FASE III ÚLTIMAS BIOTECNOLOGÍAS APLICADAS A LA REPRODUCCIÓN ANIMAL
DISNEY RODRIGUEZ_CÓD: 1.112.299.986 MAIRA ALEJANDRA FONSECA_CÓD: 1.116.258.824 ALEXANDER CERTUCHE MUÑOZ_CÓD: 14.679.395 LUISA FERNANDA FRANCO CARDONA_CÓD: 1.113.309.554 NATALY TATIANA JIMENEZ ENRIQUES_CÓD: 1.086.362.929
REPRODUCCIÓN AVANZADA GRUPO: 201502_5
PRESENTADO A ESP. EDWIN MANUEL PÁEZ BARÓN MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA CEAD PALMIRA ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE ECAPMA VALLE DEL CAUCA 2016 INTRODUCCIÓN
El presente trabajo colaborativo pretende establecer espacios de aprendizaje a partir del ejercicio práctico vivencial realizado en campo. En ese orden de ideas, se busca afianzar los conocimientos respecto al curso Reproducción avanzada, con el propósito de conocer el manejo real reproductivo de las especies de interés zootécnico y las distintas dificultades que se presentan en la cotidianidad en los procesos biotecnológicos reproductivos que permiten el mejoramiento genético a partir de técnicas empleadas como la transferencia de embriones y fertilización in vitro. Finalmente, se espera que lo aquí consignado, contribuya al proceso de formación profesional, dotados con herramientas para la toma de decisiones en la construcción de propuestas como alternativas de solución a las problemáticas que se presentan en la región. Se habla entonces en este trabajo de la biotecnología de embriones invitro y todo su proceso desde la recolección de los ovocitos, maduración de ovocitos, fertilización invitro, maduración de embriones y posterior transferencia.
FASE III: ÚLTIMAS BIOTECNOLOGÍAS APLICADAS A LA REPRODUCCIÓN ANIMAL
SITUACION: El ganadero quiere incorporar al hato la técnica de Fertilización in vitro, ya que planea adquirir una hembra de raza Gyr de alto valor genético, campeona nacional y quisiera obtener varias crías de las misma por medio de la utilización de esta técnica. Usted deberá aconsejarle cuales alternativas para este proceso propondría y cuál sería el protocolo más aconsejable para implementar. El estudiante deberá revisar las temáticas correspondientes a la unidad 3 del curso, con base en ellas plantear cuales serían los protocolos y la técnica de Fertilización in vitro y posterior transferencia de los embriones, aconsejados a implementar en esta explotación, para ello debe señalar lo siguiente:
Protocolos y productos empleados (Debe indicarse de manera completa el nombre genérico y nombre comercial de los productos empleados, dosis, vías de aplicación, indicaciones, duración del tratamiento).Fertilización in Vitro
La FIV es una biotecnología que durante los últimos 10 años se ha venido implementando de manera paulatina en ganaderías de alto valor genético. Su valor está representado en un mayor número de embriones obtenidos durante cada uno de los tratamientos, sin embargo su principal inconveniente radica en los costos, pues requiere de un equipamiento especial, para los procesos de maduración de ocovitos, fertilización in vitro y maduración embrionaria. Sin embargo, si se cuenta con animales de alta genética es una buena alternativa y puede implementarse en animales que no podrían ser utilizados en otras biotecnologías, tales como (Cyagra, 2008):
Vacas refractaria a tratamientos súper estimulatorios. Vacas que no dan embriones transferibles en programas de Súper ovulación y
Transferencia de Embriones. Vacas con alteraciones anatómicas que impiden una correcta fecundación o anidación
del embrión. (Ej: adherencias post-cesárea). Vacas de desecho (por enfermedad o accidente). Vacas o Novillas hasta el primer tercio de gestación. Vacas en puerperio. Terneras Pre púberes.
Protocolo para implementación de la técnica FIV La técnica recomendada para recolección de ovocitos. En animales vivos la recolección de ovocitos se puede realizar por aspiración tras vaginal guiada por ultrasonido (OPU, por sus siglas en inglés, Ovum Pick Up) y por laparoscopia / laparotomía. La técnica más común y menos traumática es la de OPU, y se puede realizar hasta 2 veces por semana y repetida durante 5 a 6 meses, y con una periodicidad de dos aspiraciones por semana o una semanal, sin ningún efecto adverso sobre la reproducción o sobre el bienestar del animal. Se ha demostrado que al final del periodo de aspiraciones los animales pueden retornar a sus ciclos estrales normales y ser incorporados a programas de cría (Rodríguez, 2006). Obtención de ovocitos: La recolección de ovocitos permite rescatar y aprovechar folículos no ovulatorios, que bajo condiciones fisiológicas se tornarían en folículos atrésicos, con el fin de aprovechar el máximo potencial genético de una donadora por procedimientos in vitro. Puede realizar por aspiración trasvaginal guiada por ultrasonido
Recolecció n en animales
(OPU). Se puede realizar 2 veces por semana y repetida durante 5 a 6 meses Se aplicar anestesia epidural (lidocaína). Se utiliza un ecógrafo con transductor de 5 ó 7.5 MHz que posee una
aguja en la parte superior con punta ecogénica. El ecógrafo con transductor se conecta a una bomba peristáltica de
vacío que es introducido por vía vaginal. Se manipulan rectalmente los ovarios y se colocan contra el
transductor. Se visualizan los folículos mayores de 2 mm la aguja atraviesa la pared vaginal y se recoge el aspirado folicular en
tubos que contengan el medio de cultivo. Mediante la aspiración folicular se pueden obtener de 4 a 20 oocitos
vivos
por donante
Maduración de ovocitos.
Para el proceso de maduración es necesario realizar una buena selección de los ovocitos a madurar, en tal sentido se deben seleccionar aquellos con el citoplasma homogéneo, no granular, ni polarizado y con células del cúmulo intactas rodeando al gameto, ya que ellos representan los mayores porcentajes de maduración. Los ovocitos rodeados por un cúmulo compacto formado por varias capas de células, presentan mayores porcentajes de maduración, fecundación y de desarrollo hasta blastocitos, que los que carecen de cúmulo o los que están rodeados solamente por la corona radiata. Maduración de ovocitos in vitro Se debe seleccionar ovocitos con el citoplasma homogéneo, no granular, selección de los ovocitos a madurar
ni polarizado y con células del cúmulo intactas rodeando al gameto Medio de maduración:
TCM-199, suplementado con un 10% de suero fetal Gonadotropinas (LH, FSH) Estradiol temperatura de incubación debe estar entre 37 y 39°C. La duración del proceso de maduración está entre 22 y 26 horas.
Fertilización in vitro.
Consiste en incubar los óvulos madurados (producto de la fase anterior) con espermatozoides vivos y móviles durante un periodo de 6 a 24 horas, luego de un proceso de selección y capacitación de componentes del plasma seminal, crioprotectores y espermatozoides muertos o con escasa vitalidad. La capacitación espermática generalmente
se logra exponiendo los espermatozoides vivos a concentraciones de heparina y cafeína, entre otras. Estas sustancias logran estimular el proceso de capacitación del espermatozoide que lo prepara para interaccionar y fecundar el óvulo. Fertilización in vitro Capacitación espermática
Fecundación
Separación celular previa mediante "swim up" se recuperen
los espermatozoides con mejor motilidad. Incubación de espermatozoides con heparina.
En 50- 100 μl de medio Tyrode tamponado (pH 7,8) 10-15 ovocitos intactos o previamente denudados de las
células del cúmulo. 1 millón de espermatozoides por ml de medio El medio debe contener una atmósfera de CO2 del 5% Temperatura 39°C Tiempo entre 18 y 20 horas.
Maduración in vitro.
Cultivo de embriones: Aquellos embriones de 4 o más células resultantes de la FIV son cambiados del medio de fecundación a un medio de cultivo embrionario donde los
embriones continúan su división celular a 8, 16 y 32 células hasta llegar a mórulas y blastocitos. Al llegar a estos estadios, los embriones pueden ser transferidos a vacas receptoras (en fresco). Maduración de embriones (Cultivo in vitro) Indefinidos: cuando se utiliza suero y cocultivo con células Medio de
somáticas. Semidefinidos: cuando se omite el cocultivo y el suero se reemplaza
por albúmina sérica. Definidos, cuando el suero se reemplaza por macromoléculas como el
polivinil alcohol o la polivinil pirrolidona. Se desprende de los ovocitos las células de la granulosa. Se lleva el ovocito a una estufa con bajo % de oxígeno en su
ambiente. durante 6-7 días se llevará a cabo la división celular hasta llegar al
estadio de mórula o blastocisto. En este estadiose denominamos desarrollo embrionario.
cultivo
Maduració n
Transferencia de embriones. Transferencia de embriones Selección de receptoras Sincronización de receptoras Proceso de trasferencia: Lavado e inmovilización de cola. Palpación rectal para la detección del cuerpo lúteo. Introducción de pistola de inseminación con Pajilla embriones a través de cérvix. Deposición de los embriones en cuerno uterino ipsi lateral al ovario con cuerpo lúteo.
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Técnica De Transferencia No Quirúrgica Transcervical: Las vacas receptoras deben ser seleccionadas en el día 7 del ciclo estral (día 0= estro), detectándolo con o sin sincronización. Los embriones se cosechan al día 7-8 después de la fertilización, se los identifica en un microscopio y se transfieren los embriones de calidad excelente y buena. Una vez realizado el examen rectal de la receptora y constatada la presencia de un CL se inyecta una anestesia epidural baja (solución de xilocaína al 2%). La región perineal y vulva se lavan con jabón desinfectante, agua y se secan. El embrión es entonces colocado dentro de una pajuela esterilizada (0.25–0.5 ml) a la que se le ha cortado un extremo (aproximadamente 1,5 cm.), esto se realiza para que no se doble al ser introducida en el cérvix con la consiguiente pérdida del embrión.
Posteriormente la pajuela con el embrión se coloca dentro de la pistola de transferencia y ésta dentro de la pipeta plástica que, previamente ha sido esterilizada. Con la mano izquierda el operador sujeta el cérvix a través de la pared del recto. La pipeta se introduce en el canal cervical y su extremo se ubica, con ayuda de la mano izquierda, en el cuerno ipsilateral al CL. Una vez en la posición deseada (un poco más allá del cuerpo del útero) el embrión es depositado suavemente y la pistola se retira lentamente. Todo este procedimiento debe realizarse lo más rápido y delicadamente posible. El exceso de manipulación producirá daño a la mucosa del útero, que se traducirá en una baja en los resultados. Aparte de la destreza y experiencia que son necesarias, con cualquiera de las técnicas descritas, es necesario que las receptoras sean animales sanos, que sus ciclos reproductivos hayan sido normales y que estén en buen estado de nutrición. En la medida que las receptoras estén en buenas condiciones, tanto sanitarias como nutricionales y reproductivas, y la técnica sea bien realizada, la eficiencia de la transferencia de embriones, traducida en preñeces, será mayor. Protocolo de manejo a partir de Maduración in Vitro DÍA Semana previa
Preparación del laboratorio
al trabajo 0
Colecta de ovarios Aspiración de los
ETAPAS Desinfección
de
superficies,
esterilización
de
materiales,
preparación de soluciones stock Transporte en solución a 37°C COC Medio de aspiración: solución m –
( complejos ovocito cúmulus BPS, búfer fosfato salino modificado: )
D-BPS (+) + SFb + Atb)
Recuperación y clasificación Bajo lupa estereoscópica. de los COC. Maduración in vitro
Medio de maduración TCM-199 + SFb+ LFb + Atb
Capacitación del semen y Medio BO, capacitación y lavado del 1
3 4 – 10
dilución
semen; medio BO de dilución de semen
Fecundación in vitro Desarrollo in vitro Clivaje
(
ajuste
a
concentración
deseada) Gotas en placas de Petri pequeñas Medio de desarrollo: CR1aa Evaluación de división celular a las 48
horas Evaluación de desarrollo y Cada 48 horas cambio de medio
Tiempo de desarrollo desde la aspiración de los ovocitos hasta blastocito eclosionado Día 0 1 2 3 5 6 7 8 9
Estado de desarrollo Inseminación 1- Célula pro núcleo y segundo corpúsculo polar – cigoto 2- Células (clivaje) 4-8 Células 16 – 32 células – mórula 32.64 élulas >de 64 células – blastocito temprano – trofoblasto y macizo celular interno Blastocito expandido Blastocito eclosionado
Algunas formulaciones para los productos empleados en la biotecnología reproductiva FIV Soluciones de TL – Preparación de TALPs. Mezclar los ingredientes descritos en el Cuadro 1, se esteriliza y filtra la solución. Se escribe la fecha de elaboración y vencimiento en la etiqueta
(usarse
en
un
plazo
de
una
semana).
Se
almacenan
a
4
°C.
Medios TALP (Tyrode’s Albúmina Lactato Pyruvato). Se mezcla los ingredientes según lo descrito en el Cuadro 2. Se esterilizaron y filtraron las soluciones (se usó en un plazo de una semana). Se almacenaron a 4 °C.
SO F modificado (50 mL). A la formulaciรณn de SOF (Cuadro 3) se le agregรณ 0.25 mL 200X de Piruvato del sodio, un mililitro de Aminoรกcidos no esenciales, 0.5 mL de Aminoรกcidos Esenciales, 0.25 mL de Gentamicina (sulfato) y 400 mg de EFAF-BSA.
Elementos necesarios (Materiales) y costos de la tecnica Para la Obtenciรณn de ovocitos Materiales Cantidad ECOGRAFO WELD 3000 V PORTATIL
1
Valor unitario
Valor total
$ 8.500.000
$ 8.500.000
Dispositivo ultrasonido OPU bomba peristáltica de
1
vacío Tubos de ensayo 20 Lidocaína al 2% 1 Frasco *10 mL
$ 500
$ 10.000
$ 14.000
$ 14.000
Para Maduración de ovocitos, Fertilización in vitro y maduración de TCM-199, suplementado
con
un 10% de suero fetal heparina 50- 100 μl de medio Tyrode tamponado (pH 7,8) polivinil alcohol o la polivinil pirrolidona Transferencia de embriones Dilatador cervical.
1
$ 145.000
$ 145.000
Especulo 1 Pajillas para I.A de
$ 150.000
$ 150.000
0,5 cm paquete x 1
$ 450
$ 450.000
$ 30.000
$ 30.000
$ 300
Otros materiales $ 15.000
1000 Pistola
de
transferencia
de 1
embriones
Jeringas de 10 cm MICROSCOPIO DMW-B1
Caja x 50 1
Mangas
Paquete x 100
$ 200
$ 20.000
Solución salina
6
$ 2.000
$ 12.000
Tubos de ensayo Delantal
20
$ 500
$ 10.000
impermeable para 1
$ 35.000
$ 35.000
palpar. Detector de preñez Sincrogest
1
$ 1.500.000
$ 1.500.000
dispositivo
1
$ 18.500
$ 18.500
1
$ 40.000
$ 40.000
$ 47.500
$ 47.500
$12.500 $ 200
$ 12.500 $ 10.000
intravaginal Estradiol frasco x 100 ml GNRH SANFER®
1 frasco x 50 ml Yodo x 100 ml 1 Guantes de latex Caja x 50 Lidocaína al 2% 1 Frasco *10 mL Baldes 2 Recipiente y bolsa
$ 14.000 $ 30.000
$ 60.000 $ 21.000
de residuos
Tiempos en el manejo del cultivo invitro y sincronización de receptoras Día
Cultivo de embriones invitro
0 1
2
Aspiración
3
Célula
4
corpúsculo polar – cigoto Células (clivaje)
pro
núcleo
y
segundo
Sincronización receptoras Protocolo Ovsynch Aplicación GnRH
5
4-8 Células
6 7
16 – 32 células – mórula
Aplicar 1 dosis de PGF2∞
9
De 32- 65 Células
Aplicación GnRH
10
De 64 células – blastocito temprano – IATF (16 a 24 horas de la segunda aplicación de trofoblasto y macizo celular interno GnRH transferencia de embriones.
retirado el dispositivo)
Numero de receptoras. La aspiración de oocitos se puede hacer 2 veces semana y en cada una de ellas se pueden obtener 4 a 20 ovocitos; se puede hacer en un periodo de 5 a 6 meses. Si obtenemos de la vaca de raza Gyr 10 ovocitos por aspiración y se hace 2 veces semanal obtendríamos un total de 20 ovocitos semanales, que pueden llegar a ser transferidos, por lo cual necesitaríamos 20 vacas receptoras de las cuales se obtienen porcentajes de preñez que varían desde un 25 hasta un 45%. (Rodríguez, 2006). Ventajas y desventajas de la implementación de esta herramienta biotecnológica en la producción pecuaria. Ventajas
Mayor número de embriones obtenidos por tratamiento Utiliza animales que por medio de otras técnicas no se podrían utilizar Permite el mejoramiento genético Reduce el intervalo generacional Propagación masiva de material genético de un animal superior que a través de la
reproducción natural desaprovecharía la mayor parte de sus óvulos. Menor incidencia de enfermedades de transmisión Facilidad de transporte del material genético
Introducción de material genético nuevo al hato ganadero.
Desventajas
Elevados costos en la implementación de la técnica FIV Compra de insumos y equipos externos Necesidad de personal especializado Se debe tener buenas condiciones nutricionales y sanitarias en el hato. Síndrome del Ternero Gigante
BIBLIOGRAFÍA Area de botecnología de la reproducción animal, Universidad de Uruguay. (2011). Fertilización in vitro en bovinos. Obtenido de http://es.slideshare.net/yaelfili/fertilizacin-invitro-en-bovinos ISAZA, V. M., DUQUE, S. A., LOPEZ, A. P., RODRIGUEZ, O. C., & ALVAREZ, R. U. (2010). Evaluación de dos medios de cultivo sobre la producción in vitro de embriones bovinos. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 4(2), 39-46. Recuperado de: http://www.redalyc.org/pdf/3214/321428102004.pdf Jessica García Recillas; Jessica García Recillas. (Noviembre de 2013). Implementación de un protocolo de Fertilización in vitro en bovinos en el Laboratorio de Reproducción Animal de
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Recuperado
el
03
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Mayo
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http://bdigital.zamorano.edu/bitstream/11036/1725/1/CPA-2013-044.pdf Páez Barón, E.M (2013) Modulo reproducción avanzada Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD recuperado de www.unad.edu.co
PELร EZ P, V. A. (2011). Producciรณn in vitro de embriones bovinos. Recuperado de: http://dspace.ucuenca.edu.ec/bitstream/123456789/3053/1/mv170.pdf