Ecología microbiana de un ecosistema acidófilo extremo, las cortas mineras de la Faja Pirítica Ibérica
Índice
1. Resumen................................................................................................................................ 3 2. Introducción ......................................................................................................................... 4 2.1. Cortas Mineras ............................................................................................................. 4 2.1.1. Corta Concepción .............................................................................................. 5 2.1.2. Corta Nuestra Señora del Carmen..................................................................... 5 2.2. Aguas ácidas de minas................................................................................................... 6 2.3. Microbiología típica de aguas ácidas de minas ............................................................ 7 3. Objetivos ............................................................................................................................... 9 4. Material y Métodos ............................................................................................................ 10 4.1. Muestreo....................................................................................................................... 10 4.2. Extracción de DNA ...................................................................................................... 10 4.3. Amplificación de genes 16S y 18S................................................................................ 11 4.4. Clonaje ......................................................................................................................... 11 4.5. Análisis de secuencias.................................................................................................. 11 5. Resultados ........................................................................................................................... 12 5.1. Carcaterísticas fisicoquímicas de las cortas ............................................................... 12 5.1.1. Corta Concepción ............................................................................................. 12 5.1.2. Corta Nuestra Señora del Carmen.................................................................... 14 5.2. Metales pesados ........................................................................................................... 16 5.2.1. Corta Concepción ............................................................................................. 16 5.2.2. Corta Nuestra Señora del Carmen.................................................................... 17 5.3. Diversidad Microbiana ................................................................................................ 18 5.3.1. Corta Concepción ............................................................................................. 18 5.3.2. Corta Nuestra Señora del Carmen.................................................................... 19 6. Discusión ............................................................................................................................. 20 6.1. Ecología Microbiana de ambas cortas ........................................................................ 20 7. Conclusiones ....................................................................................................................... 25 8. Bibliografía ......................................................................................................................... 26
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1. Resumen Los ecosistemas extremos son de gran interés biológico debido a la información que pueden aportar sobre temas relacionados con el origen de la vida y los mecanismos moleculares de adaptación y evolución, sin olvidar las posibles implicaciones biotecnológicas que pueden presentar los organismos que los habitan.
Estos sistemas se caracterizan por poseer
microorganismos capaces de adecuarse a condiciones fisicoquímicas extremas como temperatura, salinidad, pH, etc. En la Faja Pirítica Ibérica existe uno de estos ecosistemas con una característica que le diferencia del resto, la elevada acidez de sus aguas. Está situado en Huelva, en el suroeste de la Península. Los ecosistemas ácidos pueden formarse por fenómenos como el vulcanismo e hidrotermalismo o por oxidación y lixiviación de sulfuros metálicos, como la pirita. Estos últimos pueden darse por causas naturales o antropogénicas, dada la importancia que tienen estos afloramientos masivos de pirita para la industria minera. Por la Faja Pirítica Ibérica discurre el Río Tinto, uno de los sistemas ácidos más extremos y extensos del mundo, formado por causas naturales. Además existen unos lagos de agua ácida que se formaron debido a la explotación minera a cielo abierto; estas minas se abandonaron, y con el tiempo se llenaron de agua, ahora se conocen como cortas mineras. En ellas habitan microorganismos de diversa índole que utilizan la pirita como sustento a través de varias rutas metabólicas. Estos sistemas suponen un gran problema ambiental ya que son altamente contaminantes, por ello el conocimiento de la fisicoquímica y geomicrobiología de estos lagos es de vital importancia para poder paliar el problema; y por otra parte los microorganismos presentes en estos ambientes son de gran interés debido a sus posibles aplicaciones biotecnológicas, sin olvidar que este sistema ácido está considerado como un análogo terrestre del planeta Marte, ya que en ambos existen elevadas cantidades de hierro . Rio Tinto ha sido objeto de estudio durante mucho tiempo y ahora son bien conocidos muchos de los procesos que tienen lugar en él, así como la microbiología que allí habita; pero hasta la fecha no se ha descrito nada acerca de la microbiología de las cortas mineras de la Faja Pirítica Ibérica. Mediante técnicas de clonaje y secuenciación se va a estudiar la biodiversidad microbiológica de las cortas mineras. Finalmente se discutirán las posibles implicaciones ecológicas de dichos resultados.
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2. Introducción 2.1 Cortas mineras_____________________________________________________ Las principales cortas mineras se sitúan en el municipio de la provincia de Huelva, Minas de Rio Tinto. Están localizadas dentro de la Faja Pirítica Ibérica, una de las mayores formaciones de complejos sulfurosos del mundo [1]. La Faja Pirítica Ibérica es una banda de más de 250 Km. de largo y 75 Km. de anchura máxima que se extiende a lo largo de gran parte del sur de la Península Ibérica desde Alcácer do Sal (Portugal), al noroeste, a la provincia de Sevilla (España), al sureste. La Faja Pirítica tiene unas 82 minas que han sido explotadas para extraer minerales. Los Tartessos e Íberos fueron quienes comenzaron a hacerlo hace unos 5.000 años. La explotación la continuaron los fenicios y posteriormente los romanos. Una compañía británica comenzó de nuevo la explotación en el siglo XIX, principalmente para extraer cobre, pero también se extrajo hierro y manganeso. Esto se prolongó hasta 1954, cuando las minas volvieron a manos españolas [2]. Hace 350 millones de años la actividad volcánica e hidrotermal ocurrida en esta región dio lugar a ocho depósitos gigantes de sulfuros masivos polimetálicos asociados a los flancos de conos volcánicos en forma de pirita, y también de calporita, blenda, galena y casiterita. Hoy en día constituyen uno de los mayores depósitos piríticos del mundo. Se van a estudiar dos cortas mineras ácidas que presentan un comportamiento fisicoquímico diferente, la corta Concepción (CC) y Nuestra Señora del Carmen (NSC). Estas minas han sido explotadas con el objeto de extraer minerales [3]. La perforación de la tierra fue tan grande que se llegó al nivel freático del agua y, por tanto, cuando estas minas fueron abandonadas el agua inundó las cortas creándose un ecosistema acuático ácido cuya ecología microbiana será el objeto de nuestro estudio.
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2.1.1 Corta Concepción___________________________________________ Ésta mina está situada junto al antiguo poblado minero de Mina Concepción. Fue una de las primeras en explotarse (1853 – 1856). Es de gran tamaño y tiene una profundidad de 15 metros y un área de 1,2 ha. El color de sus aguas no es el habitual en estas minas. Se encuentra conectada a una mina de interior formada a consecuencia de una excavación de galerías y pozos en la roca.
Corta concepción
2.1.2 Corta Nuestra Señora del Carmen____________________________ Esta segunda mina está situada muy cerca del pueblo de Paymogo. Presenta grandes diferencias con respecto a la descrita anteriormente. Su tamaño es menor y su profundidad es de 32 metros y un área de 0,68 ha. Puede apreciarse a simple vista el color rojo que le proporciona el hierro disuelto en el agua.
Corta Nuestra señora del Carmen
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2.2 Aguas ácidas de minas_______________________________________________ La causa más conocida de contaminación de agua asociada a minería se debe al resultado de una rápida disolución de los minerales que están expuestos, principalmente sulfatos, dando lugar a aguas ácidas de minas (AMD) [4]. Las características fisicoquímicas de las aguas de las minas son además una consecuencia de la intensa actividad quimiolitotrófica de los microorganismos que las habitan, capaces de crecer a expensas de los sulfuros metálicos de la Faja Pirítica Ibérica. Los minerales, como la pirita (FeS2) son químicamente estables en ausencia de agua y oxígeno, pero cuando se exponen al aire y a la humedad, estos minerales se oxidan espontáneamente. Las reacciones de oxidación de la pirita proporcionan a las aguas un pH ácido que se mantiene constante. El ión férrico en presencia de agua se hidroliza precipitando hidróxido férrico y liberando protones según la reacción [5]: Fe3+ + 3H2O → Fe (OH)3 + 3H+ Esta reacción es responsable de mantener constante el valor de pH del agua. Durante el otoño, las lluvias aumentan el volumen de agua, el hierro precipita y la reacción se desplaza hacia la derecha, liberando protones que compensan el efecto de dilución. Por el contrario en la época estival el volumen disminuye, los protones se concentran y disuelven los hidróxidos consumiéndose. La disolución de los sulfuros se debe a un ataque químico, estos son oxidados exclusivamente por el ión férrico en condiciones de baja presión y temperatura, según las reacciones [6]: FeS2 + 6 Fe3+ + 3H2O → 7Fe2+ + S2O32- + 6H+ S2032- + 8Fe3+ + 5H20 → 2SO42- + 8 Fe2+ +10H+ De esta manera encontraríamos una cantidad muy elevada de Fe2+, pero resulta que estos microorganismos son capaces de utilizar este compuesto oxidándolo y regenerando así el ión férrico. 4 Fe2+ + O2 + 4H+ → 4Fe3+ + 2H2O Por otro lado, en estos ambientes existen microorganismos capaces de oxidar el azufre elemental a ácido sulfúrico: S0 + 4H2O → SO42- + 8H+
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Por todo esto nos damos cuenta de que este ecosistema ácido está basado en el ciclo del hierro. Por una parte el hierro reducido es la principal fuente energética de muchos procariotas, es un buen aceptor de electrones en condiciones aerobias y anaerobias y además es el que se encarga de mantener el pH debido a su capacidad de tampón. Por otra parte el ión férrico protege el sistema de radiaciones ultravioleta [6]. El valor de pH que encontramos en estos sistemas varía dependiendo de la corta, pero oscila entre 2,1 y 3,5. Además de la pirita, en estas zonas hay muchísimos minerales que contienen gran cantidad de distintos metales (cobre, cadmio, aluminio, hierro, cobalto, cromo, zinc, son los más abundantes). Estos metales son altamente solubles en aguas donde la acidez es elevada. Por ello el bajo pH que caracteriza a estas aguas, mantiene en disolución estos metales pesados [7, 8]. 2.3 Microbiología típica de aguas ácidas___________________________________ Las condiciones extremas de acidez y el contenido de metales pesados en estas aguas impiden el desarrollo de organismos superiores tales como animales o plantas. Se pensaba que en esos ambientes era del todo imposible la existencia de cualquier tipo de vida. Con el tiempo se realizaron estudios microbiológicos y se encontraron una diversidad de organismos mayor de la que cabría esperar. La quimiolitotrofía es un tipo de metabolismo mediante el cual los organismos obtienen la energía de la oxidación de compuestos inorgánicos, estos pueden ser autótrofos o heterótrofos en función de si su fuente de carbono es un compuesto inorgánico (CO2) u orgánico respectivamente. Este metabolismo es usado por los organismos procariotas de este ecosistema. Estos organismos son por lo general aerobios pero se han encontrado algunos que son capaces de crecer también en condiciones de anaerobiosis [9]. Los estudios microbiológicos nos han permitido poder conocer la diversidad de seres vivos que habitan en estos ambientes. Se han encontrado organismos de todos los 3 principales dominios biológicos: Eucarya, Bacteria y Arquea. Todos ellos de pequeño tamaño y baja complejidad de organización celular. En cuanto al dominio Eucariota se han observado protistas heterótrofos pertenecientes a las divisiones Chlorophyta, Rodophyta, Euglenophyta o Bacillariophyta y hongos filamentosos. Por otra parte también se han observado organismos pertenecientes al dominio Bacteria que son principalmente bacterias quimiolitoautótrofas oxidadoras del hierro y del azufre del
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género Acidithiobacillus spp. Y Leptospirillum spp. Además también se han observado heterótrofas como Acidiphillium spp. Por último en cuanto al dominio Arquea encontramos organismos propios de la clase thermoplasmata a la que pertenecen Thermoplasma y Ferroplasma [10,11, 12].
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3.Objetivos Los principales objetivos son: 1. Describir la diversidad eucariota y procariota de las aguas de dos cortas mineras de la Faja Pirítica Ibérica. Se llevará a cabo mediante técnicas de ecología molecular que no requieren el cultivo de microorganismos como clonaje de genes 16S y 18S rRNA. 2. Análisis de los parámetros hidroquímicos y fisicoquímicos de las cortas mediante perfiles verticales con sonda multiparamétrica. 3. Diseño de un modelo geomicrobiológico que nos permita describir y entender el ecosistema de estudio.
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4. Material y métodos 4.1 Muestreo__________________________________________________________ El muestreo se realizó en mayo del 2009. Se levantaron perfiles verticales con una sonda multiparamétrica YIS590 determinando pH, temperatura, oxígeno disuelto (OD), clorofila-a y la intensidad de la radiación fotosintéticamente activa (PAR). In situ se determinó la cantidad de Fe (II), Fe (III), Fetotal y la acidez. También se midió la cantidad de metales pesados en disolución mediante técnicas de ICP MASAS Y TXRF. Teniendo en cuenta las características fisicoquímicas del agua analizadas in situ, se tomaron muestras de 5 litros de agua a distintas profundidades mediante una botella oceánica Niskin en la vertical de las dos cortas. Gracias a este perfil, se puso especial atención en aquellas alturas a las que se detectaron cambios fisicoquimicos porque es en esas zonas donde esperamos ver cambios mas significativos a nivel microbiológico. Las muestras que se recogen son: -
Concepción: 2 metros, 4 metros, 7 metros, 10 metros, 13,5 metros.
-
Nuestra Señora del Carmen: 0 metros, 15 metros.
Las muestras fueron inmediatamente refrigeradas a 4ºC y posteriormente congeladas a –20ºC hasta su analisis. 4.2 Extracción de DNA__________________________________________________ Las alícuotas que se recogieron se filtraron mediante un filtro Millipore de 0,22 micras para retener en él todas las partículas con un tamaño superior a este. Posteriormente se empleó un Kit de extracción de DNA, el Kit Fat DNA Spin for soil (Q-Bio Gene INC., CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este protocolo usa el instrumento Fast Prep para romper las células y así obtener el DNA. El DNA extraído fue purificado mediante el kit GeneClean Turbo (Q-Bio Gene Inc., CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente se midió la concentración de DNA en ng/µl para poder conocer la concentración en cada muestra mediante un nanodrop.
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4.3 Amplificación del 16S y 18S__________________________________________ Se amplificaron los genes del rRNA 16S y 18S mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para conseguir un gran número de copias del fragmento que interesa amplificar. Se usaron dos cebadores para cada uno de los dominios analizados. Excepto en el caso de arqueas que se usaron cuatro y de ellos se eligieron los dos que mejor resultado proporcionaron. Cebador1
Secuencia (5’- 3’)
Especificidad
ref
EUK BR
TGA TCC TTC TGC AGG TTC ACC TAC
Dominio Eucarya
[13]
EUK 1F
CTG GTT GAT CCT GCC AG
Dominio Eucarya
[14]
8F
AGA GTT TG AT
Dominio Bacteria
[15]
1492R
TAC CTT GTT ACG ACT T
Universal
[16]
25F
TTC CGG TTG ATC CYG CCG GA
Dominio Arquea
[17]
344F
ACG GGG YGC AGC AGG CGC GA
Dominio Arquea
[18]
915R
GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT
Dominio Arquea
[19]
Tabla 1: Lista de cebadores con diana en los genes 16S y 18S empleados para la amplificación 1 Las letras F (forward) y R (reverse) indican la orientación del primer con respecto al rRNA
4.4 Clonaje____________________________________________________________ El clonaje se llevó a cabo mediante el Kit TOPO 1 Kit (InvitroGen, Carlsbad, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células competentes empleadas en este kit son las células Mach1™ T1. Se seleccionaron las que fueron correctamente transformadas mediante una electroforesis en gel de agarosa. 4.5 Análisis de secuencias________________________________________________ Los productos de la PCR fueron secuenciados mediante el kit de secuenciación (Big-Dye 1.1 sequencing kit, Applied Biosystems), como indican las instrucciones del fabricante. Para obtener la secuencia completa de los genes del 16S y 18S rRNA, se solaparon las secuencias parciales obtenidas con distintos cebadores intermedios empleando el software DNA Baser Sequence Assembler. La identidad de las secuencias se obtuvo mediante la herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de la base de datos del NCBI, de esta manera se pudo saber a las secuencias de qué organismos se asemejan las secuencias que hemos obtenido tras el proceso de clonaje [20].
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5. Resultados 5.1 Características fisicoquímicas de las cortas______________________________ En general, el agua superficial de las cortas mineras suele estar saturada de oxígeno, y el hierro está presente mayoritariamente como Fe (III). En capas anóxicas más profundas aparece Fe (II), llegando a ser en ocasiones, la especie redox dominante. Desde primavera a otoño los lagos están térmicamente estratificados, formándose entonces una capa superior de algunos metros (epilimnion) más cálida y menos densa que la capa inferior (hipolimnion) con una estrecha zona de transición entre ambas (metalimnion), con un acusado gradiente térmico (termoclina). Esta estratificación desaparece en el invierno, debido a los procesos de mezcla que se dan en la vertical, homogeneizándose la columna de agua (mixolimnion) [21]. Lo más frecuente en los lagos mineros de la Faja Pirítica es la existencia de una capa densa y profunda que no se ve afectada por la mezcla invernal (monimolimnion), lo que da lugar a una estratificación química permanente (lago meromíctico). Hay dos tipos de monimolimnion, por un lado se tiene uno que es una capa donde las variaciones fisicoquímicas aparecen de forma escalonada, y el hierro está presente como Fe (II) y Fe (III), y por otro, una capa donde las variaciones se muestran en gradiente y donde el hierro solo aparece como Fe (II) [3]. 5.1.1 Corta Concepción___________________________________________ Como ya se ha mencionado, esta corta es más grande y presenta un comportamiento anómalo, ya que no presenta las características típicas de aguas ácidas de minas. Mediante la sonda multiparamétrica se midieron distintos parámetros fisicoquímicos a lo largo de la vertical de la misma. Estos datos quedan bien representados en las Figuras 1 y 2:
Figura 1: Variación de los parámetros A. Temperatura. B. Oxígeno disuelto. C. Concentración de clorofila-a, con la profundidad.
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En primer lugar se puede observar la variación de temperatura desde la superficie hasta el punto más profundo (Fig. 1A). En los cuatro primeros metros la temperatura se mantiene constante (20º C). A continuación se aprecia un brusco decrecimiento llegándose a alcanzar los 12º C. La termoclina es el punto donde ocurre ese cambio brusco de temperatura. La variación del oxígeno disuelto queda reflejada en la Fig. 1B. En los primeros cuatro metros ocurre de igual modo que con la temperatura, se mantiene constante entre 90 y 100 % de saturación de oxígeno. A partir de ahí el oxígeno comienza a disminuir progresivamente hasta los 10 metros, punto a partir del cual la saturación de oxígeno se hace 0. La quimioclina es el punto donde se da un cambio brusco en la concentración de una sustancia, en este caso el oxígeno. Existe una que permanece todo el año y otra que se forma en primavera. En la Fig. 1C se observa la variación en la concentración de clorofila-a que hay a lo largo de la corta. Este dato nos da información sobre la existencia de organismos fotosintéticos. La concentración comienza siendo de 0,3 µg/l. A continuación aumenta poco a poco hasta los cuatro metros y después disminuye, pero da un pico muy pronunciado a los 10 metros de 2,18 µg/l. Después se alcanzan valores similares a los de la superficie.
Figura 2: Variación de los parámetros A. pH. B. Radiación fotosintéticamente activa (PAR), con respecto a la profundidad.
En cuanto al pH se observa que permanece constante entre 2,5 – 2,6 hasta los 13 metros aproximadamente y a partir de ahí aumenta hasta 3,51. (Figura 2A) Por último se aprecia como la irradiancia es máxima en la superficie llegando a alcanzar 3607 µmol/s·m2 y a los 2 metros comienza a disminuir progresivamente y a partir de los 10 metros es mínima. (Figura 2B)
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5.1.2 Corta Nuestra Señora del Carmen_____________________________ Se midieron los mismos parámetros fisicoquímicos y se obtuvieron los siguientes resultados (Figura 3 y 4).
Figura 3: Variación de los parámetros A. Temperatura. B. Oxígeno disuelto. C. Concentración de clorofila-a, con la profundidad.
Esta corta presenta un comportamiento diferente como se puede observar en las distintas gráficas. En la Figura 3A observamos la temperatura. En la superficie la temperatura es de casi 25ºC y comienza a disminuir conforme profundizamos en su interior. La termoclina, marca el punto donde se da un cambio muy brusco, aproximadamente a los 4 metros. A partir de ese punto se estabiliza manteniendo una temperatura constante de unos 14ºC. Para continuar vemos que el oxígeno disuelto es del 100% en la parte superficial pero a poco que sumerjamos la sonda, éste alcanza un valor mínimo. La línea verde representa la quimioclina. (Fig. 3B) En cuanto a la concentración de clorofila-a, la tercera figura nos muestra que a los 0 metros, la concentración es de 1,5 mg/l. Poco después hay un pico muy pronunciado alcanzando un valor superior a 2 mg/l, pero enseguida vuelve a disminuir y a partir de los 4 metros apenas encontramos clorofila. (Fig. 3C)
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Figura 4: Variación de los parámetros A. pH. B. Radiación fotosintéticamente activa (PAR), con respecto a la profundidad.
El pH comienza siendo de 2,4 y va disminuyendo con la profundidad, posteriormente se estabiliza a los 5 metros. (Fig. 4A) Por último se registraron valores muy altos de irradiancia en la superficie llegándose a alcanzar los 4000 mmol/sm2. A partir de 1 metro aproximadamente deja de penetrar la luz y el valor es nulo. (Fig. 4B)
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5.2 Metales pesados____________________________________________________ En el agua de las cortas hay una gran cantidad de metales en disolución, pero entre todos ellos hay 6 metales que destacan sobre el resto debido a su elevada concentración, estos son; cobre, aluminio, magnesio, zinc, cadmio y cobalto [22]. La concentración de estos metales varía en cada corta. 5.2.1 Corta Concepción___________________________________________ Cu (mg/l)
Al (mg/l)
Mn ( mg/l)
Zn (mg/l)
Cd (mg/l)
Co (mg/l)
0m
3,19
28
1,11
7,18
19,9
248
2m
3,22
27,9
2,22
7,12
18,8
235
4m
3,23
27,5
3,33
7,26
18,7
241
7m
5,03
39,6
4,44
11,2
30,8
358
10 m
5,51
39,4
5,56
11,9
35,7
373
13,5 m
12,8
96,2
6,67
32,7
73,6
592
Tabla 2: Concentraciones de los metales pesados en disolución
En esta tabla podemos ver que todos los metales están en distintas concentraciones, pero todos ellos van aumentando con la profundidad. El metal que se encuentra en mayor cantidad es el cobalto alcanzando concentraciones de hasta casi 600 mg/l a los 13.5 metros de profundidad, por el contrario el manganeso es el que se encuentra en concentraciones más bajas no superando los 10 mg/l en ningún caso. El metal por excelencia en estos ambientes es el hierro y merece un análisis más detallado El hierro, metal principal en este sistema [23], tiene un comportamiento peculiar (Gráfica 1). La concentración de Fe (II) comienza siendo de 3,1 mg/l en la superficie y posteriormente comienza a descender hasta llegar a los 7 metros de profundidad, a partir de ahí se observa un pico muy pronunciado ya que aumenta enormemente su concentración. Por otro lado el Fe (III) se mantiene alrededor de los 10 mg/l hasta los 10 metros, punto en el cual sufre un leve descenso al contrario de lo que ocurría con el Fe (II). Observando a ambos en conjunto, la concentración de hierro total es máxima a 13,5 metros (510 mg/l). Gráfica 1: Concentración del hierro en sus distintas formas
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5.2.2 Corta Nuestra Señora del Carmen_____________________________ Cu (mg/l)
Al (mg/l)
Mn (mg/l)
Zn (mg/l)
Cd (mg/l)
Co (mg/l)
0m
27,4
204
77,8
8,2
12,5
645
15 m
29,6
190
84,1
8,9
13,2
666
Tabla 3: Concentraciones de los metales pesados en disolución
Los metales en esta corta se comportan de manera diferente. Todos aumentan con la profundidad, a excepción del aluminio que disminuye a los 15 metros. El cobalto es el más abundante al igual que en la anterior corta alcanzando valores de 666 mg/l, pero en este caso el minoritario es el zinc (8,2 mg/l). En cuanto al hierro (Gráfica 2), en esta corta la concentración de Fe (II) aumenta progresivamente desde la superficie hasta los 5 metros donde la concentración es de 300 mg/ml y en ese punto se estabiliza. En cuanto al Fe (III) su concentración es elevada en la superficie (600 mg/l) y luego disminuye y también se estabiliza, de manera que a partir de los 5 metros hay prácticamente la misma cantidad de ambos (un poco mas de Fe III), de forma que la cantidad de hierro total va a ser estable y de unos 700 mg/l.
Gráfica 2: Concentración del hierro en sus distintas formas
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5.3 Diversidad Microbiana______________________________________________ 5.3.1 Concepción_________________________________________________ La figura 5 esquematiza los filotipos encontrados para cada una de las profundidades estudiadas. Fueron muestreadas cinco capas, en ellas se encontraron 28 filotipos de los cuales solo 8 son típicos de aguas ácidas. Vemos que en los primeros 2 metros, los filotipos predominantes corresponden a Acidiphillium y Acidisphaera del dominio Bacteria que son heterótrofos, apareciendo también eucariotas como Chlamydomonas. A los 4 metros descubrimos un nuevo filotipo eucariota, Ochromonas. A partir de los 7 metros comienza la aparición de oxidadores de hierro como Ferrovum myxofaciens que se mantienen hasta el fondo y heterótrofos como Acidocella y Acidobacteria. También se observan Ochromonas que persisten hasta los 10 metros. A los 13,5 metros encontramos un nuevo oxidador de hierro Ferrithrophicum radicola y un nuevo heterotrofo, Actinobacteria.
Heterótrofos Versátiles No oxidan hierro Reducen hierro Oxidan azufre Autótrofos Oxidan hierro
Figura 5: Modelo esquemático de la disposición de los filotipos en CC. En cada capa aparecen los filotipos encontrados, en negro los correspondientes al dominio Bacteria y en verde los pertenecientes al dominio Eucarya. No se encontraron filotipos del dominio Arquea. Entre paréntesis se representa el número de veces que se repite cada filotipo.
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5.3.1 Nuestra señora del Carmen___________________________________ Fueron muestreadas dos capas, en ellas se encontraron 18 filotipos diferentes y de ellos 13 son típicos de aguas ácidas (Figura 6). En la superficie aparecen principalmente filotipos relacionados con organismos del dominio Bacteria como Acidiphillium y Acidisphaera que son heterótrofos. Asimismo encontramos secuencias relacionadas con la presencia de una bacteria oxidadora del hierro, Leptospirillum (L.). A los 15 metros de profundidad encontramos más heterótrofos como Actinobacterium. De nuevo aparecen los oxidadores de hierro L. ferrooxidans y L. ferrodiazotrophum. Por último los oxidadores y reductores de hierro que son a su vez oxidadores de azufre Acidithiobacillus ferrooxidans y A. ferrivorans. En cuanto al dominio Eucarya aparece únicamente el filotipo Chlamydomonas a los 0 metros, no localizando más secuencias relacionadas con eucariotas a ninguna de las profundidades analizadas. Por último, solo se encontró el filotipo Thermoplasmataceae a 15 metros de profundidad correspondiente al dominio Arquea.
Heterótrofos Versátiles No oxidan hierro Reducen hierro Oxidan azufre Autótrofos Oxidan hierro
Heterótrofos Versátiles Oxidan hierro Reducen hierro
Autótrofos Versátiles Oxidan hierro Reducen hierro Oxidan azufre
Figura 6: Modelo esquemático de la disposición de los filotipos en la corta de NSC. En cada capa aparecen los filotipos encontrados, en negro los correspondientes al dominio Bacteria, en verde los pertenecientes al dominio Eucarya y en azul los del dominio Arquea. Entre paréntesis se representa el número de veces que se repite cada filotipo.
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6. Discusión Tal y como se ha mencionado anteriormente, estudios previos desarrollados en este tipo de ambientes han permitido demostrar la importancia del ciclo del hierro en la generación de condiciones extremas en las aguas ácidas de minas: la acidez y la elevada concentración de cationes metálicos [6]. La introducción de técnicas moleculares ha permitido, no solo identificar los microorganismos presentes en el sistema sin necesidad de recurrir a medios de cultivo, sino también su cuantificación, con el fin de evaluar su importancia en el funcionamiento del ecosistema. Además gracias a estudios fisicoquímicos se han podido determinar las condiciones de temperatura, pH, oxígeno disuelto, irradiancia, etc. a las que están sometidos los organismos que habitan en las minas. 6.1 Ecología microbiana de ambas cortas__________________________________ La corta NSC sigue el modelo general descrito en la mayoría de las cortas mineras estudiadas hasta la actualidad [24, 25, 26, 27, 28]. El agua de dicha corta permanece inmóvil la mayor parte del año, esto permite la formación de unas capas que permanecen estables. La primera, una capa superficial en la cual penetra la luz fácilmente y hay una gran cantidad de oxígeno disuelto y la segunda, una capa un poco más profunda en la cual no penetra la luz y es anóxica [29]. Dado que en ambas capas las condiciones son diferentes, la microbiología presente en cada una de ellas también lo es. En la superficie se encuentran, por un lado productores fotosintéticos primarios que obtienen la energía del sol para transformar los compuestos inorgánicos en orgánicos, entre ellos están las algas como las Chlamydomonas, y por otro lado existen gran cantidad de bacterias quimiolitótrofas. En la capa anóxica los compuestos oxidados pueden ser reducidos por bacterias quimiolitótrofas y también por bacterias heterótrofas generándose y manteniéndose de esta manera las condiciones extremas. (Fig. 7) Dado que este sistema está basado en el ciclo del hierro, los organismos utilizan este mineral como fuente de energía oxidándolo o reduciéndolo según en qué parte de la columna de agua se encuentren, de manera que en la parte superficial, los organismos quimiolitótrofos como Leptospirillum oxidan el hierro a Fe3 y en la capa más profunda se establece un ciclo en el cual las bacterias oxidan y se reducen por igual el hierro, teniendo un 50% Fe3 y 50% Fe2.
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Gracias a las técnicas moleculares y a los datos fisicoquímicos obtenidos se ha podido establecer un modelo que explica las reacciones biológicas que se dan debido al metabolismo de las distintas especies en aguas ácidas de minas en esta corta.
Figura 7: Modelo esquemático de funcionamiento del ciclo del hierro en NSC.
La biomasa generada fotosintéticamente por los productores primarios es descompuesta por una gran cantidad de bacterias heterótrofas (Fig. 7). Este es el caso del género Acidiphilium. Es una bacteria muy versátil que no es capaz de oxidar hierro pero sin embargo en ocasiones puede reducirlo usando los compuestos orgánicos como donadores de electrones, además tiene la capacidad de reducir el hierro y oxidar el azufre. Por otro lado el carbono atmosférico es fijado por una bacteria autótrofa, Leptospirrilum ferooxidans, pero principalmente se encarga de oxidar el hierro pasando de Fe2 a Fe3. Debido a su actividad encontramos una enorme concentración de Fe3 en la superficie. A medida que profundizamos un poco nos encontramos con organismos pertenecientes al género Actinobacterium, que son bacterias heterótrofas capaces de oxidar y reducir el hierro. Además, al igual que Acidiphilium se encargan de eliminar compuestos orgánicos. En estas
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zonas anóxicas también habitan oxidadores de hierro como Leptospirrillum ferrooxidans, que también es capaz de ejercer su función en ausencia de oxígeno. Otras bacterias muy versátiles son aquellas que pertenecen al género Acidithiobacillus, estas son autótrofas y son capaces de oxidar y reducir el hierro y oxidar el azufre. Debido a que en esta última capa encontramos tanto oxidadores como reductores en la misma proporción, la concentración de Fe3 ya no es tan elevada, ya que está siendo reducido, debido a ello encontraremos la mitad que en la superficie. Por último, es típico encontrar organismos pertenecientes al tercer dominio, se trata de una arquea del género Thermoplasma, son heterótrofas y capaces de oxidar y reducir el hierro y también oxidar el azufre. Su nombre es debido a que su temperatura óptima de crecimiento es de 45-50ºC [30], pero se ha encontrado un filotipo relacionado con este organismo en un ambiente en el cual la temperatura no supera los 24ºC, lo que significa que no es del todo conocido su metabolismo. Por el contrario, en CC hay menos cantidad de filotipos propios de ambientes ácidos, ya que sólo aparecieron 8 (Figura 5). Además los pocos que hay no son de los más extremos que puedan encontrarse. En los cuatro primeros metros no hay reducción ni oxidación de hierro porque la cantidad de hierro que hay en la superficie de esta corta es mínima. A partir de los siete metros en adelante comienza a haber hierro por lo que se dan reacciones de oxidación encontrando oxidadores de hierro como Ferrovum myxofaciens y Ferrithrophicum radicola, además hay gran cantidad de heterótrofos que se van a encargar de reducirlo. A los 13,5 metros se registra una fuerte subida de la concentración del Fe3 (Gráfica 1).Se sabe que esta mina está conectada a una mina de interior portadora de gran cantidad de hierro, ésta puede ser la principal fuente de hierro de esta capa y la responsable de la presencia de estos organismos a estas profundidades [3]. Por otro lado, a diferencia de NSC, encontramos otro filotipo eucariota diferente, Ochromonas que se registra hasta los 10 metros. Las Ochromonas son organismos fotosintéticos por lo que únicamente deberíamos encontrarlos en capas más superficiales donde hay mayor cantidad de luz ya que es su principal fuente de energia, pero presenta una peculiaridad, que también es heterótrofa y por ello puede sobrevivir a tanta profundidad [31]. Esto explica el pico de clorofila tan pronunciado que observábamos en la Figura 1C. También se encontraron Chlamydomonas en los dos primeros metros ya que al ser únicamente fotosintética y no heterótrofa solo aparece en aquellas zonas donde pueda captar la luz necesaria para poder realizar sus funciones metabólicas. Asimismo, esta corta, a Proyecto Final de Carrera. Facultad de Biología
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diferencia de NSC no presenta filotipos relacionados con arquea, ello puede deberse a que las condiciones no son tan extremas. Todos estos filotipos se encuentran repartidos a lo largo de la corta sin seguir un patrón determinado como lo hacía la anterior, donde los oxidadores se encontraban principalmente en la superficie en la que hay gran cantidad de hierro y más abajo oxidadores y reductores. Estas diferencias en la ecología microbiana en ambas cortas podrían estar relacionadas con las diferentes condiciones fisicoquímicas del agua que presentan ambos ambientes. Las dos cortas se encuentran situadas dentro de la Faja Pirítica Ibérica a una distancia de 66 Km aproximadamente, una distancia no muy grande, y sin embargo presentan claras diferencias. Como se ha comentado, NSC presenta unas características que siguen el modelo clásico de lagos ácidos de minas (Figura 7), sin embargo CC no, esto puede ser debido a varias razones: En primer lugar NSC es una corta de menor tamaño y está situada en una zona con mayor cantidad de pirita, donde el terreno es llano y recibe poco aporte de agua [3]. Esto hace, por un lado, que la concentración de hierro disuelto en agua sea mayor
alcanzando una
concentración de hierro total máxima de 725 mg/l (Gráfica2), que aumente la cantidad de metales pesados en disolución, y que tenga un pH más bajo (Figura 4A). Sin embargo CC es mucho más grande y la cantidad de pirita es considerablemente menor que en la anterior corta, además el terreno donde se encuentra es escarpado por lo que a ella llega mucha cantidad de agua de escorrentía. La concentración de hierro no es tan elevada, a los 10 metros es de 35 mg/l, después aumenta debido una entrada de agua proveniente de la mina de interior a la que está conectada llegando a alcanzar los 510 mg/l (Gráfica 1). Por último el pH se ve ligeramente aumentado (Figura 2A). Al analizar los parámetros fisicoquímicos observamos más diferencias: - En cuanto a la temperatura, en el caso de CC el máximo que alcanza es de 21ºC y en NSC 23,5ºC (Figuras 1A y 3A). La diferencia no es muy grande pero puede ser debida al aporte externo de agua que le llega a cada una. CC al estar conectada a una mina de interior recibe un aporte subterráneo además del agua de escorrentía y NSC recibe menos agua de lluvia, esto hace que el agua no varíe su temperatura por aportes externos de agua.
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- El oxígeno disuelto presente en el agua de NSC es máximo en la superficie hasta los dos metros, a partir de ese punto el valor es 0. En el caso de CC, si nos fijamos en la Figura 3B vemos que la línea describe un movimiento escalonado que nos muestra que hay oxígeno hasta los 10 metros de profundidad. Esto puede deberse también a los volúmenes de agua tan dispares que recibe cada una, ya que el aporte de agua conlleva también un suministro de oxígeno. - La concentración de clorofila presente en el agua igualmente muestra claras diferencias. En CC se registraron dos picos de clorofila a los 4 metros y 10 metros, esto se debe a la presencia de un filotipo relacionado con Ochromonas y en NSC solo hay un pico en la superficie debido a la presencia de otro filotipo eucariotico, Chlamydomonas (Figuras 1C y 3C). Las distintas composiciones del agua son las responsables de que nos encontremos una microbiología eucariota tan dispar en cada corta, y por ello la clorofila registrada en cada una de ellas es distinta. - En cuanto a la irradiancia, NSC recibe gran cantidad de luz pero únicamente en la superficie, después los valores registrados son mínimos. En el caso de CC la luz penetra hasta zonas muy profundas (a los 8 – 10 metros se registran valores de 180 – 80 µmol/s·m2). Esto podría ocurrir porque, siendo menor la cantidad de hierro en esta última corta, las aguas son más claras y la luz penetra a más profundidad. (Figuras 2B y 4B). La cantidad de metales pesados en disolución es también un dato significativo a tener en cuenta. Hay una mayor cantidad de metales pesados en NSC, esto se debe a que al tener un pH más bajo, el agua es más ácida y disuelve con más facilidad los metales con los que está en contacto. (Tablas 2 y 3). Aunque las condiciones fisicoquímicas del agua parece que son las que van a condicionar la ecología microbiana en estos dos ecosistemas, es necesaria la realización de estudios más en profundidad para poder discernir que parámetros son los más influyentes a la hora de la distribución de las especies dentro de la columna de agua.
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7. Conclusiones Con estos resultados podemos concluir que las dos cortas mineras son muy diferentes tanto en composición química como en la microbiología que habita en cada una de ellas:
- Las aguas de Nuestra Señora del Carmen son altamente extremas en cuanto pH debido principalmente a su alta composición en pirita, además al ser pequeña y recibir poco agua, la concentración de hierro disuelto en muy elevada.
- Concepción es una corta que contiene aguas con pH ácido pero sus condiciones son menos extremas debido principalmente a un bajo contenido en pirita, un gran tamaño y una enorme cantidad de agua que conlleva menor concentración de hierro disuelto.
- La microbiología encontrada en ambas cortas es muy dispar debido a la diferencia tan grande en la concentración de hierro disuelto en el agua de cada una de ellas y a los parámetros fisicoquímicos registrados.
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