Tecnología de la reproducción humana

Tecnología de la reproducción humana

Las Técnicas de Reproducción Asistida Son las técnicas dirigidas a reproducir el Proceso de fecundación cuando éste fracasa repetidamente de forma natural.

Según su complejidad y alejamiento del proceso natural podemos clasificarlas en: • Coito dirigido (no es propiamente una técnica de RA) • Inseminación artificial (IA) • Transferencia de gametos a la trompa (GIFT) • Fecundación “in vitro” convencional con transferencia de embriones (FIV-ET) • Técnicas de FIV mediante micro manipulación: – Disección parcial de la zona pelúcida (PZD) – Inyección subzonal de espermatozoides (SUZI) – Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)

El coito dirigido Consiste en mantener relaciones sexuales en los días más propicios del mes para gestar. Es una opción de tratamiento, para todos aquellos casos de esterilidad primaria o secundaria en los que el estudio básico no encuentra ninguna patología, en pacientes jóvenes, con poco tiempo de búsqueda de gestación o parejas con esterilidad de origen desconocido que deseen una opción más natural y sencilla antes de someterse a técnicas más complejas.

La técnica consiste en estimular la ovulación con fármacos orales que aumentan la FSH endógena y que por tanto van a inducir un mayor reclutamiento y maduración de ovocitos (Citrato de Clomifeno, por ejemplo:OmifínR ). En ocasiones paralelamente se administra un estrógeno oral que va a mejorar la capacidad del moco cervical para el ascenso de los espermatozoides hacia las trompas de Falopio, así como la proliferación endometrial. Seguiremos el correcto crecimiento folicular con controles ecográficos. Cuando se considere el momento adecuado, procederemos a inducir la ovulación con una ampolla subcutánea de HCG (por ejemplo: OvitrelleR). Se tendrán relaciones sexuales a las 24 y 48 horas de la administración de la HCG. La mayoría de los embarazos logrados con este tratamiento, se consiguen en los primeros 3 o 4 meses, por lo que no es razonable prolongarlo más allá de este número.

Inseminación artificial (IA) La inseminación artificial es una de las técnicas de reproducción asistida más sencillas. Pese a la creencia de que es una tecnología moderna, se piensa que ya en el siglo XV empezaron los primeros intentos de llevar a cabo esta técnica en humanos, aunque la popularidad empezó a adquirirla a partir de los años 70. Cada vez es más común su utilización, se calcula que en España se realizan unas 23.000 inseminaciones anuales y esta cifra aumenta año tras año.

Es un procedimiento sencillo donde el tratamiento es menos invasor que el de otras técnicas más complejas de reproducción asistida, con esta técnica indolora no se requiere anestesia alguna. ¿Qué es?

La inseminación artificial consiste en la deposición de los espermatozoides de una forma no natural en el

útero de la mujer durante su periodo ovula torio con el objetivo de conseguir un embarazo.

La inseminación artificial (IA) es ampliamente utilizada, dependiendo del lugar exacto del aparato reproductor femenino dónde se realiza la deposición de los espermatozoides encontramos diferentes tipos de inseminación artificial:     

Inseminación Inseminación Inseminación Inseminación Inseminación

artificial Intratubárica artificial Intracervical artificial Intravaginal artificial Intrafolicular artificial Intrauterina

La inseminación artificial Intrauterina es la más utilizada, ya que obtiene los mejores resultados, y prácticamente es la única que se utiliza, los otros tipos sólo se utilizan en el caso de que no sea posible una canalización del cérvix uterino.

También existe otra clasificación dependiendo del origen de la muestra de semen. Si el semen es de la pareja (Inseminación Artificial Homóloga, IAH o Inseminación Artificial del Cónyuge, IAC) o en el caso de mujeres solas, lesbianas,

o parejas con un factor masculino severo deben recurrir al semen de donante, por tanto hablaríamos de una Inseminación artificial de donante (IAD).

En el siguiente vídeo se muestra cómo se realiza una inseminación artificial:

Indicaciones Esta técnica de reproducción asistida se emplea en diversos casos, a la hora de ver a qué pacientes va dirigida es importante diferenciar entre los tipos de inseminación artificial. La información acerca de este tema la encontrarás también en el artículo “Indicaciones de la Inseminación Artificial“.

Inseminación artificial del cónyuge (IAC)     

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Esterilidad femenina por factor cervical.

Endometriosis leve o moderada.

Alteraciones en el ciclo ovula torio: en los casos de síndrome de ovario poli quístico(SOP), anovulación o problemas en la fase folicular.

Imposibilidad de depositar el semen en la vagina: eyaculación retrógrada, vaginismo, eyaculación precoz, impotencia sexual.

Factor masculino leve: alteración en los parámetros seminales, aunque no debe ser muy grande, ya que se requiere un mínimo de espermatozoides para poder realizar la IA con garantías.

Esterilidad de origen desconocido: cuando los análisis previos no muestran ninguna patología determinada y los pacientes tienen parámetros de una fertilidad normal, se recomienda empezar con la IA. A pesar de que en un primer momento no se haya diagnosticado una patología no significa que no exista, sino que no se ha podido diagnosticar con las analíticas realizadas.

Esterilidad de causa inmunológica: incompatibilidad entre el aparato reproductor femenino y el esperma. Generalmente se produce por la fabricación de anticuerpos por parte de la mujer que destruyen los espermatozoides. Esta causa no es muy habitual y todavía no se conoce exactamente el mecanismo mediante el cual funciona.

Inseminación artificial de Donante (IAD) En el caso de los tratamientos de parejas, se recurre a semen de donante como última opción, siempre se debe intentar primero utilizar el esperma del paciente.    

Mujeres solas o parejas lesbianas.

Enfermedades genéticas del hombre que no se pueden diagnosticar medianteDGP. Factor masculino severo: si tras varios ciclos de ICSI no se ha conseguido una gestación y las características de la mujer son favorables a esta técnica.

Enfermedades de transmisión sexual en el varón: si tras varios lavados no se puede garantizar que no haya virus en el semen.

Requisitos Para que una pareja pueda someterse a una inseminación artificial se deben cumplir unas condiciones mínimas que determinen que esta técnica funcionará correctamente.

En primer lugar se debe descartar el riesgo de una posible Hepatitis C o Hepatitis B, del VIH, la Rubeola, la Sífilis y la Toxoplasmosis. Para garantizar que no hay riesgo de contagio a la pareja y/o al futuro bebé.

Una vez garantizada la seguridad es necesario que se compruebe la permeabilidad tubárica de la mujer, mediante diversas técnicas como histerosalpingografía (HSG) o laparoscopia se puede observar que las trompas de Falopio son funcionales.

En el caso del hombre es necesario que tenga un mínimo de espermatozoides, se requiere un REM (recuento de espermatozoides móviles) que se encuentre por encima de los 3 millones de espermatozoides móviles progresivos después de la capacitación.

Proceso La inseminación artificial es una técnica sencilla dentro de la reproducción asistida.

Consiste en estimular suavemente a la mujer y el día que se produce la ovulación introducirle el semen capacitado en el útero. A continuación explicaremos paso a paso este proceso.

Ciclo ovárico controlado Es necesario saber en qué momento exacto del ciclo ovula torio se encuentra la mujer para así poder programar el ciclo y saber en qué preciso instante se debe realizar la inseminación.

En las mujeres que ovulan sin problemas no es necesaria una estimulación del ciclo ovárico, pero sí que es recomendable ya que aumenta la posibilidad de conseguir el embarazo.

Para la estimulación ovárica se utilizan una serie de hormonas, las más utilizadas son las gonadotropinas. Es recomendable controlar el número de folículos que

se han estimulado, porque un número elevado puede producir gestaciones múltiples. Por este motivo la estimulación debe ser suave y estar controlada continuamente.

Inducción de la ovulación (hCG) Una vez se observa que los folículos tienen el desarrollo óptimo (18 mm de diámetro) se administra la hormona hCG para desencadenar la ovulación, la ovulación se produce tras las 36-48 horas siguientes.

Por lo tanto una vez administrada la hCG debe estar programada la inseminación dentro de este rango de horas, algunas clínicas realizan dos inseminaciones seriadas para así cubrir mejor la ovulación.

Capacitación del semen Para obtener la muestra de semen en buenas condiciones es aconsejable que el hombre haya guardado 4 días de abstinencia. En el caso de semen de donante la clínica se encargará de que sea el semen idóneo para la inseminación.

La muestra de semen debe capacitarse, mediante esta técnica se eliminan proteínas y otros restos del semen y sólo quedan los espermatozoides que tienen una buena movilidad.

Inseminación intrauterina Dentro del rango horario en el que se produce la ovulación se realiza la inseminación propiamente dicha. Se recogen los espermatozoides capacitados en una cánula y se inyectan en el cérvix de la mujer, se puede realizar directamente o guiado por ecografía de forma que la paciente también pueda verlo. Este procedimiento es indoloro y por precaución tras 1 hora de reposo después de la inseminación, la mujer abandona la clínica y puede hacer vida normal.

Apoyo a la fase lútea Generalmente se administra progesterona vía vaginal para dar un soporte a la fase lútea de forma que sea más fácil que se produzca la implantación del embrión.

En el artículo “Proceso de la Inseminación Artificial” se numeran uno a uno los distintos pasos que se siguen en esta técnica.

Resultados En los resultados de la IA intervienen muchos factores como la edad de la mujer, el grosor de su endometrio, la calidad del esperma, el tiempo de esterilidad… Es muy importante incluir en este tratamiento a los pacientes adecuados.

La eficacia de los resultados varía entre las clínicas, la tasa de embarazo de una mujer menor de 35 años que se realiza un ciclo con el semen de su cónyuge varía entre el 13-25% dependiendo del centro. Mientras que en el caso de semen de donante esta cifra ronda entre el 18-29%.

Diversos estudios demuestran que es recomendable realizar una serie de inseminaciones seriadas si no se consigue el embarazo. Lo más recomendable es realizar 4 ciclos de inseminaciones, si no se produce la gestación se debe pasar a otra técnica de reproducción asistida. La tasa acumulativa de embarazo en estos cuatro ciclos es de 50-60% de embarazo con semen de la pareja y de 6070% con semen de donante.

Si quieres ver un resumen de todos estos datos puedes consultar el artículo sobre los “Resultados de la Inseminación Artificial“.

Ventajas La principal ventaja de la inseminación artificial es que es una técnica sencilla, en el caso de la mujer es

importante, ya que en este procedimiento no se requiere una intervención quirúrgica, como en el caso de la FIV, y por tanto no es necesaria la anestesia ya que el procedimiento es indoloro.

Otra ventaja importante es el coste, al ser una técnica menos compleja el precio también disminuye considerablemente al compararlo con otros tratamientos que requieren un mayor instrumental o equipo médico.

Problemas Aunque cada vez es menor el número de problemas asociados a la inseminación artificial en ocasiones se pueden producir varias complicaciones como: Síndrome de Hiperestimulación ovárica: se produce por un exceso en la respuesta de los folículos a las hormonas, las estimulaciones en IA suelen ser suaves, y en todo momento se vigila mediante ecografía cuando se produce un riesgo de hiperestimulación se cancela el ciclo.

Embarazo múltiple: debido a la estimulación de varios folículos se pueden producir gestaciones múltiples sobretodo en mujeres jóvenes, las clínicas cada vez se esfuerzan más en evitar esta situación, ya que una gestación múltiple implica muchos riesgos durante el embarazo y el parto. En mujeres menores de 35 años debería cancelarse la administración de hCG si existen más de 5 folículos de 12mm o más

Transferencia de gametos a la trompa (GIFT) El GIFT (Transferencia de Gametos a la Trompa) es un método de reproducción asistida dirigido a parejas infértiles. Su finalidad es que los espermatozoides fecunden óvulos en su sitio natural, la trompa de Falopio.

Como se comprenderá, es requisito indispensable que al menos una trompa esté sana. El GIFT está especialmente indicado en parejas en que se ha probado la capacidad fecundante de los espermatozoides.

También está indicado en la infertilidad de causa desconocida, y en los casos con alteraciones seminales leves.

1. Estimulación de la ovulación

Durante un ciclo ovula torio espontáneo, de todos los folículos (estructura del ovario en cuyo interior están los ovocitos) seleccionados en cada mes (aproximadamente 10), sólo uno alcanza la madurez. El resto de los folículos se reabsorben y nunca más serán usados por el ovario. Así, sólo un ovocito participa del proceso reproductivo en cada ciclo. En ocasiones extraordinarias, se seleccionan más de un folículo, con la consiguiente producción de más de un ovocito. Estos son los casos en que pueden producirse gemelos no idénticos en forma espontánea.

El objetivo de la estimulación de la ovulación es reclutar un mayor número de ovocitos en ambos ovarios y evitar la reabsorción de la cohorte de folículos que acompaña al dominante. Esto permite disponer de un mayor número de ovocitos los que una vez aspirados del ovario, puedan ser fecundados. ¿Por qué se requiere más de un ovocito? Dependiendo de la edad de la mujer, algunos ovocitos producidos espontáneamente tienen alteraciones cromosómicas, que no impiden su fecundación pero impiden la implantación y el normal desarrollo del embrión.

La frecuencia de alteraciones cromosómicas aumenta con la edad de la mujer llegando a aproximadamente un 70% de los ovocitos producidos en mujeres de 40 o más años. Considerando que ya que, no todos los ovocitos podrán ser fecundados, no todos los ovocitos fecundados llegarán a ser embriones y no todos

los embriones llegarán a implantarse, es que se intenta fecundar más de un ovocito.

Al fecundar más de un ovocito, se tendrá más de un embrión. Al tener más de un embrión existe una probabilidad mayor, que uno de ellos esté normalmente constituido y pueda implantarse. Es por ello que al transferir más ovocitos, aumenta la probabilidad de embarazo. Esto sin embargo, también aumenta la posibilidad de un embarazo múltiple.

Métodos de estimulación hormonal. La estimulación hormonal consta de dos etapas. La primera consiste en bloquear las descargas de LH de la hipófisis de la mujer. Esto se logra con inyecciones subcutáneas diarias de agonistas y/o antagonistas de factores hipotalámicos (GnRH). También puede usarse en inyecciones de depósito o inhalaciones. Una vez bloqueada la hipófisis de la mujer, se inicia la segunda etapa que consiste en estimular hormonalmente los ovarios de la mujer. Las drogas más usadas para la estimulación de la ovulación, son una combinación de las dos hormonas con que la hipófisis normalmente estimula al ovario. Estas son: la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona lutineizante (LH), llamadas genéricamente HMG. También se cuenta con FSH pura lograda mediante tecnología de DNA recombinante. Dependiendo del caso, en algunas oportunidades se usa una combinación de anti estrógenos (citrato de clomifeno-Serofene) en asociación con HMG. A veces los medicamentos usados pueden provocar algún efecto secundario leve como dolor de cabeza, cambios en el estado de ánimo, inflamación abdominal, aumento gradual de peso. Sin embargo si se llegara a presentar síntomas como visión borrosa, dolor de cabeza intenso o aumento acelerado de peso es indispensable informar a su médico.

La estimulación de la ovulación dura entre 10 y 12 días. Durante este período y para evaluar el crecimiento y desarrollo de los folículos, se hace un seguimiento ecográfico. Esto consta de 3 a 4 ecografías transvaginales y se toman algunas muestras de sangre (no se requiere ayuno) para medir el nivel de Estradiol (hormona producida por el folículo) el que aumenta a medida que los folículos crecen.

Cuando la mayoría de los folículos ha alcanzado un tamaño promedio de 18 - 20 milímetros, se inyecta una hormona llamada HCG que es la hormona encargada de terminar la maduración folicular. Alrededor de 36 horas post HCG se programa la aspiración folicular.

2.- Aspiración folicular La aspiración folicular es un procedimiento que tiene por objeto extraer los ovocitos del interior de los folículos. Se realiza mediante la punción del ovario con una aguja que se introduce a través de la vagina y guiada al interior de los folículos mediante visualización ecográfica. Este es un procedimiento ambulatorio

que requiere de anestesia local y a veces general dependiendo de la paciente y de la localización topográfica de los ovarios.

La paciente debe hospitalizarse en ayunas una hora antes del procedimiento.

Inmediatamente después de obtenidos los ovocitos, son clasificados morfológicamente y guardados en la incubadora en cápsulas que contienen medio de cultivo y que han sido previamente rotuladas con el nombre de la paciente. La aspiración folicular demora aproximadamente 30 minutos.

El marido puede traer la muestra de semen (obtenida por masturbación) directamente de su casa o producirla en el laboratorio. Si la muestra de semen es traída de la casa, ésta debe ser entregada en el laboratorio idealmente dentro de una hora de producida y mantenida a temperaturas no inferiores a 20 grados Celsius. El semen es procesado en el laboratorio con el objeto de lograr extraer del semen y concentrar en medios de cultivo (igual al de los ovocitos), una subpoblación de espermatozoides móviles, que en dicho medio, adquirirán la capacidad de fecundar.

Después de la aspiración folicular se puede presentar un pequeño dolor abdominal que cede con el uso de analgésicos y desaparece en el transcurso del día.

También puede haber sangrado vaginal. Sin embargo si se presenta fiebre, dolor agudo, o sangrado excesivo, debe informarse al médico de inmediato.

3.- Laparoscopía A continuación de la aspiración de los folículos se realiza una laparoscopía con la paciente bajo anestesia general y durante este procedimiento se introduce un fino catéter por una de las trompas, que en su interior contiene los óvulos y espermatozoides separados por una burbuja de aire.

Al día siguiente, la mujer recibe apoyo hormonal diario con progesterona. La vía de administración puede ser intramuscular o vaginal y ocasionalmente por vía oral.

El suplemento hormonal se mantiene diariamente hasta la detección de embarazo.

Si la mujer está embarazada el suplemento con progesterona se continúa por otras cinco semanas. Si bien no está absolutamente demostrado, existen algunas evidencias que sugieren que la implantación embrionaria y el mantenimiento del embarazo se ven favorecidas por el uso de progesterona suplementaria.

Catorce días después del GIFT puede medirse en la sangre de la mujer una hormona (ß-HCG) que permite documentar la presencia de embarazo. Esta hormona duplica su valor cada 1,5 a 2 días. De esta manera, mediciones seriadas pueden aportar información útil relativa a la calidad de la gestación antes de ser visible con ecografía transvaginal 21 días después del procedimiento.

Eficiencia del procedimiento GIFT La eficiencia puede medirse en la proporción (tasa) de mujeres que logra un embarazo luego de haber aspirado sus folículos o de haber transferido óvulos y espermatozoides a la trompa. Sin embargo, considerando que la proporción de abortos espontáneos es de alrededor de 15%, la forma más real de evaluar la eficiencia es indicando la proporción de partos o nacidos vivos por cada cien ciclos de aspiración folicular y trasferencia de gametos (óvulos y espermatozoides).

La eficiencia de los procedimientos está determinada por la calidad de los profesionales y el equipamiento del centro. Sin embargo, existen condiciones que afectan las posibilidades de embarazo independiente de la calidad del centro.

Estas son el número de óvulos que logra transferirse a la trompa y la edad de la mujer.

Complicaciones más frecuentes del procedimiento GIFT Hiperestimulación ovárica Es una respuesta exagerada del ovario a la estimulación de la ovulación, en que el número de folículos en crecimiento es mucho mayor que el deseado. Se caracteriza por un aumento del tamaño de los ovarios y hay distensión abdominal por retención de líquido. Ocurre en 1 a 5% de los ciclos estimulados. Esta probabilidad esta aumentada en mujeres jóvenes con síndrome de ovario poli quístico. Cuando la hiperestimulación es severa se pueden producir alteraciones de la coagulación, daño renal, hemoconcentración, colección líquida abdominal y aún torácica. Esto es una condición transitoria que a veces requiere hospitalización para una mejor vigilancia.

Ocasionalmente, se requiere drenar el líquido acumulado en la cavidad abdominal para aliviar la distensión.

El conocimiento actual y el acceso a mediciones rápidas de la hormona femenina (Estradiol) así como la ecografía, permite en la mayoría de los casos predecir este cuadro con suficiente anticipación. Cuando esto es así, se recomienda cancelar el ciclo de estimulación no dando la inyección de HCG o usando albúmina endovenosa durante la aspiración folicular.

Embarazo tubario Es la implantación del embrión en la trompa. Este diagnóstico se puede hacer alrededor de 21 días después de la transferencia de los gametos a la trompa, cuando por ecografía se puede ver el saco gestacional. Esta complicación ocurre en alrededor de 4% de los casos. Si el diagnóstico es de certeza, éste debe ser resuelto de inmediato, ya sea a través de cirugía por laparoscopía o en ciertos casos mediante la administración de una droga quimioterapia llamada

Metotrexate. Este medicamento inhibe la multiplicación celular del embrión, con lo que disminuye el riesgo de ruptura tubárica.

Torsión ovárica El ovario hiperestimulado puede duplicar o triplicar el tamaño de un ovario normal.

El peso aumentado y la distensión abdominal, pueden facilitar su torsión, estrangulando el sistema vascular lo que origina intensos dolores cólicos. Si el cuadro no se resuelve espontáneamente, se produce necrosis (muerte celular) destrucción y hemorragia ovárica. Es una emergencia médica que requiere de solución inmediata. El tratamiento de esta situación es quirúrgico, por laparoscopía ya sea destorciendo el ovario, que rápidamente recupera su vitalidad o extirpando el ovario cuando el compromiso circulatorio es tan extenso que no permite la sobrevida del mismo. Esta patología se presenta en menos de un 1% de los casos.

Otras complicaciones Algunas complicaciones locales derivadas de la punción transvaginal durante la aspiración folicular aunque de muy baja ocurrencia, son hemorragia por lesión de la pared vaginal, infección pelviana (absceso tubo ovárico) sangrado ovárico y finalmente lesiones de las estructuras vecinas tales como intestino.

Defectos de nacimiento El porcentaje de malformaciones de los recién nacidos producto de esta técnica, no es mayor que el de la población general. En la información publicada a nivel mundial y latinoamericana, las tasas de malformaciones no superan la encontrada luego de reproducción espontánea (2 a 2.4% de los nacidos examinados).

Embarazo múltiple La tasa de multigestación es una consecuencia directa del número de ovocitos transferidos y de la edad de la mujer La tasa global de multigestación es 29%.

Esto significa que de cien embarazos, 29 se inician con dos o más sacos gestacionales. Un 10% de estos reducirá espontáneamente un saco, evento que ocurre habitualmente antes de la semana 12 de gestación. Dependiendo del acceso a centros hospitalarios adecuados y de las condiciones físicas de la mujer, el devenir del embarazo gemelar para la madre y para los bebés, no debiera reportar grandes diferencias respecto a gestaciones únicas. Sin embargo, la gestación triple y cuádruple se asocian a mayor tasa de abortos, muertes fetales en útero, partos prematuros y mayor morbimortalidad neonatal. La prematuridad y las complicaciones neonatales determinan en muchos casos, severas secuelas para los nacidos de gestaciones triples y más. La única manera de disminuir la tasa de multigestación es disminuyendo el número de ovocitos a transferir con el consiguiente impacto en las tasas de gestación. Este tema debe ser discutido extensamente entre el equipo de profesionales y la pareja.

En ocasiones, el número de ovocitos recuperados del ovario es mayor del que la mujer puede o desea usar. El destino de los ovocitos remanentes debe ser decidido por la mujer. En general pueden optar por donarlos a receptoras, al laboratorio o puede también eliminarlos.

Destino de los ovocitos remanentes Donación al laboratorio Los ovocitos donados en este caso son utilizados para investigación, en cuyo caso debe ser especificado que tipo de investigación se desarrollará con los gametos.

Donación a otra paciente (receptora) La donación de óvulos se realiza a parejas heterosexuales en que la mujer no tiene ovarios por razones genéticas, quirúrgicas o por radioterapia en tratamientos de cáncer. También se realiza en mujeres con falla ovárica prematura (menopausia precoz). Es decir, mujeres que nacieron con un número menor de óvulos y por ello su menopausia será prematura.

También la donación está indicada, cuando la mujer es portadora de alguna enfermedad ligada a genes que, de ser transmitida, ocasionarían enfermedades severas en la descendencia. Los óvulos donados son inseminados con los espermatozoides del marido/pareja de la paciente que los recibe.

Cualquiera sea la decisión de la paciente, esto debe ser respaldado por la forma de un consentimiento informado.

Costos y honorarios Se entregará un presupuesto que incluye los honorarios médicos, así como los costos del seguimiento ecográfico con las determinaciones hormonales, y la hospitalización tanto para la aspiración folicular y la transferencia de gametos a la trompa.

No incluye medicamentos que se señalarán cuando se comience la estimulación ya que cada paciente tiene una estimulación particular.

Fecundación “in vitro” convencional con transferencia de embriones (FIV-ET) La historia de la medicina contemporánea se conmovió en 1978(1) cuando en Inglaterra el ginecólogo Patrick Steptoe y el biólogo Robert Edwards dieron a conocer al mundo el nacimiento de Louise Brown, primer ser humano vivo del planeta tierra consecuencia de la fusión extracorpórea de gametos. Sin duda alguna este hito se constituyó en el acontecimiento científico más importante de las últimas décadas. Eventos médicos que hicieron noticia universal en la historia tales como el advenimiento de la píldora anticonceptiva o el primer transplante de corazón, por ejemplo, no tuvieron la trascendencia científica ni despertaron el interés generalizado de esta primera fertilización in vitro (FIV) y transferencia embrionaria (TE) exitosas.

Es evidente que tal acontecimiento tuviera relevante importancia ya que en él están involucrados diferentes aspectos controversiales en los campos experimental, científico, médico, social, religioso, legal, ético, moral, económico, etc., y esa memorable fecha no solamente marcó la culminación exitosa de procesos investigativos relacionados a la FIV, iniciados en animales de experimentación por Walter Heap a finales del siglo XIX(2) y Chang(2) a mediados del siglo pasado fundamentalmente, sino también a dos lustros de extensos estudios de fecundación extracorpórea en la especie humana realizados por Steptoe y Edwards. Por otro lado, se dio inicio a una nueva era en el entendimiento de la biología de la reproducción sobre bases verdaderamente científicas, dejando en el pasado una larga lista de falsas creencias, mitos e inclusive supercherías que durante mucho tiempo hicieron presa fácil de las parejas imposibilitadas de tener descendencia por medio naturales dando inicio a la aparición vertiginosa de un sin fin de técnicas de reproducción asistida (TRA), actualmente al alcance de todas o de la gran mayoría de parejas infértiles.

La función reproductiva de la mujer ha sido considerada como su mayor expresión humana ya que el dar vida a otro ser es el proceso que ha definido su existencia,

de tal manera que las TRA se han convertido en alternativas reales para solucionar aquellos problemas que interfieren en una función reproductiva alterada por diversos factores hasta dos décadas insolubles. Para su práctica es de suma importancia disponer de un grupo profesional multidisciplinario y altamente calificado que sea capaz de llevar a efecto exitosamente cada una de las etapas del programa.

EQUIPAMIENTO DEL LABORATORIO PARA FIV En resumen, la FIV-TE es un procedimiento de fecundación médicamente asistida aplicado a parejas infértiles, que tiene como finalidad que los espermatozoides fertilicen 2 óvulos en el laboratorio (in vitro) cuando están imposibilitados para hacerlo en su sitio natural, la trompa de Falopio. El método junta a los gametos en un plato con medio de cultivo celular adecuado que simula el fluido tubárico bajo condiciones ambientales controladas de temperatura, humedad, concentración de oxígeno, anhídrido carbónico, pH, osmolaridad, etc. Si se produce la fertilización y se obtiene embriones, éstos son transferidos a la cavidad uterina con objeto de que continúen su proceso de clivaje y desarrollo, hasta adquirir la capacidad de implantarse en el endometrio y dar lugar a una gestación de características normales.

En la lista de tecnologías médicas actualmente disponibles para el alivio de enfermedades y el mejoramiento en la calidad de vida, no existe ninguna que se equipare con la contribución que han aportado las tecnologías de reproducción asistida. No existe otra experiencia en la vida humana que se compare con el nacimiento de un niño sano, en términos de significación e importancia. Por tanto, la fusión de ovocitos y espermatozoides destinada a la creación de un embrión con potencial de desarrollar una individualidad única, no debe ser tomada ligeramente como otra más de las tecnologías médicas invasivas, sino que debe ser considerada con el respecto y responsabilidad que merece la más importante área de la vida humana.

Será atribución del laboratorio el asegurar condiciones ambientales de estabilidad, exenta

de toxicidad y libre de gérmenes patógenos, para proporcionar los parámetros óptimos para la fertilización del ovocito y el desarrollo embrionario.

El área del laboratorio debe estar localizada junto o cerca al quirófano o sala de recuperación ovo citaría, construida con materiales similares a los de una sala de cirugía que permita su limpieza frecuente y adecuada, diseñada para proveer un ambiente libre de distracciones y/o accidentes, con confortabilidad tal que permita la concentración de la atención y la seguridad necesarias para cada manipulación y, por último, con estaciones de trabajo de ubicación planificada. Idealmente debe ser catalogada como un área de acceso restringido con facilidades para que él o los biólogos puedan cambiarse con ropa y zapatos limpios antes de su ingreso. Es importante mantener adecuadas condiciones del aire ambiental para evitar en lo posible la contaminación química del aire, dado que los ovocitos y embriones humanos, al contrario que la mayoría de organismo y especies están desprovistos de mecanismos de defensa contra estos agentes. El control de calidad de los laboratorios de FIV debe ser estricto y ceñirse a normas internacionales previamente establecidas, como se detalla en el capítulo correspondiente de este libro.

A finales de 1990 el Centro Médico de Fertilidad y Esterilidad (CEMEFES), inauguró su programa de FIV-TE y en la actualidad nuestro laboratorio está implementado con el siguiente equipamiento: • Cortina de aire (marca Agudelo, Cali – Colombia) instalada en la puerta de acceso • Purificador de aire ambiental (Cloud 9M-150, Illinois – USA) • Estereomicroscopio Nikon SMZ-10 (Tokio – Japón) provisto con fuente de luz Fostec y platina temperada (MTG modelo 1205S Alemania) • Microscopio invertido Nikon TMS (Tokio- Japón) 3 • Microscopio invertido Olympus IX-70 (Tokio – Japón) con platina temperada, sistema de modulación óptica Hoffman, equipo de micromanipulación Narishige, cámara fotográfica Olympus SC35 y VHS incorporados • Monitor de video Sony SSM-121 • Cámara de flujo laminar tipo horizontal (Forma Científica modelo 1839, USA) • Platinas térmicas Termoline (Sybron – USA) y Labotec (Labor-Technik, Goltingen – Alemania) • Medidor de PH (Orion modelo SA520, USA)

• Balanza Analítica (Mettler H31 AR, Alemania) • Centrífuga para procesamiento de semen (Clay – Adams Compact II, Irvine Scientific, USA) • Equipo de agua reactiva AR 800 (C.H. Linares, Bogotá – Colombia) • Equipo purificador de agua Milli-Q Synthesis A/10 (Millipore Corporation, USA) • Incubadora para cultivo celular que proporciona temperatura de 37ºC, concentración con 5% de CO2 y 98% de humedad; tiene 8 compartimentos interiores individualizados (Forma Scientific modelo 3110, USA), Figura 1, con su respectivo filtro en línea CODA y sistema Fryrite para control del CO2 (Bacharach, USA) • Equipo para congelación de embriones CRYOBATH TR 3949 (Cryologic PL, Australia) • Tanque IC20R (International Cryogenics, USA) con nitrógeno líquido para almacenamiento de embriones • Equipos accesorios: fuente de energía Powerware Prestige Series, refrigeradora Goldstar, esterilizador Memmert 300, reloj cronómetro VWR, higrómetro portátil, termómetro de pared, juegos de pipetas (Stripper Micro Excel, Pasteur, Eppenforf, PUMP, Capilator y Clinipipette), lámpara de alcohol, jeringuillas Hamilton 81301, gradillas plásticas, etc.

• Material descartable: tubos para recolección de ovocitos y platos de cultivo Falcon (Becton-Dickinson, USA), platos de cuatro pozos para cultivos de embriones (NUNC, Dinamarca) • Medios para cultivos celular y crio-preservación de embriones: Gamete 100, IVF 100, G 1-2 (Vitrolife, Götenburgo-Suecia), aceite mineral (Irvine Scientific, USA) El sistema de video cámara es recomendable para fines de docencia y especialmente para documentar los procedimientos realizados a cada paciente, ya que experimentan enorme satisfacción y soporte psicológico al observar sus ovocitos y embriones. La incubadora con una atmósfera de 5% de CO2 es la más ampliamente utilizada para mantener un pH fisiológico, justo bajo 7.5, de los medios de cultivos requeridos, de ahí que su calibración cuidadosa y frecuente sea crítica para el éxito del programa. Se debe asegurar el correcto funcionamiento de su sistema de alarmas, así como la provisión permanente de fuente de energía.

4 FIGURA 1. Incubadora con 5% de CO2 Los medios de cultivos celular utilizados en el laboratorio de FIV deben ser controlados y manejados con el mayor cuidado posible: fecha de recibidos y expiración, número de lote, casa productora, condiciones de mantenimiento en refrigeración o

congelación según lo recomendado por los fabricantes, constatación de su osmolaridad (285 ± 2 mOsm/kg) y pH (7.35 – 7.45), etc.

Los medios de cultivo pueden rápidamente deteriorarse durante su almacenamiento, con disminución de su capacidad para mantener el desarrollo embrionario. Hasta el momento no existe evidencia firme acerca de la superioridad de unos medios en comparación con otros(4) en los procedimientos rutinarios de FIV, y la selección dependerá de consideraciones como el control de calidad y pruebas aplicadas en su producción, costos y, particularmente, de un eficiente y garantizado sistema de provisión y transporte.

EL desenvolvimiento del laboratorio se controlará minuciosamente a través de un Manual de Procedimientos que debe constar de protocolos de manejo de las muestras, documentación y reporte escrito de cada uno de los procedimientos, así como de materiales, medios y reactivos utilizados, prevención de infecciones, manejo de desechos, pruebas de control de calidad, manual de funcionamiento de los equipos y fechas de mantenimiento de los mismos, funciones específicas del personal calificado, etc.

INDICACIONES Desde el desarrollo de la FIV para su uso clínico ha existido un consenso sobre cuáles son sus indicaciones médicas primarias. Solamente en los Estados Unidos de Norteamérica se reportaron más de 3.200 nacidos vivos por año resultantes de procedimientos de fertilización in vitro y transferencia embrionaria(5) a inicios de la década pasada. Si bien en los primeros años las indicaciones estuvieron orientadas a la 5 solución del factor tubárico exclusivamente, con el paso del tiempo y la experiencia adquirida, éstas se ampliaron a otros factores de infertilidad tanto femeninos como masculinos, que en la actualidad se puede resumir a las siguientes: 1. Factor Tubárico de Infertilidad • Patología tubárica no susceptible de solucionar con microcirugía.

• Casos de función tubárica deficiente, sin obstrucción, luego de un periodo de infertilidad de 2 ó más años con tratamientos convencionales. Dependiendo de la edad de la mujer, la FIV puede aplicarse luego de un periodo más corto de infertilidad.

El factor tubárico y la pelvi-peritonitis plástica crónica son los responsables de aproximadamente el 25% de los casos de infertilidad femenina. Antes del advenimiento

de la FIV, la obstrucción tubárica bilateral de las trompas de Falopio de tipo infeccioso y especialmente iatrogénica para esterilización, constituían barreras absolutas para la procreación. Si bien la recanalización microquirúrgica de la esterilización tubárica alcanzaban tasas de embarazo de casi el 60%, las técnicas de cirugía convencional en casos de mayor grado de daño tubárico lograban un éxito significativamente menor. Los resultados exitosos en casos de cirugía por obstrucción en dos porciones de la trompa, pelvis congelada y cirugía tubárica previa fallida, eran generalmente pobres. En todos éstos casos se debe considerar la FIV como terapéutica primaria, dado el mal pronóstico con otras alternativas.

Esta indicación original para la FIV permanece como una importante causal en la mayoría de programas alrededor del mundo, conformando un grupo de pacientes con pronóstico favorable: la tasa de embarazo clínico/transferencia embrionaria supera el 25% en los programas exitosos(6).

2. Factor Masculino de Infertilidad Una detenida evaluación de la pareja infértil puede determinar la presencia de factor masculino primario en aproximadamente el 40% de casos. En términos generales, los parámetros seminales normales en el espermograma convencional incluyen concentración de espermatozoides mayor de 20 x 106/ml, motilidad progresiva (A+B) superior a 50% y más de 60% de morfología normal. Kruger y cols.(7) han propuesto un alternativo sistema estricto de análisis morfológico que se relaciona con el pronóstico de la FIV. Las anomalías en el análisis seminal pueden ser únicas o, más frecuentemente, múltiples: oligozoospermia, astenozoospermia, teratozoospermia, fundamentalmente, y sus respectivas combinaciones. En los casos de factor masculino leve o moderado la inseminación intrauterina (IUI) con semen preparado, junto a un esquema de hiperestimulación ovárica controlada (HOC), puede conseguir embarazos pero sus resultados son francamente desilusionantes en caso de factor masculino severo.

Ciertos criterios a seguir en la actualidad han sido emitidos por la Sociedad Holandesa de Obstetricia y Ginecología(8): 6 • Total de espermatozoides mótiles (TEM) < 1x106: el tratamiento de elección es la

inyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI) • TEM >1x106 y <10x106: FIV en casos de infertilidad de 2 o más años de duración, con previos ciclos fallidos de IUI. • TEM >10x106: conducta similar a la de infertilidad inexplicada.

A la fecha el factor masculino ha superado al factor tubárico como principal indicación para realizar la FIV en los principales centros especializados de Norteamérica y Europa (Cornell- New York, Rotterdam, Registro Alemán de FIV)(8), no así en Latinoamérica que reporta en 1999(9) el 34.7% para factor tubárico y únicamente 11.5% para factor masculino.

3. Infertilidad Inexplicada o Idiopática Es, por definición, un diagnóstico de exclusión en aproximadamente el 10% de parejas infértiles evaluadas en las cuales no es posible identificar una etiología específica.

Una batería diagnóstica completa que generalmente incluye, como mínimo: espermograma, histerosalpingografía (HSG) (con o sin laparoscopía-histerosonografía o histeroscopía), y documentada detección de la ovulación, no encuentra factor de infertilidad primario, sólo o asociado. Ciertos procedimientos diagnósticos auxiliares son frecuentemente realizados en casos seleccionados, pero sin existir consenso generalizado para su aplicación rutinaria. Su tratamiento es, por necesidad, empírico. Pueden someterse a ciclos de IUI con HOC antes de considerar la aplicación de fertilización in vitro, en cuyo caso las tasas exitosas de embarazo son buenas, inclusive superiores a las conseguidas en pacientes portadoras de factor tubárico puro de infertilidad. Adicionalmente, la FIV en estos casos puede servir como método diagnóstico, dado que defectos intrínsecos de los gametos pueden manifestarse a través de una tasa de fertilización disminuida, pobre calidad morfológica del ovocito o desarrollo embrionario anormal como fenómeno de clivaje retardado o excesiva fragmentación(10). En los principales reportes estadísticos(8) ocupa el tercer lugar ente las indicaciones de la FIV y deber ser aplicada en casos de infertilidad inexplicada de duración de 3 o más años, o más tempranamente si se trata de

mujeres mayores de 35 años.

4. Endometriosis Pélvica Aunque el papel de la endometriosis mínima o leve como causa de infertilidad es cuestionable, los casos moderados o severos de la enfermedad pueden definitivamente contribuir a una falla reproductiva. Extensas consideraciones al respecto se analizan en el capítulo sobre Endometriosis Pélvica e Infertilidad. La fisiopatología subyacente de la endometriosis asociada a infertilidad es compleja y puede involucrar una combinación de factores que incluyen la distorsión de la anatomía pélvica por presencia de procesos adherenciales, mayor producción de sustancias prostanoides e incrementada actividad peritoneal de macrófagos, entre otras.

Las estrategias terapéuticas estándares incluyen la ablación quirúrgica a través de varias técnicas y la supresión de la producción hormonal con varios agentes hormonales: 7 agonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas (a-GnRH), danazol y progestágenos, fundamentalmente. Cuando éstos tratamientos convencionales han fallado, la FIV ofrece tasas exitosas de embarazo similares a las obtenidas en aquellas pacientes con infertilidad tubárica. Aunque generalmente se ha sostenido que las mujeres portadoras de endometriosis severa presentan disminuidas tasas exitosas luego de la FIV, teóricamente explicadas por un menor número de ovocitos recuperados y/o mala calidad ovocitaria, Feldberg y cols.(10) han presentado evidencias sugestivas que las tasas de embarazo con fertilización in vitro no son afectadas por el estadío clínico de la enfermedad.

• Casos de endometriosis leve o moderada deben ser tratadas con similares criterios que se aplican a la infertilidad inexplicada.

• Casos de endometriosis severa deben ser tratados como aquellos de patología tubárica. Algunos estadíos III-IV deben considerar la posibilidad de la ovodonación.

5. Factor Cervical/ Infertilidad Inmunológica La presencia de factor inmunológico puede establecerse a través de una prueba postcoital francamente anormal, astenozoospermia marcada en el espermograma rutinario, luego de reversión quirúrgica de pacientes vasectomizados, o por la presencia de

anticuerpos antiespermatozoides identificados en el semen y/o en los tractos reproductivos masculino y femenino.

Las principales opciones terapéuticas en estos casos incluyen el tratamiento de infecciones coexistentes del aparato genital, IUI asociada con HOC y la terapia inmunosupresiva. La eficacia de esta última con el uso de corticoesteroides no está bien establecida, pero sus efectos secundarios y riesgos pueden llegar a ser significativos.

Luego de dos años de infertilidad la FIV debe considerarse y aún más temprano en mujeres mayores de 35 años. Ante la presencia de niveles significativos de anticuerpos antiespermatozoides circulantes en la paciente, una fuente de proteína que no sea el suero materno debe utilizarse en la suplementación del medio fertilizante. Las tasas de embarazo con la FIV en estas pacientes son comparables a las obtenidas con la FIV en la población general. En la última década, el advenimiento de la ICSI(11) es capaz de solucionar la mayoría de casos portadores del factor inmunológico.

6. Otras Indicaciones • Exposición in útero al Dietilestilbestrol (DES). Su prescripción durante el embarazo fue abandonada en 1971 debido al elevado riesgo de aparición de adenocarcinoma de células claras en el cérvix y vagina de los nacidos vivos de sexo femenino. Su empleo indiscriminado antes de ese año ha resultado en la presencia de alteraciones en el potencial reproductivo de aquellas mujeres que no desarrollaron la neoplasia, y que se ha demostrado se ven afectadas de un mayor riesgo de pérdida gestacional, aborto recurrente, embarazo ectópico, incompetencia cervical y labor pre-término. El grado de riesgo está en relación proporcional a la 8 severidad de anomalías uterinas identificables con la HSG, histerosonografía o histeroscopía diagnóstica. Las tasas de embarazos clínicos con la FIV en estas pacientes son similares a aquellas obtenidas en mujeres con patología tubárica(12).

Si se logra el embarazo es mandatorio en ellas un seguimiento cauteloso para descartar embarazo ectópico.

• Esterilidad Multifactorial. Se trata de parejas portadoras de varios y simultáneos factores femeninos y masculinos de infertilidad que imposibilitan el proceso reproductivo, y en los cuales han fracasado previamente varios intentos con tratamientos convencionales.

• Alteraciones Hormonales. Pacientes anovulatorias que luego de varios ciclos de tratamiento con diversos esquemas o protocolos de inducción de la ovulación, no han alcanzado el éxito.

Templeton y cols.(13) publicaron en 1996 uno de los más extensos e importantes

estudios realizados hasta la fecha, relacionado al efecto de cada una de las indicaciones médicas en la tasa de nacidos vivos luego de tratamientos en cerca de 40.000 ciclos con fertilización in vitro. Tabla I. TABLA I. Impacto de la causa de infertilidad en la tasa de nacidos vivos con FIV Causa de Infertilidad Número de casos Tasa de nacidos vivos (%) (95%CI) Por ciclo Por aspiración Por TE Tubárica 19.096 13.6 15.0 16.5 Endometriosis 4.117 14.2 15.9 17.9 Inexplicada 12.340 3.4 15.2 19.7 Cervical 4.232 14.2 16.2 18.8 Total 39.785 Adaptado de referencia(13) FASES DEL PROGRAMA DE FERTILIZACIÓN IN VITRO El programa de fertilización in vitro y transferencia embrionaria consta de las siguientes fases o etapas: • Fase clínica.

• Fase de recuperación ovocitaria.

• Fase de laboratorio de reproducción asistida.

• Fase de transferencia embrionaria.

• Control de la fase lútea y diagnóstico de embarazo.

9 1. FASE CLÍNICA El procedimiento de obtención del gameto femenino se puede realizar en dos circunstancias: 1.1 Ciclo Natural En un ciclo ovárico natural o espontáneo (sin aplicación de hormona gonadotropina coriónica, HCG) fue posible la recuperación de un ovocito, desarrollo in vitro de un embrión y su transferencia única a la cavidad uterina, según el primer reporte exitoso de éste programa de reproducción asistida(1). A pesar de que esta alternativa permite la natural selección de un ovocito maduro por mecanismos endógenos o intrínsecos, la ineficacia clínica con la transferencia de un solo embrión conduce a la obtención de tasas de embarazo decepcionantes.

Además, requiere de una técnica de monitoreo o seguimiento minucioso para determinar el pico endógeno de la hormona luteinizante (LH) y, ocasionalmente, obliga a realizar la recuperación ovocitaria en horas fuera de trabajo.

Lenton y cols.(14,15) revisaron los datos de su programa de FIV en ciclos naturales durante 1991-1993; en 676 ciclos de tratamientos (incluyendo mujeres mayores de 40 años) se lograron los siguientes resultados: 82% de tasa de recuperación ovocitaria, 72% de fertilización normal, 53% de transferencia embrionaria/ciclo iniciado, 19% de tasa de implantación, 15.8% de embarazo clínico y nacidos

vivos 6.8%. Se trata de cifras poco alentadoras. Claman y cols.(16) han introducido la administración de HCG a dosis de 2500 ó 5000 UI como suplemento en 75 ciclos naturales y han comparado los resultados obtenidos en 450 ciclos con superovulación. La tasa de cancelación fue de 43% y 25% respectivamente; uno o más ovocitos se recuperaron en el 60% de ciclos naturales versus 99% en los estimulados, la tasa de embarazo/transferencia fue 11% y 22% y de nacidos vivos a término 5% a 14% para cada grupo. Concluyeron que la alta tasa de cancelación y las frecuentes recuperaciones ovocitarias fallidas hacen al ciclo natural ineficiente, comparado con el estimulado. El costo de un ciclo natural de FIV es cuatro ó cinco veces inferior al del ciclo estimulado si incluimos en este último los rubros de medicación, criopreservación de embriones y una transferencia posdescongelamiento.

1.2 Hiperestimulación Ovárica Controlada Con objeto de optimizar los resultados exitosos en las técnicas de reproducción asistida, se ha considerado que uno de los requerimientos fundamentales es la estimulación de un crecimiento folicular múltiple y sincronizado, obtención de varios ovocitos maduros y viables, disponibilidad de un mayor número de embriones para la transferencia intrauterina y/o intratubárica, circunstancias que se asocian a mayores posibilidades de lograr gestaciones exitosas. Este tipo de estimulación ovárica utilizado en las TRA ha recibido diferente terminología, siendo la más ampliamente utilizada en la literatura médica Hiperestimulación 10 Ovárica Controlada (HOC), misma que corresponde a un capítulo específico en esta publicación.

Los esquemas y drogas más usualmente utilizados son los siguientes: • Citrato de Clomifeno (CC) asociado a gonadotropina menopaúsica humana (HMG) u hormona folículo estimulante urinaria (u-FSH).

Utilizado hasta hace algunos años, no se ha popularizado debido a que se acompañan de altas tasas de cancelación y bajas tasas de fertilización y embarazo.

• Gonadotropina solas. Estos protocolos usan HMG, u-FSH o r-FSH (recombinante), solas o combinadas a diferentes dosis, inicio y duración de la administración. Dado los inconvenientes que pueden acarrear como pico prematuro de LH endógena, cancelaciones, embarazos múltiples y síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO), también son ocasionalmente empleados en la actualidad.

• Agonistas de la Hormona liberadora de gonadotropinas (a-GnRH) asociados a Gonadotropinas: HMG, u-FSH o r-FSH, solas o asociadas.

Según el Registro Latinoamericano de Reproducción Asistida (RLRA) de 1999(9), los principales esquemas utilizados para la FIV fueron: a-GnRH + r-FSH (44.5%), a-GnRH + HMG + r-FSH (20.7%), a-GnRH + HMG + uFSH (13 % ) y a-GnRH + HMG (8.2%).

En el CEMEFES en la actualidad se utiliza el protocolo largo de a-GnRH asociado a la rFSH. La administración del agonista se inicia preferentemente en la fase lútea media del

ciclo previo (día 21) a una dosis habitual de 1 mg/día (0.2 ml s.c.) de acetato de leuprolide (Lupron, Abbott USA) hasta confirmar la supresión hipofisiaria y se continua a mitad de dosis (0.5 mg/día o 0.1 ml s.c.) durante todo el período de estimulación ovárica hasta la administración de la HCG. Esta supresión se logra a los 10 a 14 días del uso del agonista, comprobando el estado de quiescencia ovárica por ultrasonido y determinación hormonales, para dar inicio a la administración r-FSH desde el día 3 ó4 del ciclo en tratamiento a dosis individual variable e intramuscular (i.m.) según la edad de la paciente, cirugías ováricas anteriores, respuestas en ciclos previos, síndrome de ovarios poliquísticos, factores de riesgos para una HOC, etc.: < 25 años: 150 UI/día, entre 25 y 30 años: 150-225 UI/día, 31 a 35 años: 200-250 UI/día y > 36 años: 250-300 UI/día.

Si se trata de pacientes mayores de 38 años o con inadecuada respuesta previa a la HOC utilizamos el protocolo de microdosis de a-GnRH (50 ug cada 12 horas) iniciado el tercer día de finalizada la toma de anticonceptivo oral durante 21 días en el ciclo previo (levonorgestrel, 0.25 mg; etinilestradiol, 0.05 mg) y la estimulación intramuscular con rFSH a dosis de 300-450 UI/día después del quinto día. A partir del día 6 de la administración de la gonadotropina se inicia el seguimiento ecográfico transvaginal y determinaciones séricas de estradiol (E2) y progesterona (P4) para documentar el desarrollo y crecimiento de los folículos, niveles de esteroideogénesis ovárica y detectar un probable incremento en los niveles de P4 que pueden aparecer inmediatamente antes de que ocurra el pico endógeno de LH. 11 En todos los casos, independientemente del esquema utilizado, se administra vía i.m.

5000 UI o preferentemente 10000 UI de gonadotropina coriónica (HCG) cuando el crecimiento folicular alcance el diámetro requerido (17-18 mm), 2 o más folículos superen los 14 mm, endometrio de al menos 8 mm de espesor con apariencia de halo trilaminar y niveles de estradiol de 100-150 pg/ml por cada folículo, con objeto de inducir la ruptura folicular aproximadamente 36 a 38 horas más tarde.

Se han esgrimido varios argumentos en contra de la hiperestimulación ovárica: disconfort, mayor necesidad de anestesia general para la recuperación ovocitaria, período corto de recuperación antes de realizar otro intento y aparentemente una carga emocional mayor. Entre sus riesgos se anotan: ocurrencia de SHO, probable riesgo

incrementado de malignidad no solamente relacionado con cáncer ovárico sino mamario y del cuerpo uterino(17), mayor incidencia de embarazos múltiples con sus conocidas complicaciones obstétricas y neonatales(18), gestaciones extra uterinas(19), pérdida gestacional(20), riesgo de menopausia prematura(21), etc. Adicionales consideraciones se han hecho con relación a mayor costo, necesidad de disponer de un programa de criopreservación de embriones e, incluso, realizar reducciones fetales (no permitido en la mayoría de países) en caso de multigestaciones de alto orden.

2. FASE DE RECUPERACIÓN OVOCITARIA La aspiración folicular para recuperación ovocitaria se lleva a cabo 34 a 36 horas de la administración de la dosis ovulatoria de HCG. El procedimiento lo efectuamos en el quirófano con la paciente en posición de litotomía dorsal, anestesia general corta y superficial y mediante punción transvaginal bajo guía ecográfica (equipo Hitachi EUB405 de 6.5 Mhz) de los folículos ováricos, utilizando una aguja de aspiración descartable de 16g – 17g y de 300 mm de largo (Embryon Single Lumen de la Rolon MedicalEngland, MDT de la Medical Instruments Division BV-Holanda o Mona Lisa de Gynotec-Holanda).

Se aplica una presión negativa de 100-120 mmHg mediante un sistema o bomba de aspiración (Graff Suction Unit, Rocket of London) y el líquido aspirado se colecta en un tubo cónico Falcon de 15 ml mantenido previamente a una temperatura de 37o C en baño maría (Fanem 100, Sao Paulo-Brasil) Figura 2. La succión se inicia el momento que la aguja punciona al folículo y se la mantiene hasta que éste se colapse totalmente, como se puede apreciar en el monitor del ecógrafo. El operador debe alinear la imagen sonográfica de varios folículos en el mismo plano para minimizar el número de punciones en el interior del ovario, iniciando por el de localización más superficial de tal manera de proseguir con los folículos adyacentes. La aguja de aspiración es lavada con medio de cultivo Gamete 100-HEPES (Vitrolife, Suecia) antes del procedimiento y luego de ser retirada de la vagina para recuperar ovocitos retenidos en su interior y los tubos

Falcon son transportados inmediatamente al laboratorio situado junto al quirófano.

La asepsia y antisepsia del canal vaginal se la realiza con solución salina y al final de la aspiración se debe examinar detenidamente la probable presencia de lesiones sangrantes 12 en las paredes vaginales y/o cuello uterino. Administramos rutinariamente antibióticos profilácticos perioperatoriamente para evitar el riesgo de infección local o pélvica(22): doxiciclina 100 mg oral cada 12 horas por 3 a 4 días o azitromicina 1g oral como dosis única.

FIGURA 2. Baño maría y bomba de aspiración folicular Este tipo de recuperación ovocitaria presenta varias ventajas sobre la vía laparoscópica: facilidad de punción en casos de extensas adherencias pélvicas con inaccesibilidad ovárica, menor morbilidad, menor tiempo de exposición anestésica, eliminación del potencial riesgo de acidificación del líquido folicular por el bióxido de carbono utilizado para el neumoperitoneo y, finalmente, tiempo de recuperación más corto.

3. FASE DE LABORATORIO DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA 3.1 Identificación y Clasificación de los ovocitos En la estación de trabajo del laboratorio, que tiene instalada la cámara de flujo laminar, el contenido del tubo Falcon es inmediatamente transferido a un plato de cultivo celular (Falcon 3004) con medio IVF-100 para identificación, bajo estéreomicroscopio de disección y sobre la platina térmica, del complejo cúmuluscoronaovocito (CCO) utilizando bajo poder de magnificación para buscar en el fluido el complejo primeramente, y luego mayor magnificación para identificar el ovocito. Éste usualmente aparece rodeado de una cantidad variable de células del cúmulus ophorus y de pequeños coágulos sanguíneos provenientes de la aguja de colección que deben ser delicadamente disecados con la punta de una aguja 23g.

Cuando el CCO es localizado es necesario clasificar su grado de madurez en base a su volumen, densidad y condición de las circundantes células de la corona y cúmulus.

Si el ovocito es claramente visible este momento, la presencia del cuerpo polar nos indica que ha alcanzado el estadío de metafase II y de que, habitualmente se trata de un ovocito maduro y preovulatorio. Existen reportes relacionando la apariencia del CCO con el estado de madurez y capacidad de fertilización del ovocito. La clasificación ovocitaria tomará en cuenta los siguientes parámetros(23): estado nuclear, 13

características del ooplasma, espesor de la zona pelúcida, apariencia de las células de la corona radiata, grado de expansión del cúmulus ophorus y aspecto de las células de la granulosa, para, según ellos, agruparlos en el esquema señalado a continuación(24).

Figura 3.

FIGURA 3. Diversos estadíos de maduración del ovocito humano encontrados en el laboratorio de FIV: a) Vesícula germinal; b) inmaduro, metafase I; c) preovulatorio, metafase II; d) postovulatorio; e) luteinizado; f) atrésico. Tomado de referencia(4). a) Vesícula germinal. Se trata de un ovocito muy inmaduro. No existe expansión de las células circundantes que se encuentran aparentemente dispuestas alrededor del ovocito. Un gran núcleo (la vesícula germinal) todavía se encuentra presente y ocasionalmente puede ser visualizada con microscopio invertido. Ocasionalmente pueden madurar in vitro a partir de este estadío, luego de preincubarlos 24 horas antes de su inseminación. b) Metafase I. El ovocito se encuentra rodeado por células de la corona yuxtapuestas y éstas a su vez, por células del cúmulus ophorus densamente dispuestas alcanzando un tamaño máximo de aproximadamente cinco veces el diámetro ovocitario. No se observa vesícula germinal y la ausencia del cuerpo polar nos indica que se 14 encuentra en metafase I. Pueden ser preincubados in vitro por 12 a 24 horas antes de su inseminación. c) Metafase II: • Preovulatorio. Es el nivel óptimo de maduración apropiado para una fertilización exitosa. Las células de la corona rodean al ovocito pero están totalmente radiantes; el cuerpo polar ha sido extruído y el cúmulus se encuentra expandido en una delicada masa que puede ser estirada fácilmente.

• Postmaduro. El ovocito se visualiza fácilmente como una esfera pálida.

Escasas células de la corona se encuentran disociadas del ovocito. El cúmulus es muy profuso pero aún celular. Eventos tardíos de este estadío incluyen la condensación del cúmulus en pequeñas y retráctiles gotas negruzcas, entre otros.

• Luteinizado. El ovocito se torna difícil de visualizar debido a su gran palidez. El cúmulus se ha fracturado y convertido en una masa gelatinoso periférica. Tienen escasa probabilidad de fertilización.

• Atrésico. Las células de la granulosa se han fragmentado adquiriendo una apariencia similar a encaje. El ovocito es muy oscuro y difícil de identificar.

La verificación y clasificación ovocitarias basadas en el aspecto morfológico son sumamente subjetivas y sujetas, por tanto, a equivocaciones o imprecisiones. El advenimiento de la ICSI como método alternativo de la FIV ha permitido determinar con mayor exactitud el estado de madurez nuclear y características citoplásmicas,

dado que el procedimiento incluye la denudación completa del ovocito de las células del complejo cúmulus-corona mediante delicadas maniobras con el auxilio de pipetas Pasteur de diferentes diámetros y estiradas a la llama, facilitado por la utilización de solución de hialuronidasa(25). Parece ser que la apariencia morfológica del complejo cúmuluscoronaovocito no necesariamente se correlaciona con la madurez nuclear.

Alikani y cols.(26) utilizaron la ICSI para analizar las consecuencias en el desarrollo que pueden presentar ovocitos humanos dismórficos. De 2968 ovocitos microinyectados, 806 (27.2%) fueron clasificados como dismórficos al presentar alteraciones en la granularidad del citoplasma, áreas de necrosis, vacuolización, organelos agrupados en racimos, ovocitos no esféricos y anomalías de la zona pelúcida. La presencia de las anomalías mencionadas, simple o múltiple, no presentó disminución en la tasa de fertilización como tampoco en las tasas globales de implantación y embarazo; sin embargo, la transferencia exclusiva de embriones originados de ovocitos disfórmicos presentó una tasa de implantación menor y alta incidencia de embarazos bioquímicos. Una vez identificados y clasificados, los CCO son sometidos a lavado doble con Gamete 100-HEPES con objeto de retirar el líquido folicular, células del complejo, sangre, etc., y luego para el período de incubación se puede seguir dos variantes técnicas: 15 • Microgotas cubiertas en aceite mineral. En un plato de cultivo celular claramente identificado con el nombre de la paciente, se coloca cuidadosamente con pipeta Pasteur o pipetas ajustables con puntas estériles, varias gotas (8-10) de tamaño variable (50-250 ul/gota) del medio de cultivo IVF-100 previamente equilibrado en la incubadora de CO2 desde la noche anterior y en las cuales se coloca uno o dos ovocitos. Se cubren delicadamente con una delgada capa de aceite mineral estéril y equilibrado.

• Plato de cuatro pozos. Previamente identificados, cada pozo conteniendo 0.5 – 1ml de medio de cultivo IVF-100, equilibrado, recibe uno o dos CCO. Opcionalmente puede completarse cubriendo con aceite mineral estéril y equilibrado.

Sea cual fuere el sistema utilizado, los platos conteniendo los ovocitos son introducidos a la incubadora con 5% de CO2 y humidificada para su cultivo celular.

Simultáneamente, en el laboratorio de andrología se recolecta la muestra de semen del esposo mediante masturbación y se procede a su preparación y capacitación. En nuestro laboratorio, el manejo del semen se lo realiza de preferencia utilizando la separación espermática con la técnica de migración ascendente o “swim-up” con medio Gamete 100 o con Mènèzo (B2 INRA Medium, CCD, Francia) por considerarlo más fisiológico y menos traumático para la porción cefálica del espermatozoide, en casos de semen con parámetros referenciales de normalidad según lo establecido por la Organización Mundial de la Salud (OMS)(27), o con la técnica de gradientes de concentración de Isolate (Irvine Scientific, USA) en casos de semen con parámetros subnormales. La muestra espermática es equilibrada a 37oC y 5% de CO2 aproximadamente por una hora.

3.2 Inseminación Rutinariamente la inseminación se realiza a las 4 horas luego de la identificación ovocitaria. Independientemente de las variantes técnicas utilizadas para el cultivo de los ovocitos, éstos son inseminados con una concentración de 100.000 espermatozoides mótiles normales por mililitro o por pozo. Si la preparación espermática presenta parámetros subóptimos de motilidad y morfología, la concentración de espermatozoides puede incrementarse consecuentemente hasta alcanzar 200.000 espermatozoides mótiles normales por ml o pozo. En nuestro laboratorio utilizamos un nuevo plato Nunc para la inseminación y posterior a ésta, cada pozo es cubierto delicadamente con una delgada capa de aceite mineral estéril y equilibrado antes de introducirlos a la incubadora.

3.3 Constatación de la Fertilización Día 1. A las 18-20 horas de inseminados se procede a retirar las células de la corona y del cúmulus que rodean al ovocito para facilitar la visualización, con microscopio invertido, del ooplasma y verificar la fertilización. La selección del método de disección es cuestión de preferencia individual del biólogo, pudiendo combinarse métodos en casos particulares, pero siempre llevados a cabo cuidadosa y delicadamente en el menor tiempo posible, con objeto de evitar la exposición del ovocito fertilizado a cambios de

temperatura y pH. 16 La presencia de dos pronúcleos y dos cuerpos polares indican una fertilización normal, Figura 4, además de zona pelúcida regular e intacta y citoplasma claramente saludable; una variedad de hechos pueden, además, ser observados en caso de fertilización normal: el citoplasma usualmente es ligeramente granular mientras que el del ovocito no fertilizado es completamente claro y sin rasgos característicos; el citoplasma puede aparecer de color café u oscuro y degenerado; la forma del ovocito puede variar de perfectamente esférica hasta totalmente irregular. La presencia en la periferia citoplasmática de un halo claro de 5 a 10 um de grosor es indicador de una buena activación y reiniciación de la meiosis.

FIGURA 4. Ovocito fertilizado La observación de los pronúcleos debe llevarse a cabo en un lapso apropiado, antes que sufran un proceso de singamia-clivaje embrionario con fertilización anormal que hace imposible distinguirle de aquellos con dos pronúcleos. Aunque la presencia de dos pronúcleos confirma la fertilización, su ausencia no necesariamente indica falla de la misma y puede representar activación partenogenética o demora en el tiempo de aparición de uno o más de los eventos involucrados en el proceso. Plachot y cols.(29,30) demostraron que el 40% de ovocitos sin signos de fertilización entre 17 a 24 horas, 41% de ellos aparecieron morfológicamente como embriones normales al día siguiente, con tasa de clivaje similar a los ovocitos con obvios pronúcleos en el día 1. Sin embargo, 30% de estos cigotos presentaron detención en su desarrollo el día 2 comparado con sólo el 7% de los ovocitos fertilizados normalmente, con tasa de implantación del 6% versus 11.1% respectivamente. El análisis citogenético de estos embriones reveló mayor incidencia de anomalías cromosómicas (55% versus 29%) así como alta tasa de haploidía (20%), confirmando una activación partenogenética.

La presencia de 3 o más pronúcleos en esta etapa nos señala la ocurrencia de una polipenetración espermática y junto a la no extrusión del segundo corpúsculo polar constituyen el 5% a 10% de fertilización anormal en la FIV humana. El diagnóstico genético preimplantacional (DGP) utilizando la FISH (Hibridación Fluorescente In Situ)

ha revelado que el 80% a 89% de los embriones con 3 pronúcleos corresponden a mosaicismo.

17 Estos estudios(28) han reconocido y confirmado una nueva variante humana de interacción pronuclear durante la singamia, sugiriendo que cigotos con un sólo pronúcleo que desarrollan un proceso de clivaje normal, pueden ser transferidos con seguridad.

Posteriormente se retiran los óvulos fertilizados de las gotas o pozos de inseminación, se transfieren a nuevos platos conteniendo medios de cultivos IVF-100 nuevo y equilibrado 12 horas antes y se los introduce a la incubadora para las futuras 12 a 24 horas de cultivo.

Aquellos con fertilización anormal, como cigotos multipronucleados, deben ser cultivados separadamente para evitar la posibilidad de ser transferidos, en vista de que después del clivaje pueden ser indistinguibles de los ovocitos fertilizados normalmente.

Día 2. La visualización a las 40 horas verifica el fenómeno de división mitóti ca o clivaje con la presencia de embriones divididos típicamente en 2 a 4 células o blastómeras, permitiéndonos la valoración de la calidad embrionaria de acuerdo a su morfología; número (tasa de división celular), tamaño y regularidad de las blastómeras, tiempo requerido para el clivaje, presencia o ausencia de vesiculación, fragmentación y granularidad del ooplasma; y, por último, espesor o apariencia de la zona pelúcida.

3.4 Reinseminación Muchos ovocitos con fallida demostración de los pronúcleos en el día 1 pueden ser reinseminados, aunque esta práctica ha sido ampliamente cuestionada desde el punto de vista científico. El procedimiento debe ser realizado lo antes posible con una muestra seminal obtenida a las 26 a 28 horas luego de la recuperación ovocitaria y si esto no es posible, se debe re-examinar con la muestra original para constatar la motilidad y utilizarla como medida urgente. En ciertos casos la fertilización y clivaje pueden visualizarse el día 2, pero pueden ser consecuencia de la inseminación inicial o a un retraso de la fertilización ya sea debido alteraciones funcionales del espermatozoide o una maduración tardía del ovocito. Estos embriones poseen un mal pronóstico implantatorio; sin embargo, hay que considerar que la noticia de una falla completa de fertilización en el día 1 puede provocar profunda decepción en la pareja infértil y una

extremada dificultad para que se sometan a intentos adicionales. La experiencia en FIV puede testificar que aún en las más inusuales e improbables circunstancias, en ocasiones, se consiguen embarazos y nacimientos de niños vivos y sanos.

3.5 Selección de embriones sobrantes para criopreservación Si en un considerable número de ovocitos los pronúcleos son visibles claramente el día 1, un selecto número puede mantenerse en cultivo para su transferencia el día siguiente y los restantes pueden considerarse para criopreservación en estado de pronúcleo.

Esta decisión tendrá en consideración la historia previa de la paciente con relación al clivaje y calidad embrionarias. En este estado los embriones a congelarse deben ser regulares, con zona pelúcida distinguible, pronúcleos claramente visibles y deben someterse al proceso de congelación mientras los pronúcleos son visibles, o sea antes del inicio de la singamia.

En otras circunstancias esta selección se la efectuará luego de la observación del día 2 y 18 con embriones excedentes en estado de 2 a 6 blastómeras, como usualmente procedemos en el CEMEFES. 4. FASE DE TRANSFERENCIA EMBRIONARIA Históricamente la transferencia embrionaria se ha realizado 48 a 54 horas luego de la recuperación ovocitaria. Evidencias recientes(31) sugieren la posibilidad de transferir cigotos seleccionados en estado de pronúcleos en el día 1 obteniendo aceptables tasas de embarazo. Los autores sugieren aplicar un sistema para definir el criterio que debe ser observado en el cigoto en este estado, que nos indique un óptimo potencial de implantación: cercana alineación de los nucleolos en el mismo plano, adecuada separación de los pronúcleos, citoplasma heterogéneo con un claro halo superficial y clivaje presente entre 24 a 26 horas.

En el día 2 los embriones clivados poseen entre 2 a 4 blastómeras y constituye el estado y tiempo adecuado para ser transferidos. La transferencia en día 3 no mejora la tasa de embarazo y se basa en la posibilidad de seleccionar embriones de mejor calidad, por eliminación de aquellos que muestran arresto del clivaje temprano in vitro. Los

embriones que presentan un proceso rápido de clivaje, con buen número de blastómeras al momento de la observación, parecen poseer mejor potencial de implantación(24).

Figura 5.

FIGURA 5. Embrión clivado de 4 células La transferencia de blastocistos en día 5 ó 6 tiene la ventaja de lograr una mejor sincronización entre el estado embrionario y el grado de receptividad endometrial, así como el de eliminar aquellos embriones incapaces de desarrollarse después de la activación del genoma cigótico debido a defectos genéticos o metabólicos. Figura 6.

Hasta hace poco, los sistemas de cultivo celular in vitro no eran capaces de mantener adecuadamente el desarrollo embrionario hasta el estado de blastocisto sin el uso adicional de cocultivos. La introducción de medios de cultivo de tipo secuencial con formulación estado-específico, han incrementado considerablemente la posibilidad de obtener in vitro embriones en estado de blastocisto sin necesidad de cocultivos(31). Se ha sugerido que la transferencia de éstos en el día 5 ó 6 aumenta el potencial de implantación mejorando las tasas de embarazos, con la ventaja adicional de lograr éxito transfiriendo sólo uno o dos blastocitos y por tanto, disminuyendo la posibilidad de

Técnicas de FIV mediante micro manipulación: Esterilidad femenina por patología tubárica Cuando la mujer tiene las dos trompas obstruidas, la FIV permite el encuentro del ovocito con los espermatozoides y posibilita la formación de embriones (que de otra forma no se crearían). En el supuesto de que fuera la función de transporte de los gametos y embriones por la trompa la que pudiera estar alterada -es decir, trompas permeables pero con afectaciones que le resten funcionalidad-, la FIV también puede proporcionar una solución al problema, puesto que evita el tránsito de los embriones por la trompa porque se introducen directamente dentro del útero.

Esterilidad femenina por disfunción ovárica Hay casos en que los ovarios tienen dificultad para producir ovocitos maduros y/o muchos de los ovocitos que producen son de mala calidad. En esta situación muchos de los embriones generados tienen poco potencial para generar un embarazo. Con la FIV se intenta generar múltiples embriones y transferir aquellos que presenten un mayor potencial de desarrollo para dar más posibilidades de gestación. Con la edad, la mujer pierde funcionalidad ovárica y calidad ovular, siendo más necesaria la selección embrionaria.

También entran en este apartado aquellas disfunciones ováricas (como por ejemplo algunos casos de ovarios poliquísticos) en las cuales es difícil liberar controladamente un número limitado de ovocitos para realizar una inseminación artificial. Una solución en estos casos es practicar una FIV,

donde un número elevado de ovocitos no es problema puesto que permite obtener múltiples embriones de los cuales unos pocos se transferirían y otros muchos se congelarían, hecho que permite obviar así el riesgo de embarazo múltiple.

Endometriosis La presencia de tejido del endometrio fuera de la cavidad uterina (en las trompas o en los ovarios) puede dificultar o impedir la ovulación, la fecundación, el transporte de los gametos y embriones y disminuir la implantación embrionaria. La FIV resolvería muchos de estos impedimentos.

Esterilidad por factor masculino La FIV puede ofrecer la oportunidad de conseguir fecundación y embarazo en aquellos casos en que existe una disminución del número, movilidad y morfología espermática. En aquellos casos en que la disminución de los parámetros seminales es muy acentuada tiene que ser aplicada la técnica por la cual se introduce directamente un espermatozoide dentro del ovocito (microinyección espermática o ICSI). Esta técnica permite incluso obtener fecundación con espermatozoides recuperados directamente de testículo en casos en que no aparecen en el eyaculado.

Anticuerpos anti-espermatozoides La presencia de estos anticuerpos puede dificultar la fecundación “in vivo”, puesto que altera los mecanismos de desplazamiento del espermatozoide y la penetración de las cubiertas del ovocito. La FIV permite la creación de

embriones incluso en casos de factor inmunológico grave gracias a la microinyección espermática.

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Fallo de inseminación Cuando después de aproximadamente 3 intentos de inseminación artificial no se consigue el embarazo es conveniente cambiar de técnica puesto que se pasa a ser poco probable un embarazo en nuevos intentos. Con la FIV es posible ver si existe algún problema oculto a nivel de los ovocitos, de la fecundación o del desarrollo embrionario. A la vez proporciona porcentajes de embarazo muy satisfactorios.

Esterilidad idiopática (de origen desconocido) La FIV es una técnica muy útil en los casos de esterilidad sin diagnóstico puesto que permite valorar el aspecto de los ovocitos, ver la interacción entre los ovocitos y los espermatozoides (su capacidad de fecundación) y también la evolución y la morfología de los embriones generados. Esto permite que, además de ser una eficaz técnica terapéutica, la FIV sea también una herramienta diagnóstica muy importante, puesto que permite detectar algunas causas de esterilidad ocultas.

Esterilidad o Infertilidad de origen genético Algunas parejas presentan esterilidad, abortos de repetición o tienen

familiares afectos de enfermedades genéticas porque alguno de los componentes de la pareja es portador de anomalías o enfermedades genéticas hereditarias. La FIV permite realizar un diagnóstico genético de los embriones generados y seleccionar aquellos embriones sanos para ser transferidos. Hablamos de FIV con Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP o DGPI).

Estimulación ovárica

Consiste en inducir el crecimiento y maduración de varios folículos ovulatorios en un mismo ciclo. El objetivo en este caso es disponer de múltiples ovocitos durante la FIV puesto que esto nos permitirá obtener varios embriones y seleccionar para transferir aquellos que presenten un mejor aspecto y desarrollo, hecho que permite aumentar así notablemente las posibilidades de embarazo.

La estimulación ovárica se consigue mediante la administración diaria de unas hormonas llamadas gonadotropinas (que son básicamente la FSH y la HMG) por vía intramuscular o subcutánea en función del fármaco utilizado. La administración subcutánea permite a la mujer autoinyectarse la medicación. Este tratamiento se individualiza en función de la edad de la mujer, el funcionamiento de sus ovarios, sus niveles hormonales basales y la respuesta a otros intentos previos de estimulación, y precisa de una monitoritzación secuencial de la respuesta de la paciente al

tratamiento. La administración de gonadotropinas se inicia sobre el 2n o el 3r día de la regla del ciclo de estimulación ovárica. La duración de la estimulación ovárica es variable y normalmente es de unos 8-12 días. Durante este periodo se hacen controles mediante ecografías (contaje y medición de folículos ovulatorios) y análisis de sangre (para valorar los niveles de estradiol en sangre) para determinar la magnitud de la respuesta, controlar el crecimiento y maduración folicular y determinar el día correcto para programar la extracción de los ovocitos.

Para la inducción de los últimos cambios madurativos en los ovocitos previos a su extracción, se usa habitualmente una dosis única de HCG. Esta hormona provoca también la ovulación o expulsión de los ovocitos de los ovarios hacia la trompa aproximadamente 36-40 horas después de su administración, y por esta razón se planifica con precisión su extracción quirúrgica sobre las 35 a 36h, cuando los ovocitos están todavía a los ovarios y en su momento óptimo de maduración.

En general, simultáneamente o con unos días de anticipación a la estimulación ovárica, se hace un proceso de inhibición hipofisaria (también denominado frenación). La hipófisis es una glándula que controla los ovarios en condiciones naturales. La inhibición nos permitirá hacernos con el control total de la estimulación ovárica, y evitar así interferencias de hormonas internas que produzcan la ovulación espontánea y el consecuente desperdicio de los ovocitos antes de su extracción.

Para conseguir la inhibición hipofisaria se pueden utilizar dos tipos de fármacos similares a la GnRH, que es una hormona que participa en los mecanismos naturales de la ovulación: los agonistas o los antagonistas.

Fármacos Agonistas de la GnRH. Su administración es diaria (vía subcutánea) y pueden seguir dos protocolos diferentes de administración: o Protocolo largo: se administran desde pocos días antes de iniciar la regla del ciclo de estimulación ovárica hasta el día de la inyección de la HCG.m o Protocolo corto: desde el primer día de la regla del ciclo de estimulación hasta el día del HCG. Fármacos Antagonistas de la GnRH. Su administración es diaria (vía subcutánea) y se inicia a los pocos días de haber empezado la estimulación ovárica. Se mantiene hasta el día de la inyección de la HCG. FecunMed – Centre de Reproducció Assistida del Vallès, S.L.P. Tlf. 93 861 18 28 fecunmed@fecunmed.com

Extracción de ovocitos de los ovarios

Procedimiento por el cual se aspira el líquido contenido en los folículos ováricos.

Los folículos son pequeños quistes de los ovarios de no más de 20-25mm de diámetro.

En el interior de cada uno de ellos reside y madura un ovocito. Al finalizar la estimulación ovárica y después de administrar la HCG, la mayoría de ovocitos

maduros se liberarán de la pared folicular y estarán en suspensión en el líquido folicular.

El procedimiento es sencillo, dura unos 15-20 minutos y se lleva a cabo en un quirófano bajo sedación general, u ocasionalmente con anestesia local. Se utiliza una aguja que permite acceder a los ovarios a través de la vagina, todo realizado bajo control ecográfico. Mediante un sistema de punción-aspiración se vacían los folículos uno a uno, depositando su contenido líquido (donde se encuentran los ovocitos) en unos tubos estériles.

El procedimiento, denominado también punción folicular, se programa 35-36h después de la administración de la HCG, es decir, poco antes de la ovulación, para asegurar que los ovocitos no hayan sido expulsados de los ovarios y garantizar un buen grado de madurez. Todo el proceso es ambulatorio y la paciente está en condiciones de volver a su domicilio pocas horas después de la intervención.

Identificación de los ovocitos

Los líquidos foliculares se trasladan al laboratorio, donde se localizan los ovocitos mediante el uso de un microscopio. Hay que resaltar que no todos los líquidos foliculares contienen ovocitos. Cuando son ovulados, los ovocitos están rodeados de

un numeroso y extenso conjunto de células denominadas células del “cumulus ooforus” y de la “corona radiatta”. Los ovocitos se colocan en placas con medio de cultivo dentro del incubador debidamente identificados y numerados.

Preparación del semen

Consiste en obtener una población de espermatozoides con buena movilidad y aislarla de los otros componentes del semen (plasma o líquido seminal, espermatozoides con baja o nula movilidad, otras células presentes en el eyaculado).

Este proceso es conocido con el nombre de Capacitación Espermática puesto que induce unos cambios en los espermatozoides sin los cuales no serían capaces de fecundar.

Existen diferentes métodos de capacitación espermática (swim-up, gradientes de densidad...). El método se individualiza en cada caso en función de las características de la muestra.

En algunos casos en que no se encuentran espermatozoides en el eyaculado es posible recuperar espermatozoides de los testículos mediante punción (TESA) o biopsia (TESE). Estos espermatozoides pueden ser usados para la FIV-ICSI después de aislarlos del tejido testicular.

Inseminación/Microinyección de los ovocitos

La inseminación convencional de los ovocitos es el procedimiento por el cual se ponen en contacto los ovocitos con los espermatozoides con el fin de conseguir la fecundación. La inseminación tiene lugar generalmente entre las 3 y las 6 horas posteriores a la recuperación de los ovocitos. Todo el proceso se lleva a cabo en unas placas con unas pequeñas gotas de medio de cultivo donde se depositan los ovocitos y los espermatozoides. Estas placas se mantienen dentro de un incubador que les proporcionará un ambiente de temperatura, humedad y pureza del aire idóneo para satisfacer las necesidades de los gametos.

Existe una modalidad de interacción entre ovocito y espermatozoide para conseguir la fecundación diferente a la inseminación convencional de los ovocitos y que se llama Microinyección Espermática Intracitoplasmática (ICSI). Consiste en introducir directamente mediante micromanipulación un espermatozoide dentro del ovocito maduro. Su uso cada vez es mes generalizado por su alta eficiencia. Dada su gran relevancia y extensión de su uso, existe información complementaria sobre esta técnica en el último apartado de este capítulo.

Valoración de la fecundación

Se realiza aproximadamente a las 16-20 horas después de haber puesto en contacto los ovocitos con los espermatozoides o de haber realizado la microinyección espermática. El signo usado para detectar que un ovocito ha sido fecundado es la visualización en su interior de dos núcleos, denominados pronúcleos. Estos pronúcleos son las estructures celulares que contienen la información genética de origen paterno y materno, y sólo son visibles durante un corto plazo de tiempo.

Justo en este momento se identifican los ovocitos correctamente fecundados (embriones) y se descartan para el cultivo celular aquellos ovocitos no fecundados o que presentan anomalías de fecundación.

Para valorar la fecundación en los casos en que se ha aplicado la inseminación convencional de los ovocitos, previamente hay que disgregar las células de la granulosa y corona radiatta que rodean al ovocito, puesto que impiden la correcta visualización del ovocito. En los casos de ICSI la disgregación ya habrá sido hecha el día anterior justo antes de la microinyección.

Cultivo embrionario Los ovocitos fecundados, denominados preembriones o embriones, se mantienen en

cultivo en el incubador durante varios días para permitir que se desarrollen. El desarrollo embrionario se basa en un proceso que se llama división celular por el cual se produce un aumento del número de células del embrión. Durante el proceso hay que adaptar las condiciones de cultivo a las necesidades metabólicas de los embriones, puesto que estas varían.

Es importante controlar minuciosamente las condiciones ambientales y de cultivo (temperatura, pH, humedad, esterilidad, calidad del aire) para garantizar unas condiciones óptimas para el desarrollo embrionario “in vitro”.

La idoneidad de las condiciones de cultivo así como la capacidad de desarrollo intrínseca de cada embrión condicionarán su capacidad de progreso, y le proporcionarán un aspecto más o menos óptimo según sea el caso.

La supervisión y evaluación de los embriones durante el proceso permitirá al embriólogo seleccionar los embriones con mayor capacidad de implantación para transferir o congelar, y descartar los inviables. Los criterios usados para la valoración embrionaria son básicamente morfológicos y comprenden aspectos como el ritmo de división celular, la regularidad en el tamaño y forma de las células que componen el embrión, la presencia y el grado de fragmentación existente en el embrión, el aspecto del citoplasma, la vacuolitzación, el aspecto de la zona pelúcida o cubierta del embrión, la presencia de multinucleaciones en las células, etc.

Transferencia embrionaria

La transferencia consiste en el depósito de los embriones dentro de la cavidad uterina. Se realiza introduciendo con gran delicadeza una fina cánula a través del cuello de la matriz hasta hacerla llegar en el interior del útero y posteriormente inyectar a través de ella los embriones. Todo el proceso se controla bajo ecografía abdominal, hecho que hace necesario que la mujer tenga la vejiga llena. La transferencia no es un proceso doloroso y es excepcional el requerimiento de anestesia general o el uso de vías alternativas a la cervical para acceder a la cavidad uterina, como pueden ser la transferencia transmiometrial o intratubárica. La mujer puede abandonar el centro después de unos minutos de reposo, en condiciones normales.

El momento en que se lleva a cabo la transferencia de los embriones y el número de embriones introducidos (1, 2 o 3) se individualiza en función de las características de cada caso y del aspecto que han presentado los embriones durante su desarrollo.

Normalmente se lleva a cabo dos o tres días después de la recuperación de los ovocitos, pero hay situaciones en las cuales puede ser aconsejable esperar hasta cinco o seis días.

Microinyección espermática (ICSI)

La microinyección espermática intracitoplasmática (Intracytoplasmatic Sperm

Injection, ICSI) es una técnica que se puede aplicar en el curso de una FIV y consiste en la introducción de un espermatozoide dentro de un ovocito maduro. Su objetivo es facilitar la consecución de la fecundación. La ICSI es por lo tanto una alternativa a la técnica de inseminación “convencional” de los ovocitos.

La técnica proporciona porcentajes de fecundación situados alrededor del 70% de los ovocitos microinyectados y las tasas de degeneración son inferiores al 10%. Los casos en que no hay fecundación aplicando la ICSI son raros y son debidos a un bajo número y/o calidad de los ovocitos, a problemas ocultos en los espermatozoides, o bien por ovocitos que impiden una correcta activación (inicio del proceso de desarrollo posterior a la fecundación) del ovocito fecundado.

La ICSI requiere, a diferencia de la inseminación convencional de los ovocitos, una preparación específica de los ovocitos y de los espermatozoides, así como un complejo proceso de micromanipulación de los gametos para llevarla a cabo.

Indicaciones

El alta eficacia del proceso de ICSI ha provocado la generalización de su uso, más allá de la indicaciones originales para las cuales se empezó a aplicar la técnica, y que son

las siguientes:

Anomalías de los parámetros seminales La ICSI está especialmente indicada en aquellos casos en que los pacientes cuentan con baja concentración y/o morfología y/o movilidad espermática.

En estos casos las posibilidades de fecundación serían escasas o nulas inseminando los ovocitos de forma convencional. También la ICSI ofrece buenos resultados en aquellos hombres con factor inmunológico (presencia de anticuerpos antiespermatozoides en el semen).

Uso de espermatozoides testiculares La ICSI permite incluso obtener buenas tasas de fecundación cuando el eyaculado no contiene espermatozoides (azoospermia) debido a un problema obstructivo o secretor. En esta situación se obtienen los espermatozoides directamente de los testículos mediante una aspiración (TESA) o una biopsia testicular (TESE). Estas intervenciones son cortas, se realizan bajo anestesia local y el paciente puede retomar su actividad habitual pocos minutos después del procedimiento.

Ciclos previos de FIV con baja tasa o ausencia de fecundación.

Puede haber casos en que la inseminación convencional de los ovocitos ha revelado una baja o nula capacidad de los gametos para interactuar y dar lugar a embriones. Hay factores seminales, pero también ovocitarios, que pueden provocar este efecto. En la mayoría de casos la ICSI soluciona el problema.

Existen algunas situaciones extremas en las cuales no es posible o aconsejable recurrir a la ICSI como técnica de fecundación. Entre ellas están los casos en que no es posible encontrar espermatozoides ni en el eyaculado ni en el testículo (si bien en alguno de estos casos se pueden localizar en testículo células precursoras de espermatozoides e inyectarlas) o los casos en que la existencia de problemas genéticos en la formación de los espermatozoides desaconseja su utilización para finalidades reproductivas. La incidencia de este tipo de problemas genéticos aumenta cuanto más afectada esté la calidad seminal. Siempre que haya un factor masculino de esterilidad, es importante tener una valoración andrológica que permita detectar estos casos.

Metodología

1. Decumulación de los ovocitos Los ovocitos recuperados en una FIV están rodeados de un extenso y numeroso grupo de células llamadas células de la granulosa que forman una masa que recibe el nombre de “cumulus oophorus” o “corona radiata”.

Así como en la FIV con inseminación convencional se ponen en contacto los espermatozoides con los ovocitos rodeados de sus células del cúmulus y corona, en la FIV-ICSI hay que liberar los ovocitos de estas células. El proceso, que se llama decumulación, requiere la acción combinada de una sustancia o

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enzima llamada hialuronidasa con la repetida aspiración y expulsión del ovocito por un fino capilar.

La decumulación permite dejar al ovocito libre de células acompañantes y de esta forma puede ser valorado su aspecto, su grado de madurez y llevar a cabo la microinyección sin trabas. El diámetro aproximado de un ovocito es de 150μm (aproximadamente una décima parte de un mm).

2. Selección de los ovocitos maduros Es imprescindible seleccionar para la microinyección los ovocitos en estadio de Metafase-II, puesto que solamente estos presentan el grado de madurez necesario para ser correctamente fecundados. Los ovocitos muy inmaduros presentan en su interior un núcleo llamado Vesícula Germinal (estadio de Profase-I). Un grado de inmadurez menos acentuada es el estadio de Metafase-I, estadio en que desaparece el núcleo. Finalmente, cuando el ovocito está plenamente maduro (estadio de Metafase-II) aparece una pequeña célula adyacente al ovocito denominada Corpúsculo Polar, que contiene cromosomas sobrantes.

3. Preparación de la placa de microinyección La placa de microinyección es un pequeño contenedor especial de plástico donde se situarán unas microgotas (gotas muy pequeñas) con medio de cultivo

dentro de las cuales se colocaran los ovocitos maduros. También dispondremos una microgota con un medio viscoso donde se situarán los espermatozoides. El medio viscoso reducirá la velocidad de los espermatozoides, y permitirá inmovilizarlos y atraparlos con más facilidad.

Todas las gotas se cubren con un aceite que las protege de la desecación.

4. Preparación del equipo de micromanipulación El proceso de ICSI requiere un equipamiento sofisticado. Se trata de un microscopio situado en una zona estable del laboratorio en el cual están adaptados unos aparatos llamados micromanipuladores. Los micromanipuladores disponen de un complejo sistema que permite controlar el movimiento de las pipetas que llevarán a cabo la micromanipulación con una precisión inferior a un micrómetro. Otros aparatos diferentes, los microinyectores, se encargarán de aplicar una presión de succión o de expulsión de líquido por el interior de las citadas pipetas. Las pipetas son unos capilares de vidrio finísimos usados para sujetar el ovocito (pipeta de sujeción), así como para aspirar y microinyectar el espermatozoide (pipeta de microinyección). Las pipetas son estériles, desechables y hay que situarlas y centrarlas correctamente antes de cada ICSI.

5. Microinyección Consiste en la introducción de un espermatozoide dentro de un ovocito mediante micromanipulació. El proceso empieza por seleccionar un espermatozoide que presente movilidad e inmovilizarlo mediante una presión de la pipeta de microinyección sobre la cola del espermatozoide.

Seguidamente se aspira el espermatozoide con la misma pipeta. Después se

fija el ovocito con la pipeta de sujeci贸n. Finalmente se introduce la pipeta de microinyecci贸n en el interior del ovocito y se libera el espermatozoide. Este procedimiento se repite para cada uno de los ovocitos maduros.

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