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Indice
Il progetto Gli autori I coordinatori L’azienda Le attrezzature La teoria La sicurezza nei laboratori I microrganismi Terreni di coltura La conta microbica Gli esperimenti La conta microbica a 30° Esame della salmonella Sistema Api Colorazione di Gram
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IL PROGETTO
STAGE DI MICROBIOLOGIA
Gli alunni del Volta della classe III C, durante il periodo estivo, hanno seguito dei corsi teorico-pratici presso laboratori accreditati: corsi di microbiologia presso il Laboratorio polifunzionale Lachimer della durata di 40 h. Primo argomento del corso è stata la sicurezza in laboratorio trattato dalla dott.ssa Zenobio Cristiana con la raccomandazione sui comportamenti più equanimi da tenere all’interno di esso e l’organizzazione delle varie attività guidate da un esperto in materia
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All’interno del laboratorio il personale addetto alla guida dei corsi (la Dott.ssa Tonti) ha fornito informazioni riguardanti le diverse attrezzature che sarebbero tornate utili nel momento della pratica.
Successivamente, prima di poter passare direttamente al momento operativo, gli alunni hanno appreso grazie ad una lezione teorica i concetti fondamentali attinenti alle diverse tipologie dei microrganismi e alle loro esigenze e, di conseguenza, i principi da adottare per la scelta dei terreni che ne avrebbero permesso la crescita.
Gli ultimi concetti trattati, infine, sono stati quelli relativi alle diluizioni e ai metodi di conta in piastra dei ceppi coltivati.
Al termine della lezione teorica, gli alunni hanno potuto sperimentare le nozioni acquisite nella pratica. Si è visto, infatti, la preparazione di un campione solido, utilizzando ceppi microbici (E. Coli e Salmonella), scelti dai diversi gruppi di ragazzi, con l’utilizzo del terreno piÚ adatto al ceppo preso in considerazione. 4
La seconda lezione ha visto gli alunni impegnati nella norma della ‘Conta dei microrganismi a 30°C con un particolare strumento in grado di facilitare questa operazione mentre nelle lezioni seguenti la Dottoressa Tonti ha guidato i ragazzi nella coltura della Salmonella utilizzando brodi e terreni agarizzati.
Come ultima lezione, gli alunni sono stati in grado di ricercare tale microrganismo effettuando la colorazione di Gram, in grado di evidenziare le proprietà fondamentali della parete cellulare dei microrganismi, ed eseguendo l’analisi microscopica .
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Noi alunni al termine del corso abbiamo acquisito diverse competenze e ora siamo in grado di scegliere i diversi terreni di coltura ed esaminare semine per scopi ben precisi, effettuare le giuste diluizioni del campione preso in esame e successivamente eseguire, su campioni solidi, prove quantitative relativamente alla conta di microrganismi, utilizzando la semina per inclusione. Siamo in grado, inoltre, di eseguire la prova qualitativa della Salmonella utilizzando brodi o terreni agarizzati, effettuare la colorazione di Gram per l’identificazione dei microrganismi e, infine, interpretare i risultati ottenuti eseguendo l’analisi microscopica.
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Gli autori:
Erica Alloggio, Francesco Borneo, Rita Calabrese, Elena d'Errico, Chiara Di Laurenzo, Rosa Frontoni , Alessio Guadagno , Raffaele La Marra, Francesca Landini, Margherita Lo Campo, Immacolata Mastropietro, Giovanna Muscio, Leone Musci, Gabriella Pace, Alessandra Viggiano. Coordinatrice dello stage: prof.ssa Tea Macolino Tutor aziendale: dott.ssa Antonella Tonti Realizzatrice e-book: prof.ssa Luisa Frati
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L’ AZIENDA
L'azienda Speciale della Camera di Commercio di Foggia, denominata LACHIMER, opera allo scopo di fornire alle aziende, enti, organismi e ai privati cittadini, il supporto tecnologico in termini di analisi chimicomerceologiche e certificazioni di qualità, nonché di normative tecniche che sempre più rappresentano una esigenza per l'accesso ai mercati nazionali ed esteri. Il Laboratorio LACHIMER si è specializzato nei settori agroalimentare ed ambientale. Gli specifici servizi offerti vanno dalla determinazione dei residui di fitofarmaci in varie matrici alla determinazione del titolo e degli elementi nutritivi nei terreni o nei concimi, dalle analisi delle materie prime a quelle sui prodotti finiti, dalle analisi delle acque alle analisi e classificazione dei rifiuti, dalla valutazione degli ambienti di lavoro alla valutazione dei parametri ambientali.
Dal 1996 svolge attività di analisi, attraverso l'effettuazione di prove chimiche, fisiche e microbiologiche. Il laboratorio collabora attivamente sia con la Facoltà di Economia e Commercio che con la Facoltà di Agraria dell'Università degli Studi di Foggia e costituisce un punto di riferimento per l'attività didattica di vari istituti scolastici. E' autorizzato dal Ministero per le Politiche Agricole per le analisi chimico-fisiche valide ai fini della certificazione degli oli di oliva a denominazione di origine e per il rilascio di certificati per commercializzazioni, esportazioni, stoccaggio, distillazione ed arricchimento di vini e mosti sia nei paesi comunitari che extracomunitari. Il Lachimer è operativo nelle seguenti aree: - laboratorio chimico-merceologico 8
- analisi sensoriali sugli alimenti - laboratorio per prove su materiali da costruzione - consulenza nell'ambito della sicurezza alimentare - consulenza sui sistemi di gestione della qualità - consulenza sui sistemi di gestione ambientali - consulenza nell'ambito della responsabilità sociale - attività di formazione professionale
In particolare, l’area tecnica è suddivisa in tre sezioni: Laboratorio chimico merceologico, laboratorio prove su materiali da costruzione e Sala Panel. L'attività del “laboratorio chimico merceologico” è altamente specializzata nell'esecuzione di prove sulle seguenti matrici : • Acque potabili, Acque di scarico, Acque superficiali, Acque di mare • Prodotti agroalimentari (prove chimico-fisiche e microbiologiche) • Terreni • Fanghi • Rifiuti, Emissioni in atmosfera, Rilievi ambientali (aria, rumore, campi elettromagnetici)
Il laboratorio “prove su materiali da costruzione” si occupa delle prove sui materiali: Tale struttura opera infatti nel campo delle prove per la 9
caratterizzazione meccanica dei materiali da costruzione e degli elementi strutturali, come calcestruzzi, cementi, laterizi, acciai e determinazione del loro punto di rottura.
Infine, Lachimer si è dotato di una Sala Panel dedicata alle prove di assaggio ed alle analisi sensoriali su vari alimenti. Realizzata secondo le prescrizioni dell'Unione Europea, è idonea per l'effettuazione delle sedute di assaggio sugli oli, sui vini e su qualsiasi altra matrice alimentare. Vengono organizzati, utilizzando anche l'aula di formazione, corsi teorico-pratici per assaggiatori di olio, di vino ed per abituare il consumatore alla degustazione dei prodotti alimentari.
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LE ATTREZZATURE Strumenti del laboratorio microbiologico: - bilancia tecnica a due cifre: si utilizza per pesare campioni, terreni, vetreria ecc; - stomacher: serve a rendere liquido un campione solido il quale si introduce con il solvente (diluente) in un sacchetto sterile, l'alimento viene poi spappolato meccanicamente e i microbi passano direttamente ne diluente; - cappa a flusso laminare: cappa utilizzata per la protezione dell'operatore e dell'ambiente circostante da parte di agenti biologici (generalmente microrganismi patogeni); la sterilizzazione dell'aria all'interno della cappa viene realizzata forzandone il passaggio attraverso filtri realizzati in micro fibra di vetro che garantiscono aria "pura" al 100%; - microscopio ottico: tipologia di microscopio che sfrutta la luce con lunghezza d'onda dal vicino infrarosso all'ultravioletto, coprendo tutto lo spettro visibile; - contacolonie: utilizzato per contare le colonie, visibili come bottoncini presenti n volte, pigiando; - bagno termostatico: tiene costanti le temperature dei terreni precedentemente autoclavati a 45°C-47°C-48°C per mantenerli allo stato liquido; successivamente verranno fatti solidificare; - apparato della filtrazione: utilizza la tecnica delle membrane filtranti o dell'MPN che consiste in una membrana adagiata su una base, poi viene sovrapposto un imbuto; introdotta l'acqua, si aspira il liquido cosÏ viene concentrato. Tecnica maggiormente utilizzata per la filtrazione dell'acqua; - terreni (di coltura): hanno composizioni diverse ma tutti permettono lo sviluppo di microbi. Esempi di terreni di coltura sono: l'AGAR (composto principalmente da polisaccaridi estratti da alghe rosse), TBX (pezzo di carne con sali biliari), BYPARKER (litiocloruro e estratto di lievito); - giara: contenitore ermetico utilizzato per creare la situazione ideale per i microbi a livello gassoso. Contiene: un incubatore per condizioni di anaerobiosi e un contenitore ermetico sul quale adagiare le piastre e le buste con dei catalizzatori che consumato tutto l'ossigeno e producono CO 2 oppure catalizzatori che consumano parte dell'ossigeno; 11
- incubatori: simili a forni da cucina utilizzati per l'esigenza di una specifica temperatura del microrganismo
http://www.youtube.com/watch?v=hT2CiJzfF9s Il becco Bünsen o semplicemente Bünsen è un bruciatore utilizzato nei laboratori di chimica perché produce una fiamma ben controllabile con temperature fino a 1500 °C. È formato da un cannello verticale solitamente in acciaio, fissato su una base metallica ed è alimentato a gas (mediante un tubo di ottone); quest’ultimo entra nel bruciatore attraverso un iniettore a ugello posto alla base dell'apparecchio ed è possibile regolare la quantità di gas mediante un apposito rubinetto. Nella parte inferiore, il cannello presenta due fori opposti ed è circondato da un manicotto, che serve a regolare la quantità di aria aspirata e, quindi, immessa all'interno della canna del bruciatore, anche esso fornito di due fori: se i fori dell’aria sono aperti, avremo una fiamma ossidante, caratterizzata dalla poca luminosità e dal colore azzurro; mentre, se i fori dell’aria sono chiusi, avremo una fiamma riducente, caratterizzata da una fiamma giallo arancio luminosa.
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Il termine autoclave indica in senso stretto un tipo di chiusura ermetica in cui la differenza di pressione positiva tra l'interno e l'esterno del recipiente agevola la tenuta di una temperatura (121°C), la quale alla pressione atmosferica non potrebbe essere raggiunta. L'autoclave è un recipiente ermetico nel quale rimuoviamo l'aria, questo permette all'acqua presente di evaporare e dato che il vapore non si può disperdere si determinerà un aumento della pressione all'interno della camera. La presenza di una pressione maggiore a quella atmosferica determina un aumento della temperatura di ebollizione. Raggiunta la temperatura di 121°C si eliminano i microrganismi e le spore dei batteri mediante denaturazione delle loro proteine e altre biomolecole. Nella fotografia in alto, un’ autoclave è stata riempita con una bottiglia da 100ml contenente acqua peptonata e un'altra da 150ml contenente il diluente. Vi sono inoltre delle provette contenenti 9 ml di diluente ciascuna. La sterilità è importante nella fase di campionamento e nella fase di trasporto in quanto il campione non deve essere contaminato da microrganismi che altrimenti altererebbero la sua composizione e lo renderebbero infetto.
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LA TEORIA
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SICUREZZA Il primo giorno di stage, la prima lezione tenuta dalla dottoressa Cristiana Zenobio, ha avuto come tema principale quello della sicurezza in laboratorio.
ci è stato mostrato il simbolo di rischio biologico, per rischio biologico si intende il Rischio connesso con l’esposizione a organismi e microrganismi patogeni e non, colture cellulari, endoparassiti umani presenti nell’ambiente di lavoro a seguito di emissione e/o trattamento e manipolazione di questi ultimi. Le principali vie di trasmissione per gli agenti biologici in laboratorio sono le seguenti : inalazione, ingestione, inoculazione, contaminazione di cute e mucose ( per schizzi, spargimenti o per contatto con superfici o oggetti) Per questo si distinguono diversi livelli di biosicurezza (BSL) a seconda della classe di pericolosità. Livello 1: laboratorio di base (per i microrganismi di classe 1) Livello 2 : laboratorio di base (per i microrganismi di classe due , ad esempio : salmonella, legionella,ecc.) Livello 3 : laboratorio di base (per i microrganismi di classe 3, ossia i virus) Livello 4 :Laboratorio di base 4 (per i microrganismi di classe 4, i virus mortali) BSL 1: per il laboratorio di base uno è necessario: -
Il lavaggio delle mani
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Un limitato accesso al laboratorio durante il lavoro 15
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È vietato mangiare, bere, fumare
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Decontaminare le superfici almeno una volta al giorno
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Decontaminare i rifiuti
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Attuare sistemi di controllo per insetti e roditori
BSL 2 : Per il laboratorio di base due sono validi tutti i punti precedenti e a questi si aggiungono: -
Arredi e finiture facili da pulire
È necessario l’uso di una cappa biologica di sicurezza per qualsiasi manipolazione che comporti il rischio di areosol BSL 3 : Per il laboratorio di base tre sono validi tutti i punti elencati precedentemente e a questi si aggiungono : Un sistema di ventilazione per creare una pressione negativa rispetto alle aree circostanti ( Perché una bassa temperatura rallenta la velocità di moltiplicazione dei microbi)
I MICRORGANISMI Studio dei microrganismi
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Una condizione per poter studiare i microrganismi, è poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio è quella di conoscere la loro alimentazione, la loro temperatura di sopravvivenza ecc. I microrganismi nascono, crescono, si riproducono e muoiono. In passato gli ingredienti utilizzati per la formazione dei terreni erano naturali e poco standardizzati, oggi invece i substrati vengono formulati a partire da ingredienti standardizzati (semplici o complessi) o possono essere acquistati in forma disidratata, con ingredienti già premiscelati per soddisfare le esigenze nutrizionali dei microbi (presentano azoto, fosforo ecc.). Tutte le sostanze sostanze nutritive, naturalmente devono essere in soluzione (acqua). Agar L’Agar è cellulosa cioè estratto polisaccaridico di alghe rosse marine della famiglia delle gelicae.
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Non svolge altre funzioni nel terreno che non sia quella solidificante: non presenta perciò alcune caratteristiche nutritive per i microbi. ESIGENZE GASSOSE: È importante per la crescita batterica soddisfare anche le esigenze gassose, i microrganismi si suddividono infatti in : •
Aerobi
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Anaerobi
•
Aerobi Anaerobi facoltativi (incubatore Anaerobi o giara)
• Microaerofili si accrescono in presenza di piccole quantità di ossigeno (Es. carciofini sott’olio)
Per quanto riguarda l’analisi alimentare, svolta anche da noi in laboratorio, se in un alimento sono presenti gli Anaerobi vuol dire che il processo di produzione dell’alimento non è stato controllato ed il prodotto è pericoloso (Es. A 95°C-98°C deve avvenire la pastorizzazione). • Infatti quando il processo di produzione dell’alimento non è controllato possono crescere Anaerobi o Muffe, cioè microrganismi che alterano il ph e fanno passare una potenziale spora alla forma vegetativa.
ESIGENZE DI TEMPERATURA Oltre alle esigenze gassose, per lo studio dei microrganismi, è necessario anche esaminare le loro esigenze di temperatura, infatti i vari tipi di microrganismi gradiscono temperature diverse per il proprio habitat ottimale, essi si suddividono in: - Psicofili: prediligono il freddo 10°C 18
- Mesofili: prediligono temperature intermedie 37째C - Termofili: prediligono il caldo 55째C
TERRENI DI COLTURA
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In questa foto sono presenti alcuni dei terreni di coltura che la Dottoressa Tonti ci ha mostrato. Generalmente i terreni di coltura sono delle soluzioni solide o liquide contenenti sostanze nutritive su cui è possibile crescere cellule eucariote e procariote. I terreni di coltura batterici, cioè quelli su cui è possibile crescere colonie batteriche e altri procarioti, sono più semplici di quelli eucariotici. Nella foto è presente anche il BGA, un terreno selettivo (sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Questi fattori sono chiamati sostanze inibenti e possono essere antibiotici, coloranti o sali.) Il BGA (Brilliant green agar) contiene lattosio e saccarosio 20
che, se fermentati dai batteri, cambia colore in un verde brillante, altrimenti si ha un viraggio verso il colore rosso. Le colonie si presentano come colonie rosse circondate da terreno rosso. Il terreno ha un’elevata azione inibitrice nei confronti di E. coli, Proteus e Pseudomonas. Oltre al BGA troviamo anche alcuni campioni, preparati dai ragazzi grazie all’aiuto della Dottoressa Tonti, creati con l’utilizzo di tamponi effettuati precedentemente su oggetti di uso comune (Maglie, penne ecc.).
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In questa foto possiamo vedere il terreno di coltura XLD Agar che è un terreno differenziale e moderatamente selettivo per l'isolamento e la differenziazione di patogeni enterici Gram-negativi (Salmonella e Shigella) e utilizza l'estratto di lievito come fonte di nutrienti e vitamine e il desossicolato di sodio come agente selettivo per inibire i microrganismi Gram-positivi. Le salmonelle sono bacilli Gram-negativi, asporigeni, anaerobi facoltativi, presenti nell'ambiente e possono essere sia commensali sia patogeni per uomini e per vari animali; alcuni sierotipi lo sono esclusivamente per l'uomo (es. S. typhi e S. paratyphi A e C), altri si adattano anche ad altri animali (es. S. typhimurium ).
CONTA MICROBICA A 30°C
Per determinare il grado di contaminazione batterica di un alimento si effettua la conta microbica. Di quest’ultima ce ne sono diversi tipi, quella da noi utilizzata è la conta microbica in piastra a 30°C, basata sulla produzione di colonie microbiche su terreni agarizzati (ossia a base di agar, una sostanza nutritiva che permette la crescita microbica). Ecco come avviene : PRIMA FASE : Preparazione del campione Si prepara il campione per far sì che esso sia omogeneo: • Se il campione è solido, esso viene in un primo momento pestato in un mortaio poi omogeneizzato con del diluente e infine ‘’spappolato’’ meccanicamente mediante un apparecchio chiamato Stomacher che lo rende liquido. • Se invece il campione è liquido, esso viene semplicemente posto con del diluente all’interno di uno strumento chiamato Vortex, per essere omogeneizzato. 22
SECONDA FASE : Conta delle colonie presenti su piastra Dalla busta dello Stomacher viene prelevato 1mL di prodotto, messo in piastra e incubato. A questa operazione segue la lettura della piastra e se risulta che il numero di colonie batteriche è troppo elevato (superiore a 300 UFC) bisogna effettuare delle diluizioni per rendere la piastra contabile.
TERZA FASE : Diluizioni Mostriamo nelle immagini qui di seguito come avvengono le diluizioni :
si preparano un numero X di provette con 9 mL di diluente e lo stesso numero di piastre, si scrive il fattore di diluizione sia sulle piastre che sulle provette (esempio : 102, 103,ecc.) e successivamente si preleva 1 mL di prodotto dalla busta della Stomacher e lo si pone nella prima provetta, poi un ml di prodotto dalla prima provetta e lo si pone nella seconda, e cosĂŹ via. 23
Al termine di questo processo si preleva un determinato quantitativo di prodotto da ogni provetta per effettuare la semina nelle relative piastre con il corrispondente fattore di diluizione.
QUARTA FASE : Conta delle colonie. Si sceglie una piastra che abbia un numero di colonie tali da poterle contare; per definire il numero di colonie iniziale, si moltiplica il numero di colonie contate per il fattore di diluizione, in questo modo sarĂ possibile determinare il grado di contaminazione microbica.
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GLI ESPERIMENTI
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LA CONTA MICROBICA A 30째C
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Dopo aver descritto genericamente la conta microbica a 30°, viene mostrato lo svolgimento di questo esperimento durante il ministage di microbiologia effettuato con l’assistenza della dott.ssa Tonti. Le apparecchiature utilizzate per lo svolgimento del suddetto esperimento sono state le seguenti (alcune di queste sono mostrate in figura) : Bottiglie da 250 mL e bottiglie d 100 mL, provette, portaprovette, pipette, propipette, cucchiai, cilindro (per dosare l’acqua) e bilancia
Per la conta microbica a 30°C ci si è occupati di esaminare (per gruppo) un campione di mozzarella, uno di insalata, uno di pasta fresca e uno di biscotti. Lo scopo era quello di evidenziare la presunta contaminazione batterica dei suddetti alimenti. Al fine di renderli analizzabili, sono stati resi liquidi, 27
mediante l'utilizzo dello stomacher,(in figura infatti possiamo notare un campione di biscotti precedentemente pestato e posto con del diluente all’interno di un sacchetto sterile per poi essere omogeneizzato dallo stomacher) e diluiti più volte per far rientrare le colonie nei limiti di contabilità (dalle 20 alle 300 colonie batteriche). Sono state preparate piastre e provette, sulle quali sono stati scritti i diversi fattori di diluizione e si è proseguito attuando quest’ ultime.
Questa foto rappresenta i microbi presenti nell’ambiente del laboratorio. Questo esperimento è stato condotto dalla professoressa Tonti, utilizzando una coltura mista, in cui crescono microbi di origine diversa. Il terreno 28
utilizzato è stato l’Agar, un estratto polisaccaridico di alghe marine rosse, che serve a solidificare le piastre e permette di isolare e contare i microbi. In seguito si è proceduto a contare le UFC (unità formanti colonie), identificando le diversità morfologiche tra le varie colonie presenti nella piastra, tramite il contatore di particelle: erano presenti rizoidi, irregolari, filamentose, convesse, umbonate e con margini sia interi che ondulati. E’ stata inoltre riscontrata la presenza di muffe, ovvero organismi alteranti pluricellulari che si riproducono per mezzo di spore ma, alterando il PH, possono far trasformare le spore in batteri
Questo “esperimento” ci è stato mostrato il primo giorno di lavoro dalla Dottoressa Tonti, utilizzando terreni nutritivi già preparati in precedenza : 29
essi sono terreni ricchi di nutrienti, come peptoni, estratti di carne magra, rosso d'uovo, albumina o miscele chimicamente definite (ad esempio vitamine o aminoacidi) che consentono la crescita di specie microbiche esigenti da un punto di vista nutritivo. In seguito, è stata prelevata dalle unghie di alcune compagne, con un bastoncino immerso in una soluzione tampone, una discreta quantità di microrganismi. Abbiamo lasciato incubare per 24 ore nell’incubatore, a una temperatura compresa tra i 30°C e i 37°C e, infine, abbiamo rilevato la presenza di numerose colonie batteriche, a dimostrazione del fatto che, solamente in un piccola parte del nostro corpo, vivono ingenti quantità di microbi
ESAME SALMONELLA
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Queste foto mostrano la preparazione sul becco Bunsen di due terreni differenziali XLD e BGA che servono per l’identificazione della salmonella. Il terreno XLD di colore rosso e BGA verde-marrone vengono utilizzati nella fase di isolamento della salmonella. La salmonella su terreno XLD si presenta con colonie nere mentre su BGA si presenta con colonie rosa antico. In microbiologia ci sono quattro tipi di terreni: nutritivi, selettivi, differenziali e di arricchimento. •I nutritivi sono terreni ricchi di nutrienti che consentono la crescita di specie microbiche esigenti dal punto di vista nutritivo. 31
•I selettivi sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Es. fattori: antibiotici, sali. •I differenziali sono terreni che grazie alla presenza di particolari componenti permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri. Es. componenti: indicatori di PH, indicatori di reazioni redox, amminoacidi. •Di arricchimento sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare grazie alla presenza di fattori che rallentano la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.
SISTEMA API
L’ultimo giorno dello stage, la dottoressa Antonella Tonti ci ha mostrato come effettuare un sistema Api 20 E, nonché un sistema d’identificazione di enterobatteri ed altri batteri Gram negativi. La galleria Api 20 E consiste in 20 32
microcelle contenenti terreni disidratati. I test vengono inoculati con una sospensione batterica che ricostituisce i terreni. Le reazioni prodotte durante il periodo di incubazione si traducono in viraggi colorati spontanei o rilevati dall’aggiunta di reattivi. Esso è costituito da una base e da un coperchio in plastica
Dopo aver osservato il procedimento effettuato dalla dottoressa, ogni gruppo ha ripetuto l’esperimento con il ceppo di Escherichia Coli o Salmonella assegnatogli. Il procedimento consisteva nel riempire di acqua distillata le capsule presenti nella base per mantenere umido l’Api 20 E. Poi bisognava sollevare la base e riempire con una soluzione fisiologica sia le celle e nelle cupole dei CIT, VP e GEL test, invece riempire solo le celle degli altri test. Creare un’anaerobiosi nei test: ADH,LDC,ODC,H2S,URE ricoprendo le cupole con olio di paraffina. Richiudere la vaschetta e incubare a 35-37 °C per 18-24 ore. http://www.youtube.com/watch?v=ekRPD-eojd4
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Infine per effettuare la galleria abbiamo trascritto sulla scheda dei risultati tutte le reazioni spontanee, che si manifestano con una diversa colorazione delle celle. Per far ciò abbiamo consultato una tabella di lettura.
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COLORAZIONE DI GRAM
FASE 1: ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per un 1 minuto (tutte le cellule diventano viola) FASE 2: aggiungere soluzione iodata per 3 minuti. (le cellule rimangono viola) FASE 3: decolorare per 20 secondi. Le cellule Gram + risulteranno viola, i Gram - blu. FASE 4: Gram +: hanno introdotto il colorante e con l'alcol lo tengono, perchĂŠ hanno fissato con la soluzione di iodio Gram - : perdono la prima colorazione blu e diventano rossi PEPTIDOGLICANO Per differenziarli: uso 2 coloranti diversi intervallati da un decolorante
In questo video http://www.youtube.com/watch?v=hT2CiJzfF9s
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ci viene mostrato come una collaboratrice, dopo aver accuratamente sterilizzato un semplice filo di ferro, lo immerge nel liquido da analizzare e lo adagia nella capsula dove era presente il terreno da coltura. Se in quel liquido saranno presenti determinati batteri di cui vogliamo verificarne la presenza, essi compariranno dopo alcuni giorni.
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