et al., 2011). Aunque sí se ha utilizado en algunos países extracomunitarios, desde el año 2007 (Decisión 2007/393/CE) el diazinón no está incluido entre los plaguicidas autorizados en la Unión Europea para su uso en agricultura de acuerdo al Reglamento 1107/2009 relativo a la comercialización de productos fitosanitarios. Sin embargo, sí está aprobado su uso para otras aplicaciones como es la de antiparasitario en medicina veterinaria, siendo diversos medicamentos los que lo contienen en su composición para su uso en el ganado doméstico y las mascotas para combatir parásitos externos. Se aplican por vía tópica, bien como concentrados para diluir antes del baño antiparasitario (por aspersión o inmersión), bien como productos listos para su uso en forma de crotales insecticidas para el ganado o como collares y otros productos tópicos (jabones, champús, etc.) para mascotas, que pueden llevar una composición de hasta el 60 % de diazinón (http://www.vademecumveterinario.com; https://www.aemps.gob.es/cimavet/). El estudio realizado por Martínez-Haro et al. (2008) recoge episodios de intoxicación con diazinón en animales (mamíferos y aves). Por otro lado, es bien conocido que el conejo es un lagomorfo utilizado ampliamente en experimentación animal, siendo el conejo blanco neozelandés una de las razas establecidas como modelo ideal para estudios experimentales multipropósito. De esta forma, el

Efectos in vivo e in vitro del insecticida organofosforado diazinón en la actividad colinesterasa del sistema nervioso de conejos (Orictolagus cuniculus)

conocimiento de todas las características fisiológicas, metabólicas, patológicas, etc. de los animales es de gran importancia en experimentación animal (Fox et al., 2002). El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto tanto in vivo como in vitro del plaguicida OF diazinón sobre la actividad AChE del sistema nervioso de conejo. Material y métodos Sustancias químicas Acetiltiocolina yodada, ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) y albumina sérica bovina fueron suministrados por SigmaAldrich Química S.A., St. Louis, USA. Ácido fosfórico 85 %, etanol absoluto, fosfato dipotásico y fosfato de potasio monobásico fueron proporcionados por Panreac S.A., España. Azul brillante de Coomassie G250 de Merck, Alemania. Diazinón (Pureza: 98.3%) fue suministrado por Fluka, Seelze, Alemania. Animales, alojamiento y exposición a diazinón El estudio se realizó con un total de 24 conejos blancos neozelandeses (Oryctolagus cuniculus), 12 machos y 12 hembras, de 6 meses de edad y un peso medio de 3.2 ± 0.6 kg. La exposición in vivo a diazinón se llevó a cabo en el Servicio de Animalario de la Universidad de Extremadura (sede Cáceres; número de registro: ES 1003700001803). El ensayo se realizó conforme al Real Decreto 53/2013 y con la aprobación del Comité de Ética de Experimentación animal de la Universidad de Extremadura. Los conejos fueron albergados de forma individual en jaulas ubicadas en una habitación con condiciones microclimáticas de 21 ± 1 ºC de temperatura y un fotoperiodo de 12 h luz (7 a.m.–19 p.m.)/12h oscuridad (19 p.m.–7 a.m.). El suministro de alimento y agua fue ad libitum. Los conejos se mantuvieron 15 días en periodo de aclimatación y posteriormente se llevó a cabo el ensayo manteniendo siempre las condiciones citadas anteriormente. Los conejos se dividieron en 3 grupos constituidos por 8 animales cada uno (4 machos y 4 hembras): ‐

1 grupo control (exposición a etanol -15 %- y agua destilada).

‐

2 grupos tratados (exposición a una dosis oral única de diazinón: 25 y 125 mg/kg p.v.). El diazinón fue diluido primeramente en etanol, seguidamente en agua destilada y posteriormente administrado por sonda gástrica. Las dosis ensayadas corresponden a 0.1 DL50 y 0.5 DL50 (DL50 es la dosis que produce la mortalidad del 50% de los animales, DL50 para conejos 250 mg/kg; Merck index, Yehia et al., 2007). Tras 10 días de la administración de diazinón, todos los conejos fueron anestesiados y eutanasiados utilizando CO2 a elevadas concentraciones en una cámara especialmente diseñada para este uso. Inmediatamente se procedió a realizar una necropsia reglada con el fin de obtener cerebro, cerebelo y médula espinal que fueron almacenados en congelación (-80ºC) hasta el posterior procesado de las muestras. Estos órganos fueron homogeneizados en tampón fosfato (0.1 M; pH=7.2). Los homogeneizados fueron centrifugados a 5000xg durante 3 min a 4ºC (Avanti® 30, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). Determinación de la actividad acetilcolinesterasa y de la concentración de proteínas del tejido nervioso La actividad AChE se determinó empleando el método colorimétrico de Ellman et al. (1961), adaptado a la lectura en placas multipocillo por Guilhermino et al. (1996), midiendo durante 5 minutos la cinética enzimática de una solución constituida por 0.050 ml del sobrenadante del homogeneizado de los tejidos nerviosos y 0.250 ml de mezcla de reacción [30 ml de tampón fosfato (0.1 M, pH=7.2),

1ml de reactivo DTNB (10 mM) y 0.2 ml de yoduro de acetiltiocolina 0.075 M] a una longitud de onda de 412 nm y en un lector de placas multipocillo Power-Wave™ BioTek®. El ensayo fue realizado a una temperatura de 37 ºC que es la recomendada para mamíferos (Thompson, 1999). Cada muestra fue analizada por cuadruplicado y la actividad enzimática fue expresada como nanomoles de sustrato (acetiltiocolina yodada) hidrolizados por minuto por mg de proteínas. La concentración de proteínas fue determinada en los sobrenadantes de los homogeneizados de los tejidos nerviosos conforme al método de Bradford (1976) adaptado a la lectura en placas multipocillo y utilizando como estándar albúmina sérica bovina. Ensayo de inhibición in vitro de la actividad acetilcolinesterasa por diazinón El efecto in vitro del diazinón sobre la actividad AChE se evaluó sobre los sobrenadantes de los homogeneizados de los tejidos nerviosos (mezcla de sobrenadantes de conejos controles) a las siguientes concentraciones: 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/l. Para ello, se incubaron 0.005 ml de la concentración madre adecuada del plaguicida (usando etanol como solvente) con 0.495 ml de una mezcla de los sobrenadantes de los homogeneizados de dichos tejidos, a temperatura ambiente (25 ºC) y en la oscuridad. La actividad AChE se determinó una vez finalizado el periodo de incubación y a los 30 min, 9, 24 y 48 h siguiendo el mismo procedimiento descrito en el apartado anterior. Los grupos controles fueron incubados con 0.005 ml de etanol. Se emplearon 4 replicados para cada tiempo y concentración. Finalmente se calculó la concentración inhibitoria 50 (concentración de plaguicida que produce una inhibición del 50% de la actividad AChE - CI50), utilizando el procedimiento propuesto por Trevan (Repetto y Repetto, 2009) que se basa en transformar la relación obtenida entre el % de efecto (en este caso inhibición de la actividad AChE) y la concentración en una relación final lineal que permite interpolar la concentración que corresponde al 50 % del efecto. Estudio estadístico Los resultados fueron expresados como media ± error estándar de la media. La normalidad y homogeneidad de la varianza fueron evaluadas utilizando los tests de Kolmogorov–Smirnov y Levene, respectivamente. Como las anteriores condiciones no fueron cumplidas, se aplicaron los tests no paramétricos de Kruskal–Wallis, para detectar diferencias estadísticas entre todos los grupos, y de la U de Whitney, para detectar diferencias estadísticas entre cada uno de los grupos tratados y los controles (Zar, 1996). En el ensayo in vitro no se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos controles (control, control-etanol) por tanto fueron considerados como un único grupo. El nivel de significación fue seleccionado como igual o inferior a 0.05 y todos los análisis estadísticos fueron llevados a cabo utilizando el software estadístico GraphPad Prim, versión 5, para Windows. Resultados y discusión Valores basales de actividad acetilcolinesterasa del tejido nervioso de conejos El sistema nervioso central en mamíferos posee una alta concentración de enzima AChE en las neuronas. Dicha enzima se encuentra principalmente en las neuronas colinérgicas, estando distribuida en dendritas, axones y especialmente concentrada en las sinapsis. Los capilares y otras células sanguíneas del cerebro, así como de la médula espinal, contienen también esta enzima (Holmstedt, 1971; Picco et al., 2008). El conocimiento de los niveles basales de actividad AChE es necesario para poder detectar la inhibición en dicha actividad enzimática originada por la exposición de los animales a agentes anticolinesterásicos, tales como los plaguicidas OFs. En nuestro estudio, los valores basales de actividad AChE en el tejido nervioso de los conejos controles (n=8) fueron 258.5 ± 38.0, 242.4 ± 32.0 y

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Chaves JJ, Soler F, Perez-Lopez M, Oropesa AL.

235.1 ± 27.2 nmoles de acetiltiocolina yodada hidrolizados/min.mg de proteínas para cerebro, cerebelo y médula, respectivamente. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre estos valores entre los tres tejidos nerviosos analizados (p > 0.05). Existe una gran variabilidad en los valores basales de la actividad AChE en el tejido nervioso de conejos encontrados en la literatura, oscilando entre 11.1 y 87000 nmoles de acetiltiocolina yodada hidrolizados/min.mg de proteínas para el cerebro y 6.5 y 83.3 nmoles de acetiltiocolina yodada hidrolizados/min.mg de proteínas para el cerebelo (Owasoyo e Iramain, 1979; Costa et al., 2012; Aly y ElGendy, 2015). Esta gran variabilidad en valores basales indica la necesidad de que cada laboratorio disponga de valores propios de referencia para poder establecer un diagnóstico de exposición a plaguicidas anticolinesterásicos, mediante el análisis de la actividad AChE en tejido nervioso. Efecto de la exposición in vivo a diazinón en la actividad acetilcolinesterasa del tejido nervioso de conejos Los compuestos OFs inactivan la AChE mediante inhibición enzimática competitiva e irreversible. Su mecanismo de acción se basa en la fosforilación de dicha enzima en las terminaciones nerviosas. El átomo central de fósforo de estos compuestos tiene una deficiencia de electrones y esta configuración favorece la atracción hacia el sitio esteárico de la AChE, que posee un excedente de electrones, formando un enlace covalente con el grupo nucleofílico de la enzima (Jeyaratnanm y Maroni, 1994).

Bradbury, 1981; Fleming y Grue, 1981). La recuperación experimentada en la actividad AChE, llegando incluso a superar en algunos casos los valores observados en los controles, con bastante probabilidad, se debe a la síntesis de nueva enzima, ya que el plaguicida evaluado es un compuesto OF que inhibe de forma irreversible esta enzima y la única posibilidad de recuperación de la actividad enzimática, en estos casos, es por activación de los procesos metabólicos de formación de nueva enzima (Soler-Rodríguez et al., 1998). Efecto de la exposición in vitro a diazinón en la actividad acetilcolinesterasa del tejido nervioso de conejos La mayor inhibición (97 %) de la actividad AChE en cerebro de conejo se produjo tras 48 h de incubación a la concentración más alta evaluada de diazinón (40 mg/l). La inhibición de dicha actividad enzimática fue concentración- y tiempo-dependiente (Tabla 1). Tabla 1. Actividad acetilcolinesterasa (AChE) cerebral (media ± error estándar de la media de cuatro replicados) de conejos (Oryctolagus cuniculus) a lo largo de 48 h de exposición in vitro a 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/l de diazinón. Tiempo de Actividad AChE (nmol/min.mg proteína) exposición Control 0.025 mg/l 0.05 mg/l 0.1 mg/l 0.2 mg/l 0.4 mg/l a diazinón (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, a a a a %) %) %) %) %) a 0 min 30 min

238.1 ± 1.5 237.3 ± 1.1

217.1± 2.2 (9) 190.9 ± 1.8* (17) 184.1 ± 3.0* (16) 165.6 ± 2.1* (24)

210.6 ± 1.8 (11) 132.8 ± 0.1* (42) 120.4 ± 1.3* (45) 107.9 ± 0.5* (50)

156.1 ± 1.4* (34) 75.7 ± 0.9** (67) 41.9 ± 1.5** (81) 35.7 ± 1.2** (84)

86.8 ± 0.7** (63) 41.3 ± 1.8** (82) 20.2 ± 2.0*** (91) 17.3 ± 0.9*** (92)

49.9 ± 1.6** (79) 18.2 ± 1.1*** (92) 8.7 ± 0.7*** (96) 6.2 ± 1.4*** (97)

Para cada uno de los tejidos nerviosos estudiados no se observaron diferencias estadísticamente significativas en los valores de la actividad AChE entre los individuos expuestos a diazinón (25 mg/kg p.v.; 125 mg/kg p.v.) y los correspondientes controles (U MannWhitney, p> 0.05) (Figura 1). Por lo tanto, una exposición oral simple a dosis de 0.1 DL50 y 0.5 DL50 de diazinón no inhibió de forma duradera la actividad AChE en ninguno de los tejidos nerviosos estudiados. Así, si se produjo cierta inhibición de dicha actividad enzimática tras la exposición inmediata a este plaguicida, dicha actividad recuperó su valor basal al finalizar el ensayo (10 días).

*=(p ≤ 0.05), **=(p ≤ 0.01) y ***=(p ≤ 0.001) respecto a su correspondiente grupo control (U Mann-Whitney). a Porcentaje de inhibición de la actividad AChE en relación a la actividad AChE de su grupo control

Figura 1: Actividad acetilcolinesterasa (AChE) en tejido nervioso (media ± error estándar de la media) de conejos (Oryctolagus cuniculus) tras una exposición oral simple a diazinón. Los resultados están expresados como la media ± el error estándar de la media.

En un reciente estudio in vitro realizado en ratas se ha observado una inhibición de la actividad AChE cerebral del 24 % tras 1 h de incubación con una concentración de 3 mg/l de diazinón (Čolović et al., 2015). Podemos indicar que la actividad AChE cerebral de las ratas es más sensible a la exposición a diazinón que la de los conejos, ya que en nuestro estudio una concentración de 2.5 mg/l (similar a la de 3 mg/l usada en ratas) produjo una misma inhibición de esta actividad enzimática (24 %) pero transcurridas 48 h en conejos, mientras que en ratas esto ocurrió al cabo de 1 h. Esta menor sensibilidad de la AChE de conejos se corrobora con el hecho de que el valor de este porcentaje de inhibición enzimática se asemeja a los porcentajes de inhibición encontrados en nuestro estudio a los 30 minutos de exposición pero a concentraciones más altas, que fueron las de 5 y 10 mg/l de diazinón (11-34 %, respectivamente, Tabla 1 y Figura 2).

En este mismo ensayo, aunque siendo objeto de un trabajo paralelo (Oropesa et al., 2014), se evaluó el efecto del diazinón sobre la actividad AChE plasmática. Se observó que ésta experimentaba una importante inhibición los 3 primeros días tras la exposición al plaguicida, recuperando su valor basal a los 7 días de la exposición. En esta línea, en ratas expuestas a diazinón (50 mg/l) se observó un porcentaje de inhibición de la actividad AChE cerebral del 55 % a las 3 h post-exposición, pero transcurridas 48 h dicha actividad enzimática recuperó su valor basal (de Blaquière et al., 2000). La actividad AChE recupera sus valores fisiológicos si la exposición a un inhibidor es discontinua (Fleming, 1981), como ocurrió en nuestro ensayo. Estudios realizados en aves demuestran que la recuperación de la actividad AChE cerebral ocurre en dos fases; una fase inicial de rápida recuperación y otra fase donde la actividad se recupera poco a poco en varios días (Fleming, 1981; Fleming y 126

229.8± 0.8

24 h

218.3 ± 1.3

48 h

216.9 ± 1.0

Figura 2: Inhibición de la actividad acetilcolinesterasa (AChE) cerebral a lo largo de 48 h de exposición a 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/l de diazinón.

Si comparamos el presente estudio con la inhibición in vitro por diazinón de la actividad AChE plasmática en conejos a las

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Efectos in vivo e in vitro del insecticida organofosforado diazinón en la actividad colinesterasa del sistema nervioso de conejos (Orictolagus cuniculus)

concentraciones 3.13 y 6.25 mg/l (Oropesa et al., 2014), similares a las concentraciones 2.5 y 5 mg/l, podemos observar un comportamiento inhibitorio similar en ambos tejidos. La mayor inhibición de la actividad AChE cerebral y plasmática se produjo en las primeras 24 h de exposición al plaguicida, seguido de un porcentaje de inhibición más o menos constante hasta finalizar el ensayo. No obstante, se pudo comprobar que a este tiempo el porcentaje de inhibición fue superior en el caso de la actividad AChE plasmática (56 y 79 % a las concentraciones de 3.13 y 6.25 mg/l, respectivamente) con relación a la actividad AChE cerebral (19 y 45 % a las concentraciones de 2.5 y 5 mg/l, respectivamente, Tabla 1 y Figura 2). Estos datos ponen de manifiesto una mayor sensibilidad a los plaguicidas OFs de la actividad AChE plasmática frente a la actividad AChE de tejido nervioso. Tanto la actividad AChE cerebelar como la medular de los sobrenadantes expuestos a las diferentes concentraciones de diazinón se vieron, en general, inhibidas significativamente (p < 0.05, p < 0.01 o p < 0.001) de una forma concentración- y tiempodependientes con relación a la actividad determinada en cada tiempo para el grupo control (Tablas 2 y 3; Figuras 3 y 4). Además, los porcentajes de inhibició n observados fueron muy similares a los observados en cerebro. Por lo tanto, en caso de exposición a diazinón en conejos se podría elegir cualquiera de estos tejidos para detectar la inhibición de dicha actividad enzimática. La inhibición experimentada por la actividad AChE en todos los tejidos nerviosos estudiados fue constante, ya que no se observó recuperación de dicha actividad enzimática a lo largo del tiempo. Este hecho es obvio pues en un ensayo in vitro no existen mecanismos de degradación metabólica del agente anticolinesterásico ni tampoco mecanismos de síntesis de nueva enzima. Finalmente, y partiendo de los resultados observados en las Tablas 1, 2 y 3, se estimó la CI50 de la actividad AChE cerebral, cerebelar y medular a los 30 min de exposición a diazinón, siendo esta de 0.154, 0.138 y 0.159 mg/l, respectivamente. No hemos encontrado en la bibliografía estudios relativos a la inhibición in vitro de la actividad AChE cerebral por parte del diazinón en ninguna especie de mamífero. Por ello, no podemos comparar si la potencia inhibitoria de este plaguicida es la misma con independencia de la especie expuesta. Conclusiones A partir de nuestro estudio podemos concluir que los valores normales de actividad acetilcolinesterasa son muy similar en cerebro, cerebelo y médula ósea de conejos, siendo necesario establecer valores de referencia de esta actividad enzimática en tejido nervioso en cada laboratorio que pretenda utilizar dicho biomarcador para diagnosticar exposición a compuestos anticolinesterásicos, ya que los encontrados en la literatura no son adecuados a efectos comparativos. Por otra parte, se ha observado que una exposición oral simple a dosis de diazinón de 25 y 125 mg/kg p.v. no inhibe la actividad acetilcolinesterasa en cerebro, cerebelo y médula trascurridos 10 días de la exposición a este plaguicida. Por último, conviene indicar que el diazinón origina una inhibición in vitro de la actividad acetilcolinesterasa similar en el cerebro, cerebelo y médula ósea de conejos, con una CI50 en el rango de los 14-16 mg/l.

Tabla 2. Actividad acetilcolinesterasa (AChE) cerebelar (media ± error estándar de la media de cuatro replicados) de conejos (Oryctolagus cuniculus) a lo largo de 48 h de exposición in vitro a 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/l de diazinón. Tiempo de Actividad AChE (nmol/min.mg proteína) exposición Control 0.025 mg/l 0.05 mg/l 0.1 mg/l 0.2 mg/l 0.4 mg/l a diazinón (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, a a a a %) %) %) %) %) a 0 min 30 min

289.3 ± 2.0 275.7 ± 1.6

264.2 ± 1.9

24 h

260.4 ± 1.3

48 h

256.5 ± 1.0

255.6 ± 1.8 (7) 226.7 ± 1.1 (14) 222.8 ± 1.5 (14) 213.2 ± 1.7 (17)

219.8 ± 0.9* (20) 172.2 ± 1.7* (35) 139.7 ± 1.0* (46) 133.6 ± 1.5* (48)

153.0 ± 1.7* (44) 83.2 ± 1.1** (68) 53.1 ± 1.8** (80) 50.6 ± 2.0** (80)

100.1 ± 0.8** (64) 37.9 ± 1.4*** (86) 25.0 ± 1.7*** (90) 19.7 ± 2.1*** (92)

61.4 ± 0.7** (78) 16.0 ± 1.2*** (94) 10.2 ± 1.1*** (96) 9.5 ± 1.0*** (96)

Tabla 3. Actividad acetilcolinesterasa (AChE) medular (media ± error estándar de la media de cuatro replicados) de conejos (Oryctolagus cuniculus) a lo largo de 48 h de exposición in vitro a 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/l de diazinón. Tiempo de Actividad AChE (nmol/min.mg proteína) exposición Control 0.025 mg/l 0.05 mg/l 0.1 mg/l 0.2 mg/l 0.4 mg/l a diazinón (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, (Inhibición, a a a a %) %) %) %) %) a 0 min

30 min

269.3 ± 2.4 258.5 ± 2.0

248.2 ± 1.5

24 h

241.2 ± 1.9

48 h

231.6 ± 2.1

255.0 ± 1.8 (1) 236.6 ± 2.1 (5) 231.8 ± 2.4 (4) 226.1 ± 1.7 (2)

218.7 ± 1.5* (15) 171.0 ± 1.7* (31) 151.2 ± 1.2* (37) 140.1 ± 0.9* (40)

149.7 ± 1.6* (42) 88.1 ± 1.7** (65) 68.7 ± 1.4** (72) 63.7 ± 1.9** (73)

88.8 ± 1.4** (66) 34.5 ± 1.0*** (86) 21.1 ± 1.8*** (91) 20.8 ± 1.4*** (91)

63.5 ± 2.0** (75) 16.8 ± 1.7*** (93) 12.7 ± 1.4*** (95) 10.2 ± 1.1*** (96)

Figura 3: Inhibición de la actividad acetilcolinesterasa (AChE) cerebelar a lo largo de 48 h de exposición a 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/l de diazinón.

Agradecimientos Los autores desean agradecer la ayuda económica recibida por el Ministerio de Educación y Ciencia del Gobierno de España (CTM2007-60041).

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Validación de la metodología analítica basada en micro-extracción dispersiva líquido-líquido combinada con cromatografía líquida para la determinación del ácido diclorofenoxiacético en orina Borello J.S.*; Cañas A. I.; Lucero P.A. Centro de Excelencia en Productos y Procesos de Córdoba. Pabellón CEPROCOR. Santa María de Punilla (X5164). Córdoba. República Argentina.

Resumen: Se validó la metodología analítica que emplea microextracción líquido-líquido dispersiva acoplada a demulsificación con solventes seguida por cromatografía líquida de alto desempeño con detector de foto-arreglo de diodos para la determinación del ácido diclorofenoxiacético en orina humana. Se utilizó acetonitrilo como solvente dispersante/desemulsificante en la proporción 750 µL/750 µL y 1-octanol como solvente extractante (75 µL). La validación del método se realizó con muestras aisladas de orina de voluntarios adultos, de ambos sexos y sin exposición conocida al herbicida. Se evaluaron los siguientes parámetros: linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, selectividad, precisión, veracidad, estabilidad del analito en la muestra e incertidumbre. El método fue lineal entre de 30 µg/L - 120 µg/L; los límites de detección y cuantificación obtenidos fueron de 10 µg/L y 30 µg/L respectivamente. No se observaron en las muestras enriquecidas señales de interferentes en el tiempo de retención del analito y la señal cromatográfica fue espectralmente homogénea. La precisión se evaluó a través del HorRat: 0,4 para el nivel 30 µg/L y 0,6 para el nivel 60 µg/L. El rango de recuperación obtenido para el nivel de 30 µg/L fue: 79 % -115 % y para 60 µg/L: 76 % - 114 %. El analito en la muestra es estable una semana a 4 ° C y un mes a 20°C. La incertidumbre expandida estimada fue 11 µg/L y 19 µg/L para los niveles 30 µg/L y 60 µg/L respectivamente. La aplicabilidad del método validado fue evaluada con muestras reales de trabajadores rurales. Palabras clave: Ácido diclorofenoxiacético;Micro-extracción liquido-liquido dispersiva acoplada a demulsificación con solventes, Orina; Validación. Abstract: Validation of analytical methodology based on dispersive liquid-liquid microextraction combined with liquid chromatography for determination of urine dichlorophenoxyacetic acid Analytical methodology employing dispersive liquid-liquid microextraction coupled to solvent-based de-emulsification followed by liquid chromatography high performance with photodiode array detector for determining the dichlorophenoxyacetic acid in human urine was validated. It was used acetonitrile as a solvent dispersing/demulsifier in the ratio 750 µL/750 µL and 1-octanol as a solvent extractant (75 µL). The method validation was performed with isolated urine samples from men and women adult volunteers without known exposure to the herbicide. During the validation process linearity, limit of detection, limit of quantification, selectivity, precision, accuracy, stability of the analyte in the sample and uncertainty were evaluated. The method was linear between 30 µg/L - 120 µg/L; limits of detection and quantification were 10 µg /L and 30 µg/L respectively. Were not observed in the spiked samples interfering signals in the analyte retention time and the chromatographic signal was spectrally homogeneous. Precision was evaluated through HorRat: 0.4 for level 30 µg/L and 0.6 for level 60 µg/L. The recovery rate obtained for the level of 30 µg/L was: 79 % -115 % and for the level 60 µg/L: 76 % - 114 %. The analyte in the sample is stable one week at 4 ° C and one month at -20 ° C. The estimated expanded uncertainty was 11µg/L and 19 µg/L for levels 30 µg/L and 60 µg/L respectively. The applicability of the validated method was evaluated with actual samples of rural workers. Keywords: Dichlorophenoxyacetic acid; Dispersive liquid-liquid *e-mail: julietaborello@gmail.com 130

microextraction; Urine; Validation. Introducción En los programas que evalúan la exposición humana los métodos de análisis empleados para cuantificar herbicidas son continuamente modificados y mejorados de modo que los resultados óptimos se logren de manera rentable. Se busca que los métodos reduzcan al mínimo el procesamiento de la muestra y mantengan o mejoren la exactitud, precisión y sensibilidad (Gardner et al., 2005). El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (Figura 1) es un herbicida sistémico hormonal auxínico ampliamente usado para eliminar malezas de hoja ancha en cultivos de trigo, maíz, cebada y sorgo y en las tierras de pastoreo y pastizales. Las formulaciones comerciales incluyen ésteres y sales y presentan variaciones en sus propiedades químicas, comportamiento ambiental y en menor medida en su toxicidad (IPCS, 1987).

Figura 1: Estructura química del ácido 2, 4- diclorofenoxiacético

En la provincia de Córdoba-Argentina la Ley N° 8820 prohíbe la utilización con fines fitosanitarios de los herbicidas ácido 2,4diclorofenoxiacético y ácido 2,4-diclorofenoxibutírico en su formulación como ésteres, en algunas pedanías de la provincia (Ministerio de Agricultura, 2012). A partir del corriente año, por la Resolución Ministerial N°112, se prohíbe el uso y aplicación de los herbicidas ácido 2,4 diclorofenoxiacético en formulaciones ésteres butílicos e isobutílicos; cualquiera sea la modalidad a utilizarse (aérea, terrestre o manual), en todo el territorio de la provincia de Córdoba en el período comprendido entre el 01 de agosto al 31 de marzo correspondiente a cada campaña productiva (Ministerio de Agricultura, 2016). La exposición al 2,4-D puede ocurrir por las vías inhalatoria, digestiva y dermal (Bukowska, 2006). En el organismo humano sufre una limitada biotransformación y es eliminado inalterado por vía urinaria. La vida media de eliminación del 2,4-D por vía urinaria es de 10-28 horas después de una dosis oral. Para una dosis dérmica es de 18-68 horas para 2,4-D y de 18-87 horas para 2,4-D dimetilamina (Thomas et al., 2010). Los niveles urinarios de 2,4-D como ácido libre pueden por lo tanto ser usados como indicadores de exposición a este compuesto y a sus sales (Rosales-Conrado et al., 2008). En orina el 2,4-D ha sido tradicionalmente analizado por cromatografía gaseosa (CG) debido a los muy bajos límites de detección que se alcanzan. Entre los métodos de detección disponibles para CG, la espectrometría de masas (MS) es la más conveniente por su sensibilidad y selectividad. Debido a su polaridad, los herbicidas ácidos son menos volátiles y térmicamente inestables por lo tanto, deben derivatizarse para ser analizados por CG. La derivatización se lleva a cabo después de la preparación de la muestra que comprende hidrólisis, extracción con solvente, clean-up y pre-concentración (Ranz y Lankmayr, 2006). El método de elección para identificar, confirmar y cuantificar el 2,4-

Validación de la metodología analítica basada en micro-extracción dispersiva líquido-líquido combinada con cromatografía líquida para la determinación del ácido…

D en muestras biológicas de personas con exposición ambiental, es la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (CL-MS-MS). Los métodos para la determinación de fenoxiácidos al nivel de trazas en matrices complejas incluyen un primer paso de extracción con solvente orgánico y un segundo paso de pre-concentración. Los métodos que emplean CL con detección ultravioleta –visible (UV-Vis) se han usado para analizar muestras de orina de trabajadores con exposición laboral puesto que no se requieren en este caso límites de detección tan bajos (Conrado et al., 2007; Dickow et al., 2000). Las concentraciones urinarias resultantes de exposición laboral encontradas en la bibliografía pueden ser tan altas como 500 µg/L (Rosales-Conrado et al., 2008) y hasta 2500 µg/L (Thomas et al., 2010). Datos de biomonitoreo de trabajadores muestran valores medios de 2,4-D en orina entre 5 – 45 µg/L con valores máximos entre 410 – 2500 µg/L (Burns y Swaen, 2012). En los últimos años, la técnica tradicional de extracción líquidolíquido ha sido desplazada por técnicas de extracción miniaturizadas. En el año 2006 Assadi y colaboradores desarrollaron la micro-extracción líquido-líquido dispersiva (DLLME). Esta técnica, permite la simultánea extracción y concentración de los analitos, tiene su fundamento en el uso de un sistema ternario de solventes, constituido por la fase acuosa (la muestra de la que los analitos pretenden ser extraídos) y una mezcla de dos disolventes orgánicos, uno miscible con el agua y que funciona como agente dispersante y otro inmiscible con agua y miscible con el agente dispersante, llamado agente extractante. La mezcla dispersante-extractante se pone en contacto con la fase acuosa, se observa la formación de una emulsión, que incrementa al máximo la superficie de contacto entre las fases, favoreciendo así la rápida transición del analito entre la muestra y el extractante. Posteriormente se procede a la centrifugación para obtener la separación de las dos fases, formándose una gota del agente extractante que contiene los analitos extraídos y por otro, la muestra acuosa en la que se encuentra disuelto el agente dispersante. Los parámetros que se utilizan para caracterizar la eficacia son el factor de enriquecimiento (EF) y la recuperación (R). La eficiencia de la extracción está influenciada por muchos factores tales como: tipo de solvente extractante y dispersante y su relación de volúmenes, tiempo de extracción y adición de sales. Después de la separación de fases, la gota se extrae con una microjeringa y finalmente se inyecta en el sistema de medida. Posteriormente se procede a su separación por cromatografía gaseosa (CG) o líquida de alta resolución (HPLC), permitiendo así su identificación y cuantificación por diferentes detectores como el de espectrometría de masas, PDA, UV-Vis, etc. Este procedimiento ha sido aplicado al análisis de residuos de plaguicidas, metales pesados, hidrocarburos aromáticos policíclicos, etc. Se trata de una técnica sencilla, rápida, económica, efectiva y que requiere de pocos microlitros de solvente en cada extracción. Su principal desventaja es la inestabilidad de la gota, que en ocasiones causa problemas de repetibilidad de la extracción. Los parámetros que afectan a la microextracción son: fuerza iónica, pH de la muestra, agitación de la muestra, disolvente de extracción, tiempo de extracción, volumen de la gota y temperatura. Una alternativa que se presenta es la microextracción líquido-líquido dispersiva acoplada a demulsificación con solventes (SD-DLLME), en esta técnica la extracción termina con la adición de una segunda porción del disolvente dispersor que actúa como un de-emulsionante y promueve la separación de las fases. La estabilidad de las pequeñas gotas del solvente de extracción en la emulsión depende de la naturaleza de la interface, carga eléctrica superficial, fuerzas de Van Der-Waals, etc. Factores tales como la velocidad de agitación, temperatura, viscosidad y la presencia de una impureza puede jugar un papel importante en la eficacia de demulsificación (Behbahani et al., 2014). El objetivo de este trabajo fue realizar la validación de una metodología analítica que utiliza SD-DLLME acoplada a HPLC con

detector de foto-arreglo de diodos (PDA) para la determinación del 2,4-D en orina. Materiales y métodos Muestras biológicas La validación del método se realizó con muestras aisladas de orina de voluntarios adultos, de ambos sexos y sin exposición conocida al 2,4D (orinas blanco). Las orinas blanco (OB) se emplearon para preparar los estándares de calibración (EC), muestras de control de calidad (MCC) y muestras de estabilidad (ME) utilizando soluciones de estándar en metanol para enriquecerlas. Reactivos y equipos El patrón de 2,4-D de pureza certificada (98%) fue obtenido de Sigma Aldrich.Se emplearon los siguientes reactivos: metanol, acetonitrilo (Sintorgan, grado HPLC); 1-octanol (Fluka, pureza ≥ 99.5%); ácido acético, cloruro de sodio y ácido clorhídrico (Cicarelli, Pro-análisis); tiras reactivas de orina marca Wiener Lab. y tiras de pH marca Merck. El agua calidad HPLC se obtuvo mediante el sistema Milli-Q Plus®. Se utilizaron balanzas analíticas: Shimadzu- Modelo AUW220D Legibilidad 0,01mg y ShimadzuLibror AEG-220 - Legibilidad 10 mg. Se empleó un Cromatógrafo Líquido modelo Alliance 2690D de Waters, acoplado a detector 996PDA Waters y sistema automático de registro de datos. El software utilizado para el tratamiento de los datos fue el Empower 2 TM de Waters, (Waters Corporation, 2005). Preparación de las soluciones del patrón Las soluciones madres se prepararon pesando como mínimo 10 mg (legibilidad 0,01mg) del patrón y se diluyeron en metanol. Las soluciones intermedias y de trabajo se prepararon tomando la cantidad necesaria de la solución madre o intermedia respectivamente. Se llevó a volumen con metanol o 1-octanol. Las soluciones fueron conservadas en frascos de vidrio y se almacenaron a -20 °C hasta la fecha de vencimiento. Análisis cromatográfico El análisis cromatográfico se realizó a temperatura ambiente con una columna LichroCART® 100 RP-18 (5 µm), (250 mm x 4 mm D.I.) (Merck) y guarda columna LiChrospher®100 RP-18 (5 µm) (Merck). El volumen de inyección fue de 40 µL. La fase móvil fue preparada mezclando: (A) solución acuosa de ácido acético al 1 % y (B) acetonitrilo acidificado (con ácido acético al 1%). El gradiente de elución empleado comenzó con 43 % de acetonitrilo acidificado por 2 min, después 30 % de acetonitrilo acidificado hasta los 25 min, luego el sistema retorna a 43% de acetonitrilo acidificado hasta los 30 min, con un flujo de fase móvil de 1 mL/min. Se hizo un barrido espectral entre 210-400 nm y se cuantificó a 282 nm. En estas condiciones el tiempo de retención del patrón de 2,4-D fue 20,18 min. (Figura 2).

Figura 2: Cromatograma obtenido con HPLC-PDA de una solución de 2, 4-D en metanol de 50 µg/mL. En el recuadro se presenta el espectro de absorbancia característico del 2, 4-D.

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Borello J.S, Cañas A.I, Lucero P.A.

Micro-extracción liquido-liquido dispersiva demulsificación con solventes (SD-DLLME)

acoplada

Se empleó el procedimiento publicado por Behbahani et al. (2014) con modificaciones. Se permitió que las muestras tomaran la temperatura ambiente: 18 °C y luego se homogeneizaron por agitación manual. Una alícuota de la muestra se centrifugó durante 5 minutos a 3000 rpm. 7 mL de sobrenadante se trasvasaron a un tubo de vidrio de 10 mL de capacidad con tapa a rosca. Se añadió cloruro de sodio, concentración final 5% P/V. Luego se adicionó ácido clorhídrico concentrado (0,1N). Se verificó con tiras indicadoras que el pH final estuviera entre 1 y 2. Una mezcla de 750 µL de acetonitrilo (agente emulsificador) y 75 µL de 1-octanol (solvente de extracción) se inyectó en la muestra utilizando una pipeta automática, formándose una solución turbia (micro gotas del solvente de extracción dispersadas en la fase acuosa de la muestra). Inmediatamente se inyectó 750 µL de acetonitrilo (agente de-emulsificante), y se formó una gota de 1-octanol, se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos para obtener una gota más definida. Se dejó reposar unos minutos y se tomaron 50 µL de la gota con microjeringa que se colocaron en un microvial. Todas las muestras se procesaron por duplicado. La Figura 3 muestra un esquema del procedimiento. Validación Los parámetros evaluados durante la validación fueron: linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, selectividad, precisión, veracidad, estabilidad del analito en la muestra e incertidumbre. Linealidad La linealidad fue evaluada analizando 5 EC de concentraciones: 30 µg/L, 42 µg/L, 60 µg/L, 90 µg/L y 120 µg/L (EMA, 2011). Los EC se prepararon diariamente adicionando a 40 mL de OB, alícuotas de una solución de trabajo en metanol del estándar. Cada nivel de concentración se analizó por duplicado. La curva de calibración para el 2,4-D se construyó con las alturas de los picos cromatográficos versus las concentraciones del analito. Se realizó un análisis de regresión lineal de los datos, que proporcionó una pendiente y una ordenada al origen a partir de la cual se calcularon las concentraciones de MCC y ME. La linealidad se evaluó empleando las propuestas de la ISO 8466-1 (International Standard Organization, 1990): (1) la representación gráfica de los datos con la recta de regresión lineal calculada y (2) test estadístico:se calcula el valor PG requerido para la prueba F. Si PG ≤F la función de calibración no lineal no da lugar a una mejora significativa del ajuste y por lo tanto la función de calibración es lineal (Guerra Simoes et al., 2007). Límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC) Los LD y LC se calcularon a partir de los datos de la regresión lineal empleando las siguientes ecuaciones: LD=3Sa/b; LC=10Sa/b; donde Sa es la desviación estándar de la respuesta y b es la pendiente de la curva de calibración (Ich, 2005; Shrivastava y Gupta, 2011).

Selectividad Para descartar cualquier interferente endógeno o exógeno en la muestra se estudió la selectividad del método utilizando seis muestras de orina obtenidas de diferentes individuos. Estas muestras fueron analizadas por el método propuesto y evaluadas individualmente en busca de interferentes mediante la comparación de los cromatogramas de las muestras y de las muestras enriquecidas con 2,4-D al nivel del LC. Se determinó la homogeneidad espectral de la señal del analito en las muestras enriquecidas a partir de las curvas de similitud y umbral de pureza (EMA, 2011). Precisión La precisión del método fue evaluada en términos de repetibilidad (o precisión intradiaria) y precisión intermedia(o precisión interdiaria) y expresada como desviación estandar relativa (RSDr y RSDint respectivamente). La repetibilidad fue determinada con seis réplicas de MCC a dos niveles: 30 µg/L y 60 µg/L analizadas el mismo día por el mismo analista. Para evaluar la precisión intermedia se emplearon veinticuatro réplicas de MCC de cada concentración, analizadas en días difererentes por analistas diferentes en un período de 6 meses. El RSD observado se comparó con el nivel de precisión predicho por la ecuación de Horwitz: PRSDR = 2C-0.15; donde PRSDR es la desviación estándar relativa predicha de la reproducibilidad y C es la concentración expresada como fracción de masa. Se calculó el HorRat o relación de Horwitz: HorRat(r) = RSD(r)/PRSD(R) y se empleó como parámetro de aceptabilidad de la precisión del método. De acuerdo a las directrices de la AOAC (Association of Official Agricultural Chemists), los valores aceptables para HorRat están entre 0,3 – 1,3 (AOAC, 2012). Veracidad La veracidad del método se evaluó mediante un ensayo de adición/recuperación. Las recuperaciones se calcularon a partir de los datos obtenidos durante la evaluacíón de la precisión. Las MCC se enriquecieron en forma independendiente de los patrones de calibración utilizando soluciones preparadas por separado. Las muestras de control de calidad se analizaron con una curva de calibración y las concentraciones obtenidas se compararon con el valor nominal. Las valores de recuperación aceptables se encuentran dentro del rango 70-125 % (AOAC, 2002). Estabilidad del analito en la muestra La evaluación de la estabilidad del analito en la muestra debe llevarse a cabo para asegurar que cada paso dado durante la preparación y análisis de la muestra, así como las condiciones de almacenamiento usadas no afecten la concentración del analito (EMA,2011). Para ello se preparó una muestra enriquecida a nivel 60 µg/L, se fraccionó y las alícuotas se conservaron en las siguientes condiciones: a) 0 – 4 °C: 24, 72, 168 y 720 horas y b) -20 °C: 7, 18 y 31 días. Las muestras se analizaron por duplicado frente a patrones de calibración recientemente preparados, y las concentraciones obtenidas se compararon con la concentración nominal. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con la prueba de diferencia significativa mínima

Figura 3: Esquema del proceso de microextracción líquido-líquido para la determinación del 2, 4-D en orina.

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Validación de la metodología analítica basada en micro-extracción dispersiva líquido-líquido combinada con cromatografía líquida para la determinación del ácido…

LSD Fisher para comparaciones múltiples, en el que se compararon las medias de los resultados obtenidos. Valores de p < 0,05 se consideraron significativos. Estimación de la incertidumbre de la medición La incertidumbre de la medición (IM) se define como un parámetro asociado al resultado de la medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían atribuirse razonablemente al mensurando. Cualquier medición que hagamos tendrá cierto grado de incertidumbre asociado a ella y el intervalo de incertidumbre que citamos será el rango dentro del cual el verdadero valor reside en un determinado nivel de confianza. Normalmente se utiliza un intervalo de confianza del 95 %. La estimación de la incertidumbre de la medición se realizó utilizando la ecuación de Horwitz: [u′ = 21-0,5 log c]; donde u′ designa la desviación estándar relativa de la reproducibilidad y c la concentración de analitos (en µg/L). La IM relativa expandida, U′ (al nivel de confianza del 95%) se puede calcular mediante: U′ = 2u'. Como la ecuación de Horwitz es una función de la concentración del analito, proporcionará una gama de valores de la IM dependiendo de la concentración que se utilice del herbicida. A falta de datos de apoyo (materiales de referencia certificados, participación en interlaboratorios) la ecuación de Horwitz se utilizará con cierta precaución y solamente como indicador de la posible incertidumbre asociada con los resultados del ensayo (CAC/GL 59, 2006).

LD fue verificado experimentalmente analizando seis réplicas de orina enriquecidas con 2,4-D al nivel de 10 µg/L. En todos los casos el 2,4-D fue detectado y confirmado con detector PDA. Se considera que el LD determinado es el adecuado para evaluar la exposición laboral al 2,4-D de acuerdo a los datos publicados por RosalesConrado et al., (2008); Burns y Swaen (2012) y Thomas et al., (2010). Selectividad No se observaron señales interferentes en las OB (de seis individuos diferentes) en el tiempo de retención del analito. En todas las muestras enriquecidas el pico del analito resultó espectralmente homogéneo, es decir la curva de similitud estuvo siempre por debajo de la curva del umbral de pureza tal como se muestra en la Figura 4. Precisión y veracidad Los datos para la precisión y veracidad para dos concentraciones diferentes se presentan en la Tabla 1. Los resultados muestran que el método cumple con los requisitos de aceptación para estos parámetros según las directrices de la AOAC (Association of Official Agricultural Chemists, 2012). Tabla 1. Valores de reproducibilidad, precisión intermedia y recuperación del método.

Precisión Valor Nominal

Análisis estadístico El análisis estadístico de los datos se realizó con el software estadístico InfoStat versión 2016. Resultados y discusión Linealidad

30 µg/L

Media (µg/L) 28

60 µg/L

Veracidad

RSDr RSDint PRSDR HorRat (%) (%) (%) 11 11 27 0,4 14

0,6

% Recuperacion 79-115 76-114

Se realizaron durante la validación tres curvas de calibrado en matriz y no se observaron desviaciones de la linealidad en la representación gráfica de los datos de la calibración. La función de calibración lineal obtenida fue: y = -43,9437 + 18,2887 x. Comparando el valor calculado de PG = 0,95 con el valor tabulado de la distribución de Fisher-Snedecor, F (9.9; 0,99)= 5.35 (9 grados de libertad, nivel de confianza 0,99), resulta que PG <F y por lo tanto la función de calibración no lineal no mejoró significativamente el ajuste. Por lo cual, la función de calibración fue lineal en el intervalo (30 – 120) µg/L. Límites de detección y cuantificación Los LD y LC obtenidos fueron: LD = 10 µg/L y LC = 30 µg/L. El

Media: valor promedio de 6 réplicas de MCC concentración 30 µg/L y 24 réplicas de MCC concentración 60 µg/L. RSDr: desviación estándar relativa de la reproducibilidad, RSDint: desviación estándar relativa de la precisión intermedia, PRSDR: desviación estándar relativa predicha, calculada por la ecuación de Horwitz; b Relación de Horwitz: HorRat(r) = RSD(r)/PRSD(R)

Estabilidad del analito en la muestra Como se muestra en la Figura 5 los resultados para las muestras conservadas a - 20 °C no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de datos hasta el día 31. Para las muestras conservadas a (0 – 4) °C no se observaron diferencias estadísticamente significativas hasta las 168 horas. Por lo tanto, las muestras de orina para la determinación del 2,4-D pueden conservarse hasta 1 semana a (0 – 4) °C y hasta un mes a – 20 °C sin conservantes.

Figura 4: Curvas de similitud y umbral de pureza.

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Concentración (µg/L)

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b 40

0 0

168

720

Tiempo (horas)

Concentración (µg/L)

B a

0 0

Tiempo (días)

Figura 5: Estabilidad del 2,4-D en muestras de orina conservadas a 0-4 °C (A) y – 20 °C (B). Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas entre medias (p < 0,05) mientras que la líneas verticales muestran la desviación estándar.

Estimación de la incertidumbre de la medición La estimación de la incertidumbre de la medición se realizó para dos niveles de concentración: 30 µg/L y 60 µg/L. Los valores de u´ obtenidos fueron 18 % para 30 µg/L y 16 % para 60 µg/L. Para un nivel de confianza del 95 % y factor de cobertura de 2 los valores de U´ obtenidos fueron de 11 µg/L y 19 µg/L para los niveles 30 µg/L y 60 µg/L respectivamente. Aplicación a muestras reales El método validado fue aplicado a dos grupos de muestras reales: 5 muestras de varones adultos sin exposición conocida a 2,4-D y 5 muestras de aplicadores de productos fitosanitarios (todos varones adultos). Las muestras fueron obtenidas durante el período de aplicación del 2,4-D (Mayo 2015). En todos los casos las muestras se colectaron al final de la jornada del último día de la semana laboral y se conservaron a - 20 °C hasta su análisis. La cuantificación del 2,4-D se realizó por el método de adición de estándares (Sánchez Palacios, 2006). No se detectó la presencia de 2,4-D en ninguna de la muestras del primer grupo y en el grupo de los aplicadores se detectó la presencia de 2,4-D solo en una muestra a una concentración de 31 µg/L. Conclusiones Se validó un método analítico para determinar y cuantificar 2,4-D en orina humana a concentraciones que pueden resultar de exposiciones laborales. El método emplea SD-DLLME y HPLC-PDA; la metodología de extracción y preparación del extracto demostró ser simple, rápida, económica y amigable con el ambiente. Por su buena reproducibilidad, recuperación y simplicidad, la metodología es adecuada para su uso rutinario en el laboratorio. Se encontraron concentraciones detectables en una muestra real de un agroaplicador, este dato confirma la utilidad de este método para el biomonitoreo laboral. Es necesario desarrollar métodos más sensibles para poder emplearla en la evaluación de la exposición al 24-D en la población general ya que en los sujetos no expuestos directamente al herbicida, los bajos niveles de excreción urinaria son probablemente debido a residuos en alimentos o la contaminación del medio ambiente. 134

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Cafeína como contaminante ambiental Dafouz Ramírez R., Valcárcel Rivera, Y. Grupo de Investigación y Docencia en Toxicología Ambiental y Evaluación de Riesgos. Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Rey Juan Carlos. Avda Atenas sn. 28922 Alcorcón (Madrid) España.

Resumen: En el presente estudio, se realiza una revisión bibliográfica de los datos publicados de concentraciones de cafeína y su principal metabolito, la paraxantina, en el agua como matriz ambiental. Se recopilan las concentraciones de muestras procedentes de aguas influentes y efluentes de estaciones depuradoras de agua residual (EDAR), de aguas superficiales y de aguas potables de España. Los valores máximos de cafeína estarían ubicados en la provincia de Madrid con una concentración de 13.167 ngL-1 en agua superficial. Le sigue la provincia de Sevilla con 3.840 ngL-1 en agua de influente. La máxima concentración de cafeína en agua potable también se situaría en Madrid con 75 ngL-1. Con el método de cocientes de riesgo (Hazard quotients, HQs), los resultados indican que Madrid podría presentar posibles efectos adversos con un valor de HQ=0,25. El riesgo de aparición de cafeína en los ecosistemas acuáticos estaría relacionado con la densidad de población y la proximidad de núcleos poblacionales al medio fluvial, y su aparición en el agua superficial y potable estaría estrechamente ligada a la ineficiencia de los sistemas de depuración de aguas residuales y estaciones de tratamiento de aguas potables. Se necesitan estudios de toxicidad crónica para evaluar el riesgo real que podría tener la cafeína de forma aislada y combinada con otros contaminantes emergentes sobre los organismos expuestos.

Keywords: caffeine; paraxanthine; environmental pollutant; HQ; risk; superficial water.

Introducción En los últimos años, la cafeína, se ha venido detectando de forma continua en los efluentes de las estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR), en agua superficial, agua marina, potable y subterránea en todo el mundo gracias al gran avance y desarrollo de nuevos métodos de análisis más avanzados y sensibles (Barceló y Postigo, 2014). La cafeína y la paraxantina (Figura 1), son considerados como indicadores de contaminación antropogénica por el uso extendido de la población, por su frecuente detección en el medio ambiente, por su estabilidad química y por su relación con otros contaminantes asociados a las actividades humanas (Buerge et al., 2008).

Palabras clave: cafeína; paraxantina; contaminante ambiental; HQ; riesgo; agua superficial, agua potable. Abstract: Caffeine as an environmental pollutant. Literature review of caffeine in surface waters and Hazard quotients analysis in Spain. More and more research is being conducted on emerging contaminants. This study undertakes a literature review of data from concentrations of caffeine and its metabolite paraxanthine in water as a biological matrix. The concentrations of samples from influent and effluents wastewater treatment plants (WWTP), surface water and drinking water from Spain are collected. The maximum values of caffeine found in the literature are located in Madrid province with a concentration equal to 13,167 ngL-1 in surface water and 5,690 ngL-1. It follows Seville province with 3,840 ngL-1 in influent WWTP. The highest concentration of caffeine in drinking water also is located in Madrid with 75 ngL-1. Risk characterization with Hazard quotients (HQ) of caffeine as an environmental pollutant on our aquatic ecosystems is made. Madrid is the riskiest region with a HQ= 0.25 value. Risk occurrence of caffeine in aquatic ecosystems is related to population density and the proximity of towns to the fluvial environment. The appearance of caffeine in surface water and drinking water would be closely linked to the inefficiency of wastewater treatment systems and drinking water treatment plants. Inefficient sewage-treatment systems are shown to be closely linked with the emergence of caffeine in drinking and surface water. Chronic toxicity studies are needed to reveal the real risk that single and combined caffeine could have with other emerging pollutants on exposed organisms because, even though the amounts of caffeine are μgL-1 to ngL-1, the effect on organisms is not known when they are exposed to these amounts on a continuous basis into the environmental compartments. *e-mail: r.dafouz@gmail.com 136

Figura 1: Estructura química de la cafeína y paraxantina (metabolito principal de la cafeína) (ECOSAR)

Según la definición del Consejo Europeo de Información Alimentaria, la cafeína (C8-H10-N4-O2), “es un compuesto alcaloide del grupo de las xantinas presente en varias plantas como en los granos de café y cacao, hojas de té, bayas de guaraná y nuez de cola que, se añade, en ocasiones, a refrescos y a diversas medicinas. La cafeína también actúa como pesticida natural, protegiendo las plantas de los insectos que se alimentan de ellas. La capacidad de la cafeína de potenciar el estado de alerta y la atención prolongada está ampliamente documentada y su función primordial como estimulante del sistema nervioso central se debe a su acción como antagonista de la adenosina (…) El bloqueo de los receptores de adenosina puede contribuir a la constricción de los vasos sanguíneos, lo cual alivia la presión de las migrañas y los dolores de cabeza y explica por qué muchos analgésicos contienen cafeína” (EUFIC, 2007). La cafeína llega al torrente sanguíneo a los 30-45 minutos de su consumo y su vida media en el organismo es de 2,5 a 4,5 horas (OECD, 2002). Dicho estimulante se metaboliza en el hígado; de esta forma, la mayor parte de la cafeína se transforma en paraxantina al eliminarse uno de los grupos metilo. La paraxantina se excreta en orina como otras xantinas, ácido úrico y uracilos, mientras que la excreción de cafeína como tal en orina representa el 1-3% del total ingerido, lo que quiere decir que este porcentaje resulta desalojado a través de los conductos de agua residual de nuestra ciudad (Gil-Antuñano et al., 2008). Con respecto a las vías de entrada de la cafeína en el medio acuático, la principal vía de acceso sería el consumo en el hogar (Figura 2). Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, hoy en día, la producción anual del café ha llegado a

Cafeína como contaminante ambiental

Figura 2: Usos de la cafeína y sus respectivas vías de introducción al medio fluvial (elaboración propia)

casi nueve millones de toneladas, un millón de toneladas más que hace una década (FAO, 2015). “En Europa, la población adulta consume un promedio de 200 mg diarios de cafeína principalmente a través de café y té, aunque también contribuyen los refrescos como las bebidas energéticas” (EUFIC, 2007). Según un estudio de los hábitos de consumo de café en España, “el 63% de los españoles mayores de 15 años consumen, al menos, 1 taza de café al día” (Café & Té, 2015). Este compuesto es ingerido por el organismo a través de alimentos, bebidas o medicamentos y, después, pasa a ser excretado accediendo al ciclo del agua. Otra vía de introducción desde el hogar sería la continua eliminación de los posos del café derivados del consumo del mismo que se produce por los drenajes del domicilio. En el medio hospitalario, la cafeína también se utiliza para el tratamiento de la cefalea post punción, usando dosis de 300-500 mg Día-1 oral hasta que cede el dolor (Flores, 2016). Otro modo de acceso de la cafeína a las aguas residuales desde los hospitales estaría relacionado al gran consumo por parte de pacientes, familiares y trabajadores en estas instalaciones. Estudios como el de Al-Qaim et al. (2014) realizado en Malasia, muestran datos de niveles de cafeína en influentes y efluentes específicamente de edificios hospitalarios. Respecto al medio agrario, la cafeína es conocida como plaguicida natural efectiva contra las babosas y los caracoles, plagas comunes en cultivos (Campbell et al., 2002). La cafeína, al ser una sustancia fácilmente biodegradable (OECD, 2002) y con poca persistencia en suelos agrícolas, accede al agua subterránea del área labrada (Hendel et al., 2006). Según el coeficiente de absorción del suelo estimado log Kow -0,0135 se sugiere que la cafeína no es absorbida por el substrato (BASF, 2000). Con esta afirmación, se podría decir que la cafeína accede a las aguas subterráneas tras diluirse con las aguas de riego de los cultivos. A pesar de que estos compuestos se han encontrado a niveles bajos de concentración, del orden de µgL-1 a ngL-1, la exposición prolongada de los organismos que viven en el medio fluvial puede tener efectos nocivos para los mismos, como los sugeridos en las investigaciones de Pollack (2009) donde indica que la exposición a la cafeína de forma continuada asociada con la descarga de aguas residuales puede exacerbar el estrés de los corales. En las pruebas de laboratorio obtuvieron la concentración mínima inhibitoria (30 mgL1) de Symbiodinium goreaui, unas de las especies de algas endosimbiontes principales de los corales. El daño producido en el crecimiento del alga puede afectar directamente a la salud de los corales provocando su blanqueamiento tras afectar a proteínas asociadas con la glucólisis, la fotosíntesis, y la respuesta al estrés fisiológico. Otras pruebas, como las realizadas por Hesselberg & Vollrath (2004), demuestran la toxicidad y cambios de

comportamiento de la araña de jardín europea (Araneus diadematus), donde se muestra la modificación de la geometría de la telaraña tras haberle administrado una dosis de cafeína (260 ng/g de cafeína administrada vía oral por cada mg de peso de la araña para observar cambios de comportamiento). Respecto a la bioacumulación de la cafeína, la Agencia de Protección Ambiental (EPA), añade en su bibliografía un estudio que asegura que la cafeína no es capaz de bioacumularse en los organismos ya que el factor estimado de bioconcentración en peces es igual a log Kow -0.091 (Hansch y Leo, 1985). A pesar de este estudio de la EPA, una reciente investigación indica una potencial acumulación de cafeína en el tejido de peces mosquito (Gambusia holbrooki) expuestos directa y crónicamente a aguas regeneradas (Wang y Gardinali, 2012). En este estudio, se recogieron muestras biológicas de siete peces que vivían en un estanque de agua dulce que estaba afectado por aguas provenientes de efluentes de una EDAR cercana. En el estanque se halló una concentración igual a 81 ngL-1 de cafeína y los tejidos de los peces mosquito (con rango de tamaño 2 a 4,2 cm), presentaron una media de bioacumulación de 1,3 ng/g de cafeína. En otra investigación, se estudió la capacidad de la cafeína para acumularse en el tejido de frutas y vegetales; en éste, la cafeína fue absorbida por los cultivos a través de las aguas de riego o el suelo, exponiendo de tal forma al ser humano a través del consumo de alimentos a los posibles efectos de la cafeína (concentración de cafeína en el cultivo igual a 208 ngKg-1 en peso seco que correspondería a una ingesta de cafeína de 12 ng persona−1 día−1 si se consumiesen 400 g de frutas y verduras por persona y día) (Calderón-Preciado et al., 2011). En un estudio no estándar, el efecto de la cafeína en las plántulas de Oryza sativa (arroz) se investigó durante un período de 6 días. Los brotes inhibieron su crecimiento en un 50% con 485 mg de cafeína, mientras que la elongación de la raíz se inhibió en un 80% con un tratamiento a la misma concentración (Smyth, 1992). También se ha demostrado que la cafeína a una concentración de 0,6 mgL-1 aumenta considerablemente la actividad de los renacuajos de la rana pipiens (rana leopardo del norte) y, que además, podría tener una relación sinérgica si se combina con paracetamol (1 mgL-1), incrementando a un mayor nivel la actividad de dicho renacuajo, pudiendo tener como consecuencia la depredación por organismos superiores en la cadena trófica (Fraker y Smith, 2004). Como se ha podido observar con todos estos ejemplos, a pesar de que la cafeína es un compuesto traza común de las aguas residuales urbanas y potables, sus efectos ecológicos son aún estudiados bajo condiciones de laboratorios y pruebas de toxicidad realizadas por diversos autores, faltando estudios experimentales a concentraciones reales y en situaciones semejantes a las que ocurren en el medio ambiente. El objetivo principal de este trabajo es recopilar las concentraciones ambientales de cafeína y paraxantina, obtenidas en diferentes estudios nacionales, centrándonos principalmente en el agua como matriz ambiental (residual, superficial y potable). Con los datos bibliográficos se efectúa la caracterización del riesgo ambiental de la cafeína sobre los ecosistemas acuáticos.

Metodología Revisión bibliográfica Se realizaron búsquedas avanzadas en PubMed: caffeine, paraxanthine, environmental indicator, pollutant, effects, wastewater, surface, tap water, effluent, emerging contaminants, indicator, envirornment… Se recopilaron los datos encontrados de concentraciones de cafeína que se habían medido en muestras de agua influentes y efluentes de estaciones depuradoras de agua residual, así como aguas superficiales fluviales. Los datos recogidos de muestras superficiales son colectadas 100 metros aguas abajo del efluente de estaciones depuradoras del río (Valcárcel et al., 2011; Esteban et al., 2014). Varios de los datos representados en las tablas de concentraciones son el resultado de la media de varias muestras que se recogieron en el

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Dafouz RamĂrez R, ValcĂĄrcel Rivera Y.

mismo punto de muestreo.

especie mĂĄs sensible.

El mĂŠtodo de anĂĄlisis de las muestra de agua varĂa segĂşn la investigaciĂłn aunque el procedimiento mĂĄs comĂşn en los laboratorios consiste en la elaboraciĂłn de cromatografĂa de lĂquidos (Gardinali y Zhao, 2002; Wang y Gardinali, 2012; Al-Qaim et al., 2014) y espectrometrĂa de masas (Gardinali y Zhao, 2002; RoblesMolina et al., 2014; Campanha et al., 2014). Los datos de muestras de aguas potables han sido extraĂdos de varias investigaciones donde se explica que el origen de las muestras es tanto de zonas pĂşblicas como privadas recogidas directamente del agua del grifo (Boleda et al., 2011; ValcĂĄrcel et al., 2011).

Tras obtener los datos de MEC (concentraciĂłn mĂĄs alta encontrada en la bibliografĂa por provincias de EspaĂąa) y de PNEC, se puede obtener la caracterizaciĂłn y la interpretaciĂłn del riesgo para cada provincia.

Para la revisiĂłn bibliogrĂĄfica de los efectos de la cafeĂna sobre los organismos acuĂĄticos, se llevaron a cabo bĂşsquedas en ECOTOX DataBase, seleccionando animales y plantas para la exploraciĂłn de los efectos de la cafeĂna con Endpoint reportado. Se tuvieron en cuenta los valores de ecotoxicidad reportados en la guĂa OECD y los valores de ensayos incluidos en ECOSAR. CaracterizaciĂłn del riesgo El mĂŠtodo de cocientes de riesgo (Hazard quotients, HQs) (US EPA, 1998) o cocientes de caracterizaciĂłn de riesgos (Risk characterization ratios, RCRs) (ECHA, 2012) se ha utilizado para la detecciĂłn del riesgo de cafeĂna en el ecosistema acuĂĄtico. El HQ se define segĂşn la EPA como la relaciĂłn de la exposiciĂłn potencial a la sustancia y el nivel del que no se esperan efectos adversos (ecuaciĂłn 1). El HQ se calcula para cada provincia de EspaĂąa de la cual se han obtenido datos a travĂŠs de la revisiĂłn bibliogrĂĄfica. De tal modo, tenemos: đ??&#x2021;đ??&#x2021;đ??&#x2021;đ??&#x2021; =

EcuaciĂłn 1 â&#x20AC;?

â&#x20AC;?

đ??&#x152;đ??&#x152;Eđ??&#x201A;đ??&#x201A;

, donde:

đ???đ???đ???đ???đ???đ???đ???đ???

MEC= Measured Environmental Concentration (concentraciĂłn medida en el medio ambiente). Corresponde a la concentraciĂłn mĂĄs alta de cafeĂna medida en la literatura durante el perĂodo de muestreo ya que se asume el peor de los casos -principio de precauciĂłn. PNEC = Predicted no effect concentration (concentraciĂłn prevista sin efecto) (EcuaciĂłn 2). EcuaciĂłn 2 đ???đ???đ???đ???đ???đ???đ???đ??? =

đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;đ??&#x201A;Ăłđ??§đ??§ đ??Śđ??ŚĂđ??§đ??§đ??§đ??§đ??§đ??§đ??§đ??§ đ???đ???đ???đ??? đ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ťđ??Ť đ??&#x153;đ??&#x153;đ??&#x153;đ??&#x153;đ??&#x153;đ??&#x153; đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E;đ??&#x17E; đ??&#x201D;đ??&#x201D;đ??&#x201D;đ??&#x201D;

ConcentraciĂłn mĂnima de referencia con efecto= 52,73 mgL-1 (Artemia salina) (Chevalier et al., 2015). Por debajo de este valor no se esperan observar efectos negativos en el elemento del ecosistema que se estĂĄ evaluando (ECHA, 2008). Esta cifra corresponderĂa al organismo mĂĄs sensible respecto al compuesto cafeĂna encontrado en la bĂşsqueda bibliogrĂĄfica. Tabla 1 UF= Uncertainly Factor (factor de incertidumbre). De acuerdo con la metodologĂa de la US EPA, serĂa un valor igual a 1000 unidades. Por lo tanto: EcuaciĂłn 2

PNEC =

52,73 mgLâ&#x2C6;&#x2019;1 1000

= 0,05273 mgLâ&#x2C6;&#x2019;1

De esta forma y siguiendo el procedimiento de evaluaciĂłn de riesgos, el PNEC en el medio acuĂĄtico corresponderĂa a 0,05273 mgL-1 aplicando un factor de incertidumbre (UF) de 1000 en la Tabla 1. Valor de toxicidad PNEC escogida para la sustancia cafeĂna (Chevalier et al., 2015).

Species

Scientific

Common

Group

Name

Artemia

Brine

salina

Shrimp

DuraciĂłn

End

ConcentraciĂłn

prevista mgL-1

LC50

52,73

Crustaceans 24 h

Resultados Nivel nacional La cifra mĂĄs alta de los datos nacionales (tabla 2) en el medio fluvial, corresponde a la provincia madrileĂąa con su dato mĂĄximo de 13.167 ngL-1 ubicada en el rĂo Manzanares. Las provincias de Sevilla, Toledo, y Huelva (3.840 ngL-1, 1.558 ngL-1 y 1.060 ngL-1 respectivamente) serĂan las zonas despuĂŠs de Madrid con mayor concentraciĂłn de cafeĂna en las aguas superficiales del rĂo Tajo y ĂĄrea de DoĂąana. Las mĂĄximas concentraciones en agua superficial de Madrid para la cafeĂna y su metabolito paraxantina, corresponden al mismo muestreo ubicado en el rĂo Manzanares, recogidas a 100 metros aguas debajo de la EDAR. SegĂşn la Agencia de Medio Ambiente europea, su estaciĂłn depuradora (EstaciĂłn depuradora Sur) utiliza una tĂŠcnica de tratamiento secundario mĂĄs rigurosa que la bĂĄsica (fĂłsforo y otros) (EEA, 2016). En las aguas efluentes de EDAR, sigue destacando Madrid con 5.690 ngL-1. El segundo dato mĂĄs alto de la revisiĂłn corresponderĂa a Barcelona con 797 ngL-1 para el efluente ubicado en el rĂo Llobregat. Su tĂŠcnica de tratamiento tambiĂŠn es mĂĄs avanzada que la secundaria con tĂŠcnicas que utilizan nitrĂłgeno, fĂłsforo y otras (EEA, 2016). En Sevilla, se encuentra el tercer dato con mayor concentraciĂłn de cafeĂna (700 ngL-1) y su tipo de tratamiento coincide con el de la EDAR en el Llobregat. En cuanto a los niveles de paraxantina en agua superficial destacan las concentraciones de la provincia de Madrid con 36.019 ngL-1, seguido de Barcelona en el rĂo Llobregat con un valor de 204,67 ngL-1 y Toledo con 132 ngL-1 en agua procedente de la reserva de AzutĂĄn. En la bĂşsqueda bibliogrĂĄfica de concentraciones de cafeĂna y paraxantina en agua potable (tabla 3), se encontraron datos de las provincias de Madrid y Toledo. No se encontraron datos referentes al compuesto paraxantina en agua potable. Madrid y Toledo muestran concentraciones mĂĄximas muy similares (75 ngL-1 y 70 ngL1respectivamente). La ubicaciĂłn del muestro del estudio de Madrid se ubica en AlcorcĂłn, situado al sur de la capital. SegĂşn la base de datos del Sistema de InformaciĂłn Nacional de Aguas de Consumo, la estaciĂłn de tratamiento del agua potable que abastece a esta localidad, tiene las siguientes tĂŠcnicas de tratamientos de potabilizaciĂłn: preoxidaciĂłn, ozonizaciĂłn, adsorciĂłn, coagulaciĂłn-floculaciĂłn, decantaciĂłn, filtraciĂłn con lecho filtrante, desinfecciĂłn, correcciĂłn pH (SINAC, 2016). La muestra de Toledo se recoge en Talavera de la Reina, en la que el estudio de ValcĂĄrcel (2013) indica que el agua proviene de estaciones de tratamiento (ETAP) que transforman el agua natural en potable aplicando una serie de mĂŠtodos: aireaciĂłn, preoxidaciĂłn, coagulaciĂłn-floculaciĂłn, decantaciĂłn, filtraciĂłn por arena, neutralizaciĂłn, ozonizaciĂłn y desinfecciĂłn. En ambos casos, las tĂŠcnicas de tratamiento son muy similares. CaracterizaciĂłn del riesgo La caracterizaciĂłn del riesgo por provincias espaĂąolas en los ecosistemas acuĂĄticos (tabla 4), se llevĂł a cabo dividiendo la mĂĄxima concentraciĂłn de cafeĂna en agua superficial entre el valor PNEC hallado con la especie mĂĄs sensible encontrada en la bibliografĂa. En concordancia a los datos, la provincia de Madrid serĂa el ĂĄrea que presentarĂa un valor mayor de HQ (HQ=0,25). A pesar de ello, el peligro del ecosistema serĂa bajo con posibles efectos adversos. Para las demĂĄs provincias incluidas en la revisiĂłn, el riesgo serĂa aceptable y sin previsiĂłn de efectos adversos ya que el resultado de HQ corresponde a cifras inferiores a 0,1.

LC50: 50% concentraciĂłn letal

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Cafeína como contaminante ambiental Tabla 2. Principales estudios nacionales que han analizado la concentración de cafeína en muestras fluviales.

Concentración de paraxantina(ngL-1) en muestra fluvial Efluente Agua superficial EDAR

Concentración de cafeína (ngL-1) en muestra fluvial

Provincia

Influente EDAR

Efluente EDAR

Agua superficial

797b 30,2a; 140,5a

506,5 333b 203b 229b 122,8; 132,45

Albacete Barcelona

327a

Guadalajara Huelva

200c

91,9e 210

La Rioja f

3.840i

700c; 460c

680d; 1.370d; 150c

240j 14j 355j

70,7f; 96f, 388j; 1.558j

Toledo

Tabla 3. Concentración de cafeína en agua potable.

Provincia

Cafeína (ngL-1) en agua

Referencias

potable

Madrid

2,92l; 6,07l; 15i; 30i; 75i

Toledo

36; 70

l (Mendoza et al., 2016); i (Valcárcel et al., 2011) Valcárcel et al., 2013

Tabla 4. Caracterización del riesgo por provincia de España en los ecosistemas acuáticos fluviales de aguas superficiales.

Provincia Albacete

11,6f; 9,1f; 13,67f; 4,87f; 36.019h; 604h; 3.762h; 316h; 1.482h

236.1 ; 37,97 ; 165,7 ; 127,1f; 70g; 12.685h; 13.167h; 4.722h; 675h

Madrid

Sevilla

6,5; 8,65

80c; 360d; 630d; 1.060d

Jaén

Rivetti et al., 2015 a (Teijon et al., 2010); b (Calderón-Preciado et al., 2011)

204,67a

420c; 470c

MEC mgL-1

PNEC mgL-1

0,0005

HQ mgL-1 0,0096

0,0527

Caracterización del riesgo

Barcelona

0,0003

Guadalajara

0,0001

0,0025

Huelva

0,0011

0,0201

Jaén

0,00009

0,0017

La Rioja

0,0002

0,0039

Madrid

0,0132

0,2497

Sevilla

0,0014

0,0259

Toledo

0,0015

0,0295

No se prevén efectos adversos

0,0063

Peligro bajo, pero podría haber efectos adversos No se prevén efectos adversos

MEC: Measured Environmental Concentration; PNEC: Predicted no effect concentration; HQ: Hazard quotients

Discusión La cafeína es una sustancia que podría incluirse en el grupo de los

51j; 72j; 100j; 132j

Referencias

301j

Fernández et al., 2010 c (Camacho-Muñoz et al., 2010b); d (Camacho-Muñoz et al., 2010a) c (Camacho-Muñoz, et al., 2010b); e (Robles-Molina et al., 2014) Robles-Molina et al., 2014 f (Fernández et al., 2010); g (Esteban et al., 2014); h (Valcárcel et al., 2011)

i (Santos et al., 2007); c (Camacho-Muñoz, et al., 2010b); d (Camacho-Muñoz et al., 2010a) j (Valcárcel et al., 2013); f (Fernández et al., 2010)

contaminantes emergentes ya que, como alguno de estos, puede ser candidata a regulación futura dependiendo de las investigaciones sobre sus efectos nocivos en el medio ambiente y los datos de monitoreo con respecto a su presencia y concentraciones ambientales. Una de las características de este grupo de contaminantes sería, que no necesita persistir en el ambiente para causar efectos negativos ya que sus altas tasas de transformación/remoción se pueden compensar por su introducción continua en el ambiente (Barceló, 2003). El principal acceso de la cafeína al agua superficial estaría relacionado con el continuo consumo de cafeína a través de bebidas como el café, el té, los refrescos o incluso los medicamentos. Tanto la cafeína como la paraxantina, son transportadas por la corriente de las aguas residuales hasta las estaciones depuradoras. Es en esta parte donde varios autores marcan la ineficiencia de las EDARs como principales causantes de la aparición de cafeína en las aguas superficiales. Además, la presencia de cafeína en las aguas potables de las ciudades también podría ser una evidencia de la ineficiencia de las técnicas de tratamiento de las ETAPs. La aparición de la cafeína en muestras de influentes de EDAR podría tener un cierto sentido si se tiene en cuenta que el agua residual aún no ha sido tratada. En este caso, podemos observar que los niveles de cafeína pueden oscilar entre concentraciones más o menos altas dependiendo de las condiciones del río y del origen de sus vertidos. Así por ejemplo, si comparamos nuestros datos nacionales con otros estudios internacionales, observamos que Brasil destacaría por ser un país con concen traciones mucho más altas que España en agua influente (73.080 y 3.840 ngL-1 respectivamente) pero también se ha de tener en cuenta que dicho país es el principal productor de café (3 millones de Toneladas en el 2013) a nivel mundial (FAO, 2015). Esta razón podría afectar incrementando de forma directa las concentraciones de cafeína en sus superficies fluviales. Otro caso para comparar podría ser la isla de Barbados donde el origen de la cafeína en sus ríos se incrementa en diciembre hasta 43.000 ngL-1 debido al aumento de turistas que recibe la isla en dicha temporada (Edwards et

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Dafouz Ramírez R, Valcárcel Rivera Y.

al., 2015). Otro caso es, si nos referimos a las aguas efluentes, en las que se debería haber eliminado todo elemento, compuesto o traza que se haya vertido en los municipios y que pueda alterar al medio ambiente y ecosistema acuático. La estabilidad química de la cafeína también “jugaría” un papel importante resistiendo a los diferentes tipos y técnicas de tratamientos del agua residual. En el caso España, se puede observar que las zonas de mayor densidad de población serían también las que mayor concentración de cafeína tienen en sus aguas superficiales. Según los datos de densidad de población del año 2014 (INEbase, 2014), las provincias con mayor cantidad de ocupación serían Madrid, Barcelona, Valencia y Sevilla con 6.376.749, 5.433.744, 2.523.408 y 1.937.694 de habitantes respectivamente, que son también las provincias que presentan valores HQ superiores (HQMadrid=0,2497> HQSevilla=0,0259> HQBarcelona=0,0063), exceptuando Valencia, provincia de la que no se incluyen valores en el presente estudio. Toledo, en cambio, no destaca por ser una de las provincias con mayor densidad de población (693.826 personas en julio 2014 INEbase) pero su HQToledo= 0,0295, podría relacionarse por su situación geográfica ya que al situarse al sur de la capital española, recibe constantemente aguas efluentes de las estaciones depuradoras de los cuerpos de aguas como el río Tajo o Guadarrama, que atraviesan dicha comunidad y más tarde siguen su paso por la provincia toledana, arrastrando los contaminantes introducidos desde las masas de agua de la capital. El caso de la provincia de Huelva podría ser similar al de Toledo y Madrid ya que en su caso, sería probable que el HQHuelva=0,0201sea debido al recibimiento de las aguas de Sevilla ya que la cuenca hidrográfica del río Guadalquivir abarca ambos territorios (Sevilla y Huelva entre otros de la comunidad andaluza). De este modo, podría haber una relación directa entre los niveles de cafeína y núcleos poblacionales. A pesar de esta correlación descrita, cabe destacar que según datos del Instituto Geográfico Nacional, el índice de calidad general de los ríos de las provincias de Sevilla y Huelva se identifican como “Alta contaminación de los ríos” (Libro Blanco del Agua en España, 1998) por verse afectadas principalmente por impactos provenientes de los cambios de usos del suelo o el manejo inadecuado de la cuenca del arroyo del Partido (zona de muestreo) en Huelva (Barrera et al., 2009). Para interpretar el valor más alto ubicado en Madrid, cifra, hay que tener en cuenta que el PNEC se halló con un ensayo que utilizó un Endpoint de LC50, lo que quiere decir que aunque la interpretación del valor sea “peligro bajo con posibles efectos adversos”, se trata de una cifra resultante de un ensayo agudo por lo que habría que seguir investigando si podría aplicarse en un escenario real. Se necesitan datos de pruebas crónicas para poder confirmar si el riesgo es aceptable o no para nuestros ecosistemas acuáticos. Si se contrasta la concentración máxima de cafeína en España (13.167 ngL-1 ) con el valor de la especie más sensible encontrada en la revisión, Artemia salina, se puede observar que la concentración mínima en la que comienza a aparecer mortalidad del crustáceo sería igual a 52.730.000 ngL-1 de cafeína en agua. Si comparamos ambos valores, podríamos decir que el riesgo sería aceptable para el ecosistema aunque será necesario seguir investigando en el perfeccionamiento de la caracterización del riesgo con el desarrollo de los siguientes niveles de la Evaluación del Riesgo Ambiental para poder realizar una evaluación mucho más precisa. En cuanto a las pruebas crónicas en productores primarios, las concentraciones de los ensayos toxicológicos realizados en laboratorio fueron mayores a las reales obtenidas en el ambiente; las algas Symbiodinium goreaui endosimbiontes del coral comienzan a mostrar su perturbación y daños en su fisionomía a concentraciones de 30.000.000 ngL-1 y las plántulas de arroz inhiben el crecimiento de la raíz a partir de 485 mg de cafeína mientras que en un escenario 140

real, como se ha expuesto anteriormente, la concentración más alta analizada que se encontró en la bibliografía fue de Brasil con 73.080 ngL-1 (Campanha et al., 2014). Estos datos manifestarían que, según las cifras recopiladas, los niveles de cafeína presentarían un riesgo aceptable sobre los productores primarios. A pesar de esta observación, se necesitarían más estudios crónicos sobre los efectos de la cafeína en la flora para poder confirmar si dicho compuesto resulta nocivo para los organismos vegetales ya que habría que seguir investigando acerca del estrés u otros daños que pudiesen presentar las plántulas a concentraciones ambientales reales en exposiciones continuas. Respecto a los datos de cafeína encontrada en muestras de agua potable, la concentración más alta ha sido de 75 ngL-1 en Madrid (Valcárcel et al., 2011), valor por debajo de otras muestras analizadas en China (564 ngL-1 ) o Brasil. (220 ngL-1). El riesgo de la exposición del ser humano se consideraría aceptable a través del consumo del agua de grifo o a través del consumo de frutas y verduras, ya que el consumo por bioacumulación en vegetales sería aproximadamente de una ingesta de cafeína de 12 ng persona−1 día−1 y el valor mínimo reportado de la dosis tóxica por ruta oral que produce daño a un infante, es de 14,7mgKg-1 (Brem, 1977). Además, la cafeína tampoco se incluye en la lista de parámetros que deben controlarse de la Directiva (UE) 2015/1787, relativa a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano. Cabe destacar que la cafeína no se incluye en la Lista de sustancias prioritarias en el ámbito de la política de aguas de la Directiva 2013/39/UE Del Parlamento Europeo y del Consejo del 12 de agosto de 2013 en cuanto a las sustancias prioritarias en el ámbito de la política de aguas, en la cual se expone, que: “Faltan, en particular, datos de seguimiento de muchos contaminantes «emergentes», que se pueden definir como contaminantes que en la actualidad no están incluidos en los programas de seguimiento sistemático en la Unión, pero que suponen un importante riesgo, lo cual exige su regulación, dependiendo de sus posibles efectos ecotoxicológicos y toxicológicos, y de sus niveles en el medio acuático.”

Conclusiones Tras la revisión bibliográfica de concentraciones de cafeína en aguas efluentes, influentes de EDARs, superficiales y potables, se determina que, las concentraciones más altas encontradas en la bibliografía han sido de los datos de aguas superficiales, siendo Madrid la provincia que muestra el nivel máximo con 13.167 ngL-1 (Valcárcel et al., 2011), seguido de Toledo con 1.558 ngL-1 (Valcárcel et al., 2013). De estas zonas, el principal motivo de aparición de cafeína en las aguas estaría relacionado al continuo consumo humano y como consecuencia, el continuo vertido a los drenajes desde los hogares. Respecto a los datos de cafeína y paraxantina presentes en efluentes de EDARs, las concentraciones se podrían relacionar con la ineficiencia de la calidad de las técnicas de las depuradoras. Los estudios destacan que a pesar de que los procesos llevados a cabo en las EDARS se desarrollen con técnicas más estrictas de tratamientos secundarios (estación depuradora Sur en el río Manzanares y EDAR en el río Llobregat, por ejemplo), la metodología no sería suficiente para la remoción de la cafeína y la paraxantina. El valor máximo de cafeína en agua potable encontrado equivale a 75 ngL-1, ubicado también en la capital del país (Valcárcel et al., 2011). Dicha concentración se determina como riesgo aceptable para el consumo humano. De cara a un escenario futuro, se propone llevar a cabo un seguimiento de la calidad de las aguas especialmente de la Comunidad de Madrid por ser la zona en la que se podría predecir un mayor acceso de cafeína desde los hogares a las aguas residuales de la ciudad. También habría que considerar las zonas cercanas a los puntos donde se vierten mayores cantidades de cafeína (como Toledo), ya que podrían presentar cierto riesgo al tratarse de zonas afectadas por el flujo de la corriente fluvial, la cual podría ir cargada tanto de cafeína como de otros contaminantes emergentes. Por otro lado, es importante destacar que el riesgo de aparición de cafeína en los cuerpos de agua podría

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Cafeína como contaminante ambiental

aumentar por el uso de cafeína (posos de café) en los cultivos tradicionales como repelente de caracoles y babosas, además de ser añadido, en ocasiones, como vermicompost. En cuanto a la caracterización del riesgo de la cafeína sobre los ecosistemas acuáticos de España, la provincia que destacaría con posibles efectos adversos sería Madrid, presentando un valor de HQ= 0,2497. Es importante destacar que los valores HQ han sido hallados con un ensayo de toxicidad aguda (LC50), esto debe considerarse en el nivel de riesgo representado ya que en un escenario real los organismos que viven en los ecosistemas acuáticos se ven afectados de forma crónica por cantidades variadas y continuadas de cafeína en las superficies fluviales. Las concentraciones de cafeína de España mostrarían un riesgo aceptable sobre los organismos, ya que la Artemia salina, especie más sensible encontrada en la literatura, comenzaría a expresar signos de letalidad a partir de 52.730.000 ngL-1, concentración que no se observa en ninguno de los artículos revisados, siendo el estudio de Valcárcel (2011), el que mayor concentración de cafeína presenta en Madrid con 13.167 ngL-1 en aguas superficiales. Cabe destacar que sólo se está valorando el riesgo propio de la cafeína como contaminante aislado y en ningún caso se está valorando el efecto que podría tener la cafeína combinada con otros contaminantes emergentes de los sistemas acuáticos. De tal forma, se requieren más estudios y ensayos para determinar los efectos ecotoxicológicos de la cafeína sobre las especies tanto de forma aislada como de forma conjunta con otros contaminantes emergentes, ya que los efectos podrían variar según la combinación de los mismos. Se requieren ensayos de toxicidad crónica para una caracterización del riesgo acorde con las condiciones ambientales reales. Se propone el desarrollo de los niveles superiores de la Evaluación del Riesgo Ambiental para afinar los valores de riesgo sobre nuestros ecosistemas acuáticos.

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Estrogenicidad de los aceites de maíz y de almendras en modelos roedores Vozmediano A.1, León J.2, Peña F.2, Castillo R.1, Cavieres MF.1,3 1

Escuela de Química y Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Valparaíso, Valparaíso, Chile. Escuela de Nutrición y Dietética, Facultad de Farmacia, Universidad de Valparaíso, Chile. 3 Centro Regional de Estudios en Alimentos Saludables, Valparaíso, Chile. 2

Resumen: En este estudio se utilizaron los modelos Allen-Doisy y uterotrópico para estudiar la estrogenicidad de aceites de coco, hígado de bacalao, maíz, pepita de uva y de almendras, en ratas. En el ensayo Allen-Doisy, la actividad estrogénica fue evidenciada por cornificación del epitelio vaginal en ratas adultas ovariectomizadas a las que se administró 300 µl de aceite por tres días consecutivos y por vía subcutánea. La cornificación vaginal se estudió a través de observaciones microscópicas diarias de frotis vaginales. En el ensayo uterotrópico, la estrogenicidad fue evaluada por un incremento en el peso uterino en ratas de 18 días postnatales a las que se administró 300 µl de aceite, subcutaneo, por tres días consecutivos. En el día cuarto, los úteros fueron recolectados y pesados. En ambos ensayos se utilizaron controles negativos (sin tratamiento y suero fisiológico, 300 µl) y controles positivos (estradiol 50 μg/kg y bisfenol A 20 mg/kg). Tanto el aceite de almendras como el de maíz demostraron una respuesta estrogénica estadísticamente significativa, aunque con una potencia bastante menor a la del estradiol y bisfenol A, mientras que los aceites de coco, hígado de bacalao y pepita de uva no indujeron la respuesta. Proponemos que la estrogenicidad del aceite de almendras puede deberse a su contenido relativo en ácidos oleico y linoleico, mientras que la del aceite de maíz a su contenido de factores mitogénicos. El impacto potencial en humanos de estas respuestas en roedores debe ser investigado. Palabras clave: estrogenicidad, aceites comestibles, composición de ácidos grasos. Abstract: Estrogenicity of corn and almond oils in rodent models. Here we report the use of the Allen-Doisy and the uterotrophic assay in rats to study the estrogenicity of coconut, cod liver, corn, grapeseed and almond oil. In the Allen-Doisy assay, estrogenic activity was evidenced by vaginal epithelium cornification in adult female ovarioctemized rats which were subcutaneously administered 300 µl of oil for three consecutive days. Vaginal cornification was studied by daily observation under a microscope of vaginal smears. In the uterotrophic assay, estrogenicity was evaluated by the increase of uterine weight in 18 day rats administered 300 µl of oil subcutaneously for three consecutive days. On the fourth day, uteri were collected and weighed. An untreated group as well as a saline solution (300 µl subcutaneous) treatment group was included as negative controls while bisphenol A (20 mg/kg) and estradiol (50 μg/kg) were used as positive control in both assays. Our data shows that both corn and almond oil have a strong and statistically significant estrogenic response in the assays although their potency was several orders of magnitude lower than estradiol, while cod, coconut and grapeseed oils did not induce a response. The potential health impacts of estrogenic components in food oil deserve further attention.

cardiovascular promoviendo la vasodilatación y mejorando la relación entre el colesterol HDL y LDL. Posterior a la pubertad, el estradiol transforma el epitelio vaginal de cúbico a estratificado y aumenta el tamaño del útero de dos a tres veces al generar proliferación del estroma endometrial y un gran aumento del desarrollo de las glándulas endometriales (Levin y Hannes, 2012). Existe considerable preocupación por la modulación endocrina que moléculas distintas a las hormonas fisiológicas pudieran inducir en los seres humanos. En particular, la modulación hormonal inducida por moléculas distintas al estradiol y sus metabolitos, se conoce como estrogenicidad y existe argumentación plausible para hipotetizar que la exposición a algunos de estos compuestos podría llevar a alteraciones reproductivas, metabólicas y cáncer (Kabir et al, 2015; Giulivo et al, 2016). Se han establecido una serie de ensayos para determinar modulación estrogénica siendo el ensayo uterotrópico en roedores hembras un método estandar para evaluar la capacidad de las sustancias químicas de inducir actividad biológica consistente con agonistas o antagonistas de los estrógenos naturales (OCDE, 2007). Los estrógenos producen un rápido aumento en el peso del útero ya que inducen primero una infiltración de agua en los tejidos seguido por proliferación celular. En el curso de una investigación sobre estrogenicidad de productos naturales, observamos que aceites vegetales utilizados como vehículos en el ensayo uterotrópico resultaban positivos. Los aceites se componen fundamentalmente de triacilglicéridos como ácidos linoleico y oleico, pero contienen también otros compuestos que incluyen tocoferoles, esteroles, clorofila, fosfolípidos, entre otros, los que pueden ser bioactivos (Foster et al, 2009). Dado que muchos de estos aceites tienen amplio uso a nivel industrial y doméstico, sobre todo con fines cosméticos y culinarios, pareció pertinente evaluar si su bioactividad incluye la estrogenicidad en modelos roedores.

Keywords: estrogenicity, food oils, fatty acid composition.

En este estudio se utilizaron los ensayos uterotrópico y de Allen-Doisy para evaluar la estrogenicidad de aceites de coco, hígado de bacalao, pepita de uva, maíz y almendras, todos aceites comestibles y/o cosméticos y cuya composición en ácidos grasos, se indica en la tabla 1. Tal como se describió, el ensayo uterotrópico determina estrogenicidad a través de un aumento del peso uterino, mientras que el ensayo de Allen-Doisy permite realizar un seguimiento del ciclo estral del animal. Las fases del ciclo estral de los roedores son altamente dependientes del estradiol circulante y pueden ser monitoreadas por citología vaginal. La observación al microscopio óptico del frotis vaginal permite establecer la proporción de células epiteliales, cornificadas y leucocitarias que caracterizan cada una de estas fases (Marcondes et al, 2002). Así la presencia de células cornificadas en el frotis vaginal luego del tratamiento indica estrogenicidad. Los aceites estudiados que demostraron estrogenicidad fueron positivos en ambos ensayos. Proponemos que la composición en ácidos grasos u otros componentes del aceite podría estar influenciando su estrogenicidad.

Introducción

Materiales y métodos

El estradiol es el estrógeno de mayor potencia en vertebrados. Promueve principalmente la proliferación y el crecimiento de células específicas del cuerpo que son responsables del desarrollo de la mayoría de los caracteres sexuales secundarios de la mujer. Actúa sobre el esqueleto contribuyendo a alcanzar una masa ósea óptima, manteniendo la homeostasis mineral y ejerciendo un efecto antirresortivo. Asimismo, mantiene la salud del sistema

Animales de experimentación: Se utilizaron ratas hembras SpragueDawley del Bioterio de la Universidad de Valparaíso. Los animales fueron mantenidos bajo condiciones controladas de ciclos de luz/oscuridad de 12:12 hrs (luz 6 AM - oscuridad 6 PM), temperatura a 21ºC ± 3ºC, y acceso ad libitum a alimento (Lab Rat Diet, Champion ®) y agua potable. Los procedimientos contaron con certificación del Comité de Bioética de la Facultad de Farmacia, Universidad de Valparaíso y se llevaron a cabo de acuerdo al Guide for the Care and Use of Laboratory Animals del National Research Council de Estados

*e-mail: fernanda.cavieres@uv.cl 38

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Vozmediano A, León J, Peña F, Castillo R, Cavieres MF. Tabla 1. Porcentajes de ácidos oleico, linoleico y actividad estrogénica de aceitesa.

Porcentaje de ácido grasoc palmítico palmitoleico esteárico C16:0 C16:1 C18:0

Aceite

caproico C6:0

caprílico C8:0

cáprico C10:0

laúrico C12:0

mirístico C14:0

Cocoa Hígado de bacalaod Maíz

6-10

6-8

44-50

15-20 3.5

8-10 10.6

<0.2 8.3

<0.1

<0.2

10-17

<0.1

Pepita dea uva Almendrasb

oleico C18:1

linoleico C18:2

linolénico C18:3

Godoleico C20:1

2-4 2.7

5-9 20.6

0.5-3 3

<0.1 0.9

<0.2 10.4

<0.5

2-4

40-60

<0.5

6-10

3-5

60-75

<0.2

3.3

0.2

0.9

2550 1520 34.5

13.5

Fuente: aMinisterio de Salud de Chile. Reglamento Sanitario de los Alimentos. DTO. N° 977/96, 1997. b USDA Food composition data base (https://ndb.nal.usda.gov/ndb/). c Expresado en porcentaje de ésteres metílicos d El aceite de hígado de bacalao contiene además ácido eicosapentaenoico C20:5 n-3 (6 8 %) y ácido docosahexaenoico C22:5 n-3 (10 9 %)

Unidos (NRC, 2011). Tratamientos: La evaluación de estrogenicidad se realizó a través de los ensayos Allen-Doisy y uterotrópico, según se describe más adelante. En ambos casos se utilizaron 6 animales para cada uno de los siguientes tratamientos: controles negativos (sin tratamiento y suero fisiológico); controles positivos (estradiol 50 μg/kg y bisfenol A, 50 μg/kg de peso, ambos en aceite de pepita de uva como vehículo, administrado por vía subcutánea) y aceites (de coco, hígado de bacalao, pepita de uva, maíz y almendras, 300 μl subcutáneo). Los aceites fueron adquiridos en supermercados locales, eligiéndose aquellos productos cuya etiqueta no declarara aditivos o saborizantes adicionales. Ensayo Allen-Doisy: se realizó según Sonneveld et al (2006). Se realizó un seguimiento de al menos dos ciclos estrales consecutivos para confirmar ciclicidad regular. El seguimiento se realizó por medio de frotis vaginales, los cuales se observaron al microscopio óptico bajo un aumento de 10X. Una vez confirmada la ciclicidad regular del animal, las ratas fueron anestesiadas con ketamina al 10% y xilacina al 2% en dosis de 90 y 10 mg/kg respectivamente, y posteriormente fueron ovariectomizadas. Los ovarios de las ratas fueron expuestos y ligados a la altura de los oviductos, para proceder a su extirpación por encima de esta ligadura de acuerdo a OCDE (2007). Luego, se realizó un seguimiento del ciclo estral hasta la mantención de la etapa diestro. Una vez detectada esta etapa, se les administró una dosis única de 1 µg de estradiol para comprobar la respuesta estrogénica a través de la observación de células cornificadas en el frotis vaginal. Cuando dicho efecto finalizó, los animales se distribuyeron aleatoriamente en los grupos de control negativo, control positivo y tratamientos de aceites. Los tratamientos fueron administrados en 3 dosis subcutáneas una vez al día, durante 3 días consecutivos, luego de lo cual se realizó nuevamente un seguimiento diario de frotis vaginales por 7 días para observar la aparición de células cornificadas. Ensayo uterotrópico: se realizó según OCDE (2007) utilizando como modelo de estudio, ratas hembras pre-púberes que fueron destetadas

en el día postnatal (DPN) 18. Los animales fueron pesados y distribuidos aleatoriamente en los grupos de control negativo, control positivo y tratamientos de aceites. Se administró una dosis diaria, durante los DPN 18, 19 y 20. 24 horas después de la última administración los animales fueron pesados e inmediatamente eutanizados por exposición a CO2. Posteriormente, se recolectaron los úteros mediante cesárea, utilizando el peso de éstos, tanto húmedo como seco, como indicador de actividad estrogénica. El peso húmedo correspondió al peso del órgano luego de ser recolectado mientras que el peso seco fue obtenido luego de una suave extrusión del mismo. Análisis estadístico. Los datos fueron analizados a través de ANOVA de una vía con comparación múltiple de Dunnett’s con el programa GraphPad Prism versión 7.02.

Resultados Efecto uterotrópico La tabla 2 muestra el promedio de los pesos corporales al inicio y término del periodo de exposición, uterinos húmedo y seco y la razón entre ambos. Tal como se esperaba, los controles negativos sin tratamiento y suero fisiológico no tuvieron ningún efecto sobre el peso corporal o uterino, mientras que los controles positivos estradiol y bisfenol A aumentaron el peso uterino húmedo en casi un 500 y un 100 %, respectivamente, mientras que el peso seco aumentó también significativamente. Se observaron diferencias estadísticamente significativas en el incremento de peso uterino, tanto húmedo como seco, solo luego de la exposición a los aceites de maíz y de almendra, lo que se mantuvo también al normalizar los pesos del órgano por el peso corporal. Seguimiento del ciclo estral En la figura 1, se muestra el seguimiento de ciclo estral de ratas adultas ovariectomizadas y que fueron tratadas con suero fisiológico (control negativo); estradiol (control positivo) y los aceites de pepita de uva y de almendras. Tal como se esperaba, los animales entraron a la fase diestro luego de la ovariectomización en el día 8 y respondieron al

Tabla 2. Parámetros de ensayo uterotrópico: peso corporal, peso uterino e indicador de normalización por tratamientoa

Peso útero húmedo (mg)

Peso útero seco (mg)

46,8 ± 6,8

23,2 ± 3,0

19,3 ± 3,3

0,5 ± 0,03

40,3 ± 2,2

21,8 ± 2,6

18,7 ± 2,7

0,54 ± 0,1

0,46 ± 0,1

31,2 ± 3,4

36,4 ± 7,1

113,4 ± 28,2b

78,3 ± 6,0b

3,27 ± 1,18b

2,22 ± 0,46b

Bisfenol-A

33,1 ± 2,7

39,5 ± 4,8

52 ± 6,0b

43,8 ± 6,0b

1,33 ± 0,18b

1,12 ± 0,16b

Aceite de coco

30,0 ± 0,0

33,3 ± 2,6

30,5 ± 3,8

28,0 ± 3,7

0,9 ± 0,1

0,8 ± 0,1

Aceite de bacalao

36,7 ± 5,2

37,5 ± 6,9

35,3 ± 7,2

31,2 ± 7,8

0,9 ± 0,1

0,8 ± 0,1

35,1 ± 6,3

0,9 ± 0,2

0,8 ± 0,2

Tratamientos

Peso Corporal DPN 18

Peso Corporal DPN 21

Sin tratamiento

39,5 ± 4,8

Suero fisiológico

33,2 ± 1,9

Estradiol

Peso útero húmedo/peso Peso útero seco/peso corporal DPN 21 (x10-3) corporal DPN 21 (x103 ) 0,41 ± 0,04

Aceite de maíz

34,2 ± 3,8

42,5 ± 6,1

38,4 ± 6,9

Aceite de pepita de uva

28,3 ± 2,6

30,0 ± 3,2

30,0 ± 4,4

26,9 ± 4,2

1,0 ± 0,2

0,9 ± 0,2

Aceite de almendras

34,0 ± 1,7

41,4 ± 4,1

49,2 ± 17,5b

40,8 ± 15,2b

1,2 ± 0,43b

1,0 ± 0,37b

Valores se entregan como promedio ± desviación estándar. Valores estadísticamente distintos a control sin tratamiento.

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Estrogenicidad de los aceites de maíz y de almendras en modelos roedores

Figura 1: Seguimiento de ciclo estral. En el eje x, se indica día de ovariectomización (línea azul), día de prueba con estradiol (línea verde) y administración de tratamientos (líneas rojas). En el eje y, se indican las fases del ciclo estral D (diestro), P (proestro), E (estro). Nótese la respuesta estrogénica positiva cuando se alcanza la fase estro.

estímulo de estradiol (1 µg) en el día 18, permaneciendo 1 o 2 días en etapa estro, demostrando que eran capaces de responder a un estímulo estrogénico. La administración de suero fisiológico no indujo la etapa estro así como tampoco el aceite pepita de uva. Asimismo, los aceites de coco y de hígado de bacalao, tampoco indujeron el estro. Por el contrario, la administración de aceite de almendras y de maíz sí indujo presencia de células cornificadas. La potencia estrogénica de los aceites en relación al estradiol fue bastante menor, tal como se indica en la tabla 3. El estro inducido Tabla 3. Duración de la etapa estro en ratas ovariectomizadas, según tratamientoa

Tratamiento

Mantención del estro (días)b

Sin tratamiento

0±0

Suero fisiológico

0±0

Estradiol

4,8 ± 0,4****

Bisfenol-A

2,7 ±0,5 ****

Aceite de coco

0±0

Aceite de Bacalao

0±0

Aceite de maíz

1,5± 0,4 **

Aceite de pepita de uva

0±0

Aceite de almendras

1,7 ± 0,8 **

Datos se entregan como promedio± DS b ** y ****Valores estadísticamente distintos a control sin tratamiento

por estradiol duró, en promedio, casi 5 días, mientras que el inducido por los aceites duró menos de 2 días. Por su parte, bisfenol A, un estrógeno sintético, indujo cornificación durante casi 3 días.

Discusión En el curso de una investigación sobre estrogenicidad de productos naturales, observamos que aceites vegetales utilizados como vehículos en el ensayo uterotrópico resultaban positivos, lo cual llevó a estudiar esta bioactividad con mayor detalle. Prácticamente no existen reportes en la literatura de estrogenicidad de aceites comestibles. Sin embargo, hace casi 60 años atrás, Booth et al (1960) reportaron actividad estrogénica de diversos aceites vegetales, utilizando como marcador el peso uterino en el ratón. Estos autores observaron un aumento de peso uterino después de la administración, tanto oral como subcutánea, de aceite de ricino, de germen de trigo, de hígado de bacalao, de coco y de maíz, entre otros. Al contrario, y mucho más reciente, Bieber (1986) administró dietas suplementadas con aceites de maíz, cártamo, maravilla y soya y manteca y grasa vacuna, a ratones en los cuales no se indujo aumento del peso uterino con ningún tratamiento. Igualmente, Yamasaki et al (2001), no observaron aumento de peso uterino en ratas inmaduras a las que se administró aceite de oliva, maní, sésamo y maíz por vía subcutánea. La falta de concordancia en estos resultados pueden ser explicadas por diferencias metodológicas entre los estudios. Sin embargo, proponemos que la composición misma del aceite, en términos de proporciones de ácidos grasos y otros componentes, puede estar influenciando un potencial estrogénico.

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Vozmediano A, León J, Peña F, Castillo R, Cavieres MF.

Los aceites se componen fundamentalmente de ácidos grasos, por lo que una primera explicación para la actividad estrogénica podría encontrarse en estos lípidos. De hecho, se ha reportado que el ácido linoleico se une in vitro a los receptores de estrogéno α y β (Liu et al, 2004). Por otro lado, la degradación de este ácido graso aumenta la síntesis de ácido araquidónico y por consiguiente la de PGE2, que a su vez induce la expresión de la enzima aromatasa produciendo un incremento en la síntesis de estradiol (Noble et al, 1997). Sin embargo, en este estudio, el aceite pepita de uva, con alto contenido en ácido linoleico no fue estrogénico, mientras que el aceite de almendras con una menor proporción de ese ácido sí lo fue, por lo que probablemente el mecanismo de estrogenicidad no sea mediado solo por ácido linoleico. Proponemos que el efecto estrogénico de un aceite que contenga ácido linoleico, como el de almendras, es modulado no sólo por la concentración de éste, sino que también por la concentración de otros ácidos grasos. Los primeros miembros de cada familia de ácidos grasos (ácidos oleico, linoleico y Ƴ-linoleico) compiten por la misma enzima, ∆6-desaturasa para su biotransformación, aumentando la velocidad de transformación con el número de dobles enlaces. De esta manera, el equilibrio entre los ácidos ω6 y ω3 es importante debido a su naturaleza competitiva por la enzima (figura 2) y es justamente esta competencia la que podría estar explicando la estrogenicidad de los aceites. Se puede ejemplificar con la comparación entre el aceite pepita de uva (proporción oleico/linoleico de 1:3), con el de almendras (proporción oleico/linoleico de 4:1). En el caso del primer aceite, no existiría mayor competencia por la enzima y el ácido linoleico se degradaría. Por otro lado, la alta proporción de ácido oleico en el aceite de almendras inhibiría la degradación del ácido linoleico por la enzima ∆6-desaturasa dejando a este ácido graso disponible para ejercer su estrogenicidad por un mecanismo todavía no dilucidado pero que podría involucrar su unión a receptores de estrógeno formando un complejo que difunde al núcleo y modula la expresión proteica. La transcripción y transducción ribosomal posterior llevaría a la síntesis de proteínas específicas que tendrán participación en el crecimiento del tejido uterino (Nadal et al, 2001). Se sabe que el receptor ER α se expresa predominantemente en mama, útero y vagina, mientras que el β en tejidos del sistema nervioso, cardiovascular, inmune, gastrointestinal, en pulmones, riñón y hueso

(Lewis y Jordan, 2005), por lo que sería lógico pensar que este efecto uterotrópico podría estar mediado por el receptor α. Sin embargo, además de los receptores genómicos, existen receptores estrogénicos “no genómicos” expresados en la membrana celular y que permiten ejercer efectos rápidos a través de cascadas de segundos mensajeros. Estas respuestas ocurren rápidamente, en pocos segundos o minutos ya que no requieren de los procesos de transducción y de síntesis de proteínas, por lo que no se podría descartar la idea de que algún componente del aceite de almendras podría estar estimulando estos receptores de membrana (Björnström y Sjöberg, 2005). Por otro lado, la estrogenicidad del aceite de maíz no se debería a la composición de ácidos grasos del aceite sino que a otros componentes. En específico, se ha identificado dos moléculas derivadas de la oxidación de ácidos grasos, tetrahidrofuranodiol y leukotoxinadiol, y que en su conjunto son denominadas mitógenos del maíz. Markaverich et al. (2002a, 2002b, 2005, 2007) no solo aíslaron estas moléculas del maíz, sino que también las estudiaron en modelos in vitro e in vivo observando una estimulación de la proliferación de células de cáncer de próstata y de mamas así como un bloqueo de la ciclicidad del ciclo estral. Aparentemente, el efecto estrogénico no se debe a interacción con receptores de estrógeno sino que a un mecanismo todavía desconocido. Posteriormente, se ha demostrado también, que el uso de maíz deshidratado como cama en las jaulas de animales de experimentación podría estar asociado con tiempo al primer estro y longitud del ciclo estral en roedores (Kang et al, 2015). El aceite de maíz es frecuentemente utilizado como vehículo en estudios uterotrópicos en los cuales no demuestra estrogenicidad. Puede ser que distintas variedades de maíz, así como el proceso de obtención del aceite, afecten la concentración de estos mitógenos y por tanto se obtengan resultados contradictorios en distintos estudios, según la procedencia del aceite.

Conclusiones Los aceites de almendras y de maíz, demostraron estrogenicidad que pudiera depender de su composición en ácidos grasos u otros compuestos bioactivos. En específico, hipotetizamos que la estrogenicidad del aceite de almendras pudiera deberse a la relación entre los ácidos linoleico y oleico, mientras que el contenido de factores mitogénicos, variables según su origen, podría otorgarle actividad estrogénica al aceite de maíz. El riesgo potencial para la

Figura 2: Biodegradación de ácidos grasos ω3, ω6 y ω9.

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Estrogenicidad de los aceites de maíz y de almendras en modelos roedores

salud humana de estas respuestas moduladoras endocrinas en modelos roedores debe ser investigado.

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Catalase is more sensible to the inhibitory effect of soluble component of tobacco smoke than Glutathione Peroxidase and Superoxide Dismutase Villagrán M.1,3, Muñoz M.1,2, del Pozo M.2, Maldonado M3. and Mardones L.1* 1

Laboratorio de Fisiología Celular y Bioquímica Funcional. Laboratorio de Bioquímica. Departamento de Ciencias Básicas. Facultad de Medicina. Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepción, Chile. 3 Laboratorio de Antioxidantes, Departamento de Fisiopatología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Concepción, Chile. 2

Abstract: Tobacco smoke causes oxidative damage directly by the effect of their oxidants or indirectly through the induction of endogenously produced oxidants and/or inactivation of antioxidants. The oxidative effect of tobacco smoke depends on many variables: dose, time of exposure, tissue or cell type and endogenous antioxidant status. In an attempt to simplify this complex scenario, we examined the effect of a soluble extract of tobacco smoke on the activity of purified antioxidant enzymes (catalase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase) and in human plasma. Our results revealed that catalase and glutathione peroxidase were inhibited with an IC50 of 18 and 80 smoker equivalents (arbitrary units), respectively; meanwhile superoxide dismutase was not affected. A similar effect of soluble extract of tobacco smoke was obtained for antioxidant enzymes in human plasma, where catalase was inhibited, while superoxide dismutase was little affected, and glutathione peroxidase increased 20% its activity. Benzo[a]pyrene, a well-known component of tobacco smoke, was partly responsible for catalase inactivation. Although soluble extract of tobacco smoke and benzo[a]pyrene both induced carbonylation of plasma proteins, we ruled out that catalase inhibition would be caused by carbonylation, since the inhibition was reversed by dialysis. Considering the higher sensitivity of catalase to inhibition induced by soluble extract of tobacco smoke and its important role in peroxide elimination, we conceived that benzo[a]pyrene and other compounds of tobacco smoke extract promote a transient peroxide accumulation which could be one of the factors responsible for the oxidative damage in respiratory tract and other tissues in smokers. Keywords: catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, tobacco smoke, benzo[a]pyrene. Resumen: Catalasa es más sensible a los efectos inhibitorios de los componentes solubles del humo de tabaco que Glutatión Peroxidasa y Superóxido Dismutasa. El humo de tabaco causa daño oxidativo directamente por efecto de sus oxidantes o indirectamente por la inducción de la producción de oxidantes endógenos y/o inactivación de antioxidantes. El efecto oxidativo del humo de tabaco depende de varias variables: dosis, tiempo de exposición, tejido o tipo cleular y estado antioxidante. En un intento de simplificar este complejo escenario, examinamos el efecto de un extracto soluble de humo de tabaco en la actividad de tres enzimas antioxidantes en estado purificado y en plasma humano (catalasa, glutatión peroxidasa and superóxido dismutasa). Nuestro resultados revelan que catalasa y glutatión peroxidasa fueron inhibidas con un IC50 de 18 y 80 equivalentes de fumador (unidades arbirtarias), respectivamente; mientras que superóxido dismutasa no fue afectada. Encontramos un efecto similar del extracto soluble de humo de tabaco en las enzimas antioxidantes plasmáticas, donde catalasa fue más inhibida que superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa aumentó 20% su actividad. Benzo[a]pireno, un conocido componente del humo de tabaco, fue parcialmente responsable del la inhibicicón de catalasa. Aunque el extracto soluble del humo de tabaco y el benzo[a]pireno indujeron carbonilación de las proteínas plasmáticas, descartamos que esta modificación sera responsable de la inhibición de catalasa, porque la diálisis revertió su efecto. Considerando la alta sensibilidad de catalasa a la inhibición por extracto de humo de tabaco y benzo[a]pireno en particular, concluimos que el extracto de humo de tabaco promueve una *e-mail: lmardones@ucsc.cl 148

acumulación transiente de peróxidos que podría ser uno de los factores responsables del daño oxidativo observado en el tracto respiratorio y en otros tejidos de sujetos fumadores. Palabras clave: catalasa, superóxido dismutasa, glutatió peroxidasa, humo de tabaco, benzo[a]pireno.

Introduction Tobacco smoke is highly associated with the development of pulmonary pathologies like chronic respiratory disease, lung cancer and heart pathologies provoked by atherosclerosis such as hypertension and myocardial infarction. Oxidative stress is recognized as one of the most harmful effects produced by tobacco smoke (Wooten et al., 2006). Different compounds present in tobacco smoke are able to break the balance between antioxidants and pro-oxidant compounds endogenously generated by cells. This alteration of redox state could be caused by the direct oxidative effect of tobacco smoke. For instance, exposure of coronary, pulmonary or carotid arteries to tobacco smoke or acrolein, a single component from tobacco smoke; increased the production of superoxide or hydrogen peroxide through activation of endothelial NADPH oxidase (Cooper et al., 1992; Orosz et al., 2007). Tobacco smoke could also promote neutrophil activation and extravasation in pulmonary tissue, leading to an accumulation of oxidants produced by NADPH oxidase of neutrophil (Yao et al., 2008). Another way to switch the balance toward a pro-oxidative state is to block the antioxidant defense. Antioxidant defense of cells is composed of abundant antioxidant molecules like vitamin C and glutathione, and antioxidant enzymes like catalase, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD), whose role is to break down oxidant species. Studies in different cell models and in rats show that tobacco smoke and some byproducts like acrolein, acetaldehyde and formaldehyde, decrease glutathione levels and induce the expression of enzymes involved in glutathione synthesis (i.e glutathione synthetase) (Cooper et al., 1992; Yeager et al., 2016). In addition, tobacco smoke is able to inhibit the activity of catalase, which has been found to be decreased in the plasma of smokers, or in the liver of rats exposed to tobacco smoke (Méndez-Alvarez et al., 1998). Similarly, SOD activity decreases in plasma and liver of rats in response to tobacco smoke and in lung of smokers. However, MnSOD expression in lung of rats increases (Florek et al., 2004; Gilks et al. 1998; Margaret et al., 2011). Soluble extracts of tobacco smoke decreases SOD expression in neuroblastoma cells and benzo[a]pyrene (BaP), a polycyclic hydrocarbon compound found in tobacco smoke, increases the activity of MnSOD in rat liver (Gupta et al., 1988) . The studies concerning to GPx reveal that its expression and activity is decreased in the presence of tobacco smoke in saliva, lung, plasma and in neuroblastoma cells in culture (Giuca et al., 2010; Russo et al., 2011). The aforementioned studies highlight that the effect of tobacco smoke on the antioxidant defense is quite variable due to the complex nature of the system. Factors like dose and time of exposure to tobacco smoke, the antioxidant studied and the method used to assess the effect could influence the result. The study model itself is another source of variability since the cell type and the particular tissue studied express different levels of antioxidant enzymes or transporters involved in glutathione synthesis or vitamin C uptake, leading to a fluctuating redox state. To our knowledge, there aren't any published studies on

Catalase is more sensible to the inhibitory effect of soluble component of tobacco smoke than Glutathione Peroxidase and Superoxide Dismutase

the effect of tobacco smoke on antioxidant enzymes in an in vitro assay that allow for simplifying the complexity of antioxidant defense, avoiding the natural synergy observed between different antioxidant mechanisms and variation due to induction transcriptional. In this study, we examined the effect of a soluble extract of tobacco smoke (ETS) and benzo[a]pyrene (BaP) on the activity of purified antioxidant enzymes and compared that with the comportment of the same enzymes in human plasma. Protein carbonylation provoked by ETS and BaP was evaluated to assess a possible mechanism of antioxidant enzyme inhibition, testing the reversibility of inhibition by dialysis.

Methods Chemicals Benzo[a]pyrene (98% purity) and pyrogallol (98% purity) were purchased from Sigma-Aldrich, along with the enzymes glutathione peroxidase from human erythrocytes (cat. No G6137), glutathione reductase from baker's yeast (cat No G3664) and superoxide dismutase from bovine erythrocytes (cat. No S7571). Catalase from Aspergillus niger was purchased from Calbiochem (cat No 219261). Protein carbonylation kit was acquired in Cayman Chemical (item No 10005020). All the other reagents used were of analytical grade and purchased from Merck. Preparation of a soluble extract of tobacco smoke (ETS) To prepare ETS, we used cigarettes that are 8 cm in length, with a 3 cm filter, containing 0.6 mg of nicotine and 7 mg of tar. ETS was obtained passing the smoke produced by the combustion of 5 cigarettes into 10 ml of phosphate saline buffer pH 7.4 using the negative pressure generated by a vacuum pump. The extracts were aliquoted and stored at -20ºC until used. As defined by Raveendran et al., the ETS produced contained 100 smoker equivalents (SEq), where 1 SEq correspond to 5 cigarettes smoked by an average-sized adult or 0.002 cigarettes/ml (Raveendran et al., 2005). Catalase Assay Catalase activity was measured following the break down kinetics of hydrogen peroxide at 240 nm using 30 mM hydrogen peroxide and 4 U/ml of catalase in the presence of increasing amounts of ETS or BaP in phosphate buffer 50 mM pH 7.4 (Weydert and Cullen, 2010). Results were expressed as enzyme units considering that 1 U breaks down 1 μmol of H2O2 in 1 minute. Superoxide dismutase assay SOD activity was measured with the pyrogallol autoxidation method using different amounts of bovine SOD, 60 mM pyrogallol and increasing concentration of ETS in buffer 5 mM Tris-HCl pH 7.4 (Li, 2012). Results were expressed in enzyme units, considering that 1 U of SOD inhibits 50% of pyrogallol autoxidation.

Plasma protein carbonylation Determination of plasma protein carbonylation in presence of ETS or BaP was made with the dinitrophenylhydrazine reaction, measuring the formation of protein-hydrazone adducts at 360 nm, according to the manufacturer's instructions. Carbonyl content was expressed in nmol/mg of total proteins, which was determined through the Bradford assay. Dialysis Dialysis of plasma in the presence of ETS was performed using cellulose membranes with 3.5 kDa size exclusion (Spectra/Por) in a volume of 2 ml. The process was performed for 18 hours at 4ºC against phosphate saline buffer with 2 changes of buffer during the first and last hours of dialysis (Méndez-Alvarez et al., 1998). Statistic analysis Statistic analysis was performed using non-parametric t-student. p<0.05 was defined as statistically significant (*) and p<0.01 was defined as very statistically significant (**)(GraphPad software 2017)

Results The enzymatic activity of purified catalase, GPx and SOD was studied in the presence of different amounts of ETS ranging from a concentration 0 to 500 SEq. As shown in Figure 1A and B, catalase and GPx were dose dependently inhibited by ETS. The activity of both enzymes was completely abolished in the presence of 20 SEq or 150 SEq for catalase and GPx, respectively. Half of the inhibitory effect was obtained with 18 SEq for catalase and 110 SEq for GPx, indicating that the IC50 for catalase was 6 times lower than for GPx. Interestingly, the activity of SOD was not significantly affected by ETS, even when using concentrations 100 higher than that required to abolish catalase activity (Figure 1C). These data show that in vitro condition, which represents an isolated exploration of enzyme properties; catalase and GPx is inhibited by ETS while SOD is not affected. Human plasma is made up of a multitude of components with redox properties, which are able to react upon an oxidative insult and could therefore modify the effect of ETS on antioxidant enzymes in isolation. To address this issue, the activity of antioxidant enzymes in human plasma was measured where 10 or 20 SEq was added right before the enzyme determination. A similar effect of ETS on catalase and SOD was observed in plasma (Figure 1D and 1F). In the case of catalase, a 60% decrease in activity was induced by ETS at the two concentrations used. For SOD, a 25% decrease in activity was induced

Glutathione peroxidase assay GPx activity was measured following the kinetics of NAPDH consumption at 340 nm, coupling the reaction of H2O2 detoxification to the reduction of oxidized glutathione by glutathione reductase in presence of NADPH (Weydert and Cullen, 2010). For that purpose, GPx was incubated with 50 nM glutathione, 20 mM H2O2, 20 mM NADPH, 2 U/ml GR and increasing concentration of ETS in phosphate buffer 18 mM. It was considered that 1 unit of GPx consumes 1 μMol of NADPH, which has an extinction coefficient of 6.22 cm2/μmol. ETS effect on antioxidant enzymes in plasma The effect of ETS on the activity of catalase, SOD and GPx was evaluated in human plasma, which was obtained by venipuncture from a healthy, non-smoking volunteer who was informed about the research objectives and agreed to collaborate (oral informed consent).

Figure 1.

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by ETS. However, for GPx a strong opposite effect of ETS was observed, functioning as an activator in human plasma, increasing 20% its activity at the same concentration of ETS (Figure 1E). These data show that the effect of tobacco on antioxidant enzymes is different in presence of plasma where different compounds interfere with the action of tobacco components either enhancing or blocking their inhibitory potential. Mechanism of catalase ETS-induced inhibition Our results point to catalase as the most affected antioxidant enzyme when exposed to tobacco smoke. To gain insight into the mechanism of catalase inhibition, we asked whether carbonylation could be mediating the inhibitory effect of ETS on catalase. Carbonylation is a covalent protein modification frequently found in proteins exposed to oxidative stress. This modification is generally irreversible and associated with loss of function. The carbonylation of total plasma protein induced by increasing amount of ETS was measured (Figure 2A). In basal conditions, 0.35 nmole of carbonylation per mg of protein were detected, the amount of cabonylation was dosedependently increased in the presence of ETS, reaching 2.6 nmole per mg of protein with 100 SEq. The data obtained establish that tobacco is a potent inducer of plasmatic protein carbonylation that could be causing catalase inhibition. Since carbonylation is a fundamentally irreversible protein modification in our in vitro conditions, we reasoned that if ETS inhibitory effect were mediated by carbonylation, a dialysis filtration should not reverse catalase inhibition. On the contrary, if inhibition of catalase provoked by ETS were caused by a small compound present in tobacco that reversible binds to catalase; the inhibition would be reversed by dialysis filtration. To evaluate that hypothesis catalase activity in human plasma containing 100 SEq and submitted to dialysis at 4ºC against reaction buffer for 18 hrs before enzyme determination was measured. The catalase inhibition in the presence of ETS was completely reversed when the reaction mixture was submitted to dialysis in contrast to un-dialyzed control reaction, which showed a 90% inhibition in the presence of the chosen ETS concentration (Figure 2B). The evidence presented here is not consistent with an irreversible mechanism of ETS induced inhibition and therefore we indirectly can rule-out carbonylation as the underlying cause of catalase inhibition. In an attempt to further characterize the inhibitory effect of tobacco, the effect of BaP, on the activity of antioxidant enzymes was studied. BaP is the main polycyclic aromatic hydrocarbon present in tobacco smoke and has been recognized for its carcinogenic properties. As

Figure 2.

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seen in Figure 2C, catalase is not affected by 3 mg/ml of BaP, but 10 mg/ml induced a 35% inhibition. When the effect on catalase in human plasma was studied, the activity of this enzyme was unaffected at 3 mg/ml BaP, but was doubled at 10 mg/ml (Figure 2D). These results show that BaP alone is able to inhibit both enzymes in a dosedependent fashion, and that this compound is partially responsible for the inhibitory effects of ETS on catalase activity. Finally, BaP alone induced carbonylation although at lower rate than ETS: in the presence of 1.0 ng/ml of BaP there was no increase compared with basal carbonylation, (0.18 nmole per mg of proteins) but with 10.0 ng/ml, carbonylation levels reached up to 0.5 nmole. However, as catalase inhibition observed in plasma was reversed by dialysis, BaPmediated carbonylation is not the mechanism of ETS- induced catalase inhibition observed in plasma samples.

Discussion The results presented here reveal that soluble components of tobacco smoke produce a reversible inhibition of catalase, with an IC50 of 18 SEq and over 50% inhibition with 10 SEq in human plasma. GPx was less susceptible to ETS-induced inhibition and SOD activity was not affected even at the highest concentration assayed. Considering that 10 SEq represent the consumption 100 cigarettes a day, we realize that antioxidant enzymes are rather resistant to oxidative damage induced by tobacco smoke. The amount of cigarettes needed to produce a decrease of 65% in catalase activity is achieved with a dose of 100 cigarettes a day, which is hardly found even in an active smoker. However, we must consider that in respiratory tract, antioxidant enzymes are directly exposed to tobacco components and hence to a larger amount of oxidative damage. A partial inhibition of catalase provoked by tobacco smoke in lungs would foster the oxidative and mutagenic damage because of the accumulation of hydrogen peroxide, leading to the formation of more reactive oxidant species and accelerating the ETS-produced lung diseases like chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer. Studies related to the effect tobacco smoke on the activity of antioxidant enzymes have been performed mainly in cells, tissues or fluids obtained from animals or humans exposed to tobacco. Therefore, the behavior of studied enzymes in each model depends on the particular conditions of each study, such as initial antioxidant capacity, time of exposure to tobacco, dose of tobacco used, periodicity of treatment, biotransformation suffered by tobacco compounds, etc. Although our studies showed that GPx is poorly affected and SOD is practically insensitive to soluble tobacco components, there are published studies indicating that GPx and SOD decrease their activity in the presence of tobacco smoke (Florek et al., 2004; Giuca et al., 2010; Russo et al., 2011). The apparent discrepancy between these data and our results could arise from differences in the model, where the higher chemical complexity of the cell-derived compounds modified the effect of tobacco smoke. Particularly, the interaction of oxidative compounds of tobacco with cell-derived molecules could enhance the oxidative potential of tobacco, which alone does not induce enzyme damage. For example, ascorbic acid present in many tissues is well known for its protective effects on oxidative damage caused by tobacco smoke. However, in a cellular context ascorbate reacts with bivalent metals like copper or iron, to produce ascorbyl radical, which inhibits catalase (Davison et al., 1986; Panda et al., 2001; Panda et al., 1999). Regarding the inhibition of catalase by tobacco smoke, MéndezAlvarez et al. reported an IC50 of 0.009 cigarettes/ml (equivalent to 4.5 SEq in the units used in our study) for catalase from liver and brain homogenate of mice exposed to tobacco (Méndez-Alvarez et al., 1998). As mentioned before, the difference between this study and our data could emerge from the peculiar nature of the model used: in vitro v/s whole tissue. Although the purified catalase from our study was obtained from Aspergillus niger, we don't believe that the different origin of species could be relevant since we observed a very similar effect of tobacco smoke on A. niger catalase and human catalase used in our assays in vitro and in plasma respectively. The latter two

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catalases have only 35% sequence identity between them, meanwhile mouse and human catalase possesses 90% identity, thus we cannot attribute low sensitivity to tobacco smoke to poor sequence similarity. Furthermore there is a high conservation of the important amino acids in the active site of A. niger catalase respect to human and other species (Patnaik et al., 2013). Carbonylation is one of the most studied oxidative irreversible modifications and can be produced by hydrogen peroxide in the presence of metals or by-products of lipid peroxidation, such as 4hydroxynonenal. In this study we confirm that tobacco smoke produces carbonylation of human plasma proteins in a dosedependent manner in agreement with published data that report carbonylation of human plasma proteins, bovine serum albumin and liver microsomal proteins in the presence of tobacco smoke (Panda et al., 2001; Panda et al., 1999). Aminoacids as phenylalanine, valine and histidine are abundant in their active site, which make us proposed that antioxidant enzymes were inhibited by tobacco smoke due to carbonylation of their side chains (Halliwell and Gutterdge, 1999; Jacob et al., 2011). The oxidative effect could be favored by the presence of transition metals in their active site, as is the case for catalase (Aksoy et al., 2004; Díaz et al., 2012; Patnaik et al., 2013). However, the reversal of the inhibition after dialysis allows us to discard a covalent oxidative modification as the origin of catalase inhibition. Because more than 400 compounds have been identified in tobacco smoke, it is difficult to know which ones are responsible for tobacco's inhibitory effect on catalase and GPx. It is postulated that nitrosamines, quinones, hydroquinones and transition metals would allow the generation of ROS, RNS and aromatic hydrocarbons during combustion. We studied the direct effect of BaP on inactivation of catalase. This compound is one of the most studied components of cigarette smoke and corresponds to a polycyclic aromatic hydrocarbon generated by incomplete combustion of organic tobacco materials, petroleum and red meat. It is classified as one of the three most potent carcinogenic agents and its presence in tobacco smoke is associated with the development of cancer in smokers due to the mutagenic action of their epoxide or quinone metabolites (Emre et al., 2007; Halliwell and Gutterdge, 1999; Wei et al., 1989). In our study, we found that BaP alone produces inhibition of purified catalase, reaching 60% of the initial activity at a concentration of 10 mg/ml. However in plasma, the same concentration of BaP produces over 100% activation. Again, we observe that the plasma scenario is different from that observed with the purified enzyme. It is possible that plasma foster the formation of other derivatives of BaP that have different effects, such as catalase activation and inhibition of SOD. The concentration of BaP can reach up to 40 μg per cigarette, and although it is chemically quite inert, it can produce several derivate responsible of its deleterious cellular effects as p-benzoquinone radical by reacting with oxidants in aqueous phase, benzosemihydroxyquinone by autooxidation and different epoxides and enodiols by metabolization and producing directly protein carbonylation, as we found in this work.

Conclusions According to our data, catalase is the most sensitive antioxidant enzyme to tobacco inhibitory effect and plasma lacks a protective effect against tobacco-induced inhibition. Both, GPx and SOD showed a different comportment in purified state and in plasma, highlighting the influence of plasma compounds in ETS inhibitory effect. Although BaP evoked partially the effect of ETS, we rule-out carbonylation or other covalent oxidative modification as mechanism of catalase inhibition, because catalase inhibition in plasmatic sample was reversed by overnight dialysis, results that open possibilities of new research in the area, exploring the mechanism of catalase ETS inhibition

manuscript editing.

Support Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepción, Chile under Grant of Dirección de Investigación e Innovación number DIN 05/2012 of L.M.; and from Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología, CONICYT, Gobierno de Chile under Grant FONDECYT/Postdoctorado number 3150285 of M.V.

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Mrs. Katia Muñoz for technical support and Mrs. Mary Hayes for

15. Orosz, Z., Csiszar, A., Labinskyy, N., Smith, K., Kaminski, P. M.,

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Evaluación de la actividad hepatotóxica del acetaminofén in vivo en rata e in vitro en cortes de hígado de rata, en búsqueda de la correlación entre ambos modelos de tal forma que permita la sustitución del método in vivo Torres Wilches M.A. 1 Universidad Nacional de Colombia, Departamento de Farmacia, AA 14490, Tel. (051) 3165000 Ext.14631, Fax: 3165080, Bogotá D.C., Colombia

Resumen: Se evaluó toxicidad hepática del acetaminofén (APAP) utilizando técnica In Vitro en cortes de hígado de rata y técnica In Vivo tradicional. Daño órganos fue medido por los siguientes marcadores bioquímicos: síntesis albúmina (ALB), actividad fosfatasa alcalina (FA), actividad alanino aminotransferasa (ALT), actividad aspartato aminotransferasa (AST) y lactato deshidrogenasa (LDH).Se observó pérdida de funcionalidad de enzimas ALT, LDH, proteína ALB y elevación en actividad de enzimas FA y AST, cuando el metabolito tóxico NAPQI se encuentra en altas concentraciones citosólicas. La citotoxicidad en cortes fue medida utilizando prueba de MTT y realizando una evaluación histológica; encontrándose pérdida dosis dependiente en la viabilidad celular con MTT y ligera necrosis centrilobular del tejido. La evaluación In Vivo, de toxicidad por acetaminofén, no mostró buena relación bioquímica con los resultados In Vitro, pero si histológicos. Las diferencias enzimáticas, entre modelos, es resultado de provocación de toxicidad aguda, en grados y etapas diferentes Palabras clave: cortes hígado de rata; toxicidad acetaminofén; pruebas función hepática. Abstract: Evaluation of hepatotoxic activity the acetaminophen in vivo in rat and in vitro in rat liver slices, searching for correlation between both models in such a way that it allows the substitution in vivo model. The hepatotoxic activity of acetaminophen (APAP) was evaluated using In Vitro metodology of rat liver slices and traditional In Vivo metodology. Damage of the organ was measured with the following biochemical markers: albumin synthesis (ALB), alkaline phosphatase activity (FA), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase. The results were loss in the functionality of the enzymes ALT, LDH and ALB protein and elevation in the activity of enzymes AST and FA, how consequence of increment of the amount of toxic intermediate NAPQI into cytosol. The citotoxicity of the slices was measured using MTT test and a histological evaluation; were observed that loss dose-dependent in the cellular viability and slow centrilobular hepatocite necrosis. The evaluation In Vivo, of acetaminophen toxicity, showed that there is no relationship at biochemical level with the results obtained In Vitro, but if at histological level. The enzymatic difference, among the two models, is the result of the provocation of acute toxicity, in grades and different stages. Keywords: rat liver slices; acetaminophen toxicity; test hepatic function.

Introducción Determinar la hepatotoxicidad es importante puesto que el hígado es uno de los órganos más importantes, que como glándula es la más representativa del organismo, debido a las complejas funciones que desempeña (biotransformación de sustancias endógenas y exógenas, síntesis proteica, metabolismo energético y detoxificación). Los métodos “In Vitro” más utilizados para esta evaluación son el cultivo de hepatocitos y los cortes de hígado, es importante resaltar que hoy en día la metodología de evaluación de hepatotoxicidad a través del uso del modelo in vitro con cortes de hígado, permite *e-mail: matorresw@unal.edu.co

profundizar bastante en los mecanismos de acción molecular, genéticos e histológicos, que llevan a este tipo de daño por exposición a xenobióticos activos. Es así, como diversos trabajos publicados resaltan el uso de esta metodología haciendo énfasis, en que el principal mecanismo de hepatotoxicidad del acetaminofén es por necrosis, además de ser capaz de inducir alteración toxicogenómica manifestada por el modelo in vivo, o in vitro por el modelo de cortes de tejido, tras la exposición al APAP [Elferink et al, 2008; George et al, 1999]. En los últimos años el modelo de cortes de tejido ha sido objeto de un continuo mejoramiento, posicionándose como herramienta clave para el estudio toxicológico de compuestos bioactivos, por presentar ventajas sobre otras metodologías utilizadas. La principal de ellas es que los cortes conservan todo tipo de célula presente en el órgano “In Vivo”, preservando la organización tisular del órgano, lo cual permite observar efectos en una región ó en un tipo de célula específico, adicionalmente se conserva la interrelación espacial normal, la comunicación intercelular y la arquitectura del órgano. Sin duda ha sido evidenciado que este sistema in vitro imita exactamente y predice los efectos tóxicos observados in vivo, permitiendo diferenciar entre los diferentes mecanismos de toxicidad [Elferink et al, 2008; Osma et al, 2016; Uzi et al, 2013; Mukazayirea et al, 2010; Rastogi et al, 2007; Plaay y Charbonneau, 2001]. Un aspecto fundamental a resaltar en la utilización de cortes de hígado en la evaluación de la actividad hepática de diversos xenobióticos, es la viabilidad presentada por este tipo de técnica in vitro bajo las condiciones de mantenimiento que se utilizaron y que se describirán más adelante, usando para ello condiciones utilizadas en otros trabajos y que establecieron viabilidad adecuada de los cortes por al menos 24 horas, que permite la adecuada y reproducible valoración de los marcadores usados para tal fin [Elferink et al, 2008; Hadi et al, 2012; Mukazayirea et al, 2010]. Entre los más recientes trabajos publicados, uno resalta la evaluación de fibrosis hepática producida por acumulación progresiva de tejido conjuntivo, que lleva a la pérdida de función hepática. Resaltándose que no se dispone de fármacos antifibróticos eficaces, debido a la falta de modelos de evaluación fiables en humanos. El investigar el proceso fibrótico en cortes de precisión de hígado humano (PCLS), ha permitido evaluar la eficacia de múltiples compuestos antifibróticos putativos. Además, este trabajo demostró que los PCLS humanos mantienen su viabilidad durante 48 h. También evidenció un perfecto contraste de datos obtenidos en PCLS humanos con los de rata, indicando que la eficacia de los fármacos antifibróticos evaluados son claramente especie específicos [Westra et al, 2016]. El método in vitro en cortes de hígado, aplica el enfoque ético de la investigación, basado en el Principio de las tres R´s de Russell (reducción, refinamiento y reemplazo), en cuanto al uso de animales de laboratorio [Mrad y Cardozo, 1998]. Para realizar sus funciones, el hígado cuenta con una gran cantidad de enzimas con funciones oxidativas y reductivas, entre las cuales se encuentran las del sistema del citocromo de la proteína 450 (P-450), flavin-monooxigenasas, peroxidasas, hidroxilasas, esterasas y amidasas. Otras enzimas también presentes son las glucuroniltransferasas, las sulfotransferasas, metilasas, acetiltransferasas, tioltransferasas. Todas éstas enzimas tienen gran importancia en las biotransformaciones de las sustancias tóxicas. La posible afección de estas enzimas genera potencial daño hepático, 153

Torres Wilches M.A.

principalmente provocado por mecanismos complejos que implican formación de radicales libres que inducen estrés oxidativo con posible peroxidación, daño de ADN e inflamación. Uno de los más claros ejemplos de hepatotoxicidad por esta vía es la surtida por el CCl4, que tras la formación metabólica del radical triclorometilo altamente reactivo, ataca los ácidos grasos poliinsaturados de la membrana del retículo endoplasmático produciendo pérdida del citocromo P-450, con fallo funcional, disminución proteica y acumulación de triglicéridos. [Osma et al, 2016; Peña et al, 2003]. El APAP igualmente en su biotransformación surte un metabolito altamente reactivo como lo es la N-acetil-p-bezoquinoneimina (NAPQI), tal como ha sido determinado en diversos trabajos. Uno de ellos demostró en sus resultados el efecto oxidativo, con alteración significativa de varios marcadores, como superóxido dismutasa y de la relación de glutatión reducido/oxidado (GSH/GSSG) [Correia et al, 2016; Hamza y Al-Harbi, 2015].

60*15 mm), viales de vidrio de 5 mL, tubos de vidrio estériles vacutainer de 7 mL (tapa roja), homogenizadores manuales de vidrio (Ø*H:5*100 mm), equipo de disección Stainless, desecador de vidrio, balón de fondo plano (50 mL), espátulas.

Para evaluar el posible mecanismo de acción hepatotóxico del acetaminofén, en éste trabajo, se utilizaron como marcadores de daño celular pruebas enzimáticas de funcionalidad hepática y análisis histológico. Los resultados obtenidos se relacionan con las seis principales rutas de mecanismo de daño hepático conocidas, dentro de las cuales la principalmente resaltada para este agente es la necrosis [Olinga et al, 2001].

Extracción del hígado de rata y obtención de los cortes: se seleccionó y sacrificó por dislocación cervical una rata Wistar albina de 10-12 semanas de edad y con peso de 250 ± 40g y se extrajo el hígado cuidadosamente, posteriormente se lavó con agua destilada, para retirar la sangre.

Otro importante aspecto en el que resulta de fundamental importancia el uso de cortes de hígado para la evaluación, sin resaltar relevancia de la especie animal del que provengan, es en la evaluación hepatoprotectora que siempre se ha resaltado de los productos de origen natural con actividad fitoterapéutica, como lo son Silybum marianum, Tridax procumbens, Strychnos potatorum, y Andrographis paniculata, haciendo uso de marcadores de efecto como los utilizados en esta investigación [Osma et al, 2016]. El uso de cortes es una técnica complementaria al cultivo de células en monocapa, que proporciona datos de gran valor a nivel bioquímico, fisiológico, farmacológico y toxicológico. Los cortes de hígado pueden ser incubados por largos periodos de tiempo, permitiendo la evaluación de toxicidad aguda, crónica e inducción enzimática causada por diversos xenobióticos [Plaay y Charbonneau, 2001].

Materiales y métodos Reactivos

Material Biológico. La especie animal seleccionada para la realización de ésta prueba es la Rata Wistar Albina (colonia OF1), suministrados por el Bioterio del Departamento de Farmacia U.N, con un peso de 250 ± 40g, entre diez y doce semanas de edad, género masculino, bajo procedimientos aprobados por el comité de ética del departamento. Los animales son mantenidos bajo condiciones controladas de temperatura (22 ± 3 ºC), humedad relativa (30 -70 %), y periodos de luz oscuridad de 12 horas; con suministro de agua y alimento ad libitum. Obtención de la muestra In Vitro

El órgano se mantuvo en medio de cultivo Williams E suplementado y en refrigeración durante la realización de los cortes, condiciones que se mantuvieron de ser necesario hasta por 8 horas antes de la incubación. Se colocó cada lóbulo (del más grande al más pequeño) dentro de un montaje que incluye un baño de escarcha de hielo para cortarlo manualmente en forma transversal, obteniéndose fracciones de hígado con un espesor y peso uniforme, aproximadamente 700 µm y 50 mg respectivamente. Incubación del corte de hígado con acetaminofén en medio de cultivo: se incubaron 40 cortes de tejido, con un peso promedio de 50 mg ± 6 mg de acuerdo con el diseño experimental, explicado en la Tabla 1. [Jetten et al, 2014; Mukazayirea et al, 2010] Lavar los cortes con buffer fosfatos, una vez terminado el tiempo de incubación [Hadi, 2012; Behrsing, 2003] y posteriormente obtener el homogenado de tejido con dos mililitros de buffer Hepes. Determinar marcadores de “respuesta” de actividad hepática: fosfatasa alcalina, albúmina y lactato dehidrogenasa presentes en el homogenado de tejido. Tabla 1. Diseño experimental método 1.

Medio Williams E, Suero Fetal Bovino Cualificado Origen Australia, L- Glutamina, Gentamicina 10mg/mL GIBCO. MTT>97.5% (TCL). Powder cell culture tested, Lactato Dehidrogenasa (LDH/LD), Bicarbonato de Sodio R.A., Buffer Hepes SIGMA. Ácido Acético R.A, Cloruro de Sodio R.A., Fosfato monosódico R.A., Fosfato disódico R.A., Isopropanol R.A. MERCK. Kit Fosfatasa Alcalina, Kit Transaminasas GOT, Kit de Transaminasas GPT WIENER LAB. Colorante de Bradford BIORAD. Rojo Neutro MOL LABS. Acetaminofén P.A. MALLINCKRODT CHEMICALS. Etanol 96%. LICORERA DE CUNDINAMARCA, Aceite de Girasol GRASCO, Agua destilada Laboratorio de Microbiología Departamento de Farmacia Universidad Nacional de Colombia. Equipos e instrumentos Micropipetas Lab-mate (20,100 y 1000 µL), balanza electrónica de precisión SARTORIUS BASIC BP 221 S, centrífuga Jouan MR 182, incubadora Memmert BE 400, espectrofotómetro Spectronic 20 Génesis UV/VIS, baño termostatado con agitación horizontal LabLine. Materiales Tubos Reacción Eppendorff 1.5-2.0 mL, celdas espectrofotométricas semimicro Ultravette® (1.5-3.0 mL), (A*H:4.5*23 mm). Rango λ: 220-900nm, cajas de petri (Ø* H: 154

* Las concentraciones de agentes hepatotoxicos están expresadas en milimoles/litro de medio de cultivo Williams E suplementado con: bicarbonato de sodio, suero fetal bovino, lglutamina, fosfatos y gentamicina (usando como guía la referencia [Renwick et al. 2000]).

Determinar la viabilidad celular de cada corte de hígado, sometiendo los tejidos al diseño experimental descrito en la tabla 1 y una vez

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Evaluación de la actividad hepatotóxica del acetaminofén in vivo en rata e in vitro en cortes de hígado de rata, en búsqueda de la correlación entre…

terminada la incubación, seguir el protocolo regular usado con MTT (Bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio)) y el de RN (Rojo neutro). Analizar los datos obtenidos con el modelo estadístico descrito anteriormente. Preparación de los cortes para la evaluación histopatológica: terminado el tiempo de incubación los cortes de hígado destinados al análisis histopatológico, se sumergieron en formaldehído bufferado al 10% y fueron enviados al Laboratorio de Histopatología, Departamento de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de Colombia. Obtención de homogenado del hígado de rata: terminado el tiempo de incubación, todos los cortes de tejido fueron lavados con buffer fosfatos (pH: 7,4), para retirar de la superficie el exceso de agente tóxico. Luego cada corte se colocó dentro del homogenizador manual de vidrio, se adicionó 0.5 mL de buffer Hepes y se homogeneizó durante 1 minuto a 60 rpm, manteniendo el homogenizador en un baño de escarcha de hielo. El homogenado fue vertido en un tubo eppendorf de 1ml, asegurando el vertido total del residuo al homogenizador; posteriormente se centrifugó a 8500 rpm durante 15 minutos y 4°C. El sobrenadante se mantuvo refrigerado como muestra hasta la cuantificación de los marcadores bioquímicos. Obtención de la muestra In Vivo Administración de los animales: se seleccionaron 25 animales con peso entre 250 ± 40 g y 10 semanas de edad. Se distribuyeron de forma aleatoria en grupos de cinco, un animal por dosis y un animal control, se controlaron las condiciones de temperatura (22°C ± 3 ºC), humedad relativa (30-70 %), periodos de luz/oscuridad de 12 horas y ayuno de 12 horas previa administración de las dosis de acetaminofén vía peroral. Se prepararon suspensiones de acetaminofén en aceite comercial de girasol administrando dosis de: 100, 200, 400 y 600 mg APAP/Kg de peso [Janbaz et al, 2002; Tran et al, 2001; Noriega et al, 2000] y para los animales control 0.5 mL de aceite de girasol. Luego de una hora de la administración se suministró a los animales alimentación y agua ad libitum. Obtención del suero: Pasadas 24 horas de la administración se anestesió cada animal con éter etílico, se colocó en posición dorsal sobre la superficie de operación para disecar la musculatura del área, hasta encontrar la arteria carótida, levantándola con el fin de colocar el clamp para cortar el vaso sanguíneo y colocarlo en la boca del tubo de ensayo. Se retiro el clamp y se extrajeron aproximadamente 5 mL de sangre.

El resultado total de los marcadores bioquímicos: albúmina, fosfatasa alcalina, animotransferasas (ALT y AST) y lactato deshidrogenasa, corresponden a la sumatoria de los valores encontrados en la cuantificación en las dos muestras obtenidas por la técnica In Vitro, mientras en la técnica In Vivo se determinaron de forma independiente el valor en suero y en el sobrenadante, ya que no es posible garantizar que el total de los diferentes marcadores bioquímicos provengan exclusivamente del tejido hepático. La determinación de los marcadores bioquímicos en la técnica In Vitro se realizo en dos días diferentes, mediante el uso de tejidos recién obtenidos con el fin de garantizar la reproducibilidad de los resultados. Determinación de albúmina: se vertieron 20 µL de la muestra en una celda espectrofotométrica semimicro, se adicionaron 980 mL de agua destilada y 200 µL de reactivo de Bradford. Luego se mezcló por inversión y pasados dos minutos de reacción se leyó la absorbancia a 595 nm. El blanco se preparó a partir de agua destilada a la que se aplicó el mismo procedimiento ejecutado con las muestras, pero sin estas. Utilizando la ecuación de la curva de calibración, previamente realizada y teniendo en cuenta la dilución hecha se calculó la concentración de albúmina. Los resultados obtenidos son expresados como g proteína/dL*g de hígado. Determinación de la actividad de fosfatasa alcalina en el medio de cultivo y en sobrenadante. Sé tomaron tres celdas espectrofotométricas semimicro para: blanco (B), estándar (E) y muestra (M) en cada una de estas se virtió 100 µL de sustrato (4-aminoantipirina 29 mM en solución de amino metil propanol 3 mM pH: 10.0) y se incubarón por 5 minutos a 37°C. Terminado el tiempo de incubación se adicionaron 10 µL de agua destilada a la celda del blanco, 10 µL solución de fenol 200 UI/L a la celda del estándar y 10 µL del medio de cultivo ó del sobrenadante en la celda de la muestra. Se mezcló e incubó por 10 minutos a 37 °C. Terminada la segunda incubación, se adicionó a cada celda 500 µL de reactivo de color (ferricianuro de potasio 10 mM), se mezcló por inversión y se leyó la absorbancia (A) a 520 nm. La actividad de fosfatasa alcalina se calculó utilizando la siguiente ecuación: FA (UI/l)= (200 UI / E – B) x (M – B) Los resultados obtenidos son expresados como UI de FA/L*g de hígado. Determinación de la actividad de aminotransferasa (ALT y AST) en el medio de cultivo y en sobrenadante.

La sangre obtenida se incubó a 37 °C por 30 minutos, con el fin de acelerar y garantizar el óptimo proceso de coagulación, despues se centrifugó por 5 minutos a 2500 rpm y temperatura ambiente, terminado este proceso se separaron 2 mL de sobrenadante “suero” el cual se mantuvo en refrigeración hasta su análisis.

Se tomaron dos celdas espectrofotométricas semimicro para blanco (B) y para la muestra (M). En cada celda se vertieron 82 µL de sustrato (para la ALT el sustrato contiene: dl-alanina 200 mM y αcetoglutarato 2 mM en buffer fosfatos 100 mM pH 7,4 y para la AST el sustrato contiene: l-aspartato 100 mM y α-cetoglutarato 2 mM en buffer fosfatos 100 mM pH 7,4) y se incubaron por 5 minutos a 37 °C.

Extracción del hígado de rata y obtención de los cortes: se sacrificó el animal por exceso de anestesia, se extrajo el hígado y se realizaron los cortes del mismo de acuerdo a la técnica descrita en la metodología In Vitro.

Terminado el tiempo de incubación se adicionó a la celda del blanco 16 µL de agua destilada y en la celda de muestra 16 µL del medio de cultivo ó sobrenadante. Se mezcló por agitación suave y se incubó por 30 minutos a 37 °C.

Se realizó el número de cortes necesario que permitiera: 2 cortes para determinaciones enzimáticas, 2 cortes para pruebas de viabilidad celular y 3 cortes por dosis para estudios histopatológicos.

Terminada la segunda incubación se adicionó a cada celda 82 µL de reactivo 2,4-DNFH (2,4- DNFH 1 mmol en ácido clorhídrico 1 mM). Se mezcló e incubó a 37°C por 10 minutos.

Preparación de los cortes para la evaluación histopatológica y obtención de homogenado del hígado de rata: se realizaron de acuerdo a la técnica descrita en la metodología In Vitro. Cuantificación de los marcadores Bioquímicos de las muestras obtenidas In Vitro e In Vivo

Tras la tercera incubación se adicionó a cada celda 820 µL del diluyente para enzimas (solución de hidróxido de sodio 0.25 M), se mezcló por inversión y se leyó la absorbancia (A) a 505 nm. La actividad de transaminasas se calculó utilizando las tablas de conversión reportadas en el protocolo de Wiener Lab y de las cuales se obtuvo las siguientes ecuaciones de las rectas:

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ALT (UI/L) = (A-0.043)/ 0.0053 AST (UI/L) = (A- 0.032)/ 0.0034 Los resultados obtenidos son expresados como UI de AST ó ALT/ L*g hígado. Determinación de la actividad de lactatodeshidrogenasa (LDH) en el medio de cultivo y en sobrenadante. Se colocó en una celda espectrofotométrica semimicro 500 µL del reactivo, que contiene: lactato 50 mM y NAD 7 mM en buffer de pH 8,9. Se incubó por 1.5 minutos a 60 °C, para alcanzar en este tiempo una temperatura de 30 °C en la solución. Luego se adicionó 12.5 µL de agua destilada y 12.5 µL de la muestra. Se mezcló suavemente por inversión y pasados 30, 60 y 90 segundos se leyó la absorbancia a 340 nm obteniendo los siguientes valores: A1 (30 segundos), A2 (60 segundos) y A3 (90 segundos). La actividad de LDH se calculó utilizando la siguiente ecuación: LDH (UI/L) = [(∆ A x 0.525 mL x 1000) / (6.22 x 0.0125 mL)] x 2

sustancia hepatotoxica se utiliza ANOVA de un factor con un 95% de confianza; la reproducibilidad de cada factor es determinada por medio del cálculo del coeficiente de variación (CV), considerando que en trabajos bioanalíticos la precisión y exactitud puede ser establecida usando como mínimo cinco determinaciones por nivel de concentración (excluyendo los controles) y el valor de la media puede tener en un CV de + 20%. De esta forma a todos los resultados obtenidos se realiza el siguiente análisis estadístico: 1. Promedio, desviación estándar y coeficiente de variación. 2. ANOVA de un factor, con α= 0.05. 3. Prueba de Tukey y Dunnett, con α= 0.05. Los puntos 2 y 3 se realizan con ayuda del software estadístico SAS System for Windows V8. Resultados y discusión Resultados Pruebas In Vitro:

Donde 6.22 es la absortividad del NADH a 340nm y ∆ A es la diferencia entre las absorbancias final e inicial (A3-A1). Los resultados obtenidos son expresados como UI de LDH/ L/ g de hígado.

Posterior a la exposición del corte de hígado al agente tóxico In Vitro, se realizó la valoración del sobrenadante y el medio de cultivo, encontrando los siguientes cambios bioquímicos:

Determinación de la viabilidad celular In Vitro del corte de tejido utilizando MTT.

Disminución dosis dependiente en el contenido de albúmina, observándose mayor perdida a medida que se incrementa la dosis del agente tóxico acetaminofén (Figura 1).

Se incubaron 25 cortes de tejido, con un peso promedio de 50 mg ± 6 mg de acuerdo al diseño experimental explicado en la Tabla 2.

Los cortes obtenidos para la realización de la prueba de viabilidad celular de la metodología In Vivo fueron manejados de igual forma que los cortes en el diseño in vitro. Se realizo la lectura de absorbancia de la solución resultante a 550 nm, expresando los datos como A/peso de tejido. El resultado final es el porcentaje de diferencia con respecto al valor de viabilidad del tejido control, en el cual A/peso de tejido se asume como 100%. Tabla 1. Diseño experimental método 2.

ALB (g/dL/g Hígado)

Determinación de la viabilidad celular In Vivo del corte de tejido utilizando MTT.

SÍNTESIS ALBUMINA 5 4 3 2 1 0 0

100

200

300

400

500

DOSIS APAP (mM) Día 1

Día 2

Figura 1: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la síntesis de ALB en cortes de hígado de rata; en 2 días diferentes. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

Ligero aumento seguido de una caída marcada en la actividad de LDH, con la menor y las dos mayores dosis de acetaminofén, respectivamente (Figura 2).

LDH (UI/L/g Hígado)

ACTIVIDAD LDH 100000 87500 75000 62500 50000 37500 25000 12500 0 0

100

200

300

400

500

DOSIS APAP (mM) Día 1

Día 2

Figura 2: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de LDH en cortes de hígado de rata; en 2 días diferentes. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

* Las concentraciones de agentes hepatotoxicos están expresadas en milimoles/litro de medio de cultivo Williams E suplementado con: bicarbonato de sodio, suero fetal bovino, l- glutamina, fosfatos y gentamicina (usando como guía la referencia [Renwick et al. 2000]).

Disminución dosis dependiente en la actividad de ALT, observándose mayor perdida a medida que se incrementa la dosis de agente tóxico (Figura 3), y aumento en la actividad de AST (Figura 4). Aumento en la actividad de FA, de manera dosis dependiente, a medida que crece la dosis de agente tóxico (Figura 5). Pérdida de la viabilidad celular con el aumento de la dosis de acetaminofén (Figura 6).

Modelo Estadístico Aplicado En este trabajo al manejar cinco tratamientos diferentes para la 156

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Evaluación de la actividad hepatotóxica del acetaminofén in vivo en rata e in vitro en cortes de hígado de rata, en búsqueda de la correlación entre…

Similares resultados han sido expresados por trabajos publicados sobre el uso de modelos de evaluación similares, en los cuales se manifiesta adecuada correlación de estos con el modelo in vivo. [Zhang et al, 2016; Elferink et al, 2008; Rastogi, 2007; Moronvalle-Halley et al, 2005]

ALT (UI/L/g Hígado)

ACTIVIDAD ALT 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 0

100

200

300

DOSIS APAP (mM) Día 1

400

500

Día 2

Figura 3: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de ALT en cortes de hígado de rata; Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

aductos no funcionales con aquellas enzimas por las que tiene gran afinidad y que se encuentran activas dentro de las rutas metabólicas celulares. Esta hipótesis se ha confirmado para algunas enzimas de la familia de las dehidrogenasas, como la glutamato y aldehído dehidrogenasas [Iyanda y Adeniyi, 2011; Moronvalle-Halley et al, 2005].

AST (UI/L/g Hígado)

ACTIVIDAD AST 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 0

100

200

300

400

500

DOSIS APAP (mM) Día 1

Día 2

Figura 4 Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de AST en cortes de hígado de rata;Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

FOSFATASA ALCALINA

FA (UI/L/g Hïgado)

1200 1000 800 600 400 200 0 0

Estos efectos histológicos hallados concuerdan con la caída en la actividad de los marcadores citosólicos (LDH, ALT y ALB), consecuencia del daño directo que el metabolito tóxico “NAPQI” causa a macromoléculas fundamentales para la célula, como aquellas de carácter proteico, inhibiendo su síntesis en el retículo endoplásmico o formando

DOSIS APAP (mM)

Por otra parte, el aumento en la actividad de AST (Figura 4) y la ausencia de alta necrosis del parénquima hepático, demuestran que el metabolito tóxico no ha producido una lesión mitocondrial, caso en el cual se aceleraría el daño necrogénico Es por esta razón que la enzima AST, es sobre expresada como respuesta celular de la agresión a la cual se somete el hepatocito; sin embargo, éste incremento en la actividad enzimática no es dosis dependiente, puesto que, no es proporcional al grado de deterioro celular [Iyanda y Adeniyi, 2011]. El aumento dosis dependiente de la actividad de fosfatasa alcalina, marcador mixto de daño necrótico y colestásico, refleja la alta sensibilidad de esta enzima al daño hepatocelular; puesto que, a pesar de no reflejarse una lesión severa en la evaluación histológica su actividad se encuentra aumentada tres, seis y nueve veces, por encima del valor correspondiente al tejido normal, de dosis menor a mayor respectivamente. Estos resultados permiten inferir que el metabolito NAPQI no afecta la actividad de este marcador.

Figura 5: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de FA en cortes de hígado de rata; cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

Figura 7: Alteraciones histológicas de hígado de rata con APAP (446,4 mM). Hepatocitos con cambios iniciales de apoptosis y necrosis (flecha negra) alrededor de la vena central (VC), leve dilatación sinusoidal (*) y vacuolas grasas (flecha clara). Tinción de hematoxilina-eosina. Aumento 400x. Figura 6: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la viabilidad celular en cortes de hígado de rata; Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

Hallazgos In Vitro y Relación entre Histología y Bioquímica El tejido control presentó una leve dilatación sinusoidal y moderado cambio graso generalizado. El hígado posee una función clave en el metabolismo graso y mantiene un contenido graso uniforme entre el 3 y 8 por ciento (++). En los cortes de tejido expuestos a las dosis de 16,5 - 49,6 y 148,8 mM, se observó leves cambios de: dilatación sinusoidal, cambio graso (vacuolas grasas intracelulares pequeñas), activación generalizada de células de kupffer e infiltración inflamatoria mixta en áreas portales. Los tejidos con la mayor dosis de acetaminofén (446,4 mM) presentan leve dilatación sinusoidal, vacuolas grasas pequeñas y grandes, en la mayoría de hepatocitos. En el área centrolobulillar en torno de algunas venas centrales pueden verse pocos hepatocitos que presentan eosinofilia y redondeamiento, cambios iniciales de apoptosis y de necrosis. En algunas áreas se encuentra una ligera infiltración inflamatoria mixta. Ver Figura 8.

Figura 8: bsérvese el tejido control del hígado de ratas Wistar. Los hepatocitos se encuentran ligeramente redondeados con citoplasma eosinifílico granular (flechas). Tinción de hematoxilina – eosina, aumento 400x.

En el ensayo con MTT, la funcionalidad de las células define la viabilidad de las mismas; demostrándose que la capacidad reductora de la mitocondria disminuye al aumentar la dosis de acetaminofén. En éste caso específico la obtención del formazán a partir del MTT decrece con el aumento en la dosis de agente tóxico. La histología de los tejidos control muestra una moderada congestión en las áreas portales. En general todas las células presentan citoplasma eosinofílico granular, son ligeramente redondeadas y de tamaño uniforme. Este cambio puede corresponder a acumulo de glicógeno intracelular. (Ver Figura 8).

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El acetaminofén produjo lesiones en los hepatocitos que aumentan a medida que se incrementa la dosis. Se observa necrosis y apoptosis en el área centrilobular del tejido, asociado a una respuesta inflamatoria en forma leve y severa según la dosis empleada. En la Figura 9, se observa una leve migración de leucocitos y macrófagos, células del sistema inmune, que se presentan como respuesta a la necrosis de hepatocitos, mientras que en la Figura 10, se muestra una reacción inflamatoria severa.

siguientes alteraciones de los marcadores evaluados de los animales tratados con acetaminofén en comparación con los niveles encontrados en los animales control:

La lesión en la membrana celular puede ser la responsable de la degeneración hidrópica observada en la Figura 11, en donde los hepatocitos se encuentran hinchados y con citoplasma translúcido.

A las dosis utilizadas en esta investigación se evidenció el efecto sobre la albúmina señalado en el artículo de Iyanda de 2011, aunque en él la exposición se hizo con dosis sustancialmente mayores de acetaminofén (1000,3000 y 5000 mg/kg).

A pesar de no ser muchos los trabajos que reflejan la utilidad de los cortes de hígado como modelo predictivo del metabolismo in vivo y como modelo de evaluación de toxicidad, un trabajo que utilizó acetaminofén como agente hepatotóxico [Miller et al, 1993] y que al igual que el nuestro permitió evaluar la toxicidad de este, aportando documentación completa. En el se incubó acetaminofén con cortes de hígado, evaluando la formación de metabolitos de acetaminofén, niveles de glutatión e histopatología a partir de los cortes El acetaminofén bajo dosis de 0,5, 1 y 2 mM no produjo agotamiento del glutatión en los cortes de hígado de rata; encontrándose además reducida formación del metabolito NAPQI. Para determinar si la lesión centrilobular característica inducida por acetaminofén in vivo, podría ser reproducida in vitro, la histopatología del hígado se evaluó 6 y 12 horas después del tratamiento con acetaminofén (2 mM) por 2 horas. Sin embargo no se observó daño centrilobular del hígado; pero de acuerdo con la formación de metabolitos y la histopatología de los cortes, se estableció que estos sirven como excelentes predictores de la hepatotoxicidad del acetaminofén in vivo [Miller et al, 1993].

Figura 9: Alteraciones histológicas de hígado de rata tratada con 200 mg/kg de APAP. Obsérvese leve infiltración de células inflamatorias (flecha negra) y fagocitosis de células necróticas (flecha clara). Tinción hematoxilina- eosina, aumento 400x.

Figura 10: Alteraciones histológicas de hígado de rata tratada con 600 mg/kg de APAP. Obsérvese severa infiltración de células inflamatorias (flecha negra) y fagocitosis de células necróticas (flecha clara). Tinción hematoxilina- eosina, aumento 200x.

1. Leve disminución en el contenido de albúmina en el tejido, para los animales con dosis de 400 y 600 mg/kg (Figura 12); el nivel sérico de ésta proteína no mostró un cambio estadísticamente significativo, entre los tratamientos y el control (Figura 13).

2. Pico de leve elevación en la actividad de LDH, en tejido, con dosis de 400 mg/kg (Figura 14); el nivel sérico de ésta enzima, muestra una actividad constante de este marcador (Figura 15).

Figura 12: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la síntesis de ALB en ratas Wistar; determinación en tejido. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5)

Figura 13: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la síntesis de ALB en ratas Wistar; determinación en suero. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

Figura 14: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de LDH en ratas Wistar; determinación en tejido. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

Figura 11: Alteraciones histológicas de hígado de rata tratada con 400 mg/kg de APAP. Obsérvese severo cambio hidropico en el área midzonal (flechas). Tinción hematoxilina- eosina, aumento 400x.

Hallazgos In Vivo Histológicos y Bioquímicos Por otra parte la valoración bioquímica In Vivo, determinó las 158

Figura 15: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de LDH en ratas Wistar; determinación en suero. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

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Evaluación de la actividad hepatotóxica del acetaminofén in vivo en rata e in vitro en cortes de hígado de rata, en búsqueda de la correlación entre…

Tal como se observa en las figuras de resultados, los niveles de Albúmina y actividad de LDH no presentan cambios significativos, lo cual demuestra que bajo estas condiciones experimentales no hay formación de aductos no funcionales. Para dosis bajas de acetaminofén, la mayoría del NAPQI se ha detoxificado por distintas rutas (sulfatación, glucoronidación y conjugación con glutatión), quedando libre solo bajas concentraciones que al durar un largo periodo de tiempo en el citosol, penetran las membranas mitocondriales y causan una leve necrosis. Con altas dosis de acetaminofén, la conservación de los niveles normales ó los ligeros cambios observados en los marcadores evaluados, puede indicar la regeneración del tejido, por mecanismos de defensa como lo es la recuperación de concentraciones del sistema antioxidante mediado por el glutatión, el cual detoxifica al organismo del metabolito NAPQI y protege de la respuesta inflamatoria, alrededor de la vena central, en donde los macrófagos fagocitan las células necrosadas.

Figura 18: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de FA en ratas Wistar; determinación en tejido. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

3. Leve disminución de la actividad de ALT en el tejido, para las dosis de 200, 400 y 600 mg/kg (Figura 16); se da aumento en la actividad sérica de esta enzima para la dosis de 600 mg/kg (Figura 17). ACTIVIDAD TRANSAMINASAS (UI/L/g Hígado)

3000 2500

Figura 19: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de FA en ratas Wistar; determinación en suero. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

2000 1500 1000

en la evaluación enzimática y en la determinación de la viabilidad celular, en donde no se da una diferencia significativa entre los animales tratados con el agente tóxico y los animales control.

500 0 0

200

400

600

800

DOSIS APAP (mg/Kg) ALT

AST

Figura 16: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de ALT y AST en ratas Wistar; determinación en tejido. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

ACTIVIDAD TRANSAMINASAS (UI/L Suero)

3000 2000 1000 0 0

200

400

600

800

DOSIS APAP (mg/Kg) ALT

AST

Figura 17: Efecto de dosis crecientes de acetaminofén sobre la actividad de ALT y AST en ratas Wistar; determinación en suero. Cada barra de error representa la media ± CV (n = 5).

4. Niveles en la actividad de AST constantes, en el tejido (Figura 16); en suero se da aumento en la actividad con las dosis de 200 y 400 mg/kg, seguido de una ligera caída con la dosis de 600 mg/kg (Figura 17). 5. Disminución en la actividad de FA, en el tejido (Figura 18); con tendencia al incremento de su actividad en suero, pero sólo se encuentra diferencia significativa de la dosis 600 mg/kg frente al control (Figura 19). La ligera elevación en la actividad sérica de ALT, AST y FA (Figuras 16, 17 y 18), constituyen un pobre indicio del daño en la integridad estructural del hepatocito, caso en el cual, se origina la liberación de estas enzimas a la circulación y la leve caída en las actividades enzimáticas en el tejido. El daño necrogénico es producto de las altas dosis de acetaminofen suministradas (400 y 600mg/Kg), durante un periodo de exposición prolongado; siendo éste más evidente en el estudio histológico que

De los anteriores marcadores en la referencia [Eakins et al, 2015] se reporta los resultados obtenidos en ratas tratadas vía P.O. con dosis muy elevadas de APAP, como 500, 1000 ó 1500 mg/kg que se cita permiten evidenciar lo acontecido en humanos a dosis de esta magnitud. Con dosis de 1.500 mg/kg, pasadas 48 h, las ratas mostraron aumentos en enzimas hepáticas circulantes con pico de ALT en suero 36 veces superior y de AST 33 veces superior que en los animales control, confirmando lo observado en nuestro trabajo con el aumento de las dosis de este agente, aunque las concentraciones nunca llegaron a ser tan elevadas. Se evidenció también lesión histopatológica hepatocelular como en nuestro trabajo. A pesar de lo anterior, el grado de degeneración del tejido hepático fue bajo de acuerdo con la histopatología. Igualmente se encontró un elevado cambio en la abundancia de diversas proteínas, después de 48, 72 y 96 horas del tratamiento. Además, de acuerdo con la referencia [Iyanda y Adeniyi, 2011], un estudio que revela que ratas tratadas con acetaminofén, donde se mostró reducción significativa de proteína total y albúmina a 3000 mg/kg y 5000 mg/kg después de 4 y 16 horas del tratamiento, condiciones estas mucho más extremas a las utilizadas en nuestro trabajo. Se observó aumentos significativos de las actividades de enzimas hepáticas en comparación con los controles, especialmente a niveles tóxicos de exposición de 1000, 3000 y 5000 mg/kg; pero también a niveles subtóxicos, se observó similar situación a las 16 horas, mostrando diferencia no significativa cuando se comparan animales de los niveles de tratamiento con los animales control, excepto para la dosis de 1000 mg/kg. Igualmente no hubo diferencia significativa entre las actividades séricas de las enzimas hepáticas (ALT Y AST) por el tratamiento frente a los controles.

Conclusiones Se verificó la hepatotoxicidad del acetaminofén, por medio de la medición de niveles enzimáticos y análisis histopatológico, usando el modelo de cortes de hígado y el modelo In Vivo. Los cambios morfológicos del daño celular encontrados en clos resultados del

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método In Vivo, pueden ser reproducidos en la metodología In Vitro, encontrándose correlación histológica entre los dos modelos y verificando así los efectos necrosantes, apoptóticos, esteatósicos y colestásicos producidos por el acetaminofen.

11. Miller M.G., Beyer J., Hall G.L., Degraffenried L.A., Adams P.E. Predictive Value of Liver Slices for Metabolism and Toxicity in Vivo: Use of Acetaminophen as a Model Hepatotoxicant. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1993;.122 (Issue 1), 108–16.

De acuerdo con lo hallado podemos decir que el modelo de evaluación estandarizado permite una adecuada predicción de la toxicidad multi-celular hepática de agentes bioactivos como el acetaminofén.

12. Moronvalle-Halley V., Sacré-Salem1 B., Sallez V., Labbe G., Gautier J.C. (2005) Evaluation of cultured, precision-cut rat liver slices as a model to study drug-induced liver apoptosis. Toxicology. 2005; 207 (Suppl 2), 203–14.

Agradecimientos

13. Mrad A., Cardozo C.A. Boletín de divulgación de actividades relacionadas con Animales de laboratorio, Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia, Anilab, N° 1 y 2. Bogotá, Colombia, 1998.

Se agradece la participación en el desarrollo de la investigación a las estudiantes de la carrera de Química Farmacéutica Jenny Lucero Quintero y Leidy Yenit Rodríguez. Nuestros más sinceros agradecimientos al Laboratorio de Histiopatologia de la Facultad de Veterinaria de la U.N., al Departamento de Farmacia de la U.N. y al División de Investigación de la Sede de Bogotá (DIB) de la U.N. por el financiamiento de este proyecto.

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Actas de las Jornadas de Formación en Toxicología 2017

ACTAS DE LAS V JORNADAS DE FORMACIÓN EN TOXICOLOGÍA, VALENCIA 2017 Comité Científico: Dra. Mónica Fernández-Franzón. Dra. Guillermina Font, Dra. María José Ruiz, Dra. Houda Berrada, Dra. Emilia Ferrer, Dra. Ana Juan-García, Dra. Cristina Juan y Dr. Giuseppe Meca. Comité Organizador: Dra. Lara Manyes, Josefa Tolosa, Laura Escrivá, Federica Saladino, Juan Manuel Quiles, Noelia Pallarés, Jorge Calpe Ruano, Carlos Luz Mínguez y Dionisia Carballo Organizadas por la Asociación Española de Toxicología (AETOX) el 31 de enero de 2017 en el Salón de Grados de la Facultat de Farmàcia. Universitat de València. Colocación de carteles en el Hall de la Facultat de Farmàcia

CONFERENCIA EXPERIMENTACIÓN IN VIVO EN SEGURIDAD ALIMENTARIA Dra. Rosario Moyano Salvago Catedrática de Toxicología. Departamento de Farmacología, Toxicología y, Medicina legal y Forense. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba La sociedad exigen nuevos avances en la investigación biomédica (cáncer, enfermedades cardiovasculares,..) que se recogen como líneas prioritarias para ser financiadas por los distintos organismos. En todas ellas se hace necesario el uso de animales de experimentación. Pero además, la administración y la opinión pública requieren la máxima seguridad en los productos de consumo (alimentos, fármacos,…). Por ello, se hace necesario la evaluación de las sustancias y preparados químicos para garantizar la protección de la salud humana y del medio ambiente (REACH, 2006); la evaluación, autorización, registro y control de los medicamentos de uso humano y veterinario; y asegurar que los productos alimentarios sean seguros evaluando los riesgos para proteger la salud de la población. Pues bien, todos estos procesos conllevan estudios in vivo. En Seguridad alimentaria, al igual que otras ramas de la toxicología se requiere tres tipos de procedimientos experimentales con animales: en la investigación toxicológica no regulada (básica y aplicada); en la investigación toxicológica regulada o reglamentada; y en la docencia. En el esquema de la evaluación de riesgo en seguridad alimentaria son necesarios ensayos in vivo para el cálculo de la exposición y caracterización del riesgo en la cadena alimentaria. En investigación básica y aplicada, para dar una respuesta fiable y reproducible se requiere de la elección de un buen modelo y un buen diseño experimental. En toxicología experimental con fines reguladores, existen normativas muy rígidas que deben ser seguidas, que exigen la evaluación de sustancias con diferentes requerimientos según su uso previsto, aplicando protocolos de ensayo estandarizados (OCDE,..). Así las autoridades en materia de seguridad alimentaria (Efsa, Aecosan) establecen para la autorización de nuevos alimentos una directrices de estudios y datos relativos a la inocuidad (ensayos de toxicidad de 28 días en roedores, toxicidad subcrónica de 90 días,..). En todos los casos debe hacerse cumpliendo las normativas de protección de los animales de experimentación y todos los procedimientos con animales deben ser autorizados por la autoridad competente (Directiva 2010/63/UE; R.D. 53/2013). Antes de llevar a cabo un procedimiento experimental con animales es necesario establecer un equilibrio ético entre el grado de sufrimiento de los animales y el beneficio científico. Para ello se dispone de una estrategia basada en: la legislación específica, la existencia de comités éticos y el principio de la 3Rs (reemplazo (métodos alternativos), refinamiento y reducción).

COMUNICACIONES ORALES Moderadoras: Dra. Emilia Ferrer García y Dra. Houda Berrada Ramdani O1) EVALUACIÓN DEL RIESGO DE EXPOSICIÓN A DIOXINAS A TRAVÉS DE LA DIETA EN LA COMUNIDAD VALENCIANA Quijano, L 1., Font, G 1., Yusà, V 2., Pardo, O 2. 1 Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina Legal, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia. 2 Área de Seguridad Alimentaria, Centro Superior de Investigación en Salud Pública. Valencia.

Las dioxinas, furanos y bifenilos policlorados (PCBs) similares a las dioxinas (DL-PCBs) son compuestos orgánicos persistentes que se generan al medio ambiente. Son muy solubles en grasas, transmitiéndose al ser humano a través del consumo de altas concentraciones de alimentos de origen animal. El objetivo de este estudio es evaluar la exposición a dioxinas, furanos y DL- PCBs en la población de la Comunidad Valenciana a través de la dieta a partir de las concentraciones calculadas de dioxinas (Laboratorio Salud Pública de Valencia) y los datos de Estudio de Dieta total, así como comparar los resultados obtenidos con la Ingesta Semanal Tolerable (IST) (14 pg TEQ/kg peso corporal) (Scientific Committee on Food (SCF), 2001). Los pescados, leche y lácteos y aceites y grasas, presentaron las concentraciones medias de dioxinas más altas (0.81, 0.37, 0.34) pg WHO- BEQ/gr. Los pescados y productos de la pesca son los alimentos que más contribuyen a la exposición de dioxinas en la población adulta, y la leche y productos lácteos en niños. La Ingesta Diaria Estimada se calculó a partir del Estudio de Dieta Total realizado en la Comunidad Valenciana durante el año 2010-2011. Bajo el enfoque probabilístico y en el escenario pesimista, la Ingesta media Diaria Estimada de dioxinas a través de la dieta fue de 1.58 pg WHO-BEQ/kg p. c. día y 2.76 pg WHO-BEQ /kg p. c. día., para adultos y niños, respectivamente. La caracterización del riesgo en el escenario pesimista pone de manifiesto que hasta un 22.4% de población en adultos y 58.5% en niños podría estar en riesgo derivado de la ingesta de dioxinas a través de la dieta. Serían aconsejables recomendaciones dietéticas a estos grupos de población. Palabras clave: dioxinas, furanos, (DL-PCBs), Estudio de Dieta Total, evaluación de la exposición. Referencias: Scientific Committee on Food (SCF), 2001. Opinion of the SCF on the risk assessment of dioxins and dioxin-like PCBs in food. Update based on new scientific information available since the adoption of the SCF opinion of 22nd November 2000. O2) ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE PRODUCIDOS POR BACTERIAS LÁCTICAS

PÉPTIDOS

Luz, C., Quiles, J.M., Fernández-Franzón, M., Mañes, J., Meca, G. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

Las bacterias ácido lácticas (BAL) se utilizan comúnmente en una gran variedad de procesos de fermentación en la industria alimentaria. Además, éstas pueden presentar actividad antimicrobiana, lo que representa un potencial en el campo de la bioconservación. El deterioro de los alimentos causado por hongos micotoxigénicos es uno de los retos en seguridad alimentaria. En este contexto, algunas cepas de BAL son capaces de producir péptidos antifúngicos a partir de las proteínas durante los procesos de fermentación. En este estudio, una cepa de BAL Lactobacillus plantarum obtenida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), fue cultivada en medio líquido MRS Broth durante 48h a 37ºC en condiciones anaerobias. A continuación, se purificaron los medios fermentados mediante cromatografía de exclusión molecular con el objetivo de purificar péptidos de bajo peso molecular y aislarlos mediante LC en fase reversa semipreparativa. Se realizó un estudio de actividad antifúngica en medio líquido frente a Penicillium expansum y Aspergillus

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Actas de las Jornadas de Formación en Toxicología 2017

parasiticus de los compuestos aislados, empleando el método de difusión en agar. La identificación de los compuestos fue mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Tras la purificación, aislamiento e identificación se han obtenido tres compuestos de naturaleza peptídica. Los resultados de los estudios de actividad antifúngica en medio líquido evidencian que el péptido SGADTTFLTK produce una inhibición del crecimiento de los dos hongos micotoxigénicos entorno al 55%. En cambio, los péptidos LVGKKVQTF y GTLIGQDYK no presentaron actividad antifúngica observable. Palabras clave: Bacterias ácido lácticas, actividad antifúngica, péptidos antimicrobianos, bioconservación. O3) BIODEGRADACIÓN DE LA OCRATOXINA MEDIANTE BACTERIAS ACIDO LÁCTICAS

Ferrer, J1., Luz, C1., Saladino, F1., Schoch, A2., Luciano, FB2., Mañes, J1., Meca, G1. 1 Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España. 2 Departamento de ciência animal, Escola de Ciências da Vida, Pontificia Universidade Católica do Paraná. RuaImaculadaConceição 1155, 80901215 Curitiba, Paraná, Brasil. La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina generada en el metabolismo de hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium. Está clasificada por la International Agency for Research on Cancer (IARC) como posible carcinógeno para los humanos (grupo 2B) y se han demostrado sus propiedades nefrotóxicas y hepatotóxicas, entre otras. La exposición humana a la OTA ocurre principalmente por la vía de la ingestión en la dieta, puesto que es un contaminante frecuente en diversos alimentos como granos de cereales y de café, uvas, etc. De igual forma, supone un riesgo para la salud pública la intoxicación que pueden sufrir los animales en la ganadería, por estar expuestos a productos agrícolas y piensos contaminados con estos hongos. En el presente estudio se evaluó la capacidad de diferentes cultivos de bacterias ácido lácticas (BAL) para degradar la OTA presente en medio de cultivo de ManRogosa Sharpe (MRS) característico para el crecimiento de las BAL. Para ello, se utilizaron 17 cepas de distintas bacterias, la mayoría de las cuales proporcionadas por la CECT y que fueron cultivadas en caldo MRS, tanto a pH 3.5 como a 6.5, contaminado con un 1 mg/L de OTA. Los experimentos se realizaron a la temperatura de 37°C durante 48h. Posteriormente los medios de cultivo se centrifugaron y se cuantificó la OTA remanente, tanto en el sobrenadante como en las células residuales. Los resultados obtenidos demostraron que la cantidad de OTA en el medio sufrió una reducción total de hasta el 98% a pH 6.5 y 95% a pH 3.5. La mayor parte de esta reducción ocurre por hidrólisis de la molécula de OTA, mientras que el mecanismo de adsorción a las células bacterianas presenta poca influencia. Palabras clave: micotoxinas, biodegradación, ocratoxina A, bacterias lácticas.

O4) ANÁLISIS MULTI-MICOTOXINA MEDIANTE UHPLC- ORBITRAP

PASTA

Tolosa, J1,2., Graziani, G2., Gaspari, A2., Chianese ,D2., Ferrer, E1., Mañes, J1., Ritieni, A2. 1 Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España. 2 Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Nápoles “Federico II”. Via Domenico Montesano 49, 80131 Napoli, Italia.

El empleo de métodos multirresiduo para la detección de contaminantes en alimentos está siendo ampliamente utilizado en los últimos años debido a las múltiples ventajas que presenta. El desarrollo de métodos multi-micotoxina empleando una única extracción y un único análisis por muestra son el principal reto de la optimización de este tipo de análisis. Por lo que respecta la extracción, en los últimos años el método QuEChERS ha mostrado buenos resultados en diferentes matrices alimentarias (RodríguezCarrasco et al., 2012). El objetivo del presente estudio es la identificación y cuantificación de un total de 17 micotoxinas en muestras de pasta mediante el empleo de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un espectrómetro de masas Orbitrap. Las micotoxinas objeto de estudio son las más comúnmente descritas en 162

cereales: ocratoxina-A (OTA), aflatoxina B1 (AFB1), zearalenona (ZEA), deoxinivalenol (DON), 3-y 15-acetil-deoxinivalenol (3AcDON y 15-AcDON), nivalenol (NIV), neosolaniol (NEO), fusarenon-X, (FUS-X), toxina T-2 (T-2) y toxina HT-2 (HT-2), fumonisina B1 y B2 (FB1 y FB2) y algunas micotoxinas emergentes de Fusarium: tres eniatinas (ENA, ENA1, ENB), y beauvericina (BEA). Veintinueve muestras de pasta (de trigo) y dos muestras de alimentos infantiles fueron adquiridas en diferentes supermercados de la ciudad de Nápoles. Los resultados muestran que el DON, NIV, y la toxina HT-2 son las que mostraron una mayor incidencia. Este es el primer estudio llevado en cabo en muestras de pasta mediante el empleo de espectrometría de masas Orbitrap. Palabras clave: micotoxinas; pasta; cromatografía líquida; orbitrap. Agradecimientos: Trabajo financiado por el Ministerio de Economía y competitividad AGL 2013/43194/P y por la Universitat de València (OTR2013-11518INVES/CPI-16- 143/APOTIP 2016-A-040). O5) EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS A BASE DE CEREALES POR CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC-MS/MS) Carballo, D., Berrada, H., Ferrer, E., Font, G. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

Las micotoxinas son compuestos tóxicos de cereales, entre sus efectos se incluyen principalmente la carcinogenicidad y neurotoxicidad. Algunas micotoxinas son estables a tratamientos térmicos de los alimentos, mientras que otras no (Nijs et al 2015; Sirot et al 2013). Por lo cual es interesante evaluar los contenidos de micotoxinas en los alimentos listos para consumo. El presente estudio tiene como objeto la determinación de diferentes micotoxinas (DON, 3AcDON, 15 AcDON, NIV, NEO, DAS, FUS-X, T-2, HT-2, ZON, αZAL, βZAL, αZOL, βZOL) en alimentos a base de cereales procesados listos para su consumo. Se analizan 28 muestras de los siguientes alimentos procesados: pastas, canelones, hojaldre, quiche, croquetas, empanadas y arroz. Para ello se evalúan dos métodos de extracción, QuEChERS y extracción Sólido – Líquido. las recuperaciones óptimas (63 – 98%) se alcanzan para el método QuEChERS debido a la adición de sales. La determinación de micotoxinas se realiza por cromatografía de gases (CG) acoplada a espectrometría de masas en tándem (GCMS/MS). Los resultados obtenidos muestran la presencia de DON en muestras de arroz y empanada a concentraciones que oscilan desde 2,61 a 21,59 μg/kg y de HT-2 en muestras de empanada y pastas a concentraciones desde 3,70 a 57,39 μg/kg. La incidencia de DON en muestras es de 64% y HT-2 36%. DON y HT- 2 se encuentran en la misma muestra en un 29% resaltando que estas muestras tienen como componente principal la harina de trigo. No se ha encontrado la presencia simultánea de DON y HT-2 en una misma muestra de arroz. Palabras claves: DON, HT-2, Cereales, Micotoxinas, GC-MS/MS. Agradecimientos: Ministerio de Economía y Competitividad AGL2013-43194-P y al Programa Nacional de Becas de Postgrado en el Exterior Don Carlos Antonio López – República del Paraguay. Referencias: De Nijs, M., van den Top, H., de Stoppelaar, J., Lopez, P., & Mol, H. (2016). Fate of enniatins and deoxynivalenol during pasta cooking. Food Chemistry, 213, 763-767. Sirot, V., Fremy, J., & Leblanc, J. (2013). Dietary exposure to mycotoxins and health risk assessment in the second french total diet study. Food and Chemical Toxicology, 52, 1-11. O6) EFECTO GENOTÓXICO INDUCIDO POR BEAUVERICINA Y ENIATINA B EN LINFOCITOS T HUMANOS IN VITRO Fassi, C., Escrivá, L., Font, G., Manyes, L. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

Beauvericina (BEA) y eniatina B (EN B) son dos micotoxinas

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producidas por hongos del género Fusarium que invaden y crecen en diferentes tipos de cultivos. Se encuentran mayoritariamente en cereales y derivados. A causa de la falta de datos científicos relacionados con su toxicidad, especialmente in vivo, EFSA hizo un llamamiento en 2015 para promocionar su investigación. El objetivo es ahondar en los efectos tóxicos producidos por ambas micotoxinas en células del sistema inmune. Para ello, se han escogido una técnica experimental para determinar viabilidad celular, MTT, y otra para genotoxicidad, COMET. Las dosis utilizadas de ambas micotoxinas para MTT han sido 1,5 – 3 – 5 – 10 – 15 μM. En cambio para COMET, se escogieron las tres menos concentradas de las descritas para MTT. Las células tratadas con BEA mostraron un IC50 a las 24h de 7,5 μM, sin embargo, EN B no inhibió el crecimiento celular por debajo del 60% a ninguna concentración. Los resultados obtenidos en el ensayo COMET muestran efectos genotóxicos de BEA dependientes de la concentración, es decir, el daño al ADN efectuado por BEA en célulasJurkat aumenta según se incrementa su concentración en el medio a 24h de exposición. Este resultado concuerda con el resultado de la viabilidad celular a los mismos tiempos y concentraciones, que se ve comprometida en un % similar al % de células con daño en el ADN. Palabras clave: Beauvericina, eniatina B, Jurkat, comet, genotoxicidad. COMUNICACIONES TIPO CARTEL C1) OCURRENCIA DE AFLATOXINA M1 EN LECHES INFANTILES Y ESTIMACIÓN DE LA EXPOSICIÓN EN NIÑOS DE 1 A 3 AÑOS Rodríguez-Carrasco, Y., Font, G., Berrada, H. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

La exposición a las micotoxinas, metabolitos secundarios tóxicos producidos por hongos filamentosos, ocurre principalmente mediante el consumo de alimentos contaminados. Las aflatoxinas son micotoxinas a las que se les ha conferido efectos cancerígenos, teratogénicos, mutagénicos, hepatotóxicos e inmunosupresivos. La aflatoxina M1 (AFM1) puede encontrarse en la leche de los mamíferos y humanos como resultado del metabolismo de aflatoxina B1. En el presente trabajo se analizaron 40 muestras de leches infantiles. El análisis deAFM1 se realizó en HPLC en fase reversa con detector de fluorescencia tras un proceso de extracción en columnas de inmunoafinidad (IAC). De las muestras analizadas, cinco resultaron positivas para AFM1 (12,5%). La concentración media de AFM1 encontrada en las muestras positivas fue de 0,045 μg/kg ± 0,021; superior al límite máximo permitido para este tipo de matriz (0,025 μg/kg) establecido en el Reglamento (EC) No 1881/2006. La ingesta de AFM1 mediante el consumo de esta matriz alimentaria se calculó para niños entre 1 y 3 años (intervalo de peso corporal 10 – 15kg). Asumiendo un consumo de 200 mL/día, la ingesta de AFM1en niños correspondería a 9 ng/día (0,6 – 0,9 ng/kg p.c y día). Debido a la elevada toxicidad de las aflatoxinas no se ha establecido de forma oficial una ingesta diaria tolerable (TDI) para estos compuestos. No obstante algunos autores han atribuido una TDI para AFM1de 2 ng/kg p.c y día. Con los datos obtenidos en este estudio se pone de manifesto una exposición a AFM1destacable, aunque dentro de los niveles de seguridad, equivalente al 30-45% de la TDI atribuida. Palabras clave: Aflatoxina M1, leche, niños, ocurrencia, exposición. C2) LA “EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD” EN LOS SEMINARIOS DE TOXICOLOGÍA DEL GRADO DE FARMACIA Fernández-Franzón, M., Ferrer, E., Berrada, H., Juan-García, A., Ruiz, M.J., Font, G.

Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

La Toxicología es una asignatura obligatoria de cuarto curso del Grado de Farmacia, que se imparte en la Universitat de València. Esta asignatura consta de 9 créditos ECTS y tiene carácter anual. Uno de los bloques que se imparte en la asignatura es la Evaluación de la Toxicidad en el que se aborda estudios de toxicidad in vivo e in vitro. Esta asignatura tiene seis sesiones de seminarios, en dos sesiones de seminarios se profundiza sobre el bloque de evaluación de la toxicidad, ya que es una de las partes de la asignatura teórica que más dificultad plantea a los alumnos. Antes de la primera sesión se agrupan los alumnos en grupos de cuatro y se les asigna un ensayo toxicológico. A cada grupo se les facilita un artículo científico sobre dicho ensayo junto a los protocolos de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD). Los artículos pueden estar en ingles o en castellano, estos últimos principalmente son de la Revista de Toxicología. La primera sesión de seminarios es de trabajo en grupo, los estudiantes se agrupan para preparar las exposiciones sobre el ensayo asignado. Se les proporciona una serie de preguntas para que respondan y les sirva de guión para la exposición. El profesor en esta sesión hace un seguimiento del trabajo de los distintos grupos y resuelve las dudas que puedan surgir. En la siguiente sesión cada grupo explica a sus compañeros el ensayo toxicológico sobre el que han trabajado basándose en el protocolo y los resultados del artículo trabajado. Después se realiza un turno de preguntas. El objetivo de estos seminarios es doble: por un lado, el profesor aplica una metodología de enseñanza activa y cooperativa en la que los propios estudiantes explica los contenidos a sus compañeros, de esta manera entre ellos responden las dudas que vayan surgiendo y, por otro lado, se profundiza en los contenidos teóricos del programa estudiando. C3) CITOTOXICIDAD DE DEOXINIVALENOL, TOXINA T-2 Y PATULINA EN CÉLULAS HepG2 Diana, M.N.a, Elmo, L., Pigni, M.C., Ruiz, M.J. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

El deoxinivalenol (DON) y la toxina T-2 (T-2) son micotoxinas del grupo de los tricotecenos producidos por hongos del género Fusarium y se encuentran principalmente en cereales como el trigo, el maíz y la cebada. La patulina (PAT) es una micotoxina producida por hongos de género Penicillium y se encuentra mayoritariamente en manzana, zumo de manzana y derivados. Por tanto, estas micotoxinas, podrían encontrarse en una dieta mediterránea habitual. El objetivo de este trabajo es determinar el efecto citotóxico del DON, la T-2 y la PAT en las células de hepatocarcinoma humano (HepG2). El intervalo de concentraciones ensayadas fue de 0,625 a 15 μM para el DON, de 0,00125 a 0,05 μM para la T-2 y de 0,45 a 7,5 μM para la PAT. El método utilizado es el ensayo del MTT que mide la actividad mitocondrial en células vivas durante 24, 48 y 72 h de exposición. Se determina la concentración que produce el 50% de inibición de viabilidad celular (IC₅₀). Los resultados demuestran valores de IC₅₀ de 9,3 ± 0,1 μM, 2,83 ± 0,53 μM y 2,53 ± 0,21 μM a 24, 48 y 72h para el DON; de 38,52 ± 0,12 nM, 33,69 ± 7,21 nM y 44,37 ± 1,77 nM a 24, 48 y 72h para la T-2; de 2,66 ± 0,66 μM, 1,24 ± 0,33 μM y 1,17 ± 0,21 μM a 24, 48 y 72h para la PAT. En resumen, la toxicidad aumenta con el tiempo de exposición y la T-2 es la más citotóxica para las células HepG2. Agradecimientos: Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2016-77610-R). C4) ADITIVOS EN ALIMENTOS PREPARADOS CONSUMIDOS POR ESTUDIANTES UNIVERSITARIOS Romero Nácher, L., Abiétar Jimenez, G., Saldaña Gil, C., Juan García, C.

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Actas de las Jornadas de Formación en Toxicología 2017 Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

Los hábitos alimentarios de los estudiantes universitarios están condicionados por factores económicos, habilidades culinarias, costumbres y tiempo, por lo que recurren en numerosas ocasiones al consumo de alimentos preparados (zumos, batidos, refrescos, congelados, refrigerados, liofilizados, platos preparadas...). Una de las características de estos productos es que contienen aditivos, que se añaden con una finalidad tecnológica (mejorar su aspecto, textura, resistencia a los microorganismos, etc). Los aditivos que se utilizan en la UE han sido evaluados y autorizados (Reglamento (CE) Nº 1331/2008), demostrando que son seguros a las cantidades utilizadas por la industria alimentaria. Por otro lado, deben figurar en la lista de ingredientes, bien por su nombre o número E, código con el que se autorizan en la UE. Existen 27 clases distintas de aditivos, entre los más utilizados encontramos los colorantes que añaden o restablecen el color de los alimentos, o los conservantes que aumentan la vida útil de los mismos. Con el objetivo de conocer la frecuencia de consumo de alimentos preparados y la exposición a aditivos, se pasó una encuesta de frecuencia de consumo (entre 1 a >4 veces por semana), a 88 estudiantes de la Universitat de València. Se observó que la mayor frecuencia de consumo (>4 veces a la semana) eran bebidas, siendo los refrescos en hombres (E150d, E952, E950, E338 y E331) mientras que los más consumidos en mujeres fueron los zumos. En cuanto a aperitivos, patatas fritas y chocolate fueron los más consumidos por ambos sexos. Respecto a comidas preparadas el producto más consumido es la pizza (E452, E340, E331, E202 y E160b) con un 35%, prefiriéndose aquellos que son refrigerados (47%) a los congelados (19%). Palabras claves: alimentos preparados, aditivos, estudiantes. Reglamento (CE) Nº 1331/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, Diario Oficial de la Unión Europea L354/16-33. C5) ESTUDIO DE MICOTOXINAS EMERGENTES EN LA MATERIA PRIMA DE PLANTAS MEDICINALES MEDIANTE EXTRACCIÓN POR QuEChERS Pallarés, N., Stanziani, A., Font, G., Ferrer, E. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

El término micotoxina designa a compuestos altamente tóxicos resultado del metabolismo secundario de origen fúngico. El género Fusarium es responsable de la producción de las micotoxinas emergentes que contaminan principalmente cereales, pero también otros productos de origen vegetal (Marín et al., 2013). En este sentido, por "planta medicinal" se entiende cualquier planta salvaje o cultivada usada con un fin terapéutico (OMS). Durante el cultivado, la cosecha, el almacenamiento y la distribución, las plantas medicinales pueden estar sujetas a la contaminación por varios hongos productores de micotoxinas provenientes del suelo (Ashiq et al., 2013). Hasta la actualidad, la información acerca de la presencia de las micotoxinas emergentes en plantas medicinales es escasa (Hu & Rychlik, 2014). En este contexto, el objeto del presente trabajo es desarrollar un método de extracción por QuEChERS y determinación por Cromatografía Líquida- Espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la determinación de los contenidos de micotoxinas emergentes en 45 tipos de plantas medicinales. Para ello, fueron adquiridas un total de 90 muestras de distintos herbolarios. Los resultados obtenidos muestran que se han detectado ENB y ENB1, con una incidencia del 12 y 4% respectivamente y con contenidos que oscilan desde <LOQ a 311.24 μg/kg (ENB) y desde 3.6 a 55.7 μg/kg (ENB1). ENA1 y BEA solo fueron detectadas en una muestra. Palabras clave: plantas medicinales; micotoxinas emergentes; QuEChERS; LC-MS/MS. 164

Agradecimientos: este trabajo forma parte de un proyecto de investigación financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad AGL 2013-43194-P y por el programa de formación de personal investigador de carácter pre-doctoral: “Atracció de Talent” de la Universitat de València. C6) REDUCCIÓN DE LA DIGESTIÓN DE GRASA DE PALMA MEDIANTE EL EMPLEO DE GOMA XANTANA RodríguezConstantinescu, L., Salvador, A., Sanz, T., Espert, M. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA-CSIC)

El aceite de palma se extrae de Elais guineensis, planta que produce diez veces más aceite por unidad de superficie que cualquier otro cultivo de semilla oleaginosa. Es empleado ampliamente en la industria alimentaria en la elaboración de productos de pastelería, galletas, chocolates, margarinas, aperitivos, etc., y supone el 30% de la producción total de grasas y aceites. El aceite de palma crudo contiene diversos compuestos beneficiosos para la salud como la vitamina E, carotenoides y fitoesteroles. Sin embargo, la industria alimentaria requiere un aceite de palma incoloro, inodoro, suave y estable, por ello, el refinado es obligatorio en su procesado, perdiendo así la mayoría de componentes beneficiosos. Diversos estudios han demostrado una relación directa entre el consumo excesivo de aceite de palma y la obesidad, procesos inflamatorios, cambios en la microbiota intestinal, enfermedades cardiovasculares e incluso ciertos tipos de cáncer en comparación con una dieta baja en grasas. Puesto que la preocupación por la alimentación saludable del consumidor va en aumento, la industria alimentaria está obligada a desarrollar nuevos estrategias encaminadas a la reducción de grasas saturadas, sin descartar el empleo del aceite de palma a los niveles actuales. La goma xantana, polímero producido principalmente por Xanthomonas campestris y utilizado como espesante y estabilizante de emulsiones, se sugiere en diversos estudios para la reformulación de alimentos con alto contenido graso como sustituto parcial de los lípidos. En este trabajo se investiga la funcionalidad de sistemas formados por goma xantana-grasa de palma en la reducción de la digestibilidad de la grasa. C7) DIETARY INTAKE OF MYCOTOXINS THROUGH CEREAL PRODUCTS FOR TUNISIAN INFANTILE POPULATION Juan, C.*2, Oueslati, S. 1,3, Berrada, H2., Mañes, J. 2 1 Departement de Génie Biologique, Université Libre de Tunis; 2 Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España. 3 Regional Field Crop Research Center of Beja (CRRGC), Béja, Tunisia.

A total of eight trichothecenes (deoxynivalenol (DON), 3Acetyldeoxynivalenol (3- AcDON), 15-acetyldeoxynivalenol (15AcDON), fusarenon-X (FUS-X), diacetoxyscirpenol (DAS), neosolaniol (NEO), nivalenol (NIV) and zearalenone (ZON)) have been analyzed in cereal products for infantile population (6 and 12 months) commercialized in Tunisia to estimate their dietary intake (EDI). JECFA have been established provisional maximum tolerable daily intake (PMTDI) for NIV, DON & acetylated derivatives (3AcDON & 15Ac-DON), toxin T-2 & HT-2 and ZON, at 1.2, 1, 0.1 and 0.25 μg/kg bw/day, respectively. Results pointed out that DON presented the highest incidence (81%) which levels ranged between 0.02 and 111 μg/kg (mean 32.15 μg/kg). Otherwise, other mycotoxins were detected such as 15-AcDON (mean 1.3 μg/kg), NIV (mean 51 μg/kg), NEO (mean 4 μg/kg) and ZON (mean 1.3 μg/kg), without exceeding the maximum permitted levels (MLs) set by the European Commission for baby food (200 μg/kg for DON; and 20 μg/kg for ZON). The dietary exposure of Tunisian infants to trichotheces was estimated by the calculation of the EDI through the consumption of commercial infant formula (from 12 to 90g) and a body weight mean of 8.5 kg. Considering the maximum consumption (90g), the EDI were 0.34, 0.01, 0.54, 0.04, 0.01 μg/kg bw/day for DON, 15ADON, NIV, NEO and ZON , respectively. Ones values

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lower than PMTDI. Acknowledgments: AGL2013-43194-P, AGL2014-52648-REDT, Emerging research groups no. GV-2016-106. Keywords: Trichothecenes, baby, cereals, estimated daily intake. C8) FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA FORMACIÓN DE ACRILAMIDA Y ESTRATEGIAS DE MITIGACIÓN Molina Periz, E.M*., Manyes Font, L. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

La acrilamida es un compuesto presente en alimentos ricos en almidón generado durante el procesamiento a altas temperaturas y cuya presencia en la dieta afecta prácticamente a toda la población. Está clasificado por IARC en el grupo 2A, probable carcinógeno en humanos1. En Europa no existe legislación relativa a su presencia en alimentos. Se ha realizado una búsqueda de artículos publicados en las bases de datos Scopus, Web of Knowlegde of Science y Pubmed utilizando combinaciones de palabras relacionadas con el tema. La acrilamida dietética puede aumentar el riesgo potencial de desarrollar cáncer aunque los estudios en humanos no son concluyentes2. Suprincipal mecanismo de formación es la reacción de Maillard. El proceso está influido por diversos factores que tienen distinto peso específico en función de la matriz del alimento como aminoácidos libres, azúcares –tipo, cantidad y estado físico, humedad y relación tiempo/temperatura. Asimismo, la matriz del alimento también interviene en la biodisponibilidad de la molécula. La implementación de estrategias de mitigación incluye la elección de materias primas con menor cantidad de precursores, aplicación de tratamientos previos a la elaboración, adición de sustancias en las recetas, control de los parámetros de tratamiento térmico, así como nuevas técnicas de cocción3. Numerosos estudios han examinado la asociación entre el consumo deacrilamida en la dieta y el riesgo de cáncer en varios tejidos sin llegar a resultados concluyentes. Aunque algunas estrategias de mitigación son comunes a todos los grupos, cada categoría de alimentos requiere métodos específicos en función de los principales factores de formación. Palabras clave: acrilamida; formación; mitigación; toxicidad; alimentos. Bibliografía: 1IARC. International Agency for Research on Cancer. (1994). Acrylamide. In IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogen Risk to Humans: Some Industrial Chemicals. 2EFSA. Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (2015). Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific Opinion on acrylamide in food. EFSA Journal 2015;13(6):4104. 3Arvanitoyannis, I.S. and Niki D. (2014). Acrylamide: Formation, Occurrence in Food Products, Detection Methods, and Legislation. Taylor & Francis. Critical reviews in food science and nutrition. 54. 708-733. C9) SISTEMAS DE APPCC Y ALERTAS ALIMETARIAS EN PRODUCTOS A BASE DE CACAO Saiz Marzal, I., De Joz García, M., Bianca Milea, I., Juan-García, A. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

El desarrollo de la industria alimentaria ha permitido crear productos nuevos cada vez más seguros y de mayor calidad, con el fin de satisfacer las exigencias del consumidor. En los últimos años, el sector del cacao en España ha aumentado su producción tanto en importación como en exportación, lo que ha supuesto también un incremento en el registro de alertas alimentarias relacionadas con este sector. Las alertas alimentarias están reguladas por organismos nacionales e internacionales dependiendo de su lugar de origen y de impacto; a nivel nacional está gestionado por el SCIRI y el RASFF mientras que a nivel europeo e internacional por INFOSAN. El

complejo procesado del cacao hace necesario implantar medidas preventivas y correctoras a través de los sistemas APPCC. En ocasiones estas medidas preventivas fallan o no son suficientes, lo que hace que se registren varias alertas. En este trabajo se presenta un caso de alerta alimentaria registrada en febrero de 2016, por la presencia de un trozo de plástico en un producto a base de cacao, debido a un fallo en el proceso de producción. A su vez, se presentan los organismos que gestionan las alertas alimentarias, el funcionamiento e implantación de un sistema de APPCC en la industria de cacao alimentaria y el modo de actuación durante el transcurso de la alerta alimentaria del caso de productos de cacao. C10) EVALUATION OF EMERGING AND LEGISLATED MYCOTOXINS IN BREAD COMMERCIALIZED IN ROMANIA Stanciu, O., 1* Juan, C., 2 Miere, D., 1 Loghin, F., 3 Mañes, J.2 1 Department of Bromatology, Hygiene, Nutrition and 3 Department of Toxicology, Faculty of Pharmacy, “Iuliu Haţieganu” University of Medicine and Pharmacy Cluj-Napoca, Romania; 2 Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

Bread is the most important wheat-based product that contributes to wheat consumption in Romania. However, others cereals (oat, rye or maize) are included in bread elaboration as a source of nutrients and substances, sometimes including that with toxic effects (e.g. mycotoxins). Mycotoxin presence in cereals and products has been studied, and some of them were legislated (e.g. ochratoxin (OTA)), while others have not yet (e.g. emerging mycotoxins). In this study, the presence of 13 mycotoxins (emerging mycotoxins: enniatins (ENA, ENA1, ENB, ENB1), beauvericin (BEA), Alternaria mycotoxins (alternariol - AOH, alternariolmethylether - AME, tentoxin - TEN); and legislated mycotoxins: aflatoxins (B1, B2, G1, G2), OTA) was evaluated in 70 bread samples commercialized in Cluj-Napoca, Romania, using liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry. Analytical results showed that ENB was the most detected mycotoxin (79%) in the samples evaluated, ranging from 2.1 to 31.3 μg kg-1. Regarding legislated mycotoxins, only AFB2 was detected in 13% of the samples (3.1 to 3.9 μg kg-1). Bread contribution on dietary exposure to mycotoxins for Romanian population was assessed calculating the estimated daily intake (EDI), knowing the wheat and wheat products consumption (365 g/capita/day) and setting a default body weight for adults (70 kg) (EFSA, 2012). According to this, the EDIs were 163 and 20 ng/kg bw/day for ENB and AFB2, respectively. This study brings an important contribution in order to evaluate mycotoxin exposure for Romanian population through bread consumption for both legislated and emerging mycotoxins, including compounds not studied until now as Alternaria mycotoxins. References: EFSA, 2012. Guidance on selected default values to be used by the EFSA Scientific Committee, Scientific Panels and Units in the absence of actual measured data. EFSA Journal, 10(3), 2579. Keywords: LC-MS/MS; emerging mycotoxins; aflatoxins; Alternaria; bread. Funding: This work has been supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (AGL2013-43194-P, and AGL201452648-REDT), the Generalitat Valenciana (project for emerging research groups no. GV-2016-106) and the PhD Reseach Projects of “Iuliu Haţiaganu” University of Medicine and Pharmacy Cluj-Napoca (project no. 7690/103/15.04.2016). C11) OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE LA PATULINA EN ZUMO DE MANZANA Vieira, P.P.F.1, Sardellini J.2, Berrada, H.2 1 Departamento de Gastronomia, Centro de Tecnologia y Desarrollo Regional, Universidad Federal de Paraíba, Brasil 2 Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/ n, 46100

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La patulina es un metabolito secundario tóxico producido por distintos géneros de hongos. En manzanas el P. expansum es el principal, capaz de producirla a temperaturas de refrigeración. La patulina es estable a las condiciones ácidas y a los tratamientos térmicos del zumo.En este estudio se investiga los diferentes factores que afectan a suextraccióndesde muestras de zumo de manzana con diferentes disolventes, adición de ácido y salantes de su determinación por GC- MS/MS.La adición de1g NaCl ha permitido mejorar los datos de extracciónconacetonitrilo.Pero, las condiciones óptimas se han obtenido con la adición de 400μl de ácidoacético (pH4) a 5 ml de zumo de manzana para extraerla con 2 ml de acetato de etilo que permitió unas recuperaciones entre 80 y 110% a diferentes puntos de fortificación. La metodología propuesta fue repetible y reproducible al obtener, unas RSDs< 18%. En cuanto allímite de detección y cuantificación instrumentales se consigue alcanzar 1 ppb y 5 ppbrespectivamente,por debajo de los límites de la legislación 50ppbde la Unión Europea. La respuesta es linear en el rango LOQ- 100 LOQ. La cuantificación se hace basándose en rectas de patulina en extracto de zumo para tener en cuenta el efecto matriz y permitir una cuantificación adecuada.Finalmente, se lleva a cabo una monitorización de los niveles de patulina a través del análisis de diferentes muestras comerciales de zumo de manzana para evaluar el grado de exposición a la misma. Palabras Claves: Zumo de Manzana, Patulina, Extracción, GCMS/MS. Agradecimientos: Este Trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013 – 43194-P; BES- 2014 – 068039)

C13) PLAN DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN EN UN SISTEMA DE APPCC EN RESTAURACIÓN COLECTIVA Sanz Bosch,M., Ballester Rodríguez, A., Bescós Cuevas, A., Juan-García, A. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

En este trabajo se presentan los sistemas APPCC, cuáles son las características principales y los prerrequisitos esenciales que se deben aplicar como sostén a este sistema para poderlo llevar a cabo. La visita a un servicio de restauración colectiva durante una inspección, ha permitido seguir paso a paso la revisión y evaluación de todas y cada una de las partes del APPCC implantadas en el mismo, mediante la utilización de varios planes dirigidos a valorar las instalaciones, así como los aspectos relacionados con la higiene alimentaria. El trabajo se centra i) en explicar el Plan de Limpieza y Desinfección (Plan L+D) implantado en un servicio de restauración (basado en la utilización de tablas que distribuyen las tareas de higienización de los distintos elementos, la frecuencia, el personal encargado de la limpieza, el producto químico utilizado); ii) en conocer el procedimiento de revisión visual y microbiológica en el Plan L+D y la documentación para la inspección de cada zona; y iii) en la elaboración de partes de acciones correctivas para que en caso de puntos críticos con evaluación negativa, estos sea declarada junto con las medidas necesarias para su corrección, según el riesgo que ésta implique.

C12) ESTUDIOS TOXICOLÓGICOS DE MICOTOXINAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS Escrivá, L., Manyes, L., Berrada,H., Font, G. Àrea de Toxicologia. Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, València, España.

Las micotoxinas, además de su notoria toxicidad, han demostradodiversos niveles de bioacumulaciónen fluidos, órganos y tejidos animales. 110 publicaciones entre 2005 y 2016 han sidoevaluadasrespecto al objetivo del análisis de micotoxinas en muestras biológicas. El desarrollo de nuevos métodos analíticos (35%) y la biomonitorización de la exposición a través de la orina (30%) son las principales finalidades, seguido de estudios de lapersistencia (10%), biodisponibilidad(9%) y toxicocinética (6%). Otros objetivos como el estudio de agentes adsorbentes (carbón activado y glucomanán), la transferencia aleche materna (aflatoxinas, deoxinivalenol; DON y zearalenona; ZEA) y placentaria (ocratoxina A; OTA), o la relación de micotoxinas con enfermedades(OTA y nefropatía) han sido también evaluados. La biomonitorización de multi-micotoxinas en orina humana se ha llevado a cabo en diferentes regiones destacando Bangladesh, Alemania, Bélgica, Portugal, España, Italia y Brasil.La biodisponibilidad y persistencia de micotoxinasen tejidosha sido estudiada para DON, ZEA, OTA, toxina T-2, fusarenon-X, nivalenol, fumonisina B1,eniatinas (ENs) y beauvericina, mientras que los estudios de toxicocinética se limitan a DON, ZEA y EN B1. Los principales resultados indican la rápidaabsorción, distribución y eliminación de ZEA yEN B1 mostrando una biodisponibilidad oral de 10% y 90%en aves de corral y cerdo respectivamente. T-2 no muestra datos de acumulación en tejidos de rata ni siquiera a altas concentraciones de exposición (20mg/kg). La OTA se acumula en riñón e hígado de gallinas expuestas a 200μg/kgcon relevante excreción biliar. Palabras clave: micotoxinas, muestras biológicas, bioacumulación, toxicocinética, ADME. Agradecimientos: este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-43194-P; BES-2014068039). 166

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ACTAS DE LAS JORNADAS CIENTÍFICAS DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL Y ECOTOXICOLOGÍA TOXECOTOX, MADRID 2017 Comité Científico: María José González Muñoz, Roberto Rosal, Francisca Fernández Piñas y Carmen José Mateos Vega Comité Organizador: Roberto Rosal, María José González Muñoz. Francisca Fernández Piñas, Eduardo de la Peña y Yolanda Valcarcel. Organizadas por la Universidad de Alcalá, Universidad Autónoma de Madrid, Universidad Rey Juan Carlos, CSIC y la Asociación Española de Toxicología el 26 y 27 de enero de 2017 en Instituto de Ciencias Agrarias. Consejo Superior de Investigaciones Científicas.

SESIÓN INAUGURAL RESULTADO DE LA ENCUESTA DE LA RED IBEROAMERICANA DE TOXICOLOGÍA Y SEGURIDAD QUÍMICA SOBRE LAS OPORTUNIDADES EN IBEROAMÉRICA DE FORMACIÓN E INVESTIGACIÓN EN TOXICOLOGÍA de la Peña de Torres E. Investigador del CSIC. Coordinador de la Red Iberoamericana de Toxicología y Seguridad Química. CSIC. Instituto de Ciencias Agrarias. c/ Serrano 115 dpdo. 28006 Madrid. Se muestran los resultados de la encuesta que se puso en marcha y realizó el pasado mes de mayo, con el objetivo de conocer las oportunidades de formación e investigación en Toxicología en Iberoamérica. Un resumen de los resultados obtenidos de la citada encuesta los presenté el pasado octubre, en la III Reunión de RITSQ, que realizamos durante la celebración del XIV International Congress of Toxicology IUTOX, Mérida México; y que acordamos pondríamos a disposición de todos los toxicólogos asiduos a nuestra página web de RITSQ (http://ritsq.org). Este trabajo nos ha permitido obtener el conocimiento del estado actual del desarrollo de la disciplina Toxicología, tanto de la actividad docente como de la actividad científica en esta área en Iberoamérica, y con ello se contribuye a cumplimenta los objetivos de RITSQ, como son: a) Coordinar la participación de los diferentes grupos existentes en universidades y organismos de investigación de Iberoamérica, implicados en estudios relacionados con la Toxicología; b) Fortalecer la colaboración y el intercambio académico entre los programas de Doctorado y Maestría de diferentes países iberoamericanos, que tengan como objeto el estudio y la investigación en Toxicología o áreas relacionadas; c) Favorecer la realización de proyectos de investigación conjuntos entre docentes e investigadores de Iberoamérica, pasantías estudiantiles y eventos académicos. Los aspectos considerados en la encuesta, contribuyen a propiciar actividades que permitas desarrollar la Toxicología. Manifestamos el agradecimiento a los toxicólogos que han respondido a la encuesta. Dado el tipo de información que se requieren, hace que algunas preguntas requieran determinadas respuestas, que pueden hacer peligrar el anonimato de la misma; sin embargo, se asegura la privacidad de quienes han respondido a la misma. En todo lo relacionado, tanto el análisis de los datos, como en la exposición de documentos aportados en este trabajo, y cualquier consulta sobre la citada encuesta se puede demandar a los coordinadores de la RITSQ. Comunicaciones orales. BIOMARCADORES Y NUEVAS ESTRATEGIAS DE EVALUACION DEL IMPACTO AMBIENTAL DE DISTINTOS TIPOS DE CONTAMINANTES ¿POR QUÉ UN CONTAMINANTE PERSISTE EN EL AMBIENTE? Ortega Calvo JJ.

BIODEGRADABLE

Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNASCSI) Que un contaminante orgánico sea en principio biodegradable no implica que sea biodegradado en cualquier escenario ambiental. La causa es, en muchas situaciones, la falta de biodisponibilidad. A pesar de existir en un suelo o un sedimento contaminado los microorganismos con la maquinaria enzimática apropiada para realizar la transformación, la biodegradación puede ocurrir muy lentamente si el contaminante no está accesible para su asimilación, debido a adsorción o reparto. Esto supone un freno si queremos utilizar la actividad biológica como instrumento de descontaminación. Desde mediados de los 90 hemos investigado en el IRNAS-CSIC sobre los mecanismos para el aumento de biodisponibilidad de contaminantes orgánicos. Como compuestos modelo hemos utilizado un grupo representativo de contaminantes hidrófobos, en concreto los hidrocarburos aromáticos policíclicos (o PAHs), que se incorporan a los suelos y sedimentos tras la combustión de la materia orgánica y por vertidos de petróleo. Nuestros resultados indican que es posible aumentar la biodisponibilidad utilizando nuevos abordajes, sin necesariamente aumentar el riesgo de los contaminantes. Estos abordajes incluyen la utilización de tensioactivos, el favorecimiento del crecimiento de microorganismos adheridos, y la movilización microbiana mediante quimiotaxis. Nuestras investigaciones tienen también implicaciones para la estimación del riesgo de los contaminantes orgánicos, al proporcionar herramientas para predicciones más precisas sobre su actividad química y persistencia. Nota: La charla también incluirá una breve exposición de oportunidades para la comunidad ToxEcotox dentro de la Sociedad de Toxicología y Química Ambiental en Europa (SETAC Europe). LA CARBENDAZIMA INDUCE EFECTOS CITOTÓXICOS Y CITOSTÁTICOS EN CÉLULAS HUMANAS NO TUMORALES Fernández Freire P, Peropadre A, Hazen MJ Universidad Autónoma de Madrid La carbendazima es un derivado del benzimidazol ampliamente estudiado en líneas celulares humanas por sus prometedoras propiedades antitumorales. No obstante, no se cuenta con datos concluyentes sobre su citotoxicidad en células humanas no tumorales. En este trabajo hemos evaluado los efectos de citotoxicidad aguda causados por la carbendazima en células HaCaT utilizando marcadores bioquímicos y morfológicos, valorando además la potencial reversibilidad de los mismos. Nuestros resultados muestran que una exposición continua durante 24h al compuesto induce un descenso de la viabilidad celular dependiente de concentración según el ensayo de reducción de MTT. La utilización de microscopía de fluorescencia nos permitió asociar estos valores con alteraciones en el patrón morfológico normal del retículo mitocondrial en las células HaCaT. En estas mismas condiciones experimentales, la proliferación de las células se vio afectada como consecuencia de un bloqueo de la mitosis en la transición profase – metafase. El citoesqueleto de microtúbulos, analizado por inmunofluorescencia de α tubulina, presentaba una evidente alteración tanto en interfase como en las células en división, observándose husos mitóticos aberrantes. Los estudios de reversibilidad de los efectos indicaron que el daño celular generado en la exposición continua durante 24h se mantenía al menos hasta 72h después de retirar el tratamiento. Además, en estas condiciones aparecían una cantidad importante de células con morfologías apoptóticas. Nuestros resultados demuestran que la toxicidad ejercida por la carbendazima no presenta selectividad por las células tumorales, siendo necesarios estudios complementarios utilizando distintas estirpes de células humanas para valorar por completo su citotoxcidad. PRESENCIA DE DICLOFENACO, ESTRADIOL Y ETINILESTRADIOL EN EL RÍO MANZANARES Y SU TOXICIDAD SOBRE EL DESARROLLO EMBRIONARIO DEL PEZ ZEBRA. García Cambero JP2, Corpa C3, Sierra P4, Aguayo S1. 1Científico Titular OPI. Unidad Contaminación Hídrica. CNSA.

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ISCIII, 2Científico Titular OPI. Unidad Embriones Pez Zebra. CNSA. ISCIII, 3Estudiante de Máster. Realización trabajo fin de master en el CNSA. 4Responsable Unidad de Contaminantes Orgánicos, Unidad Contaminación Hídrica. CNSA. ISCIII. La última revisión de la Directiva Marco de Agua, (DI /EU 2015/495) estableció la primera lista de observación de sustancias en las aguas europeas incluyendo el 17-alfa etinilestradiol, el 17 beta estradiol y el diclofenaco entre otros fármacos. La decisión incluye la necesidad de monitorizar los niveles ambientales de estas sustancias y poder así definir medidas para minimizar su riesgo para el medio. La Directiva Marco de Agua, incluye también la evaluación del peligro que estas sustancias pueden tener para el medio mediante el empleo de ensayos de toxicidad. Por todo ello, el objetivo principal del proyecto es caracterizar los niveles ambientales de estas 3 sustancias y realizar su valoración toxicológica de los niveles ambientales de estos contaminantes en aguas superficiales (ríos) y efluentes de depuradora. Se han realizado dos muestreos a lo largo del cauce del Río Manzanares (Madrid) en el punto de vertido de cinco depuradoras de la capital y un kilómetro aguas abajo de cada una de ellas. Se ha aplicado la metodología del método EPA 1694 (2007) para el análisis cuantitativo mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas. La evaluación toxicológica se realizó utilizando el ensayo en embriones de pez zebra mediante la valoración de la cardiotoxicidad, neurotoxicidad y efectos sobre el desarrollo embrionario. Los resultados obtenidos revelan unos niveles ambientales que se encuentran en el rango de los obtenidos por otros países europeos, con excepción del EE2 que presenta unos valores superiores en uno de los puntos de toma de muestra. En cuanto a los resultados de los ensayos, los resultados nos demuestran toxicidad en dos de los puntos de toma de muestra SP2 y SP3 en la mortalidad, cardiotoxicidad y locomoción, no mostrándose ningún efecto estadísticamente significativo durante el desarrollo embrionario. UN CASO ESTUDIO PARA LA PRIORIZACION DE FÁRMACOS EN EFLUENTES HOSPITALARIOS BASÁNDONOS EN SU RIESGO Y PELIGRO AMBIENTAL. Valcárcel Y1,2, Olalla A1, Mendoza A1, Negreira N2, Aceña J2, Pérez S2, Barceló D2,3 y López de Alda M2. 1Grupo de Investigación y Docencia en Toxicología Ambiental y Evaluación de Riesgos. Universidad Rey Juan Carlos Móstoles. Madrid. 2Departamento de Medicina y Cirugía, Psicología, Medicina Preventiva y Salud Pública e Inmunología Microbiología Médica y Enfermería y Estomatología. Rey Juan Carlos University, Avda. Atenas s/n, E-28922 Alcorcón (Madrid), Spain. 3Water and Soil Quality Research Group, Department of Environmental Chemistry, Institute of Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), C/ Jordi Girona, 18-26, 08034 Barcelona, Spain. 3Catalan Institute for WaterResearch (ICRA), Parc Científic i Tecnològic de la Universitat de Girona, Edifici H2O, EmiliGrahit 101, 17003 Girona, Spain. Los hospitales constituyen una de las principales vías de entrada de fármacos (y sus metabolitos) en el ciclo del agua. Muchos de estos compuestos, no totalmente metabolizados, llegan desde las EDARs a los ríos. En los hospitales se consume gran cantidad de agua y fármacos por día, por lo que se genera gran cantidad de agua residual con una matriz compleja de sustancias que interactúan entre sí, compuesta por muchos micro- contaminantes, de los cuales se desconoce sus efectos a largo plazo sobre el medio ambiente y los seres humanos. El consumo diario de agua en un hospital medio puede estar ente 400-1200 litros por cama y día. Se ha estimado que la toxicidad de aguas hospitalarias es entre 5 y 15 veces mayor que la de las aguas residuales urbanas, sin embargo, se siguen eliminando de forma conjunta a la red de alcantarillado. El objetivo de estos dos estudios ha sido el de monitorizar la presencia y toxicidad de diferentes grupos de fármacos, entre ellos, medios de contrate yodados y citostáticos, especialmente interesantes por su posible potencial toxicológico una vez son eliminados al medio ambiente. Asimismo, se calculó el riesgo de cada sustancia (HQ), 168

según las Directrices de la Unión Europea, y su peligro en términos de Bioacumulación, Persistencia y Toxicidad (PBT), con el fin de realizar una selección preliminar de los compuestos más peligrosos ambientalmente hablando, que contribuyan a tomar decisiones en la Caracterización del Riesgo cuando se evalúan contaminantes emergentes. Los resultados mostraron la presencia de fármacos en concentraciones entre ng/L y mg/L. Las concentraciones más altas fueron del medio de contraste iomeprol, el analgésico acetaminofeno, y el diurético furosemida, así como los antibióticos ofloxacina y trimetoprima. Los citostáticos detectados en mayor concentración fueron: ifosfamida, metotrexato y ciclofosfamida. Los valores más altos de HQ correspondieron a acetaminofeno, diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, ifosfamida, irinotecam y ciclofosfamida. Por último, los PBT máximos fueron para diclofenaco, ibuprofeno, claritromicina, el agente hormonal tamoxifeno, ifosfamida, ciclofosfamida e irinotecam, lo que indica un elevado riesgo ambiental para estas sustancias. Este estudio ha permitido realizar una evaluación preliminar del riesgo y peligro ambiental de una amplia variedad de fármacos provenientes de efluentes hospitalarios, identificando como fármacos prioritarios: ibuprofeno, diclofenaco, acetaminofeno, tamoxifeno, ifosfamida, ciclofosfamida e irinotecam. Los autores agradecen la financiación del Ministerio de Economía y Competitividad a través del Instituto de Salud Carlos III (Proyectos en Salud FIS 2012-2014) (PI11/00180), a la Comisión Europea a través de su Proyecto SOLUTIONS (contratato 603437), así como a la Generalitat de Catalunya (Consolidated Research Groups “2014 SGR 418-Water and Soil Quality Unit” and 2014 SGR 291-ICRA). DETERMINACIÓN DE FACTORES DE CARACTERIZACIÓN PARA LA ESTIMACIÓN DEL IMPACTO POTENCIAL TOXICOLÓGICO Y ECOTOXICOLOGICO DE PHACS Ortiz de García S, García-Encina PA y Irusta-Mata R Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente. Escuela de Ingeniería Industriales. Universidad de Valladolid La presencia de productos farmacéuticos (PhACs) en diferentes compartimentos ambientales, instalaciones de aguas residuales e industria, y las evidencias de sus efectos adversos sobre el medio y las personas ha dado lugar a un incremento en el estudio de los impactos de estos compuestos, siendo el análisis de ciclo de vida (ACV) una de las herramientas empleadas para estimar ese impacto. La importancia relativa de una sustancia en cada categoría de impacto de un ACV, como toxicidad humana o ecotoxicidad en agua, se determina mediante los factores de caracterización (FCs). En este estudio se han estimado los FCs de 27 PhACs ampliamente utilizados, para incorporar sus valores en estudios de Evaluación de Impacto del Ciclo de Vida (EICV) o para generar listas de clasificación de impactos. La estimación de los FCs se ha llevado a cabo mediante el software USEtoxTM a partir de las propiedades fisicoquímicas, tasas de degradación, bioacumulación, ecotoxicidad y efectos sobre la salud humana, obtenidos a partir de datos experimentales, bases de datos reconocidas o estimaciones mediante EPI SuiteTM. Estos valores estimados de FCs, junto con otros obtenidos a partir de la literatura, se han empleado para elaborar una clasificación de impacto para 49 Productos farmacéuticos y de cuidado personal (PPCPs). Se ha observado que la emisión al compartimento de agua dulce continental presenta los FCs más altos con efecto sobre la salud humana (de 10-9 a 10-3 CTUh*•kg-1 o casos•kg-1) y los mayores valores de ecotoxicidad (entre 1 a 104 CTUe$•kg-1 o PAF¥•m3•day•kg-1). En ambos casos los menores valores correspondieron a las emisiones al agua de mar, por lo que el impacto ecológico de los PPCPs en ambientes acuáticos debe ser una cuestión de atención urgente y prioritaria. De entre los PPCPs estudiados, los que poseen un mayor impacto son, las hormonas, los antidepresivos, las fragancias, los antibióticos, los bloqueadores de los receptores de la angiotensina y los reguladores de los lípidos sanguíneos. Estos resultados serán útiles para llevar a cabo evaluaciones individuales de riesgo ambiental. * CTUh: Unidades comparativas de toxicidad humana (número de casos). $ CTUe: Unidades comparativas de ecotoxicidad

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(PAF•m•day). ¥ PAF: Fracción de especies potencialmente afectadas VALORACIÓN DE RIESGO DE PESTICIDAS EN CERA PARA LA ABEJA (Apis mellifera). Carballo M., González M., Asensio I. y Muñoz M.J. INIA-CISA. Grupo de Epidemiologia y Sanidad Ambiental. Carretera Algete-El Casar s/n. Valdeolmos. 28130 Madrid. La cera es el soporte fundamental de las colmenas. Es un producto elaborado por la propia abeja que tiene naturaleza lipófila compleja. La cera se reutiliza continuamente, en los colmenares, tras sufrir tratamientos suaves. En los últimos diez años, los análisis químicos realizados en esta matriz han mostrado la presencia de una gran variedad de compuestos químicos, principalmente pesticidas. Esta situación representa una nueva vía de exposición para las abejas a sustancias que podrían originar efectos adversos a largo plazo. El objetivo de este trabajo es valorar los compuestos más usuales detectados en cera y determinar su peligrosidad para Apis mellifera. Se revisa la información disponible de compuestos en cera y se aplica la metodología de valoración de riesgo. Los resultados indican la presencia en la cera de contaminantes ambientales, de pesticidas de uso agronómico y de pesticidas utilizados para el control de enfermedades en la propia colmena. Estos últimos aparecen en el 82 % de las muestras y a concentraciones del orden de ppm, pudiendo suponer riesgo para este insecto. La información de los efectos a largo plazo en las abejas (larvas y adultos) es escasa. La cera debería ocupar un pilar fundamental en cualquier evaluación de riesgos toxicológicos en las colmenas y habría que extremar las condiciones de su reutilización. RTA2013-00042-C10-09. APLICACIÓN DE UN PANEL CITÓMICO CON MICROALGAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD DE CONTAMINANTES ACUÁTICOS Cid A, Rioboo C, Esperanza M, Seoane M y Herrero C. Laboratorio de Microbiología, Facultad de Ciencias. Universidad da Coruña Gran cantidad y variedad de contaminantes químicos llegan a los ecosistemas acuáticos procedentes de las prácticas agrícolas y ganaderas, la industria o los espacios urbanos. El análisis de la posible toxicidad de estas sustancias en aguas superficiales es uno de los principales retos para la monitorización ambiental y el control de la contaminación. Como productores primarios, las microalgas constituyen el primer eslabón de la cadena trófica acuática y cualquier alteración sobre ellas puede repercutir en los niveles superiores de esta cadena. Debido a que presentan tiempos de generación cortos, una población microalgal responde rápidamente a los cambios ambientales y permiten estudiar efectos transgeneracionales a la exposición de contaminantes. Los tests de toxicidad con microalgas se han ido introduciendo en los sistemas de control de la contaminación. Los efectos citotóxicos de los contaminantes acuáticos sobre las microalgas son muy heterogéneos. Crecimiento o fotosíntesis son analizados en bioensayos con microalgas, pero otros aspectos relevantes no se estudian debido a las dificultades experimentales. Durante las últimas dos décadas, nuestro grupo ha tenido un objetivo científico prioritario: estudiar la toxicidad ejercida por diferentes contaminantes basándonos en la respuesta fisiológica de la microalgas expuestas a concentraciones subletales de contaminación, y hemos elaborado un panel citómico que analiza, por citometría de flujo, parámetros celulares a nivel de población y con resultados célula a célula y en condiciones próximas al in vivo. Los parámetros analizados son viabilidad y vitalidad celular, composición bioquímica, estrés oxidativo, daño oxidativo en el DNA, calcio y pH intracelulares, y potenciales de membrana, actividad caspasa, ciclo celular y seguimiento de la progenie celular, además de parámetros intrínsecos como tamaño, complejidad y autofluorescencia. EFECTO DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS SOBRE

LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS ESTERASAS EN LÍNEAS CELULARES NEURONALES Y GLIALES HUMANAS. Martínez Morcillo S1, Soler Rodríguez F1, Míguez Santiyán MP1, González Mateos M2 y Pérez-López M1 Unidades de Toxicología1 y Fisiología2, Facultad de Veterinaria (UEX), Cáceres. A partir de la segunda mitad el siglo XX, con la necesidad de disminuir el uso de productos organoclorados, se generalizó la aplicación como plaguicidas de compuestos organofosforados (OFs) debido a su menor persistencia en el medio, los bajos costes de producción y su alta efectividad. La principal acción tóxica de estos compuestos se produce sobre la acetilcolinesterasa (AChE), enzima con un papel fisiológico perfectamente definido en las transmisiones nerviosas y cuya inhibición es uno de los mecanismos primarios de toxicidad aguda en el tejido nervioso. La AChE pertenece al mismo grupo de esterasas que la butirilcolinesterasa (BChE) y la carboxilesterasa (CbE). Debido al papel que desempeñan en los mecanismos de toxicidad, así como en su participación en la protección frente a la toxicidad por OFs, estas enzimas tienen especial interés en ensayos ecotoxicológicos. Tradicionalmente las neuronas han sido consideradas las células diana de la toxicidad por OFs. Sin embargo, estudios recientes in vitro e in vivo demuestran células gliales también son diana de los OFs, y se ha sugerido que ponen en marcha mecanismos de neuroprotección frente a su efectos tóxicos. Dentro de la línea de investigación que llevamos a cabo sobre el efecto de OFs en diferentes tipos de cultivos celulares, en el presente trabajo hemos evaluado la toxicidad de dos plaguicidas OFs (clorpirifós y dimetoato) sobre células SK-N-BE y U87. Las células se incubaron durante 24h en presencia de los OFs y se estudió la actividad de las enzimas AChE, BChE y CbE. Los resultados muestran diferencias en los parámetros cinéticos de las enzimas B-esterasas en los dos tipos de células estudiadas y en la sensibilidad tanto a inhibidores específicos, como a los plaguicidas usados. En ambas, hay una mayor inhibición de la actividad CbE (sobre todo en la exposición a clorpirifós), lo que puede suponer una función de “protección” con respecto a la inhibición de la AChE. DESARROLLO DE UNA ESTRATEGIA INTELIGENTE PARA LA EVALUACIÓN DE LA SALUD DE ECOSISTEMAS ACUÁTICOS Herrero O1, Servia MJ2 y Planelló R1 1Grupo de Biología y Toxicología Ambiental. Facultad de Ciencias. UNED. 28040, Madrid, España. 2Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología. Facultad de Ciencias. Universidad de A Coruña. Campus da Zapateira s/n. 15008 A Coruña, España. La contaminación de los ecosistemas acuáticos representa actualmente una de las mayores amenazas para la conservación de los espacios naturales y supone uno de los mayores retos a los que se enfrenta en la actualidad la Toxicología ambiental. En los últimos años, la proliferación de las 'ómicas' ha permitido analizar efectos subletales de contaminantes ambientales desde una aproximación más mecanicista. Sin embargo, es la integración de estas técnicas con herramientas más clásicas de toxicología, química analítica y bioinformática, lo que conducirá a enfoques más sólidos que permitan descifrar la complejidad de las exposiciones a estas sustancias en ecosistemas naturales. Chironomus (Diptera) cuenta con cuatro ensayos recogidos por la OCDE y validados internacionalmente para la evaluación de la toxicidad de aguas y sedimentos, empleando parámetros tradicionales de toxicidad (supervivencia, inmovilización, reproducción y desarrollo). No obstante, cada vez se tienen más en cuenta otras dianas: morfológicas, fisiológicas, celulares o moleculares. En su conjunto, todas estas aproximaciones están aún muy parceladas, limitándose generalmente a una población de estudio, unas pocas dianas y con escasos análisis que permitan correlacionar efectos tempranos y sus consecuencias últimas. Resulta así imprescindible desarrollar un protocolo integral de evaluación del riesgo ecotoxicológico, que permita abordar estudios complejos en espacios naturales integrando diversas disciplinas, especies, poblaciones y escenarios de exposición . Se podrán caracterizar los

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efectos tóxicos detectados en los distintos niveles de organización biológica, analizando biomarcadores tempranos para predecir en última instancia respuestas fisiológicas ecológicamente relevantes, capaces de comprometer la supervivencia de una población y de indicar la salud general de su entorno. EFECTOS DE AGUAS REGENERADAS EN EL DESARROLLO DE Chironomus riparius: APROXIMACIÓN MEDIANTE BIOMARCADORES MOLECULARES Y PARÁMETROS ECOTOXICOLÓGICOS. Planelló R2, Herrero O2 y Sánchez-Argüello P.1 1Laboratorio de Ecotoxicología. Departamento de Medio Ambiente. INIA. 28040, Madrid. España. 2Grupo de Biología y Toxicología Ambiental. Facultad de Ciencias. UNED. 28040, Madrid, España. La depuración de aguas residuales y su reutilización se considera una estrategia de sostenibilidad en la gestión del agua como recurso limitado y escaso. La legislación española reconoce su uso ambiental en el mantenimiento de humedales o de caudales mínimos. Sin embargo, estas prácticas pueden alterar recursos naturales indispensables para la supervivencia de especies acuáticas si las aguas regeneradas no cumplen con criterios de calidad que garanticen un uso adecuado. Las aguas regeneradas pueden contener mezclas complejas de contaminantes, muchos de ellos persistentes, que tienden a acumularse en sedimentos y afectan a la fauna bentónica. Chironomus riparius es una especie de díptero de sedimento ampliamente utilizada en Ecotoxicología. La OCDE dispone actualmente de cuatro protocolos estandarizados para evaluar efectos agudos sobre el desarrollo y sobre el ciclo de vida de este organismo. Además, se han utilizado con éxito biomarcadores moleculares para estudiar los mecanismos de acción de los contaminantes en las larvas de esta especie. En este trabajo se han evaluado los efectos de aguas regeneradas en C. riparius, sobre su ciclo de vida (emergencia de adultos, proporción de sexos, tasas de desarrollo y reproducción) y sobre la expresión génica relacionada con la ruta hormonal mediada por ecdisona (vitelogenina y EcR). El objetivo de este estudio ha sido determinar si las aguas regeneradas inducen efectos sobre el desarrollo de C. riparius y si estos están correlacionados con variaciones en la expresión de los genes analizados. Este trabajo ha sido cofinanciado por los siguientes proyectos del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad: CTM201344986-, y CTM2012-37547. EVALUACIÓN ECOTOXICOLÓGICA DE MEZCLAS DE CONTAMINANTES UNRAVELLING THE EFFECTS OF MULTIPLE STRESSORS ON AQUATIC INVERTEBRATE COMMUNITIES IN SEMIARID AREAS Rico A, Vighi M y Arenas-Sánchez A. IMDEA Water Institute, Avenida Punto Com 2, 288805 Alcalá de Henares, Madrid, Spain. Combined effects of chemical pollution and water scarcity are one of the most important threats to aquatic ecosystems in (semi-)arid regions. Although some studies have evaluated the occurrence of chemical stressors in those ecosystems, the biological responses to these and other interacting stress factors have been poorly investigated. In this study we present a series of research activities dealing with the combined effects of chemical and non-chemical stressors associated to water scarcity conditions on invertebrate communities. A monitoring campaign was performed in the upper Tagus river (Central Spain) in which the occurrence of more than 400 emerging contaminants and metals, together with measures of physicochemical parameters, were examined trough three different periods (spring, summer, autumn). The study is still ongoing, but preliminary results suggest that chemical pressure is distinctively associated to different levels of anthropogenic pressure. Further analyses will elucidate structural components and functional traits that are associated to different hydrological and chemical stress 170

conditions. Moreover, a microcosm experiment was performed in which the effects of the insecticide lufenuron were evaluated on a zooplanktonic community under different temperature and drought regimes. First results reveal that temperature had only slight effects on the community composition, but influenced the zooplankton vulnerability to the insecticide stressor. Short-term insecticide effects were not found to be larger in the drought treatment as compared to the constant water volume treatment. However, the evaluation of the long-term effects of such combined stressors and the population/community recovery is still undergoing. The results of the series of studies initiated by our group will contribute to characterize the vulnerability of aquatic ecosystems to multiple stress factors in arid and semi-arid regions, and to identify suitable risk management actions to protect the sustainability of aquatic ecosystems under a global and climate change scenario. IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES CONTAMINANTES EMERGENTES RESPONSABLES DE LA TOXICIDAD DE MEZCLAS COMPLEJAS A CONCENTRACIONES AMBIENTALES MEDIANTE UN NUEVO MÉTODO Gonzalez-Pleiter M1, Rodea-Palomares I1,3, Gonzalo S2, RosalR2, Leganes F1, Sabater S4,5, Casellas M4, Muñoz-Carpena R3 y Fernández-Piñas F.1 1Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid. 28049 Madrid, Spain. 2Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Alcalá, E-28871, Alcalá de Henares, Madrid, Spain. 3Department of Hydrology & Water Quality. Agricultural & Biological Engineering Faculty. University of Florida. Florida, USA. 4Institut Català de Recerca de l’Aigua, Carrer d’Emili Grafhit, 101, 17003 Girona, Spain. 5Instituto de Ecología Acuática, Universidad de Girona, Campus de Montilivi, 17071 Girona, Spain. El estudio de los efectos producidos por contaminantes emergentes, como fármacos, a concentraciones ambientales plantea importantes retos que aún no han sido resueltos. Actualmente, las metodologías empleadas en toxicología son inadecuadas para identificar los efectos de los contaminantes emergentes, a bajas concentraciones y en mezclas complejas, y sus interacciones con variables ambientales. En este trabajo se estudiaron 16 fármacos en mezclas complejas a concentraciones ambientales junto con una variable ambiental (intensidad lumínica), con el fin de identificar los principales responsables de la toxicidad generada en una cianobacteria bioluminiscente y en comunidades microbianas de agua dulce. Para abordar este estudio, se ha desarrollado una nueva metodología que se denomina análisis de sensibilidad global acoplado a análisis biológico cuantitativo de alto rendimiento (global sensitivity analysis coupled with quantitative high-throughput screening, GSA-QHTS). Mediante la metodología GSA-QHTS se generaron 180 mezclas diferentes de los 16 fármacos a dos niveles de intensidad lumínica, equivalentes al análisis integrado de 2700 observaciones, todas ellas plausibles en base a las concentraciones y mezclas encontradas en las aguas naturales. Se encontró que las mezclas generaban efectos tóxicos sobre la cianobacteria. Los efectos no pudieron ser predichos en base a las metodologías actuales de análisis de riesgo ambiental. Los resultados obtenidos con la metodología GSA-QHTS mostraron que 8 de los fármacos (carbamazepina, furosemida, eritromicina, hidroclorotiazida, gemfibrozil, venlaflaxina, atenolol, diclofenaco) eran los principales responsables de los efectos observados. Con el fin de extrapolar los resultados a niveles tróficos más complejos, se estudió el efecto de la mezcla más tóxica en comunidades microbianas. La mezcla más tóxica afecto a la fotosíntesis y la actividad de la β-glucosidasa de las comunidades microbianas. Además, se evaluó el efecto de la mezcla más tóxica eliminando cuatro de los fármacos identificados como principales responsables de la toxicidad de dicha mezcla. Se observó una disminución del efecto toxico y se corroboró que los fármacos identificados eran los principales responsables de la toxicidad generada. Nuestros resultados sugieren, que las metodologías actualmente empleada en toxicología pasan por alto contaminantes emergentes que podrían ser peligrosas

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para el medioambiente e introduce una nueva metodología para identificación de contaminantes emergentes con un potencial riesgo ambiental. Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por MINECO (CTM2013-45775-C2-1-R y CTM2013-45775-C2-2-R). LOS BIOENSAYOS COMO HERRAMIENTA EN LA EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE MEZCLAS DE PRODUCTOS FITOSANITARIOS UTILIZADOS EN INVERNADERO. García-Cambero JP y Díaz López G. Centro Nacional de Sanidad Ambiental. Instituto de Salud Carlos III. Ctra Majadahonda-Pozuelo, km 2. 28220 Majadahonda, Madrid. El enfoque actual en la evaluación de riesgo ambiental de productos fitosanitarios requiere la utilización de bioensayos, cuyos organismos están expuestos a sustancias químicas únicas. Sin embargo, la situación ambiental más próxima a la realidad es el que los organismos estén expuestos a mezclas de varios contaminantes, y por tanto la evaluación del peligro en este nuevo escenario representa un gran reto en el campo de la toxicología ambiental. El presente estudio tiene como objetivo evaluar la toxicidad, para organismos medioambientales, de productos fitosanitarios (formulados), cuando estos se aplican en un invernadero tipo, de forma individual, también se propone valorar la naturaleza tóxica de las mezclas en los casos de exposición en dichos organismos. Para ello, se han utilizado bioensayos OECD, ISO, EPA de medio dulceacuícola (daphnias, embriones de pez cebra) y del medio terrestre (lombriz de tierra, Lactuca sativa), expuestos a formulados de dos fungicidas, un insecticida y un herbicida, individualmente y en combinación, conforme a un protocolo de aplicación real en un invernadero tipo (tomate, calabacín). Tras la obtención de la CE50 y las concentraciones sin efecto adverso (NOAEC) de cada producto fitosanitario individualmente y en combinación para los diferentes bioensayos, se comprobó que las mezclas potenciales de exposición a los productos fitosanitarios producían una mayor toxicidad en la mayoría de los bioensayos. Hay que tener en cuenta que la presencia de varios contaminantes en un medio acuático o terrestre, puede originar compuestos muy diferentes de los que se parten (procesos de degradación, reacciones entre distintos productos químicos…) y originar efectos de toxicidad que pueden en algunas ocasiones ser superiores al identificado en un principio, por ello la implementación de los bioensayos de toxicidad, es una herramienta útil que puede conseguir dar fiabilidad añadida a la identificación del peligro tras los procesos de aplicación de los productos fitosanitarios. EVALUACIÓN ECOTOXICOLÓGICA DE NANOMATERIALES NANOMATERIALES Y SU EVALUACIÓN (ECO)TOXICOLÓGICA: EL CASO DE LAS NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CERIO. Pulido-Reyes G, Tamayo-Belda M, Hurtado-Gallego J, MartínBetancor K, González-Pleiter M, Martin E, Marco E, Leganés F, Rosal R y Fernández-Piñas F. Dpto Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, y Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Alcalá, Madrid, España. En los últimos años, en el Grupo de Toxicología Ambiental de la Universidad Autónoma de Madrid, en conjunción con la Universidad de Alcalá, hemos estado involucrados en la evaluación de la toxicidad de distintos compuestos diseñados y sintetizados en la escala nanométrica, los llamados comúnmente como NanoMateriales (NMs). Hasta la fecha, hemos utilizado distintas nanopartículas de Fe (de tipo cero-valente y otras superparamagnéticas), diferentes nanopartículas de óxido de Cerio, dendrímeros de varios tamaños y composición, así como otros materiales de estructura metalo-orgánica. Con ellos, no sólo se ha evaluado su (eco)toxicidad usando diferentes organismos fotosintéticos (como cianobacterias y algas verdes), sino que

también se han evaluado sus posibles mecanismos de acción tóxica. Asimismo, hemos construido diferentes biosensores basados en cianobacterias con el objetivo de detectar estrés oxidativo intracelular tras la exposición a los NMs y disolución de iones metálicos de NMs metálicas. De entre todos los NMs, hemos prestado especial interés a las nanopartículas de óxido de cerio, debido a su gran bioactividad y sus peculiares propiedades redox. ¿Existe algún factor clave que explique la toxicidad de estas nanopartículas? ¿Todas las nanopartículas de cerio se comportan igual? ¿Cuáles son los efectos biológicos específicos que presentan? Estas y otras cuestiones han sido resueltas gracias al estudio en profundidad de los parámetros fisicoquímicos que presentan las nanopartículas tanto en condiciones ideales, como en condiciones más realistas desde un punto de vista biológico. De igual forma, usando diversos parámetros biológicos como la fotosíntesis, el estrés oxidativo intracelular, la integridad de membrana, entre otros, hemos evaluado los efectos que producen estas nanopartículas en los organismos utilizados. Por último, aprovechando las particularidades redox que presentan estas nanopartículas, hemos ahondado en su faceta como agente antioxidante. LOS METALES Y SU REPERCUSIÓN EN EL MEDIOAMBIENTE ESTRATEGÍAS GENÓMICAS DE ADAPTACIÓN A ESTRÉS EXTREMO INDUCIDO POR METAL EN EL CILIADOMODELO Tetrahymena thermophila. de Francisco P, Martín-González A y Gutiérrez JC. Dpto. Microbiología-III. Facultad de Biología. Universidad Complutense (UCM). 28040 Madrid. Durante más de 2 años, cultivos de T. thermophila han sido expuestos a concentraciones crecientes de Cd2+, Cu2+ o Pb2+, hasta alcanzar la concentración máxima tolerada. Igualmente, se ha obtenido una cepa knockout en el gen MTT1 (MTT1KO), una cepa knockdown en el gen MTT5 (MTT5KD) y una cepa doble mutante MTT1KO + MTT5KD. En estas cepas se ha estudiado por RT-PCR cuantitativa la expresión relativa de las 5 isoformas génicas (MTT1, MTT3, MTT5 y el par MTT2/4) presentes en el genoma de este ciliado. Igualmente, se ha calculado el número copias de estos genes por PCR cuantitativa. Las conclusiones generales que podemos destacar referidas a los cambios genéticos ligados al proceso de adaptación al estrés por metales son: 1- En la cepa adaptada al Cd2+, hemos detectado, por primera vez en ciliados, un incremento rápido y reversible del número de copias (≈ 5 copias/una CdMT, lo que se traduce en una sobre-expresión de este gen en presencia de Cd2+. El incremento del número de copias afecta al fragmento sub-cromosómico macronuclear completo, que incluye también al gen MTT3. Aunque éste no se sobre-expresa como el MTT1, lo que sugiere elementos reguladores de la expresión génica diferentes para ambos. 2- En las cepas adaptadas al Cu2+ o al Pb2+ se detecta una sobre-expresión de los genes MTT2/4 o MTT5, respectivamente. 3- La cepa MTT1KO presenta un valor de CL50 (Cd2+) aproximadamente la mitad que el control, revelando la relevancia del gen MTT1 en la destoxificación del Cd2+. 4- No se pudo aislar una cepa MTT5KO estable, obteniéndose por el contrario una cepa MTT5KD (con una ploidía-Ma estimada para el gen MTT5 = 1n). Esto revela que el gen MTT5 es un gen esencial, siendo la primera vez que un gen de metalotioneina se manifiesta como esencial. 5- En la cepa MTT5KD, se ha detectado la presencia en su genoma de dos nuevas isoformas (MTT1a y MTT1b), derivadas de la recombinación genética entre dos copias del gen MTT1. Por primera vez en microbiología, se muestra una nueva estrategia de adaptación genómica contra el estrés originado por la pérdida de un gen esencial. LA BIOACUMULACION DE METALES PESADOSY METALOIDES COMO FACTOR DE RIESGO PARA LAS COMUNIDADES DEL BENTOS FLUVIAL Rodríguez P1, Méndez-Fernández, L1 y Martínez-Madrid M2. 1Dpto. Zoología y Biología Celular Animal, Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Sarriena s/n, Leioa 48940. 2Dpto . Genética , Antropología Física y Fisiología

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Animal, Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Sarriena s/n, Leioa 48940. El objetivo general de este estudio es el desarrollo de criterios de calidad en tejido de macroinvertebrados fluviales que permita realizar una evaluación de riesgo para las comunidades del bentos. La bioacumulación de As, Cu, Hg, Ni y Se en 10 taxones de macroinvertebrados representativos de diferentes grupos funcionales se ha utilizado para establecer los valores de referencia para la cuenca del río Nalón (Asturias). Los taxones elegidos forman parte de 5 grupos funcionales (depredadores, fragmentadores, fitófagos raspadores, detritívoros, filtradores de materia particulada gruesa y fina) de la comunidad del bentos. Dichos niveles derivados de la condición de referencia se utilizan como herramienta de evaluación de riesgo de bioacumulación en localidades afectadas en distinto grado por contaminación de metales y metaloides, y como criterio de calidad para la gestión del medio fluvial. El modelaje de los datos de concentración en tejido en relación con las alteraciones de las comunidades permite realizar propuestas de criterios de calidad de bioacumulación para la protección de las comunidades fluviales. POTENCIAL ECOTÓXICO DE LOS RESIDUOS DE UNA EXPLOTACIÓN MINERA A CIELO ABIERTO SIN ACTIVIDAD Cano Rodríguez ME, Gómez Bujedo S y Lhoëst Mathijsen F. Facultativo del instituto nacional de toxicología y ciencias forenses de Sevilla, Servicio de Valoración Toxicológica y Medio Ambiente. El objeto de esta ponencia es el estudio de los residuos producidos en una explotación minera a cielo abierto perteneciente a la Faja Pirítica Ibérica, que no cuenta con actividad en la actualidad, y el potencial ecotóxico de dichos residuos. La actividad de la mina se centraba en la explotación, principalmente, de sulfuros polimetálicos (cobre, plomo y zinc, además de oro y plata). En los diferentes procesos mineros, las aguas utilizadas, los residuos minerales y los ácidos usados para separar los distintos componentes han sido almacenados en balsas para ser, posteriormente, sometidos a un proceso de decantación. Una vez depuradas, las aguas (previo paso por una planta depuradora) se vertían al río coincidiendo con épocas de lluvias. En este trabajo se llevan a cabo estudios de campo, dadas las condiciones de abandono de la mina, donde se procede a toma de muestras líquidas, de tierras, residuos y lixiviados en distintos puntos (cortas, balsas, contraembalses, vertederos, depuradoras…). Las muestras son sometidas a análisis de metales y estudios de ecotoxicidad aguda. Los datos obtenidos demuestran la existencia de residuos en las instalaciones que requieren control, gestión y depuración de sus lixiviados. ESTUDIO DE LA FAUNA BENTÓNICA EN EL ENTORNO DE UNA EXPLOTACIÓN MINERA Gómez Bujedo S, Cano Rodríguez ML, Lhoëst Mathijsen, F. Facultativo del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses de Sevilla. Servicio de Valoración Toxicológica y Medio Ambiente Con objeto de evaluar el estado ecológico de un curso de agua próximo a una explotación minera a cielo abierto de la Faja Pirítica Ibérica, se ha realizado el estudio de su fauna bentónica acompañado del análisis de parámetros fisicoquímicos y de estudios de ecotoxicidad. En esta ponencia se pone de manifiesto la correlación existente entre la alteración en la fauna bentónica estudiada como indicador de calidad de aguas superficiales (índice IBMWP) y la variación de los parámetros fisicoquímicos in situ (pH, conductividad, oxígeno disuelto) y en laboratorio (pH, conductividad, metales) y los resultados en los test de ecotoxicidad en ensayos de Inhibición de luminiscencia en Vibrio fischeri y ensayos de toxicidad aguda en Daphnia magna.

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Toxicología ÓRGANO OFICIAL DE LA ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE TOXICOLOGIA

INSTRUCCIONES A LOS AUTORES

Los manuscritos, en español o inglés, se someterán por el editor a dos expertos que actuarán como revisores externos a la revista, cuyas observaciones se trasladarán al autor para la reescritura del original en caso de ser aceptados. El texto debe ser claro y conciso, cuidando la ortografía y la utilización de abreviaturas (SI). Tanto la forma como el contenido deberán ser cuidadosamente revisados antes de su envío. Se utilizará interlineado a doble espacio, letra tipo Times New Roman de 12 puntos, sin sangrías en los párrafos, con justificación completa, con márgenes amplios, en tamaño DIN A4, preferiblemente en archivo Word. Todas las páginas irán numeradas correlativamente.

Conclusiones. Breves obtenidas directamente del trabajo. Agradecimientos. Si fueran necesarios, particularmente a las entidades financiadoras. Bibliografía. La exactitud de las referencias bibliográficas es responsabilidad de los autores. Sólo deberían incluirse referencias relacionadas estrechamente con el trabajo. Todas las referencias listadas deben ir citadas en el texto. Las referencias bibiográficas se referencian en el texto con el apellido del autor y año de publicación si el autor de la obra es uno solo (Font, 2005). En caso de ser dos los autores de la publicación se citarán los apellidos de ambos (Font y Ruiz, 2009). Si son tres o más los autores se pondrá el apellido del primer autor et al., año (Tolosa et al., 2013). Las referencias a distintos trabajos en una misma cita se separan con punto y coma y son ordenadas cronológicamente: (Rodriguez et al., 2012; Serrano et al., 2013). Si existieran varias referencias de un autor/es o autora/s en un mismo año se consignarán con las letras a, b, c, etc., después del año. En el apartado de bibliografía se recogen todas las referencias por orden alfabético y del modo indicado a continuación. La bibliografía irá citada de la siguiente forma: 1. Artículos de revistas.Estructura general: Autor/es. Título del artículo. Abreviatura internacional de la revista. Año; volumen (número), página inicial-final del artículo.

Manuscritos en español: Título, Apellido/s e inicial/es del nombre del autor/es, Institución/es, Resumen, Palabras Clave, Title, Abstract, Key Words, Introducción, Material y Métodos, Resultados, Discusión, Conclusiones, Agradecimientos, Bibliografía, Tablas, Leyendas de las Figuras.

Ejemplo: Tolosa J, Font G, Mañes J, Ferrer E. Presencia de micotoxinas Fusarium en pescado de acuicultura. Rev. Toxicol. 2013; 30 (2), 193-197.

Manuscritos en inglés: Title, Family name/s and First name/s initial/s, Abstract, Key Words, Título, Resumen, Palabras Clave, Introduction, Materials and methods, Results, Discussion, Acknowledgements, References, Tables, Leyends of figures.

Estructura general: Autor/es.Título del libro. Edición. Lugar de publicación: Editorial; año. La primera edición no es necesario consignarla. La edición siempre se pone en números arábigos y abreviatura: 2ª ed. Si la obra estuviera compuesta por más de un volumen, debemos citarlo a continuación del título del libro: Vol. 3.

El manuscrito se estructura, por tanto, en los siguientes apartados (por favor, no use mayúsculas más que en la primera letra del título y apartados):

-Capítulo de libro.

Título descriptivo del artículo (no en mayúsculas) y Title, además de una versión corta del título. Apellido/s e inicial/es del nombre del autor/es. Institución/es donde se ha realizado el trabajo, distinguiéndolas con numerales en superíndice. Marcar con un asterisco el autor de contacto e incluir su correo electrónico, teléfono y fax. Resumen y Abstract. Las versiones en español e inglés serán lo más informativas posible, en un solo párrafo, con una pequeña introducción, la identificación de los métodos, los resultados abreviados y particularmente las conclusiones del trabajo. Su lectura dará una idea clara del mismo. Ninguno debe sobrepasar las 250 palabras ni incluir abreviaturas, referencias o tablas.

2. Libros y otras monografías.-

Autor/es del capítulo. Título del capítulo. En: Director/Coordinador/Editor del libro. Título del libro. Edición. Lugar de publicación: Editorial; año. Página inicial-final del capítulo. Ejemplo: Cameán AM, Repetto M. Introducción y conceptos. En Cameán AM, Repetto, M. (Eds.), Toxicología alimentaria. Díaz De Santos, Madrid, España. 2006. p.1-18. -Comunicación presentada a un congreso. Autor/es de la Comunicación/Ponencia. Título de la Comunicación/Ponencia. Título oficial del Congreso. Publicación. Editorial; año. Página inicial-final de la comunicación/ponencia.

Palabras Clave y Key Words tras cada resumen, con hasta cinco palabras separadas por punto y coma.

Ejemplo: Saladino, F., López, M., Manyes, L., Fernández-Franzón, M., Meca, G. El uso de antimicrobianos naturales para el aumento de la vida útil del pan de molde. XXICongreso Español y V Iberoamericano  de Toxicología. Rev. Toxicol. 32 (1). Asociación Española de Toxicología; 2015, p32.

Introducción: descripción de los orígenes y bases del estudio.

3. Material electrónico.- Artículo de revista en Internet.

Material y Métodos. Se evitarán descripciones de todo aquello que pueda encontrarse en la bibliografía citada. Deben describirse de forma concisa los individuos y series estudiados, criterios de selección, procedimientos, duración y número de repeticiones de los ensayos, equipo y materiales utilizados y cuantos datos puedan precisarse para la repetición del estudio. Deben especificarse las técnicas analíticas y los métodos estadísticos. Para sustancias químicas o fármacos se citará el nombre genérico conforme a la IUPAC. Si se utiliza una marca registrada, se hará constar el nombre genérico y el nombre del fabricante.

Autor/es del artículo. Título del artículo. Nombre de la revista [revista en Internet] año [fecha de consulta]; volumen (número): [Extensión/páginas]. Dirección electrónica.

Resultados. Se presentarán las observaciones realizadas, sin interpretarlas, así como el análisis estadístico. Los datos numéricos se pueden presentar en tablas o figuras, pero sin repetirlos entonces en el texto.

Autor/es o Director/Coordinador/Editor. Título [monografía en Internet]. Edición. Lugar de publicación: Editor; año [fecha de consulta]. Dirección electrónica.

Discusión: en ella se considerarán los resultados presentados comparándolos con otros publicados, las razones que apoyan la validez de los mismos, su aplicación práctica y las directrices para nuevas investigaciones. *Los apartados de resultados y discusión pueden redactarse conjuntamente.

Ejemplo: Francés I, Barandiarán M, Marcellán T, Moreno L. Estimulación psicocognoscitiva en las demencias. An Sist Sanit Navar [revista en Internet] 2003 septiembre-diciembre. [Acceso 19 de octubre Disponible en: de 2005]; 26(3). http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/vol26/n3/revis2a.html -Monografía en Internet.

Ejemplo: Moraga Llop FA. Protocolos diagnósticos y terapéuticos en Dermatología Pediátrica. [Monografía en Internet]. Madrid: Asociación Española de Pediatría; 2003 [acceso 19 de diciembre de 2005]. Disponible en: http://www.aeped.es/protocolos/dermatologia/index.htm -Sede Web o Página principal de inicio de un sitio Web.

Autor/es. Título [sede Web]. Lugar de publicación: Editor; Fecha de publicación [fecha de actualización; fecha de acceso]. Dirección electrónica. Ejemplo: Fisterra.com, Atención Primaria en la Red [sede Web]. La Coruña: Fisterra.com; 1990- [actualizada el 3 de enero de 2006; acceso 12 de enero de 2006]. Disponible en:http://www.fisterra.com -Parte de una página de un sitio o sede Web.

Figuras Los pies de las figuras se incluyen en el documento principal del manuscrito, tras las tablas, numerados consecutivamente (1, 2…) y deben ser lo suficientemente descriptivos como para hacerlos comprensibles sin necesidad de consultar el texto.

Título de la página [sede Web]. Lugar de publicación: Editor; Fecha de publicación [fecha de actualización/revisión; fecha de acceso]. Título de la sección [número de páginas o pantallas]. Dirección electrónica.

Las figuras propiamente dichas se envían comprimidas en formato WinZip. Las imágenes se enviarán digitalizadas, preferiblemente en formato TIFF, JPEG o PNG de al menos 300 p.p.p.de resolución (pero no mucho más) para el tamaño final.

Ejemplo: American Medical Association [sede Web]. Chicago: The Association; c1995- 2002 [actualizado 5 de diciembre de 2005; acceso 19 de diciembre de 2005]. AMA Office of Group Practice Liaison;

Dado que actualmente la revista únicamente se edita en versión digital, las figuras deberán enviarse en color. Los símbolos identificadores preferidos en las figuras son círculo, cuadrado y triángulo abiertos o llenos.

[aproximadamente 2 pantallas]. Disponible en: http://www.amaassn.org/ama/pub/category/1736.html. –Base de datos en Internet. Institución/Autor. Título [base de datos en Internet]. Lugar de publicación: Editor; Fecha de creación, [fecha de actualización; fechade consulta]. Dirección electrónica. Ejemplo: PubMed [base de datos en Internet]. Bethesda: National Library of Medicine; 1966- [fecha de acceso 19 de diciembre de 2005]. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ -Parte de una base de datos en Internet. MeSH Browser [base de datos en Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US); 2002 [acceso 19 de diciembre de 2005]. Meta-analysis; unique ID D015201 [aproximadamente 3 pantallas]. Disponible en: http://www.nlm.nih.gov/mesh/MBrowser.html. Ficheros actualizados semanalmente. Para otras situaciones no recogidas en este texto se puede consultar la siguiente dirección http://www.fisterra.com/herramientas/recursos/vancouver/#ejemplos

Las figuras deben tener suficiente calidad. No contendrán los títulos ni referencia a su número ni tendrán innecesariamente espacio en blanco alrededor. Las señales y leyendas se pueden incluir dentro de los ejes de la figura. Las figuras publicadas previamente deben contar con el permiso escrito del titular de los derechos. La redacción de la revista se reserva el derecho de introducir modificaciones en los artículos recibidos, siempre que no alteren el sentido de los mismos, para adaptarlos al estilo de la revista.

Los trabajos se enviarán a través de la plataforma de la revista: http://rev.aetox.es/wp/index.php/envio-articulo/

Tablas

El Equipo Editorial: revista@aetox.es

Deben ser tan claras y simples como sea posible.

Las tablas se incluyen tras la bibliografía, en el documento principal del manuscrito, en páginas independientes, numeradas correlativamente (1, 2…).

Editora: Dra. Guillermina Font Pérez. Universitat de València. Dpto. de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina Legal. Avda. Vicente Andrés Estellés s/n 46100 Burjassot. Valencia

Los títulos deben ser suficientemente descriptivos para hacerlos comprensibles sin consultar el texto.

La información adicional puede incluirse como nota al pie de tabla o figura.

Las tablas debieran ser lo suficientemente cortas para evitar dividirlas.

Editoras adjuntas: Dra. Emilia Ferrer García. Universitat de València Dra. María P. Míguez Santiyán. Universidad de Extremadura Dr. Juan Carlos Rios Bustamante. Pontificia Universidad Católica de Chile

ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE TOXICOLOGÍA Rev. Toxicol. 34 (2), 83-172 (2017) ISSN 0212-7113

Incluido en Scopus, Latindex, REDALYC, REDIB, IBECS, ICYT, Index Copernicus, IME, Recolecta, EMBASE/ Excerpta Medica y Chemical Abstracts

Presidenta: Dra. Ana Cameán Fernández Facultad de Farmacia.Universidad de Sevilla Vicepresidenta: Dra. Mª José Ruiz Leal Facultat de Farmàcia. Universitat de València. Secretaria: Dra. Emma Martínez López. Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia. Tesorera: Dra. Ángeles Jos Gallego. Facultad de Farmacia.Universidad de Sevilla. Internet: http://aetox.es

Dra. Mónica Fernández Franzón (Monica.Fernandez@uv.es) Universitat de València.Valencia

Dr. Tomás Camacho García (atcamacho@lemabandin.com) Laboratorios Lema & Bandín. Vigo.

Dr.Guillermo Repetto Kuhn (grepkuh@upo.es) Universidad Pablo de Olavide. Sevilla.

Dra. Rosario Moyano Salvago (r.moyano@uco.es) Universidad de Córdoba. Córdoba

Dra.Silvia Pichardo Sánchez (spichardo@us.es) Universidad de Sevilla.Sevilla.

Dra. María Luisa Soria Sánchez (luisa.soria@mju.es) Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Sevilla

Dra. Mª José González Muñoz (mariajose.gonzalez@uah.es) Universidad de Alcalá. Madrid.

Dr. Antonio Juan García-Fernández (ajgf@um.es) Universidad de Murcia.Murcia.

Editora: Dra. Guillermina Font Pérez. Universitat de València. Valencia E-mail: Guillermina.font@uv.es

Editores adjuntos: Dra. Emilia Ferrer García. Universitat de València. Valencia E-mail: Emilia.ferrer@uv.es Dra. María P. Míguez Santiyán. Universidad de Extremadura. Cáceres E-mail: mpmiguez@unex.es Dr. Juan Carlos Rios Bustamante Pontificia Universidad Católica de Chile E-mail: jcrios@med.puc.cl