Obtención del extracto acuoso de Stevia Rebaudiana y su acción bactericida en el Streptococcus Mutans responsable de la cariogénesis humana Miguel Angel Luque Gutiérrez Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas, Programa Profesional de Ingeniería Biotecnológica, Universidad Católica de Santa María, Arequipa-Perú Resumen En el presente estudio se obtuvo el extracto vegetal de Stevia Rebaudiana con el método acuoso para la obtención del extracto para su posterior uso en la inhibición de la bacteria Streptococcus mutans causante principal de la cariogénesis humana así como también en el presente trabajo se procedió a asilar la bacteria Streptococcus mutans por medio de una muestra salival y tratada con suero fisiológico a temperaturas bajas y para su debido aislamiento de la bacteria se utilizo el medio de cultivo selectivo solido TYCSB trabajado a temperatura de 37C que resulta ser adecuada para el Streptococcus mutans y se vio finalmente la acción de inhibición de dicho extracto en contra del Streptococcus mutans para su posterior uso. Palabras claves: cariogénesis, Streptococcus mutans, inhibición
Abstract In the present study there was obtained Stevia Rebaudiana extract by the watery method for the obtaining of the extract for his later use in the inhibition of the bacterium causative principal Streptococcus mutans of the human cariogénesis as well as also in the present work one proceeded to shelter the bacterium Streptococcus mutans by means of a sample salivary and treated with physiological whey to low temperatures and for his isolation of the bacterium by means of a selective culture solid worn out TYSCB to temperature adapted for the Streptococcus mutans and finally one saw the action of inhibition of the above mentioned extract for his later use. Keywords: Cariogénesis, Streptococcus mutans, inhibitión
INTRODUCCION En la actualidad la caries dental es una enfermedad infecciosa de naturaleza multifactorial transmisible que ocurre en la estructura dentaria en contacto con los tres principales causantes de dicha enfermedad que son restos de comida, bacterias y la pieza dental cuya acción es provocada por ácidos por medio de la acción de las bacterias sobre los hidratos de carbono fermentables (azúcares); uno de los ácidos más importantes es el acido láctico que lo produce el Streptococcus mutans, causante principal de la cariogénesis dental. Uno de los principales agentes antimicrobianos que contiene una propiedad bactericida es la Stevia rebaudiana donde actúan los principios activos de dicha especie vegetal y que se localiza principalmente en las hojas de esta especie vegetal que actúa como agente bactericida del Streptococcus mutans. La Stevia esta planta es originaria de Paraguay descubierta en 1887; A pesar de que los conquistadores españoles tuvieron conocimientos de esta planta (siglo XVI), no atrajo su atención sino hasta fines del siglo XIX (1899), cuando fue descrita por primera vez en la literatura científica por el Dr. Moisés Santiago Bertoni, quien realizó los primeros estudios científicos sobre esta planta hace aproximadamente 100 años(1), momento a partir del cual recibió el nombre científico de Stevia Rebaudiana Bertoni. Existen más de 300 variedades de Stevia en la selva Paraguayo-Brasilera, pero la Stevia Rebaudiana Bertoni es la única con
propiedades endulzantes gracias a su principio activo, denominado “esteviósido” en 1921 por la Unión Internacional de Química. (2) Composición: La hoja de la Stevia, en su estado natural, posee gran cantidad de nutrientes, que en orden de concentración son: - Más del 50%: carbohidratos de fácil asimilación. - Más del 10%: fibras, polipéptidos (proteínas vegetales). - Más del 1%: lípidos, potasio. - Entre el 0,3 y el 1%: calcio, magnesio, fósforo. - Menos del 0,01%: cromo, cobalto, hierro, manganeso, selenio, silicio, zinc. - Indicios de ácido Ascórbico, aluminio, beta caroteno C, estaño, riboflavina, Vit B1. - Varios aceites esenciales. Entre los glucósidos, se encuentra en mayor proporción el esteviósido generalmente entre 5 a 10% del peso de la hoja y en menor medida, del orden de 2 a 3% rebaudosidos A, B, C, D, E, dulcosido A y B, y steviosido. (3) La Stevia es apta para diabéticos, es hipotensora (recomendada para personas con tensión alta, pues la reduce), sirve para el cuidado facial, para problemas de acidez de estómago, es adecuada para bajar el nivel de acidez de la sangre y de la orina, ayuda a bajar de peso porque no tiene calorías y no produce ninguno de los nocivos daños causados por el azúcar y los demás edulcorantes artificiales. Es soluble en agua fría o caliente, sin nutrientes, sin calorías, se puede hornear (es estable a los 200°C), no se fermenta, no crea placa dental, es anti-caries, y no tiene efectos tóxicos. (4) La microbiota oral cariógena, localizada en sitios específicos sobre los dientes comprende los agentes que producen las sustancias químicas (ácidos orgánicos y enzimas proteolíticas) que causan la destrucción de los componentes inorgánicos y orgánicos del diente. El sustrato local, es decir, la dieta, proporciona los requerimientos nutricionales y, por tanto energéticos a los microorganismos orales, permitiéndoles así colonizar, crecer y multiplicarse sobre superficies dentarias selectivas (5) La flora dental La boca es un medio favorable para el mundo microbiano: Condiciones constantes (saliva) Suministro periódico de alimentos (ingestión) Limpieza de desechos (saliva) Las bacterias orales forman un ecosistema Especies adaptadas al medio Influencia de la flora en las condiciones físico-químicas de la cavidad oral Dependen de 1.Capacidad para nutrirse de la dieta 2.Tolerancia a condiciones químicas (pH, O2, fuerza iónica) de la saliva 3.Resistencia a mecanismos de defensa (lisozima, anticuerpos, aglutinógenos) 4.Competencia en el crecimiento con otras especies 5.Adherencia y resistencia al lavado de la saliva • Especies presentes – Aerobias y anaerobias – Pioneras: Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces – Posteriores: Flora dental compleja Poder cariogénico de las bacterias – Cepas con poder cariogénico bajo •Streptococcus salivaris, produce levanos •Streptococcus sanguis, produce dextranos
– Cepas con poder cariogénico alto •Streptococcus mutans, produce mutanos insolubles(6) Los estreptococos son un grupo grande de cocos Gram positivos que se desarrollan en pares o en cadenas. La mayor parte de ellos corresponde a anaerobios facultativos, aunque algunos son anaerobios obligados. Numerosos estudios han demostrado que los estreptococos del grupo mutans están relacionados con la placa cariogénica y asociado con su comienzo: en la saliva hay un aumento significativo de estos microorganismos antes de la formación de la caries dental. Esto fue corroborado cuando se comprobó que ante la acción de sustancias antisépticas como la clorhexidina el nivel de Streptococcus mutans decrezca y se observaba una disminución del número de caries dental, en los pacientes tratados en comparación con otros pacientes no tratados. Los Streptococcus mutans son anaerobios facultativos, la temperatura óptima para su desarrollo es de 36+/- 1 C , aunque pueden multiplicarse a temperatura ambiente, una práctica aconsejable es incubar las placas inoculadas 24 horas en anaerobiosis y, posteriormente, otras 24 horas en aerobiosis, esto favorece a la formación de agua oxigenada, que es un importante carácter diferencial y, en parte, la síntesis de polisacáridos extracelulares que, en algunos casos pueden facilitar el reconocimiento de las colonias. Como medio más selectivo es usado el MSB (mitis-salivarius-bacitracina). (7) Materiales y métodos: 1. Obtención del extracto por método acuoso: Para la obtención del extracto vegetal de Stevia Rebaudiana por el método acuoso se recolecto y se peso hojas de Stevia Rebaudiana dependiendo de la cantidad de extracto vegetal que se quiere obtener de la especie vegetal antes mencionada con la siguiente relación (E=7.47*SRg-3.807 R=0.999) procediendo a macerar durante 24 horas a temperatura ambiente y se procederá a macerarlas a temperatura ambiente durante 24 horas en agua destilada con la relación (A=14*SRg) con carbonato de calcio con la relación(CC=0.05*SRg), luego de transcurrido el tiempo de maceración se procedió a filtrar por medio de un filtro a vacio con ello se eliminara el material innecesario, luego del filtrado se procedió a agregar hidróxido de calcio con la relación(HC=0.1*SRg) y se deja actuar durante 30 minutos, después de transcurrido el tiempo se procede a almacenar el extracto a temperaturas bajas en un frasco completamente estéril para su uso posterior.
Grafico 1. Mililitros de extracto vs gramos de Stevia Rebaudiana en la grafica mostrada se muestra la relacion entre los gramos de Stevia que se necesita para la cantidad de extracto obtenido se experimento con 3 experiencias dando los resultados mostrados en la grafica. g de Stevia Factor cantidad Stevia Rebaudiana 10 7.477 70.963 extracto en ml Agua destilada 14 140 ml Carbonato de calcio 0.05 0.5 g Hidróxido de calcio 0.1 1 g Tabla 1. Se muestra la obtencion de 71 ml de extracto de stevia y la cantidad de cada sustancia para la obtencion del extracto cada uno con sus diferentes factores. 2. Preparación del medio de cultivo: Para la preparación del medio de cultivo se tomo en cuenta un estudio comparativo de medios para el crecimiento de Streptococcus mutans en el cual se trabajo con el medio donde presento mayor cantidad de presencia del Streptococcus mutans. TYSCB: medio de cultivo que ha dado óptimos resultados tanto en recuperación como en selectividad en algunos estudios comparativos, además es fácil de preparar y económico, aspectos de valiosa importancia en nuestro medio. TYCSB 0.2 15 5 0.1 0.1 1 2
g g g g g
L-cistina HCl monohidratado Bacto peptona Extracto de levadura Sulfato de sodio Cloruro de sodio g Na2HPO4.7H2O fosfato de sodio g NaHCO3 carbonato de sodio g C2H3O2Na.3H2O acetato de sodio g 20% p/v sacarosa g Agar granulado U/ml Bacitracina
20 200 15 0.2 741.4 ml Agua destilada Tabla 2. Componentes del medio de cultivo TYCSB para el crecimiento selectivo de Streptococcus mutans para 1 litro de medio 3. Aislamiento del Streptococcus mutans: Se recolecto muestras salivales de personas la cantidad de 2ml por persona dependiendo del flujo salival que cuenta cada persona se determino un promedio de 3 a 5 minutos para dicha obtención de saliva la cual se coloco en recipientes estériles los cuales se mantuvieron en un ambiente cubierto con hielo después se procedió a sacar 0,1ml de la muestra a un tubo de ensayo con la ayuda de una micropipeta y se diluyo con suero fisiológico 5ml después de esto se tomo una alícuota de 0,1ml de esta dilución para realizar el sembrado que se ejecuta por medio de la utilización de un hisopo en el medio de cultivo para el desarrollo de la bacteria (Streptococcus mutans)todo esto desarrollado en completa esterilidad. Después se llevo las placas a incubación por 48 horas a 37C, durando dicho medio de cultivo unos 6 días
después de transcurrido dicho tiempo se ve por completo que ya no hay medio de cultivo por lo consiguiente no hay la bacteria. Luego de transcurrido el tiempo de crecimiento de la bacteria se procederá a observar en el microscopio por medio de la técnica de tinción de Gram la presencia de Streptococcus mutans así como se procederá hacer las diferentes pruebas bioquímicas (reactivo de Kovac y la prueba de la catalasa). 4. Prueba de difusión en discos: Del extracto obtenido se sumergió discos de papel filtro en 5 frascos estériles diferentes concentraciones (100%, 70%, 50%, 25%, 10%), estos discos se aplican en el medio de cultivo TYCSB, donde se observo el mejor desarrollo de la bacteria, se procedió a incubar a 37C durante 48 horas. Después de pasado el tiempo se observará los diferentes halos de inhibición, dichos halos se procederán a evaluar de la siguiente manera: si los halos miden 9mm a más este se considera positivo, si el halo dio entre 6-9mm la actividad es moderada y si el halo dio menor a 6mm se considera negativo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: La obtención del extracto vegetal por el método acuoso resulto de fácil procedimiento ya que no se vio muy dificultoso al momento de obtener dicho extracto el único inconveniente fue el de el tiempo de maceración ya que se tiene que esperar unas 24 horas para la obtención del extracto así como para el almacenamiento del extracto se coloco a temperaturas bajas y en frasco oscuro ya que a temperatura ambiente el extracto se contamina.
Figura1. En la figura se observa el extracto de Stevia obtenida por el método acuoso se obtuvo en el recipiente la cantidad de 5ml de extracto
En el aislamiento del Streptococcus mutans se obtuvo dichas colonias con una concentración de 35 a 40 colonias por placa de cultivo con lo que se caracterizo dicha colonia por medio de la tinción GRAM así como se realizaron pruebas bioquímicas estas tres pruebas se realizaron para ser identificada ya sea morfológicamente a través de la tinción de gran donde se observaron la morfología de la bacteria así como bioquímicamente a través de la prueba de oxidasa mediante el reactivo de Kovac resultando esta negativa al no observarse un cambio en la coloración del reactivo de Kovac y otra prueba bioquímica fue la de la prueba de catalasa dicha prueba fue negativa ya que no se formaron burbujas cuando se coloco la bacteria indicando con estas pruebas la presencia de la bacteria Streptococcus mutans.
Figura2. Vista en Microscopio 40x la presencia de Streptococcus mutans por medio de la tinción de Gram.
En la prueba de difusión en discos se observo los halos de inhibición debido al extracto donde se pudo determinar que el tenia mayor concentración presento mejor respuesta en cuanto a la respuesta al cabo de 48 horas se pudo observar que no hubo crecimiento en la localización del disco de inhibición número 1 el que contenía el 100% del extracto así como también se observó en el disco de inhibición número 2 que se observó poco crecimiento de la bacteria en cuanto a los otros discos se pudo observar mayor crecimiento de la bacteria en los que tenían menor concentración del extracto de Stevia dichos resultados se muestran en la siguiente grafica.
Figura3 y 4. IZQ 3Concentración del extracto de Stevia Rebaudiana (de izq. a der. 10%, 25%, 50%, 70% y 100%) DER 4 placa con discos del extracto después de 48 horas. Grafico2. Se observa en el siguiente grafico las diferentes concentraciones del extracto así como el grado de crecimiento de la bacteria con un grado de ponderación de 10 como menor crecimiento al 50 como mayor crecimiento
CONCLUSIONES: En el presente estudio para la obtención del extracto vegetal se pudo obtener dicho extracto con suma facilidad para el debido estudio dependiendo de cuanto de extracto vegetal de Stevia Rebaudiana se quiere obtener ya que se pudo lograr obtener el extracto con los diferentes componentes para su obtención siendo el inconveniente la espera de maceración ya que este lapso de tiempo es de 24horas, en cuanto al aislamiento del Streptococcus mutans se trabajo con el medio de cultivo especifico(TYCSB) con el cual trajo buenos resultados en cuanto a su obtención de dicha bacteria ya que para la elaboración del medio de cultivo así como de sus componentes se obtuvieron del mismo lugar y no presentaba ninguna dificultad todo esto siempre trabajando en condiciones de lo mas estéril posible y la vida del Streptococcus mutans en el medio de cultivo es de 5 días con lo que se ve la alternativa de obtener a la bacteria por un tiempo de vida largo en cuanto a la inhibición del extracto se vio que si resultaría factible la inhibición de la bacteria con unas concentraciones altas del extracto pero todavía faltarían hacer más pruebas en cuanto la acción de dicho extracto para su posterior uso en cuanto a la elaboración contra la cariogénesis humana.
REFERENCIAS: (1) http://www.unq.edu.ar/servlet/ShowAttach?idAttach=5760. (2) http://www.encolombia.com/medicina/materialdeconsulta/incauca-cultivo.htm (3) ttp://www.verdeynatural.com.ar/Dietetica%20y%20Nutricion/Dietetica%20y%20Nutricionmasdetalle.asp?es=No tas%20y%20Articulos&en=Dietetica%20y%20Nutricion&de=&iddatos=1155&idioma=&titulo=STEVIA%20%2 0UN%20ENDULZANTE%20NATURALยบ (4) www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ingenieria/tesis17.pdf (5) http://www.cybertesis.edu.pe/sisbib/2003/bisso_af/html/index-frames.html (6) www.uv.es/~salgado/odonto/.files/Introduccion.pdf (7) http://www.cybertesis.egdu.pe/sisbib/2003/bisso_af/html/index-frames.html