Prostaglandines, inflammation et dégradation cartilagineuse by francis berenbaum

Marjolaine Gosset Francis Berenbaum

Master M2 – Bobigny Décembre 2008

Prostaglandines, inflammation et dégradation cartilagineuse UMR 7079

La dĂŠgradation cartilagineuse

Sain

Polyarthrite rhumatoĂŻde

Arthrose

Le cartilage articulaire est un tissu atypique

Absence de vascularisation (hypoxie) • •

Eau (90%) Macromolécules (10%)  Collagène (collagène de type II)  Protéoglycanes haut PM (agrécane)

• • •

Unique type cellulaire Cellules différenciées Absence de prolifération cellulaire

Caractéristiques microscopiques de la dégradation du cartilage • dégradation de la matrice (MMP) QUANTITATIVES • apoptose des chondrocytes

Cartilage sain

Cartilage pathologique

• synthèse d’une matrice de mauvaise qualité QUALITATIVES • anomalies de la différenciation chondrocytaire

Les Métalloprotéases

* * * * * *

* = impliquées dans la dégradation du cartilage

Les Agrécanases ADAMTS– a disintegrin and a metalloproteinases with a thrombospondin motif

Mort and Billington Arthritis Res 2001

ADAMTS-4

ADAMTS-5

Modèle OA- cartilage chien - Pelletier et al. Arthritis Research & Therapy 2005

Dégradation de la matrice par les MMP et les ADAMTS exemple de l’agrécane

Nagase and Kashiwagi Arthritis Res Ther , 2003

Les médiateurs solubles de la dégradation du cartilage Espèces réactives de l’oxygène (ROS) NO

H2O2

Cytokines

Prostaglandines

IL1 +++ IL17

PGE2+++ Leucotriènes

Adipokines Leptine Visfatine

Composants de la matrice Fibronectine, Fragments de coll II

Articulation dégradée

La dégradation du cartilage résulte d’un déséquilibre de son homéostasie Stress mécanique Cyclique - faible intensité

BMP

Stress biochimiques

TGF-β IL-10

IGF-1

IL-4

Anabolisme

PGE2

Statique - excessif NO PGE2

Catabolisme

synthèse de dégradation de matrice matrice Déséq Homéostasie uilibre

TNFα IL-17 IL-1β

MMP ADAMTS

Les stress biochimiques D’un point de vue cellulaire. Médiateurs solubles inflammatoires ROS Composants de la matrice

Facteurs cataboliques

Voies de signalisation inductible

MAPK

NF-κB

Régulation transcriptionelle et post-transcriptionnelle c-fos c-jun

CREB

egr-1

AP-1 CRE GC

MMPs Agrécanases Interleukines NO Prostaglandines

Les voies de signalisation inflammatoire du chondrocyte

Goldring Best practice, 2006

IL-1 et dégradation du cartilage – exemple de la polyarthrite rhumatoïde

Les stress biochimiques D’un point de vue cellulaire. Médiateurs solubles inflammatoires ROS Composants de la matrice

Facteurs cataboliques

Voies de signalisation inductible

MAPK

NF-κB

Régulation transcriptionelle et post-transcriptionnelle c-fos c-jun

CREB

egr-1

AP-1 CRE GC

MMPs Agrécanases Interleukines NO Prostaglandines

La PGE2est un médiateur de la dégradation du cartilage Amin et al, JCI, 1997.

Sain

Arthrosique

Sain + IL-1, TNF, LPS

X 18

X 50

arthrite au collagène mPGES-1 +/+

mPGES-1 -/-

Trebino et al, PNAS U S A, 2003. EP4 +/+

Mc Coy et al, JCI, 2002.

Arthrosique

EP4 -/-

La cascade de l’acide arachidonique Phospholipides membranaires PLA2

AINS ulcère & saignement gastro-intestinaux

Acide arachidonique COX-1

COX-2

PGH2

Coxib

risque cardiovasculaire

mPGES-2 cPGES

TxA2 TxB2

PGF2α

mPGES-1

PGE2

PGI2

Inhibiteurs spécifiques

PGD2 15d-PGJ2

La prostaglandine E synthétase microsomale de type -1 •

découverte en 1999 – nommée MGST1-L1 famille des MAPEG (membrane-associated proteins involved in eicosanoid and glutathione metabolism). Ex : Leucotriene C4 synthase (LTC4 synthase), 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP)

•

Structure primaire hautement conservée 152 AA – 16 KDa

•

Enzyme basale forte: vésicules séminales, prostate, testicule, vessie, glande mammaire et placenta.

inductible – couplée à COX-2 •

Implication dans processus physiopathologiques: ex : douleur, fièvre, résorption osseuse, athérosclérose

Expression de la mPGES-1 dans les chondrocytes : exemple de l’arthrose Pas de régulation par l’IL-4, IL-6, IL-10, IL-8

IL-1 IL-1 R

erk

MAPK + Kojima et al, Arthritis Res Ther, 2004

COX-2

Masuko-Hongo et al, Arthritis Rheum, 2004 Kojima et al, Fundam Clin Pharmacol, 2005 Bianchi et al, Arthritis Res Ther, 2005 Li et al, J Rheumatol. 2005

NF-κB mPGES-1

PPARγ

+ PGH2

15d-PGJ2

p38

AMPc

+ PGE2

EP2/4 PGE2

Induction de la synthèse de PGE2 dans les chondrocytes soumis à l’IL-1

IL1 24h

IL1 18h

IL1 8h

IL1 4h

IL1 2h

IL1 1h

IL1 30min1

h IL

18 T

IL1 18h

IL1 8h

8h 1

6h 1 IL1 6hIL

4h 1 IL

IL1 4h

COX 1

IL1 1h

IL1 30minI

m n

IL1 15minL1

IL1 8h I

IL1 30min

IL1 15min

0,5

1,5

2,5

IL1 18h

m n

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

IL1 4h T

3,5

Expression4500 en ARNm gène d’intérêt/HPRT - RT - PCR quantitative en temps réel PGE2 (pg/mL)

IL1 1h

mPGES-1

COX 2

IL-1β – 10ng/ml C

15 ‘

30’

18h

24h

mPGES-1 β-actine

Masuko-Hongo et al. Arthritis Rheum, Sept 04

Régulation de l’expression de la mPGES-1 C/EBPβ C/EBPδ

GRE

C/EBPβ

Analyse par délétion du promoteur AP1

5’

SP1 -125

Barbie boxes -98

activité CAT relative

construction

-1200

CAT

-13

-822

-550

-13

-177 -13

- IL-1β

+ IL-1β

mPGES-1 et dĂŠgradation du cartilage

mPGES-1 et MMP13

mPGES-1 et MMP3

e surpoids, premier facteur de risque de la gonarthrose 1er lien: les contraintes mécaniques Facteurs cataboliques

Stress mécanique

Voies de signalisation inductible

MAPK

NF-κB

Régulation transcriptionelle et post-transcriptionnelle c-fos c-jun

CREB

egr-1

AP-1 CRE GC

MMPs Agrécanases Interleukines NO Prostaglandines

Le stress mécanique assure la nutrition du chondrocyte Stress mécanique : - cyclique/faible intensité - statique délétère

bénéfique

Intensité des stress in vivo: 0.1 – 10 MPa

Le stress mécanique module le métabolisme du chondrocyte articulaire Les intégrines

Stress mécanique

canaux ioniques

médiateurs solubles

voltage SAC dépendant α5β1

déformation MP cytosquelette

Intégrines, CD44

Voies de signalisation

Prot Kinase – Phospholipases - MAPK - NF-κB

C-fos C-jun

CREB

egr-1 NF-κB

AP-1 CRE GC SSRE

+/Synthèse de: matrice (collagène, agrécane) médiateurs solubles (NO - PGE2) enzymes (MMP)

+/Prolifération cellulaire

Mise au point du modĂ¨le de compression

Souriceau de 5 jours

Cage thoracique

Flexercell Compression system plus

Pool de fragments de cartilage

BoĂŽte de culture Biopress

La synthèse de NO et de PGE2 • monoxyde d’azote

• prostaglandine E2 Libération de PGE2

Libération de NO

(induction/contrôle NC)

700

700 NC C

600 500

***

400

***

300

600

***

300

***

100

100 2h

18h

NC C

400

200

***

500

200

***

24h

***

0 2h

18h

24h

Implication des voies de mécanoréception Implication de l’intégrine α5β1

Invalidation d’un rôle potentiel de l’IL-1β

fibronectine RGD β1 α5

IL-1Ra

Pas de signalisation

Ac β1

IL-1 signalisation 800 Libération de PGE2 700 (induction/contrôle NC) 600 500 400 300 200 100 0 IL-1Ra NC

900 800

700

Libération de PGE2 (induction/contrôle NC)

α5

Ø signalisation

* ***

600 500 400 300 200 100 0 C

cont

Ac Ac non bloq bloq NC

cont

Ac non bloq C

Ac bloq

Les gènes mécanosensibles (1) COX-2

NON COMPRIME

COMPRIME

mPGES-1

cPGES

mPGES-2

Les gènes mécanosensibles (2): expression des cyclooxygénases expression relative des ARNm de COX-2/HPRT

2,5 2 1,5

PGH2

NC C

4h -

18h

24h

Compression COX-2

COX-1

0,5

COX-3

ARNm COX-1/HPRT COX-1/HPRT

1,5

0,5

COX

12h

β −actine

ARNm de COX-3/HPRT

0 NC

Les gènes mécanosensibles (3): expression des prostaglandines E synthétases 8 7 6 5 4 3 2 1 0

PGES

expression relative des ARNm de mPGES-1/HPRT

PGH2

NC C

2h -

PGE2

4h -

18h +

24h - +

Compression mPGES-1 cPGES

12h

mPGES-2 β−actine

ARNm mPGES-2/HPRT

ARNm cPGES/HPRT 2 1 0

2 1 0 NC

Les voies de mécanotransduction: mécanotransduction implication des MAPK Compression 120

Libération de PGE2 (induction /contrôle comprimé)

100 80

MAPK

erk JNK X X p38 X

SB203580 SP600125

PGE2

Inhibiteurs MAPK

20 C

PD98059

SB203580 (p38)

PD98059 (Erk ½)

SP600125 (Jnk)

Les voies de mécanotransduction: implication des MAPK AA

COX

PGES

PGH2 120

PGH2

expression relative des ARNm de COX-2/HPRT

120

PGE2

expression relative des ARNm de mPGES-1/HPRT

100

80 60

0 C C

SB203580

PD98059

SP600125

(p38)

(Erk ½)

(Jnk)

SB203580 (p38)

PD98059 (Erk ½)

SP600125 (Jnk)

Modèle pour une synergie « chimie » / « physique » Stress physique

IL-1β

Intégrine α5β1

MAPK N F -k B

N F -k B

Other s

PGE2 AMPLIFICATION DE LA REPONSE

e surpoids, premier facteur de risque de la gonarthrose 2nd lien: les adipokines Facteurs cataboliques

Les adipokines

Voies de signalisation inductible

MAPK

NF-κB

Régulation transcriptionelle et post-transcriptionnelle c-fos c-jun

CREB

egr-1

AP-1 CRE GC

MMPs Agrécanases Interleukines NO Prostaglandines

Les adipokines

La visfatine, médiateur catabolique du cartilage ► Expression de la visfatine dans le cartilage OA

► Rôle catabolique de la visfatine dans le cartilage

Expression et rôle de la visfatine au cours de la polyarthrite rhumatoïde (RA) • Présence de la visfatine dans le liquide synovial RA

[visfatine] = 50 – 200 ng/ml

• Synoviocytes de souris arthritique : Expression visfatine • Expression par les Synoviocytes RA humains Visfatine

Activateurs TLR TNFα, IL-1β, IL-6, OSM

+ IL-6 Synoviocytes RA

Bretano et al, Arthritis Rheum, 2007 Nowell et al, Arthritis Rheum, 2006 Otero et al, Ann Rheum Dis, 2006 Schäffer et al, JAMA, 2006

MMP-1 MMP-3

La visfatine induit la synthèse de PGE2 35

15 10 5 0

2,5

[visfatine] (µg/ml) – 6h

Chondrocytes humains

(induction/contrôle)

Libération de PGE2

(induction/contrôle)

Libération de PGE2

***

1 0 0

2,5

[Visfatine] (µg/ml)

Chondrocytes murins

Gosset et al. Athritis Rheum 2008

La visfatine stimule l’expression de la mPGES-1 et diminue celle de la 15-PGDH mPGES-1

COX-2

Acide arachidonique

Phospholipides membranaires

Expression des ARNm de la mPGES-1/HPRT(induction/contrôle) 18

PGE2

15-keto PGE2 métabolite inactif

1.2

Expression des ARNm de la 15-PGDH/HPRT (induction/contrôle)

1 0.8

0.6

6 1 0

PGH2

15-PGDH

0.4

0.2 0

2,5

[Visfatine] (µg/ml)

2,5

[Visfatine] (µg/ml)

Gosset et al. Athritis Rheum 2008

L a visfatine stimule l’expr ession et la libér ation des M M P-3 et M M P-13 6

ARNm MMP-3/HPRT (induction/2.5µg/ml)

• Expression des ARNm

8 7

5 4

16 14 12 10 8 6 4 2 0

ND 2,5

[Visfatine] (µg/ml)

• Libération des MMP dans le milieu extracellulaire

3 1

ARNm MMP-13/HPRT (induction/2.5µg/ml)

ND 0

2,5

[Visfatine] (µg/ml)

Libération de MMP3 (induction)

* [Visfatine] (µg/ml) 0

2.5

MMP-3 ND 0

1 2,5 5 [Visfatine] (µg/ml)

MMP-13

Gosset et al. Athritis Rheum 2008

Expression du NGF en réponse à la Visfatine Immature Murine Articular Chondrocytes

 Protéine (surnageant)

 ARNm

3,0

3 expériences ; n=2

N GF (pg/ml)

N GF / H PRT

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

3 expériences ; n=2

40 30 20 10

Ct 24h

Visf 5 µg/ml

Ct 24h

2,5

Visfatine 24h (µg/ml)

Pecchi et al. (manuscrit en préparation)

Rôle des autres tissus de l’articulation dans la dégradation cartilagineuse exemple de l’os sous chondral

CART I L AGE

Le cross-talk ostéoblastes – chondrocytes Utilisation d’un modèle de co-culture

Chondrocytes (billes d’alginate)

Ostéoblastes (sclérotique/non sclérotique)

Sanchez et al. O&C 2005

Les voies de mĂŠcanotransduction des OB

Liedert A, 2006

Un modĂ¨le de compression des ostĂŠoblastes en 3D Freshly isolated mouse calvaria osteoblasts

7 days of culture osteoblasts

Plates disposition in Flexercell compression plus FX-4000C

Sealing plates

28 days of culture : ALP activity of osteoblasts in their collagen matrix

Membrane disposition in Biopress plates

Synthèse de PGE2 par les ostéoblastes comprimés 700 Unloaded

600

COX-2

***

unloaded-fold

***

400 300 200

ND 1h

***

*** 2h

***

100 0

***

10%

500

pg/µg DNA

PGE2

Les voies de mécanotransduction impliquées dans la synthèse de PGE2 80

PGE2 production (fold)

PGE2

60 50

* 40 30

*** ***

***

10 0

Control U0126 U0126 U0126 BAY 2.5 10 40 5

ERK1/ 2

BAY 20

NF-κB

BAY 40

BAPTA BAPTA BAPTA 15 50 100 µM

Intracellular Ca++

Synthèse d’IL-6 et MMP par les ostéoblastes comprimés 200

100

IL-6

***

Unloaded

MMP-3

***

10% 80 Unloaded

***

10%

pg/µg DNA

150

100

***

ND 1h

*** 2h

*** 4h

Conclusion aging pr ocess

Soluble mediator s

Over load/over use/tr auma

M echanical str ess

Genetics

M atr ix fr agments

Pierre & Marie Curie University Paris VI « Joint ageing, cartilage degradation and inflammation» (F. Berenbaum) • • • • • • • •

Marjolaine Gosset (post-doc) Xavier Houard (assistant professor) Claire Jacques (assistant professor) Geoffroy Nourissat (doctoral fellow) Audrey Pigenet (technician) Sabrina Priam (fellow) Colette Salvat (assistant engineer) Jeremie Sellam (assistant professor)