Совреман пристап во откривањето и развојот на нови лекови Откривањето и развојот на нови лекови е многу скап процес. Бенефиот да се биде прв на пазарот со нов лек значи околу 1 милијарда долари профит во првата година и поседување на 75% од пазарот во текот на целиот период на продажба на лекот. Да се биде прв на пазарот е неопходно за современите фармацевтски компании да опстанат во бизнисот со висок ризик.
Историска еволуција на откривањето на нови лекови До 70 години од минатиот век Случајните откритија при хемиската синтеза и претпоставките кои биле добивани од експерименти со животни и изолирани органи биле водичи во синтезата на нови лекови. До 90 години од минатиот век По деталното откривање на лек рецептор интеракциите, молекуларно моделирање го презема приматот во откривање на новите лекови. Испитувањата се вршени на in vitro модели (одредување на ензимска инхибиција, врзување за рецептор) и потоа синтеза на нови соединенија со слични карактеристики. Во овој период се откриени голем број на лекови Acetanilide, Acetylsalicylic acid, Amphetamine, Chloral hydrate, Cisplatin, Clonidine, Cromoglycate, Cyclosporin, Dicoumarol, Diethylstilbestrol, Haloperidol, Heparin, Imipramine, Iproniazid, Isoniazid, Levamisole, Lithium carbonate, Lysergide (LSD), Nitroglycerine, Penicilli, Sulfonamides, Tamoxifen,Urethane, Valproic acid, Warfarin.
1
Од 2000 година-современ пристап во откривање на лекови “ориентиран кон болеста и нејзиниот причинител” Современиот пристап во процесот на откривање на нови лекови е дефиниран од ислкучителниот напредок на технологијата, брзиот развој на молекуларната биологија, генетика, геномика и протеомика со што е откриена молекуларната основа на болеста. Тоа е причината зошто откривањето и развојот на новите лекови е “ориентиран кон болеста и нејзиниот причинител”. Сведоци сме на автоматизирани лабораториски системи во полето на хемиската синтеза, биолошките тестови, метаболизамот на лекови и протеинската кристалографија, како резултат на што High throughput screening (HTS) стратегиите станаа доминантни во многу области во испитувањето на лековите. И покрај сите овие нови достигнувања на денешницата откривањето на лековите останува тешка задача, но сепак имаме поголем дел од сложувалката и тоа во делот на информации, тахнологии и експертиза. Потребни карактеристики што треба една супстанца да ги поседува за да биде лек -
-
Висок афинитет и селективност Можност за синтеза Орална биорасположливост – Правило на Липински, правило на пет Lipinski (Pfizer) „Rule of Five“: MW < 500, log P < 5, H донори < 5, H акцептори < 10 Добри фармакокинетски карактеристики Метаболизам (пр. без метаболизам на прв премин) Патишта на елиминација Отсуство на несакани ефекти и токсичност
Карактеристики кои го дефинираат дејство на лекот Липофилноста и дисоцијација/јонизација се одговорни за транспортот и дистрибуцијата на лекот во биолошките системи и негово доаѓање до местото на делување. Комплементарноста на геометриските 3D карактеристики на лекот со оние на врзувачкото место на рецепторот се одговорни за неговиот афинитет и фармаколошкиот одговор. Еден од водечките принципи во дизајнот на нови лекови е принципот на сличност. Медицинските хемичари, секогаш ја користат сличноста на хемиски соединенија за дизајн на aналози на активни водечки соединенија leading compounds. Кога и дa откријат соединенија со подобрена активност, селективност, фармакокинетика, намалена токсичност итн., тие ги користат овие соединенија за добивање и испитување на аналози кои ќе имаат подобри карактеристики.
2
Успешен критериум во откривањето и испитување на лекови!!! Соодветна одлука за постигнување на индустрискиот успех не е лек кој ќе поседува карактеристики кои се исти со веќе постоечки лек, туки ќе има подобри карактеристики, ќе даде побрз одговор, ќе биде прв на пазарот со одредена карактеристика или ќе биде единствен Односно: Не ”me too” туку”me better”,”me faster”,”me first” или ”me only”. Современ пристап во процесот на откривање и развој на нов лек Современиот процес во развојот на лекот има неколку стадиуми, поедноставено представени на следниот начин:
Идентификување на потенцијални “таргети”- Молекуларна биологија Идентификување на потенцијални “hits”-Биохемија и HTS Идентификување на водечко соединение “Leading compound” референтна супстанца -Медицинска хемија и молекулатно моделирање Развој на лек -
Предклинички развој
-
Клинички развој
-
Регистрација
-
Пуштање во промет
Процесот на откривање на лек е цикличен. Фазата на оптимизација која води до добивање на кандидати за лекови е повторлива, како што соединението успешно се модифицира на некој начин, повторно се анализира и повторно се тестира.
3
Преноминацијата за кадидат за лек и финалното пуштање на лек во промет е долго и водено од многу строги правила и регулативи за де се осигура безбедноста и ефикасноста на лекот. Насочен пристап во пребарување на водечко соединение (leading compound) Идентификација на патофизиолошки релевантен молекулски таргет, ензим, јонски канал или транспортер Детерминирање на DNA секвенцата Дефинирање структурата, функцијата и механизмот на дејство на протеинот Докажување на терапевтскиот концепт на животни HTS (High Throughput Screening) тест систем Синтетски програм и масовен скрининг Одбирање на една или неколку водечки соединенија Оптимизација на водечко соединение и развој на лекот Детерминирање на 3D структурата на молекулскиот таргет (протеин) и неговите комплекси со лиганди со ниско молекулска маса (водечки соедиененија). Молекуларно моделирање и дизајнирање на нови лиганди Натамошна синтеза и биолошки тестови на селектираните кандидати Оптимизација на селективност, биорасположливост и фармакокинетика HTS (High Throughput Screening) во откривањето на нови лекови Истражување на медицинските хемичари и компјутерските хемичари во процесот на откривање на нови лекови може да се подели на две фази: 4
- идентификување на нови соединенија кои покажуваат активност кон биолошкиот рецептор и -понатамошна оптимизација на овие водечки соединенија за да се добие соединение со подобрена потентност и фармаколошки карактеристики in vitro како и евентуално подобрена ефикасност, фармакокинетика и токсиколошки профил in vivo. Развојот на лекот е ориентиран кон е причинителот на болеста. Целта е да се најде лек кој ќе го анулира предизвикувачот на болеста.
Дизајнирање на лекови базирано на лиганд Ligand based drug design (LBDD)
Дизајнирање на лекови базирано на структурата Structure based drug design (SBDD)
без позната протеинска 3D структура, без познат лиганд комбинаторна хемија, просејување со висок ефект (―high-throughput screening, HTS‖ ) виртуелен скрининг
без позната протеинска 3D структура, со познат лиганд фармакпфпри
позната протеинска 3D структура, без познат лиганд de novo дизајнирање (флексибилност на протеините)
позната протеинска 3D структура, без познат лиганд структурнп базиранп дизајнираое
High Throughput Screening (HTS) – (просејување со висок ефект) е процес за анализа на ефектот на серија на соединенија насочени кон даден таргет. Тој се вклучува во прва фаза од развојот на лекот откако таргетот ќе биде идентификуван и е еден од неколкуте стадиуми во целиот процес на развој на нов лек каде може да се заштеди на време. Идентификацијата на водечките соединенија се врши или со случаен скрининг или со насочен пристап во испитувањето. И двата пристапи се од еднаква важност, а пристапот зависи од конкретниот проблем. Насочениот пристап во испитувањето бара рационална почетна точка за медицинските хемичари и молекуларните моделатори за започнување на нивното пребарување. На пример, дизајнирање на аналози на лекови за кои се знае дека се активни кон таргет рецепторот и се слични на природните субстрати на ензимите. 3D структурата на многу биолошки таргети е откриена со кристалографија сп Х-зраци и NMR, со што се отвара можноста за дизајнирање на нови молекули кои директно ќе ги поседуваат структурните карактеристики на врзувачкото место на рецепторот. Во последниве години достиднувањата на дизајнирање на лекови базирано на структура има главно влијание во рационалниот дизајн и оптимизацијата на новите водечки соединеија бидејќи структурата на рецепторот е добро позната. 5
Алтернативен пристап (неопходен кога нема корисна почетна информација) е случаен скрининг на колекцијата на постоечки соединенија. Соединенијата може да бидат обезбедени од in-house базите на податоци на фармацевтските компании. При тоа во минатотото ова бил долготраен процес бидејќи бил потребен долготраен скрининг. Денес овој процес е многу скратен поради употребата на HTS и во сите фармацевтски компании тоа претставува основа за добивање на ново водечко соедиение. Скрининг тестовите за одредување на афинитетот на испитуваните соединенија кон таргетот се најчесто од следниот тип: -Инхибиција со компетитивно врзување за познат тип на рецептор, каде релативното врзување на соединението се споредува со врзувањето на позната врзувачка компонента. -Инхибиција на произвотство на протеини-соединенијата се додаваат во бунарчиња кои содржат познати живи клетки и концентрацијата на протеини се мери после одреденo време. Доколку соединението успее да ја инхибира протеинската продукција, таа ќе биде намалена кај активните примероци. Скринингот се изведува на плочи вообичаено од 96 бунарчиња, а испитувањата се вршат со употреба на флуоресценција, радиоактивно обележување или LC/MS( Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry). Со High Throughput Screening (HTS) се скринираат илјадници на компоненти на една (100 M) или на три (100 M, 10 M и 1 M) концентрации насочени кон познат таргет и се добиваат првичните резултати дали соединенијата воопшто имаат афинитет кон рецепторот или се комплетно неактивни. Овие концентрации се толку ниски бидејќи тоа е концентрацијата која во биолошкиот систем лекот ја постигнува на местото на врзување за рецепторот по поминување на сите бариери во организмот. За статистичка релевантност примероците се аплицираат во трипликати и активноста на секоја компонента се мери три пати. Доколку соединението има било каква активност треба да даде приближно еднаков резултат три пати. На плочата секогаш се наоѓаат соединенија со дефиниран и познат одговор како и слепи контроли во кои отсуствува било какво соединение кое може да има активност. Овие се првите тестови кои се спроведени кон таргетите од интерес. Процесот е високо автоматизиран и употребува софистицирана лабораториска опрема и модерна техника за хемиска анализа. По добивањето на филтриран сет на соединенија кои имаат афинитет по првиот скрининг (the hits), се врши секундарниот скрининг и се добива подетален преглед на ефектот на соединението врз таргетот.Се прават мерења со повисок опсег на концентрации (од М до nМ концентрации) за да се добијат доза-одговор криви за да се утврди точниот афинитет на лекот кон дадениот рецептор. Целата на овој процес е да се намали сетот на соединенија на 5% од оригиналниот број кои би имале потенцијал за натамошен развој до лек. Ова е фазта која може да се дефинира како “from hit to lead”. Овие водечки соединенија се подложни на фаза на оптимизација, со што водечките соединенија се модифицираат и се ресинтетизираат за да се добијат слични содиненија кои повторно го поминуваат процесот на HTS. Во оваа фаза се спроведуваат анализи на помали сетови (DMPK drug metabolism and pharmacokinetics) со што се добиваат што е можно повеќе информации за 6
компонентите што е можно порано поврзани со метаболизмот и фармаокинетиката на лекот. Овие тестови, дури и ако се негативни во смисла на елиминација на соединението кое не ги задоволува критериумите, се особено корисни во натамошното оптимизирање на водечките соедиенија, бидејќи се добиваат информации за карактеристиките кои ги има соединението и се причина за неговата несоодветност и истите се елиминираат во следната синтеза на рафинираните водечки соедиенија. Предности на HTS -
Можност за скрининг на стотици илјади соединенија со контролирани и повторливи експерименти
-
Способноста за да се оптимизира водечко соедиение со елиминирање на соединенијата без никаква активност уште во многу рана фаза.
-
Како резулат на ова многу ефикасни лекови може да се развијат многу побрзо.
-
Високо ниво на сигурност во селектираните кандидати за лекови
-
Со ова се минимизираат трошоците и се продолжува животот на пациентите.
Сепак HTS, не гаранција за успех, и проблемите асоцирани со добивање на пренадежни случајни HTS е се почест случај. Воспоставувањето на робусни тестови за нови таргети бара многу време и пари. Добивањето на Hit соединенија за некои рецептори се многу ретки, за што е потребен скрининг за голем број на соединенија (десетици до стотици илјади). Колекциите на синтетизирани соединенија или природни продукти често содржат помал хемиски диверзитет отколку што е потребно за дефинирање на сите карактеристики на водечкото соединение, не се неисцрпни ресурси и потребен е долг период за испитување. Техниките како комбинаторна хемија даваат потенцијал за синтеза на многу големи библиотеки на соединенија, но во пракса овој процес бара многу време за добивање соединенија кои ќе имаат својства на лек. За да бидат работите уште потешки, последните достигнувања во геномиката и протеомиката го згоелмува бројот на потенцијалните таргети за испитување. Иако ова згоелмување недвосмислено ќе резултира со бенефит, размислувајќи на глобално ниво, во развојот на нови лекови, моментално се јавува проблем како да се валидираат сите овие нови таргети и како да се идентификуваат корисни водечки соедиенија на ефикасен начин. Како до порационален скрининг? Милиони на супстанции се синтетизирани и се сега достапни за нов скрининг. Кога е откриен нов таргет не е возможно да се направи скрининг на сите соединенија бидејќи 7
има премногу. HTS е ефикасен пристап, но е прескап. Овој проблем е делумно решен со примената на комбинаторна хемија. Недостатоци на традиционалната медицинска и органска хемија
Комплексност и долго времетраење на синтеза Низок диверзитет (недоволно за откривање на нови Leading compounds) Мал синтетски принос Спор развој на SAR профил во класа на соединенија Спора оптимизација во еволутивниот циклус Недоволна заштита на пациенти Високи трошоци (околу 5,000 – 10,000 US-$ за соединенија)
Цели: Брза идентификација на нови водечки соедиенија и оптимизација на нивниот афинитет (=активитет), селективност, ADME каратеристики, редукција на токсичност и елиминација на несакани ефекти. Комбинаторна хемија вo испитување на лекови Комбинаторната хемија преку воспоставување на автоматизирана паралелна синтеза го забрза процесот на откривање на водечко соедиение и негова оптимизација. При тоа биолошките карактеристики се позначајни од синтетските можности. За добра оптимизација на водечките соедиенија библиотеките треба да имаат висок степен на сличност, за да се покрие хемиската структура на водечкото соедиение, односно да се добијат најголем можен број на соедиенија кои целосно ќе се окарактеризира истото . Комбинаторната хемија и автоматизираната паралелна синтеза не може да ја замени класичната хемија, но со комбинаторната хемија се генерират огромен број на хемиски поврзани соединенија
Врзувачките блокови со 68 различни резидуи на 10 различни позиции (R1 - R10 се 5, 10, 10, 4, 2, 5, 5, 2, 5, и 20 резидуи) даваат библиотки од 20 милиони различни соединенија. Земајќи ги во предвид и двата стерни центри (*) се зголемува бројот на 80 милиони различни соединенија. Избор на примерок Основното прашање е како да го оптимизираме процесот на избор на примерок за иницијален скрининг за новиот таргет? Ако не е возможно да се изврши скрининг на 10 милиони примероци, “најветувачките” 100 000 мора да бидат идентификувани и скринирани. Се избират врз база на две нивоа: 8
-
Избирање кој сет на примероци од постоечките библиотеки на соединеија
-
Избор кој од примероците добиена со комбинаторна хемија треба да се синтетизираат, пред спроведување на скрининг
Screen smarter, not faster. Оваа тема е една од главните теми во процесот на откривање на лекови, и успешното решение на овој проблем ќе доведе не само до намалување на супстанциите врз кои треба да се изврши скрининг, но исто така и ќе се зголеми кваитетот на овие примероци, што ќе резултира со намалување на времето потребно за оптимизација на Leading compound. QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) анализите е техника за идентификување на најдобрите примероци за скрининг која се надоврзува на SAR (Structure Activity Relationship) резултатите од претходниот скрининг, идентификувајќи подсетови на соединенија со најсоодветна структура за работа според карактеристиките на новиот таргет идентификуван од молекуларна биологија. Што е QSAR ? QSAR (quantitative structure-activity relationships) ги опфаќа сите статистички методи, преку кои биолошката активност (најчесто изразена преку логоритми на еквипотетнтни моларни активности) е поврзана со структурните елементи (Free Wilson analysis), физичко-хемиските карактеристики (Hansch analysis), (3D QSAR). Класични QSAR анализи (Hansch-овите и Free Wilson-овите анализи) ги опфаќаат само 2D структурите. Главната нивна апликација е кај варијација на субституенти. 3D-QSAR анализа има многу поширока примена. Започнува од 3D структурата и ја корелира со биолошката активност на 3D-карактеристиките на активното поле, односно врзувачкото место на протеинот. Основни барања за QSAR студии - сите аналози припаѓаат на единствена серија - сите аналози имаат ист механизам на дејство - сите аналози се врзуваат на сличен споредлив начин - ефектите од изостерична замена може да бидат предвидени - врзувачкиот афинитет се поврзува со енергиите на интеракции - биолошкаите активности се во корелација со врзувачкиот афинитет 2D QSAR модели Сознанието за постоење на врска помеѓу хемиската структура и нејзиниот биолошки одговор (SAR) е прилично старо. Во втората половина на минатиот век англиските научници Crum-Brown и Fraser за прв пат го спомнуваат односот на хемиската структура и биолошката активност на соединенијатра: стрихнин, бруцин, тебаин, кодеин, морфин и никотин и го поставиле најосновниот израз кој претставува основа на сите QSAR модели: BR= f(C) 9
BR-биолошки одговор C- хемиска структура Предвидувањето на биолошката активност се врши преку имплементирање на физичко-хемиските особини на потенцијалната лековита супстанца како што се: растворливоста во вода, партициониот коефициент, електронските и стереохемиските параметри кои ја опишуваат молекулата. Log (BR) = a (физичкохемиски карактеристики)+c Log (BR) = дефиниран фармаколошки одговор (изразен во милимоли) а=нагиб на отсечката с= одсечок на Y отсечката (интерсепт) За да се разбере активноста на лековите во биолошките системи, потребно е познавање на хемиските особини, бидејќи само на тој начин може да се дефинираат: -
Транспортот
-
Дистрибуцијата на лекот во биолошкиот мултикомпартментен систем
-
Неговиот афинитет кон комплементарно-структурен рецептор
-
Интеракциите меѓу лек-рецептор
Во дизајнирањето на нови лекови основна цел претставува квантифицирањето на ефектите од структурните промени врз дефиниран фармаколошки одговор, што резултира со поставување на хипотеза за однос меѓу хемиската структура и биолошката активност, која служи за предвидување на нови структурни аналози. Физичко-хемиските параметри кои се применуваат во QSAR испитувањата мора да задоволат неколку критериуми: -
Најсоодветно да ги опишува интеракциите помеѓу мала молекула и биолошката околина
-
Вредностите за параметрите да се добиваат од литература
-
Експериментално да се применливи, да се математички пресметливи и да се репродуцибилни во in vitro системи користејќи модел соединеија.
-
Експериментално добиените резултати за параметрите мора да се применливи за истиот параметар и за друго соединение.
-
Да се корелираат меѓу себе.
Кон крајот на 19 век Mayer и Overton го користат партициониот коефициент на молекулата како мерка за нејзината липофилност и го искористуваат ова својство како квантитаивна мерка за предвидување на наркотичната активност на органските 10
молекули. Квантитативните истражувања на електронските ефекти на супституентите се прикажани со Hammett-овата дефиниција-сигма ( -константа за електронски ефект на супституентите. Хаметовата едноставна но исклучиво важна идеја ја развил Taft кој ја дефинирал алифатската константа- константа за електронски ефект и стерична константа Es. Во 1939 година Ferguson успеал да ја најде меѓусебната поврзаност помеѓу поранешните сознанија и ја предложил следната равенка: Ci=kAim Ci- концентрација на соединеие кое е потребно да даде биолошки одговор Ai – физичко-хемиски или структурен параметар на испитуваното соединени k.m- константи кои се однесуваат на испитуваната група на соединенија. Со развојот на компјутерската технологија во 60-тите години овозможија брз развој на QSAR. Во 1964 година се прикажани Hansch-овиот LEF (linear free energy), модел на линеарна слободна енергија и Free-Wilson-овиот модел. Поставувањето на овие математички модели за влијанието на различни физичко-хемиски особини на молекулите врз нивната биолошка активност, претстава почеток на квантитативни анализи за зависноста меѓу хемиската структура и биолошката активност на лековитите супстанции.
Hansch-ов модел Овој модел се состои од : -физичко-хемиски аспекти за транспорт на лекот и дистрибуција од местото на апликација до местото на делување - интеракции кои се јавуваат меѓу лек и рецептор Во група на лекови кои имаат аналогна структура и делуваат со ист механизам, најважни се следниве параметри: -
Липофилната константа
-
Хаметовата сигма константа(
-
Стерички ефекти Es
Липофилноста (распределбата на соединенијата меѓу водената и неводената фаза) претставува физичко-хемиска особина игра голема улога во QSAR анализите поради нејзината зависност од растворливоста во водена фаза, пенетрација низ клеточните мембрани и уделот на ентропијата при врзувањето за рецепторот.
11
-
Липофилната константа се базира на партициониот коефициент. Партициониот коефициент покажува адитивно-констутивнии особини што значи дека липофилноста на одредено соединение може да се пресмета преку собирање на липофилните удели од неговите констутивни групи, супституенти или фрагменти, тргнувајќи од фактот дека овие удели се константни односно независни од молекулата на која припаѓаат logPx - logPh x-субституент P-n-октанол/вода партиционен коефициент Преку познавањето на P вредностите за за референтните супстанции и вредностите на субституентите, овозможено е предвидување на хидрофобноста на нови молекули. Позитивни вредности за зголемува растворливоста во неполарни растворувачи, а негативни вредности дека растворливоста се зголемува во поларни растворувачи. Често имаме зголемување на биолошкото дејство кога водородот, метилната група или халоген е заменет со трифлуорометилна група што е резултат на значителен придонес на оваа група за зголемен липофилен карактер. Имено. Флуоро супституираните групи поседуваат силен липофилен карактер, что се гледа при нивно споредување со водородните- супституирани аналози: CF3> CH3;
-
SCF3>SCF3; OCF3> OCH3
Хаметовата константа на супституентот ( ), константа која го изразува електронскиот карактер на субституентот. Хаметовата корелација го изразува квантитативниот однос помеѓу хемиската реактивност и електрон-донорската или акцепторска природа на субституентот. Субституентите кои привлекуваат електрони (-COOH, -NO2) имаат позитивна ( ) вредност и обратно, супституентите кои даваат електрони (-OH, -OCH3, -NH2, CH3) имаат негативна вредност.
-
Тафт го вовел поимот стерички ефект Es каде за прв пат се воведуваат стереохемиските влијанија на молекулата во односот помеѓу структурата и биолошката активност. Односот меѓу ) и Es константите на супституентите Ханш ги прикажал со следната равенка: Log (1/C) = -a b
c Es +d
Log (1/C)-релативна активност на аналозите C-концентрација на адекватниот аналог кој предизвикува стандарден биолошки одговор 12
-липофилна константа карактеристична за адекватниот структурен аналог -константа на брзина на хемиска реакција која настанува на местото на делување
Es-Taft-ов стетричен параметар a, b, c, d- коефициенти кои се карактеристични за испитуваната група на соединенија, а кои се одредуваат со повеќекратна регресиона анализа Hansch и Fujita тргнале од претпоставката дека биолошкиот одговор на лекот во организмот зависи од патот на лекот во организмот, вклучувајќи три степени кои лекот мора да ги помине до местото на делување. Тоа се апсорпција, транспорт и врзување за рецепторот. Овие три степени во голема мера зависат од липосолубилноста на лекот- доколку лекот е полипосолубилен поголема е веројатноста да стигне до местото на делување. Оваа теорија ја претставиле со равенката: d (биолошки одговор)/dt = A x C x Kx A- Веројатност дека лекот ќе стигне до местото на делување по одреден период С- моларна концентрација на соединеието кое се испитува Кх- константа на рамнотежа на реакцијата одговорна за делувањето Веројатноста А дека некој лек успешно ќе ги помине трите степени, авторите ја дефинирале како logP (логоритам од коефициентот на распределба) за систем nоктанол/вода(пуфер) logP= logCo/logCw Co-конценрација на лекот во органската фаза (n-октанол) Cw- концентарција на лекот во водената фаза Промената на факторите на веројатност во серија на структурните аналози ја дефинирале со липофилната константа на субституентите logPx-logPh липофилна константа на супституент Px- партиционен коефициент на супституирано соединеие Ph- партиционен коефициент на несупституирано соединение Под претпоставка дека Po е оптимален партиционен коефициент, а партиционите коефициенти околу оптималниот се нормално распределени според Gauss-овата крива на распределба, веројатноста А може да се изрази: 13
A=f ( ) = a x e-(
)2/b
Ако оваа равенка ја замениме во равенката d(биолошки одговор)/dt=A x C x Kx добиваме: d (биолошки одговор) / dt= a x e-
)2/b
x C x Kx
Ако аплицираната доза С предизвикува стандарден биолошки одговор тогаш d(биолошки одговор)/dt може да се замени со константа. Со логоритмирање на последната равенка се добива: Log (1/C) = -k
2
+ k’
- k’’
+ log kx + k’’’
Хаметовата константа ( ) за електронски карактер на супституентите е дефинирана со изразот logKx / Kh= Со замена во равенката добиваме Log (1/C) = -k
2
+ k’
- k’’
+
+ k’’’
Бидејќи претставува идеална вредност за супституентот, значи дека сумата на промана на слободната енергија е минимална, па равенката може да се редуцира на: Log (1/C) = -k
2
+ k’ +
+ k’’
Оваа равенка претставува општа равенка на Ханшовиот модел,според која зависноста на log(1/C) од logP параболична. Во наједноставни случаи каде поголемо од , а последната равенка може да се редуцира:
е многу мала или еднаква на нула
Log (1/C) = a + b и во овој случај биолошката активност е линеарно зависна од log P и Иако на почетокот од развојот на овој модел се претпоставувало дека биолошката активност е линеарно зависна од logP, испитувањата покажале дека односот е линеарен до одредена вредност на logP во серија на структурни аналози, а после тоа настанува прекин, што значи дека одредени членови од хомологниот низ не покажуваат активност иако имаат поголем logP. Фергусон прв дал логично објаснување на тој феномен. Тоа го објаснил со фактот дека повисоките членови од хомологната низа стануваат нерастворливи во дадениот систем, што резултира со недоволно висока концентрација на тоа соединение за постигнување на стандарден биолошки одговор.
14
Ханш дал друго објаснување за параболниот однос на log(1/C) и logP. 1. Ако партициониот коефициент се дефинира како однос меѓу концентрацијата на соединението во липидната и водената фаза, и ако се претпостави дека за некое соедиение е нула, тогаш соедиенението е нерастворливо во липидната фаза, нема да ја помине липидната мембрана и нема да дојде до местото на делување, со што ќе изостне биолошкиот одговор. 2. Наспроти ова ако партициониот одговор ако партициониот коефициент се приближува кон неограничени вредности, соединението ќе биде нерастворливо во водената фаза и ќе следи негова локализација во масните ткива. Некаде помеѓу овие крајности се наоѓа оптималната вредност за партициониот коефициент (Po). Лекот кој поседува оптимален партиционен коефициент ќе биде најмалку инхибиран на својот пат кон липидо-водените фази на клеточните мембрани. Затоа односот меѓу log(1/C) и logP, најдобро е опишан со парабола.
Log biologic response versus log partition coefficient usina linear. oarabolic. and bilinear models.
Можни причини за нелинарна липофилност-биолошка активност врска -
Кинетика во транспортот на лекот во биолошкиот систем
-
Рамнотежните состојби при дистрибуцијата на лекот
-
Стерни пречки а алостерни ефекти 15
-
Различна фармакокинетика и/или метаболизам
-
Растворливост, формирање на мицели
-
Инхибиција на крајниот продукт на ензимите
-
Лек-рецептор фитување.
Пример за употребата на Ханшовиот модел е споредувањето на антибактериската активност на хлормицетин каде R=NO2 и неговите аналози каде се менува нитро групата. Компарирајќи ја антибактериската активност на голем број на аналози на хлоромицетинот и пресметаните антибактериски активности со Ханшовиот модел, покажуваат одлична корелација. Од овие податоци може да се заклучи дека силната електрон-акцепторска нитро група ( NO2= +0,71) и умерената липофилна константа ( NO2=+0,06)покажаа најголема активност. Free-Wilson-ов модел (модел на адитивност)-1964 Во овој QSAR модел вредноста 1 укажува присуство на определен супституент или структурна карактеристика додека вредност 0 укажува на неговото отсуство. Тие се во корелација со биолошката активност преку повеќекратна регресиона нализа, На почетокот овој модел не користел референтна супстанција и се работело со т.н. симетрски равенки за да се избегне проблемот на линеарна зависност меѓу варијаблите. Од таа причина денес се применува модифицирана форма на овој модел од страна на Fujita и Ban, која ја олеснува примената на регресионата анализа. Лесно може да се инкорпорира или отфрли било кој супстанца при што не се менуваат позначително вредностите на другите регресиони коефициенти. Log1/C= aij +
16
ai,j- уделот кој го има субституентот I во позиција j вредност на биолошката активност на референтното соединение. Free-Wilson-овиот модел лесно се применува, особено во раната фаза на QSAR испитувањата, нуди едноставен начин за изведување на супстанции и разгледување на нивната можна зависност од физичко-хемиските својства. Предности и недостатоци a) Free Wilson –ов модел + лесно се изведува, најчесто дава единствени решенија + јасно дефинирање на ефектите на супституентите + се надополнува на Hansch-овиот модел - потребна е структурна варијација во најмалку две позиции - многу параметри, само неколку степени на слобода - ограничен QSAR модел, не може да изврши предвидување за супституенти надвор од анализата - ограничен на линеарни адитивни односи b) Hansch-ов модел + ги корелира биолошката активност со физичко-хемиските карактеристики + за почетна анализа потребно е познавање на биолошката активност на мал број на структурни аналози + можно предвидување на супституенти надвор од анализата - применлив само во унифицирани серии - најдобри резултати со единечна варијација на ароматични супституенти - се донесуба самои на 2D структури - не дава единествени решенија - ризик од грешно корелирање - Потребно е знаење на нумерички вредности на физичко-хемиските параметри - Преслетувањето на физичко-хемиските параметри не се доволно прецизни. Виртуелен скрининг- 3D QSAR концепти и можности Виртуелниот скрининг e 3D QSAR пристап кои се применува при одредување на пофокусиран примерок на соединенија за иницијален скрининг за новиот таргет за HTS со употреба на високо ефикасна компјутерски анализи на бази на податоци на хемиски соединенија и претставува технологија која ги применува најновите достигнувања во хемиската синтеза и биолошките тестови. Со тоа се издвојуваат приоритетни соединенија за синтеза и тестирање. Секако, оваа стратегија покажува дека информацијата е достапна поради знаењето на местото за врзување на рецепторот и структурата на лигандот и се верува дека нивната интеракција е релност. Виртуелниот скрининг бара знаење за критериумите за геометријата на врзувачкото место, лек-рецептор интеракции, молекулска сличност или 17
биоизостерични замени на функционалните групи. Овие информации потоа се користат за предвидување на активноста .
Со Виртуелниот скрининг се сумираат бројни компјутерски пресметки од наједноставни до најсложени и се добиваат најразлични типови на информации кои даваат објаснување за рецепторот.
Основата на пребарувањето во виртуелниот скрининг се конформационите анализи кои се засновани на одредување на меѓусебните растојанија и торзионите агли на лигандот и врзувачкото место на протеинот. Со минимизирање на енергијата се одредува нивната најдобра поставеност за воспоставување на меѓусебни интеракции кои најчесто се од нековалентен тип.
18
Оваа техника може да се користи за да се добие многу фокусиран под-сет на соединенија (на пример ако не интересираат само соединеија кои се структурни аналози на leading compound) или многу поопширен сет на соединија (ограничување само од аспект на големината на лигандот или молекулската тежина). Пристапот зависи од конкретниот проект кој се работи. На пример доколку некој HTS е веќе во развојна фаза и проблемот кој се јавува е кој сет од 100 000 соединенија од database од еден милион треба да биде прв испитуван се работи на првиот начин. Основните филтри кои се користат при virtual screening (во однос на зголемување на софистицираноста) може да се сумираат како: -
Селекција на бази од 2D профил на карактеристики
-
Селекција врз основа на таргет-специфични pharmacophore
-
Селекција врз база на подетално 3D моделирање: пример рецепторлиганд molecular docking.
Селекција на база на 2D профил на карактеристики. Без разлика дали некоја корисна информација е достапна за да се опише рецепторот или познатиот лиганд, секогаш е неопходно да се ограничи HTS на “drug like” соединеија. Со тоа се ограничуваме на структурни карактеристики кои се генерално неопходни во различните фази на оптимизација на лекот како што се стабилност, растворливост и липофилност кои влијаат на абсорпцијата и екскрецијата на лекот. Овие карактеристики воопшто не зависат од 3D структурните карактеристики на лигандот. Трендот во фармацевтската индустрија е фармакокинетскиот и токсиколошкиот профил на соединението да биде откриен уште во раните фази на процесот на откривање на лекот. Затоа е корисно да се воведат некои од овие концепти во фазата на virtual screening. 19
Правилото на Липински односно “правило на пет” е добро познато правило со кое се објаснува профилот на орално биорасположливо соединеие, кое се базира на класификација на лимит на молекулска маса, липофилност (според партициониот коефициент logP) и хидрофилноста (пресметување на бројот на водородните донори и акцептори). Овие карактеристики може да бидат пресметани брзо и може лесно да се применат за да се окарактеризираат големите database. Овие филтрирања може да се применат на специфични хемиски структури, на пр.оние кои се поврзани со проблеми во хемиската растворливост или токсичност. Во натамошните фази на овој пристап, има примери каде е можно да се дефинираат 2D карактеристиките за кои се верува дека се битни за селекција на интеракција со даден рецептор. На пример, селекцијата за соединенија соодветни за анализата како естроген рецептор агонисти може да се направи врз основа на молекулската маса и липофилноста која треба да биде нешто повисока од другите drug-like соединенија со што некогаш драстично се намалува бројот на соединенијата од сетот за скрининг. Селекција врз база на таргет-специфичен фрамакофор Фармакофор Фармакофор е поедноставен 3D опис на клучните структурни карактеристики на сет од познати лиганди или на таргет рецептор. Toa е групација на стерни и електронски карактеристики кои се неопходни за да се обезбедат оптимални интеракции со специфичен биолошки таргет и да се предизвика (или да се блокира) биолошкиот одговор. Фармакофорот не претставува вистинска молекула или вистинска асоцијација на функционални групи, туку е апстрактен концепт кој ги дава вообичаените молкулски интеракции на група на соединенија со нивна таргет структура. Фармакофорот може да се дефинира како деноминатор кој е заеднички за цел сет на активни молекули кон даден таргет. Структурните катактеристики обично се опишуваат врз основа на фармакофорните дескриптори: водородните донори и водородните акцептори, липофилните центри, циклични структури и други сепарирани врз основа на растојанија. Обично мал број на такви делови се дефинирани од 2 до 5. На пример, класичните тромбински инхибитори се карактеризираат со катјонски центар (врзување со еден дел од рецепторот) 9-11 ангстреми оддалечен од липофилен центар (друг дел од рецепторот). Сите АКЕ инхибитори имаат три клучни акцепторски места на соодветно меѓусебно растојание и геометриска поставеност.Фармакофорите се користат за пребарување на базите со податоци на хемиски структури. Овие структури неопходно е да поседуваат 3D модели, и конформациска флексибилност за истите да не бидат отфрлени поради тривијална причина како на пример отсуство на дадениот конформер во базата на податоци.
20
Пребарувањето спроведено врз основа на фармакофорната 3D структура може да биде брзо спроведено во големи бази на податоци. Често се случува фармакофорите со три или четири клучни позиции да бидат пререстриктивни и да резултира пребарувањето само со откривање на неколку hits. Рнгирањето на hits, е според сличноста со иницијалниот лиганд. Затоа со фармакофорното пребарувањето се добиваат решенија слични на оние кои се веќе познати, а не лимитиран сет на нови решенија. Селекција врз основа на рецептор-лиганд молекуларен докинг. Следниот чекор по фармакофорното испитувањето е докингот на базите со соединија во биолошкиот таргет од интерес. Овој стадиум вклучува докинг на секое соединение (или како ригидно или како конформациски флексибилно) во модел на рецептор кој може да биде третиран како ригиден или како лимитирано флексибилен. Пределот на очекувано врзување е претходно дефиниран. Оваа стартегија на виртуелен скриниг бара постоење 3D база на лиганди, 3D структура на таргет рецепторот и точна функција за рангирање на резултатите од докингот. Докинг стратегијата е фокусирана на објаснување на интеракциите на лиганд-рецептор и дава објаснување на најверојатниот начин на врзување на лигандот за рецепторот. Со тоа се добива информација кои лиганди се корисни кандидати за синтеза и тестирање. Овој пристап дава најдетална компјутерска идентификација на рецептор-фокусиран подсет на соединенија соодветнинзан за HTS . Употребата на фокусиран сет врз база на 2D карактерниот профил и 3D фармакофорниот карактерен профил може да го намали диверзитетот на сетот на соединенија затоа што е дефиниран од карактеристиките на познати лиганди. Споротивно на ова програмот за молекуларен докинг може да испита цела база со соединија со минимално префилтрирање (пр. елиминирање на нестабилни и токсични радикали) па финалната селекција се базира на квалитетот на докинг моделите, а не на субјективно мислење за тоа кои карактеристики се очекуваат од лигандот. Овој начин е многу битен за откривање на структурни нови лиганди, кои може да дадат интеракции со рецепторот слични со 21
познатите лиганди или може да постигнат различни интеракции во други активни врзувачки места. Практично објаснување на докинг. Голем број на комплекси на протеинските рецептори врзани со лиганди (агонисти, антагонисти..) се добиени со помош на со крсталографија со Х зраци. Со тоа 3D структура на овие комплекси е широко достапна и може да бидат преземена од PDB (protein data bank) достапна на интернет.
PDB file на водечкото соединие ATPO врзана за активното место на GluR2 рецепторот Проблеми на PDB протеинска 3D структура и компјутерска подготовка на протеинот за docking Геометријата на врзувачкото место може да е различна во слободна и во врзана форма Недостаток на водородни атоми и ориентација на хидроксилни групи Протонизација на киселите и базните резидуи Аминокиселинските вредности за pKa се менуваат His: рамнотежа по протонизација
Нема диференцијација меѓу C,O и N Рамнотежа на ротамерите на: his, thr, asn, gln
22
Kристалографската сруктура бара минимални поправки пред докинг: додавање на водородни атоми и поправки во геометријата на резидуите кои го формираат врзувачкото место, на пр. резидуи кои се на 15 ангстреми одалечени од лигандот. Структурните поправки на рецепторот се прават со комерцијалните софтвери 2D и 3D конверзии во базите на податоци. Филтрирање и подготовка на групата на лиганди која се испитува пред docking: Префилтрирање на базите на податоци -
Протонизирање на киселини и бази како што е пропишано на физиолошка pH
-
Пресметување на физичко-хемиските карактеристики (физичкохемиски карактеристики, log P, одредување на водородни врски, флексибилност, одредување на хирални центри)
-
Отсранување на неоргански соединенија
-
Отстранување на соединенија кои имаат non-drug карактеристики: молекулска маса <200 или >600, пресметаниот logP>7, број на донори на водородни врски >8 или акцептори >8.
2D филтри
Претварање во 3D : -
Еден конформер по молекула плус дополнителни енантиомери за недефинирани хирални центри.
Физичкохемиските карактеристики беа дефинирани за да се отстранат соединенијата кои се наоѓаат на границите на екстрамност. По избор на тест на соединенија за испитување со дозволен диверзитет и подготовката на протеинот се спроведува докинг на флексибилни лиганди во ригиден рецептор модел. Со тоа се овозможува конформациска флексибилност на лигадот во ригиден рецептор каде нема подвижност на страничните низови од резидуите во активното место. Се воспоставуваат правила за ориентација на лигандот во врзивното место за суперпозиција на молекулите со употреба на пр. со "active analog approach". Се поставува молекулата според фармакофорните карактеристики и карактеристиките на активната површина на рецепторот. Вметнување на молекулите во box и генерирање на grid кој опфаќа само 10 ангстреми околу активниот дел од протеинот кој стапува во интеракција со активниот лиганд.
23
Се предвидуваат можнате интеракција на молекулите со активниот дел од протеинот. Се пресметуваат енергиите на интеракција меѓу различни атомски групации или функционални групи и активниот дел на протеинот на еквидистантно дистрибуирани grid точки. Параметрите за јачина на врските како van der Waals и електростатските сили, хидрофилните и хидрофобните карактеристики на врзувачкото место се земаат во предвид како и базичните концепти на флексибилност на страничните низови од протеинот. Тие се користат за анализа на врзувачките места како и за оптимизација на водечкото соединие. Со спроведувањето на докинг се врши компјутерска анализа на голем број на потенцијални докинг конформери и ориентации за секој лиганд и рангирање и процена на точниот начин на врзување со што се добиваат релавантни резултати за врзувачкиот афинитет. Вообичаено 105 до 106 движења треба да бидат извршени и на лигандот и на активниот дел од рецепторот за да се добие глобалнот минимум на интеракциите што претставува многу комплициран процес. Овој процес се повторува неколку пати од случајна почетна точка на лигандот. 3D моделите даваат најрепрезенативна и детална база за детерминирање кои молекули се способни за фитување во многу строго ограничени структурни константи на врзувачката страна на рецепторот. По завршување на сите пресметки се добиваат резултатите од докингот во вид на предлог и тоа со 3D анимација на врзувањето и табеларна пресметка на интеракцијата. Најчесто се нудат 10 солуции за можен начин на интеракција, а рангирањето и проценката за реалноста на тие интеракции се врши преку предвидувањето на слободната енергија на врзување. Понегативна енергија предвидува поверојатна врзувачка интеракција. Пресметувањето на слободната 24
енергија е базирано на евалуирање на силата на лиганд-рецептор интаракциите односно, геометријата на водородните врски, липофилните контакти, врзувањата со металните јони, заедно со ентропијата со која се опишува оневозможувањето на конформациската флексибилност на лигандот при врзувањето за рецепторот. Таа енергија не е само способна да ги оддели познатите лиганди од случајните соединенија за даден рецептор туку е исто способна да даде индикација за селективност на рецепторот. Оваа карактеристика е многу битна за дизајн на лекови, каде токсичноста на лекот може да биде резултат на врзувањето на лигандот за бројни структурнослични рецептори. Врзувачко место на GluR2-ATPO (антагонист)
Интеракции на ATPO-GluR2 3D моделите се многу битен извор на информации за разбирање на природата на врзувањето на лигандот за даден рецептор и извор на инспирација за дизајн на нови аналози и нови лиганди.
25
Phenylalanine-ATPO” пристап во синтеза на нови селективни антагонисти за GluR -рецепторите
Врз основа на изостерна замена на изоксазолното јадро на рефернтната супстанца ATPO е синетизирана група на 100 различни лиганди со различни радикали во позиција 4,5и 6. При тоа беше направена изостерна замена и на фосфорната група со пропил карбоксилна. Еден од лигандите кој покажа афинитет кон GluR2 рецепторот беше и EL-7. EL-7 лиганд како потенцијален селективен антагонист HOOC
COOH
H2N
Cl
NO2
Резултати добиени од докин на EL-7 лигандот за активниот дел на GluR2 во споредба со референтната супстанца ATPO
По спроведување на докинг и компјутерска аналлиза за врзувањето на овој лиганд беа добиени десет различни конформерни поставености на истиот во активното место на рецепторот. Најдобрите две конформации кои беа и најдобро рангирани според слободната енергија на интеракции се претставени на сликите погоре. Се забележува 26
дека пропилкарбоксилната група е добра замена за фосфорната група и ги дава истите интеракции како и референтната супстанца ATPО. Потоа фенилното јадро претставува добра замена за изоксазолното јадро и игра улога на спејсер во врзувачкото место. Нитро групата има добра ориентација кон тирозинската хидроксилна група и се очекува дека ќе биде возможна директна интеркција со неа поради растојание од само 2,52 А кое е соодветно за водородна врска.Поради сите овие факти откриени од резултатите од docking, EL-7 соединението беше воведено во фаза на протеинска кристализација.
Техника на кристализација на лиганди со протеин
Кристална структура на EL-7 со GluR2
После успешната кристалографија на лигандот EL-7 со GluR2 рецепторот и добивањето на кристалот се врши детерминирање на структурата и интеракциите меѓу лигандот и рецепторот со помош на X-ray. Поставеност на EL-7 лигандот со активното место на GluR2 :
1) во кристлот
2) Според докинг резултатите
27
Потенцијалните проблеми врзани со молекуларниот докинг како стратегија на виртуелен скрининг се: -квалитетот на докинг резултатите и техничката соодветност за спроведување на испитување на големи бази на податоци. Се поставува прашање за точноста на предвидениот начин на врзување и енергиите особено кога се употребуваат брзи docking протоколи за да се испитаат големи сетови од соединенија: дали методите се соодветни за идентификување на вистински hits и за отфрлање на неактивните соединенија? Иако секоја HTS техника мора да жртвува дел од точноста, нема доволно искуство со различни пакети за докинг за да се даде сигурност дали тие се доволно точни за да изведат реално фокусирање во базата со податоци. Целта на docking е да се изведе еден подсет на соединенија (1-10% од базата со податоци) кои ќе содржат поголем број на hits отколку сет избран случајно. За virtual screening да биде корисна алатка која се надополнува на HTS, треба да биде способна да процесира сетови од најмалку милион соединенија. (Оваа количина претставува груба бројка на комерцијалнои достапни drug-like соединенија или историска колекција на фармацевтските компании и бројни потенцијално достапни поради комбинаторните хемиски синтези). Еден од основните проблеми претсавува прашањето: Која конформација е биолошки активна конформација? -конформацијата добиена со виртуелен скрининг (in vacuo) -конформацијата во кристалот -конформацијата во водениот раствор -конформацијата на врзувачкото место 3D QSAR + ја зема во предвид 3D структурата на лигандите + применлив на похетерогени сетови од податоци + електростатски, стерни, хидрофобни и хидрофилни полиња за хемиски интеракции + 3Dграфички решенија за можни и неможни интеракции - недоволна сигурност за биоактивната конформација - несигурност за различните начини за врзување за лигандите - ризик за случајна поврзаност межу структурата и активноста - применлив само за in vitro податоци Сепак 3D QSAR-от претставува најсовремена алатка во процесот на добирање на фокусиран подсет на соединеија кои ќе бидат вклучени во HTS и овозможуав значително скратување на времето за добивање и оптимизација на водечкото соединие.
28
Хемгеномски пристап во третман на хронична миелоцитдна леукемија
Со откривањето на хуманиот геном е овозможен се откриени 600-1500 гени кои може да бидат причина за одредено заболување и тие претставуваат таргети за синтеза на нови лекови. Цел: да се открие активен и/или селективен лиганд за биолошки таргет на систематски начин, скрининг на постоечка библиотека на соединенија кон таргет фамилија на рецептори(GPCRs, интегрини, нуклениски рецептори, протеин кинази, проеази, фосфатази итн.) Принцип: скрининг на сите можни соединенија кон сите можни таргети (хемиски свет насочен кон светот на таргети) Реалност: скрининг на класи на соединија, таргетирани или фокусирани библиотеки насочени кон класи на таргетирани фамилии на протеини (рецептори).
29
Таргетирани фамилии: GPCRs, интегрини, нуклениски рецептори,проеази, фосфатази, тирозин и серин/треонин протеин кинази, металопротеази, серин протеази итн. Кај 90% од пациентите кои се заболени од хронична миелоцидна леукемија е забележана транслокација меѓу хромозомите 9 и 22 како резултат на што се добива 22-филаделфија хромозом каде се наоѓа хибридор на bcr-abl генот. Последица на оваа транслокација е значително зголемената тирозин протеин киназа активност.
Третман на хронична миелоцидна анемија STI 571 (Imatinib, Glivec, Novartis)
PKC-protein kinase C Системски пристап во развојот на Imatinib лек против хроничната миелоцодна леукемија
30