STRAHLQUELLEN
Bild 1. Routineeinsatz eines Multiphotonenmikroskops bei der Untersuchung von Zellstrukturen
Kurzpulslaser erobern die Multiphotonenmikroskopie Günstige und zuverlässige Alternative in der Forschung Stefan Kremser, Wessling Titan-Saphir-Laser werden häufig in der medizinisch-biologischen Forschung eingesetzt, sind aber komplex und teuer. Kurzpulslaser, basierend auf diodengepumpten Festkörperlasern, bieten günstige und anwenderfreundliche Perspektiven in der Multiphotonenmikroskopie. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine bewährte Methode zur ortsaufgelösten Untersuchung von biologischen Mikrostrukturen. Die Proben werden mit Fluorophoren präpariert, die bei geeigneter Anregung mit Laserlicht ihre charakteristische Fluoreszenz abgeben. Die Beobachtung dieser Fluoreszenz unter dem Mikroskop erlaubt präzise Aussagen über Zellstrukturen und ermöglicht Rückschlüsse auf chemische Abläufe innerhalb der Zellen.
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Hohe Fluoreszenzausbeute erfordert leistungsstarke Laser Im Gegensatz zur klassischen Anregung, bei der ein einziges hochenergetisches Photon die erforderliche Energie bereitstellt, werden die Fluorophore bei der Multiphotonenmikroskopie durch die fast gleichzeitige Absorption mehrerer niederenergetischer Photonen des Anregungslasers angeregt. Lebende Zellen
werden dadurch erheblich weniger geschädigt. Die Wahrscheinlichkeit einer Multiphotonenabsorption ist dabei sehr gering und wächst exponenziell mit der Laserintensität an. Im Fokus des Laserstrahls ergibt sich dadurch eine sehr gute Lokalisierung der Fluoreszenz und somit ein hoher Kontrast im aufgenommenen Bild. Für eine ausreichende Fluoreszenzausbeute sind jedoch leistungsstarke Laser erforderlich. Aus diesem Grund werden Kurzpulslaser eingesetzt, die bei Pulslängen von wenigen 100 fs Pulsspitzenleistungen von mehreren 100 kW abgeben. Modengekoppelte Titan-Saphir-Laser findet man häufig in solchen Anwendungsfällen. Als Lasermedium dient ein Titan-Saphir-Kristall, der von einem diodengepumpten und frequenzverdoppelten Festkörperlaser gepumpt wird. TitanSaphir- Laser geben Femtosekundenpulse hoher Pulsspitzenleistungen mit Wellenlängen zwischen 700 und 1000 nm ab. Die Stärke des Titan-Saphir-Lasers liegt in der Durchstimmbarkeit der Wellenlänge, wodurch die maximale Absorptionsrate bestimmter Fluorophore optimal getroffen werden kann. Um jedoch eine optimale Leistung an den Grenzen des Wellenlängenbereichs (besonders im langwelligen Bereich bei 1000 nm) zu erreichen, muss der Laser nachjustiert werden. Obwohl Titan-Saphir-Laser deutlich kleiner und zuverlässiger geworden sind, bleiben noch Nachteile, wie hohe Anschaffungs-, Betriebs- und Wartungskosten und höhere Anforderungen an den Benutzer, bestehen.
KONTAKT Laser 2000 GmbH, 82234 Wessling, Tel. 0 81 53 /4 05 -0, Fax 0 81 53 /4 05 -33, www.laser2000.de
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Titan-Saphir-Kristall oder Ytterbium Moderne Kurzpulslaser basieren auf diodengepumpten modengekoppelten Festkörperlasern. Als Lasermedium dient Ytterbium, das im Gegensatz zum TitanSaphir-Laser direkt mit einer Hochleistungslaserdiode gepumpt wird. Ein zusätzlicher Laser mit Frequenzverdopplung ist nicht erforderlich. Hohe Zuverlässigkeit, einfache Bedienbarkeit und ein geringerer Preis sind die Folge.
die Multiphotonenanregung bei 1030 nm gegenüber einer kürzerwelligen oder Einphotonenanregung Vorteile: ■ Fluorophore lassen sich gezielt und tief im Präparat anregen, da infrarotes Licht von den meisten biologischen Substanzen nur wenig gestreut und absorbiert wird. ■ Infrarotstrahlung schädigt lebende Präparate erheblich weniger als kürzerwellige Strahlung. ■ Die Wellenlängen des Anregungslichts und der Fluoreszenz liegen weit auseinander, sodass die Fluoreszenz über einen breiten Spektralbereich beobachtet werden kann, ohne dass es zum Übersprechen mit dem Anregungslicht kommt. Die Folge ist ein geringes Hintergrundrauschen bei hoher Fluoreszenzausbeute. ■ Sehr gute Lokalisierung der Fluoreszenz und damit hoher Bildkontrast im Laserfokus durch die starke Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Laserintensität.
spielsweise der ›t-Pulse-20‹ von Amplitude Systemes, ist klein und lässt sich mit 20 x 12 x 60 cm3 leicht in ein Mikroskopsystem integrieren. Die Laser sind für den täglichen routinemäßigen Einsatz konzipiert. Außerdem sind sie wartungsfrei und gewährleisten einen zuverlässigen Betrieb. Die Multiphotonenmikroskopie entwickelt sich aufgrund der Vorteile gegenüber der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie zu einer der wichtigsten Messmethoden in der medizinisch-biologischen Forschung. Der diodengepumpte modengekoppelte Festkörperlaser kann helfen, die Multiphotonenmikroskopie als Routinemessverfahren für einen breiten Anwenderbereich zugänglich zu machen. Dr. Stefan Kremser ist Vertriebsingenieur bei Laser 2000 in Wessling.
Zuverlässig und einfach zu bedienen Bild 2. Hippocampus-Neuron einer Maus – Zweiphotonenanregung von GFP und Alexa568 bei 1030 nm
Für den praktischen Einsatz eines Kurzpulslasers in der Multiphotonenmikroskopie spielen die Lasergröße, der Stromund Wasserverbrauch, die einfache Bedienbarkeit und hohe Zuverlässigkeit eine entscheidende Rolle. Nicht-Laser-
Ytterbium-dotierte Festkörperlaser emittieren im modengekoppelten Betrieb Pulse mit Pulslängen zwischen 200 und 400 fs bei Pulsspitzenleistungen zwischen 100 und 500 kW. Die Pulswiederholraten liegen zwischen 10 und 50 MHz, sodass sich mittlere Leistungen von 1 bis 2 W ergeben. Die Wellenlänge liegt im infraroten Spektralbereich bei 1030 nm und ist im Gegensatz zum Titan-Saphir-Laser festfrequent. Dies ist Bild 3. Laserkopf und Controller des t-Pulse 20 von Amplitude Systemes jedoch bei den meisten Anwendungen kein Nachteil. Bei be- spezialisten müssen das Mikroskop samt kannten Fluoreszenzproteinen, wie GFP Laser im täglichen Laboralltag routineoder DsRed, liegt das Maximum der Zwei- mäßig betreiben können. Diodengephotonenabsorption bei 970 beziehungs- pumpte Festkörperlaser kommen daher weise 1150 nm. Die Anregung ist daher mit einem normalen 220-V-/500-W-Netzbei 1030 nm sehr effektiv. Selbst bei anschluss aus. Die Pumpdiode wird über Messungen mit Fluorophoren, die weni- einen kleinen geschlossenen Wasserger effektiv angeregt werden können, hat kreislauf gekühlt. Der Laserkopf, bei-
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