HÜKÖK Dergi Sayı: 1 by Yener Caliskaner

mayıs 2012

sayı 1 Hacettepe Üniversitesi Kök Hücre Öğrenci Topluluğu Dergisi

hükök

dergi

Kök Hücre

Biyolojisi Reprogramming Kök Hücreler ve

Epigenetik i izler Transdiferansiyasyon Klinikte Kök Hücre Kök Hücre Etiği Röportajlar

Hacettepe Üniversitesi Kök Hücre

Öğrenci Topluluğu Dergisi

Mayıs 2012 Sayısı

Editörler

Barış Boyraz Mehmet Yener Çalışkaner

Kapak Tasarımı

Natali Miletli

Grafik&Dizgi

Mehmet Yener Çalışkaner

Yazarlar

Rıza Mert Çetik Oğuzhan Duvar Betül Kubat Betül İçli Elif Haznedaroğlu Ece Hocaoğlu Cansu Ayvacıoğlu Tolga Bacak İrem Ozarlı Yusuf Yıldırım Sena Bocutcu Ceyda Acılıoğlu Çağrı Küçükkayıkçı Yener Çalışkaner Görkem Yavaş Tuna Üstünkaya Ömer Uludağ Armağan Keskin Ceren Yağmur Elif Reyhan Güneş Elvan Açıkgöz Oğuzhan Serin Ayşe Zehra Karadere Ülke Kocademir Damla Erimhan Fatma Yaman Berşan Özcan Barış Boyraz Güldehan Nuğral Gökhan Uruk Fatma Deniz Selda Karaaslan Merve Yılmaz Merve Cansu Kaya

hükök

dergi

mayıs 2012 1

içindekiler Hematopoetik Kök Hücreler ve Niş Kavramı

Rıza Mert Çetik

Kök Hücreye Genel Bakış

Betül İçli

Farklılaşma Yeteneklerine Göre Kök Hücreler

Oğuzhan Duvar

Kökenlerine Göre Kök Hücreler

Betül Kubat

Nükleer Yeniden Programlamaya Genel Bakış ve Yamanaka'dan Önce Yeniden Programlama

Cansu Ayvacıoğlu

Yamanaka'nın Hayatı ve Yeniden Programlama

Elif Haznedaroğlu

Yeniden Programlamanın Işığındaki Gelişmeler

Ece Hocaoğlu

iPS Hücre Eldesinde Daha Etkili Bir Yöntem: RiPS Hücreleri

Tolga Bacak

mikroRNA Tarihçesi, Moleküler Özellikleri ve RNA İnterferansi

İrem Ozarlı

iPSC Üretiminde Alternatif ve Yüksek Verimli Bir Yöntem: miRNA Kullanımı

Yusuf Yıldırım

Epigenetik ve Kök Hücre

Sena Bocutcu

iPS Hücrelerin Epigenetiği

Ceyda Acılıoğlu

Bir Method Olarak: Optogenetik

Tuna Üstünkaya

Extreme Makeover: Converting One Cell into Another

Çağrı Küçükkayıkçı Mehmet Yener Çalışkaner

3 Faktör Ne Yapabilir? Cevap: Sinir Hücresi

Mehmet Yener Çalışkaner

İndüklenmiş Sinir Hücreleri

Ömer Uludağ

Yetişkin Pankreatik Ekzokrin Hücrelerinin In Vivo Ortamda β Hücrelerine Yeniden Programlanması

Armağan Keskin

Dırect Conversıon Of Human Fıbroblast To Multilineage Blood Progenitors

Ceren Yağmur Doğru

Kök Hücreler ve Kardiyak Onarım

Oğuzhan Serin

Multipl Skleroz ve Kök Hücre Tedavisi

Görkem Yavaş

2 mayıs 2012

Doku Mühendisliği ve Hücre Bazlı Terapiler; Benchten Kliniğe: Yedekleme, Onarım Ve Rejenerasyon Potansiyeli

Ayşe Zehra Karadere

Kök Hücre, Kanser ve Kanser Kök Hücreleri

Damla Erimhan, Ülke Kocademir, Merve Cansu Kaya

106

Kök Hücre Etiği

Elif Reyhan Güneş

121

Ayşen Günel Özcan Röportajı

Yusuf Yıldırım, Betül İçli

124

mayıs 2012 3

4 may覺s 2012

hükök Hepinize merhaba! HÜKÖK'le 15.03.2011'de tanıştım. Tıp Bayramı'nda yazlıktan arkadaşım Emir Charles Roach ile fakültede karşılaştım, bana heyecanla bazı fikirleri olduğunu ve beni yakın zamanda arayacağını söyledi. Gerçekten de hızlıydı, ertesi gün telefonda bana kız arkadaşı Gamze Gezgen'le (şimdi nişanlılar, tebrikler!) Hacettepe Üniversitesi Kök Hücre Öğrenci Topluluğu adı altında bir kulüp başlattıklarını ve bu kulüpte aktif olup olmak istemeyeceğimi sordu. Açıkçası başta çekindim, önceki kulüp deneyimlerim pek keyifli değildi ve bunlara bir yenisini daha eklemek istemiyordum. Öte yandan, Emir çok değer verdiğim bir ağabeyimdi ve beni çok da sıkıntılı bir şeyin içine sokmayacağını düşünerek kabul ettim. Şimdi baktığımda herhalde üniversite hayatımda şu ana kadar verdiğim en doğru kararlardan biriydi, iyi ki Emir'in aklına gelmişim. HÜKÖK, tamamen amatör bir ruhla çok önemli bir şey başardı bence. 'Önem' kelimesinin altında şimdilik büyük bir araştırma projesi ya da uluslararası bir çalışma yatmıyor ama bu kulübü değerli kılan tıp öğrencileri arasında modern biyolojik kavramların konuşulabileceği bir ortam yaratması. Sene boyunca düzenlediğimiz ve devam ettiğimiz makale saatleri, oluşturulan bu öğrenci ağı ve ,eğer ki her şey yolunda giderse, kongremizde elinizde tuttuğunuz bu dergi bence ilk sene için 'önem' kelimesinin altını yeterince dolduruyor. Kök hücre biyolojisi, hala çok temel kavramlar üzerinden ilerleyen ve insanları fazlasıyla düşünmeye iten bir alan. Bu alandaki çalışmaları okurken ben, beynimin büyüdüğünü hissediyorum. Biyoloji tarihindeki bir alanın çok temel düşünceler üzerinden gelişmesini gözlemlemek bence büyük bir şans, bir de böyle tıp öğrencileriyle oluşturulmuş bir ağ olarak herhalde biz bu keyfi birkaç katına çıkarıyoruz. Umarım bundan sonraki senelerde de HÜKÖK gerek fakülte içinde gerekse başka ortamlarda popüler bir kulüp olur ve bizim oluşturduğumuz bu keyifli ağa birçok insan daha dahil olur. Sene boyunca bizle birlikte çalışan ve bize destek olan tüm hocalarıma ve arkadaşlarıma teşekkür ederim.

Başta Yener Çalışkaner olmak üzere bu dergide emeği geçen herkes adına, Barış Boyraz mayıs 2012 5

hükök

DERLEME Hematopoetik Kök Hücreler ve Niş Kavramı Rıza Mert Çetik Kemik iliği, insan vücudunda hücre bölünmesi ve sayısal artışın en yoğun olarak gerçekleştiği organlardan birisidir. Bu durum bize, kemik iliğindeki kök hücrelerin önemi üzerine bir fikir verebilir. Esas görevi hematopoez (kan hücresi üretimi) olan bu organ, barındırdığı kök hücrelerin henüz sadece bir kısmı aydınlatılabilmiş olan inanılmaz çeşitlilikteki fonksiyonları sayesinde, organizmanın tüm sistemlerine katkıda bulunmaktadır. Hematopoetik kök hücrelerin evi olarak nitelendirebileceğimiz bir mikro çevre olan “niş” ise, kemik iliğindeki hücrelerin fonksiyonlarının ve patolojilerinin anlaşılması yolunda mutlaka incelenmesi gereken bir konudur. Bu yazıda kemik iliğindeki hematopoetik kök hücreler, niş kavramı ve niş içerisinde bulunan diğer hücre türleri anlatılacaktır. Hematopoetik Kök Hücreler:

ematopoetik kök hücreler, kısaca kanın hücresel elemanlarını oluşturmaktan sorumlu hücreler olarak tanımlanabilir. Her 10,000-15,000 kemik iliği hücresi ve her kan 100,000 kan hücresi içerisinden birinin hematopoietik kök hücre (HKH) olduğu düşünülmektedir. HKH'ler, asimetrik bölünme geçirerek (bölünme sonucunda bir projenitör hücre bir de kök hücre oluşur) bir yandan HKH havuzunun devamlılığını sağlayarak bir yandan da kan hücresi üretimini devam ettirirler. Hematopoetik kök hücrelerin keşfi, McCulloch ve Till'in farelere radyasyon vererek yaptığı çalışmalara, yani 1960'lara dayanmaktadır (1). Radyasyon verilen farelere yapılan kemik iliği nakli işlemleri sonrasında kan hücrelerin yenilenmesi, kemik iliğinin kök hücreler barındırdığına kanıt olmuştur. HKH'lerin fenotipik özelliklerinin iyi bilinmesi, yapılacak çalışmalara temel oluşturması açısından

6 mayıs 2012

çok önemlidir. İnsan HKH'leri CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38-, c-kit-, lin- olarak tanımlanır (2). Bazı çalışmalar sonucunda kemik iliğinde, CD34- olması açısından diğer HKH'lerden farklı olan küçük bir hücre populasyonu daha ortaya çıkarılmıştır. Bu kök hücreler, “uzun dönem hematopoetik kök hücre” olarak da adlandırılmaktadır. Kan hücresi üretimine fazla katkıları olmadığı, kemik iliğindeki hematopoetik kök hücre populasyonunun devamlılığını sağlamakla görevli olduğu düşünülmektedir. Yukarıda da bahsedildiği üzere insan vücudunda hematopoezden sorumlu olan organ, kemik iliğidir. Fetal dönemde ise kan hücresi üretimi kemik iliğine gelene kadar birçok kez yer değiştirir(3). İlk olarak sarı kesede (yolk sac) başlayan hematopoez işlemi, daha sonra aort-gonad-mezonefroz (AGM) bölgesi, plasenta, fetal karaciğer,timus, dalak ve kemik iliği organlarında farklı zamanlamalarla devam eder(34). Fetal kara-ciğer ile kemik iliği HKH çoğalması ile farklılaşmasını sağlayan temel organlardır. Ancak bu iki bölgeden köken alan HKH'lerin farklı özelliklerde oldukları gösterilmiştir. Karaciğer kökenli olan kök hücreler, kemik iliği HKH'lerinin ak-

derleme

hükök

-sine genellikle dolaşımda bulunur ve simetrik bölünme geçirerek kan hücrelerini oluşturur. HKH'lerin esas kaynağı ve en yoğun bulundukları yer, kemik iliğidir. Birçok hastalığın tedavisinde kullanılan bir yöntem olan “hematopoetik kök hücre transplantasyonu işlemi” için ilk basamak, HKH'lerin eldesidir. Uzun yıllar boyunca kemik iliği aspirasyonu, HKH eldesi için tek yöntem olarak uygulanmışken, HKH'lerin kanda da bulunduğunun gösterilmesi ile periferik kandan aferez ile HKH eldesi yöntemi günümüzde ilk tercih olmuştur. Kök hücrelerin kana geçmesine “mobilizasyon” denir. Periferik kanda bulunan kök hücreler, normal koşullarda çok az sayıdadır (1 / 100,000 hücre oranında). G-CSF gibi bazı mobilize edici ajanların kullanılmasıyla bu oran artırılabilir, ve klinik uygulamalarda aferez ile HKH eldesi öncesinde bu yöntem uygulanmaktadır. G-CSF'in yetersiz olduğu durumlarda adjuvan olarak siklofosfamid ve AMD3100 (CXCR4 antagonisti) gibi maddeler de kullanılmaktadır (detaylı bilgi için bkz: ref. 5-6). Hematopoetik kök hücrelerin kemik iliğindeki aktiviteleri ve hematopoez, insan vücudunda

gerçekleşen bütün olaylar gibi çok sıkı bir şekilde regüle edilmektedir. Sitokinler, bilinen en etkili çevresel regülatörlerdir; fakat her geçen gün HKH üzerine etkili olan yeni faktörler bulunmaktadır ve niş içerisinde HKH'lerin etkileşimde bulundukları her hücre türü, direkt veya indirekt olarak hematopoezi etkilemektedir. G-CSF, GM-CSF ve IC-3 ve diğer bazı sitokinler hücreyi proliferasyona gitmesi yönünde uyarırken; Plt-3 ligand ve kit ligand gibi sitokinler ise HKH'leri apoptozdan korur. CXCL12, diğer bir adıyla Stromal Derived Factor-1 (SDF-1), HKH'lerin regülasyonunda adı en sık geçen kemokinlerden birisidir. HKH'lerin kemik iliğindeki niş bölgelerine yerleşimi, diğer niş elemanları tarafından salgılanan SDF-1'in katkılarıyla gerçekleşmektedir. Aynı zamanda “homing” olayı da (ihtiyaç durumunda kök hücrelerin başka bölgelere göç etmesi) HKH'lerin SDF-1 konsantrasyonunu takip etmesiyle gerçekleşir. Son çalışmaların sonuçları göstermiştir ki, SDF-1 kemik iliğindeki endosteal niş bölgesinde bulunan HKH'lerin dormant halde tutulmasında da da görev yapmaktadır(7-8). Hematopoezin regülasyonunu sağlayan etkileşimlerin biri de Wnt sinyalleriyle sağlanmaktadır. Bu sinyal yolakları, HKH'ler ile diğer niş elemanları arasındaki ilişkinin çok önemli bir boyutunu oluşturur; ve kök hücrelerin nişte yerleşimi ve kendini yenileme potansiyelinin devam ettirilmesinde rol almaktadır. Wnt sinyallerinin Wif1 gibi inhibitör faktörler kullanılarak bloke edilmesiyle yapılan deneylerde, HKH'lerin zamanla tükenme eğilimi gösterdiği tespit edilmiştir(9-10).

(Şekil: Mikkola HKA, Orkin SH (2006) The Journey of Developing Hematopoietic Stem Cells. Development 133: 3733-3744)

mayıs 2012 7

derleme Niş Kavramı:

iş; hematopoetik kök hücrelerin içerisine yerleştiği, kemik iliğinde bulunan, kompleks çok boyutlu bir mikroçevredir(11). HKH'lerin görevlerini yerine getirebilmesi için uygun koşullar “niş”te sağlanmıştır. Niş kavramı sıklıkla hematopoetik kök hücreler için kullanılıyor olsa da, vücutta başka bölgeler de niş olarak adlandırılabilmektedir (bağırsak kök hücre nişi, saç kökü nişi gibi). Niş kavramı ilk olarak 1978 yılında ortaya atılmıştır; fakat daha sonra Drosophila ile yapılan çalışmalara kadar oldukça az ilgi görmüştür(12). Niş, kök hücreleri dış etkilerden korur. Fonksiyonlarını gerçekleştirebilmeleri için gereken fiziksel ortamı ve sinyalleri üretir, entegre eder. Organizmayı, kök hücrelerin sınırsız çoğalma potansiyelinden korur. Gördüğümüz gibi “niş”in hematopoezde son derece hayati bir rolü vardır. Günümüzde nişin yapısını detaylı bir şekilde anlayabilmek ve çeşitli patolojilere açıklama getirebilmek için yürütülen birçok çalışma vardır. “Niş”, tıp dünyasının en gözde konularından birisidir. Fareler üzerinde yapılan en güncel çalışmaların bize sunduğu bilgiler ışığında, memelilerin kemik iliğinde 2 ayrı türde niş bulunduğunu bilmekteyiz. Bunlardan birincisi, kemik trabeküllerinin endosteal yüzeyleri üzerinde yerleşik olan “endosteal nişler”dir. İkinci grup ise, daha merkezi

hükök yerleşimli olan, oldukça fazla damar içeren alanlar olan “perivasküler nişler”dir. Endosteal Niş: Vasküler sinüsoidlerin az bulunduğu, HKH'lerin çoğunlukla dormant halde olduğu nişlerdir. Osteoblastlar, osteomac'lar, mezenkimal kök hücreler (MKH), sempatik sinir uçları, vasküler endotel hücreleri, adipositler ve kondrositler bu nişin elemanlarıdır. Hücresel elemanların çokluğu, niş yapısının ne kadar kompleks olduğu konusunda bizlere bir fikir verebilir. Mezenkimal kök hücreler ve osteoblastlar başta olmak üzere niş elemanları, HKH'lerin devamlılığını sağlayan çeşitli maddeler salgılarlar. Bu maddeler; CXCL12 (SDF-1), stem cell factor (SCF), ang-1, osteopontin ve IL-7'dir. Bu maddelerin dinamik bir denge halinde bulunması, HKH fonksiyonu açısından oldukça önemlidir. Örneğin; G-CSF alan kişilerde CXCL12 ekspresyonu azalır, ve HKH'leri nişte tutan sinyaller azalır. G-CSF'in mobilizasyonu bu yolla sağladığı bilinmektedir. Aynı zamanda MKH'ler ile temas halinde olan sempatik sinir uçları da, gün içinde HKH'lerin mobilize olduğu sirkadyan bir düzen oluşmasını sağlar(12). Perivasküler Niş: Vasküler sinüsoidlerin yoğun olarak bulunduğu, ve HKH'lerin aktif halde olduğu nişlerdir. Perivasküler MKH'ler, CAR (CXCL12 abundant reticular) hücreleri, makrofajlar bu niş bölgesinin elemanlarıdır.

(Şekil: Ehninger A, Trumpp A (2011) The Bone Marrow Stem Cell Niche Grows Up: Mesenchymal Stem cells and Macrophages Move In. J Exp Med 2011 (208) 421-428)

8 mayıs 2012

hükök Osteoblastlar tarafından salgılanan TPO, HKH'leri dormant halde tutan önemli faktörlerden birisi olarak gösterilmiştir. Endosteal ve perivasküler nişlerdeki HKH'ların aktivite farkları, bundan kaynaklanmaktadır. Makrofajlar ise, niş bölgelerinin yeni tanımlanan elemanları olarak MKH'lerle ilişki içerisindedirler. Kemik iliğindeki makrofajların yok edildiği hayvan modellerinde, MKH'lerin aktivitesinde çok belirgin azalmalar görülmüştür. G-CSF'in de etkisini makrofajlar üzerinden yarattığı düşünülmektedir; çünkü yapılan araştırmalar bu molekülün reseptörünün sadece makrofajlarda bulunduğunu göstermiştir(14).

derleme Her ne kadar hematopoetik kök hücreler, üzerinde en çok çalışma yapılan kök hücreler alanlarından birisi de olsa, bildiklerimizin henüz bilmediklerimize kıyasla ne kadar az olduğu, çok açıktır. Durmak bilmeyen bilimsel gelişmelere bizim de gelecekte büyük katkılar yapacağımızı umarak, yazımı bir alıntıyla bitirmek istiyorum: “Bildiğim bir şey varsa, o da hiçbir şey bilmediğimdir.” – Sokrates

Hematopoetik kök hücre nişlerinin –özellikle endosteal nişler- bir başka özelliği de, oksijen yoğunluğunun çok az olduğu alanlar olmasıdır. Hipoksi durumunda indüklenen HIF (hypoxia inducible factors) faktörlerinin HKH'lerin devamlılığı ve dormant halleri üzerine etkisi kanıtlanmıştır(15) . Beyin, testisler, kıl kökleri gibi bazı vücut bölümleri, immün sistemin etkilerinden uzak tutulur ve bu bölgelere “immune-privileged” denir(16). Kemik iliğindeki kök hücre nişlerinin de bu özelliklere sahip olabileceği, son yıllarda yapılan bazı çalışmalarla ortaya atılmıştır(17).

(Şekil: Ehninger A, Trumpp A (2011) The Bone Marrow Stem Cell Niche Grows Up: Mesenchymal Stem cells and Macrophages Move In. J Exp Med 2011 (208) 421-428)

mayıs 2012 9

derleme Referanslar: 1. McCulloch EA, Till JE (1960) The Radiation Sensitivity of Normal Mouse Bone Marrow Cells, Determined by Quantitative Marrow Transplantation into Irradiated Mice. Radiation Research 13; 115-125 2. Koçyiğit İ, Kaynar L, Çetin M (2008) Hematopoietik Kök Hücre Biyolojisi. Türkiye Klinikleri J Hem Onc 1(2): 16-22 3. Mikkola HKA, Orkin SH (2006) The Journey of Developing Hematopoietic Stem Cells. Development 133: 3733-3744 4. Kansu E, Çamurdanoğlu BZ (2009) Erişkin ve Hematopoietik Kök Hücreler. TÜBA Kök Hücre Biyolojisi ve Klinik Uygulamalar: 41 5. Winkler IGi et al (2012) Hematopoietic Stem Cell Mobilizing Agents G-CSF, Cyclophosphamide or AMD3100 Have Distinct Mechanisms of Action on Bone Marrow HSC Niches and Bone Formation. Leukemia 1-8 6. Mohty M, Ho AD (2011) In and Out of the Niche: Perspectives in Mobilization of Hematopoietic Stem Cells. Experimental Hematology 39:723-729 7. Tzeng YS, et al (2011) Loss of CXCL12/SDF-1 in Adult Mice Decreases the Quiescent State of Hematopoietic Stem Cells and Alters the Pattern of Hematopoietic Regeneration After Myelosuppression. Blood 117 (2) 429-439 8. Itkin T, Lapidot T (2011) SDF-1 Keeps HSC Quiescent at Home. Blood 117 9. Schaniel C, et al (2011) Wnt-inhibitory Factor 1 Dysregulation of the Bone Marrow Niche Exhausts Hematopoietic Stem Cells. Blood 118 2420-2429 10. Ichii M, et al (2011) The Canonical Wnt Pathway Shapes Niches Supportive for Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Blood 11. Scadden DT (2006) The Stem-Cell Niche as an Entity of Action. Nature 441 1075-1079 12. Moore KA, et al (2006) Stem Cells and Their Niches. Science 311, 1880 13. Ehninger A, Trumpp A (2011) The Bone Marrow Stem Cell Niche Grows Up: Mesenchymal Stem cells and Macrophages Move In. J Exp Med 208 421-428 14. Winkler IG, et al (2010) Bone Marrow Macrophages Maintain HSC Niches and Their Depletion Mobilizes HSCs. Blood 116 4815-4828

10 mayıs 2012

hükök 15. Rehn M, et al (2011) Hypoxic Induction of Vascular Endothelial Growth Factor Regulates Murine Hematopoietic Stem Cell Function in the Low-Oxygenic Niche. Blood 118 1534-1543 16. Niederkorn JY (2006) See No Evil, Hear No Evil, Do No Evil: the Lessons of Immune Privilege. Nature Immunology 2006 (7) 354-359 17. Fujisaki J, et al (2011) In Vivo Imaging of TReg Cells Providing Immune Privilege to the Haematopoietic Stem Cell Niche. Nature 2011 (474)

hükök

MAKALE Kök Hücreye Genel Bakış Betül İçli

ücudumuzdaki 200'den fazla tip özelleşmiş hücrenin, döllenmiş bir yumurtadan nasıl meydana geldiği oldukça şaşırtıcı bir konudur. Belirli bir zamana kadar eş özelliklere sahip hücreler, bir yerden sonra nasıl farklılaşmaya başlarlar? Çok farklı görevleri gerçekleştiren hücrelerin türediği ortak yapı “kök hücre” olarak adlandırılır. Kök hücreyi bu kadar ilgi odağı yapan özelliği ise tıpta birçok tedavide kullanılabilme potansiyeli olmasıdır. Bunların başında organ üretimi ve yenilenmesi gelmekte. Kök hücreden üretilen dokular kanser, şeker hastalığı, kalp hastalıkları gibi birçok yanlış işleyişte insanlara umut veren bir noktada. Tüm kök hücrelerin, kaynağına bakılmaksızın, 3 ortak özelliği vardır: uzun bir süreç boyu bölünebilme ve kendini yenileyebilme, özelleşmemiş olma, başka hücre tiplerine dönüşebilme. Bir kök hücre popülasyonu laboratuvarda aylarca tutulduğunda, sürekli bölünüp sayısını milyonlara çıkarabilir. Sonda oluşan hücreler de ilk popülasyondaki hücreler gibi özelleşmemiş ise bu özelliğe uzun süreli kendini yenileyebilme(? Longterm self-renewal) denir. Bilim insanları bu özellikle ilgili 2 önemli sorunun cevabını aramakta: neden embriyonik kök hücreler laboratuvarda bir sene belki daha fazla sürekli çoğalabiliyor da embriyonik olmayanların çoğu bunu başaramıyor ? ve normalde canlı vücudunda kök hücrelerin bu bölünmesini düzenleyen faktörler neler? Bu soruların cevaplarına ulaşmak ,hücre çoğalmasının normal embriyonik gelişmede

ya da kansere neden olan kontrolsüz bölünmede nasıl düzenlendiğini anlamak açısından çok önem taşıyor. Kök hücreler dokuya özgü özellik göstermiyor. Mesela hiçbir zaman yanındaki hücrelerle birlikte vücuda kan pompalayamıyor ya da oksijen taşımıyor. Ama farklılaşma süreciyle birlikte birçok hücre tipine dönüşebilme potansiyeline sahip. Bu farklılaşmayı tetikleyen içeriden ve dışarıdan gelen sinyaller var. İçten gelen sinyaller hücrenin kendi genleri tarafından kontrol ediliyor. Etraftaki diğer hücreler tarafından sentezlenen kimyasallar, komşu hücrelerle olan fiziksel etkileşimler ve mikroçevrede bulunan belli bazı maddeler dıştan gelen sinyallerden sayılıyor. Bu sinyallerin etkileşimleri, epigenetik değişikliklere neden oluyor ve böylece hücre farklılaşmaya başlıyor. Bu süreç aşama aşama gerçekleşiyor ve her seferinde hücreler biraz daha özelleşmiş oluyor. Bu kadar üzerinde çalışılan bir konu, ne zamandır bilim dünyasının dikkatini üzerine çekiyor? Genel olarak bir tarihine bakalım; Kök hücre sözcüğü 1908 yılında Rus histolojist Alexander Maksimov tarafından Berlin'deki bir hematoloji kongresinde ortaya atıldı. 1950lerde kemik iliğindeki bazı hücrelerin başka dokuları oluşturabilme kabiliyetinin farkedilmesi, insanlardaki kök hücre araştırmaları için bir başlangıç noktasıydı. Hasar görmüş, işlevini yerine getiremeyen dokuların bu yöntemle yeniden oluşmayıs 2012 11

makale hükök turulabileceği düşüncesi bilim adamları için ilham kaynağı oldu. 1956 yılında Amerikalı doktor E. Donnall Thomas (1990'da J. E. Murray'le birlikte Nobel Ödülüne layık görüldü) tarafından ilk kemik iliği nakli gerçekleştirildi. Lösemili hastanın vücudu, uygulanan radyoterapinin ardından, tek yumurta ikizinden yapılan nakli reddetmedi ve işlem başarılı oldu. Bugünlerde kemik iliği nakli bilindiği üzere lösemi, lenfoma, multiple myelom gibi kanserlerde; orak hücre anemisi, ağır immün yetmezliği sendromu, talasemi gibi kemik iliği üretimini etkileyen hastalıklarda ya da kemoterapi dolayısıyla kemik iliği hasarı ileri düzeyde olan hastalarda uygulanmakta. 1981'de Martin Evans ve Matthew Kaufman tarafından yeni bir teknik denendi: Uterusta gelişmekte olan fare embriyolarından blastosit aşamasında kök hücrelerin izole edilmesi. Yine aynı sene Gail Martin “embriyonik kök hücre” terimini kullandı ve bu embriyoların in vitro olarak da yetiştirilebileceğini yazdı. 1988'de ise yetişkin farelerden hematopoetik kök hücreler saflaştırıldı. 1992'de insan beynindeki kök hücreler tanımlandı ve böylece modern nöroloji biliminin babası olarak bilinen Cajal'ın “yeni nöronlar oluşmuyor” hipotezi yanlışlanmış oldu. 1998'de James Thomson ilk kez insan embriyonik kök hücrelerini izole edip çoğaltabilceği bir yöntem ortaya koydu ve bu kök hücre biyolojisinin insan ayağı için önemli bir adım oldu. 2000li yıllarda erişkin kök hücrelerin farklı hücrelere dönüşebildiğine dair birçok rapor yayınlandı. 2001 yılında çekirdek transferiyle fare embriyonik hücresi oluşturuldu. 2002 yılına gelince fare embriyonik kök hücresinden üretilen pankreatik hücrelerin, farelerdeki diabete iyi geldiği görüldü. 2003'te Dr. Songtao Shi ve ekibi çocukların süt dişlerinden kök hücre elde etti.(DPSC-dental pulp stem cell) 2004'te ise Parkinson hastalığı dolayısıyla kaybedilen bir sinir hücresi tipinin insan embriyonik kök hücrelerinden üretildiği duyuruldu. Kingston Üniversitesi araştırmacıları 2005'te göbek kordon kanından elde edilen bir kök hücre tipini belirlediler.(CBE- cord-blood-derived embryonic-

12 mayıs 2012

makale hükök like stem cell) Bu tipin, erişkin kök hücreden daha fazla tür dokuya dönüşebilceğini savundular. 2006'da Kazutoshi Takahashi'nin ve Shinya Yamanaka'nın fare indüklenmiş pluripotent kök hücresiyle ilgili makaleleri yayınlandı.(iPS) 2007'de amniyotik sıvıdan kök hücre üretildi. Bunun araştırmalarda ve tedavide embriyonik kök hücreye alternatif olabileceği düşünüldü. Yine 2007'de insan olgun fibroblastlarından indüklenmiş pluripotent kök hücreler elde edildi. Günümüzde sadece fibroblastlar değil başka insan hücreleri de bu iş için kullanılabilmekte. 2008'de insan diz kapağında otolog erişkin mezenkimal kök hücrelerden kıkırdak doku oluşumu gerçekleşti. 2009'da deri hücrelerinin doğru manipülasyonlarla hastaya özel, indüklenmiş pluripotent kök hücreye dönüştürülebilineceği ortaya atıldı ve bunun nasıl yapılacağına dair bir yol da açıklandı. Ve son yıllarda yapılan birçok başarılı çalışma daha… Hastalıkların tedavisini derinden etkileyecek kökten değiştirecek özelliği, son zamanlarda yapılan çalışmaların umut verici başarısıyla birleşince, tüm dünyada ilgi gösterilen, büyük bütçeler ayrılan bir alan olma niteliğini kaybetmeyecek gibi.

hükök

MAKALE Farklılaşma Yeteneklerine Göre Kök Hücreler Oğuzhan Duvar

mbriyonal gelişim sürecinde kök hücreler değişik doku ve organları oluşturmak üzere farklılaşmaktadırlar. Canlılarda döllenme sonrası oluşan zigot bölünerek değişik farklılaşma yetenekleri olan kök hücreleri meydana getirir. Aynı kalıtsal materyale sahip olmalarına rağmen farklı genlerin ifade edilmesi, insan vücudundaki kök hücrelerin farklılaşma yeteneklerinin birbirinden farklı olmasının en önemli sebebidir. Kök hücreler farklı hücre tiplerine dönüşebilme kapasitelerine göre aşağıdaki şekilde gruplandırılmıştır: Totipotent kök hücre: Embriyonal gelişim sürecinin başlangıcında yumurta sperm tarafından döllenir ve vücuttaki bütün hücre türlerine dönüşebilme yeteneği olan zigot meydana gelir. Döllenmeyi takip eden ilk dört gün içerisinde(morula evresi) zigot bölünerek 16 hücreli yapıyı oluşturur. Bu hücrelerin her biri totipotent kök hücrelerdir. Totipotent kök hücreler bütün embriyonal ya da ekstra embriyonal dokulara farklılaşabilirler. Pluripotent kök hücre: Morula dönemindeki 16 hücreli yapıdaki totipotent hücreler bir ileriki aşamada farklılaşarak blastosisti oluştururlar. Blastosist, trofoblast ve iç hücre kitlesi adı verilen iki farklı yapıdan oluşur. İç hücre kitlesindeki hücreler pluripotent kök hücrelerdir. Pluripotent kök hücreler her üç embriyonal tabaka (endoderm, mezoderm, ektoderm) hücrelerine de farklılaşabilirler. Pluripotent kök hücrelerin totipotent kök hücrelerden farkı ekstra embriyonal doku hücrelerine (plasenta gibi) farklılaşamamalarıdır. Dolayısıyla totipotent kök hücreler bölünmeye bırakıldıklarında canlı bir organizma oluşturabilirken pluripotent hücreler oluşturamazlar.

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC): Pluripotent olmayan bir hücrenin dışarıdan bir takım etkilerle gen ekspresyonunun değiştirilmesiyle oluşturulan yapay pluripotent hücrelerdir. Derginin ilerleyen sayfalarında ayrıntılı olarak anlatılacağından, şimdilik bu kısa bilgiyi vermekle yetiniyoruz. Multipotent kök hücre: Embriyonal gelişimin ileriki dönemlerinde ortaya çıkan ve sadece belirli hücre tiplerine farklılaşma yeteneği bulunan kök hücrelerdir. Multipotent kök hücreye en iyi örnek hematopoetik kök hücredir. Hematopoetik kök hücreler bütün kan dokusu hücrelerine farklılaşabilirler. Oligopotent kök hücre: Farklılaşma yeteneği multipotent hücrelerden daha az olan hücrelerdir. Lenfoid ve myeloid hücreler oligopotent hücrelere iyi birer örnektir. Unipotent kök hücre: Yalnızca tek bir hücre tipine farklılaşabilen öncü hücrelerdir. Son yıllarda yapılan bazı araştırmalar bilim adamlarını bu gruplandırmanın kalıcılığı üzerine düşündürmeye başlamıştır. Çünkü laboratuvarlarda yapılan yeni çalışmalarla tamamen farklılaştığı düşünülen bazı hücrelerin dışarıdan birtakım etkilerle pluripotent hücrelere dönüşebildiği gözlenmiştir. Yine tamamen farklılaşmış hücrelerin dışarıdan birtakım etkilerle farklı doku türlerinin hücrelerine dönüştürüldüğü bazı deneyler mevcuttur.

mayıs 2012 13

hükök

DERLEME Kökenlerine Göre Kök Hücreler Betül Kubat

ök hücreler; tüm insanlarda, gelişimin ilk evrelerinden son evrelerine kadar var olmaktadırlar. Kök hücreler; içinde bulunduğu gelişim evresine, dokuya vb. ne göre, gerek farklı dokulara dönüşme kapasiteleri gerek doku içinde bulunma oranları gibi özelliklerle birbirlerinden ayrılırlar. Örneğin embriyonik kök hücreler, insan gelişimin oldukça erken safhalarından elde edilip vücuttaki tüm hücre çeşitlerine dönüşme kapasitesine sahiplerken; yetişkin kök hücreleri, gelişimini tamamlamış insanın belirli dokularından elde edilip belirli hücre tiplerine dönüşme kapasitesine sahiplerdir. Ayrıca ayıklanma kolaylığı bakımından; yetişkin kök hücreleri içinde bulundukları olgun dokunun hücreleri arasından ayırmak, embriyonik kök hücrelere nispeten daha zordur. Bu gibi farklılıklar sayesinde kök hücreler daha iyi anlaşılmakta ve çeşitli çalışmalarla yeni kök hücrelerinin keşfi hızla gerçekleşmektedir.

14 mayıs 2012

Kök hücre çeşitlerini kesin bir sınıflandırmaya tabi tutmak zor olsa da bu hücreler belirli başlıklar altında toplanabilir: Embriyonik Kök Hücreler: Embriyonik kök hücreler blastosistin iç hücre kütlesinden(inner cell mass) türeyen pluripotent kök hücrelerdir. Blastosist, memelilerin erken embriyogenez döneminde moruladan sonra oluşan, 4-5 günlük embriyoya verilen isimdir. Bu yapı; normal gelişim sürecinde embriyoyu oluşturacak iç hücre kütlesini (inner cell mass) (embryoblast) ve plasentayı oluşturacak dış hücre katmanını(trophoblast) içerir. İç hücre kütlesi, gelişimin erken evrelerinde implantasyon öncesi oluşur ve embriyonik kök hücreler bu kısımdan elde edilir. Ayrıca gelişmekte olan bir fetusun primordial germ hücrelerinden de embriyonik kök hücrelere benzeyen hücreler elde edilebilir. İnsan embriyonik germ hücreleri,

derleme

hükök fetusun bir parçası olan gonadal yapıdan köken alan primordial germ hücrelerinden elde edilir. Embriyonik kök hücreler(ES) blastosistten elde edilmek istendiğinde blastosistin dış kısmı çıkarılır ve iç hücre kütlesi elde edilir. Elde edilen bu hücreler, hücrelerden ES lerin elde edilebileceği besince zengin kültür ortamlarına alınırlar. Bu ortamda, hücrelerin özel hücre tiplerine uzunca bir süre dönüşmeden çoğaltılması sağlanır. Kök hücre çalışmalarında kök hücreler, in vitro fertilizasyon ve çekirdek transferi olmak üzere iki temel kaynaktan elde edilirler. Kök hücre tedavilerinde kök hücreleri, farklılaşmamış halde hastaya vermek risklidir. Çünkü; geniş bölünme kapasitelerinden dolayı hücreler, bulundukları yerde teratoma denilen tümore neden olabilirler. bu yüzden ES hücreleri ile tedavi yapılabilmesi için hücrelerin transplanttan önce spesifik hücrelere dönüştürülmüş olması gerekir. Ayrıca, bu tedavilerin hepsinin hipotetik ve deneysel aşamada olduğunu belirtmek gerekir. Yetişkin(Erişkin) Kök Hücreler: Yetişkin kök hücreler; embriyonik gelişim sonrasında vücut doku hücreleri arasında bulunan, farklılaşmamış ve farklılaşma kapasiteleri embriyonik kök hücreler göre daha sınırlı olan kök hücrelerdir. Dokularda nadir olarak bulunurlar. Birincil görevleri bulundukları dokuda hücre ölümü veya doku hasarı meydana geldiğinde kısmen dokuyu tamir

İn vitro fertilizasyon

etmektir. Bulundukları ortama göre farklı davranış özellikleri gösterirler. Örneğin; hematopoietik kök hücreler, olgunlaşmış kan hücrelerine dönüşmek üzere kemik iliği tarafından sürekli üretilirler. Bu hücrelerin en önemli görevleri kan hücrelerini yenilemektir. Bu durmun aksine, ince bağırsaktaki kök hücreler sabittir (sürekli üretilmezler) ve fiziksel olarak oluşturdukları matür hücrelerinden kolaylıkla ayırt edilebilirler. Kök hücresi içerdiği bildirilen erişkin organ ve doku listesine her gün bir yenisi eklenmektedir. Bunlar arasında kemik iliği, periferik kan, beyin, spinal kord, diş kökü, kan damarları, çizgili kas, derinin epitel tabakası, sindirim sistemi, kornea, retina, karaciğer ve pankreas bulunmaktadır. Bir hücreye erişkin kök hücre denebilmesi için o hücrenin kendini yenileyebilmesi ve bu hücrelerin klonlanabilmesi gerekmektedir. Diğer bir deyişle; ihtiyaç olduğunda olgunlaşmış hücrelere dönüşebilecek, kendisiyle aynı genetik özelliklere sahip hücreler oluşturabilecek özelliğe sahip olmalılardır. Dönüştüğü hücrelerin tamamıyla matür bir hücre fenotipinde olması, bulunduğu dokuya entegre olması ve o dokuya ait fonksiyonu yerine getirebilmesi gerekir. Yetişkin kök hücreler çeşitli hücre tiplerine ayrılırlar. Hematopoietik kök hücreler, mamal kök hücreler, bağırsak kök hücreleri, mezenkimal kök hücreler, endotelyal kök hücreler, nöral kök hücreler, burun(olfactory) kök hücreleri, sinir ucu (neural crest) kök hücreleri vb. yetişkin kök hücre tipleridir. Hematopoietik Kök Hücreler: Bu kök hücreler kemik iliğinde bulunup kan hücre çeşitlerinin tümünü oluşturabilecek kapasiteye sa-

çekirdek transferi

15 mayıs 2012 7

derleme

hükök

hiptirler ve multipotent kök hücrelerdir. Ayrıca bu kök hücreler kemik iliği dışında; periferik kan, umblikal kord kanı ve plasentadan da elde edilebilirler.

Sinir sisteminin ana görünümünü oluşturan, kendi kendini yenileyebilen multipotent kök hücrelerdir.

Mamal Kök Hücreleri: Bu kök hücreler; ergenlik dönemi,hamilelik ve meme karsinogenezi sırasında meme bezlerinin büyümesini sağlayan hücrelerin kaynağını oluştururlar. İntestinal Kök Hücreler: Bu kök hücreler düzenli olarak hayat boynca bölünürler ve bağırsağın içini astarlayan hücreleri oluştururlar. Ayrıca intestinal kök hücreler, ince ve kalın bağırsak kanserlerinin olası kaynakları olarak görülürler. Mezenkimal Kök Hücreler: Hücrelerin bağ dokularında bulunurlar. Dokuların desteğini başka bir deyişle çatısını oluşturan stroma hücrelerinin temelini oluştururlar. Plasenta, yağ dokusu, akciğer, kemik iliği ve kandan izole edilebilirler. Her ortamda farklılaşma kapasitesine sahiptirler. Bulunduğu dokudan hasarlı bir dokuya geçerek bu sayede hasarlı doku tamirini sağlayabilirler ve bu sayede birçok organda yapımonarım işlerini yürütebilirler. Ayrıca ortamdaki farklı koşullara bağlı olarak farklı bir görünüm kazanabilirler. Bu nedenle, ortamlarda yetenekleri değişebilir ve her yetenekleri kesin değildir. Endotelyal Kök Hücreler: Endotelyal kök hücreler, kemik iliğinde bulunan multipotent kök hücre çeşitlerinden biridir. Nadir bulunurlar ve kan damarlarını astarlayan endotelyal hücrelere farklılaşma yeteneğine sahiptirler.

Olfaktori Kök Hücreler: Olfaktori kök hücreler, insan burun mukoza hücrelerinden elde edilirler. Burun mukoza hücreleri burnu astarlar ve koku duyusunun alınmasında görev alır. Bu hücrelerin doğru kimyasal ortamlara verilmesi halinde bu hücreler, embriyonik kök hücreler gibi birçok farklı dokuya farklılaşma özelliğine sahip olurlar. Herkesten kolaylıkla elde edİlebilirler. Kök hücre terapilerine özelikle ihtiyaç duyan yaşlı kişilerde bu kök hücrelerin önemi büyüktür.

Sinir Ucu (Neural Crest) Kök Hücreleri: Bu kök hücreler; nöronları, Schwann hücrelerini, kondrositleri ve melanositleri oluşturma kapasitesine sahiptirler. Fetal Kök Hücreler: Adından da anlaşılacağı üzere fetal kök hücreler, fetusten elde edilmektedir. Fetus, üçüncü gebelik ayı başından doğuma kadarki devre içinde ana rahmindeki canlıya verilen addır. Fetusteki birçok doku kök hücre içerir. Bu kök hücreler, hızlı büyüme ve organ gelişiminden sorumludurlar.

Nöral Kök Hücreler:

Mamal Kök Hücreleri (kırmızı)

16 mayıs 2012

Mamal Kök Hücreleri (yeşil)

derleme

hükök Fetal kök hücreler ile yetişkin kök hücreler arasında bazı benzerlikler bulunmaktadır. Yetişkin kök hücreler gibi fetal kök hücreler de genelde dokuya özgüdürler ve yine yetişkin kök hücreler gibi bulundukları dokunun olgun hücrelerini oluşturma kapasitesine sahiptirler. Kordon Kanı Kök Hücresi: Bebek doğduktan sonra göbek kordonunda ve plasentanın içerisinde, bebek kanı ile aynı yapıda bir miktar kan kalır ve bu kan genellikle atılarak boşa gider. Oysa bu kan, vücudumuzda bulunan birçok hücreyi oluşturma yeteneğine sahip kök hücreleri büyük miktarlarda içerir. Kordon kanı; hastalıkları tedavi veya belirli kanserlerin tedavisinden sonra kan sistemini restore etme amacıyla kullanılır. Olgun kemik ilğindeki kök hücreler gibi kordon kanı kök hücreleri de dokuya özgü özellik gösterirler.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre (iPSC): iPSC veya iPSler; pluripotent olmayan bir hücreden, spesifik genlerin 'zorla' ekspresyonu indüklenerek elde edilen pluripotent hücrelerdir. İPS lerin türetildiği pluripotent olmayan hücreler genelde vücut hücreleridir. Fakat biz bu hücrelere yetişkin kök hücreleri diyemeyiz. Çünkü İPS ler embriyonik kök hücreler gibi doğal pluripotent olan kök

hücrelere; teratoma oluşturmaları, belirli kök hücre genlerinin ekspresyonu, blastosiste enjekte edildiğinde yeni oluşan bireyin vücut hücrelerine katkıda bulunma gibi yönlerden benzerler. iPSC ler elde etmek için; yetişkin hücreler, çeşitli yöntemler kullanılarak yeniden programlanır. Fakat bu yöntemin insanlarda kullanımını sınırlayan önemli riskler oluşabilir. Örneğin; hücreleri genomik olarak değiştirmek için virüsler kullanılırsa, kansere neden olan genler ekprese olabilir. Amniyotik Kök Hücreler: Amniyonitik sıvı; gelişmekte olan bebeği korur, fetusün hareketini kolaylaştırır, ısı kaybından fetusü korur. Ayrıca amniyotik sıvı hatırı sayılır miktarda kök hücre içerir. Bu amniyotik kök hücreler, multipotent kök hücrelerdir ve çeşitli dokulara dönüşme kabiliyetine sahiplerdir. Bununla beraber; araştırmacılar, amniyotik sıvının nonpluripotent kök hücreler bakımından da oldukça zengin olduğunu ortaya koymuşlardır. Bu hücreler, belirli hücrelere dönüşme kabiliyetine sahiptirler. Bu hücreler ise beyin, karaciğer ve kemik hücreleridir. Günümüzde amniyotik kök hücreleri, özel kök hücre bankalarında korumak mümkündür. Bazı özel şirketler bu uygulamayı, belirli ücretler karşılığında sağlayabilmektedirler.

mayıs 2012 7

derleme

hükök

Kanser Kök Hücresi (KKH): Bu hücreler tümörlerde bulunan kanser hücreleridir ve normal kök hücre özelliği gösterirler. Belirli kanser çeşitlerinde,kanserli dokuda bulunan tüm hücrelere dönüşebilirler. Tümörleri oluşturmaları, farklılaşma ve kendi kendilerini yenileme yoluyla olmaktadır. Son çalışmalarla KKH'lerin ilaç ve radyasyon tedavisine dirençli oldukları gösterilmiştir. Gelecekteki çalışmalar, kanserin tedavisi için KKH'leri hedef alan tedavilerin geliştirilmesine öncülük edecektir.

Amniyotik Kök Hücre Eldesi

18 mayıs 2012

hükök

tek sayfa

Selda Karaaslan

EMBRİYONİK

KÖK HÜCRE Embriyonik kök hücre, embriyodan oluşan sınırsız yaşam kapasitesi olan ve birçok hücre dizisini oluşturabilen hücredir. Embriyonik kök hücre hücre, erken embriyonun (4.-5. gün) blastosit evresindeki iç hücre grubunun hücre kültürlerinden elde edilir. Ancak bu kültüre hücreler embriyonun normal gelişimindeki gibi hareket etmezler. Embriyonik kök hücre sonsuz üreme potansiyeline sahiptir; pluripotent bir hücredir yani embriyonun her üç germ tabakasından (endoderm, ektoderm, mezoderm) hücreleri oluşturabilir ve vücutta yaklaşık 200 hücre tipine dönüşebilirler. Embriyonik kök (EK) hücreleri iki çok önemli özelliğe sahiptirler ve bu özellikler sayesinde rejeneratif tıbbın odak noktası haline gelmişlerdir: kendini-yenileme süreci ile farklılaşmaksızın prolifere olma becerisi, farklılaşma için indüklendiklerinde özelleşmiş hücre türleri oluşturma potansiyeli. Günümüzde, kök hücrelerin farklılaşmasının kontrolü üzerinde durulmaktadır. Bu amaçla kültür ortamına çeşitli büyüme faktörleri, sitokinler ve kimyasallar eklenmiş, farklı destek hücreleri kullanılmış ve gen aktarımı ile farklılaşmanın yönlenmesi yönünde çalışmalar yapılmaktadır. Embriyonik kök hücrelerin farklılaşmadan kendini yenileyebilmesi için birçok faktörün denge içinde olması gerekmektedir. In-vitro olarak farklılaşmayı kontrol etmek için kültür ortamında destek hücreler ve sitokinlerden yararlanılmaktadır. İnsan embriyonik kök hücreleri, fare embriyonik fibroblast hücreleri ve "Leukemia Inhibitory Factor"-LIF

Embrioid Cisimcikler

varlığı nda bu özellikleri ni korumaktadır. Destek hücreler ve LIF ort a m d a n u z a k l a ş t ı r ı d ı ğ ı n d a hücreler arasında kümeleşme ve sonrasında Embriyoid Cisim oluşumu gözlenir. Embriyoid cisimcikler (embrioid bodies) embriyonik kök hücrelerden elde edilen hücre kümeleridir. Bu kümeler üç ana germ tabakasından kaynaklanan çeşitli hücre tiplerine yönlenmiş hücrelerden, farklılaşmamış olanlara kadar değişen hücreleri içermektedir. Kültürlerden elde edilen embriyonik kök hücrelerde aşağıdaki hücrelere değişim gözlenmiştir; -Pankreas adacık hücresine benzer, insülin salgılayan hücreler (fare ve insan çalışlmaları) -Kasılma gösterebilen kalp kası hücreleri (fare ve insan) -Kan hücreleri (fare ve insan) -Bazı beyin kimyasallarıın salgılayan sinir hücreleri (fare) Rejeneretif tıpta diabetes mellitus, nöronal onarım, kardiak restorasyon, hemapoietik transplantasyon, ortopedik hastalıklar gibi alanlarda embriyonik kök hücre uygulamalarında çalışılmaktadır. Ayrıca bilimsel ve politik engellerin üstesinden gelindikten sonra, insan embriyonik kök hücre alanının yanık travması ve diyabetik ayakyaraları gibi belli hastalıklarda ve aynı zamanda Parkinson hastalığı, Tip 1 diyabet, romatoid artritve myokard enfarktüsü gibi dejeneratif hastalıklarda önemli farklılıklar yaratacağı öngörülmektedir.

Embriyonik kök hücre çalışmalarında dönüm noktası olarak tanımlanabilecek 3 önemli çalışma vardır.Konuyu daha iyi kavrayabilmek için bu çalışmalara değinDestek kültüründe üreyen mekte fayda vardır. embriyonik hücreler mayıs 2012 19

tek sayfa

hükök

Konuyla ilgili ilk önemli gelişme Lewis j. Kleinsmith ve G.Barry Pierce tarafından yapılan çalışmadır(1964)Bu çalışmayla embriyonal karsinoma hücrelerinin pluripotent özelliğe sahip olduğu gösterilmiştir.Bunu göstermek amacıyla in vivo klonlama tekniği kullanılmıştır. Embriyonel karsinoma hücrelerinin orijini teratokarsinomlardır(germ hücreli tümör). Fare teratokarsinomasının dönüşümünden embriyonel karsinoma hücreleri içeren embriyoid cisimcikler elde edildi. Embriyoid cisimcikler tripsinle tek hücrelere(single cell) ayrıştırıldı ve bunlar kılcal tüplerde toplandı ve bunlar fareye aktarıldı. 1700'ün üzerindeki aşılamadan 44'ünde klonal dizi elde edildi. Bu klonal dizilerin 43'ü embriyonel karsinomun 14 kadar vücut dokusuna farklılaşabilen teratokarsinomalardı. Bunların farklılaşma dereceleri, büyüme hızları farklıydı. Kalan klonal dizi sadece embriyoid karsinoma, vitellüs kesesi ve tropoblastı üretebilecek sınırlı farklılaşma kapasitesine sahipti. Bu çalışmalar embriyoid karsinomaların pluripotent özelliğini göstermiştir.

Martin Evans

Embriyonik kök hücrelerin elde edilmesiyle ilgili ilk başarılı çalışmalar Martin Evans ve Matthew Kaufman tarafından Cambridge Üniversitesi'nde, Gail Martin tarafından San Francisco Üniversitesi'nde fare embriyonik kök hücre dizisi eldesiyle gerçekleştirilmiştir(1981). Embriyonik kök hücre dizileri farelerde blastositlerin iç hücre (inner-cell mass) kitlelerinden izole edilmişler ve fare fibroblast hücre dizileri üzerinde in-vitro şartlarda kültürlerde üretilmişlerdir. Embriyonik kök hücrelerin besleyici tabakadan ayrılması agregasyonu ve basit ya da kistik embriyoid cisimciklere farklılaşmayı uyarır. Bu aşamada uygun indükleyici ajan kullanıldığında farklı hücre hattı yolları boyunca farklılaşma mümkündür. Kullanılan kültür koşullarına bağlı olarak, fare EK hücrelerinin epidermal hücreler,tip II alveoler epitelyal hücreler, telensefalik prekürsörler, osteoblastlar ve kardiyomyositler de dahil olmak üzere değişik yönlere farklılaşabildikleri daha sonraki çalışmalarla gösterilmiştir. Ayrıca Martin Evans bu keşfiyle 2007'de Capecchi ve Smithies ile Nobel Ödülü'nü paylaşmıştır.

İkinci büyük gelişme Dr. James Thomson ve arkadaşları tarafından Wisconsinsin Üniversitesi'nde insan embriyonik kök hücre dizisinin eldesiyle gerçekleştirilmiştir. Bunun için infertilite nedeniyle in-vitro fertilizasyon için tedavi programına alınan çiftlerden geriye kalan artık embriyolar kullanılmıştır. Thomson ve arkadaşları blastosit iç hücre kitlesindeki 160 ile 180 embriyonik kök hücreyi lazer diseksiyon mikro-cerrahi yöntemiyle blastosit içinden ayırmışlar ve fare ambriyonk fibrolastları üzerinde petri kutularında kültüre koymuşlardır. Fare fibroblastları üzerinde çoğalan embriyonik kök hücreleri pasajlar yaparak ve yeni petri kutularında kültür ortamlarına ekerek uzun süre hücreleri diziler halinde koruyabilmişlerdir. Embriyonik kök hücrelerinin embriyoid cisimcikler olarak eldesi mümkün olabilmektedir. Bu ve bunu izleyen çalışmalarda fare EK hücrelerinde olduğu gibi insan EK hücrelerinde de farklılaşma olmadan kendini-yenileme becerisi ve pluripotent bir yapı olduğu gözlenmiştir. Bu özellikler rejeneratif tıbbın geleceği ve genel anlamda medikal araştırmalar için büyük ümitler vaat etmektedir.

20 mayıs 2012

Lewis Kleinsmith

James Thomson

hükök

DERLEME Nükleer Yeniden Programlamaya Genel Bakış ve Yamanaka'dan Önce Yeniden Programlama Cansu Ayvacıoğlu

ök hücreler; embriyo ve post natal organizmada farklı kaynaklardan elde edilebilen, differansiye hücreleri oluşturma ve kendini yenileme özelliğine sahip hücrelerdir. Memelilerde sadece zigot ve ilk blastosistler totipotenttir ve extraembriyonik dokular dahil tüm organizmayı oluşturan hücrelere farklanabilirler. Omurgalıların erken embriyolarında iç hücre kitlesi(inner cell mass) 3 germ tabakasına da farklılanabilecek olan pluripotent hücrelerden oluşmuştur. Multipotent hücreler ise tek germ tabakasındaki hücrelere farklanabilme yeteneğine sahip hücrelerdir. Normal gelişimde, hücreler totipotent zigottan, pluripotent İCM'ye, epiblast ve en sonunda çok daha sınırlanmış, farklanmış hücrelere dönüşürler. Differansiye olmuş hücreler genelde çeşitlerini değiştirmezler; yani bir hepatosit bir anda

kardiyomiyosit olmaz. Ancak çalışmalar hücrelerin plastisite özelliği olduğunu ileri sürmektedir: yani farklı bir mikroçevreye maruz kalan hücrenin çeşidini değiştirebileceği söylenir.1960'ların başında, Hadorn ve Gehringin (D.Melanogasterden alınan disklerin, yetişkin sineğin karnına transplante edildiğinde orijinal olarak genital hücre oluşturacak hücrelerin bacak ve kanat oluşturması) ve Lievre ve Douarinin (Bıldırcınlardan alınan nöral krest hücrelerinin tavukta farklı yönlendirilmesi) çalışmaları plastisiteyi kanıtlamaktadır. Uzunca bir süre farklanmış hücrelerin, farklanma süreci içerisinde kromozomlarını geri dönüşümsüz bir şekilde inaktive ettikleri düşünüldü.Ancak Nükleer Tranfer- Hücre Füzyonu- Transdüksiyon Faktörlerinin Transdüksiyonu yaklaşımları ile birkaç istisna hariç (lenfositlerdeki homolog rekombinasyon gibi) ES hücreye dönüşmek için gereken tüm genleri barındırdığını ve inaktivasyonun kalıcı olmadığı anlaşıldı. Ve ayrıca bu 3 yaklaşım, farklanmış hücrenin hücresel hafızasının sürekli olarak kontrol halinde olduğunu ve transkripsiyonel faktörlerin değişimine bağlı olduğunu gösteriyordu. Buradan yola çıkarak bilim adamları, somatik diferansiye hücreleri başka tip somatik hücrelere ve kök hücre benzeri hücrelere (iPS) dönüştürmüşlerdir. Bu işleme de hücrenin yeniden proglamlanması (reprogramming) diyoruz.

mayıs 2012 21

derleme Nükleer transfer: Somatik hücre çekirdeği, nukleusu çıkarılmış oosite transplante edilince reprogramming gerçekleşir; bu hücreden köken alan hücreler pluripotent özellik kazanır, blastosist gelişir ve somatik hücrenin aynı özelliklerini taşıyan Dolly gibi klon bir organizma oluşur. Bu olaydan; tam bir organizma oluşumu için gerekli tüm genlerin somatik hücrede korunduğunu, reprogramming için gerekli faktörlerin de oosit içinde aktive olduğunu anlayabiliriz. NT çalışmaları nükleer reprogramming mekanizmalarının anlanmasında, örneğin oosit içeriğindeki reprogramlama faktörlerinin nasıl hücreyi dönüştürdüğünün anlaşılmasında önemlidir. 1952'de Briggs ve King tarafından kurbağalarla yapılan çalışmada(erken blastosistten, çekirdeği çıkarılmış oosite transfer)genlerin kaybolmadığı ilk defa gözlemlendi. Ancak daha farklılanmış hücrelerle yapınca anormal doku oluşumu beliriyordu. Bu sınırlama hücre ileri farklandığında plastisite özelliğini kaybeder şeklinde yorumlandı. Sonrasında Gurdon farklı bir kurbağa türüyle yaptı.(tamamen farklanmış kurbağa bağırsak hücresini, başka bir kurbağada bulunan oosite implante etti) Tür seçimi ve sonuçların yorumlanması kritik noktaydı; insidans çok düşük(insidans, kök hücreden hücre çekirdeği alınarak nükleer transplantasyon yapımına oranla yaklaşık 30 kat daha düşüktü) olmasına rağmen-ki bu bazı araştırıcılar tarafından oluşan kolonilerin kontaminasyon kökenli olduğunu düşündürüyordu- Gurdon, sonucu, differansiyasyon sırasındaki olayların geri dönüşümsüz olmadığı şeklinde yorumladı.NT ile üretilen organizmalar, farklılaşmış hücrelerin fixe olmadığını, embriyonik duruma yeniden dönüştürülebileceğini kanıtlamaktaydı. 1997'de ilk memeli klonu olan Dolly'yi, Wilmut ve meslektaşları üretti. Fusogenik elektriksel atım kullanarak; meme hücresiyle nukleusu çıkarılmış oositi birleştirmişlerdir.1 sene sonra Wakayama ve meslektaşları tarafından, Dolly'e oranla çok daha nazik hücrelerle çalışılarak-bunu sağlayan piezo elektrik attım sayabilen enükleasyon pipetinin kullanılmasıydı- fare klonu elde edildi. Sonrasında çok sayıda labda SCNT (somatic cell nuclear transfer) deneyleri yapıldı. SCNT, sadece oosit değil fertilize yumurtayla da yapılabiliyordu ki bu bize gelişimin fertilize yumurtada aşamasında da

22 mayıs 2012

hükök reprogramming faktörleri olduğunu gösterir. Sonrasında, Jeanisch ve grubu, son derece farklanmış koku ya da B hücrelerinden yeniden programlamayla fare kolonisi üreterek, kontaminasyon iddialarına son verdi. Kuzu ve fareye ek olarak köpek gibi bir çok hayvan klonlandı. Ve 10 sene sonra hücre dondurulması deneyleriyle birleştirilerek iyileştirme amaçlı saklama fikrinin çıkışı sağlandı. Hala SCNT 'den elde edilen kök hücreler (ntES hücreler) nükleer klonlamada daha etkiliydi. ntES hücrelerin üretimde normal kök hücreyle eşit etkinliği vardır. ntES hücre klondan elde edildiği için çok fazla sayıda bölünmeyi gerektirir. Hala primatların klonları yapılmamasına rağmen, ntES hücreleri başarıyla elde edilmiştir. Klonlama işlemi, reprogramming problemleri yüzünden implantasyon ve yaşama başlama aşamasında birçok klonun ölümü ve anormalili kolonlar doğmasından dolayı çok efektif değildir. Bu yüzden iyileştirmek amaçlı hastaya özel kök hücre yapımında reprogramming hatalarını belirlemek önem kazanıyor. Klonlanmış canlı normal görünse de, SCNT'de fenotipik olmayan defektler yüzünden embriyo gen ekspresyonunda anormallik, telomer elongasyonu, yetişkinde obezite, bozulmuş immün sistem ve kansere yatkınlık gibi anormallikler barındırabiliyordı. Gelişim defektleri, epigenetik hafızanın silinmesindeki yetersizlikten, DNA sekanslarındaki değişime bağlı olmayan gen ekspresyonlarının kalıtımsal etkilerinden, genomik reprogramminge bağlı problemlerden dolayı ortaya çıkıyordu. Bunların üstesinden gelmek için oosit aktivasyonu, enükleasyon zamanının değişimi, sitokinez inhibisyonu ve nükleer enjeksiyon yerine hücre füzyonu kullanmak gibi testler yapıldı ancak bunların sadece klon oluşturma sıklığını arttırdığı görüldü. Bu bulgular yeniden programlamanın, hücre tipine, gelişim basamağına ve epigenetik faktörlere bağlı olduğunu gösterir. Epigenetik faktörler, gen ekspresyonunda DNA metilasyonu, histon modifikasyonu ve yerdeğiştirmesi ve ATP bağımlı kromatin modelleri dahil paternlerin devamlılığını sağlayan faktörlerdir.

Hücre Füzyonu: Hücre füzyonu 2 ya da fazla hücrenin tek bir birliktelikte birleşmesidir. İki hücre birleştikten sonra ya hibrit ya heterokaryon oluşturur. Birleşim sonrası proliferasyon görülüyorsa hibrittirler, bölünme sırasında kromozom miktarı 4n'e çıkar.

hükök Eğer karışık türlerin hibritleri oluşturulduysa kromozom kayıp ve rearanjmanıyla aneuploidi görülebilir, ancak aynı türlerse euploidi korunur. Heterokaryonlar ise bölünmez, çok çekirdekli-kısa ömürlü hücreler olarak kalırlar. Kromozom kaybı yoktur, çekirdekler ayrı ama etkileşim içindedir ; bu da mixed türlerin oluşturduğu heterokaryonlar için her iki çekirdeğin de gen ürünlerinin ayırt edilebilmesini sağlar. Bu yapılar nukleus oranına göre istenilen hücre türüne farklandırılabilir. Heterokaryonlar ideal olarak reprogrammingin erken moleküler evrelerini incelemede uygundur. Hibritlerde ise çoğalma nedeniyle erken gen ekspresyonları değerlendirilemiyor. Füzyon çalışmaları, 1960'ların sonunda bir genomun diğerine etkisi ve bu şekilde fare fibroblastının, hamster melanositi ya da hepatositi ile birleşmesi sırasında melanin ve tirozin aminotransferaz sentezinin gerçekleştiğini dolayısıyla sadece cis çalışan DNA elementlerince değil, trans çalışan represörlerce de kontrol edildiğini kanıtladı. Birkaç yıl sonra kanser olmayan hücreler ve tümör hücreleri füzyona uğratılınca normal hücre tümör hücresini domine etti ve tümör süpresör proteinlerin varlığının anlaşılmasını sağladı. Cell fusion ile bundan sonra memeli hücrelerinin fixe olmadığı, hücrelerin içinde bulundukları durumu korumaları için devamlı regülatör etkinin gerektiği eklendi. Birçok çalışmada, önceden bir hücre tipinde sessiz olan gen aktive olmuştu ancak füzyonda hibritler ayırt edilemediği için kromozom düzenlenmesi olduğundan, çoğalabilir hibrit kullanılarak gözlenen ekspresyonun, represör genin inaktivasyonundan mı yoksa aktivatör genin aktivasyonundan mı değiştiği kesin değildi. Hibritte gözlenen rearanjman problemini 1983'te HMB heterokaryonlarla çözdü. Önceden sessiz olan genlerin heterokaryonlar oluşturarak aktive edilebileceğini ve çekirdekler ayrı kalıp etkileşimde

derleme olduğundan, reprogramlamanın hesaplanabilir duruma geldiğini kanıtladı. İlk başarılı deneyde multinukleuslu (hücre bölünmesini önlemek ve gen dozajını arttırmak amaçlı) ve post mitotik fare kas hücreleri, füzyon partneri olarak da plastisitesi çok yüksek olan insan amniyon hücreleri birleştirildi. Oluşan heterokaryonlarda kas hücresi olmayan amniyotik hücreden kas genleri aktive edildi, insan kas proteinleri eksprese oldu. Sonrasında fare kas sinsityasının, insan fibroblastı (mezoderm), hepatositi (endoderm) ve keratinositi (ektoderm) ile heterokaryonları yapıldı; her 3 germ yaprağı kökenli hücreden de kas geni aktivasyonu gözlendi. Devamında, kas hücresi için geçerli olan aktivasyon diğer hücre türleri için de bulundu (eritroid ve hepatosit sprsifik genler fibroblast kökenli heterokaryonlarda aktive oldu). Beraberce bu çalışmalar değişik hücre tiplerinin başka hücre tiplerince indüklenmesiyle in vivoda bile gen ekspresyonunun değişebileceğini, hücrelerin geridönüşümsüz bir şekilde farklanmadıklarını gösterdi. Füzyon deneylerinde, farklı somatik hücrelerle, embriyonik karsinoma hücreleri,ES hücreleri ve EG hücrelerinin hibritleri, parental embriyonik hücrelerle bir çok özelliği paylaşarak, bu füzyon ürünlerinde pluripotent fenotipin baskın olduğunu kanıtladı. Pluripotans genlerinin aktivasyonunu sağlamak için hibrit çalışmaları aneuploidinin önlenmesi amacıyla aynı türler kullanılarak yapıldı. Tada, Surani ve meslektaşları, dişi embriyonik germ hücrelerini yetişkin fare timositleriyle birleştirince oluşan tetraploid hücrelerin pluripotent olduğunu buldular.Daha sonra somatik hücrelerle kök hücreleri – ki kök hücre füzyon partneri olarak germ hücresinden farklıdır, tetraploid hücrede imprinted genler demetile değildi- birleştirince somatik hücrelerin hibritlerinde pluripotent özellik kazanabileceğine moleküler bir kanıt gösterdiler.

23 mayıs 2012 7

derleme

hükök

(Erkek fare kök hücresiyle, dişi fare timositleri birleşince inaktif X kromozomu aktifleşiyor ve normalde kök hücrelerde bulunan 'Oct 4 GPF reporter'ı timositte aktif hale geliyor). Devamında aynı araştırma grubu alt türler arasında hibrit oluşturdu, somatik genomun ES ile hibritlerinin pluripotent halde korunduğuna dair kanıtlar(histon metillenmesi) elde ettiler. Cavan ve meslektaşları bu işi, insan somatik hücreleriyle genişlettiler. Smith ve meslektaşları da farede Nanog'un (pluripotans transkripsiyon faktörünü kodlar) reprog-rammingde oluştuğunu gözlemlediler.Bu deneyler, açıkça, proliferasyon sonrası pluripotans regülatörlerinin, farklılaşma regülatörlerine baskın olduğunu kanıtladı. Heterokaryonlarda ise bölünme olmadan büyüme, pluripotansın kaybolacağı beklentisini doğuruyordu. Ancak insan B hücreleri ve fare ES hücreleriyle yapılan deneyler, 1 gün içinde Oct4 ve Nanog'un aktive olduğunu ve promotörlerin demetile olduklarını gösterdi. Pluripoteansın etkin olması heterokaryon oluştururken kullanılan hücrenin tipine-özellikle farklı türler seçimi önemli(resim)-gen aktivasyonu ve DNA metilasyonu gözlemleme zamanına bağlıdır. Heterokaryonlar reprogrammingin başlamasındaki moleküler mekanizmaların açıklanmasında hibritlerden daha uygundurlar. Örneğin HMB ve meslektaşları, heterokaryon kullanımında, AID'in (sitozin rezidülerini deamine eden enzim) pluripotans reprogramming indüksiyonunda önemli bir rolü olduğunu açıkladı. Füzyon metodunda yeniden programlanmakta olan hücrelerin tetraploidisi ve büyük ölçüde genomik kararsızlık riskinden ötürü hücre terapisinde kullanmakta kusurlar çıkıyor. Bu yaklaşım klinik açıdan kullanışlı hücre üretiminde uygun değildir fakat yeniden programlamanın moleküler mekanizmasının aydınlatılmasında önem taşır. Bu çalışmalar, hücre füzyonundaki engelleri çözmeyi ve başarılı bir reprogramming gerçekleştirmeyi araştırmayı sağlar.

Transkripsiyon Faktör Transdüksiyonu: Bu yaklaşım retrovirüsler kullanılarak (başka yöntemler de geliştirildi) pluripotent hücrelere özel transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin overekspresyonu ile hücrenin pluripotent özellik kazanarak, kök hücre benzeri iPS hücreleri üretimini tanımlar. iPS hücreleri ve embriyonik kök hücreler oldukça benzer-ancak farklılıkları konusundaki çalışmalar devam etmekte-, uygun

24 mayıs 2012

koşullarda nerdeyse tüm hücre tiplerine farklanabilen ve aynı zamanda kendilerini de yenileyebilen hücrelerdir. Bu iki hücre tipi üzerindeki çalışmalarla reprogramming oluşumunu açıklayabiliriz. Embriyonik ES'nin tersine iPS hücreleri erken embriyoya zarar vermeyi gerektirmez bu yüzden etik ve immunolojik sorunlar olan durumlarda doku tamirinde kullanılabilir. Dahası, bu hücreler hastanın kanından alındığından ilaç adaylarını göstermek ve insan hastalıklarını modellemede araştırıcıya yardımcıdır. Transkripsiyon faktörleri üzerinden gidilen çalışmalarla somatik bir hücreyi başka bir somatik hücreye çevirmek mümkündür. İlk olarak 1987'de Gehring, hücrenin kaderinin tek bir doku spesifik transkripsiyon faktörü overexpresyonu ile değişebileceğini kanıtladı. D.Melanogaster larvasında homeotik bir genin overexpresyonu ile heat shock gen promotörünün kontrolü altında anten yerine bacak oluşumunu gösterdi. 10 sene sonra “eyelass”in (farede Pax 6)ektopik ekspresyonu ile bacakta antende ve kanatta fonksiyonel bir göz oluşumunu sağladı. Yine 1987'de Weintraub farede ilk master regülatör transkripsiyon faktörünü buldu. MYOD proteini ile myojenik kökenli fenotipik değişim gerçekleştirilebileceğini ispatladı. 1979'da John ve Taylor, fibroblast kültüründeki flamentöz yapıları demetile eden anti-kanser ajanı(5-azacytidin) ile muamele ettiğinde sinsityal miyotüpler oluştuğunu buldu. 2004'te Graf,farede C/EBP ailesi transkripsiyon faktörünün lenfositten makrofaja dönüşümde rol aldığını gösterdi.Bu şekilde transkripsiyon faktörlerince indüklenen trans differansiyasyona bakarsak, memelilerde de-

hükök ğişimin, yakın hücre tiplerine fenotipik değişim şeklinde olduğunu, dolayısıyla transkripsiyon faktörlerinin etkisinin bağlama bağlı olduğu düşünülmelidir. Bu yaklaşımla somatik hücrelerin pluripotent hücreye dönüştürülmesi düşünüldüğünde son 6 yıla kadar mekanizmanın çok kompleks belki de yüzlerce gen tarafından kontrol edildiği düşünülüyordu. Sonradan S.Yamanaka 24 tane pluripotans ile ilgili gen trandüksiyonu sonucu hücrenin pluripotent olacağı hipotezinden yola çıkarak, retroviral vektörlerle ES den elde edilen 24 genlik mini komplementer DNA yı, fare embriyonik ve yetişkin hücrelerine taşıdı(2006) ve Fbx 15 aktif(ES hücrelerine özel bir gen), büyüme özellikleri,gen ekspresyon özellikleri ES hücreleriyle aynı klonlar(iPS hücreleri) elde etti. Bu klonlar fare içine enjekte edildiğinde pluripotanslarını belli edecek şekilde teratom oluşturabiliyorlardı ancak kimerik canlılar oluşturamıyorlardı. Faktörlerin katkısı belirlenmek istendiğinde, -Oct4,SOX2,KFL4 ve cMYC - 4 faktörün hücreyi pluripotent yaptığı anlaşıldı. (Oct4 ve SOX2, hücrenin pluripotent olarak devamlılığını sağlar ve diğer 2 faktöre oranla etkileri daha belirgin ve vazgeçilmezdir. cMYC; bir proto-oncogendir.Hücrede proliferasyon, büyüme, farklılanma ve apopitosisle ilgili genleri kontrol eder. Aşırı miktarı, tümör oluşumu ve kanserle ilgilidir. Klf-4;proliferasyon, differansiyasyon ve hücre siklusunu kontrol eder. Olay şu şekilde gerçekleşir: Transgenler hücrenin genomuna entegre oluyor, böylece transgenlerin uzun süre ekspresyonu sağlanıyor. Sonra bu genlerden sentezlenen 4 transkripsiyon faktörü,DNA üzerine bağlanıyor ve normalde diferansiye olmuş hücrede eksprese olmayan genlerin transkripsiyonunu kontrol ediyor, bir transkripsiyon kaskadını indüklüyor. Bir periyod sonrası fibroblastın gen ekspresyon profili değişiyor ve pluripotent kök hücrede eksprese olan genleri eksprese etmeye başlıyor. Aynı zamanda yeniden programlanmış hücreler morfolojik değişiklikler geçiriyor.Embriyonik kök hücrelerin gelişimi gibi sıkıca toplanmış koloniler şeklinde büyüyor. Bu kolonilerin oluşumu reprogrammingin gerçekleştiğinin kanıtıdır.) Takip eden çalışmalarla 1 yıl içinde insan iPS hücreleri de elde edildi(2007). 2006'daki ilk deneyde Fbx15 aktif hücrelerin pluripotent durumlarını korumak için viral transdüksiyon ile Oct4 ve Sox2 ekspresyonunun devamlılığı şarttı, çünkü endojen Oct4 ve Nanog genlerinin ekspresyonu sağlanamamıştı.Bu yüzden

derleme Fbx15-iPS hücrelerin tamamlanmamış reprogramming gerçekleştirdiği söyleniyordu. Nanog ve Oct4 endojen genlerinin aktivasyonu ile tam reprogramming gerçekleştirildi. (Bu durumda faktörü kodlayan transgenler sadece iPS hücresinin üretim aşamasında bulunur, hücreler oluştuktan sonra retroviral transgenler sessizleşiyor ve endojen genler faktörleri kodlamaya devam ediyor. Böylelikle iPS hücrelerinin kendini yenilenmesi ve pluripotent özelliğinin devamı sağlanıyor. Bundan yola çıkarak, iPS hücrelerinin neredeyse tamamlanmış bir reprogramming geçirdiği önce sürülür.) İps hücrelerinin izolasyonu, retrovirüs ile onkogen transdüksiyonuna ve madde bağımlı Fbx15,Oct4 veya Nanog aktivasyonu seçilimine dayanıyordu. Bu iki deneysel gereklilik sırasında in vitroda fareler üzerinde yapılan deneyler kanserle sonuçlanıyordu. Tehlike ilerleyen çalışmalarla aşıldı.Örneğin, 2007'de fare ve insanda iPS hücrelerinin cMYC'nin over ekspresyonu olmadan da üretilebileceğini (ancak 4lü kombinasyon kadar efektif bir sonuç alınmadan ve ileri aşamaların soru işaretleri devam ederek) kanıtlandı.Bu durumda hangi faktörler gerekiyordu? C-myc nin etkileri olduğu aşikardı ancak çıkarılabilirdi de.Şimdi araştırmacılar farklı faktörler ve belirli küçük moleküllerle değiştirilebileceği konusunda çalışmalar yapıyorlar ancak anahtar faktörler-Oct4 gibi- çıkarılayamayacağı kesin bulgu olarak korunuyordu. Ayrıca reprogrammingde başka faktörlerin de önemi örneğin, hipoksik çevrenin ve vitC'nin verimi arttırdığını kanıtlandı.Tümör supresor protein p53 ile sinyal yolağı bozulduğunda yine verim artıyordu. MicroRNA'ların da reprogrammingde pozitif etkileri tanımlandı. Daha da ileri çalışmalarda iPS hastalıklar doku oluşumları üzerine gidildi. Günümüzde de çalışmaları devam etmekte. 3'lü değerlendirme: 3 metodun birbiriyle farklılıkları belirgindir ancak sonuçları sinerjisttir. Bunları karşılaştırmak bazı mekanizmaları ve genel özellikleri (pluripotans gen promotörlerinin demetilasyonu, Oct4 ve Nanog'un aktivasyonu ve ES hücre spesifik gen dizilimi gibi) ortaya çıkarır.Her durumda, regülatör dengesi pluripotansı teşvik ediyorsa epigenom değişir ve pluripotent özelliği sağlayan proteinlerin regülasyonu olur. Bunu pluripotent durumun korunması için feed back loopları ve pluripotansın pozitif ve negatif transkripsiyon regülatörlerinin(oct4 gibi) otoregülasyonu takip eder. Yine her 3 durumda bazı somatik hücre tipleri diğerlerinden daha kolay reprogramlanır ve hepsi için DNA demetilasyonu

25 mayıs 2012 7

derleme

hükök

Genel bakış: Reprogramming hikayesi renkli ve yaklaşık 50 yıllık genç bir süreçtir. Aşağıdaki, tabloda yukarıda anlatılanların toplu kronolojik sırası gösterilmiştir

*Ayrıca 2008'de Parkinson ve ALS hastalığı araştırmalara dahil edilmiş.2009'da virüsler yerine DNA kasetlerinin ve sonrasında, genlerin taşınımı yerine Yamanaka faktörleri ile kodlanmış proteinlerin kullanılabileceği bulunmuş.iPS hücreleri fare yapmış ve p53 ün reprogrammingdeki etkisi bulunmuş. şarttır. Teknik açıdan bazı farklar gösterirler (pluripotans geninin indüksiyonunun etkinliği, reprogramming için gereken zaman gibi) Farkları, reprogramming mekanizmalarının açıklanması ve tedavi amaçlı ele alınabilir. Nükleer transfer, hızlı reprogramming, embriyonik gelişimin prensiplerinin aydınlatılması ve reprodüktif biyolojide ES hücre verimini sağlamak için uygundur. Cell fusion, reprogrammingin başlangıç nükleer mekanizmasının aydınlatılmasında uygundur ama tedavi amaçlı hücre üretiminde sınıfta kalır. Pratik amaç için (hastalıkların mekanizmalarının , ilaç çalışmaları, hücre terapisinde) temini de rahat olan traskripsiyon faktör transdüksiyonu kullanılır. Başka bir farkları da reprogramming sırasında altlarında yatan mekanizmalardır ve geliştirilmeye devam edilmektedir. Örneğin, iPS hücrelerinin oluşumu için bir pasif DNA de-metilasyon mekanizması önerildi. Bu mekanizmada hücreler yayıldıkça de-metillenmeye devam ediyor, DNA replikasyonu sonrası metilasyon devamlılığını koruyamıyor. Buna karşın AID ile düzenlenilen ve replikasyondan bağımsız aktif de-metilasyon mekanizmasında; nuclear transfer sonrası heterokaryonlardaki gibi hücre bölünmesi ve DNA replikasyonu varlığında pluripotans genleri aktive oluyor ve promotörleri de-metilleniyor. Gelecek çalışmalar reprogramming mekanizmalarının ve hücre farklılaşmasının açıklamasının geliştirecek,

26 mayıs 2012

reprogrammingin pratik alanda kullanımına katkı sağlayacak ve böylece in vitroda hastalıklar modellenebilecek, terapatik ajanların araştırılması sağlanabilecek. Şimdiye kadar pek çok araştırmacı pluripotent hücreye dönüşümü araştırdı, yakın zamanda ise bazı araştırmacılar daha sınırlanmış olan multipotent hücreye dönüşüme odaklandı. Reprogramming çalışmaları hızla devam edecek.

hükök

derleme

Referanslar: 1. Shinya Yamanaka and Helen M. Blau Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Nature. 2010 June 10; 465(7299): 704–712. 2. Jaenisch R, Hochedlinger K, Eggan K. Nuclear cloning, epigenetic reprogramming and cellular differentiation. Novartis Found Symp. 2005;265:107-18; discussion 11828. 3. Rideout WM 3rd, Eggan K, Jaenisch R.Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome.Science. 2001 Aug 10;293(5532):1093-8. 4.Yang X, et al. Nuclear reprogramming of cloned embryos and its implications for therapeutic cloning.Nature Genet 2007;39:295–302. [PubMed: 17325680] 5. Morgan HD, Santos F, Green K, Dean W, Reik W.Epigenetic reprogramming in mammals.Hum Mol Genet. 2005 Apr 15;14 Spec No 1:R47-58. 6. Blau HM, et al. Plasticity of the differentiated state. Science 1985;230:758–766. [PubMed: 2414846] 7.Blau HM, Baltimore D. Differentiation requires continuous regulation. J. Cell Biol 1991;112:781–783. [PubMed: 1999456] 8. Rudolf Jaenisch and Richard Young Stem Cells, the Molecular Circuitry of Pluripotency and Nuclear Reprogramming j.cell.567-582 9. Rideout WM, Eggan K, Jaenisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 2001;293:1093–1098. [PubMed: 11498580] 10. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006;126:663–676.

27 mayıs 2012 7

hükök

MAKALE Yamanaka'nın Hayatı ve Yeniden Programlama Elif Haznedaroğlu Yamanaka'nın pluripotent hücreler konusundaki çalışmalarından önce difere olmuş hücrelerin embriyonik kök hücre füzyonu ya da nükleer içerik transferiyle embriyo- benzeri bir duruma getirilebilecekleri biliniyordu. Fakat hangi faktörlerin bu durumu gerçekleştirebilecekleri konusunda pek fazla bilgi yoktu.

Shinya Yamanaka, Kobe Üniversitesinden 1987'de MD ünvanını, Osaka City Üniversitesinden 1993'de PhD'sini aldı. Osaka hastanesinde ortopedik cerrahi asistanlığından sonra San Francisco'daki Gladstone Enstitüsünde kardiyovasküler hastalıklar konusunda uzmanlaştı. Amerika dönüşünde “Post America Depression” diye tabir ettiği bir durumla karşı karşıyaydı, çünkü Japonya'da imkânları çok kısıtlıydı. Bilimde çığır açan çalışmasında farelerini kendi almak durumundaydı. 1999–2003 arasında Nara Teknoloji Enstitüsünde yardımcı doçent olarak, 2003–2010 arasında profesör olarak çalıştı. Şu anda Kyoto Üniversitesinde “iPS Hücre Araştırma ve Uygulama Merkezi” direktörlüğünü yapmakta. 2006'da fare fibroblastları, 2007'de insan fibroblastları üzerinde yaptığı çalışmalar bilim dünyasına iPS hücrelerini, ona ise birçok prestijli ödül ve saygınlık kazandırdı.

amanaka, öncelikle 2006'da fareler üzerinde yaptığı çalışmayla fare embriyonik veya yetişkin fibroblastlarından pluripotent hücre indüksiyonunu gösterdi, 4 faktör ile: Oct3/4, Sox2, cMyc ve Klf4. (embriyonik kök hücre kültür koşullarında) Induced pluripotent cell (iPS ) ismi konan bu hücreler embriyonik kök hücrelerin morfolojisini ve büyüme özelliklerini gösterirken embriyonik kök hücre marker genlerini de taşıyorlar. Memelinin iç hücre blastosistinden elde edilen embriyonik kök hücreler (ESc) pluripotentliği korurken süresiz olarak gelişerek üç germ yaprağına da farklanabilme özelliğine sahiptiler. Yamanaka bu çalışmasında

28 mayıs 2012

hükök embriyonik kök hücrelerin oluşmasını sağlayan faktörlerin somatik hücrelerde de pluripotentliği sağlayıp sağlayamadığını anlamak için yola çıkmıştır. Oct3/4, Sox2 ve Nanog erken embriyolarda ve embriyonik kök hücrelerde pluripotentliği sağlayan transkripsiyon faktörlerindendir. Stat3, E-Ras, cmyc, Klf4 ve b-catenin de embriyonik kök hücrelerin hızlı proliferasyonunu ve fenotiplerini korumalarını sağlarlar. Yamanaka bu çalışmasında bu faktörlerin somatik hücrelerde pluripotentlik indüklemelerini araştırdı. 24 gen bu hipoteze göre aday faktörler olarak seçildi . Bu 24 aday geni geliştirmek için bir assay sistemi geliştirildi, Fbx15 geni üzerinden. Faktörler için teker teker koloniler yetiştirildi, ama Fbx15 geninin aktive olduğu hiçbir koloni gözlenmedi. 24 faktörün tümünün kullanıldığı kolonilerde ise bazı klonlarda embriyonik kök hücrelere benzer morfoloji gözlendi, yuvarlak hücre biçimi, büyük çekirdekçik, az sitoplâzma. Bölünme hızları da embriyonik kök hücrelerle benzerdi. Bu hücrelere iPS -MEF24 denildi, “fare embriyonik fibroblastlarından 24 faktörle indüklenen pluripotent kök hücreler”. Bu klonlar bazı embriyonik kök hücre markerlarını fenotipte gösteriyorlardı. Bu markerlardan bazıları demetile iken ( Fbx15, Nanog ) Oct3/4 metile durumdaydı. Bu bilgiler 24 faktörün bir çeşit kombinasyonunun MEF kültüründe embriyonik kök hücre markerlarını eksprese ettiğini gösteriyordu. Bundan sonra bu 24 aday arasından hangilerinin kritik olduğunu anlamak için bazı faktörler çekilerek deneyler yapıldı. Bu deneyler sonucunda 24 faktör kullanıldığında oluşandan daha çok ESc benzeri koloni üreten 10 faktör belirlendi. Bu 10 faktör arasında da aynı yöntem uygulanarak fare embriyonik fibroblastlarından iPS indüklemeyi sağlayan 4 transkripsiyon faktörü belirlendi: Oct3/4, Klf4, Sox2 ve c-Myc. Hiçbir iki faktör kombinasyonu Fbx15 lokusu aktif kolonileri oluşturamadı. Üç faktör kombinasyonları ise ya üretilemedi ya da embriyonik kök hücre morfoloji göstermediler. Sadece Oct3/4, Klf4, cMyc kombinasyonu ile Fbx15 lokusu aktif koloniler oluştu, ama bu koloniler morfoloji olarak iPS-MEF4 ve iPS-MEF10'dan farklılık gösterdiler.

makale uygulandı. Bu yöntem ile Ecat1 dışındaki marker genlerinin çoğunu taşıdığı anlaşıldı. iPS-MEF4 ve iPS-MEF10 hücrelerinin embriyonik kök hücrelere benzer olduğu, ama aynı olmadığı ortaya kondu bu deneylerle. iPS-MEF3 klonlarında Ecat1, Esg1 ve Sox2 genleri aktive değil, Nanog ise iPS-MEF4 ve iPS-MEF10'de olduğundan daha az olmak üzere indüklenmiş. Oct3/4 bazı iPS-MEF3 klonlarında zayıf aktive olmuş, bazılarında ise hiç aktive olmamış. E-Ras ve Fgf4 ise iPS-MEF3'de iPS-MEF4 ve iPS-MEF10'a göre daha fazla aktive olmuş. Bu bilgiler iPS-MEF3 hücrelerinin iPS-MEF4 ve iPS-MEF10'dan farklı olduğunu gösteriyor. Embriyonik kök hücreler, iPS hücreleri ve Fbx15 geni aktif olan fare embriyonik fibroblastlarının global gen ekspresyon profilleri DNA microarraylari kullanılarak karşılaştırıldı, bazı genlerin ise hem iPS hücrelerinde hem embriyonik kök hücrelerde daha sık upregüle olduğu tanındı. Bazı genler ise embriyonik kök hücrelerde daha fazla upregüle olmuştu. Bu bilgiler iPS hücrelerinin embriyonik kök hücrelere benzer olduğunu, ama aynı olmadığını doğrular nitelikte. Teratoma oluşumunda iPS hücrelerinin pluripotentlik özellikleri araştırıldı. “Nude” farelere deri altı enjeksiyon sonucunda 5 iPS-MEF10, 3 iPSMEF4, 1 iPS-MEF4wt ve 6 iPS-MEF3 klonunda tümor elde edildi. Histolojik gözlem sonucunda 2 iPS-MEF10 klonu, 2 iPS-MEF4 klonu ve iPSMEF4wt-4 klonunun üç germ yaprağına da farklandığı tespit edildi, nöral hücreler, kıkırdak dokusu ve prizmatik epitel dahil. iPS-MEF10-6 ve iPS-MEF10-1 dışındaki iPS-MEF10 kolonilerinde ve iPS-MEF4-10 kolonisinde ise farklanma gözlenmedi. Bu bilgiler çoğu iPS-MEF4 ve iPS-MEF10 kolonisinin, ama hepsinin değil, pluripotentlik gösterdiğini gösteriyor. Tersine, iPS-MEF3 kolonilerinin birçoğu difere olmadan kaldı. Bu da her ne kadar Oct3/4, c-Myc ve Klf4 embriyonik hücre markerlarını indüklüyor olsa da, pluripotentlik gösteremediklerini ifade ediyor. iPS-MEF10, iPS-MEF4 ve iPS-MEF3 hücreleri plastik kültür ortamında embriyonik cisimler oluşturdular, iPS-MEF10 ve iPS-MEF4 hücreleri ortamın tabanına bağlanarak farklanma gösterdiler, 3 günün sonunda immün boyama hücrelerde düz kas aktini (mezoderm markerı) , a-fetoprotein (endoderm

iPS hücrelerinde ES hücre markerlarının eksprese olup olmadığını araştırmak için RT-PCR yöntemi mayıs 2012 29

makale markerı) için pozitiflik tespit etti. iPS-MEF3 hücreleri ise gelatin kaplı ortamda bile diferasyona uğramadan kaldılar. Bu bilgiler iPS-MEF10 ve iPSMEF4 hücrelerinin pluripotentliği ile iPS-MEF3 hücrelerinin nullipotentliğini in vitro olarak doğrular nitelikteydi. Bundan sonra seçilen dört faktör dört adet 7 haftalık erkek Fbx15 aktif farenin kuyruk dibi fibroblastlarına sunuldu. 3 koloni elde edildi, hepsinden iPS hücresi elde edilebildi. Ayrıca bu faktörler 12 haftalık dişi Fbx15 aktif farenin kuyruk dibi fibroblastlarına da sunuldu. Elde edilen bilgiler yetişkin fare fibroblast kültüründen de seçilen 4 faktörle pluripotent hücre indüklenebileceğini gösterdi. Bundan sonra bu 4 faktörün ve diğerlerinin iPS hücrelerindeki ekspresyonu karakterize edildi. Gerçek zamanlı PCR Oct3/4 ve Sox2'nin endojen ekspresyonunun iPS hücrelerinde embriyonik kök hücrelere göre daha düşük olduğunu doğruladı. iPS hücrelerinde Nanog ve E-Ras proteinleri tespit edildi, ama embriyonik kök hücrelere göre daha düşük oranda. p53 seviyeleri de iPS hücrelerinde fare embriyonik fibroblastlarına göre daha düşük, embriyonik kök hücrelere eşitti. Southern Blot analizi her klonun kendine özel bir transgenik integrasyon şekli olduğunu gösterdi. iPS hücrelerinin kültürde feeder hücreleri olmayınca diferensiye olmamış şekilde kalamadıkları anlaşıldı. Bu ve farklı gen ekspresyonu patternleri iPS hücrelerinde önceden kalan ES hücrelerinin kontaminasyonu ihtimalini elimine etti. iPS hücrelerinin subklonları alkaline phospatase enzimi için pozitiflerdi ve in vitro olarak üç germ yaprağına farklanabiliyorlardı, bu da klonal doğalarını doğruluyordu. Oct3/4,Sox2 ve Nanog önceki çalışmalarda pluripotentliği korumak için kritik faktörler olarak gösterilmişti, ancak bu üçü arasından Oct3/4 ve Sox2'nin temel olduğu anlaşıldı bu çalışmada, şaşırtıcı olarak Nanog vazgeçilebilirdi. Buna ek olarak c-Myc ve Klf4 de esansiyel faktörlerdendi. CMyc proteininin proliferasyonu ve transformasyonu geliştiren birçok downstream hedefinin olduğu bilinmekteydi, bunlardan birçoğunun iPS hücrelerinin gelişiminde rolü olduğu düşünülmekte. Klf4'ün p53ü direk baskıladığı biliniyordu, p53 proteininin de Nanog'u baskıladığı bilinmekteydi. Bu yüzden Klf4'ün bu dönüşümdeki rolünün Nanog'un ve diğer ES-spesifik genlerin aktivasyonu olabileceği düşünülüyor. Başka bir teoriye göre de Klf4 Myc-indüklenen apoptosu önlemesi. Öbür

30 mayıs 2012

hükök yandan, Klf4 p21'i aktive ederek hücre proliferasyonunu baskılıyor. Klf4ün bu fonksiyonu p21'i baskılayan c-Myc tarafından inhibe edilebilir. Klf4 ve c-Myc'in dengesi bu yüzden iPS hücrelerinin oluşumunda önemli olabilir. Çalışmanın akılda bıraktığı bir soru iPS hücrelerin kökeniydi. Yapılan çalışmada multipotent doku kök hücrelerin iPS hücrelerinin orijini olmadığı anlaşıldı. iPS hücrelerinin dört faktör içeren retroviral vektörlerin varlığında in vitro ve in vivo olarak farklanabildiği anlaşıldı bu çalışmayla. Oct 3/4 ve Sox2 proteinlerinin miktarlarının in vitro farklanma sırasında oldukça azaldığı fark edildi. Ayrıca iPS hücrelerinin transgenlerin ve Nanog'un protein seviyelerini azaltan bir mekanizmaya sahip olduğu anlaşıldı. Bu mekanizma farklanırken de gelişebilir. Bu çalışmanın beklenmeyen bir verisi de Fgf4 ve Fbx15'in Oct3/4, Klf4 ve c-Myc kombinasyonu ile verimli aktivasyonu oldu, çünkü bu genlerin Oct3/4 ve Sox2 tarafından regüle edildiği gösterilmişti önceki çalışmalarda. Ayrıca Nanog'un iPS hücrelerinin indüksiyonu ve korunmasında vazgeçilebilir olması da şaşırtıcı oldu. 2006'daki bu çığır açan çalışmadan sonra akıllarda kalan en önemli soru tabi ki insanlarda da diferensiye olmuş hücrelerin faktörlerle pluripotent safhaya gelip gelemeyecekleri idi. Böyle bir buluş hastaya ya da hastalığa yönelik spesifik kök hücreler yaratılmasına olanak verecekti. Yamanaka yaptığı çalışmayla bunun olası olduğunu gösterdi: yetişkin insan dermal fibroblastlarından dört faktörle (Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc) indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPS) gelişimini ortaya koydu. Embriyonik kök hücrelerin özellikli tedavi için elde edilmeleri zor olduğundan iPS hücrelerinin bu tedaviler için kullanılmaları ve elde edilmeleri önemliydi. Daha önce yapılan çalışmada farelerden embriyonik fibroblast ve kuyruk-dibi fibroblastlarından dört faktör ile iPS hücrelerinin elde edildiği gösterilmişti. Bu çalışmada ise yetişkin insan somatik hücrelerinden retroviral transdüksiyon ve kültür koşullarında iPS hücrelerinin gelişmesi araştırıldı. Yetişkin insan dermal fibroblastlarında (HDF) transdüksiyon metodları optimize edildi, sonrasında insan Oct3/4, Sox2, Klf4 ve c-Myc içeren retrovirusler hazırlanan HDF'ye verildi. HDF 36 yaş-

hükök ında beyaz bir bayanın yüz dermisinden elde edilmişti. Transdüksiyondan 6 gün sonra feeder hücrelerin bulunduğu kültür kabına ekildi. Yaklaşık iki hafta sonra morfolojik olarak insan embriyonik kök hücrelerine (hES) benzemeyen granüllü koloniler belirdi. 25. gün civarında düz, hES hücre kolonilerini andıran koloniler gözlendi. 30.günde oluşan hES-benzeri koloniler toplandı ve disagrege edildi. Bu kolonilerin izole edilmesi zordu çünkü granüllü hücreler çok yoğundu. hES-benzeri hücreler feeder hücrelerin üzerinde artarak sıkıca paketlenmiş ve düz koloniler oluşturdular, bütün hücreler insan embriyonik kök hücrelere benzer morfoloji gösteriyorlardı, büyük çekirdek ve az sitoplâzma ile. Ayrıca bazı hücrelerde hES hücrelerinde olduğu gibi kendiliğinden diferansiyasyon gözlendi. Bu şekilde elde edilen hücrelere insan iPS hücreleri ismi konuldu. Genel olarak insan iPS hücreleri stage-spesifik embriyonik antijen ifade etmediler, buna karşılık hES hücre-spesifik yüzey antijenlerini eksperese ettiler. Ayrıca RT-PCR yöntemi birçok diferensiye olmamış ES hücre marker genini eksprese ettiklerini gösterdi. Western-blot yöntemi de OCT3/4, SOX2, NANOG, SALL4, E-CADHERIN ve hTERT protein seviyelerinin iPS hücreleri ile insan ES hücrelerinde benzer olduğunu gösterdi. DNA microarray analizleri de iki tip hücre arasındaki global gen ekspresyonu patternlerinin benzer olduğunu ama aynı olmadığını gösterdi. Bisülfit genomik sıralama analizleri Oct3/4, Rex1 ve Nanog gibi pluripotentlik ile ilgili genlerin fazlasıyla unmetile olduğunu ortaya çıkardı, yani bu promotorlar insan iPS hücrelerinde aktif. İnsan iPS hücreleri yüksek telomeraz aktivitesi gösterdiler. Eksponansiyel olarak en azından 4 ay boyunca prolifere oldular. Eşleşme zamanları da hES hücrelerinin eşleşme zamanlarına eşit bulundu. İnsan iPS hücrelerinin in vitro olarak farklanma kabiliyetleri test edildi, 8 gün sonra kültürde embriyoid yapılar oluşturdular. Bu top-şekilli yapılar 8 gün boyunca jelatin kaplı plakalara transfer edilip orada geliştirildi. Bu hücreler çeşitli morfolojiler gösterdiler. İmmunositokimyasal yöntemler ile hücrelerde bIII-tubulin (ektoderm marker), glial fibrillary acidic protein (GFAP, ektoderm), düz kas aktini (a-SMA, mezoderm), desmin (mezoderm), a-fetoprotein (AFP, endoderm) ve vimentin (mezoderm ve parietalen-

makale doderm) için pozitiflik tespit edildi. RT-PCR ile de teyit edildi. Bu bilgiler iPS hücrelerinin in vitro olarak üç germ yaprağına da farklanabildiklerini gösteriyor. Ayrıca PA6 hücreleriyle co-culture yapıldığında iPS hücrelerinin dopaminerjik nöronlar dâhil nöronal hücrelere farklanabildikleri gösterildi. İn vitro olarak kardiyak myositlerine de farklanabildikleri başka bir deneyde ortaya kondu. İn vivo pluripotentliği test etmek için insan iPS hücreleri immun eksikliği olan farelerin deri altına enjekte edildi. Enjeksiyondan dokuz hafta sonra tümör formasyonu gözlendi. Histolojik araştırma tümörün bağırsak benzeri epitelyal doku (endoderm), çizgili kas(mezoderm), kıkırdak (mezoderm), nöral doku(ektoderm) ve keratin içeren epidermal doku (ektoderm) taşıdığı fark edildi. İnsan iPS hücrelerinin genomik DNA'larında yapılan PCR dört retrovirüsün integrasyonunu gösterdi. 16 kısa tandem tekrar da insan iPS klonları ile parental HDF arasında tamamıyla eşleşti. Ayrıca kromozomal G–band analizi iPS hücrelerinin normal bir 46XX karyotipine sahip olduğunu gösterdi, bu da insan iPS hücrelerinin HDF'den elde edildiğini, çapraz kontaminasyona uğramadığını gösteriyor. iPS hücreleri fibroblastların yanında insan fibroblast-benzeri synoviosit (HFLS)'lerden de elde edildi. Bu hücreler 69 yaşında beyaz bir erkekten alındı ve HDF'den elde edilen iPS hücreleri gibi embriyonik kök hücre kolonilerine benzeyen koloniler oluştu, bunlar da üç germ yaprağına farklanabiliyorlardı. Sonuç olarak bu çalışmada iPS hücrelerinin yetişkin insan dermis fibroblastından ve başka somatik hücrelerden Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc faktörlerinin retroviral transdüksiyonu ile elde edilebildiği ortaya kondu. Bu hücreler morfoloji, proliferasyon, feeder bağlılığı, yüzey markerları, gen ekspresyonu, promotor ve telomeraz aktiviteleri, in vitro diferensiasyonları ve teratoma formasyonu açısından insan embriyonik kök hücrelerine benziyorlardı. Farelerde ve insanlarda iPS hücre oluşumu için aynı faktörler kullanılmasına rağmen pluripotentliği korumak için kullanılan ekstrinsik faktörler ve sinyaller farklıydı. Bu çalışma hasta ve hastalık-spesifik pluripotent kök hücreler için yeni bir sayfa açtı. Retroviral integrasyonun riskleriyle bile insan iPS hücreleri hastalık mekanizmalarını anlayabilmek, ilaç geliştirmek ve toksikoloji için kullanışlı olacağının işaretini verdi. Güvenlik mayıs 2012 31

makale konuları da aşıldıktan sonra insan iPS hücreleri rejeneratif tıp için kullanılabilir ve embriyonik kök hücrelerin yerini alabilir.

hükök KAYNAKLAR Takahashi (2007) Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. Yamanaka, S. & Takahashi, K. (2006) [Induction of pluripotent stem cells from mouse fibroblast cultures]. Tanpakushitsu Kakusan Koso, 51, 2346-2351.

32 mayıs 2012

hükök

MAKALE Yeniden Programlamanın Işığındaki Gelişmeler Ece Hocaoğlu

PS hücreleri tipik olarak olgun kök hücrelerden elde edildiği için embriyonik kök hücrelerin kullanımını kısıtlayan bazı etik tartışmalarını önler. Başarılı bir şekilde vücut hücrelerinden yeniden programlanan pluripotent nitelikteki hücreler hastaya ve hastalığa özgü kök hücre üretimine olanak sağlayabilir. Üretilen bu kök hücreler kısaca İPS(induced pluripotent stem cell) olarak adlandırılır. İnsan İPS hücreleri morfolojileri, çoğalmaları, yüzey antijenleri, gen ekspresyonları ve telomeraz aktiviteleri bakımından embriyonik kök hücrelerle benzerlik gösterirler. Aynı zamanda bu hücreler de embriyonik kök hücrelerdeki gibi teratom hücrelerine de dönüşebilmekte. Ancak yapılan çalışmalarda yeniden programlama Yamanaka faktörleriyle, retrovirüslerle gerçekleştirilmiştir. Memeli blastosistinin iç hücre kitlesinden elde edilen embriyonik kök hücreler hem pluripotent olma özelliğini korur hem de sınırsız olarak bölünme potansiyeline sahiptir. Bu eşsiz hücrelerin ,hastalıkların mekanizmalarını çözmekte,etkili ve güvenli ilaçları tespit etmemizde,çeşitli hastalıkların (omirilik yaralanması ve diabet gibi) ve yaralanmaları olan hastaların tedavisinde kullanılabilecek olması herkesi heycanlandırmaya başlamıştı ancak çeşitli etik sorunlarına bağlı olarak bahsettiklerimin uygulanması teorik olarak mümkün görülse de hayata geçirilememiştir. Çünkü bir insan embriyosunun embiyonik kök hücre(ES) kaynağı olarak kullanılması etik olarak büyük bir sorundur. Aynı zamanda hastaya veya hastalığa özgü embriyonik kök hücre üretilmesi çok zordur. Vücut hücrelerinin indüklenip,yeniden programlanmasıyla oluşan ploripotent nitelikteki hücrelerin bu sorunların üstesinden gelebileceği düşünülmektedir. Basit olarak etik sorununu ortadan

kaldırmaktalar. Bu nedenle son yıllarda yapılan çalışmaların çoğu vücut hücrelerinden üretilen İPS adı verilen bu kök hücrelerin oluşturulmasıyla ilgilenmekte. Aynı zamanda bu kök hücreler nadir bir hastalığı veya mutasyonu olan kişilerden de üretilebilir. Böylece bu hastalıkları yapay hücre ortamı olarak adlandırdığımız in vitro koşullarda da inceleyebiliriz. Daha sonra bu hastalıklar bu yapay ortamlarda anlamlandırılıp,tedavi geliştirilebilir. Çeşitli ilaçların etkisi araştırılabilir. Gelecekte iPS hücreleriyle yapılması öngörülen temel araştırmalar: iPS kolonilerinin genel olarak paylaşılımı yapılırsa, bu heyecan verici alandaki gelişim kolaylaşabilir. Bir İPS kolonisinin özellikle hangi özel çalışma için uygun olduğunu tahmin etmek imkansızdır. Yani bu hücreleri tedavi edici hücrelere mi dönüştürmeliyiz yoksa ilaçlara verilen cevapları mı incelemeliyiz bilemeyiz. Gelecekte araştırmacıların temel deneyleri klasik yöntemlerle, İPS ve türevleriyle gerçekleştirmek istemeleri olasıdır. Genom dizi taramasıyla hastalıkların patogenezi ve tedavisi hakkında yeni hedefler belirlemede yeni anlayışlar ortaya çıkabilir. İnsan kök hücrelerini insan olamayan canlıların beyinlerine enjekte ederek Parkinson,Alzheimer ve inme gibi hastalıklardaki yeni geliştirilen terapilerin klinik öncesi testleri bu canlılarda uygulanabilir. İPS hücreleriyle gelecekte yapılabilecek hassas araşırmalar: İPS hücreleriyle yapılabilecek transplantasyon ve reproductive araştırmaların gelecekte tartışmalı mayıs 2012 33

makale

hükök

olabileceği öngörülmekte. Çünkü bu araştırmaları yapmak için vücut hücresi vericilerinin izni İPS hücreleriyle yapılabilecek genel araştırmalar: gerekmekte ve bu vericilerin de buna karşı çıkacağı düşünülHücrelerin genetik modifikasyonu mekte. Şu anki tekniklerle İPS hücrelerinin insanlara nakli olaİPS hücrelerinin veya türevlerinin insan olmayan canlıların beyin de naksız çünkü ploripotentliği dahil olmak üzere organlarına enjekte edilmesi ortaya çıkarmak için hücrenin başka bir DNA'yla etkileşime Geniş genom dizi taraması geçmesi gerekli. Ancak genel olarak beklenen dışardan bir Hücre kolonilerinin diğer araştırmacılarla uygun gizlilik korumalarıyla DNAyla etkileşime girmeden paylaşılması önümüzdeki birkaç yıl içerisinde ploripotentliğin ortaya çıkarıBilimsel araştırmaları donörlerle hiçbir hak paylaşımı olmadan labileceği şeklinde. Bu şekilde patentlemek ve yeni ticari testler geliştirmek insanlara transplantasyonu mümkün olacağı düşünülüyor. İlk üretilen İPS hücreleri 24 adet liklere maruz kalabilirler. Örneğin, küçük plasmidfaktörle oluşturulmuştu. Ancak daha sonra yapılan lerle etkileşime girebilirler ya da kimyasallarla çalışmalarla 4 faktörle de bu hücrelerin uyarılmış mutasyonlar gerçekleşebilir.Bu nedenle oluşturabildiğini kanıtlamıştır. Bilim adamların de bu değişiklikleri saptamak için, İPS hücrelerinin ortak görüşü ne kadar az faktör kullanılırsa o kadar tam olarak dizi analizi yapılmalıdır. gerçek embriyonik kök hücre gibi hücreler üretilebileceği şeklinde. İleriki çalışmalar “İPS İnsanlara Nakli: hücreleri sadece OCT ¾ adı verilen ve pluripotentlik için büyük önemi saptanan bu faktörle üreteOrgan naklinde olduğu gibi vücut hücrelerini veren bilebilir mi?” sorusunu öne çıkarmakta. insanların bu araştırmalar için izni gerekmektedir. Bazı kişiler diğer insanların hayatını kurtarmak için Viral entegrasyon genellikle endojen genlerin böyle bir çalışmaya istekli bir şekilde izin verirken içinde yer alır ve gen aktivasyonuna neden olabilir. bazıları ise diğer insanların büyüyen bir parçası Bu nedenle bu şekilde üretilen hücreler, retrovirüs olamaktan çekinip izin vermek istemeyebilir. ve lentivirüslerle üretilen hücrelere göre daha az hücre güvenliğini sağlamakta. Yapılan iki çalışma Dokuyu alırken bu izni almamız gerekmekte. Bu viral entegrasyon olmadan İPSlerin üretilebiledokuyu İPS hücrelerine dönüştürüp organ elde ceğini göstermiştir. Son yapılan çalışmalarda etmemiz yıllar alabilir. Aynı zamanda, bu zaman adenoviruslerle, lentivirüslerle, plasmidlerle veya diliminde vericiler kanser olmuş olabilir veya transposonlarla da üretilebilecekleri gösterilmiştir. ailesindeki kanser öyküsü artmış olabilir. Transfer Plasmidlerle üretilen hücrelerin ise konak hücreedilecek hücrelerin taramasının yapılması alıcıların lerin genomuyla hiçbir etkileşim göstermediği PCR karşı karşıya kalabilecekleri riskleri saptamaya ve Southern Blotting tekniğiyle gösterilmiştir. yetmeyebilir. Kalıtsal olarak kalıtılan kanser Ancak bu şekillerde üretilen İPS hücrelerinin verimi türlenin tümü saptanamamıştır bu nedenle de çok düşüktür. tarama da yapsak tam olarak sonuç alamayabiliriz. İPS hücrelerini passajlara ekerek çoğaltabilir ve çok Viral entegrasyon olmadan bir de kimyasallar ya da sayıda hücre elde edebiliriz. Bu da bu hücrelerin küçük moleküller yardımıyla da İPS hücreleri gelecekteki risklerinin saptanmasının çok önemli üretilebilir. Birkaç çalışma grubu,bir veya iki olmasını sağlamakta. Çünkü eğer kalıtsal hastalık yeniden programlama faktörüyle yerdeğiştirebilen taşımayan bir İPS hücresi elde edilebilirse, bu hücre kimyasalları tanımlamıştır. Belki de sadece yeniden çoğaltılıp, transplantasyona ihtiyacı olan çoğu programlamada esansiyel görevi olan OCT3/4 adlı hastaya nakledilebilir. Bu nedenle de donör olan faktörün endojen genlerinin kimyasallarla sağlam kişilerin sürekli olarak tıbbi ve aile hikayeleri bir aktivasyonu yapıldığında İPS genlerini alınmalıdır. Bu tip çalışmalar da izinin kapsamına üretmede yeterli olacak.İPS hücrelerinin transgengirmelidir. lerle etkileşimi olmasa da başka genetik değişik-

34 mayıs 2012

hükök

makale

Reproduktif Çalışmalar: İnsan İPS hücreleri ilkel üreme hücrelerine sonra da olgun gametlere dönüştürülebilir. İPS hücrelerinden üretilen bu gametler gametogenesizi anlamak ve kısırlık tedavisi için bir potansiyel olabilirler. İPS hücrelerinden türeyen gametler somatik hücre vericisiyle aynı DNAyı taşır. Bazı insanlar yeni bir gamet yaratıp canlı oluşturmaya, doğal dengeyi bozduğunu düşünerek karşı çıkmakta. Ama bazıları da kısırlık tedavisinde çığır aşacağını düşündüğü için desteklemekte. Bu nedenle somatik hücre donörlerinin izni olmadan hiçbir çalışma yapılmamalıdır. Ancak etik olarak karşıt çok fazla görüş oluştuğu için bu çalışmaların yasaklanması istenmektedir.

mayıs 2012 35

tek sayfa

hükök

REVERS TRANSKRİPTAZ ve

Onur Can Zaim

RETROVİRÜSLER

ücrelere pluripotent özelliği kazandırmak veya başka hücrelere dönüştürmek amacıyla hücrelerin yeniden programlanmasında kullanılan bir teknoloji de retrovirüslerdir (eski adıyla RNA tümör virüsleri). Retrovirüsler, yapılarında RNA'dan cDNA oluşturabilecek revers transkriptaz (ters transkiptaz ya da RNA'ya bağlı DNA polimeraz) enzimi içeren RNA virüsleridir (RNA'dan revers transkriptaz enzimiyle oluşan DNA'ya cDNA denir.). Bu tür virüslerin en çok tanınmış olanlarından biri de HIV'dir (aynı zamanda bir lentivirüstür). Retrovirüslerin DNA'yı çoğaltma yolları uzun bir süre anlaşılamadı. İlk defa 1970'te birbirlerinden bağımsız olarak Wisconsin Üniversitesi'nden Howard Temin ve MIT'den David Baltimore, RNA tümör virüslerinde RNA'dan cDNA oluşturabilen bir enzim tanımladılar. Adı revers transkriptaz olan bu enzimin buluşu ile bu iki bilim adamı 1975'te Fizyoloji veya Tıp alanında Nobel Ödülü'nü İtalyan bir virolog olan Renato Dulbecco ile paylaştılar. Revers transkriptaz enziminin buluşu ile 1974 yılında Princeton Üniversitesi'nden Beatrice Mintz ve Rudolf Jaenisch (şu anda MIT'de) bir makale yayınlayarak, retrovirüslerin revers transkirptaz enzimi ile RNAlarından oluşmuş cDNAlarını, konak canlının genomuna entegre edebildiklerini ve bu sayede entegre edilmiş DNA'nın, konak canlının kendi DNA'sı gibi davranabildiğini (endojen DNA) ileri sürdüler. Jaenisch bu bilgiye dayanarak 1976 yılında, ilk transgenik fareleri üretti ve bunun bir fare retrovirüsünün fare eşey ana hücresine entegre edilmesinden kaynaklandığını göstermiş oldu. Retrovirüslerin, revers transkriptaz aktiviteleri dışında trandüksiyon (bir bakteri hücresinden bir bakteri hücresine veya dışarıdan bir bakteri hücresine virüsler yoluyla gen taşınması olayı) özellikleri de vardır.

36 mayıs 2012

Bir diğer teknoloji ise retrovirüslerin bu özelliğinden yararlanılarak, onları retroviral vektörler olarak kullanıp her türlü bölünebilen hücre içersine, çok rahat bir şekilde gen taşınması yapılabilmesidir. İlk defa 1984 yılında MIT'ye bağlı Whitehead Institude'de Constance Cepko ve Richard Mulligan retroviral vektörleri kullandılar. 1996 yılında Luigi Naldini ve ekibi bölünemeyen hücrelere de gen taşıyabilen, retroviridae familyasına ait lentivirüsleri, lentiviral vektörler olarak kullandılar. Günümüzde ise lentiviral vektörler, retroviral vektörler içinde en yaygın kullanılan cinstir. Hücrelerin yeniden programlanmasında ise transkripsiyon faktörlerinin taşınması için lentiviral vektörlerden yararlanılmaktadır.

hükök

MAKALE iPS Hücre Eldesinde Daha Etkili Bir Yöntem: RiPS Hücreleri Tolga Bacak

ilim her zaman olduğu gibi bugün de birikimli ilerlemeye devam ediyor. Son yıllarda kök hücre alanında yaşanan gelişmeler de bunun bir ispatı. Bilindiği üzere kök hücre araştırmaları tıp dünyasında büyük umutlar vaat ediyor fakat bu araştırmalarda embriyoların kullanılması da etik sorunları beraberinde getiriyor. 2006 yılında Yamanaka ve arkadaşlarının fibroblastlara 4 farklı transkripsiyon faktörüyle (KLF4, Cmyc, OCT4, SOX2(KMOS)) köklük özelliği kazandırmaları bu sorunların çözümü için atılan büyük bir adım oldu.(Takahashi et al. 2007; Takahashi and Yamanaka,2006) iPSC(Induced Pluripotent Stem Cell) adını alan bu hücreler hESC (Human Embryonic Stem Cell) benzeri yapılar olduğundan embriyoya gerek kalmadan erişkin hücrelerden pluripotent kök hücre elde edilmesine imkan tanıyabileceği düşüncesiyle son yıllarda kök hücre araştırmacılarının göz bebeği olmuş durumda. Bu araştırmacıların başında 2011 yılında TIME'S ın en etkili 100 insan listesinde yer alan ve halen Harvard Tıp Fakültesi Kök Hücre ve Rejeneratif Biyoloji Anabilim Dalında profesör olan Derrick J. Rossi geliyor. Bilindiği üzere Yamanaka ve arkadaşları fare ve insan hücrelerinde yapmış olduğu deneylerle fibroblastlara sadece 4 faktör vererek onlara köklük özelliği kazandırmıştı. Yamanaka bu faktörleri retrovirüsler aracılığıyla vermişti. Retrovirüsler revers transkriptaz enzimiyle RNA şeklinde olan genomlarını DNA ya çevirerek içine girdikleri hücrenin genomuna bu DNA parçasını ekleyen virüsler. Genomun istenmeyen yerlerine integre ola-

Derrick J. Rossi, PhD bilmeleri, protoonkogenleri onkogenlere dönüştürmeleri ve kansere neden olabilmeleri gibi bazı problemlere yol açtığından retrovirüslerin iPS hücre eldesinde kullanılmaları bilim camiasınca etkili bir yöntem olarak görülmedi. Bu durum bilim adamlarını daha etkili yollar aramaya sevk etti. Bazı bilim adamları retrovirüsler yerine adenovirüs ve plasmitleri denediler fakat genomik integrasyon olmamasına rağmen beklenen verimi alamadılar. mayıs 2012 37

makale Bazı bilim adamları ise transpozon vektörlerini ve sendai virüslerini denediler ve onlar da bekledikleri verimi alamadılar. Bazı bilim adamlarıysa fibroblastların köklük özelliği kazanması için gerekli faktörleri protein halinde verdiler fakat proteinler stabil kalamadığı için bu yöntem de etkisiz oldu. (Chang et al., 2009; Kaji et al., 2009; Okita et al., 2008; Stadtfeld et al., 2008; Woltjen et al., 2009; Yu et al., 2009; Kim et al., 2009; Zhou et al.,2009; Fusaki et al., 2009) Rossi ve arkadaşları işte tam da bu aşamada devreyi girdi ve bu faktörleri mRNA halinde vererek sentezletmeyi düşündüler. Sonuçta fibroblastlara köklük özelliği kazandıran Yamanaka'nın bulduğu transkripsiyon faktörleriydi ve bu faktörler protein yapıdaydılar. Rossi bu noktada santral dogmadan hareketle proteinden önceki basamak olan mRNAyı kullanmayı düşündü. Böylece genomik integrasyon olmayacak ve gerekli faktörler sentezlenecekti fakat bu işlemin immün sistem tarafından baskılanma sorunu vardı çünkü eğer mRNAyı direk olarak verselerdi hücre onu yabancı bir genom olarak algılayacak ve bu da immün sistemi tetikleyerek interferon cevabı oluşmasına yoaçacaktı. Rossi ve arkadaşları bu noktada türev bazlar kullanarak (5-metil-sitozin,psödoüridin,) ve immün sistemi baskılayarak (NF-kB bağımlı yol) in vitro transkripsiyonla bunu başardılar ve bu modifiye mRNA' yı hücrelere cationic lipid delivery vesicles ile endositozla ileterek RiPSC (RNA Induced Pluripotent Stem Cell) adını alan hücreleri elde ettiler. Ekspresyon kinetiğini sitometri ile takip ettiler ve 12-18 saat arasında maksimum ekspresyon ve hemen sonrasında hızlı azalma tespit ettiler. Ayrıca yaptıkları kontrollü çalışmalar sonucunda mRNA yönteminin klasik yönteme kıyasla 2 kat hızlı ve 100 kat daha etkili olduğu görüldü. Rossi ve arkadaşlarının çalışması “Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differantiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA” adıyla Cell Stem Cell Dergisinde 2010 yılında yayımlandı. RiPS hücreleri pluripotent özellik taşıması ve elde edilme yönteminin daha verimli olması nedeniyle rejeneratif tıp için büyük umut vaat ediyor. Rossi'nin çalışmasında ayrıca bu hücreler oluştuktan sonra bunların kas hücresi miyosite çevrilmesi (MYOD transkripsiyon faktörüyle) de bunun bir kanıtı. Rossi ayrıca buldukları yöntemin protein eksikliğinden kaynaklanan hastalıkların tedavisinde de işe yarayabileceğini belirtiyor. Devam eden her çalışma bilimin biriken zincirine bir

38 mayıs 2012

hükök halka daha ekleyeceğe benziyor.

Referanslar: 1. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differantiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA,2010 2. http://www.hsci.harvard.edu/newsroom/hsciresearchers-achieve-major-breakthrough-cellreprogramming 3. http://www.boston.com/news/health/blog/2010/09 /harvard_scienti_3.html 4. http://news.sciencemag.org/sciencenow/2010/09/ a- better-way-to-reprogram-cells.html

hükök

DERLEME mikroRNA Tarihçesi, Moleküler Özellikleri ve RNA İnterferansi İrem Ozarlı

ikroRNA lar yaklaşık 20 nükleotit uzunluğunda, kodlanmayan RNA(noncodingRNAs) başlığı altında incelediğimiz küçük, tek zincirli RNA parçalarıdır. Hedef mRNA'nın 3'-Translasyonu Olmayan Bölgesine (3'UnTranslated Region, UTR), 5'-Translasyonu Olmayan Bölgesine(5'UTR) ve hatta kodlanan bölgelerine bağlanarak, mRNA translasyonunu önler ya da mRNA yıkımına öncülük eder. Yani,miRNAlar post-transkripsiyonel olarak gen ekspresyonunu düzenleyen moleküllerdir. Hücrenin yaşamsal döngüsünde rol oynayan çeşitli önemli olayları (apoptoz, proliferasyon, diferansiyasyon, metastaz gibi) kodlayan genler dahil olmak üzere, miRNAlar kodlanan genomumuzun yaklaşık %30'unun regulasyonunda görev alırlar.

larva gelişiminde L1 evresinden L2 evresine geçişte gereklidir. Bu buluşun perde arkası ise şöyledir: 1987 yılında Ferguson ve arkadaşları C.Elegans'ta lin-14 geninde, anlamsız-lin-4 mutasyonu sonucu oluşan fenotipi geri döndüren bir baskılayıcı mutasyon keşfeder. Aslında, lin-14 genindeki anlamsız mutasyon sonucu oluşan fenotip, lin-4 genindeki anlamsız mutasyon sonucu oluşan fenotipin tam zıttıdır. Lin-4 ve lin-14 genlerindeki defektler sonucu ortaya çıkan bu ilginç fenotip zıtlığını açıklamak için şöyle bir hipotez ortaya atılır: Lin-4, lin-14'ün negatif kontrolünden sorumludur. 1989 yılında, Ambros ve Ruvkun lin-14 genini klonlamaya karar verirler ve tam bu noktada Ambros'un lin-4, Ruvkun'un lin-14 üzerine yoğunlaşmasıyla iki meslektaşın yolları ayrılırlar.

MİKRORNA'NIN TARİHÇESİ

ünümüzden 20 yıl öncesine kadar değil önemi, varlığından bile haberdar olmadığımız miRNA'nın tarihçesine ve gelişimine bakacak olursak; 1993 yılında Ambros ve Ruvkun adlı iki bilimadamı, bir nematod olan Caenorhabditis Elegans üzerinde yaptıkları deneyler sonucu ilk miRNA olarak kabul edilen Lin-4'ü keşfeder. Lin-4, etkileri izole edilen anlamsız-mutasyon sonucu anlaşılmış, heterokronik bir gendir. Lin-4 fonksiyon kaybı ile sonuçlanan mutasyonlara sahip hayvanların zamansal gelişimlerinde (bazı erişkin yapılarda eksiklik, yumurtlama yeteneğinde kayıp gibi) birtakım anomaliler gözlenmiştir. Ayrıca lin-4 aktivitesi,

Ambros, Lee ve Feinbaum ile birlikte; lin-4'ü içeren 700-baz çifti içeren bir fragment izole eder ancak başlangıç ve bitiş kodonlarını saptamakta bu kadar şanslı değildir. Yürüttükleri birtakım deneyler sonucu, lin-4 geninin open reading frame dizisinde mutasyonlar oluştururlar. Bu mutasyonlar sonucu fenotipte bir değişim beklerlerken tam tersi bir sonuç ile karşılaşırlar: Lin-4 fonksiyonu değişmemiştir. Buna dayanarak Ambros, lin-4'ün herhangi bir protein kodlamadığı sonucuna ulaşır. Diğer cephede, Ruvkun ile meslektaşları Wightman ve Ha, lin-14'ün post-transkripsiyonel aşamada baskılandığını ve lin-14 genindeki3'-translasyonu (3'-UTR) zamansal düzenleme için yeterli olduğu sonuçlarına ulaşır. mayıs 2012 39

derleme

hükök

Sonuç olarak, 1992 Haziranında, 2 grup henüz yayınlamadıkları bilgilerini birbirleriyle paylaşır ve ortak bir sonuca varırlar: lin-14 genindeki 3'translasyonu olmayan bölgedeki tekrarlanan sekanslarla lin-4 geninin transkriptleri birbirinin komplementeridir. Aralık 1993'te, Ambros ve Ruvkun'un Cell dergisine, birbirlerinden bağımsız olarak gönderdikleri makalelerinse anlattığı şudur: Küçük, protein kodlamayan transkript (lin-4), lin14'ün 3'UTR'sine bağlanarak, regulasyonundan sorumludur. 2000 yılında Reinhart ve arkadaşları; C.Elegans'ta, lin-4 gibi heterokronik bir gen ürünü olan let-7'yi keşfederler. Let-7, L4 evresinden erişkin evreye geçiş için gerekli olan 21 nükleotid içeren bir miRNA'dır. Let-7 aktivitesi kaybında, larvaya ait bazı özellikler yeniden ortaya çıkmakta; artmış let-7 aktivitesi sonucunda da erişkin evreye ait bazı özellikler erken dönemde gözlenmektedir. Mekanizma ise, lin-4&lin-14 birlikteliği ile oldukça benzerdir: Let-7, lin-41 genindeki 3'-translasyonu olmayan bölgede yakın yerleşimli 2 bölgenin regulasyonundan sorumludur. Let-7 geninin C.Elegans'ta keşfedilmesinin ardından yapılan araştırmalar göstermiştir ki, Let-7 sineklerden insanlara kadar çeşitli türler arasında korunmuştur. Bu sonuç, miRNA tarihinde bir kırılma noktası sayılabilir çünkü bu farkındalık ile birlikte diğer türlerde özellikle insanlarda miRNA çalışmaları başlar ve küçük-kodlanmayan RNAlar(small ncRNAs) haklı olarak kendi isimlerine kavuşurlar: mikroRNA. Günümüzde ise miRNA'lar başta kanser olmak üzere pek çok hastalığın etyopatogenezini anlamak adına çok önemli bir

yere sahiptir. Şimdiye kadar insanlarda ve diğer türlerde binlerce miRNA keşfedilmiş ve internet üzerinde de online miRNA sekans depoları (miRbase database gibi) oluşturulmuştur. miRNA fonksiyonel olarak “RNA İnterferansı” olarak tanımlanan bir gen baskılama mekanizmasının iki ana kahramanından biridir. Fonksiyonel özelliklerini ve önemini daha iyi kavrayabilmek adına RNAi'nin tarihsel gelişimi ve kısaca moleküler mekanizması üzerinde durmakta fayda vardır: RNA İNTERFERANSI

NA İnterferansı(RNAi),çift zincirli RNA'nın (dsRNA) hücreye girdiği zaman komplementer mRNA dizisinin parçalanmasına yol açması ile sonuçlanan transkripsiyon sonrası gen susturma mekanizmasıdır. RNAi, doğal bir mekanizmadır ve fonksiyonunun virüs kalıtım materyali ve transpozonlar gibi hareketli genetik elementlerin istilasına karşı genomu koruyarak hücresel savunma olduğu düşünülmektedir.Bugün RNA interferansı, modern biyolojide ve tıpta önemli gelişmelere yol açacak bir fenomen olarak düşünülmektedir ve RNAi, fonksiyonel genomik araştırmalarında üzerinde yoğun araştırmalar yapılan yeni bir alandır. RNAi, Science dergisi tarafından 2001'de “yılın molekülü” ve “2002 yılının en önemli bilimsel hamlesi” seçilmiştir. Yine 2006 yılında Andrew Z. Fire ve Craig C. Mello adlı araştırıcılar RNA interferans ile ilgili yaptıkları çalışmalarla Fizyoloji/Tıp alanında Nobel Ödülü almışlardır. RNAi TARİHÇESİ

Grafik. Yayın yılına göre yayınlanan miRNA sayısı dağılımı

40 mayıs 2012

1980li yılların başlarında Jorgensen ve arkadaşları, daha mor petunyalar elde etmek amacıyla, petunya bitkisine ekzojenik olarak petunyada pigmentasyondan sorumlu chalcone synthase(chs) enzimini kodlayan geni aktarırlar. Ancak beklenilenin aksine, daha mor petunyalar yerine morlu beyazlı, alacalı petunyalar elde etmeye başlarlar. Bunun üzerine, aktardıkları ekstra genin chs ekspresyonunu arttırmak yerine azalttığı sonucuna varırlar. İzole ettikleri nükleuslarla yaptıkları çalışmalar, sitozolik mRNA konsantrasyo-

hükök nunda herhangi bir azalma olmadığını gösterir ve sonrasında Jorgensen ve arkadaşları bu durumu açıklamak için Post-Transcriptional Gene Silencing-PTGS (transkripsiyon sonrası gen baskılama) ifadesini kullanırlar. Yürütülen deneyler sonucunda, belirtilmesi gereken bir diğer nokta da şudur; aktarılan transgen kendi ekspresyonunu baskılamakla kalmayıp, açıklanamayan bir mekanizma ile endojenik –orjinal- genin ekspresyonunu da etkiliyordu. Jorgensen ve arkadaşları bunu da co-supresyon şeklinde tanımlarlar. Daha sonra yapılan çalışmalarla gösterilir ki, transgenin ekspresyonu çift zincirli RNA(dsRNA) oluşumuna yol açmakta ve böylelikle PTGS/co-supresyon'u başlatmaktadır. Bitkilerde PTGS raporları birikirken, funguslarda gen baskılama üzerine ilk rapor 1992 yılında Pandit ve Russo isimli iki araştırmacıdan gelir. Aynı yıl, Romano ve Macino adlı iki araştırmacı, Pandit ve Russo gibi Neurospora crassa üzerinde yaptıkları

derleme Bitkilerde ve funguslarda gen baskılanmasının gösterilmesinin ardından, endojenik genin baskılanma mekanizmasını açıklayan yaygın görüş, transgenik antisense RNA'nın mRNA ile hibridize olarak translasyonu inhibe ettiği yönündedir. Ancak, 1995 yılında Guo ve Kempheus isimli araştırmacılar nematod türü bir solucan olan Caenorhabtidis elegans'ta gen ekspresyonunu baskılamak için sense RNA'nın da, antisense RNA kadar etkili olduğunu tespit ederler. Ardından yürüttükleri deneyler ile, dsRNA'nın gen ekspresyonunu baskılamada sense ve anti-sense RNA'ların tek başına gösterdikleri etkinin on katından daha fazla bir potansiyel etkiye sahip olduğunu gösterirler. Daha sonra, Craig Mello ve Andrew Fire, Ceanorhabditis elegans'ta dsRNA'nın gen ekspresyonunu spesifik ve selektif olarak inhibe ettiğini ilk defa deneysel olarak kanıtlarlar. Bu keşifler, RNA interferansı için bir kırılma noktası sayılabilir çünkü bu keşiflerden sonra, bahsettiğimiz PTGS, quelling ve antisense RNA ile gen baskılama mekanizmalarının aslında C.elegans'ta gösterilen RNAi'nin farklı mekanizmaları olduğu anlaşılır ve RNAi'nin tüm ökaryotlarda gözlenen doğal bir mekanizma olduğunu sonucuna varılır. Andrew Fire ve Craig Mello ise RNAi konusunda yaptıkları çalışmalar için 2006 yılında Nobel ödülü ile taçlandırılır. RNAi MEKANİZMASI Gen ifadesinin susturulmasını sağlayan RNAi yolakları, small interfering RNA (siRNA) ve mikro RNA (miRNA) adı verilen RNA parçacıkları aracılığıyla gerçekleşmektedir. Bu iki tür kodlamayan RNA'nın sentez ve olgunlaşma süreçleri ortak aşamalardan geçmekle beraber aralarında önemli farklılıklar vardır.

Şekil1.Petunia'da chs geninin ekspresyonunun baskılanması ile değişen pigmentasyon(1)

deneyler sonucu, Pandit&Russo ikilisinin "baskılamanın sadece transgenik sekanslarda olduğu" tezinin aksine baskılamanın transgenik ve endojenik sekanslar üzerinde olduğunu gösterirler ve Neurospora crassa'da gözlenen bu yeni fenomene quelling ismi verilir. 1994 yılında da Matzke isimli başka bir araştırmacı tarafından, Homology Dependent Gene Silencing-HDGS (Homolojiye Dayalı Gen Baskılama) ifadesi ortaya sürülür.

Başlangıç molekülü çoğunlukla, RNA bağımlı RNA polimerazın kalıp olarak endojen veya ekzojen kaynaklı bir RNA'yı kullanarak sentezlediği çift zincirli RNA'dır. miRNA için ise, RNA polimeraz II tarafından sentezlenen primer mRNA'nın intron bölgelerinde saç tokası şeklinde kıvrılıp eşleşmiş kısımlardır. Bu yolla transkripsiyon sonucu oluşan ilk miRNA molekülüne pri-miRNA adı verilir. Pri-miRNA molekülüne etki eden RNaz III grubu bir endonükleaz (Drosha), bu kıvrılmış RNA parçasını zincirin geri kalan kısmından ayırır ve böylelikle

41 mayıs 2012 7

derleme

hükök

pre-miRNA molekülü oluşur. Pre-miRNA çekirdek zarında bulunan özel bir taşıyıcı sistem ile sitoplazmaya taşınır.

mRNA'nın 3'-translasyonu olmayan bölgesindeki belirli nükleotidler ile (yani kısmen) eşleşebilmektedir.

Bu aşamadan sonra miRNA ve siRNA aynı işlemlerden geçer. Sitoplazmada bulunan diğer bir RNaz III enzimi (Dicer) ATP bağımlı bir etkileşim ile RNA'ya bağlanır ve önce RNA'nın ucundaki kıvrımlı kısmı koparır. Daha sonra dupleks RNA molekülünü helikaz aktivitesi ile açar ve 21-23 nükleotid uzunluğunda kısa RNA parçacıkları halinde keser. Dicer enzimi tarafından bu şekilde oluşturulan RNA'lar daha sonra yine ATP bağımlı bir biçimde RNA ile İndüklenen Susturum Kompleksine (RISC, RNA-induced silencing complex) aktarılır. RISC, RNA ve RNA bağlayan proteinlerden zengin bir komplekstir. Olgun siRNA veya miRNA zincirinin mRNA ile etkileşimi de RISC kompleksi içinde gerçekleşir. RISC yapısında bulunan substrat siRNA ise, hedef mRNA dizisiyle birebir eşleşir ve mRNA molekülü eşleşme bölgelerinden endonükleazlar ile kesilerek ortamdan uzaklaştırılır. Eğer RISC yapısında bulunan substrat miRNA ise, hedef

Doğada zaten var olan ve protein sentezi düzenlenmesiyle ilgili olan RNAi mekanizması, araştırma ve tedavi amaçlı olarak geniş bir uygulama alanına sahiptir. RNAi yolağında yer alan siRNA'ların hedef dizilerine mükemmel eşleşme göstermesi onları gen işlevinin araştırılmasına çok uygun araçlar haline getirir. RNAi uygulamaları bugüne kadar tedavileri sorunlu olan nörodejeneratif hastalıklara yeni bir yaklaşım sunmaktadır. siRNA uygulamaları genel olarak en iyi sonucu tek nükleotid polimorfizmlerine bağlı hastalıklarda göstermelerine rağmen uygulama alanı bu hastalıklarla sınırlı kalmamaktadır. IRNAi'NİN UYGULAMA ALANLARI Fonksiyonel genomik analiz Hedefe yönelik ilaçlar Transgenik hayvanlar

Ÿ · Ÿ · Ÿ ·

Şekil2. RNAi mekanizmasında rol alan miRNA ve siRNA'ların sentez ve etki yolakları(6)

42 mayıs 2012

derleme

hükök RNAi'nin tedavi edici etkisi ile ilgili deneysel çalışmalar: Başta kanser, otoimmun hastalıklar, infeksiyon hastalıkları, nörodejeneratif hastalıklar üzerine terepatik etkileri çalışılan RNAi'nin etkisinin gösterildiği bazı hastalıklar: Huntington Hastalığı, Alzheimer, ALF, Machado-Joseph Hastalığı, Parkinson, Hepatit B ve C, HIV/AIDS… Özetlemek gerekirse; miRNA, yer aldığı “RNAi” mekanizması sayesinde çeşitli hücresel olayların düzenlenmesinde rolü olan önemli bir moleküldür. Özellikle immün sistemin normal fonksiyon göstermesi için gerekli düzenleyici etkisi sayesinde otoimmün hastalıklar; onkogen ve tümör supressör genlerin üzerindeki düzenleyici etkisi sayesinde de kanser başta olmak üzere, çeşitli hastalıkların hedefe yönelik tedavisinde miRNA'nın yeni ufuklar açtığı ve açacağı süphesizdir.

Referanslar: 1. Carolyn Napoli, Christine Lemieux, Richard Jorgensen (1990). lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes In trans. The Plant Cell, 2, 279-289 2. Rosalind C. Lee, Rhonda L. Feinbaum, Victor Ambros (1993). The C. elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity to lin-14. Cell,75, 843-854 3. Annette S. Pickford, Caterina Catalanotto,Carlo Cogoni,and Giuseppe Macino(2000). Quelling in Neurospora crassa. 4. Ahmet Karagüzel, Ersan Kalay, Figen Celep(2007) RNA İnterferans (RNAi): Gen Sessizleştirilmesi veTedavi Edici Uygulamaları. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 33, 41-44 5. T F Duchaine, F J Slack (2009). –Rna Interference and MicroRNAOriented Therapy In Cancer: Rationales, Promises and Challenges. Current oncology Toronto Ont 16 (4) , 61-66 6. Ebru Bodur, Ediz Demirpençe(2010). Kodlamayan RNA'lar ve Gen Susturumu. Hacettepe Tıp Dergisi, 41, 82-89 7.Maria I Almeida, Rui M Reis, George A Calin (2011) MicroRNA history: Discovery, recent applications, and next frontiers. E-pub,Elsevier '11.

mayıs 2012 43

hükök

MAKALE iPSC Üretiminde Alternatif ve Yüksek Verimli Bir Yöntem: miRNA Kullanımı Yusuf Yıldırım

ök hücre araştırmalarında embryonal kök hücrelerin kullanılmasındaki ciddi kısıtlamalar bilim adamlarını diğer kaynaklara yöneltmiştir. Bugün kök hücre elde etme çalışmalarının büyük bir kısmı iPSC(induced pluripotent stem cell) üzerine yoğunlaşmaktadır. iPSC elde etmenin çeşitli yolları bulunmaktadır, standart prosedür ise fibroblastlara Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006) ' nin ekspresyonu sağlatılarak iPSC elde etmektir. Son dönemde sıklıkla adından söz ettiren yöntemlerden diğeri ise miRNA(micro RNA) kullanımıyla İPSC elde etmedir. MiRNA'lar gelişim ve diferansiyasyonun regülatörleridir ((Lee et al., 1993; Ruvkun,2001). Bu miRNA'lar embryonik kök hücrelerde(ESC) yoğun olarak bulunan ve ESC fenotipinin sağlanmasında etkin olan miRNA'lardır(Babiarz et al., 2008; Wang et al., 2007, 2008; Wang and Blelloch,2009;). ESC ve iPSC'lerde üretilen miRNA'lar arasında miR302/367'nin, Oct4 ve Sox2'nin doğrudan hedefi olduğu görülmektedir(Card et al., 2008). miR302/367 seviyesi ESC'nin erken embryonik gelişiminde Oct4 transkripsiyonuyla orantılıdır ve ESC'nin homeostazında ve pluripotent özelliğinin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır (Card et al., 2008). Pensilvanya Üniversitesi'nde yapılan araştırmalar gösteriyor ki bilinen PSC transkripsiyon faktörleri eksikliğinde dahi miR302/367 ekspresyonu fare ve insan hücrelerini iPSC'ye dönüştürmektedir. OSKM faktörleriyle birlikte kullanıldığında ise bu yöntem 2 kat daha etkili olmaktadır. Ayrıca bu çalışmada fare fibro-

44 mayıs 2012

blastlarının yeniden programlanmasında valproik asidin spesifik olarak Hdac2 proteinini parçaladığı için gerekli olduğu da gösterilmiştir. Bu yüzden miR302/367 ekspresyonu ve Hdac2 baskılanması bilinen herhangi bir yeniden programlama faktörü kullanmadan yapılan etkili bir iPSC üretici yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır.

Sonuçlar: miR302/367 fibroblastları iPSC ye yeniden programlar Bu araştırmacılar miR302/367 ekspresyonunun somatik hücreleri yeniden programlayabildiğini göstermek için miR302/367 genini farenin embyonik fibroblastına(MEF) enfekte edecek lentiviral vektörler oluştururlar. Bu deneye işlemi hızlandırması için VPA da eklerler. Şaşırtıcı bir şekilde işleme başladıktan 6-8 gün sonra ESC'ye benzer morfolojide hücreler elde ederler. Bu “klon”ların çoğu Oct4-GFP ve alkalin fosfataz pozitiftir. Bu klonlarda ayrıca Nanog, Sox2 ve SSEa1 ekspresyonu da gözlenmiştir. OSKM faktörleriyle bu yöntem karşılaştırıldığında bu yöntemin daha hızlı olduğu görülür çünkü OSKM faktörleriyle 6-8 günde herhangi bir şey elde edilememektedir. Ayrıca bu deney göstermektedir ki VPA eksikliğinde bu yöntem etkisiz kalmaktadır. Bu yöntemin etkinliğini ölçmek için dizilim analizi yapıldığında R1 ESC dizilimindeki global gen ekspresyonuyla çok büyük paralellik gözlenmiştir. Ayrıca fare kök hücreleriyle aynı gen ekspresyonuna sahip oldukları Q-PCR ile gösterilmiştir. Bu sonuçlar gösteriyor ki miR302/367 ve VPA

makale

hükök farenin embryonik fibroblastına herhangi bir yeniden programlama faktörü vermeden uyguladığımız zaman hızlı ve etkili bir şekilde iPSC elde etmekteyiz.

OSKM ile karşılaştırırsak: Eşit sayıda sünnet derisi fibroblastı ile yapılan deneylerde işleme başladıktan 18-26 gün sonrasında miR302/367 ile yeniden programlama ile oluşan embryonik kök hücreye benzeyen koloni sayısının OSKM faktörlerine göre 2 katı kadar daha fazla olduğu gözlenir. Yine farelerde yapılan deneylerde de gözlendiği gibi Q-PCR uygulandığı zaman miR302/367 ile yeniden programlanmış hücrelerde OSKM faktörleri uygulanmış olanlara nazaran çok daha fazla pluripotent özellikli gen ekspresyonu olduğu gözlenmiştir. Tüm bunlar göstermektedir ki miR302/367 ile yeniden programlama OSKM faktörlerine göre çok daha etkili bir yöntemdir.

etkinliğini görmek için sünnet derisi ve dermal fibroblastlara miR302/367 lentivirüsleri gönderirler. 12-14 gün içerisinde klasik insan ESC morfolojisinde klonlar elde ederler. İmmün boyama yöntemiyle ise OCT4, SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81 ekspresyonunu gözlerler. 3 farklı klon üzerinde Q-PCR uyguladıklarında ise insan ESC dizilimi HUES'e denk bir şekilde pluripotent özellikte marker ekspresyonu görürler. Bunların yanında miR302/367 ile yeniden programla ile üretilmiş insan hücre klonlar herhangi OSKM virüs tamamlayıcısı da içermemektedir. işin ilginç yanı, insan fibroblastları ile yeniden programlama yaparken VPA kullanmak gerekmemektedir ve bu durum herhangi bir performans düşüklüğüne yol açmamaktadır. 7 farklı miR302/367 ile yeniden programlanmış insan iPSC'si ile teratomlar oluşturulmuş ve 3 germ tabakasının da oluştuğu gözlenmiştir.

Yorum - Daha önce de belirtildiği gibi miR302/367 ile yeniden programlama OSKM faktörlerine göre daha hızlı bir yöntemdir. - miR302/367 ile yeniden programlamada OSKM faktörlerine göre 2 kat daha fazla iPSC elde edilmiştir - Deneyin 10. Gününde miR302/367 ile yeniden programlanan klonların %79.8'i Oct4-GFP içerirken OSKM faktörleri ile elde edilen klonların %50'sinde bu ekspresyon görülmüştür. Bu deneyler göstermektedir ki miR302/367 ile yeniden programlama OSKM faktörlerini kullanılarak yapılandan daha üstündür.

iPSC üretimi için şu an ki strateji birkaç pluripotent kök hücre faktörünün ekspresyonunu sağlatmaya dayalıdır. Fakat bu araştırmada tek bir miRNA grubunun, miR302/367, standart OSKM metodundan daha etkili bir şekilde fibroblastları yeniden programlayabildikleri görülmüştür. Devam eden avantajlarıyla miRNA'larla iPSC üretimi yalnızca yalnızca temel kök hücre çalışmalarında değil, geniş hasta popülasyonlarında da uygulanabilir.

Referanslar: 1. Highly Efficient miRNA-Mediated Repro-gramming of Mouse and Human Somatic Cells to Pluripotency

3 germ tabakalı teratom Pensilvanyalı araştırmacılar, miR302/367 ile yeniden programlama ile oluşturulan İPSC 'lerin pluripotent özelliklerini daha iyi karakteize etmek için bunlarla immün sistemi baskılanmış fareler üzerinde teratom oluştururlar. Yaptıkları deneyler sonucunda her üç germ tabakasından da dokuların elde edildiği gözlenmiştir.

İnsan üzerinde de Oskm'den iyi Pensilvanyalı araştırmacılar miR302/367 ile yeniden programlamanın fibroblastlarındaki mayıs 2012 45

tek sayfa

hükök

DNA

Merve Deniz Yılmaz

METİLASYONU

en ifadesinin düzenlenmesinde rol oynayan önemli bir olay, DNA bazlarına metil grubunun eklenmesi ya da bu bazlardan metil grubunun çıkarılmasıyla ortaya çıkan kimyasal değişikliktir. Birçok ökaryotik organizmanın DNA'sı, metil gruplarının enzim (DNA metiltransferaz) aracılığıyla bazlara eklenmesiyle replikasyondan sonra değiştirilir. Metillenme, DNA'daki CG çiftleri halinde bulunan sitozinlerden ve genellikle de her iki zincirde birden olur. Metilasyon, DNA dizisindeki guaninin önünde yerleşmiş sitozinlerin (CpG) 5. konumundaki karbonuna metil grubu bağlanması ile gerçekleşmekte ve bölgesel hipermetilasyon, promotor bölgede (gen ifadesini başlatan bölge) bulunan CpG adacıklarını etkileyerek genin aktivitesini durdurmaktadır. CpG adacıkları, sıklıkla promotor bölgeleri olarak işlev görürler ve ayrıca replikasyon başlangıç bölgeleri oldukları düşünülmektedir DNA metilasyonu gen ifadesini nasıl kontrol eder? Üç olası mekanizma ile özetlenebilir: 1-Metillenmiş promotor bölgelerine bağlana-bilen proteinlerin hedef dizilere (sekanslara) bağlanarak, esas bağlanması gereken transkripsiyon faktörlerinin buralara bağlanmasını engelleyerek, 2-Transkripsiyon faktörlerinin metillenmiş sitozine bağlanmasını engelleyerek, 3-Kromatin yapısını değiştirerek transkripsiyon miktarında bir değişim gerçekleştirerek . DNA metilasyonu, genomun önemli bir “epigenetik” modifikasyonudur. Epigenetik modifikas-

46 mayıs 2012

yon, genotipi değiştirmeden fenotipi etkileyen herhangi bir modifikasyon olarak tanımlanabilir. DNA metilasyonu, kalıtımla geçebilen, enzimatik bir işlemdir ve diyetle düzenlenebilir. Cinsiyet farklılaşmasını düzenleyen önemli olaylar örneğin; “genomik imprinting” (genlerin sadece paternal ya da sadece maternal olarak ifade edilmesi, paternal gen aktif ise maternal gen suskundur), Xkromozom inaktivasyonu ve embriyonik gelişim DNA metilasyonu ile ilişkilidir. Yapılan Çalışmalar: Metillenmenin gen ifadesinin düzenlenmesindeki rolü ile ilgili en kuvvetli bulgular baz anologları ile yapılan çalışmalardan elde edilmiştir. Bir baz anoloğu olan 5'-azasitidin nükleotiti, DNA› da sitozinin yerine girer ve bu molekül kimyasal olarak metillenemediği için, girdiği bölgelerde DNA'nın metillenmesi engellenir. 5'-azasitidinin DNA'ya katılması, gen ifadesi olayını değiştirir ve inaktif X kromozomu üzerindeki allellerin ifadesi uyarılır (Bird 2002). 2003 American Society for Microbiology

Same Genome, Dıfferent Epıgenome: Agouti bölgelerindeki CpG metilasyonundaki çeşitlilik genetik olarak özdeş farelerde kürk renginde farklılıklara sebep olur. Beslenme; agouti bölgesindeki CpG metilasyonunun derecesini değiştirerek yavruların fenotipini etkiler (Reprinted with permission, MolecCell Biol,Aug2003)

hükök

DERLEME Epigenetik ve Kök Hücre Sena Bocutcu

pigenetik kavramı aynı genoma sahip hücrelerin, nasıl farklı hücre tiplerine dönüştüğünü ve herhangi bir genetik değişiklik olmadan nasıl farklı fenotipler oluştuğunu ve bunun sonraki nesillere aktarılma şeklini açıklayabilmek için ortaya çıkmıştır. Bununla beraber epigenetik kavramının Aristo'ya kadar uzandığı da bilinmektedir. Aristo; embriyonun tamamen gelişmiş minik canlılardan büyüdüğü fikrine karşın, insanın şekillenmemiş bir yapıdan gelişerek meydana geldiğini savunmuştur. Epigenetik kavramının isim babası ise, “epigenetik manzara” kavramının da yaratıcısı olan Conrad Waddington (1905-1975)'dır. Waddington; hücre farklılaşmasını, bir bilyenin tepeden en alçak noktaya yuvarlanmasına benzetmiştir. Buna göre, hücre farklılaşırken vadilerde ilerlemekte ve etrafındaki yüksekliği artan kabartılar ise hücrenin geri dönüşümünde karşılaşılan kısıtlamaları ifade etmektedir. Epigenetik sözcük olarak genetik–üstü anlamına gelmektedir. Daha ayrıntılı olarak, DNA dizilimini değiştirmeden uzun dönemde gen ekspresyonunu düzenleyen ve bunu sonraki nesillere aktarabilen yöntemler şeklinde tanımlanabilir. Bu yüzden epigenetik değişiklikler, hücre döngüsünde, gelişiminde ve çevresel etkenlere tepki

verilmesinde önemli rol oynar. Epigenetik bilgi, çevresel koşullara bağlı olarak değişebildiği için, çevrenin hücredeki fizyolojik etkilerinin gözlenmesinde önemli bir etkendir. Hücresel epigenetik süreç kavramının karşılaması gereken bazı özellikler vardır. Bu özellikler: (i) aynı genetiğe sahip iki hücre arasında gözlemlenebilecek bir fark yaratması, (ii) bu farkın başlangıçtaki uyarı yok olduktan sonra da devam edebilmesi ve (iii) farkın mitotik - ya da bazı durumlarda mayotik – bölünme ile sonraki nesillere aktarılabilmesidir. Ancak bu özellikler, fazla kısıtlayıcı olması sebebiyle bazı durumlarda görülmeyebilirler. Epigenetik modifikasyonlar, çeşitli kimyasal değişikliklerle genlerin aktif ya da inaktif olmalarını sağlar. Hücrenin epigenetik mekanizmaları temel olarak üç başlık altında incelenebilir: DNA Metilasyonu, Histon Proteinlerinin Post-Translasyonel Modifikasyonu ve Non-Coding RNA'lar. Dinlenme evresindeki bir hücrede DNA, kromatin halinde nükleusun içinde bulunur. Kromatini oluşturan en küçük birime ise “nükleozom” adı verilir. Nükleozom sekiz adet histon proteini [ (H2A, H2B, H3, H4)x2 ] ve bu proteinlere sarılmış olan 146 baz çiftinden oluşur. DNA, histon proteinlerine sıkı bir biçimde sarılırsa, RNA Polimeraz enzimi DNA'ya ulaşamaz ve bu DNA yapısına 'Heterokromatin' denir. Ancak, gevşek sarılırsa RNA Polimeraz DNA'ya kolayca ulaşabilir ve transkripsiyon gerçekleşir. Bu DNA yapısı ise 'ökromatin' olarak adlandırılır. Histon proteinleri DNA'nın sarıldığı ve genetik regülasyonda rol alan globüler proteinlerdir .Bu proteinlerin çeşitli bölgelerine yapılan modifikasyonlarla DNA'nın histonlara bağlanma afinitesi değiştirilebilir. Histon modifikasyonları; hücre döngüsü, gelişimi ve farklılaşması sırasında düzenlenir. En önemli histon modifikasyonları, asetilasyon ve metilasyondur. Bu modifikasyonlar mayıs 2012 47

derleme

hükök

sıkı kontrol altındadır. Histon Asetil Tranferaz (HAT) enziminin gerçekleştirdiği asetilasyon, Histon Deasetilaz (HDAC) enziminin görevi olan deasetilasyonla; Histon Metil Transferaz (HMT) enziminin yaptığı metilasyon da çeşitli enzimlerin (ör: LSD, JMJC,...) demetilasyon aktivitesiyle ile dengelenmiştir. Histon asetilasyonu daima transkripsiyonel aktivasyona yol açarken; H3'ün 4., 36., 79., lizinlerinin trimetilasyonu gen aktivasyonuna, H3'ün 9., 27. lizinlerinin ve H4'ün 20. lizininin trimetilasyonu gen baskılanmasını sağlar. Bu modifikasyonların tümüne “histon kodu” denir ve “histon kodu hipotezi”ne göre bu proteinlere ekleme yapan (writer) ve kimyasal eklemleri kaldıran (eraser) enzimler sayesinde hücrede spesifik bir örüntü (pattern) oluşur. Bu örüntü efektör (reader) proteinler tarafından okunarak anlamlı bir biyolojik sonuç (ürün) ortaya konur. Bir diğer yöntem ise, DNA'nın kendisinde değişiklikler yaparak RNA Polimeraz'ın DNA'ya bağlanma afinitesini değiştirmektir. Histon proteinlerinin aksine, DNA üzerinde yapılan tek değişiklik metilasyon ve demetilasyonudur. DNA metilasyonu, Metil Bağlayıcı Proteinlerin(Methyl Binding Protein-MBP) DNA'ya bağlanmasını sağlayarak RNA Polimeraz'ın DNA'ya ulaşmasını engeller. Dolayısıyla genin ekspresyonunu engellemiş olur. DNA Metil Transferaz(DNMT)'lar metilasyondan ve demetilazlar da demetilasyondan sorumludur. DNMT1, metilasyonu yarım kalmış DNA dizilerinin; DNMT3A ve 3B ise metillenmemiş dizilerin metilasyonun sağlar. Transkripsiyon başlangıç dizilerinde(upstream) olan CpG adaları metilasyonun ana hedefidir ve bunların %80'i metillenmiş halde bulunur. Farklılaşmış hücrelerde, hücre tipine göre kullanılmayan DNA bölümleri baskılanmış, kullanılan diziler ise metilasyona uğramadığı için protein sentezine katılmıştır. Embriyonik dönemde DNA metilasyonu, X-inaktivasyonu(dişilerde) ve genomik baskılama mekanizmalarında rol oynar; bu da monoallelik ekspresyona yol açar. Kromatin yapısını ve gen

48 mayıs 2012

ekspresyonunu düzenleyen başka moleküller ise non-codingRNA'lardır. Bu grup RNA'lar birkaç ile birkaç bin nükleotit dizisinden meydana gelebilirer. Bu grup RNA'ların bir alt bölümü olan mikroRNA'lar yaklaşık 21-23 baz çiftinden oluşan ve gen ekspresyonunun posttraslasyonel modifikasyonunda rol oynayan, protein kodlamayan RNA'lardır. miRNA'lar genellikle mRNA'ların 3'UTR'lerine bağlanırlar ve tamamlayıcılık derecesine göre protein kodlanır ya da baskılanır. Bu miRNA'lar embriyonik gelişimde, hücre farklılaşmasında, döngüsünde, apoptozda veimmün fonksiyonlarda görev alır. Bazı miRNA'lar ise DNA metilasyonu ve histon modifikasyonunu hem gen aktivasyonunu sağlayan bazı histon modifikasyonları hem de pro-

hükök moter bölgelerinde DNA metilasyonu içermektedir. Bu bulgulara dayanarak, pluripotent hücreler için yeni bir gen regülasyon mekanizması ortaya konmuştur.Buna göre, hücre farklılaştığında sentezlenmeye başlanacak olan proteinler kök hücrede sentezlenmiyor, ancak ilerde kullanmak üzere hazırlanmış oluyorlar. PcG(polycomb group) proteinleri de, kök hücrelerde gen inaktivasyonunda önemli bir yere sahiptir. PcG proteinleri, gen inaktivasyonunu birden fazla yöntemle sağlarlar:PRC(polycomb repressor complex) proteinlerinin H3K27 trimetilasyonunu katalizlemesi, birbirinden uzak gen lokuslarının bir araya getirilmesiyle daha sıkı birkromatin yapısının oluşturulması, DNMT'leri bazı spesifik hedeflere yönlendirebilmesi gibi. PcG proteinlerinin hücre farklılaşmadan önce baskıladığı genlerin, hücre farklılaşınca tekrar aktive olabildiği görülmüştür. Ayrıca, PcG proteinlerine sahip olmayan kök hücrelerde de, farklılaşma sürecinde bazı dokuya özgü proteinler, aşırı miktarda sentezlenmiştir. Dolayısıyla, PcG proteinleri, epigenetik açıdan önemli bir konuma sahiptir. Ortak özelliklerine karşın, kök hücreler de kendi aralarında yenilenme veya farklılaşma potansiyellerine, elde ediliş biçimlerine ve başka özelliklerine göre birbirlerinden ayrılabilirler. Kök hücreler temel olarak iki grupta incelenebilirler: İç hücre kitlesi(Inner Cell Mass-ICM) benzeri kök hücreler ve post-implantasyon epiblastik kök hücreler. İç hücre kitlesi -enzeri kök hücrelerin diğer bir adı da saf kök hücrelerdir ve bu tip hücreler embriyonik kök hücreleri ve primordial germ-çizgisi kök hücrelerini içerirler. Post-implantasyon epiblastik kök hücrelerin diğer adı primed(farklılaşmaya daha yakın) kök hücrelerdir ve yalnızca epiblast kök hücreleri

derleme makale içerirler. Primed hücreler, saf hücrelere göre daha çok farklılaşma özelliği taşırlar.Ayrıca bu hücrelerin birbirine dönüşmesi sağlanabildiği gibi, bu dönüşümün sürekli olması da mümkündür. Embriyonik kök hücreler, bir embriyodan elde edilen ilk kök hücrelerdir. Embriyonun İç hücre kitlesinden elde edilen bu hücreler, Oct4, Sox2, Nanog gibi temel kök hücre transkripsiyon faktörlerini sentezleyebilirler. Bu faktörler, hücrenin stabilitesini korurlar ve bir feed-forward mekanizmasıyla birbirlerinin ve başka bazı faktörlerin sentezini sağlarlar. Embriyonik kök hücrelerde Xinaktivasyonu başlamamıştır ve bu hücreler sonsuz yenilenme kapasitesine sahiptirler. Ayrıca bu hücreler pluripotent oldukları için, teratoma(üç germ tabakasından da hücreler içeren bir tür tümör) ve kimera(aynı genoma ve farklı fenotiplere sahip hücreler içeren yapı) oluşturabilirler. Epiblastik kök hücreler, embriyonun implantasyonundan sonra ICM'den farklılaşan epiblast tabakasından oluşur. Bu hücreler pluripotent olmalarına karşın, embriyonik kök hücrelerden daha az farklılaşma kapasitesine sahiptirler .Bu hücrelerde X-inaktivasyonu ve hücrelerin farklılaşmaya bir adım daha yaklaştığının belirtileri görülür. Ayrıca epiblast kök hücrelerinde daha az Nanog, Rex1 ve Klf ekspresyonu görülürken; farklılaşmayla ilgili proteinlerin(Fibroblast Growth Factor-FGF,Major Histocompatibility ComplexMHC,...) miktarları artmıştır. Yani, embriyonik kök hücreler hücrenin farklılaşmasını engelleyen proteinleri, epiblastik kök hücreler ise hücreyi farklılaşmaya hazırlayan düzenleyen genleri kontrol eder. Ancak DNA metilasyonu ve histon modifikasyonları da miRNA'nın çalışmasını düzenlemede rol oynar. Burada bir cross-talk mekanizması görülür. Ayrıca miRNA'ların transkripsiyonel seviyede de

mayıs 2012 49

derleme epigenetik kontrolü olduğu düşünülmektedir. Bunun mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, transkriptlerin yaklaşık 1/3'ünün miRNA'lar tarafından kontrol edildiği düşünülmektedir. Epigenetik mekanizmalar birçok yaşamsal fonksiyonda ve çoğu hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Hücre gelişimi ve farklılaşmasından yaşlanmaya, depresyondan otoimmün hastalıklara, genomik baskılamadan Barr cisimciği oluşumuna kadar birçok olayda epigenetiğin etkilerini görmek mümkündür. Hücre farklılaşması ve gen ekspresyonundaki işlevinden dolayı, epigenetik, kök hücre ve kanser çalışmalarında da gittkçe artan bir öneme sahip olmaktadır.

Epigenetiğin sonraki nesiller üzerindeki etkisini incelemek amacıyla yapılan bir araştırmada uyaranlarca zengin bir çevrede yetişen dişi farenin yavrularında hafıza testlerinde diğerlerinden daha iyi sonuçlar elde edildiği gözlenmiştir. Ayrıca, öğrenmeyle ilgili bazı genetik bozukluklara sahip anne farelerin zengin çevre ve keşfetmeye açık bir ortamda bu bozuklukları tolere edebileceği gösterilmiştir. Anne farelerin, bu yolla edindikleri hafızayı yavrularına aktarma yolu kesin bir şekilde bilinmemekle birlikte, çevrenin annede yarattığı değişikliklerin, hormonal yollarla yavruda da benzer etkiler oluşturduğu düşünülmektedir. Başka bir araştırmada ise, anne farelerin doğumdan sonraki ilk hafta gösterdikleri yavrusunu yalama ve yavru bakımı davranışlarının, yavrular üzerindeki etkisi incelenmiştir. Her annede farklı olan bu davranışların, yavruların ileriki yaşamında büyük öneme sahip olduğu belirlenmiştir. Yavrular büyüdüklerinde bir stres uyaranına verdikleri tepkiler, bu yalama ve yavru bakımı davranışlarına

50 mayıs 2012

hükök göre değişiklik göstermektedir. Fazla miktarda yalama ve bakım davranışı gösteren annelerin yavrularının hipokampüslerinde glukokortikoid reseptörü(GR) ekspresyonu ve glukokortikoid feed-back mekanizmasının duyarlılığı artarken, hipotalamik Kortikotropin Releasing Factor(CRF) ekspresyonu azalmıştır. Bu değişiklikler sonucunda ise yavrunun herhangi bir stres uyaranına tepkisinin daha makul düzeyde olduğu görülmüştür. Bu değişikliklerin mekanizması tam olarak bilinmese de, bazı çalışmalar, olası bir yola işaret etmektedir. Buna göre, yavrudaki bu davranış değişikliği, annenin yalama ve bakım davranışlarının oluşturduğu yüksek miktardaki dokunsal uyaranın etkisiyle oluşmaktadır. Yüksek dokunsal uyaranlar, yavrunun hipokampüsünde serotonin seviyesini artırarak birtakım hücreiçi reaksiyon zincirlerini ve bazı transkripsiyon faktörlerini(nerve growth factor-inducible protein A- NGFI-A,cAMP response elementbinding protein-CREB, specific protein 1-SP1) harekete geçirmektedir. CREB, histon asetilasyonunu sağlayarak, NGFI-A ve SP1'in DNA demetilasyonunu katalizlemesini kolaylaştırır. GR geni, bu modifikasyonlarla ekspresyona hazır hale gelir. Böylece GR miktarı artırılmış olur ve yavrunun stres karşısındaki tepkisi düzenlenir. Bu deney, genetik faktörlerin yavru davranışı üzerindeki etkisini görmek amacıyla, doğumdan hemen sonra yüksek ve düşük yavrusunu yalama ve yavru bakımı davranışları gösteren annelerin yavruları değiştirilerek tekrarlanmıştır. Bu deney sonucunda

derleme

hükök ise düşük yalama ve yavru bakımı davranışı gösteren annelerin yavruları, yüksek yalama ve yavru bakımı gösteren anne farelerce büyütüldüğünde, bu yavrularda da yüksek GR seviyesi saptanmıştır. Sonuç olarak, yavrunun strese verdiği tepki, genetik özelliklerindense, erken dönemde karşılaştığı bakım davranışının miktarıyla şekillenmiştir.

hücreler, farklılaşmış hücrelerden daha fazla DNA metilasyonu olan bölge içerirler. Ancak bu iki hücre tipinde farklı protein bölgeleri metilasyona uğramıştır. Örneğin; OCT4/POU5F1 ve NANOG gibi, hücrenin pluripotent özelliklerinin sürdürülmesinde görev alan genlerin promoter bölgelerindeki CpG adaları, kök hücrelerde metilasyona uğramamışken, hücre farklılaştığında bu bölgelerin

Kök hücre, kendini yenileyebilme ve birden çok hücre çeşidine dönüşebilme özellikleri nedeniyle araştırmacıların ilgisini çeken konulardan biridir. Kök hücreler, benzer bir epigenetik profil sergilemelerine karşın, tüm kök hücre tipleri birbirinden farklı yenilenme ve farklılaşma kapasitelerine sahiptirler. Örneği; yetişkin(somatik, multipotent) kök hücreleri, embriyonik kök hücreden daha kısıtlı farklılaşma kapasitesine sahiptir. Yetişkinde görülen hematopoetik kök hücreler kan hücrelerine, nöral kök hücreler nöronlara ve gliya hücrelerine, mezenkimal kök hücreler ise bağ dokusu hücrelerine dönüşebilirler. Ancak embriyonik kök hücre grubunu da içine alan pluripotent kök hücreler, tüm hücre çeşitlerine dönüşebilmektedirler.

metilasyonu başlar.

Epigenetik açıdan incelendiğinde, kök hücreler ve farklılaşmış hücreler farklı özellikler gösterirler. Kök

Embriyonik kök hücrelerin kendilerine ait miRNA dizilerine sahip oldukları da belirlenmiştir. Bu miRNA'lar (ör:cancer associated mir17 ve mir372 ailesi), farklılaşmamış hücrelerde yüksek oranlarda bulunmaktadırlar. Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda da bu miRNA'ların indüklenmiş pluripotent kök hücre elde edilmesinde kullanılmasının, hücrelerin yeniden programlanma verimini arttırdığı gözlenmiştir. Bazı araştırmalar göstermiştir ki; embriyonik kök hücrelerdeki birçok baskılanmış gen, aynı anda proteinleri daha çok kullanıyorlar. Bu durum, iki tip kök hücrenin birbirine zıt mekanizmaları kullandıkları şeklinde de yorumlanabilir. Pluripotent hücrelerin, embriyonik ve yetişkin primayıs 2012 51

derleme makale

hükök

mordial germ hücrelerinden de elde edilebileceği görülmüştür. Bu hücreler de diğer pluripotent hücreler gibi kimera ve teratoma oluşturma özelliği taşımaktadırlar. Bu hücrelerin ilginç bir özelliği ise; embriyonik kök hücrelerin aksine, somatik hücrelerle aynı ortama konduklarında, onların demetilasyonunu uyarabilmeleridir. Böylece farklılaşmış hücreler, 'başlangıç ayarlarına dönebiliyor. Ancak embriyonik germ hücrelerinden elde edilen kök hücrelerden elde edilen bu sonucun, yetişkin germ hücrelerinden elde edilen kök hücrelerde aynı şekilde işleyip işlemediği kesin olarak bilinmemektedir.

bazı genler incelenmiştir. Bu araştırmada,kültür ortamındaki embriyonik kök hücrelerde, kansere yol açabilecek genlerdeki aktivite değişiklikleri incelenmiştir. Sonuç olarak; kültür ortamının embriyonik kök hücrelerde, kanserde görülen tümör baskılayıcı genlerin baskılanmasına yol açabileceği belirlenmiştir. Ayrıca, hücre gelişiminde ve proliferasyonda rol aldığı bilinen ve kanser hücrelerinde baskılanmış olarak bulunan bazı genlerin de kültür ortamında metilasyona uğradığı görülmüştür. Yine de, bu bilgilere dayanarak kök hücrelerin epigenetik stabilitesi hakkında kesin bir yorum yapmak güç olacaktır.

Son olarak, Takahashi ve Yamanaka, somatik fibroblastlarda Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc transkripsiyon faktörlerinin aşırı sentezlenmesini sağlayarak, fibroblastların pluripotent kök hücreye dönüşebileceğini göstermişlerdir. Bu pluripotent kök hücrelere, indüklenmiş pluripotent kök hücreler denir. Bu hücreler, saf pluripotent kök hücrelerin tüm genel özelliklerini gösterirler.

Kök hücre alanında hızlı bir gelişme sağlanmasına rağmen çözümlenmemiş sorunlar varlığını sürdürmektedir. Çeşitli kök hücrelerin stabilizasyonunun sağlanması, saf pluripotent hücrelerin elde edilmesi ve bunun devamının sağlanması ve bu kök hücrelerin istenen hücre tipine farklılaşması için gerekli kültür koşullarının tespit edilmesi özellikle önemlidir. Kök hücre teknolojisini insan embriyolarına daha etkili bir şekilde uygulayabilmek için, bu sorunlara farklı deneysel ve teorik bakış açılarıyla yaklaşılmalıdır.. Bu alandaki sorunların çözümlenmesiyle, araştırmacılar belirli bir hastalığa özgü bir tedavi için deneysel şartlar sağlayabilecekler ve kişisel rejeneratif tıp için gelişmiş çalışmaların temeli atılacaktır.

Embriyonik kök hücreler ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler karşılaştırılırken, bu iki hücrenin birbirine denk olup olmadığı sorusu gündeme gelmiştir. İndüklenmiş kök hücrelerde, farklılaşmasında ya da transplantasyonda oluşangenetik ya da epigenetik bir değişiklikten kaynaklanan ve bu hücrelerin özelliklerinin, embriyonik kök hücrelerin özelliklerinden sapması olasılığı ve bunun istenmeyen sonuçlara yol açabileceği ihtimali göz ardı edilmemelidir. B lenfositlerinden elde edilen indüklenmiş kök hücrelerle embriyonik kök hücreleri karşılaştıran bir araştırma; transkripsiyon faktörleriyle yeniden programlanmış bir indüklenmiş pluripotent kök hücrenin, önceki hücreden kalan epigenetik hafızayı taşıyabileceğini ortaya koymuştur. Bununla beraber çekirdek transferiyle elde edilen embriyonik kök hücrelerde bu hafıza görülmemiştir. Bunun sebebi, çekirdek transferini epigenetik hafızayı sıfırlaması olabileceği gibi, embriyonik kök hücre kültürlerinde kullanılan ancak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerde kullanılmayan ERK inhibitörü(yeniden programlanmayı tamamlamayı sağlayan bir faktör) de olabilir. Başka bir sorun ise embriyonik kök hücrelerin epigenetik stabilitesinin sağlanıp sağlanamayacağıdır. Bir çalışmada erken ve geç geçiş dönümündeki hücreler ve bunlarda, kanser hücrelerinde genelde fazla DNA metilasyonu görülen

52 mayıs 2012

hükök

derleme makale

Referanslar: 1. Altun G. Laurent L C. Loring J F. Epigenetic remodeling and stem cells. Drug Discovery Today: Technologies. 2008:5:139-142. 2. Brooks W H. Le Dantec C. Pers J O. Youinou P. Renaudineau Y. Epigenetics and autoimmunity. Journal of Autoimmunity. 2010:34:207-219. 3. Buchen L. In their nurture. Nature. 2010:467:146-148. 4. Collas P. Epigenetic states in stem cells. Biochimica et Biophysica Acta. 2009:1790:900-905. 5. Hanna J H. Saha K. Jaenisch R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 2010:143:508-525. 6. Hewagama A. Richardson B. The genetics and epigenetics of autoimmune diseaes. Journal of Autoimmunity. 2009:33:3-11. 7. Juliandi B. Abematsu M. Nakashima K. Epigenetics stem cells and cellular differentiation. Handbook of Epigenetica: The new Molecular and medical Genetics.Editor T. Tollefsbol. London: Elsevier, 2011:315-328. 8. Khamsi R. Twins grow apart as they age: genetic tests reveal how the environment changes our DNA. Nature:2005: Avaible from URL http://www.nature.com/news/2005/050704/full/news 050704-3.html 9. Maher L. In their nurture. Nature: 2010:467:146-148. 10. Mathews H L. Janusek L W. Epigenetics and psychoneuroimmunology: Mechanisms and models. Brain Behavior and Immunity 2011:25:25-39. 11. McKay R. Stem cell epigenetics: Is it all dowmhill from here?. Cell Stem Cell. 2007:July:15-16. 12. Muyrers-Chen I. Renato P. Epigenetics: Unforeseen regulators in cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 2001:1552:15-26. 13. Pannetier M. Feil R. Epigenetic stability of embryonic stem cells and developmental potential. Trends in Biotechnology. 2007:25:556-562. 14. Roloff T C. Nuber U A. Chromation epigenetics and stem cells. European Journal of Cell Biology. 2005:84:123-135. 15. Spivakov M. Fisher A G. Epigenetics signatures of stem-cell identity. Nature Reviews. 2007:8:263-271.

mayıs 2012 53

hükök

MAKALE iPS Hücrelerin Epigenetiği Ceyda Acılıoğlu

on birkaç yıl içinde hemen hemen insan embriyonik kök hücreleriyle(hESC) aynı olan, yenilenme terapileri için daha fazla potansiyele sahip indüklenmiş pluripotent kök hücreler(iPSC) elde edildi(Yu ve Takahashi, 2007).iPSCler normal yetişkin dokularından kökenlenmiş ancak hESC pluripotentliği için temel olduğu düşünülen proteinleri üretmesi için yönlendirilmiş hücrelerdir. Yetişkinin hücrelerine bu ESC proteinlerinin ekspresyonunu sağlatmak suretiyle görünüş ve fonksiyon bakımından hESClerle neredeyse aynı hücreler elde edilebilir. Yetişkinin dokularından yeniden programlama suretiyle embriyonik benzeri pluripotent kök hücre elde edilmesi fikrinin ortaya çıkışı iPSClerin eldesinden çok daha uzun zaman öncedir. Ancak tamamen farklılaşmış bir hücrenin çekirdeğinin yeniden programlanabilip programlanamayacağı çeşitli gruplara yıllarca tartışma konusu olmuştur. Eski çalışmalar embriyodan elde edilen çekirdeği kullanmış olsa da sonuçlar somatik hücre çekirdeği transferine(SCNT) temel oluşturmaktadır. SCNT, somatik hücreden alınan çekirdeğin çekirdeksiz yumurta hücresine yerleştirilip gelişerek yetişkin bir organizma eldesi; yani çekirdek vericisi hayvanın klonlanmasıdır. İlk olarak koyun Dolly'nin,sonrasında diğer hayvanların başarıyla klonlanması birbirini izledi.Ancak bu yöntemde bazı problemler hala devam etmekteydi ve başarı

54 mayıs 2012

oranı çok düşüktü. Dolly ve diğer klon hayvanlar gibi capcanlı kanıtlar, yetişkinin somatik hücresinin yeniden programlanıp embriyo benzeri hücre elde edilebilirliğinin bilimsel çevrelerde yeniden ilgi odağı olmasını sağladı. Üretilmesinden bu yana iPSC teknolojisi büyük gelişmeler gösterdi. Araştırmacılar yetişkinin hücre genomunu doğrudan değiştirmeden anahtar yeniden programlama proteinlerini hücrelere dağıtarak iPSCler elde etmeyi başardı. SCNT ve transkripsiyon faktöre dayalı yeniden programlama yöntemiyle herhangi bir dokudan alınan hücrelerin emriyonik hale döndürülebileceğini yani pluripotent kök hücre elde edilebileceğini söylemiştik. Bu iki yeniden programlama yönteminin farklı mekanizma ve kinetikte gerçekleşiyor oluşu genomik metilasyon,gen ekspresyonu gibi epigenetik özellikleri yeniden oluşturması sebebiyle elde edilen pluripotent hücrelerin de farklı özelliklere sahip olabileceği fikrini akla getirdi. Ayrıca iPSClerin kökenlendiği dokuya ait bazı verileri hala barındırabileceği fikri (epigenetik

hükök

bellek) de ortaya atılmıştı. iPSCler de fESCler (fetüs embriyonik kök hücre) ve ntESCler(çekirdek transferli embriyonik kök hücre) gibi teratoma oluşturup 3 embriyonik germ tabakasına ait dokulara farklılaşabiliyordu. Ancak transkripsiyon faktöre dayalı ve çekirdek transferine dayalı yeniden programlama özelikle DNA metilasyonuna bakıldığında belirgin bir şekilde birbirinden ayrılmaktaydı. Araştırmacılar çeşitli pluripotent hücrelerin , iPSCntESC-fESC ,farklılaşma potansiyellerini ve genomik metilasyonlarını karşılaştırdılar.Ve iPSClerin epigenetik bellek denebilecek bir oluşum ile kökenlendiği dokunun metilasyon özelliklerini kaybetmediklerine yönelik kanıtlar buldular. Deneylerine başlamadan önce karşılaştıracakları hücrelerin gerçekten kök hücre karakteri kazandıklarını ispatlamaları gerekti. Bunun için 2 yöntem kullanılabilir: Ya immünohistokimya ile embriyonik bazı proteinlerin üretildiği gösterilebilir(bkz:1) ya da farenin üstüne ekerek teratoma oluşumu sağlanır;eğer 3 germ tabakasına ait doku varsa her

makale

şeye farklılaşabiliyor demektir, yani kök hücredir. (bkz:2) Sonra üretilen bu kök hücrelerin kemik(osteojenik) ve kan(hematopatik) hücrelerine ne kadar verimlilikte dönüştüklerine baktılar. ntESC ve fESClerin iPSClerden daha fazla hematopatik koloni oluşturduğunu; iPSCler karşılaştırıldığında ise kan kökenli B-iPSClerin ,F-iPSClerden daha fazla hematopatik koloni oluşturduğunu(bkz:3) gözlemlediler. Benzer şekilde F-iPSClerin B-iPSClere kıyasla daha kolay osteojenik koloni oluşturduğu,daha fazla kalsiyum depoladığı(bkz:4) ve osteoblastik genleri daha fazla eksprese ettiği sonucuna ulaştılar. Daha sonra farklı pluripotent hücrelerin farklı genetik DNA metilasyon özellikleri barındırabileceği düşüncesiyle CHARM(geniş kapsamlı metilasyon analizi)analizini yaptılar.Bu analize göre fESClere en çok benzeyen ntESCler;en çok farklılık gösterenler ise F-iPSCler oldu(bkz:5).Sonra doku kökeninin (kemik iliği ya da fibroblast) dokuya özgü

mayıs 2012 55

makale

metillenme durumuna göre belirlenip belirlenemeyeceğini merak ettiler: Somatik hücre ve iPSClerdeki metillenmeleri inceleyerek F-iPSC kümelerinin fibroblastlara yakın kemik iliğinden uzak ;BiPSClerin de kemik iliği hücreleriyle gruplandığını gözlemlediler. Bundan yola çıkarak metillenme profilinin iPSClerin kökenini gösterdiği sonucuna vardılar. Ayrıca bu 'iPSClerde epigenetik bellek' fenomenini destekleyen bir başka bulgudur. Sonra B-iPSC,F-iPSC ve ntESC lerdeki farklı metillenme profilinin birbirinden farklı yeniden programlamalara neden olabileceği varsayıldı ve bu varsayım 2 bağımsız hesaplama analiziyle desteklendi. Erişkin farenin farklı dokularından kökenlenmiş iPSCler karşılaştırıldığında kemik iliğinden pluripotentliği üstün özellikte kök hücreler elde edildiyse de hiçbir iPSC ntESCye ya da fESCye eşdeğer olamadı. Daha sonra sekonder ve tersiyer iPSClerde yapılan deneyde farklılaşma eğilimi ve metillenme

56 mayıs 2012

hükök

profilinin yeniden kurulabileceği anlaşıldı. Örneğin kan farklılaşması yetersiz nöral progenitör kaynaklı iPSCler (NP-iPSC) kana farklılaştırıldıktan sonra yeniden programlandırılıp pluripotent hücre olduğunda kan oluşturma potansiyelinde belirgin bir artış olduğunu saptadılar. Ancak bu deneylerde karsılaştırılan pluripotent hücreler erken pasajlanmıştır. Devam eden seri pasajlamalarla bu pluripotent hücre çeşitlerinin farklılaşma potansiyellerinin birbirine daha çok yaklaşacağını öne sürdüler. Kültür ortamında devam eden pasajlama sonrası kandan, fibroblasttan ve kastan kökenlenen iPSClerde benzer epigenetik bellek olduğunu saptayarak belleğin yok edilebildiğini belgelemiş oldular. Başka bir araştırma grubu da hücre kökeninin iPSClerin moleküler ve fonksiyonel seyirlerinde etkisini inceledi.Bu incelemeleri yaparken 2 kimerik erişkin fareden alınan genetik olarak aynı fakat kökeni bakımından farklı 4 hücreden üretilen

hükök

makale

iPSCleri kullandılar. Kuyruktan alınan fibroblast (TFF), dalaktan alınan B-hücresi,kemik iliği türevli granülosit(Gra) ve iskelet kası öncülü(SMP) hücrelerine yoğunlaştılar.(bkz:6) İlk olarak iPSClerin kökenlendiği somatik hücrenin gene ekspresyon seyrini gösterip göstermediğine baktılar. Ve beklendiği üzere SMPiPSClerin SMP belirteci olan itgB1 ve CxCr4'ü GraiPSClerden oldukça fazla;Gra-iPSClerin de granülosit belirteci olan lyzozim ve Gr-1'i SMP-iPSC'den çok daha fazla eksprese ettiğini saptadılar(bkz:78).Bundan yola çıkarak da iPSClerin kökenlendiği hücreye ait transkripsiyonel belleği kaybetmediği sonucuna ulaştılar. Sonra bu gözlemledikleri gen ekspresyonu farklılıklarının epigenetik işaretlerdeki farklarla ilişkili olup olmadığını merak ettiler. Ve donör hücre çeşidinin yalnızca iPSClerin transkripsiyonel seyrinde değil aynı zamanda metilasyon profilinde de etkili olduğunu saptadılar.(bkz:9)

deki farklardan kurtulup kurtulamayacağını incelediler. Devam eden pasajlamanın epigenetik farklardan kurtulmada öncü olduğunu saptadılar. Benzer transkripsiyonel ve epigenetik seyri olan kökenleri farklı iPSClerin farklılaşma potansiyellerinin de eşitlenip eşitlenemeyeceğini merak ettiler ve deneyler sonucunda iPSClerin farklılaşma potansiyellerindeki farklardan kurtulabilecekleri sonucuna vardılar. iPSClerle ilgili çalışmalar halen devam etmektedir ve çok da uzun olmayan bir zaman sonra iPSClerin çok fazla kullanılacağı öngörülmektedir.

Daha sonra bu 4 hücre çeşidinin iPSClerinin embriyoid cisim, eritrosit ve makrofaj oluşturabilme özeliklerini incelediler ve hücrenin kökeninin iPSClerin farklılaşma potansiyelini koşullandırabileceği sonucuna vardılar. Son olarak devam eden pasajlamayla, iPSClerin gen ekspresyonundaki ve farklılaşma potansiyellerin-

mayıs 2012 57

hükök

METOD Bir Method Olarak: Optogenetik Tuna Üstünkaya Optogenetik spesifik hücrelerin belirlenmiş fonksiyonlarını incelemek için genetik ve optik metotların birleştirilerek kullanılmasıdır. Nörobilim alanından çıkmasına rağmen optogenetik; belirli veya istenen bir olayın, belirli bir zamanda belirli ve sağlam hücre grupları üzerine etkinliği gibi çok daha geniş bir bilimsel amaca hizmet etmektedir. Ayrıca optogenetik metodu bu sayede bizim tek başına bir hücrede meydana gelen reaksiyonlara organizmanın verdiği tepkiyi görmemizi sağlaması açısından çok değerlidir. Daha şimdiden bir çok hastalığın tedavisinde ve bir çok fizyolojik olayın açıklanmasında tek nöronun aktivitesinin önemini gösteren optogenetik, bilim dünyasının en prestijli ödüllerinden biri olan “Nature Methods 2010” yılı ödülüne layık görülmüştür. Optogenetiğin Çıkışı: Nörobilimin karşılaştığı en büyük engel, tek bir hücreyi aktive ederken diğerlerini değişmeden bırakabilmektir. Bilinen yöntemlerden elektrotlar çok iyi lokalize olamaz ve diğer hücre gruplarını da uyarırken; ilaçlar genelde çok yavaş etki göstererek hücresel olayların ani cevaplarının görülmesini engeller. Bu temel sorunu çözmek için Francis Crick ışığın kontrol mekanizması olarak kullanılmasını önerse de araştırmacılar tarafından herhangi bir öneri geliştirilememiştir. 2002'de ışıkla uyarılan alglerin ışıktan kaçtığı fark edilmiş, buna bir transmembran proteini olan channelrhodopsin-2'nin neden olduğu ileri sürülmüştür. Bu proteinin bulunması, araştırmacıların hücrenin ışıkla yönetilmesi fikrini gerçekleştirmesini sağlamıştır. Optogenetiğin Özellikleri Ve Uygulaması: Optogenetik metodun çalışmasında dört temel prensip bulunmaktadır. Bunlardan ilki 58 mayıs 2012

metodun en önemli özelliği olan; ışıkla beraber zar potansiyeli değişimidir. Bu iki yolla sağlanabilir. İlk olarak ışığa bağımlı bir madde beyine verilir, bu madde için nöronlarda genetiği değiştirilmiş bir reseptör yaratılır. Alternatif olarak mikroorganizmalarda bulunan ve ışığa karşı duyarlı microbial opsin molekülleri kullanılabilir. Buna en önemli örnek channelrhodopsin-2 reseptörüdür. Mavi ışıkla uyarıldığında depolarizasyona neden olan bu reseptör türü nöronun aktive olmasını sağlar. Ayrıca variantlarıyla tonik veya fazik uyarılar da oluşturabilir. Halorhodopsin reseptörü kullanıldığında ise nöron sarı ışıkla hiperpolarize olur. Bu şekilde nöronun inhibisyonu sağlanır. Yine variantlarıyla daha kalıcı hiperpolarizasyon elde edilebilir. Bazen zar potansiyeli kontrolü membran reseptörleri yerine intraselüler G-proteinleri ile de sağlanabilir.

metod

hükök Örneğin kimerik bir protein olan OptXR proteinleri G-protein kaskadı kontrolünde, PhyB proteini ise GTPaz kontrolünde kullanılarak nöronal modülasyona etkide bulunabilir. İkinci önemli nokta gerekli genlerin transfer edilmesidir. Genler transenfeksiyon yoluyla, viral transdüksiyon yoluyla veya transgenic hayvan modelleri yaratılmasıyla organizmaya aktarılabilir. İstenilirse Cre-Lox sistemi kullanılarak gen aktarımının sadece belirli hücrelere aktarılması sağlanır. Üçüncü olarak ışığın hücreye aktarımı çok kritik bir rol oynar. In vitroda foton scanning mikroskoplarla sağlanan ışıklandırma, in vivo koşullarda genel olarak optik fiberlere bağlı ışık kaynaklarıyla veya küçültülmüş LEDlerle sağlanmaktadır. Son zamanlarda iki foton scanning mikroskobu ve temporal fokuslama ile hücrenin sadece küçük bir segmenti aktive edilebildiği gibi, digital microaynalama gibi sistemle belirli bir alandaki nöronların tümü de aktive edilmeye başlanmıştır.

metot sayesinde, elektriksel artifakt nedeniyle elektriksel stimulasyonu takiben okunamayan elektriksel kayıt, artifaktın yok olması sayesinde simultane bir biçimde kaydedilebilir hale gelmiştir. Bu simultane kayıt teknolojisi verdiğimiz uyarının organlarda nasıl dönüştürüldüğünün yorumlanmasında devir açabilecek önemdedir.

REFERANSLAR 1. Deisseroth, Karl. "Optogenetics." Nature Methods 8 (2011): 26-29. 2. Pastrana, Erika. "Optogenetics: Controlling Cell Function with Light." Nature Methods 8 (2011): 24-25. 3. www.youtube.com Method of the Year 2010: Optogenetics.

Dördüncü ve son prensip ışıkla meydana gelen ani olayların kaydedilmesidir. Genellikle bir elektrot aracılığıyla yapılırken, bazen florasan bazlı biyoreseptörlerle de yapılabilir. Gelecek imkanlar: Yukarıda da belirtildiği gibi bazı hücre kaskadlarının (G-protein yolağı, GTPaz'lar) ışık yoluyla değiştirilebilmesi; vücuttaki her hücrenin kontrolünü ani bir şekilde, elektrikle uyarılabilirliğine bakılmaksızın sağlayabilecektir. Bu uygulamalar günümüzde nöronların yanı sıra, kas hücresi, kardiyak hücresi ve embriyonik kök hücreler üzerinde de kullanılmaya başlanmıştır. Bunun dışında channelrhodopsin'le alınan Ca glia hücrelerini uyarmakta kullanılmaya başlandığı gibi, Ca tarafından düzenlenen T-lenfositler, insulin salgılayan B hücreleri gibi birçok hücrede de kullanılabilir. Optogenetik metodun hızlı ve spesifik olması fizyolojik sistemlerin input-output mekanizmalarının anlaşılmasında büyük faydalar sağlamaktadır. Bu mayıs 2012 59

tek sayfa

hükök

TRANSKRİPSİYON FAKTÖRLERİ ve

DÜZENLEYİCİ

DÖNGÜLER

ıl 1961, Paris'teki “Institut Pasteur”, sonunda genlerin düzenlenmesinde ki “O-peron” teorisine ula-şacak bir çalışmaya ev sahipliği yapar. Bilim dünyası daha DNA molekülünün yapısının farkına 8 yıl önce, 1953'te, varmışken François Jacob ve Jacques Monod'un “Escherichia coli”nin laktozu nasıl sindirebildiği konusundaki incelemeleri, epigenetik ve hücrelerin yeniden programlanması çalışmalarının önünü açar. Escherichia coli için bu düzenleme “lac operon” olarak adlandırılmaktayken, genel anlamda “operon” modeli operatörlere ve repressörlere, cis ve trans birimler, dayanır. Genlerin düzenlenmesi konusunda bazı temel gerçekleri ortaya çıkarmak, sonrasında da açıklamak açısından bu çalışma önemli bir basamağı oluşturur. 6 yıl sonra 1967 yılının içerisinde, Mark S. Ptashne, diğer bir düzenleyici devrenin işleyişini ortaya koyduğu çalışmasını bilim dünyasının bilgi birikimine sunar. “Bakteriofaj lambda”nın hem litik hem de lizogenik özelliğinin bulunması şimdi şu soruyu akla getirir: “Bu iki özellik aynı anda ortaya çıkamayacağından hangisi ne zaman ve nasıl baskın olabilir?” Bu sorunun kaderini DNA'nın bazı özel bölgelerine bağlanmaya çok yatkın bir repressör belirlemekte ve bu repressör, çevresel etkenlere tepkisel bir tutum sergiler. Böylece, değişen çevre koşullarına uygun “adaptasyon”un nasıl elde edildiği sorunu çözümlenebilir. Bu basit sistemin anlaşılması, bilimsel gelişim süreci için önemli bir dönüm noktası mıdır? Memelilerin hücre dizilerinin transkripsiyon faktörleri doğrultusunda şartlanarak dönüşecekleri hücre türlerine farklılaşması sistemsel bir anlayışla ele alındığında herhangi bir dönüm noktası değil midir? Bakteriofajlar gibi basit bir sistem, karmaşık sistemlerin birlikteliğini açıklayacak benzerliklere nasıl sahip olabilir ki? Bu konuda biraz daha ileri gidelim.

60 mayıs 2012

Gökhan Uruk

2000 yılının sonlarına doğru, 9 bilim insanı, PU.1'in GATA-1 ve eritroid farklılaşmasını GATA-1 faktörünün DNA'ya bağlanmasını fiziksel olarak engellediğini gösteren bir çalışma ortaya koyar. Bu makaleye ek olarak 2009 yılında Thomas Graf ve Tariq Enver, hücrelerin miyeloidden eritropoide yeniden programlanması sürecinde GATA-1 ile PU.1 transkripsiyon faktörlerinin birbirlerini antagonistik bir biçimde etkilediklerini yayımladıkları makaleyle öne sürerler. Lizogenik programlamayı çalıştıran transkripsiyon faktörü aynı zamanda litik programı baskılayarak bu ikisini dengeler. Bu durum elektrik anahtarına benzetilebilir. Bir anahtarla elektriğin geçişine ya izin verirsiniz ya da vermezsiniz; ancak her iki durumda da anahtar bulunduğu konumdan memnundur. Hem litik hem de lizogenik durumda gen ifadesinin tanımlanması böyle bir sistemin varlığında dengelenmektedir. Bu benzerlikler, bizlere bir bakteriofajın gelişmiş bir memeli hücresinin transdiferansiyasyonu sırasında kullanılan sistemin mantığını kavramada ne kadar önemli olabileceğini gözler önüne sermektedir. Ayrıca, denizkestaneleri üzerinde araştırma yaparak sonuçlarını 2010 yılında literatüre sunan Erik Davidson, makalesinde eski çalışmaların sonuçlarıyla çelişen herhangi bir bulgu belirtmez. Biz insanoğlu, gelişmişliğin ve karmaşanın anlamlandırılması peşinde ne kadar koşarsak koşalım basitliğin ve temelin önemini göz ardı edemeyiz. Bu bilimsel gelişim de bu düşüncenin doğruluğunu kanıtlayan gerçeklerden sadece biri değil mi? Böylece, transdiferansiyasyon ve yeniden programlamanın geldiği bu nokta, hücrelerin kaderlerini nelerin belirlediği konusunda bizi transkripsiyon faktörleriyle düzenleyici döngüleri daha fazla incelememiz gerektirdiği konusunda için yönlendiriyor.

hükök

DERLEME Extreme Makeover: Converting One Cell into Another Çağrı Küçükkayıkçı, Mehmet Yener Çalışkaner Yetişkin memeli hücrelerin yeniden programlanarak başka hücrelere dönüştürülmesi mümkün kılan çalışmalar geçtiğimiz yıllarda ortaya kondu. Yani yetişkin hücreler önce plüripotent kök hücreye, sonrasında ise farklılaşma yoluyla yeni hücre türlerine rejenere oluyorlar. Buna alternatif olarak yetişkin hücreler direkt olarak diğer yetişkin veya projenitör hücrelere dönüştürülebilir. Bu iki farklı yaklaşımı karşılaştırmaya ve rejeneratif tıp için önemlerini incelemeye çalışacağız. Giriş Rejeneratif tıpın birincil amacı hasarlı ve hastalıklı hücrelerin tamiri ve yenilenmesi için yeni hücreler üretmektir. Bunu amaçlayan fikirler içinde en ilginci ve yenilikçi olanı bir hücre çeşidini başka bir hücreye dönüştürme fikri. Örnek olarak, insan vücudunda bol bulunan dermal fibroblast ve adipositlerin elde edilip nöron, kardiyomyosit veya pankreatik β hücreleri gibi daha önemli hücrelere dönüştürülmesi verilebilir. Bu immünolojik olarak eşleşen hücreler yeniden hastaya nakledilerek hastanın kendi hücrelerini geri alması sağlanabilir. Bu da adeta bir deri parçasının başka bir amaca uygun hale getirilerek kalbe veya pankreasa yerleştirilmesine benzer. Yetişkin Hücrelerin Kararlılığı Yetişkin hücrelerin yeniden yapılmasındaki en büyük sorun, bu hücrelerin önemli derecede kararlı olmalarıdır. Farklılaşmış hücrelerin evrelerini muhafaza etmeleri yıllar alır, nadiren farklı bir evreye geçerler ve doğruyu söylemek gerekirse bu değişim kanseröz hücrelerin oluşumu dahil kötü sonuçlar doğurabilir. Conrad H. Waddington, öncü bir embryolog, hücrelerin plüripotent embryonik hücreden başlayıp, olgun ve diferansiye olmuş aşamaya gelene kadar geçirdikleri yolculuğu bir topun epigenetik bir arazideki vadilerden yuvar-

lanışı olarak betimlemiştir. Bu yolculuğun sonunda hücre gelişimsel yollardan yuvarlanarak bir vadinin sonundaki kararlı, “terminal diferansiyasyon” evresine ulaşır. Eritrosit, keratinosit veya nöron gibi birçok hücre bu evreden sonra bölünme kabiliyetini kaybeder. Sayılı örneği olan bölünebilen hücreler ise aynı şekilde terminal diferansiyasyon evresindeki hücreler üretir. Yetişkin hücrelerin farklı hücre tiplerine dönüşme kabiliyetleri (yani plastisiteleri) gözlemlenmiş olmasına karşın canlı organizmada fizyolojik ya da gelişimsel önemde kayda değer oranda gerçekleşmemektedir. Hücre Dönüşümünde Değişik Yaklaşımlar Buraya kadar olan bölümde normal gelişim ve fizyolojik devamlılığı tartıştık. Fakat aynı zamanda, hücrelerin deneysel manipülasyonla terminal diferansiye olmuş hücrelerin bile değişebileceğinin önemine de vurgu yapmak gerekir. 1960larda amfibiler üzerinde yapılan deneyler olgun bir hücrenin kimliğinin tersine çevrilebileceğini gösterdi. Yetişkin hücreden alınan çekirdeğin döllenmemiş yumurta hücresine aktarılması sonucu farklılaşma tamamen tersine döndürüldü ve yetişkin hücrenin çekirdeği tam bir canlıyı oluşturabilecek plüripotent evreye döndürüldü. Bu deney çok sayıda memeli türünde de uygulanarak başarıya ulaştı. Bu çalışmalar farklılaşmış hücreleri plüripotent evreye döndüren yeniden program-

Albert Einstein

mayıs 2012 61

derleme

lama (reprogramming) faktörlerinin araştırılmasına öncülük etti. Yamanaka ve ekibinin yetişkin deri hücrelerini hücre kültüründe bazı transkripsiyon faktörleri ekleyerek indüklenmiş plüripotent kök hücreye (iPSC) çevirmeleri Waddington'ın öne sürdüğü arazideki topların vadinin tepesine doğru ters yönde hareket edebileceğini, yani hücrelerin gelişim evrelerinde geri sarabileceğinin bir göstergesi oldu. Yeniden programlama hücrenin gelişimi boyunca oluşan neredeyse bütün epigenetik izleri yok ediyor ve adeta hücrenin hafızasını siliyor. Bu hücrelerin in vitro ortamda elde edilmek istenen hücre tiplerine farklılaştırılması ve terapötik uygulamalarda kullanılması rejeneratif tıpta çok güçlü bir strateji haline geldi. Plüripotent yeniden programlamaya ek olarak bu konuya farklı yaklaşımlar da var. Yetişkin hücreler plüripotent evreye döndürülmeden direk olarak başka yetişkin veya projenitör hücrelere dönüştürülebilir. Semenderlerin uzuv rejerenasyonu sırasında yetişkin deri, kas ve kıkırdak hücreleri projenitör bir evreye dediferansiye (geri farklılaşma) olur ve sonrasında yeni bir uzuv oluşturacak şekilde rediferansiye olurlar. Tavuklarda ise hasar sonrasında iristeki pigmentli hücreler transdiferansiyasyon adlı süreçle lens hücrelerini oluşturur. Bu duruma benzer birçok örnek verilebilir. Cynidaria (sölentere) şubesindeki canlıların yaşam döngüsü polip, medusa ve ölüm şeklindedir. Bir sölentere olan Turritopsis nutricula ise medusa evresinden tekrar polip evresine dediferansiye olabilmekte ve bu özelliği sayesinde ölümsüz olmaktadır. Sigara dumanına maruz kalma sonucu solunum yolu epitelinin yassı epitele ya da gastro-özofageal reflü nedeniyle mide epitelinin yassı epitele dönüşmesi gibi insandaki bazı fizyolojik metaplaziler de transdiferansiyasyona örnek oluşturur.

62 mayıs 2012

hükök

Transdiferansiyasyon uzun süredir yapılan araştırmalara rağmen görece olarak az bilgiye sahip olunan bir konudur. Çünkü çevrilmek istenen hücrelerdeki ana regülatör genlerin ortaya çıkarılmasının önemliliği, bu konudaki genel bir strateji oluşturulmasını engellemektedir. Örnek olarak; MyoD adlı iskelet kaslarının özelleşmesinde kritik bir transkripsiyon faktörü, kültür ortamındaki embryonik fibroblast, kondroblast ve retinal epitel hücrelerini kasılan kas hücrelerine çevirebilmiştir. Benzer şekilde CEBP transkripsiyon faktörü sayeesinde B-lenfositler makrofajlara transdiferansiye olabilmiştir. Başka bir çalışmada ise araştırmacılar Math1 transkripsiyon faktörünü kullanarak işitme sorununa çözüm aramış, iç kulaktaki destek hücrelerini işitme kıllarına çevirmişlerdir. Pankreastaki ekzokrin hücrelerin insülin salgılayabilen β hücrelerine dönüştürülmesi transdiferansiyasyonun rejeneratif tıpta ne kadar önemli olduğunun göstergesi olmuştur. Dediferansiyasyon ve transdiferansiyasyon hücrelerin plüripotent evreye döndürülmesini içermez ve böylece epigenetik izlerin çoğu korunmuş olur. Ayrıca programlama sonucu oluşan yetişkin ve projenitör hücreler direk olarak hücre yenileme tedavilerinde kullanılabilir. Yetişkin Hücre Serisi Yeniden Proramlaması için Geniş Strateji Yeniden programlamaya geniş ve etkili bir strateji belirleyebilmek için geren bilgi rejenerasyondan geliyor; embriyonik genlerin aktivasyonu. Bu prensip kullanılarak yetişkin pankreatik ekzokrin hücreler β hücrelerine dönüştürüldü. Her iki hücre tipi de aynı embriyonik kökenden gelmesine rağmen çok farklı morfolojik ve fizyolojik özelliklere sa-

hükök

derleme

hip. Ekzokrinden βya transdiferansiyasyon için kullanılacak transkripsiyon faktörleri (TFler) genomun taranması sonucunda elde edildi. Öncelikle pankreatik projenitör hücrelerde ifade edilen 30 TF elde edildi. Daha sonra knockout çalışmaları ile aday gen sayısı 9'a indirildi. İlerleyen çalışmalarla bir ekzokrin hücreyi β hücresine dönüştürmek için gereken TF sayısı 3 olduğu görüldü. Peki bu çalışma diğer hücre serilerine uygulanabilir mi? Gittikçe artan hücre tiplerine özgü TF bilgisi ve iyi düzenlenmiş protokollerle bu yaklaşımı bir çok hücreye uygulamak mümkün. Örnek vermek gerekirse glial hücrelerden motor nöronlar elde etmek mümkün. Bu yaklaşım sayesinde ALS (amyotrophic lateral sclerosis) gibi hastalıkları ya da omurilik hasarları gibi hasarları gibi hasarları tedavi etmek olası. Bir başka örnekte ise kalp kası hücrelerini fibroblastlardan ya da iskelet kası hücrelerinden elde ederek, kalp krizi sonrasında oluşan hasarların tedavi edilmesi var. Her iki hücre tipi de farklı yaklaşımlarla (projenitörlerden elde etmek ya da embriyonik kök hücrelerden elde etmek gibi) elde edilebilmekle birlikte, hangi yaklaşımın tedavilerde etkili olacağını zaman gösterecek. Rapor edilen bazı hücresel "dönüşümler" çok güçlü transkripsiyon faktörlerinin çok yüksek düzeyde ektopik olarak ifade edilmesi ile sağlanmış durumda. Bu tarz bir yaklaşım sonucunda elde edilen hücrelerde belirli genler ifade olmaya zorlanmıştır ancak stabil bir dönüşüm elde edilememiştir. Gerçek bir reprogramlamada gerekli Tflerin yalnızca geçici ifadesi söz konusudur ve elde edilen hücreler stabil olmalıdır. Aksi takdirde elde edilen hüceler hibrid fenotip göstereceklerdir ki bu da transdiferansiyasyonda istenen birşey değildir. Prensipte, yetişkin bir hücrenin hücre soyu (cell lineage) reprogramlaması ile başka bir hücre tipine dönüşmesi mümkündür. Farklı "son" hücre tiplerini elde etmek için kullanılacak yeniden programlama faktörlerini belirlemek için iki önemli soru önümüzde durmaktadır. İlki, hangi genler testler için iyi birer adaydır? Ve ikincisi, testin in vivo olarak mı yoksa in vitro olarak mı yapılması gerekmektedir? Her yeniden programlama deneyinin kendi içinde tasarlanması gerekmekle birlikte bazı genel yol göstericiler önerilebilir. Örneğin, elde edilmek istenen son hücre tipinde ifade edilen önemli

gelişimsel regulatör genler yeninden programlama faktörleri olmak için iyi birer adaydır. En iyi adaylar knockout çalışmalarında delesyonları şiddetli gelişimsel hatalara ya da belirli bir özelliğin tamamen kaybolmasına neden olan genlerdir. Hücre serisi analizleri ile de hangi aday gen hangi hücrede ve gelişimin hangi evresinde ifade edildiği bulunabilir. Bu iki yaklaşımın geçerli olmadığı durumlarda gelişimde önemli rol oynadığı bilinen gen ailleleri arasında adaylar aranabilir. Önemle altının çizilmesi gereken bir nokta ise, aday Tfler aranırken tamamiyle başkalaşıma uğramış yetişkin hücreler yerine gelişimin bir kaç basamak aşağısındaki henüz tam başkalaşım geçirmemiş hücrelere bakılmalıdır. Aday genler bir kez belirlendi mi in vivo ya da in vitro testlere başlanabilir. İn vitro teslerin avantajı bir çok TFnin paralel olarak test edilebilmesi iken, çoğu hücrenin kültür koşullarının çok iyi bilinmemesi bir sorundur. İn vivo çalışmalarda ise yalnızca az sayıda TF ile çalışmak mümkündür ve sonuç elde etmek daha zordur. mayıs 2012 63

derleme Nişin Rolü İn vivo hücresel dönüşümlerde nişin rolü hesaba katılmalıdır. Bir hücrenin yetişkin başkalaşmış durumu, kendi doğal çevresi içinde, nişinde, iken en stabil halindedir. Dışarıdan bir etki ile organ sistemindeki başka bir hücre tipine dönüşümde nişin etkisi, in vivo çalışmalarda bir avantaj olabilir. Yetişkin hücrelerle karşılaştırıldığında, projenitörlerin ya da kök hücrelerin bir niş için daha sıkı gereksinimleri olabilir. Ancak uygun kültür koşulları varsa çalışmalar in vitroya taşınabilmektedir. Eğer çalışma doğrudan in vivo yapılacaksa, niş mutlaka uygun olmalıdır. Aksi takdirde, dönüşüm başarılı olsa bile elde edilen projenitörler/kök hücreler hızlı bir şekilde apoptozise ya da farklılaşmaya başlayabilirler. Belki de bu nedenle in vivo yeniden programlama ile elde edilen projenitör/kök hücre ile ilgili az sayıda başarılı çalışma vardır. Yine de in vivo stratejiler yetişkin projenitör/kök hücre barındıran hematopoietic sitem, sinir sistemi, iskelet kası, deri gibi dokular için geçerli olabilir. Yetişkin Soy Yeniden Programlamasına Yardımcı Olabilecek Stratejiler Yeniden programlamadaki güncel örnekler yeniden programlama faktörlerinin ektopik ifadesine dayanıyor. Bu faktörlerin ise var olan epigenetik programı silerek yerine bizim istedi-ğimiz yeni programıkoyması gerekiyor. Dönüşüme uğramasını istediğimiz hücrenin orjinal epigenetik durumunu stabilize eden faktörlerin delesyonunun yeniden programlama sürecini kolaylaştırdığına dair kanıtlar var. Bu durumda ektopik ifade edilen yeniden programlama faktörlerinin yanı sıra, içsel bazı genlerin susturulmasının birlikte uygulandığı stratejilerin daha başarılı olabileceğini gösteriyor. Yalnızca epigenetik durumu sürdüren genlerin susturulmasının yeniden programlamayı sağlayabileceğini gösteren çalışmalar bile var. Hücrelerin farklı gelişimler durumlarını sürdürmesini sağlayan faktörlerin belirlenmesi ve yeniden programlama sürecinde kullanılması oldukça iyi bir strateji olarak görünse de, bu faktörlerin bir çoğu halen bilinmiyor. Hücrenin kimliğini devam ettirmesini sağlayan genlerin "kaybedilmesinden" başka yeniden programlamayı kolaylaştıracak bir başka strateji de uygun hücre tipinin seçilmesi. Bazı hücre soyları, diğer hücre soylarına göre belirli hücre tiplerine dönüşmeye daha "yatkın". Kısaca başlangıçta

64 mayıs 2012

hükök kullanılacak olan hücre popülasyonu, sonucu değiştirecektir. Farklı hücre tiplerinin gelişim sürecinde basamak basamak oluşmuş farklı epigenetik izleri vardır. Yakın ilişkili hücreler benzer izler taşırken, gelişimin çok erken evrelerinde yolları ayrılmış hücre tipleri çok farklı epigenetik "makyaja" sahiptir. Bu epigenetik farklılık nedeniyle, başlangıç popülasyonunun son hücreye yakın bir hücre tipinden seçilmesi sonuçları olumlu yönde etkileyebilir. Bir başka kolaylaştırıcı strateji ise hücre bölünmesinin uyarılması olabilir. Hücreler epigenetik yeniden programlamaya mitoz sırasında en yatkın durumdadır. Yeniden programlama faktörlerinin mitoz sırasında, çekirdek zarfı kaybolmuşken verilmesi epigenetik yeniden programlamanın başarısını arttırabilir. Not edilmesi gereken durum ise şudur, şimdiye kadar rapor edilen dönüşümlerin tamamı birbirine yakın hücre tipleri arasında gerçekleştirilmiştir. Yukarıda bahsedilen kolaylaştırıcı stratejilere rağmen birbirine uzak iki hücre tipinin birbirlerine tamamen dönüştürülüp dönüştürlemeyeceği tam olarak bilinmiyor. Ana Yeniden Programlama Yaklaşımlarının Karşılaştırılması Pluripotent (iPSC) yeniden programlama ve hücre soyu (Trans-, Dediferansiyasyon) arasında birkaç önemli fark bulunmaktadır. (Tablo 1) Örneğin pluripotent yeniden programlamada kullanılan bir çok faktör şimdiden keşfedilmiş durumda ve bir çok farklı hücre tipinin kök hücreye geri dönüşünde bu faktörler işe yarıyor. Farklı olarak, transdiferansiyasyon faktörleri hücre tiplerine özgü ve bir çoğu hala bulunmayı bekliyor. Yine de transdifreansiyasyon ile elde edilen hücreler projenitörler ya da yetişkin hücreler olduklarından iPSC ya da ESClerden farklı olarak doğrudan klinik uygulamalarda kullanılmaya daha uygun. Transdiferansiyasyonun diğer bir avantajı ise istenen hücrenin doğrudan in vivo olarak dönüşüme uğratılabilmesi. Bu in vivo rejenerasyon ve tamir stratejilerini iPSC tabanlı yeniden programlama çalışmalarına uygulamak mümkün değil. Hücre soyu yeniden programlamasının bir başka ptoensiyel avantajı ise bir adım geri ya da bir adım yana atılması. Yani değiştirilmesi gereken epigene-

derleme

hükök

tik izlerin sayısı iPSC yaklaşımına göre çok daha az. iPSC yaklaşımında neredeyse bütün epigenetik işaretlerin kaldırılması gerekiyor; kısaca bütün makyaj silinmeli. Transdiferansiyasyon yaklaşımındaki sınırlama ise, şimdilik, yalnızca yakın hücre tipleri arasında dönüşümün gerçekleştirilebilmiş olması. Bir birine uzak akraba hücreler arasındaki dönüşümün nasıl sonuçlar vereceği hakkında kesin bilgiler mevcut değil. iPSC yaklaşımı ile ise, teoride, bütün hücre tiplerini kullanarak istenen her hangi bir hücre tipini elde etmek mümkün. ESCler ve iPSCler kültür ortamında neredeyse sınırsız bölünme yeteneğine sahipler. Bu başlangıç materyali açısında elimizde geniş bir kaynağın olmasını sağlamasına rağmen; her bölünmede oluşacak farklılaşmlar ve birikecek mutasyonlar ile stabil olmayan bir fenotip gösterebilirler ya da kültüre uyum sağlamış kök hücreler elde edebiliriz. Bu değişken fenotipe sahip hücreler kansere neden olabilir ya da in vivo ortama uyum sağlayamayabilir. Transdiferansiyasyonda ise, hücreler birbirleri ile yakın ilişkili olduklarından daha az bölünme ile sonuç elde edilebilir ve kanser şansı en aza indirilebilir. Transdiferansiyasyon İle İlgili Çözülmesi Gereken Sorunlar

eksikliği yetişkin ve yetişkin olmayan hücrelerdeki yeniden programlama kapasitemizi sınırlandırıyor. Bu alanda edinilecek bilgiler ile yeniden programlama çalışmalarına daha farklı ve ve etkili stratejiler getirilebilir. Ayrıca transdiferansiyasyon çalışmalarının terapatik etkisi hayvan çalışmaları ile gösterilmeye başlanmıştır. Örneğin, iç kulaktaki destek hücrelerinin kıl hücrelerine dönüştürülmesi ile sağır hayvanlarda duyma sağlanabilmiştir. Transdiferansiyasyonun önünde duran ve çözülmesi geren önemli bir konu ise bu hayvan çalışmalarının insan çalışmalarına dönüştürülebilmesidir. Örneğin yalnızca bazı TFler daha küçük ve güvenli moleküller ile değiştirlebilmektedir. Ya da tam anlamı ile dönüşüme uğramamış hücrelerin malignant değişler geçirmesi mümkündür. Yeniden programlama faktörlerinin dikkatlice belirli dokulara hedeflenmesi klnik uygulamalara geçilmesiden önce yapılması gereken en önemli şeylerden birisidir.

Referanslar 1. Zhou Q., Melton D. A. "Extreme Makeover: Converting One Cell into Another", Cell Stem Cell 3, 382388

Hasta-spesifik tedavilerin geliştirilmesinde, hastadan alınan yetişkin hücrelerin yeniden programlanması, embriyolardan alınan yetişkin olmayan hücrelerin kullanılmasından daha pratik bir yaklaşımdır. Ancak, terminal farklanmış yetişkin hücrelerdeki epigenetik kilitleri açıp yeniden ğrogramlamak, yetişkin olmayan hücrelerdekine göre daha zor olabilir. Bu düşünceyi hematopietik sistem hücreleri ile yapılan çalışmalar doğrulamaktadır. Sistemin embriyonik hücreleri ile yapılan yeniden programlama çalışmalarına dair çok sayıda veri bulunmakla birlikte yeişkin kan hücreleri ile yapılan başarılı çalışma sayısı oldukça azdır. Epigenetik programlama hakkındaki bilgilerimizin mayıs 2012 65

hükök

MAKALE 3 Faktör Ne Yapabilir? Cevap: Sinir Hücresi Mehmet Yener Çalışkaner Birkaç yıl öncesine kadar hücre farklılaşmasının güçlü ve geri dönüşümsüz bir süreç olduğu düşünülüyordu. Ancak Yamanaka'nın çalışmaları bunun aksini ispatlamayı başardı; fare ve insan fibroblastları 4 trankripsiyon faktörü kullanılarak pluripotent kök hücrelere yeniden programlandı. Bu çalışma akıllara şu soruyu getirdi; transkripsiyon faktörleri kullanılarak farklı hücre tipleri elde etmek de mümkün mü? Bu sorudan yola çıkan Wernig ve ekibi 19 aday gen ile işe başladılar. Amaçları fibroblasttan fonksiyonel sinir hücresi elde edebilmekti. Çalışmalarının sonunda 19 aday geni 3 gene indirmeyi ve fare ve insan fibroblastlarından indüklenmiş nöronlar (iN) elde etmeyi başardılar.

etişkin organizmalar çok çeşitli hücre tiplerine sahiptir. Bu hücre tipleri, gelişim süreci boyunca kök hücrelerin farklılaşması ile oluşur. Bu farklılaşma sürecinde, hücrelerin kaderini belirleyen transkripsiyon faktörleri (TFler) olur. İlk grup TFler hücreyi belirli bir yola sokar; 'sen bir kan hücresi olacaksın.' Daha sonra gelen TFlerin yaptığı iş ise 'sen lökosit olacaksın, sen de eritrosit ol' demektir. TFler ile sağlanan bu hücre-tipineözgü (cell-type-specific) gen ifadesinin devamlılığı

ise epigenetik modifikasyonlar ile hayat boyu güvence altına alınır. Bu farklılaşma sürecini geriye döndürmek mümkün mü? Bu sorunun cevabı evet, belirli transkripsiyon faktörlerini kullanarak hücrelerin kaderini dramatik bir şekilde değiştirmek mümkün. Benzer şekilde somatik hücre çekirdeğinin oosite transferi ya da pluripotent hücreler ile farklılaşmış hücrelerin füzyonu sonucunda hücrenin kaderini değiştirerek pluripotent duruma sokmak mümkün. Hücrenin kaderindeki bu değişimin yalnızca farklılaşmış durumdan embriyonik duruma doğru olduğu düşünülebilir; ancak farklı çalışmalarla bir hücrenin başka bir hücreye doğrudan dönüşebileceği gösterilmiştir. Biz de bu yazıda spesifik TFler kullanılarak bir fibroblastın doğrudan bir sinir hücresine dönüştürülüp dönüştürülemeyeceği sorusunun yanıtını tatışacağız. Transkripsiyon Faktörlerini Bulmak: Bizi kim nörona götürebilir? Bir hücreyi nörona dönüştürebilmek için muhtemelen birden fazla TF gerekliydi; bu nedenle 19 farklı genden oluşan bir havuz oluşturuldu. Nöral gelişimde önemli görevleri olan, nöral dokulara

Marius Wernig 66 mayıs 2012

“Only those who attempt the absurd can achieve the impossible.” Albert Einstein

hükök

özgü olan ya da epigenetik kontrolde görev alan bu 19 gen ile fare embriyonik fibroblastlarını (FEFler) enfekte etmek üzere lenti virüsler hazırlandı. FEFler TauEGFP geni aktarılmış farelerden alındı. (TauEGFP geni, EGFP floresan proteinini kodlar. Transgenik farelerimizde bu gen yalnızca sinir dokusunda ifade olacağı için ilerleyen basamaklarda nöron oluşumunu test etmek için EGFP çok iyi bir araç.)

makale

rağmen mono- ya da bi-polar morfolojideydiler. 19F iN hücreleri ise kompleks morfoloji gösterebilmişlerdi; Ascl1 tek başına 19F havuzunun yaptığını yapacak güçte değildi. Ardından diğer 18 aday genin Ascl1 ile kombinasyonları test edilmeye

Fibroblastlar alınırken sinir dokusundan hücrelerin araya karışmaması için büyük bir dikkat gösterildi, bu dikkatin yanı sıra bazı testlerle (İmmünofloresan, Polimeraz zincir reaksiyonu ve revers transkripsiyon 'RT-PZR') ortamda nöron olmadığı kesinleştirildi. Enfekte edilmemiş FEFler, nadir olarak Tuj1-pozitif (nöral marker), TauEGFP-negatif ve fibroblast benzeri morfoloji özellik gösteriyorlardı; beklenildiği gibi. Bu durumun aksine 19F havuzu ile enfekte edilmiş hücreler 32 günün sonunda tipik nöron morfolojisi ile birlikte Tuj1pozitif ve TauEGFP-pozitif (parlak floresan markerlar) gösteriyorlardı; iNlar oradaydı. Daha sonra iN oluşturabilmek için için gerekli olan TF sayısını azaltmak için kolları sıvadılar. Sinir hücrelerinin oluşumundaki bilinen önemleri nedeni ile öncelikle Ascl1 ve Neurod1 bireysel olarak test edildi. Sadece Ascl1 ile nefekte edilmiş hücreler Tuj-1 pozitif ve TauEGFP-pozitif olmalarına

başlandı. Bu testlerin sonunda 5 genin (Brn2, Brn4, Myt1l, Zic1 ve Olig2) Ascl1 ile birlikte iN oluşturabildiği görüldü ve bu genlerin hiçbirinin tek başına iN oluşturmak için yeterli değildi. Brn2 ve Brn4 arasındaki benzerlik nedeni ile Brn4 deney dışında bırakıldı ve 5F havuzu oluşturuldu; Ascl1,

mayıs 2012 67

makale Brn2, Myt1l, Zic1, Olig2. 5F havuzu ile enfekte edildikten 12 gün sonra iN hücreleri karmaşık morfoloji ile birlikte Tuj1-pozitif özellik gösterdiler. 5F havuzu, 19F kadar başarılı olmuştu ve hatta 19F'i geçmişti! iN Hücreleri Fonksiyonel mi? Çalışmadaki amaç fonksiyonel sinir hücreleri elde edebilmek olduğu için, iN hücrelerinin bu açıdan da test edilmesi gerekiyordu. Peki, fonksiyonel sinir hücrelerinin sahip olmaı gereken özellikler nelerdir? Bir sinir hücresinin üç önemli özelliği vardır; · Nöron-spesifik proteinler · Aksiyon potansiyeli oluşturabilme · Sinaps oluşturabilme Bu üç özellikten ilki zaten test edilmişti, evet elimizdeki hücreler sinir hücreleriydi. Aksiyon potansiyeline gelince, 5F havuzu kullanılarak elde edilen iN hücrelerinin membran potensiyeli özellikleri patch-clamp tekniği ile enfekte edildikten 8, 12 ve 20 gün sonra test edildi. Bu testler sonucunda iN hücrelerinin aksiyon

potansiyeli oluşturabildiği gözlendi (Fig. K). Bu aksiyon potansiyelleri tetrodotoxin ile, Na+ iyon kanalı inhibitörü, durdurulabiliyordu. Eldeki bu bulgulara ek olarak zarda ligand-kapalı iyon kanallarının olup olmadığına bakıldı. Dışarıdan uygulanan GABA'ya (gamma-aminobütirik asit) cevap alındı ve bu cevap GABA inhibitörleri ile inhibe edilebiliyordu. Sonuç olarak FEF-kökenli iN

68 mayıs 2012

hükök hücreleri sinir hücrelerinin membran özelliklerine ve GABA reseptörlerine sahipti. iN hücrelerinin nörotransmitter profiline bakıldığında ise glutamat'a ve GABA'ya cevap veren sinir hücreleri gözlemlendi. Tirozin hidrolaz, kolin asetiltransferaz ya da serotonin ifadesi görülmedi. iN büyük kısmı periferin, periferik nöronlara özgü bir hücre iskeleti proteini, için negatifti. Membran potansiyeli özelliklerinden ve nörotransmitter profilinden sonra bir başka önemli soru fonksiyonel sinapsların oluşturulup oluşturulamayacağıydı. İlk olarak iN ile önceden var olan sinir ağları arasında sinaps oluşup oluşamayacağı sorusuna cevap arandı. Bunun için 7 gün kültürde geliştirilen neonatal kortikal nöronların üzerine enfekte edilmesinin üzerinden 7 gün geçmiş iN'lar ekildi. Ekimden bir hafta sonra iN ile neonatal kortikal nöronlar arasında kültürdeki kortikal nöronlara özgü ritmik ve spontane aksiyon potansiyelleri gözlendi. Elektrik uyarımı ile egzite edici ve inhibe edici postsinaptik akımların (EPSCler ve IPSCler) her ikiside gösterildi. EPSCler ve IPSCler inhibitörler ile durdurulabiliyordu, bu da iNların oluşturduğu sinapsların vücuttakiler ile aynı ya da benzer özellikte olduğunu gösterdi.

Sıradaki soru ise beklenildiği gibi; iN hücrelerinin kendi aralarında sinaps oluşturabilir mi? Bu sorunun cevabı ise enfekte edildikten 8 gün sonra primer astrosit kültürüne aktarılan FEF-kökenli 5F iN hücreleri ile arandı. Astrositlerin ortamda bulunmasının nedeni sinaptogeneziste önemli bir yerleri olmasıydı; astrosit kültürü önceden ortamda sinir hücresi olmaması için dikkatle test edildi ve saf astrosit kültürleri kullanıldı. iNlar astrositlerin üstüne aktarıldıktan 12-17 gün sonra elde edilen sonuçlar spontane postsinaptik akımları gösterdi. Ektraselüler uyarımlar sonucunda ölçülen postsinaptik akımların büyük çoğunluğu EPSClerdi. Enteresan bir şekilde IPSCler gözlemlenmedi. Sonuç olarak iN hücreleri kendi aralarında sinaps yapma yeteneğine sahiptiler ve oluşan sinapsların büyük bir kısmı EPSClerdi.

makale

hükök FEFlerde Çalışıyor, Ya Postnatalda? Yukarıda açıklandığı gibi 5F havuzu embriyonik fibroblastlar ile verimli ve hızlı bir şekilde çalışıyor. Postnatal hücrelerdeki durumu görebilmek için, farelerden kuyruk-tipi fibroblastlar (KTFler) alındı.

FEFler ile olan çalışmanın başında olduğu gibi öncelikle ortamda nöronların olup olmadığı kontrol edildi ve çalışmaya başlandı. KTF iN hücrelerinde nöronal doku markerları enfekte edildikten 12 gün sonra gözlendi. 12 gün sonunda FEF iNlara benzer olarak fizyolojik membran potansiyelleri, aksiyon potansiyelleri ve voltaj-kapılı iyon kanallarının ifadesi gösterildi. Yine iNlara benzer olarak glutamat ve GABA nörotransmitterleri görülebilirken, diğer nörotransmitterlere rastlanmadı. KTFler ile yapılan sinaps deneyleri de olumlu sonuçlar verdi ve iN sonuçlarına benzer sonuçlar elde edildi. 19F ile İşler Yürüyor, 5F Daha İyi, Daha Azı Ne Yapar? 5F havuzu ile alınan iyi sonuçların sonunda ortaya başka bir soru atıldı, peki ya daha az faktör aynı işi yapabiliyorsa? Bu soruyu cevaplamak için 5 faktörden her defasında 2 faktör dışarıda

bırakılarak 3lü gruplar denendi. Bu denemeler sonucunda en iyi sonuç BAM havuzu ile alındı. Enfeksiyon sırasında kullanılan toplam virüs sayısı sabit tutulduğunda BAM havuzu ile elde edilen sonuçlar, 5F havuzuna göre çok daha verimliydi. Elde edilen sonuçlar bir ya da iki faktörün FEFlerden fonksiyonel iN hücrelerinin elde edilebileceği yönündeydi. Bu doğrultuda BAM havuzunun daha küçük alt grupları denendi. Elde edilen sonuçlara göre Ascl1 tek başına aksiyon potansiyeli oluşturabilen ve basit sinir-benzeri morfolojide hücrelerin oluşması için yeterliydi, buna fonksiyonel voltaj-kapılı kanal proteinleri de dahil. Ancak bu hücreler immature olup, kompleks sinir hücresi özelliklerini göstermekten uzaktı. BAM havuzu ile yapılan testlerde elde edilen sonuçlara göre kompleks morfoloji, olgun aksiyon potansiyeli ve diğer olgun sinir hücresi özellikleri bu iNlarda vardı. FEFlerin yanı sıra KTFler ile yapılan deneylerde benze olumlu sonuçları verdi. Sonuç olarak iNlar bir çok hastalıkta hastaya özgü tedaviler açısından çok önemli bir noktada duruyor. Gelecekteki araştırmalar ile diğer nörotransmitter ve postsinaptik akım profillerinin elde edilmesini sağlayacak başka 'havuzlar' da bulunacaktır ve bu sayede tedavi edilecek bölgede ihtiyaç duyulan iNlar üretilebilecektir. Şimdilik major tedaviler uzak görünse de gözdeki sinir tabakanın tedavi edilmesi gibi minör tedaviler için artık sona yaklaşılıyor. Tedavi amaçlı kullanımın dışında sinir sistemi hastalıklarının modellenmesinde, hücre plastisite araştırmalarında ve ilaç deneylerinde iNlar kullanılarbilir.

Referans; ŸDirect conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors

mayıs 2012 69

hükök

DERLEME İndüklenmiş Sinir Hücreleri Ömer Uludağ

aşta Yamanaka ve arkadaşlarının çalışmaları ve bunu takip eden çalışmalar sonucu artık belirli faktörlerle terminal diferansiyasyona uğramış hücrelere yeniden pluripotensi kazandırabileceğimizi artık biliyoruz. Bu hücrelere indüklenmiş pluripotent kök hücreler[induced pluripotent stem cells(iPSCs)] diyorduk. Bunun ötesinde Marius Wernig ve arkadaşlarının çalışmaları sayesinde artık fibroblast gibi(hatta endodermal hücreler gibi) kökeni farklı hücrelerden, yine belirli faktörler ekleyerek, indüklenmiş nöronlar(iN) elde edebileceğimizi de artık biliyoruz. Bu yazıda Marius Wernig' ten sonra bu konudaki araştırmaları ve gelecekteki olası gelişmeleri inceleyeceğiz. Öncelikle fare fibroblastlarını indüklenmiş nöronlara çevirmek için gerekli 19 farklı gen tespit edildi ve bu genlerin ürünü olan transkripsiyon faktörleri farklı kombinasyonlarda verilerek ilk önce en önemli 5 transkripsiyon faktörü(Ascl1, Brn2, Olig2, Zic1 ve Myt1l) belirlendi. Daha sonra bu sayı 3' e indirildi(Brn2, Ascl1, Myt1l). Bunlara kısaca “BAM” diyoruz(Şekil-1). Fibroblastların indüklenmiş nörona(iN) dönüşme verimliliğinin iPSC' ye dönüşme verimliliğinden daha yüksek olduğu bulunmuştur. Öte yandan bu ilk çalışmalar yeni bazı sorular doğurmuştur. Fibroblastlardan iN elde ederken bir ara nöral progenitör hücre basamağının olup olmadığı gösterilememiştir. Ayrıca oluşan hücrelerin kökenlerine ait bir hafıza taşıyıp taşımadığı henüz bilinmemektedir. İnsandaki uygulamaları ve klinik sonuçları da merak konusudur.Şekil-1: Fare ve insanda fibroblasttan ve hepatositlerden uyarıcı nöronlar, dopaminerjik nöronlar, motor nöronlar ve nöronal progenitör hücreler(NPCs) elde edebiliyoruz. Farklı çalışmalarda kullanılan alternatif

70 mayıs 2012

transkripsiyon faktörleri parantez içinde gösterilmiştir. Yakın bir zamanda Marro ve arkadaşları “BAM” ile hepatositlerden(endoderm kökenli) de iN elde etmeyi başardılar. Bu çalışma gösterdi ki fibroblastlar ile hepatositlerin dönüşüm zamanları farklıdır. Hepatositler dönüşüme daha dirençlidir. Ayrıca her ikisinde de donör hücreye özgü gen ekspresyonların bittiği gözlendi. Bu da “BAM” faktörlerinin sadece nöral programı indüklemeyip, ayrıca donör programı da down-regüle ettiğini gösterir. Klinik uygulamalar açısından bu faktörlerin insan fibroblastlarında da aynı dönüşümü sağlayıp sağlamayacağı önem taşır. Yamanaka'nın 4 transkripsiyon faktörünü(Sox2, Klf4, Oct4 ve cMyc) verdiğimizde hem insan hem fare fibroblastları iPSC'ye dönüşür. Ancak BAM faktörlerini insan fibroblastlarına verildiğinde iN elde edilemediği görüldü. Pang ve arkadaşları BAM ile birlikte 20 farklı transkripsiyon faktörü denediler ve sonuçta NeuroD1'in fonksiyonel nöron oluşturmak için gerekli olduğunu buldular. Bu nöronlar çeşitli nöronal belirteçleri eksprese ettiler ve aksiyon potansiyeli oluşturma yeteneğine sahiptiler. Ancak ilk fonsiyonel sinapslar 5-6 hafta gibi uzun bir süre sonra oluştu. Ayrıca verimlilik olarak farelerdekinden on kat az olduğu bulundu. Bu beklenen bir sonuçtur. Çünkü insan hücrelerinin plastisitesi genel olarak daha düşüktür ve epigenetik engelleri daha yüksektir. Ayrıca Qiang ve arkadaşları ilk baştaki 5 faktörü denediler ve birçok nöronal özelliği taşıyan hücreler elde ettiler PSEN geninde mutasyon taşıyan Ailesel Alzhemier Hastalığı(FAD) hastalarından

hükök elde edilen iN'lar bu hastalığa özgü özellikler taşıyordu. Bu iN'ların belirli hastalıklarda model olarak kullanılabileceği fikrini doğrulayan bir gelişmeydi. 2011'de iki farklı grup araştırmacı yeniden programlamada miRNA'ların önemli birer ajan olabileceğini göstediler. Hiçbir transkripsiyon faktörü eklemeden direk olarak miRNA'lar ile insan ve fare iPSC'leri elde ettiler. Yine 2011'de Yoo ve arkadaşları insan fibroblastlarından miR-9/9* ve miR124 ile nöron benzeri morfolojiye sahip ve MAP2(bir pan-nöronal marker) eksprese eden hücreler elde ettiler. Ancak bu hücreler tam bir iN değildiler. Daha sonra ilaveten NeuroD2, Ascl1 ve Myt1l eklediklerinde daha yüksek dönüşüm verimliliğine sahip iN'lar elde ettiler. Daha sonra Pang ve arkadaşları miRNA'ların Brn2'nin görevini üstlendiğini ve nöronal diferansiyasyonu engelleyen bir proteinin ekspresyonunu baskıladığını buldular. Fibroblast ve hepatositlerden, sadece BAM faktörlerini kullanarak elde edilen iN'lar uyarıcı, yani glutamaterjik nöronlardır. Farklı transkripsiyon faktörleri ile farklı nöron tipleri elde edilip edilemeyeceği önemli bir soru haline geldi. 2011'de Son ve arkadaşları fibroblastlardan motor nöron özelliklerine sahip iN elde ettiler. Bunun için BAM ile beraber 4 farklı transkripsiyon faktörü

makale (Lhx3, Hb9, Isl1 ve Ngn2) kullandılar. Elde edilen iMN'lar tavuk omuriliğine transplante edildiğinde ventral boynuza yerleştikleri gözlendi. Ayrıca G93A mutasyonuna sahip Sod1 genine sahip glialar(ALS hastalığının ailesel formunda görülür.) ile birlikte kültür yapıldığında iMN'ların hayatta kalımları azaldı. 2011'de iki ayrı grup dopaminerjik iN'lar üzerine çalıştılar. Pfisterer ve ekibi BAM ile birlikte Lmx1a ve Foxa2 kullandılar ve tirozin hidroksilaz ile aromatik aa. dekarboksilaz enzimlerini(katekolamin sentez yolağı enzimleri) eksprese eden ancak dopamin salmayan iN'lar elde ettiler. Caiazzo ve arkadaşları ise Ascl1, Nurr1 ve Lmx1a kullandılar. Onların elde ettikleri iN'lar ayrıca dopamin de salıyordu. Ancak her iki çalışmada da hücreler orta beyin markerlarını eksprese etmiyorlardı. Bu klinik uygulama için önemli bir sınırlamaydı. Bunun üzerine Kim ve arkadaşları önce sadece Ascl1 ve Pitx3 kullanarak, daha sonra bunlara Nurr1, Lmx1a, Foxa2 ve En1 eklerek orta-beyin markerlarını eksprese eden iN'lar elde ettiler. Ancak in-vivo deneylerde bu hücrelerin yeterince etkili olmadığını gözlemlediler. Hücre-yenileme temelli klinik terapilerde çok sayıda hücreye ihtiyaç duyulduğu için fibroblast-

Şekil-1: Fare ve insanda fibroblasttan ve hepatositlerden uyarıcı nöronlar, dopaminerjik nöronlar, motor nöronlar ve nöronal progenitör hücreler(NPCs) elde edebiliyoruz. Farklı çalışmalarda kullanılan alternatif transkripsiyon faktörleri parantez içinde gösterilmiştir. mayıs 2012 71

makale

hükök Şekil-2: Normal şartlarda dört Yamanaka faktörü iPSC oluşmasını sağlarlar(1). Ancak kısa süre bekletirsek kararsız pluripotent hücreler oluşur ve ortama göre nöronal öncüllere farklılaşabilirler(4). Direk yeniden programlama(3) BAM faktörleri ile olur. Gelecekteki çalışmalar (2) 'deki gibi direk programlamaya yönelik olacaktır.

olarak farklılaşır. Daha sonra aktif ve pasif membran özelliklerinin kazanılması, hiperpolarize dinlenme potansiyeli, kapasitansta artış ve iyon kanallarının artışına bağı dirençte azalma meydana gelir. Şekil-4: A; birkaç ince uzantısı olan Tuj1-pozitif fibroblast.

lardan direkt olarak iN yapmak yerine çoğalma kapasitesi yüksek olan indüklenmiş nöronal öncül hücre[induced neuronal precursor cell(iNPC)] etmek daha çok istenen bir sonuçtur. Bunun için Kim ve arkadaşları 2011'de fibroblastlardan iPSC oluşturacak klasik 4 faktörü eklediler. Ancak çok kısa süre beklettiler ve kültürü nöronal büyümeyi teşvik edici bir ortama aldılar. Bir süre sonra nöronal öncül hücreler birçok nöron tipi ve astrosite dönüştüler(Şekil-2). Yeniden programlamada farklı aşamalarda hücreler elde ettiğimiz için iN tanımının ve kriterlerinin belirlenmesi önemlidir. Tamamen programlanmış iN'lar nöronal morfolojiye sahip olmalı, nöron spesifik gen ürünleri eksprese etmeli ve temel iki fonksiyonel nöron özelliğine(aksiyon potansiyeli ve sinaptik iletim) sahip olmalıdır. Bunlardan bazılarına sahip hücreler “kısmi programlanmış iN hücreleri” veya “olgunlaşmamış iN hücreleri” olarak adlandırılabilir.

B; bir veya iki uzantılı olgunlaşmamış iN. C; Daha olgun iN'lar.Daha sonra ise fonksiyonel sinapsların oluşması gelir. Bunun için glia hücrelerinden salınan çeşitli faktörlere ihtiyaç vardır. Sinaps oluşumu morfolojik olarak, yüksek çözünürlüklü florasan mikroskoplar ile sinaptin, sinaptofizin, sinaptotagmin gibi çeşitli sinaptik proteinleri işaretleyerek incelenebilir. Ayrıca fonksiyonel olarak incelemek için de elektrofizyoloji kullanılabilir. Bunun için postsinaptik reseptörlere agonist verilerek, reseptör veya kanal bloker'ı varlığında ve yokluğunda akım kaydedilir. Ayrıca spontan postsinaptik akımların(PSC) kaydedilmesi de fonksiyonel inceleme için önemlidir(Şekil-5). Son gelişen özellik ise ise sinapslardaki kısa-dönem plastik değişikliklerdi. Sonuç olarak direk yeniden programlama ile elde edilen iN'lar hastalık modellemelerinde ve hücreyenileme terapilerinde yeni ufuklar açmaktadır. Ayrıca insan fibroblastlarından iN elde etme verimini arttırma, direk olarak nöronal öncül hücreler elde etme gibi yakın zamanda cevap bulmayı bekleyen pek çok yeni fikir doğurmuştur.

Başlangıçta bu uzantılar hem dendrit hem akson markerları taşırken daha sonradan bir uzantı akson

Şekil-3 yeniden programlanmanın derecesine göre kazanılan özellikleri özetlemektedir. Buna göre ilk değişiklikler morfolojik değişikliklerdir(Şekil-4). Somadan uzantılar çıkar.

72 mayıs 2012

makale

hükök

Şekil-4: A; birkaç ince uzantısı olan Tuj1-pozitif fibroblast. B; bir veya iki uzantılı olgunlaşmamış iN. C; Daha olgun iN'lar.

Şekil-5: PSC'lerin voltaj-clamp ile kaydedilmesi sonucu yandaki kayıtlar elde edilmiş. Aynı kayıdın üst tarafta gürültüsü daha az alt tarafta ise daha fazla arka planda yapılmış halini görüyoruz. 1. bölgede(siyah) kümelenmiş spike'ları, 2. bölgede(kırmızı) ise ayrı spike'lar görüyoruz

mayıs 2012 73

hükök

MAKALE Yetişkin Pankreatik Ekzokrin Hücrelerinin In Vivo Ortamda β Hücrelerine Yeniden Programlanması Armağan Keskin

ankreas hem ekzokrin hem endokrin salgıları olan bir organımızdır. Ekzokrin olarak sindirim enzimle-rinin bulunduğu pankreas özsuyunu, endokrin olarak ise çeşitli hormonları salgılar. Pankreasın histolojik özellikleri nelerdir? Histolojik olarak 2 farklı parankimal dokudan oluşur; 1-Langerhans adacıkları-endokrin salgılar 2-Asinüsler-ekzokrin salgılar Pankreasta kaç çeşit hücre grubu bulunur? 1-Ekzokrin hücreler(Amilaz) 2-Duktus hücreleri(CK19) 3-Endokrin hücreler 4-Vasküler hücreler(PECAM) 5-Mezenkimal hücreler(Nestin ve Vimentin) Peki Langerhans adacıklarında kaç çeşit hücre vardır ve hangi hormonları salgılarlar? 1-beta(β) hücreler insülin üretir. 2-alfa(α) hücreler glukagon üretir. 3-delta hücreler somatostatin üretir. 4-PP hücreler pankratik polipeptid üretir. 5-epsilon hücreler grelin üretir.

74 mayıs 2012

Bu hücreler arasında en fazla beta hücreleri ikinci olarak ise alfa hücreleri bulunur. Embriyolojik olarak ekzokrin hücreler de Langerhans adacıkları da endoderm yaprağından köken alan ön barsaktan gelişir, yani ortak bir kökenleri vardır. Ayrıca ekzokrin hücreler birbir-lerinden ayrılıp in vitro olarak çoğaltıldıklarında endokrin programların çalışmasını sağlayabiliyorlar. Pankreas hücrelerinin ortak embriyolojik orijini ekzokrin hücrelerin β hücrelere dönüşmesindeki mekanizma açısından çok önemlidir. İşte bu şekilde non-stem cell'in farklı bir hücre çeşidine dönüşmesine transdiferansiasyon denir. Aslında bir çeşit metaplazidir. Diğer bir ifadeyle farklılaşmış bir kök hücrenin kendi farklılaşma yolunda değil de daha farklı bir yolakta farklılaşmasıdır. Dediferansiasyon ise hücrelerin embriyoner duruma gelmesi ve diferansiyel karakterlerini yitirmeleridir. Solucanlarda, amfibilerde ve aynı zamanda bitkilerde görülür. Bazı otoriteler bunun kansere neden olan bir gelişim sapması olduğunu düşünmektedir. Öteki taratan ise evrimsel süreç sonucu insanların kaybettiği bir immün cevap olduğu düşünülmektedir. Reprogramming(yeniden programlama) ise DNA

hükök metilasyonu gibi epigenetik özelliklerin silinmesi ve yeniden düzenlenmesidir. Bu iki kavramı birbirine bağlayan başka bir kavram ise SCNT(somatic cell nuclear transfer)dir. SCNT ile yeniden programlama metafaz II safhasındaki olgun oositlerle yapılmaktadır. Oosit, SCNT sonrası olgun bir nükleusu embriyonik hale yani daha totipotent bir hale getiriyor. Yetişkin organizma hücreleri geri dönüşümsüz olduğu düşünülen sıralı farklılaşma basamakları sonucu oluşur. Son çalışmalar sayesinde insan kök hücresinin iPS-induced pluripotent stemcell (uyarılmış kök hücreye) yeniden programlandığı gösterilmiştir. Ayrıca bir hücre çeşidinin farklılaşmamış bir hücreye çevrilmeden direkt olarak başka bir hücre çeşidine dönüştürülmesinin de mümkün olduğu gösterilmiştir. Aslında vücudumuzda normal olarak zaten böyle bir mekanizmanın olduğu da biliniyor.Olgun B lenfositlerin makrofajlara ve pro-B hücrelere dönüşmesi bunun en güzel örneğidir.Bunun yanında dermal fibroblastların ve retinal epitel hücrelerinin kas benzeri hücreleri dönüşebilmesi de buna örnektir. Bu gelişmeler sayesinde günümüzde birçok hastalığın tedavisi için artık genetik bilimi daha ön plana çıktı. Dünya genelinde 346 milyon insanı etkileyen diabetes mellitus hastalığı için de transdiferensiasyon ile çözüm önerileri aranmaya başlandı. Bunlar içinde en önemlilerden bir tanesi ekzokrin hücrelerin, insülini asıl sentezleyen hücreler olan β hücrelere dönüştürülmesidir. Bu dönüştürme işlemi belli transkripsiyon faktörleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

makale maşık bağışıklık sistemi zayıf olan Rag1-/suşundaki farelere verilmiştir. Bunun amacı immün cevap ilişkili komplikasyonların engellenmesidir. Bu 9 faktörden hangilerinin gerekli olduğunun anlaşılması için sürekli içlerinden farklı bir tanesi çıkarılarak deneyler yapılmıştır. Faktörler önce altıya (M6) daha sonra ise üçe(M3) düşürülmüştür. M3; Ngn3, Pdx1 ve Mafa adlı faktörlerden oluşmaktadır. Ngn3 yerine NeuroD konduğunda kompleksin etkisinin azaldığı gözlenmiştir. Yeni insülin+ hücreler ilk olarak enjeksiyondan 3 gün sonra ortaya çıkmıştır. 10. günde ise endojen β β hücreler ile kıyaslanacak seviyeye geldiği gösterilmiştir. 3 ay sonra bile az da olsa varlıkları gösterilmiştir. Ayrıca M3 kompleksinin spesifik olarak pankreas ekzokrin hücrelerini etkilediği ortaya çıkmıştır. Çizgili kas ve fibroblast hücrelerinin insülin ekspresyonunu etkilemediği gösterilmiştir. Pankreasta 5 çeşit ana hücre grubu bulunduğundan bahsetmiştik. Enjekte edilen vürusların en çok hangi hücreleri etkilediğini anlamak için immünohistokimyaya başvurulmuştur. Bunun sonuncunda insülin+ hücrelerin %95'inin amilaz+ yani ekzokrin hücre olduğu anlaşılmıştır. Normalde ekzokrin hücreler β hücrelerden daha büyüktür ve şekilleri kaldırım taşı şekline benzer.Ancak yeni oluşan β hücrelerin(induced β cells) normal endojen β hücreler ile aynı boyut ve şekilde oldukları gözlenmiştir. Ayrıca yeni oluşan β hücrelerin adacık şeklinde değil de ekzokrin hücre-

β hücrelerde en az 20 farklı çeşit transkripsiyonun faktörünün eksprese edildiği gösterilmiştir. Tek tek mutasyona uğratılıp, değişikliklere bakılarak bunların içinden 9 tanesi yeniden programlama deneyleri için seçilmiştir. 9 farklı transkripsiyon faktörü pankreas hücrelerine adenoviral vektörlerle verilmiştir. Adenovirus kullanılmasının avantajı seçici bir şekilde adacık hücrelerini değil de ekzokrin hücreleri enfekte etmesidir. Böylece Langerhans adacıkları dışında oluşacak olan β hücreler (exta-islet insulin + cells) daha kolayca gösterilebilir. Her bir transkripsiyon faktörü ile nGFP(nuclear green flourescent protein)'yi birlikte sentezleyen adenoviruslar izole edilip 9 adenovirus elde edilmiştir. Buna M9(mixture of 9) denmektedir. 9 tane transkripsiyon faktöründen oluşan bu karmayıs 2012 75

makale

hükök Sonuç olarak ekzokrin hücrelerin β hücrelere yeniden programlanması dediferensiasyon olmadan gerçekleşmektedir. Belirli transkripsiyon faktörleri ile epigenetik değişiklikler yapılarak bu dönüşüm sağlanmaktadır. β hücrelerin bir arada kümelenmesini sağlayan yeni fikirler ile glukoz/insülin cevapsızlığını ortadan kaldırmak mümkün görünüyor. Bu sayede diyabet tedavisi için yeni yollar açılmıştır ve gelecekte daha çok hastalığın tedavisi için genetik temelli yöntemler geliştirilmesi açısından büyük bir adım olmuştur.

ler arasına dağılmış şekilde bulundukları gözlenmiştir. Adacık içinde bulunan β hücreler arasında sinyaller vardır. Bu sinyaller sayesinde bazal insülin sekresyonu azaltılır, glukoz ilişkili insülin sekresyonu artar. Β hücrelerin dağınık konumlanması bu bakımdan bizim için bir dezavantajdır. Yeni insülin+ hücrelerin GLUT2, glukokinaz, prohormon konvertaz ve çoğu β hücre transkripsiyon faktörlerini sentezlemesi, ekzokrin hücre genlerini (CK19,amilaz) sentezlememesi ve glukagon, somatostatin değil de hormon olarak sadece insülün sentezlemesi β hücrelerine ne kadar fazla benzediğinin göstergesidir. Yani yeni insülin+ hücrelerin asıl fonksiyonu insülinin sentezlenmesi ve salgılanmasıdır. Salınımı kolaylaştırmak için VEGF de sentezlediği gösterilmiştir. Böylece anjiyogenez uyarılmış olur ve sentezlenen hormonun kana salınması kolaylaşır. Bu hücrelerin insülün salgılayıp salgılamadığını test etmek için fareler STZ ile diyabetik hale geitirilmiştir ve ardından M3 kompleksi verilmiştir. Diyebet sebebiyle oluşan hipergliseminin düzelmesinin ardından induced β hücrelerin in vivo ortamda da insülin üretip salgıladıkları doğrulanmıştır. Deneyin son kısmı ise uyarıcı TF lerin ne sıklıkta gerektiğini anlamak için yapılan testlerden oluşuyor. Bu testler sonuncunda endojen β hücrelerin Pdx1 ve Mafa'yı eksprese ettikleri ancak Ngn3'ü eksprese edemedikleri ortaya çıkmıştır.Yani ekzokrin hücreleri β hücrelere çevirmek için TF lerin geçici olarak verilmesinin yeterli olduğu görülmüştür.

76 mayıs 2012

hükök

DERLEME Dırect Conversıon Of Human Fıbroblast To Multilineage Blood Progenitors

Ceren Yağmur Doğru

nsan fibroblastlarından indüklenmiş pluripotent kök hücresi (iPSC) oluşum mekanizması tam olarak çözülmüş değil. Ancak pluripotent özellik saptanmadığı halde öncül ve olgun hematopoetik hücre oluşturabilen insan dermal fibroblastlarının bu yeteneklerini açıklamaya yönelik yapılan çalışmalarda OCT4'ün (POU5F1 olarak da bilinir) ektopik ekspresyonu ortaya çıkarıldı. OCT4'ün ektopik ekspresyonu , özgül stokin tedavisi ile beraber pan-lökosit işareti CD45 ekspresyonunu sağlar. Bu tip hücreler daha sonra granülosit, monosit, megakaryosit ve eritroid hücrelerini oluşturur. Araştırmalar pluripotent özellik taşımadan gerçekleşen yetişkin hematopoez programının aktive olmasıyla, pluripotent kök hücre gerektiren embriyonik hematopoez programının aktive olmasının birbirinden farklı olduğunu düşüdürmüştür. Ayrıca yapılan çalışmalar insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinin (iPSC) otolog hücre yerine koyma tedavilerindeki komplikasyonlardan uzak alternatifi olarak insan fibroblastlarının kullanılabileceği fikrini doğurmuştur.

Araştırmacılar ön çalışmalarına göre insan dermal fibroblastları pluripotent yeniden programlama süresince ağırlıklı olarak OCT4 eksprese etmişlerdir. Bu süreç içinde insan pan-hamatopoetik işaretçisi CD45 de dahil olmak üzere hücre soyuna ait işaretçileri de eksprese edilmiştir. POU ailesinden OCT1(POU2F1) ve OCT2POU2F2), OCT4'ün bağlandığına benzer bir DNA motifine bağlanır ve lenfoid gelişiminde rol oynarlar. OCT4 ise hematopoezde görev alır. Araştırmacılar bu çalışmaları ile POU proteinlerinden OCT4'ün ektopik ekspresyonuyla insan fibroblastlarından multipotent kan hücresi atasına direkt dönüşümü gösterip tanımlamışlardır. Fibroblastlardan CD45+ Hücrelerin Oluşumu Pluripotentliğe doğru yeniden programlama teratom oluşturabilen stabil iPSC alt kümesi olan ve nadir görülen çeşitli hücrelerin de oluşturulduğu bir kaskat gerektirir. Bu öncül hücrelerin bir kısmı

İntersellüler ortam pluripotent durumun korunmasında ve pluripotent uyarılmanın tamamlanmasını sağlayacak yeniden programlama faktörlerinin eksprese olmasında yetersiz kalır. Bu ara maddelerin koekspres genleri nöron, mezoderm gibi farklılaşmış yapılarla ilişkili ve bazı durumlarda muhtemelen fibroblastları özelleşmiş soylara farklanması için uyarmaktadır.Bu durum fibroblastların nöron, kardiyomiyosit ve makrofaj bezeri hücreler gibi tek tip hücrelere farklanması ile alakalı olabilir. mayıs 2012 77

derleme hematopoetik hücrelere benzer morfoloji gösterirler ve insan pan-hematopoetik işaretçisi olan CD45 eksprese ederler(CD45+). Ancak aynı hücreler pluripotent işaretçisi olan Tra-1-60'tan yoksundurlar. Fibroblastlardan türemiş ve CD45+ olarak adlandırılan bu hücreler NANOG ve SOX2'ü az miktarda bulundururken tercihen OCT4 eksprese ederler. Bu durum fibroblastlardan türemiş hücrelerin farklı hücre soylarına ait morfolojilere sahip olabileceğini düşündürür. Araştırmacılar iki farklı fibroblast kaynağından (yetişkin ve yenidoğan) koloni oluşumunda OCT4'ün ve yalnız başlarınayken NANOG ve SOX2'nin rollerini karşlaştırmıştır. Transdüksiyona uğramış ve uğramamış fibroblastlar transdüksiyondan sonraki 14 ve 21. günler arasında incelemiştir (D14-D21) Transdüksiyona uğramamış veya SOX2veya NANOG transdüksiyonuna uğramış hücrelerin aksine OCT4 ekspresyonu koloninin artmasını sağlamıştır. OCT4'ün ekspresyon miktarı iPSC'deki ekspresyon miktarına benzer çıkmıştır. OCT4 eksprese eden hücreler özellikle hematopoetik benzeri CD45+ hücreler oluşumunu artırmıştır. Üstelik CD45+ hücrelerde de OCT4 ekspresyonunda artış, fibroblastların spesifik genlerinin ekspresyonunda da azalma görülmüştür. CD45+ hücrelere dönüşüm sırasında yaklaşık 1000 genin 4.günde aktivitesi artarken bir o kadar genin de aktivasyonu azalmıştır. CD45+ fibroblastlarının

oluşumunu açıkayabilmek ve düzenleyabilmek için yapılan çalışmalarda erken hematopoez için gerekli uyarıcı büyüme faktörleri yerine FLT3 ligandı ve SCF kullanılmıştır. Bu maddeler OCT4 eksprese eden fibroblastlardan(FibOCT4) CD45+ kolonilerinin oluşma frekansını artırmıştır. Bu sırada kontrol fibroblastlarında bir değişiklik kaydedilmemiştir. Bu veri erken hematopoetik büyüme faktörleriyle

78 mayıs 2012

hükök uyarılabilen fibroblastlardan CD45+ hücelerinin oluşumu için OCT4'ün yeterli olduğunu göstermiştir. CD45+ Hücrelere Dönüşüm iPSC Gerektirmez CD45+ fibroblastların oluşumu süresince pluripotentliğin korunması ve uyarılması için gerekli olduğu bilinen genlerin ekspresyonu incelenmiş. OCT4 geninin artan aktivasyonu dışında OCT4 geni transdüksiyonunun pluripotentlik genlerinin ekspresyonunda değişiklik ortaya çıkarmadığı görülmüş. Hatta POU proteinleri ailesinden olan OCT1 ve OCT2 proteinleri de transdüksiyondan etkilenmemiştir. iPSC 'lerde pluripotent işareti olan SSEA3 ve Tra-1-60 miktarı derece derece artarken sadece OCT4'ün ektopic ekspresyonunun olduğu hücrelerde bu moleküllerin ikisi de gözlenmemiştir. Bunların yanısıra tamamen yeniden programlanmış insan iPSC'in aksine aynı miktarda, transdüksiyona uğramış FibsOCT4 ve uğramamış olan fibrobastlar immün yetmezliği olan fareye enjekte adildiğinde teratom oluşumu gerçekleşmediği gibi ne fiboblastlar ne de FibOCT4 hücreler ölümsüzleşme olmamıştır. Ancak yaklaşık yedi geçiş sağlayabilmişler ve bu sırada MYC onkogeninde artış olmamıştır. Buradan çıkarılan sonuç ise pluripotent veya dönüşüme uğramış hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini göstermeyen FibsOCT4

hücrelerinin hematopoetik hücre akıbeti gösteriyor olmalarıdır. CD45+ FibsOCT4 Hücrelerin Hematopoetik Ataları Cd45+ FibsOCT4 hücrelerinin fonksiyonel olarak hematopoetik kapasitelerini belirlemek için yenidoğandan ve erişkinden CD45+ FibsOCT4

hükök fiziksel olarak izole edilmiştir. İzole edilen hücreler insan hematopoetik ataların gelişimini ve yayılmasını desteklediği bilinen bir sitokin kokteyli ile kültüre edilmiştir. İşlem sonucunda hücrelerdeki OCT4 ekspresyonu değişmemiş ve ilik-spesifik işareti CD33 ve CD13 tespit edilmiştir. Bir kısım CD45+ FibsOCT4 ileriki aşamalarda fagositoz yeteneğine sahip makrofajlara olgunlaşmak üzere M-CSF ve IL-4 ile uyarılabilen, CD14 eksprese eden monosit içermiştir. CD45+ Fibroblastların Eritroid Ve Megakaryotik Potansiyelleri CD45+ FibsOCT4 hücrelerinin eritroid hücreler dışında tüm iliksel hücrelere dönüşme imkanı olduğu saptanmıştır. OCT4 transdüksiyonu ile eritroblast işareti olan CD71 yaklaşık olarak %40 sıklıkla eksprese edilmiştir. Erken eritroid farklılaşmasını uyaran eritropoietin(EPO) FibsOCT4 kültür ortamına eklenmiştir. Fibroblastların CD71 ekspresyonunun 2 katına çıktığı, bu süre içinde glikoporin-A ve erişkin b-globin protein ekspresyonunda artma olduğu gözlemlenmiştir. Ancak fibroblastlar ve insan PKH'den türemiş hematopoetik hücrelerde b-globin protein saptanmamıştır. CD45+ FibsOCT4 EPO'nun

olmadığı ortamda b-globin protein tespit edilmemişken yalnızca b-globin proteinin ekspresyonu olmuştur. iPSC'den türemiş hematopoetik hücrelerin aksine CD45+ FibsOCT4 hücrelerinden türemiş hematopoetik hücrelerde globin ekspresyonu olmamış ve fetal globinlerin ekspresyonu da az olmuştur. EPO ile tedavi edilmiş CD45+ FibsOCT4 hücreleri ilkel ve olgun eritrosit morfolojisi göstermiş ve eritroid oluşumunu sağlamıştır. Araştırmaların sonuçlarına göre eritroid ve mega-

derleme karyosit hücre soyları kesinlikle ortak bir öncü populasyondan beraber meydana geldiği ortaya çıkmıştır. CD45+ FibsOCT4 hücrelerinin EPO ile uyarılması megakaryotik soyların oluşumunu teşvik etmiştir. Bu megakaryotik soylar megakaryotik (Mk)-CFU tahlillerinde Mk-spesifik antijenleri GPllb/llla(CD41;kırmızı-pembe koloniler) varlığı ile tespit edilmiştir. Ancak Epo tedavisi uygulanmamış CD45+ FibsOCT4 hücrelerde ve kontrol fibroblastlarında megakaryotik ata oluşumu yoktur. Sonuç olarak EPO, insan fibroblastlarından hematopoetik hücre oluşum sürecinde megakaryotik hücre soylarının ortaya çıkmasını sağlamıştır ama bu embriyonik programlar için geçerli değildir. Fibroblastlardan Oct4 Hematopoetik Programı Firoblastların hematopoetik dönüşümünde OCT4'ün rolünü anlamak için CD45+ hücrelerin oluşum ve olgunlaşma sürecinde OCT4 varlığı, ekspresyonu incelenmiştir. Süreç içinde metabolik ve gelişimsel olayları içeren moleküler yolaklarda önemli değişiklikler kaydedilmiş ve fibroblastspesifik genlerin ekspresyonunda azalma görülürken (D0, D4 ve D21)OCT4 haricinde pluripotentgen uyarımı olmamıştır. FibOCT4 hücreler hematopoetik gelişimle bağlantılı olarak hematopoetik sitokin resptörlerinin,FLT3LG ve SCF reseptörlerinin transkripsiyon faktörleri ile beraber sırasıyla aktivasyonunu artırmıştır. Fibroblastlarda NANOG ve SOX2 gibi pluripotentlikile ilgili genler ve SCL/TAL1, RUNX1,GATA1, PU.1/SPII veya C/EBPa gibi hematopoetik-spesifik genler az miktarda tespit edilmiştir.OCT4 transüksiyonuna uğramış hücrelerde ise SCL,GATA1,RUNX1 ve C/EBPa miktarında artış görülmüş ancak ilkel kan gelişimini düzenlediği bilinen PU.1 ve MIXL1 regülasyonları farklılık göstermemişti. Brachury,GATA2 gibi pluripotent durumdan mezodermal gelişimle ilişkili genlerin fibroblastlarda ve CD45+ FibsOCT4 hücrelerde bulunmuyor olması, fibroblastların hematopoetik hücrelere özelleşmesi için embriyonik-mezodermal dönüşümün gerçekleşmesinin zorunlu olmadığını gösterir. Sitokinle tedavi edilmiş CD45+ FibsOCT4 hücrelerin moleküler analizlerinde 37. Günde OCT4 miktarının azaldığı RUNX1,SCL ve C/EBP a miktarının ve hemoglobin-a, b ve d aynı kaldığı tespit edilmiş(Ek fig.17c,Fig 5d). OCT4 gibi OCT1 ve OCT2 de hematopoetik genleri düzenleyebilir. CD45+ hücreler oluşumu sırasında sitokin azaltılmış ve OCT4 ekspresyonu artarken OCT1 veOCT2 miktarı değişmeden kalmıştır. Bu da mayıs 2012 79

derleme gösterir ki OCT ailesinin diğer üyeleri OCT4'ün hedefleri arasında yer almıyor. Ancak OCT1, OCT2 veOCT4 aynı oktamer (POU) bağlanma yapılarına bağlanma potansiyeline sahip, dolayısıyla OCT4'ün OCT1 ve OCT2'nin hedef genlerini düzenleme potansiyeli vardır. Bu sebepten OCT1, OCT2 veya OCT4'ün bağlandığı varsayılan, hematopoetik, nanhematopoetik ve pluripotent genlerin promotor ve enhancer genleri incelenmiştir. OCT4 varlığı ile RUNX1, GATA1, CD45 ve SCL gen ekspresyonundaki değişikler arasında bağlantı kurulmuştur. CD45+ hücrelerinin oluşumu sürecinde hematopoetik hedeflerdeki OCT4 varlığının spesifikliğini belirlemek için OCT1 ve OCT2'nin bağlandığı nonhematopoetik promotorlar incelenmiştir.OCT4, housekeeping genlerden GADD45A ve POLR2A promotorlarına bağlandığında bu genlerin ekspresyonu artarken mezodermal gelişimle ilişkili genlerden MYF5 VE NKX2.5 ekspresyonunda artış olmadığı görülmüştür. iPSC aksine CD45+ FibsOCT4 hücrelerinde OCT; NANOG, MYC ve TBX3 promotoruna bağlanmaz. Ayrıca OCT4 kendi promotoruna bağlanırken OCT2nin promotoruna bağlanmaz.Bu geçici gen ekspresyonlarından çıkarılan sonuç OCT4'ün ektopic ekspresyonun hematopoetik programı uyarması ile fibroblastların kan hücresine dönüşümünü sağlamasıdır. Tartışma Yapılan bu çalışmalar insan fibroblast hücrelerinin pluripotent duruma geçmeden ya da mezodermal yolaklar olmadan multipotent hematopoetik atalar oluşturabilme yeteneğini gösterir. Embriyonikten erişkin hemoglobin transkripsiyonuna dönüşüm sözü edilen dönüşümün de taslağını çizmiştir. İnsan PKH'den ayrılmış hematopoetik hürelerin aksine CD45+ fibroblastlarda sadece hematopoetik programın aktive olduğunu gösteren erişkin globin proteinleri kazandıkları görülmüştür. OCT1 ve OCT2 erişkin lenfopoiezde görev alırken OCT4'ün hematopoetik-spesifik genlerin düzenleme bölgelerine bağlandığında hematopoetik fenotipin ortaya çıkmasının ile alakalı olduğu belirtilmiştir. Ayrıca OCT4 varlığı fibroblastların ilik ve eritroid oluşturmasını sağlaöoş ancak lenfoid hücrelerin oluşumu tespit edilmemiştir.

80 mayıs 2012

hükök OC1, OCT2 ve OCT4'ün ektopik ekspresyonunun lenfoid hücre oluşturabileceği hala araştırılmaktadır. Ayrıca fare fibroblastlarından kalple ilgili, nöral ve makrofaj benzeri hücrelerin oluşmuşve yapılan diğer çalışmalarda insan fibroblastlarından unipotentten çok multipotent hücrelerin oluşuyor olduğu görülmüştür. Bunlar oluşan multipotent hücrelerin ilerde klinik teavilerde kullanılabileceğini kanıtlamaktadır. Araştırmacılar yayılma kapasitesi ve klinik uygulanabilirliği göz önüne alındığında kullandıkları tekniklerin klinik tedavilerde bu hücrelerin kullanılması için akılcı sebepler oluşturabileceğini ileri sürmüşlerdir.

hükök

tek sayfa

Kök Hücre

BÜYÜMEve FAKTÖRLERİ

STROMAL HÜCRELER Fatma Yaman

ünümüzde, kök hücrelerin farklılaşmasının kontrolü üzerinde durulmaktadır. Bu amaçla kültür ortamına çeşitli büyüme faktörleri, sitokinler ve kimyasallar eklenmiş, farklı destek hücreleri kullanılmış ve gen aktarımı ile farklılaşmanın yönlenmesi yönünde çalışmalar yapılmaktadır. Kök hücrelerin vücutta farklı hücrelere gelişebilmesi için büyüme faktörlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Büyüme faktörleri kök hücrelerinin çoğalmasını tetikler. Stromal hücreler tarafından büyüme faktörleri salınır. Tanımlanmış ortamda yetiştirilen ilk fibroblast kültürleri sığır serumu (EGF, PDGF, FGF gibi birçok büyüme faktörü içerir) ile desteklenme ihtiyacı duydu. Böylece birçok özel hücre türlerinin ek doku ve büyüme faktörlerine ihtiyacı olduğu anlaşıldı. Tespit edilen ilk büyüme faktörü olan Sinir Büyüme Faktörü (NGF) Rita Levi-Montalcini ve Viktor Hamburger tarafından 1950'li yıllarda keşfedildi. Levi-Montalcini faktörü saflaştıran Stanley Cohen ile beraber 1986'da Nobel Ödülünü paylaştı. Ayrıca 1950'de Viktor Hamburger ve Rita Levi-Montalcini, hedef dokuların, nöron sağ kalımını düzenlemede kritik bir rol oynadığını belirlediler. Koşullanan ortamdan bir tümör hücre hattının kültürdeki civciv nöronlarının fazla büyümesini tetiklediğini keşfettiler. Böylece özel hücre tiplerinin vücut geliştirmek için spesifik nişlere ihtiyacı olduğu öğrenildi. Bu nişler çözünebilir faktörler ve spesifik reseptörleri aktifleştirerek sinyal yolağını harekete geçiren birebir hücre-hücre etkileşimlerinden oluşmaktadır. Sırasıyla sinyal yolaklarının tetiklen-mesinin sonunda farklılaşma ve büyüme kontrolüyle ilgili genleri düzenleyen transkripsiyon faktörleri etkin hale geçer.

mik iliğine yerleşik bir hücre, IL-2 ve GM-CSF reseptörlerinin dışsal olarak uyarılmasıyla miyeloid soya yönlendirilebilir. Yani hücreler GM-CSF'ye maruz kaldıktan sonra lenfoid potansiyellerini kaybedip granülosit ve makrofaj üretmeye başladılar. Böylece sitokin reseptörlerinin soy-öğretici (lineage-instructive) etkisi keşfedilmiş oldu. Benzer şekilde C/EBP(alfa)(güçlü bir myeloid soy-öğretici transkripsiyon faktör) ve C/EBP(beta)'nın zorunlu ifadesi farklılaşmış B hücrelerinin hızlı ve etkili bir şekilde kendini yeniden programlamasına yol açar. Özelleşmiş hücrelerin büyüme gereksinimleri hakkında detaylı bilgiye sahip olmadan, transdiferansiyasyonu indükleyen transkripsiyon faktörlerle ilgili deneylerin gerçekleşmesi mümkün olmazdı. Çünkü in-vitro olarak farklılaşmayı kontrol etmek için kültür ortamında destek hücreler ve sitokinlerden yararlanılmaktadır. Örneğin, C / EBP(alfa) tarafından pre-B hücrelerinin makrofajlara dönüşümü için hem B hücreleri hem de makrofajların gelişimine uygun sitokinler ve stromal hücreler gerekir. Sitokinler ayrıca, pluripotency için yeniden programlamada önemli bir rol oynamıştır. Çünkü fare iPKH'ı, EKH gibi LIF gerektirir. (İnsan kök hücresi için LIF kullanılmaz, FGF kullanılır). EKH'nin büyümesi ve pluripotency halinin sürdürülebilmesi için gerekli bir faktör olan LIF'in keşfi, Oxford Üniversitesi ve Heidelberg Avrupa Moleküler Laboratuarında 1988 yılında yapıldı. LIF in ortamdan kaldırılması kök hücreyi farklılaşmaya iter. Daha sonra, Cambridge Üniversitesindeki(UK) Austin Smith ve arkadaşları serumsuz ortamda LIF'in yerini alabilen GSK3 ve fosforlanmış ERK inhibitörlerini buldular. Bu koşullar EKHlerin kendini yenileyen durumda kalmasını sağlıyor.

Rieger ve arkadaşları fizyolojik sitokinlerin, GCSF ve M-CSF, hematopoetik bir soy seçimini yönlendirebileceğini gösterdiler.

Rita Levi-Montalcini

Klonojenik yaygın bir lenfoid progenitör, özellikle lenfositlere (T, B ve doğal öldürücü hücreler) uyandırılacak bir ke-

EGF: Epidermal büyüme faktörü PDGF: Trombosit içeren büyüme faktörü FGF: Fibroblast büyüme faktörü G-CSF: Granülosit koloni stimule edici faktör M-CSF: Makrofaj koloni stimüle edici faktör GM-CSF: Granülosit-Makrofaj stimüle edici faktör IL-2: İnterlökin-2 C/EBP: CCAAT/Enhancer binding protein LIF: Lösemi inhibitör faktör ERK: Extracellular signal regulated kinase GSK-3: Glikojen sentetaz kinaz.

mayıs 2012 81

hükök

DERLEME Kök Hücreler ve Kardiyak Onarım Oğuzhan Serin

ök hücrenin en yaygın kabul gören tanımı; hem kendini yenileme yeteneğine sahip hem de farklı olgun hücre tiplerine farklanabilen bir hücre olmasıdır. Çeşitli kök hücre ve progenitör hücreler hücresel kalp tedavisinde kullanılmaktadır. Bu hücrelerin bazıları iyi tanımlanmış farklı fenotipik özellikler içerir ve buna göre isimlendirilir; bazıları da elde edilişine, in vitro kültürde davranış biçimi-ne, yüzey proteinleri gibi özelliklerine bakılarak adlandırıl-mıştır. Kardiyal hücre tedavisi myogenez ve anjiyogenez prensiplerini içermektedir. Buna göre bazı aday hücreler myokardiyal rejenerasyon için indüklenebilir.(Tablo 1) Günümüzde kardiyak hücre tedavisinde (myokardiyal rejenerasyon) için hangi hücreler uygun olduğu hala kesinlik kazanmamıştır. Tedavi için

82 mayıs 2012

çalışmaların sürdüğü aday hücreler; İ s ke l et Ka s M yo blastları İskelet kas hücre satellit hücreleri sayesinde hasarlı durumlarda kendilerini yenileme yeteneğine sahiptir. Uygun hücresel uyarı ile bu hücreler yeni hücreleri için öncüsü myotüplere farklanabilir.(1,2,3) Hücresel tedavide kullanılacak myoblastlar iskelet yetişkin kas biyopsileri izole edilebilir ve in vitro kulanımına(Tablo3) çok uygun olması myoblastları kardiyak hücre nakli için bu hücreleri iyi bir aday haline getirmektedir. Önemli kalp hastalıklarını tedavisine klinik uygulamaları vardır. Bu hücrelerin çeşitli transdifferansyona girerek kalbe özel kontraktil proteinler sentezleyebildikleri gösterilmiş.(4-5)

derleme

hükök

Mezenşimal kök hücrenin kardiyak ve diğer transplantasyonlarda geliştirilebilir uygun bir hedef olduğu gösterilmiştir.(11,18-21) Mezenşimal kök hücre uygun biyokimyasal indüksiyonla adiposit, osteoblast ve myositlere farklanabilir.(22) Mezenşimal hücre erişkin dokularından izole edilebilir, kemik iliği ve yağ hücresi bu izolasyon için iyi bir hedef olabilir. Kesin olmayan paternlerine rağmen bu hücreler kardiyak rejenerasyon için birçok artı yöne sahiptir; Buna ek olarak Akut MI sonrası yapılan çalışmalarda bu hücrelerin transferlerinin sol ventrikül fonksiyonunu belirgin ölçüde artırdığı gösterilmiş.(5,6,7) Fakat bu hücrelerin tüm kardiyak fonksiyon geliştirimi için gerekli klinik faydayı sağlayıp sağlamayacağı kesin değildir. Kemik İliği Kökenli Kök Hücreler Hematopoitetic öncül hücre transplantasyonunda önemli olmalarının yanı sıra myositlere farklanma yeteneklerine sahip oldukları 90'lı yıllardan beri bilinmektedir.(8-9) Kemik iliğinde elde edilebilen 4 hücre soyu vardır; Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ

· · · ·

Hematopoietik kök hücre Mezenşim kök (10) Multipotent erişkin kök hücre( 11, 12) Progenitör endotel hücrler (13)

Kemik iliği kökenli mezenşimal hücrenin 5azacytidine ile yapılan kültürde kardiyomyositlere farklanabildiği göste-rimiş. (14-15-16) Bu yöndeki bulgular araştırmacıları klinik uygulamalar için cesaretlendirimiştir. Orlic'in çalışmasın farelerde %68 varan infakte myokard duvarı rejenerasyonu görülmüştür.(17) Bu hücrelerin transferinde temel sorun fibrotik yaraya transferden sonra fibroblastlara farklanabilecek olmalarıdır. Buna paralel olarak Akut MI sonrası kemik iliği kökenli hücrelerin myokardiyal rejenerasyonu sağlamadığını kanıtlayan çalışmalar da mevcuttur. Erişkin Mezenşim Hücreleri

Kalp hücreleriyle aynı gelişim yoluna sahip oldukları için transplantasyondan sonra da farklanmalarına devam edebilecekleri düşünülüyor. Ayrıca bazı araştırmacıların da belirttiği gibi kardiyak rejenerasyon için sadece basit bir transfer ve doku yenilenmesi yeterli değildir. Bunun yanında Mezenşim kökenli birçok hücrenin (damar hücreleri ve fibroblastlar vb) rejenerasyonu gereklidir. Bir diğer olumlu yan ise; mezenşim hücrelerinin sahip oldukları immünmodulasyon kapasiteleri nedeniyle transplante hastalara immünsupresyon gerekmeyebilir.(23) Bu yönleriyle hastalara yarar anlamında çok önemlidirler. Nitekim transplante hastaların çoğu hayatları boyunca immünsupresyonla yaşamak zorunda olabiliyorlar. İnsan deneylerine geçmeden önce kemirgenlerde yapılan klinik yararlık deneylerin infakt bölgesi ve LV fonk siyonlarına yönelil olumlu sonuçlar alınmıştır.(24,25) Embriyolojik Kök Hücre İç blastosit (6 günlük) kitlesinde elde edilebilir ve tüm kök hücre tiplerine dönüşme yeteneğine sahiptir. Fakat bu hücrelerle yapılan çalışmalar immünolojik ve etik bariyerlere takılmaktadır 26 ayrıca kontrol edilmesi zor olduğu için teratoma oluşturma riski de fazladır. Embriyonik kök hücre kullanımının tartışıldığı günümüzde fibroblastlardan indüklenen pluripotent kök hücrenin kardiyak myositlerin genetik mayıs 2012 83

derleme

hükök sonrası fetal kardiyak hücre transplantasyonunda klinik fayda görülmüştür(29-31) Bu hücreler normal paternlerinde zaten erişkin kardiyak myositlere farklaşacakları için çok önemli terapatik hedeflerdir. Buna ek olarak kardiyak hücre transplantasyonu için önemli birçok mekanizmaya sahiptir. Neovaskülarizasyonu tetikleyen angiyogenik faktör salgıladıkları gösterilmiştir.(32) Araştırmacıları bu hücrelerin iyi yaşamları, çoğalmaları ve erişkin kök hücrelere farklanmaları nedenliyle diğer kök hücrelere göre daha faydalı olacağı görüşünde birleşmişlerdir. Embriyonik kök hücre tartışmalarının benzerleri fetal hücreler için de yaşanmaktadır. Bunlar da bu çalışmaların gelişimini oldukça kısıtlamaktadır. Endotel Progenitör Hücreler Hücre transplantasyonun geçerli olması için öncelikle preklinik deneylerde faydalarının görülmesi bu faydaların ürüne dönüştürülmesi çalışılması gerekir.

ve fenotipik özelliklerine uyum sağladıkları gösteren çalışmalar mevcuttur.(27)

Anjiyogenez ve neovaskülarizasyonun hasarlı miyokard için önemli bir terapatik mekanizma olduğu önceden beri bilinmektedir.

Fetal Kardiyak Myoblast Fare myokardiyumuna başarılı Fetal kardiyak myosit transplantasyonu daha önce belirtilmiştir.(28) Ayrıca bazı hayvan deneylerinde Akut MI

Hücre transplantasyonundaki çalış-malar endotel progenitör hücrelerin kardiyak hücre tedavisinde kullanabileceği gösterimiştir. Bu hücreler periferik kandan, otolog arter ve venlerin intima tabakalarından elde edilebilir ve otolog hücre donorü olarak başarılı bir şekilde kullanılabilir.(33-34) Buna ek olarak endotel progenitör hücrelerin kardiyomyositlerin indüklemesiyle kalp hücrelerine transdiferansiye olabildikleri görülmüş.(35-36) Bu hücreler geniş kapiller ağlar sağlayabilir fakat yeterli conduit damarları indükleyemez. Düz Kas Hücreleri Bunlar damarlardan, vermiform appendixten ve uterustan elde edilebilir. Myokardiyal fonksiyonların iyileşmesi, fibrotik doku azalması gibi faydaları görülmüştür.(37)

84 mayıs 2012

hükök Klinik Yararlılık Erişkin myokardiyumu infarkt sonrası tamir için kendini yenileme yeteneğine sahip değildir. Tedavi için kullanılan hücresel kardiyomyoplasti infarkte dokuların fibrozisi ve büyüklüğü azaltılır, iskemi sonrası zararlı mekanimaları engeller ve myokardiyal kontraktilte sağlar(Tablo 2).

derleme hücrelerden elde edilebilecek yeni, fonksiyonel, elektriksel olarak entegre kalp için preklinik tecrübeler henüz çok yeterli değildir. Bu sebeple yeni deneysel çalışmaların klinik çalışmalara yön verecek olması, transplantasyon için tüm moleküler mekanizmaları açıklayacak olması gerekir. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda en dikkat çekici mekanizmalar parakrin ve anjiyognez teorilerdir. Kök hücre transplantasyonun anjiyogenik etkisinin donör hücrelerden kaynaklı değil asıl olarak ana myokardın parakrin etkisiyle açıklanmaktadır. Bu yüzdendir ki bu 2 dikkat çekici mekanizma tek bir açıklamada birleşmektedir. Bu parakrin etki myokardiyal koruma, neovascularizasyon, olası patolojikleri engelleme, kardiyak miyosit metabolizması geliştirme gibi özelliklere sahiptir.(41) İnsan Deneyleri ve Doku Mühendisliği Çalışmaları

Uygulamalara Yönelik Yaklaşımlar Son yıllarda yapılan myokardiyal kök hücre transplantasyon çalışmalardan sonra akut koroner olaydan sonra yapısal ve fonksiyonel getiri amaçlı progenitör ve kök hücre transplantasyon çalışmaları hızlanmıştır. Hatta yaşlanmış kalplere yapılacak transferlerin fonksiyonel olarak fayda getirebileceği düşünülmektedir. Fakat bu yöndeki bulgular ve teorik tartışmalar henüz netlik kazanmamıştır. Doğrudan enjeksiyon için genellikle koroner bypasslı açık cerrahi girişimler düşünülmektediri, fakat altenatif olarak minimal invazif torokoskopik enjeksiypn ve hatta daha az invazif olan transventriküler kateter bazlı enjeksiyon alternatif bir seçenek olarak gözükmektedir. Tüm bu işlemler doğru uygulanması için elbette elektriksel haritalama gerekmektedir. buna yönelik olarak Biosense NOGA sistemi geliştirilmektedir.(38-40)

Günümüze kadar 100'ün üzerinde kardiyak transplantasyonla ilgili çalışmalar vardır. Akut MI sonrası kan ve kemik iliği bazlı transferleri içeren birçok insan deneyleri bulunmakta ve bu yönde meta analiz çalışmalar da mevcuttur.(42-44) Kalp hastalıklarının tedavisi için hücre transplantasyonuna yönelik birçok yaklaşım bulunmaktadır. Bu önemli çalışmaların yanı yeni kalp oluşturmaya yönelik doku mühendisliği çalışmaları da vardır. Yazının devamında bu yönde birçok atıf almış önemli bir çalışmanın derlemesi yer almaktadır; Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart ABD'de yaklaşık 3.000 birey nakil için kalp bekliyor; dünya çapında kalp yetmezliği olan 22 milyon kişi

Hücre transplantasyonlarında enjekte edilen hücre konsantrasyonların çok dikkat edilmelidir aksi takdirde enjekte bölgenin/enjektatın vizkositesi ile sonuçlanabilir. Mekanistik Açıklamalar ve Sınırlılıklar Günümüze kadar yapılan çalışmalarda donör mayıs 2012 85

derleme

yaşıyor. Yılda 550,000 'e yakın yeni vaka teşhis edilmektedir. Kalp transplantasyonu, son dönem kalp yetmezliği için kesin tedavidir ancak donör organların kaynağı sınırlıdır. Kalp nakli olan bireyler yaşam boyu immün baskın olarak yaşamakta, hipertansiyon, diyabet ve böbrek yetmezliğine maruz kalabilmektedir.(45)

hükök

Deneyin desellülerizasyonu aşaması sağlam tamamlamak ve deneyin devamlılığını sağlamak için en geçerli hücresizleştirme metodunu bulmak için 140 kadavra kalbi üzerinde bu işlem uygunlandı ve hücresizleştirme derecesini karşılaştırıldı.(Fig 1)

Biyoyapay kalp oluşturulması teorik olarak bu sorunları çözebilir.ve bu tür kalp dokusu girişimleri için çok çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır.(46) Yapılan kontraktil myokard yapılarının hayvan deneylerinde ve gelişmiş ventrikül fonksiyonu sağlanmıştır (47, 48, 49) Biyoyapay kalp oluşturma; kalp mimarisi, uygun hücresel bileşenler ve pompa fonksiyonu sağlanması gerektirir. Bu çalışmada, donör kalplere deterjanlar ile (koroner perfüzyon ile aktarılmış) desellülerize edilmiş. Üç boyutlu yapıyı korumak ve kalp inşası için kalp-damar iskelesi oluşturmak için, kadavra kalplerine koroner perfüzyonla doğrudan deterjan verilmiş, bu yöntemin daha uygun bir iskele oluşturmak için uygun olduğu gösterilmiştir.(50-54)

86 mayıs 2012

Fig. 1

derleme

hükök 3 deterjanın kalp hücrelerinde çekirdek ve kontaktil element görüntülemelerine göre karşılaştırıldı. SDS(Fig 1c,f) kullanımı polietilen glikol(Fig 1a,d), Triton-X-100(Fig 1b,e) ve enzim bazlı yöntemlerden daha yararlı sonuçlar verimiştir. Desüllülerize Yapının Özellikleri(Fig2) Kollajen 1 ve 3,laminin ve fibronektin desellülerize kalp matriksinde korunmuştur(Fig 2a ). 3 boyutlu ağ yapısı ve myokardiyal ECM uyumu korunmuştur. Kalan ventrikül ECM'sinde endotel ve düz kas hücreleri olmayan bazal membran sürekliliği sağlanmıştır.

Epikardiyal basal lamina altındaki epikardiyal fiberlar kaybedilmemiştir. Fiber uyumu ve düzeni desellülerize aortik duvarı ve kapaklarında korunmuştur.(Fig 2c) Fakat zar sertlik ölçümlerinde kadavra ve desellülerize kalplerde fark görülmemiştir. Yalnızca bu 2 grubunu fibrin gel kontrol grubuna göre farklar görülmüştür.(Fig.2f) Kadavra ve desellülerize kalplerin görüntülemesi (Fig 3a) Klempli ve klempsiz aort perfüzyon görüntüleri(Fig 3b)

Fig. 2

mayıs 2012 87

derleme

hükök yapay kalpte 2 erişkin kalbin %2 ve 16 haftalık fetus kalbin % 25 eş-değeri kadar pompa fonksiyonu görülmüştür.

Fig. 3 Klempli ve klempsiz aort perfüzyon görüntüleri (Fig 3b) Koroner açıklıklar çap ve şekillerini korumuş. Endotel hücreleri ve çekirdek bulunmamakta.(Fig 3d) Bu işlemde ekstrasellüler yapı, kalbin kapaklarının, damarlarının ve odalarının anatomik yapısı korunmuş. Kardiyak hücre bileşimi taklit etmek için, kardiyak ve endotel hücreler nakledilmiş ve kalp inşası için uygun fizyolojik koşullar sağlanmıştır.(55) İncelemeler kalp fizyolojisini simule eden bir biyoreaktörde 28 gün sürdürülmüş. 4 günde makroskopik kasılmalar gözlendi. Fizyolojik yükü ve elektriksel stimülasyon altında geçen 8.günde,

88 mayıs 2012

hükök Referanslar: 1. Chiu RCJ. Therapeutic cardiac angiogenesis and myogenesis: the promises and challenges on a new frontier. J Thorac Cardiovasc Surg 2001;122:851–2.

derleme 12. Shake JG, Gruber PJ, Baumgartner WA, et al. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects. Ann Thorac Surg 2002;73:1919–25.

2. Rajnoch C, Chachques JC, Berrebi A, Bruneval P, Benoit MO, Carpentier A. Cellular therapy reverses myocardial dysfunction. J Thorac Cardiovasc Surg 2001;121:871–8.

13. Chachques JC, Duarte F, Herreros J, et al. Cellular myogenic and angiogenic therapy for patients with cardiac or limb ischemia. Basic Appl Myol 2003;13:29–37.

3. Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat Med 1998;4:929–33.

14. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A.I. (1994) Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18, 1417–1426.

4. Pouzet, B., Vilquin, J.T., Hage´ge, A.A., et al (2000) Intramyocardial transplantation of autologous myoblasts: can tissue processing be optimized? Circulation. 102, III210–III215.

15. Makino, S., Fukuda, K., Miyoshi, S., et al (1999) Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clin. Invest. 103, 697–705.

5. Robinson, S.W., Cho, P.W., Levitsky, H.I., et al (1996) Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77–91. 6. Jain, M., DerSimonian, H., Brenner, D.A., et al (2001) Cell therapy attenuates deleterious ventricular remodeling and improves cardiac performance after myocardial infarction. Circulation. 103, 1920 -1927. 7. Ghostine, S., Carrion, C., Souza, L.C., et al (2002) Longterm efficacy of myoblast transplantation on regional structure and function after myocardial infarction. Circulation. 106,I131–I136. 8. Saito, T., Dennis, J.E., Lennon, D.P., et al (1995) Myogenic expression of mesenchymal stem cells within myotubes of mdx mice in vitro and in vivo. Tissue Eng. 1, 327–343. 9. Grigoridis, A.E., Heersche, J.N.M., Aubin, J.E. (1988) Differentiation of muscle, fat,cartilage,and bone from progenitor cells present in a bone-derived clonal cell population:effect of dexamethasone. J. Cell Biol. 106, 2139 –2151. 10. Chedrawy EG, Wang JS, Nguyen DM, Shum-Tim D, Chiu RC. Incorporation and integration of implanted myogenic and stem cells into native myocardial fibers: anatomic basis for functional improvements. J Thorac Cardiovasc Surg 2002;124:584–90. 11. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002;418:41–9.

16. Bittira B, Kuang JQ, Al-Khaldi A, Shum-Tim D, Chiu RC. In vitro preprogramming of marrow stromal cells for myocardial regeneration. Ann Thorac Surg 2002;74:1154–9. 17. Orlic, D., Kajstura, J., Chimenti, S., et al (2001) Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410, 701–705. 18. Toma, C., Pittenger, M.F., Cahill, K.S., et al (2002) Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105, 93–98. 19. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., et al (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143–147. 20.Sensebé L, Bourin P. Mesenchymal stem cells for t h e r a p e u t i c p u r p o s e s . Tr a n s p l a n t a t i o n . 2009;87:S49–S53. 21. Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M, Paolucci E, Stornaiuolo A, Cossu G, et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science. 1998;279:1528–1530. 22. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., et al (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143–147. 23. Kode JA, Mukherjee S, Joglekar MV, Hardikar AA. Mesenchymal stem cells: immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneration. Cytotherapy. 2009;11(4):377–391. 24. Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J, Chedrawy E, Eliopoulos N, Chiu RC. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg. 2000;120:999–1005 mayıs 2012 89

derleme 25. Nagaya N, Kangawa K, Itoh T, Iwase T, Murakami S, Miyahara Y, Fujii T, Uematsu M,Ohgushi H, Yamagishi M, Tokudome T, Mori H, Miyatake K, Kitamura S. Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy. Circulation. 2005;112:1128 –1135.marrow mesenchymal cells into CCl4-injured rats. J Hepatol. 2006;44:742–748. 26. Min JY, Yang Y, Sullivan MF, et al. Long-term improvement of cardiac function in rats after infarction by transplantation of embryonic stem cells. J Thorac Cardiovasc Surg 2003;125:361–9.REVIEWS 27. Zwi L, Caspi O, Arbel G, Huber I, Gepstein A, Park IH, Gepstein L. Cardiomyocyte Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation. 2009 Sep 28. [Epub ahead of print] 28. Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG, Field LJ. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science. 1994;264:98–101. 29. Scorsin M, Marotte F, Sabri A, Le Dref O, Demirag M, Samuel JL, et al. Can grafted cardiomyocytes colonize p e r i - i nfa rc t myo ca rd i a l a re a s ? C i rc u l at i o n . 1996;94:II337–II340. 30. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Mickle DA, Zhang J, Mohabeer MK, et al. Cardiomyocyte transplantation improves heart function. Ann Thorac Surg. 1996;62:654–660. 31. Etzion S, Battler A, Barbash IM, Cagnano E, Zarin P, Granot Y, et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 2001;33:1321–1330. 32. Van Meter CH Jr, Claycomb WC, Delcarpio JB, Smith DM, deGruiter H, Smart F, et al. Myoblast transplantation in the porcine model: a potential technique for myocardial repair.J Thorac Cardiovasc Surg. 1995;110:1442–1448. 33. Shintani S, Murohara T, Ikeda H, Ueno T, Honma T, Katoh A, et al. Mobilization of Endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation.2001;103:2776–2779. 34. Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, Silver M, et al. Bone marrow origin of endothelial p ro ge n i to r c e l l s re s p o n s i b l e fo r p o st n ata l vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res. 1999;85:221–228. 35. Condorelli G, Borello U, De Angelis L, Latronico M, Sirabella D, Coletta M, et al.Cardiomyocytes induce

90 mayıs 2012

hükök endothelial cells to trans-differentiate into cardiac muscle: implications for myocardium regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:10733–10738. 36. Badorff C, Brandes RP, Popp R, Rupp S, Urbich C, Aicher A, et al. Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes.Circulation. 2003;107:1024–1032. 37. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Merante F, Mickle DA. Smooth muscle cell transplantation into myocardial scar tissue improves heart function. J Mol Cell Cardiol 1999;31:513–22. 38. Tse HF, Kwong YL, Chan JK, Lo G, Ho CL, Lau CP. A n g i o ge n e s i s i n i s c h a e m i c myo ca rd i u m by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation. Lancet.2003;361:47–49. 39. Perin EC, Silva GV, Sarmento-Leite R, Sousa AL, Howell M, Muthupillai R, et al. Assessing myocardial viability and infarct transmurality with left ventricular electromechanical mapping in patients with stable coronary artery disease: validation by delayedenhancement magnetic resonance imaging. Circulation. 2002;106:957–961.

40. Wolf T, Gepstein L, Dror U, Hayam G, Shofti R, Zaretzky A, et al. cardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2001;37:1590–1597. 41. Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 2008;103:1204–1219. 42. Burt RK, Loh Y, Pearce W, et al. Clinical applicationsof blood-derivedand marrowderivedstemcells for nonmalignant diseases. JAMA 2008; 299:925–936. 43. Abdel-Latif A, Bolli R, Tleyjeh IM, et al. Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair:a systematic review and meta-analysis. Arch Int Med 2007; 167:989–997. 44. Martin-Rendon, E, Brunskill, SJ, Hyde, CJ, Stanworth, SJ, Mathur, A and Watt, SM. Autologous bone marrow stem cells to treat acute myocardial infarction: a systematic review.Eur Heart J 2008;29: 1807–1818. 45. Kobashigawa, J.A. & Patel, J.K. Immunosuppression for heart transplantation: where are we now? Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 3, 203–212 (2006).

hükök

derleme

46. Eschenhagen, T. & Zimmermann, W.H. Engineering myocardial tissue. Circ. Res. 97,1220–1231 (2005). 47. Zimmermann, W.H. et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nat. Med. 12, 452–458 (2006). 48. Sekine, H., Shimizu, T., Kosaka, S., Kobayashi, E. & Okano, T. Cardiomyocyte bridging between hearts and bioengineered myocardial tissues with mesenchymal transition of mesothelial cells. J. Heart Lung Transplant. 25, 324–332 (2006). 49. Robinson, K.A. et al. Extracellular matrix scaffold for cardiac repair. Circulation 112,I135–I143 (2005). 50. Dellgren, G., Eriksson, M.J., Brodin, L.A. & Radegran, K. Eleven years' experience with the Biocor stentless aortic bioprosthesis: clinical and hemodynamic followup with long-term relative survival rate. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 22, 912–921(2002). 51. Rieder, E. et al. Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127, 399–405 (2004). 52. Ketchedjian, A. et al. Recellularization of decellularized allograft scaffolds in ovine great vessel reconstructions. Ann. Thorac. Surg. 79, 888–896 (2005). 53. Chen, R.N., Ho, H.O., Tsai, Y.T. & Sheu, M.T. Process development of an acellular dermal matrix (ADM) for biomedical applications. Biomaterials 25, 2679–2686(2004). 54. Gilbert, T.W., Sellaro, T.L. & Badylak, S.F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials 27, 3675–3683 (2006). 55. Gerecht-Nir, S. et al. Biophysical regulation during cardiac development and application to tissue engineering. Int. J. Dev. Biol. 50, 233–243 (2006).

mayıs 2012 91

hükök

DERLEME Multipl Skleroz ve Kök Hücre Tedavisi Görkem Yavaş

öron kaybına bağlı birçok hastalıkta, bu kaybı geri döndürecek veya nörolojik işlevlerin iyileşmesini sağlayacak tam anlamıyla etkili, nöral ağı tekrar canlandıracak, nöron hücrelerinin rejenerasyonunu sağlayacak bir tedavi yoktur. Bu anlamda remiyelinizasyonun sağlanmasının yanında hücre replasmanıyla veya endojen nöronları uyararak onları nörogeneze sürükleyerek hasarlı nöron dokuyu onarabilecek tedavilere ihtiyaç vardır. Yetişkin kök hücresi, yukarıdaki ölçütler kapsamında plastisite kapasitesinden dolayı en umut verici adaydır. Embriyonik kök hücrelerin(ESC) tersine, yetişkin ve fetal dokulardan alınan çoğu kök hücre, alındığı dokunun özellikleriyle kısıtlı farklılaşma özelliğine sahiptir. Embriyonik kök hücrelerle yapılan ve Multipl Skleroz(1), Parkinson hastalığı(2) ve diğer hastalıkların(3) tedavisini amaçlayan çalışmalarda klinik anlamda pratikliğin yoksunluğu ve aynı zamanda bazı etiksel(4) problemlere bağlı sorunlar ortaya çıkmıştır. Uyarılmış kök hücrelerin kullanımı (iPSC), bu anlamda yeni bir ufuk yaratmış ve ESC'lerde ortaya çıkan bu problemleri ortadan kaldırmıştır(5). Ancak, bu yöntem hala emekleme döneminde seyretmekte, uzun ve kısa vadede ne tür sonuçlar yaratacağı tam olarak bilinmemektedir. Kordon kanından veya kemik iliğinden elde edilmiş hematopoietik yetişkin kök hücreleri, multipl skleroz(6) ve amiyotropik lateral skleroz(7) gibi nörolojik hastalıklarda nöron kaybını onarmak ve immün baskılama sonrası immün sistemi sıfırlamak(8) amaçlı kullanılmıştır. Ancak bu hücrelerle yapılan çalışmalarda sınırlı farklılaşma kapasitelerinden ve sadece ait oldukları dokuya dönüşebilmelerinden dolayı beyin engraftı sonrasında nöral farklılaşma gözlenmemiştir(9), bu

92 mayıs 2012

hücrelerde farklı olarak hasarlı nöronların gelişimini sağlayacak bazı nörotropik faktörlerin sentezlendiği kaydedilmiştir(10). Daha sonraki çalışmalar intravenöz enjekte edilen hematopoietik kök hücrelerin, santral sinir sisteminde biyoaktif molekül sentezleyecek ve doku onarımını sağlayacak sayıda reserve ulaştığını göstermiştir. Mesenkimal kök hücreler(MSC) ve nöral öncü hücreler (NPC) bu anlamda test edilmiş kök hücrelerdir. NPC'ler fetal beyin dokularından izole edilip tedavi için önemli plastisiteye sahiptir; çünkü bu hücreler farklılaşmadan santral sinir sisteminin ektopik perivasküler nişlerinde uzun süre canlı olarak kalabilir. Aynı zamanda bu hücreler, çevre nöral dokuyu uyarabilecek bazı faktörler üretebilir ve böylece burada proliferasyonu ve yaşam süresini uzatabilir, santral sinir sistemine infiltre olan immün hücrelerle etkileşime girebilir. Ancak, NPC'lerin nöral hücrelere dönüşme kapasitesi zayıftır, bu nedenle hücre replasmanını tam olarak sağlayamaz(11). NPC'lerin intravenöz veya intratekal infüzyonu otoimmün ensefalomiyelit, inme, medulla spinalis hasarlarında olumlu sonuçlar vermiştir. Ancak bu iyi sonuçlara rağmen, fetal nöral doku elde edilişinin zor olması, çoğaltılmasındaki teknik problemler ve MHC uyumlu olmayan konaklarda immün sistem baskılayıcı terapiye gerek duyulmasından dolayı tercih edilmeyen bir yöntemdir. Mesenkimal kök hücreler, mesodermal hücrelerin stromal öncülleri olarak neredeyse her bağ dokudan elde edilebilen –özellikle kemik iliği ve adipoz doku- hücrelerdir. Kemik iliğinden izole edilen MSC'ler plastik yapı üzerinde adherent bir şekilde büyür, fibroblast benzeri morfolojiye sahip-

makale

hükök tir ve koloni oluştururlar. Bu koloniler hematopoezi destekler, mesodermal kökendeki diğer hücrelere farklılaşır ve stromal markerları taşırlar. MSC'lerin terapatik etkisi NPC'lere benzer; ancak daha az immünojenik özellik taşır, böylece ksenojenik transplantasyonlar da yapılabilir (insan MSC'lerinin farelere transplantasyonu gibi) ve daha önemlisi insandan insana allojenik bir şekilde aktarımının mümkün olması. Bu anlamda MSC'lerin kullanımı pratik anlamda daha sık ve daha kullanışlıdır. Medulla spinalis hasarında lokal verilen kemik iliği türevli hücreler miyelin onarımı ile işlevsel olarak iyileşme göstermiştir. Başka bir çalışmada intravenöz enjekte edilen kemik iliği stromal hücreleri inme sonrası bazı anti-apoptotik moleküller ve nörotropinlerle remiyelinizasyon, endojen öncül hücrelerin proliferasyonunun uyarılması sağlanmış, hızlı bir iyileşme kaydedilmiştir. MG-132 ile oluşturulmuş Parkinson modelinde, substansiyel MSC terapisi dopaminerjik nöronların kaybını azaltmıştır. MSC'ler beyin dokusuna az sayıda lokalize olur; ancak proliferasyon, göç ve endojen NPC'lerin farklılaşmasını sağladığı için bu az sayıdaki hücrenin etkisi daha büyük olur. Bu çalışmaların tümünde insan MSC'leri kullanılmıştır, bu çalışmalarda immün ret yanıtının oluşmadığı ya da yanıtın hücrelerin etkilerini gösterdikten sonra ortaya çıktığı görülmüştür.

müştür. Bununla beraber infüzyon yapılan MSC'lerin uzun süre işlevsel kaldığı konusunda çok kısıtlı bir veri vardır, büyük çoğunluğu invivo infüzyondan sonra NK hücreleri ve γδ T hücreleri tarafından immünolojik olarak yıkıma uğrar. Az sayıda hücrenin santral sistemine yerleşmesine rağmen, MSC'ler burada doku onarımını sağlar ve periferal immün tolerans mekanizmalarını uyararak otoimmün cevabı azaltır. Bu mekanizmalar dahilinde, santral sinir sisteminde MSC'ler parakrin yolla nöral dokunun korunmasını da sağlar. Parakrin etki ile oligodendrosit öncülleri uyarılır, oligodendrogenez artar, nöral hücrelerin apopitozu engellenir, nörotropik faktörler salınır, enflamasyona bağlı oluşan oksidatif stres azalır ve mikroglia hücrelerinin aktivitesi düzenlenerek koruyucu bir profil ortaya konur. Sistemik infüzyon sonra MSC'ler lenf bezlerinde, akciğerlerde –yoğun olarak bulunduğu yer- ve hasarlı doku olan santral sinir sisteminde lokalize olur (şekil 1). Bu nedenle temel anlamda iki farklı mekanizmayla etki gösterir: 1İmmün sistemin periferal düzenlenmesi 2Nöral hücrelerin korunması Preklinik Çalışmalar

Santral sinir sistemindeki onarım mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir, ancak MSC'lerin bu konuda büyük katkısı olduğu aşikârdır. Bu etkide MSC'lerin bir diğer rolü olan immünregulasyon mekaniz-maları da etkili olduğu düşünülmektedir. MSC'ler T ve B hücrelerini, dendritik hücreleri ve doğal bağışıklık sisteminin bazı elemanlarını etkileyerek otoimmün hastalıkların patogenezinde pozitif yönde rol oynamaktadır. İntravenöz verilen MSC'ler otoimmün ensefalomiyelitli farelerde sekonder lenfoid organlara lokalize olmuş, ve burada antijen miyelin oligodendrosit glikoproteinine karşı periferal T hücre toleransını indüklemiş, böylece demiyelinizasyon sürecini engellemiş ve santral sinir sistemindeki T hücre ve makrofaj infiltrasyonuna engel olmuştur. Ancak, bu yararları infüzyon hastalık öncesi veya hastalığın en ağır geçtiği aşamalarda yapıldığında görülür, bunun yanında kronik progresif evrede MSC infüzyonunun anlamlı bir farkı bulunamamıştır. Bu anlamda MSC'ler otoimmün ensefalomiyelitte yararlı olmuştur, fakat histolojik boyama yapıldığında az sayıda hücre santral sinir sistemine lokalize olduğu ve burada nöral fenotipe dönüşebildiği görül-

MSC'lerle yapılan birçok çalışmadan önemli sonuçlara ulaşabiliriz. İlk olarak, MSC'ler başarılı bir şekilde inme, medulla spinalis hasarında ve otoimmün ensefalomiyelit gibi çok sayıda akut hastalıkta kullanılmıştır. Bu başarı, MSC'lerin immün baskılayıcı karakterleriyle örtüşmekte ve akut hastalıkların enflamasyon ve immün cevap mekanizmalarını inhibe etmektedir. İkincil olarak, MSC'ler kronikleşen nörolojik hastalıkların tedavisinde beklenenin tersine daha az etkili olmuş ve nörolojik işlevlerin düzelmesinde etkisi belirgin değildir. Nöral dokuya göçü, farklılaşma özelliği yapılan çalışmalarla zayıf bulunmuştur; bunun nedeni temel olarak MSC'lerin kendini yenileme özelliğinin az olması ve genellikle mesenkimal kökene farklılaşma eğiliminin olmasıdır. Üçüncül olarak, MSC'ler intravenöz infüzyon sonrası akciğerde toplanır ve burada MHC uyumlu olmayan konaklarda büyük bir hızla yıkıma uğrar, bu da uzun süreli santral sinir sistemi engraftını engeller. Bunca engele rağmen, allojenik MSC'ler birçok nörolojik hastalığın hayvan modellerinde başarılı olmuştur.

mayıs 2012 93

makale

hükök

Şekil 1: (A)İntravenöz enjekte edilen MSC'ler(1) santral sinir sistemine ulaşır ve burada mikrogliaların proliferasyonunu azaltır(2), nöronları enflamasyondan, iskemiden ve oksidatif hasardan korur(3), oligodendrositleri uyararak remiyelinizasyonu tetikler(4), ve gliotik hasar dokunun oluşmasına neden olan astrositlerin proliferasyonunu inhibe eder(5). MSC'lerin lokal nöral öncül hücrelerle etkileşimi endojen nörogenezi sağlar(6). (B) İntravenöz enjeksiyon sonrası çoğu MSC akciğerlerde toplanır(7), ve burada regülatuar sitokinlerle enflamasyonun baskılanması saplanır –büyük ihtimal buradaki alveolar makrofajlarla etkileşimi ile- (8). (C) MSC'ler aynı zamanda lenf bezlerine göç eder ve B hücrelerinin proliferasyonunu ve farklılaşmasını engeller(9), T hücrelerinin proliferasyonunu baskılar(10), dendritik hücrelerinin olgunlaşmasını ve T hücrelerine antijen sunulmasını engeller(11). Şekil: Uccelli A, Laroni A, Freedman M. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases. Lancet Neurology, 2011; July, 64956.

94 mayıs 2012

makale

hükök

Bazı nörolojik hastalıklarda MSC'ler ile klinik deneyler yapılmaktadır. Kaynak: Uccelli A, Laroni A, Freedman M. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases. Lancet Neurology, 2011; 10: 649-56. Aynı zamanda MSC'lerin doğal bağışıklık sistemi tarafında hızlı bir şekilde yok edilmesi ve tekrarlanan infüzyonlarında ret cevabın oluşması, MSC'lerin etkilerini akut olarak gösterdiğinin ve uzun süreli engraftlarının gerekli olmadığının büyük bir kanıtıdır. Bu terapatik etki, hücre hücre etkileşimleriyle, yüksek ihtimalle parakrin mekanizmalarla, çözümür faktörlerin çevreye salınımıyla alakalıdır. Bu nedenle, MSC terapileri nörolojik hastalıkların akut fazında uygulanmalıdır. Birçok nörolojik hastalık için MSC terapi denemeleri son zamanlarda başlamıştır, ancak etki verileri şu an için istenen düzeyde değildir. Yüzlerce hasta, yüzlerce farklı nörolojik problemle kontrol edilmeyen şartlarda tedavi edilmeye çalışılmış, hastalar sözgelişi medikal turizme yönlendirilmiştir. Bu çalışmalardan sadece birkaçı güvenli şartlarda yapılmış ve önemli etkiler kaydedilmiştir (Şekil 2, tablo). Hurler sendromlu (mukopolisakkaridoz tipIH) veya metakromatik lökodistropik hastalarda yapılan çalışmalarda hiçbir toksik etki kaydedilmemiş, belirgin bir klinik değişim olmamasına rağmen sinir iletim hızlarında belirgin bir artış gösterilmiştir(12). Yine bazı küçük çalışmalarda MSC'lerin serebral infarktta(13) gelişim kaydettiği, kemik iliği kökenli MSC'lerin medulla spinalis hasarında önemli bir fark yarattığı(14, 15), substansiyel toksik etki olmaksızın gösterilmiştir. Benzer bir şekilde otolog MSC infüzyonu ALS

hastalarında olumlu sonuç vermiştir(16, 17). Multiple skleroz üzerinde yapılan MSC'ler ve kemik iliği türevli hücre transplantasyonu faz 1 aşamalarında güvenli bulunmuştur. İntravenöz ve intratekal yapılan bu çalışmalarda anlamlı bir etki gösterilmiştir. Ancak, kök hücre terapisinin pahalı, zor ve etki derecesinin belirsiz olması daha büyük, kontrollü klinik deneylere gerek olduğunu gösterir, bunlardan sonra etkili bir tedavi yöntemi ve protokol belirlenmeli ve diğer biyolojik hastalıkların tedavisinde de denenmelidir. Uzun Dönemde Etkileri ve Güvenilirliği Multipl sklerozda kök hücre terapisi hala içinde birçok soru işareti barındırmaktadır. Özellikle kronik hastalıklarda –multiple skleroz gibi- sadece bir enjeksiyonun yeterli olup olmadığı, uygun MSC dozunun ne kadar olduğu hala bilinmemektedir. Hücre dozu hakkındaki veri hayvan modellerinden insana aktarmadaki zorluktan dolayı tam hesaplanamamakta, insandaki verilerin çoğu da hemato-onkolojik hastalıklardan gelmemektedir ki burada hücre miktarı 1x106 ile 5x106 arasında değişmektedir. MSC'lerin nöral dokuyu koruduğu ve nörogenezi hızlandırdığı, böylece hastaların işlevsel olarak iyileştiği MR görüntülemeyle incelenmelidir. Çeşitli çalışmalarda santral sinir sistemine lokalize olan MSC'ler gösterilmesine karmayıs 2012 95

makale şın bu lokalizasyonu arttıracak diğer tekniklerin de geliştirilmesi gerekmektedir. Çoğu nörolojik hastalığın –multipl skleroz gibi- multifokal olduğu düşünülürse intravenöz infüzyonun en iyi yöntem olduğu preklinik verilerle kanıtlanmıştır. Ancak fokal lezyonlar içeren diğer nörolojik hastalıklarda –medulla spinalis hasarı gibi- lokal MSC transplantasyonu daha etkili olmuş ve buralardaki santral sinir sistemi engraftını arttırmıştır. Transplant ilişkili akut yan etkiler, MS ve inme gibi nörolojik hastalıklarda kısa dönemde yok denecek kadar azdır. Uzun dönem etkileri hakkında henüz kesin bir veri yoktur, çünkü sadece sayılı çalışma MSC'lerin kronik hastalıklarda kullanımını araştırmıştır. MSC'lerin olası uzun süreli yan etkileri tümör hücre gelişmesini arttırması, bu hücrelerin immün sistem kontrolünden kaçmasına neden olması, tümör hücre göçünü arttırması, invazyonu arttırması ve hücre-hücre etkileşimiyle metastazı etkinleştirmesi olabilir. Çok nadir olarak MSC'lerin karsinojenik transformasyona uğraması da mümkündür. MSC'lerin veriliş yöntemine göre istenmeyen fenotiplere farklılaşması da bir diğer olası yan etkisi olabilir. Bunca preklinik veriye rağmen bu tedavi yönteminin uygulanabilmesi için hastalarda yeterli güvenirliğe ve etkiye ulaşması gerekmektedir. Bu anlamda bilim adamları ve klinisyenler MSC'lerin multipl sklerozda nasıl kullanılacağına dair bir

96 mayıs 2012

hükök kılavuz yayınlayarak 2010 yılında ortak yargıya varmışlardır(18). Bu kılavuzda MSC'lerin etkilerinin enflamatuar MS modellerinde MR görüntüleme temelli gösterilmesi gerektiği belirtilmiştir. Bu çalışmalar randomize, çift-kör, yarı-değişken olmalı, otolog MSC'ler intravenöz olarak verilip MR aktivitesi 6 ay sonra ölçülmelidir. Temel amaç, multipl skleroz hastalarında güvenilirlik ve intravenöz verilen hücrelerin aktivitesi öğrenmek, kontrast bölgelerin büyüklüğünün konvensiyonel 1-5 T MR görüntüleme ile 6 ay sonra belirlenmesidir. Diğer amaçlar ise MR ile hastaların işlevsel bozukluklarının takibi, iyileşme ve yeniden oluşma durumunun saptanması ve immünolojik markerlar hakkında bilgi sahibi olmaktır. Sonuç İmmün cevaplara karşı geliştirilen birçok tedaviden dolayı erken multipl sklerozda MSC terapisinin rolü küçüktür. Ancak, preklinik ve invitro çalışmalardan elde edilen verilere göre MSC terapisi gerçek nöron kaybını koruyucu etkiye sahiptir. Bu yüzden, MSC terapisi gelecek için büyük bir umut taşımakta, hem klinik hem de radyololojik enflamasyonda büyük gerileme kaydetmekte, nörogenezi parakrin yolla uyararak doku onarımını sağlamaktadır. Preklinik verilerin yeterli olmamasına rağmen, ALS ve lökodistrofi gibi diğer nörolojik hastalıklarda MSC'lerin nöron koruyucu rolü belirgin bir şekilde gözler önüne serilmektedir.

makale

hükök

Çalışma Şekli

MSC kaynağı

Veriliş Şekli

Tedavi Edilen Hasta Sayısı

Hastaların Yaş Aralığı

Doz

Verilerin Biçimi

Sonuçlar

Yorumlar

Multipl Skleroz

Mohyeddin et al

Faz 1, açık, güvenli

Otolog

İntratekal

22-40

Ortal ama 8.73x10 6 hücre

Yan etkil er, etki derecesi

Yamout et al

Faz 1, açık, güvenli

Otolog

İntratekal

34-56

32x10 6– 100x10 6 arası hücre

Yan etkil er, etki derecesi

Otolog

10 hastada intratekal, 5a in traven öz

25-65

İntratekal: Ortalama 63.2x106 hücre İntravenöz: 24.5x106 hücre

Yan etkiler, etki dereces i

Karussis et al

Faz 1-2, açık, güvenli

Güvenilirlik: iatrojenik menenjit, baş ağrısı Etki: deği şmeyen(n=4) Kötüşen(n=5) iy ileşen(n=1) EDSS MR: değişiklik yok(n=7), artmış l ezyon(n=2) , azalan lezyon(n=1) Ortalama takip: 19 ay Güvenilirlik: geçici ensefalopati, en yüksek doz MSC alan hastada nöbetl er Etki: k linik iyileşme(n=6) , kötül eşen MR verileri Güvenilirlik: ateş(n=10), b aşağrısı(n=10 ), as eptik men enjit(n=1) Etki: EDSS’de azalma

Progresif multipl skleroz, EDSS<6.0

EDSS 4.0-7.5

Aktif normal tedavile re cevap vermeyen MS

Amiyotropik Lateral Skleroz Mazzi ni et al

Faz 1, açık, güvenli

Otolog

İntraspinal

21-75

57x106 hücre

Yan etkil er, etki derecesi

Yan etkil er

Karussis et al

Faz 1-2, açık, güvenli

Otolog

10 hastada intratekal , 9 hastada intravenöz

25-65

İntratekal: 54.7x10 6 hücre İntravenöz: 23.4x10 6 hücre

Mazzini et al

Faz 1, açık, güvenli

Otolog

İntraspinal

20-61

11.4x10 5 ile 120x106 hücre

Yan etki

Geçici ağrı(n=4), geçici du yu etkileşimleri(n=6) Güvenilirlik: ateş( n=11), başağrısı(n=5) , dispnea(n=1) Etki: nörolojik hastalıklarda 6 ayda bir değişim yok Ağrı(n=7), lokalize duyu kaybı(n=5) , karıncalanma duyusu(n=1)

…

Sporadik hastalık

Serebral İskemi

Bang et al

Faz 1-2, randomize, kontroll ü

Otolog

İntravenöz

Aktif tedavi için 5 hasta, kontrol grubunda 25 kişi

54-72

5x107 hücre, iki doz

Yan etkil er, etki derecesi

Güvenilirlik: 1 yılın ardından öl üm, inme reküransı yok Etki: 12 ayın ardından kontrol grubunda daha fazla ventriküler dilatasyon, MSC grubunda işlevsel iyileşme

Orta serebral arter infarktları

Yan etki, sinir iletim hızı deği şikl ikleri, BMI

Güv enilirlik: 1. Derece ateş(n=4), 2. Derece filebit(n=1) Etki: MLD hastalarında sinir iletim hızlarında artış( n=4), BMI değişiklik yok

Daha önceden hematopoietik k ök hücre transplantasyonu yapılmış hastal ar

Genetik Hastalıklar

Koc et al

Faz 1-2, güvenl i, etkili

Allojenik

İntravenöz

Hurler sendromlu 5 hasta, metakromatik lökodistropili 6 hasta

5-25

2x106 ile 10x10 6 hücre

mayıs 2012 97

makale Referanslar: 1. Aharonowiz M, Einstein O, Fainstein N, Lassmann H, Reubinoff B, Ben-Hur T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived precursors in an animal model of multiple sclerosis 2. Ben-Hur T, Idelson M, Khaner H et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors improves behavioral deficit in Parkinsonian rats. Stem Cells, 2004; 22: 1246-55 3. Joannides AJ, Chandran S. Human embryonic stem cells: an experimental and therapeutic resource for neurological disease. J Neurol Sci 2008; 265: 84-88 4. Abbott A. Europe rules against stem-cell patents. Nature 2011; 471: 280 5. Cundiff PE, Anderson SA. Impact of induced pluripotent stem cells on the study of central nervous system disease. Curr Opin Genet Dev, 2011; 21: 1-8 6. Mancardi G, Saccardi R. Autologous haematopoietic stem-cell transplantation in multiple sclerosis. Lancet Neurol 2008; 7: 626-36 7. Appel SH, Engelhardt JI, Henkel SJ, et al. Hematopoietic stem cell transplantation in patients with sporadic amyotropic lateral sclerosis. Neurology 2008; 71: 1326-34 8. Muraro PA, Douek DC, Packer A, et al. Thymic output generates a new and diverse TCR repertoire after autologous stem cell transplantation in multiple sclerosis patients. J Exp Med 2005; 201: 805-16 9. Massengale M, Wagers AJ, Vogel H, Weissman IL. Hematopoietic cells maintain hematopoietic fates upon entering the brain. J Exp Med 2005; 201: 1579-89 10. Chio A, Mora G, Bella VL, et al. Repeated courses of granulocyte colony-stimulating factor in amyotrophic lateral sclerosis: clinical and biological results from a prospective multicenter study. Muscle Nerve 2011; 43: 189-95 11. Martino G, Pluchino S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat Rev Neurosci 2006; 7: 395-406 12. Koc ON, Day J, Nieder M, Gerson SL, Lazarus HM, Kriwit W. Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatmen of metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler Syndrome (MPS-IH). Bone Marrow Transplant 2002; 30: 215-22 13. Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann Neurol 2005; 57: 874-82.

98 mayıs 2012

hükök 14. Pal R, Venkataramana NK, Bansal A, et al. Ex vivoexpanded autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in human spinal cord injury/paraplegia: a pilot clinical study. Cytotherapy 2009; 11: 897-911 15. Ra JC, Shin IS, Kim SH, et al. Safety of intravenous infusion of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in animals and humans. Stem Cells Dev 2011; p u b l i s h e d o n l i n e M a r c h 1 7 . DOI:10.1089/scd.2010.0466. 16. Karussis D, Karageorgiou C, Vaknin-Dembinsky A, et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Arch Neurol 2010; 67; 1187-94 17. Mazzini L, Ferrero I, Luparello V, et al. Mesenchymal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: a phase I clinical trial. Exp Neurol 2010; 223: 229-37 18. Freedman MS, Bar-Or A, Atkins HL, et al. The therapeutic potential of mesenchymal stem cell transplantation as a treatment for multiple sclerosis: consensus report of International MSCT Study Group. Mult Scler 2010; 16: 503-10

hükök

DERLEME Doku Mühendisliği ve Hücre Bazlı Terapiler; Benchten Kliniğe: Yedekleme, Onarım Ve Rejenerasyon Potansiyeli Ayşe Zehra Karadere

cak ayında Akdeniz Üniversitesi'nde gerçekleştirilen yüz ve organ nakillerinin ardından yeniden gündeme gelen doku mühendisliği, kuşkusuz günümüz biyotıbbının en popüler alanı. Doku mühendisliğini böylesine öne çıkaran şey,ürettiği mühendislik harikası dokular sayesinde yakın gelecekte organ naklini tarihe gömecek olması fikri. Organ nakli oldukça uzun ve sancılı bir süreçtir; uygun bağışçı bulunması,organı vücuda kabul ettirebilmek adına kullanılan yan etkisi kaçınılmaz immün baskılayıcı ilaçlar vb. birçok problemi beraberinde getirir. Bu noktada doku mühendisliğinin temel hedefi,hasar veya kayıp durumlarında kullanılmak üzere laboratuvar koşullarında organ/doku oluşumunu sağlamak. Üstelik hastaya göre tedavi odaklı olduğu için organ naklinde karşılaşılan sorunları mümkün olan en az seviyeye düşürür. Tarihçesine bakacak olursak;'Doku Mühendisliği' terimi ilk olarak 1987'de California Üniversitesi'nden Dr. Y. C. Fung tarafından NSF'nin bir toplantısında dile getirilmiş. Konsepti ise ilk defa 1933'te şu deneyle tanıtılmış; fare tümör hücreleri polimer zarla örtülü halde tavuk embriyosunun karın boşluğuna nakledildikten sonra görülmüş ki bu hücreler pankreatik B hücreleri gibi insülin salgılayabilmiş. 1980 başlarında Burke'un yapay deri üretmesi de günümüz klinik çalışmalarına ışık tutmuş. Fakat bilimsel çevrelerin bu konuya gerçek

anlamda odaklanması ise 2 önemli makale sayesinde olmuş: bunlardan biri Nerem tarafından 1991'de 'Hücre Mühendisliği' konusunda, diğeri ise Langer ve Vacanti tarafından 1993'te 'Science' dergisinde 'Doku Mühendisliği' başlığı altında yayınlanmış. Böylece temel bilimciler, malzeme mühendisleri, biyologlar ve klinisyenlerin ortak çabasıyla bu alan günümüzde bütünüyle disiplinler arası bir alan haline gelmiştir. Şu anda doğum aşaması geride bırakılıp klinikte kullanılabilecek çeşitli ürünlerin üretilebileceği aşamaya gelinmiştir. Peki, yapay organ üretimi için gerekli prosesler nelerdir? Bahsedilen organ ve doku yapılarının geliştirilmesi dört anahtar materyal kullanımına bağlıdır: doku iskeleleri(tissue scaffolds), büyüme faktörleri, uygun ECM ve hücreler. 3 boyutlu doku iskeleleri hücre üremesini doku ve organ oluşturmak üzere yönlendirmek adına çeşitli biyomalzaemelerden üretilir. Ayrıca gerçek doku mikroçevresindeki mekanik kuvvetlere benzer etkilerin sağlanabilmesi için çeşitli biyoreaktörler kullanılır. Büyüme faktörleri hücre gelişimi çeşitlenmesi mekanizmalarında görev yapan doğal proteinlerdir, doku oluşumunda önemli rolleri vardır. Vücudun farklı bölgelerinde hasarları tamir etmede farklı büyüme faktörleri görev almaktadır; örneğin kemiklerde oluşan kırık tedavisinde kemik morfojenez proteinleri gerekmektedir. Hücreler mayıs 2012 99

derleme sağlıklı yaşayabilmek için doğal ortamlarına benzeyen yapay bir matris içinde bulunma ihtiyacı hissederler. Doku mühendisliğindeki en önemli konulardan birisi, gerekli yapay matrislerin ne şekilde tasarlanması ve sentezlenmesi gerektiğidir. Nanofibrasyon teknikleriyle ECM'yi en iyi biçimde taklit edebilecek doku iskeleleri geliştirilirken, doğal ECM nin en temel yapıtaşı olan kollajen iplikçikler temel alınır. Son ve belki de en önemli olan aşama da uygun hücre kaynağı bulmaktır. Son 20 yıldır doku mühendisleri tüm hücre tiplerini inceleyerek her bir ayrı doku oluşumu için en iyi hücreyi bulmaya çalışıyorlar. Bu noktada kök hücreler kendilerini yenileyebilme ve uygun koşullarda her türlü hücreye dönüşebilme özellikleri ile en cazip hücre kaynağı olarak gösteriliyorlar. Tüm bu materyallerin kullanımı ise şu strateji ile gerçekleştirilir: öncelikle hastadan hücreler izole dilir, bu hücreler kültürde çoğaltılır ve onlara uygun biyomekanik çevre sağlayacak doku iskelelerine yerleştirilirler. Doku oluşumu tamamlandıktan sonraysa nakil gerçekleştirilir. Bu proseslerde doku mühendislerinin karşılaştığı en büyük problemlerse; nakil sonrası dokunun yaşayabilmesi, normal fonksiyon gösterebilmesi ve çevredeki dokularla entegre olmasıdır. Ayrıca çok yakın bir zamana kadar gerçek boyutta organ sistemlerini oluşturmak üzere çalışmaları yalnızca 'makro ölçekte' gerçekleştirildi; fakat dokunun işlevsel birimlerini oluşturmak için hücresel boyutun altında nanoyapılar gereklidir. Bu yapıların üretimi içinse, özelllikle nanoteknoloji ve yenilikçi biyoreaktör teknolojisine ihtiyaç vardır. Günümüzde, bahsedilen bilimsel problemler ötesinde göz ardı edemeyeceğimiz etiksel yaklaşımlar da vardır. Özellikle embriyonik kök hücre kullanımındaki kısıtlamalar birçok ülkede hâlen tartışılmakta ve bu durum kısa vadede değişecek gibi durmuyor. Her şeye rağmen doku mühendisliği; özellikle tedavisi henüz mümkün olmayan felç ve kalp krizi gibi durumlarda en önemli tedavi yöntemi olarak görülmektedir. Yeni üretilecek yapay matrisler, biyoaktif moleküller ve hücrelerin kullanılmasıyla organ yetmezliği çeken hastaların kendi organlarının üretimi yakın zamanda mümkün olacaktır. Hayat kalitesinin yükseltilmesi için bu tür biyoteknoloji çalışmaları büyük önem taşımaktadır. Umuyoruz ki, gelecekte özellikle kök hücre araştırmalarından edineceğimiz bilgiler ve disiplinler arası işbirliğiyle etik ve teknik problemler

100 mayıs 2012

hükök ortadan kaldırılacaktır.

ejeneratif biyoloji ve bunun tıp uygulamaları biyolojik ilaçların etkin şekilde tedavi edemediği hastalık ve yaralanmalarda terapatik tedavi sağlamada umut vaad eden araştırma alanları olarak hızla gelişiyor. Özellikle rejeneratif tıp alanında kaybedilen fonksiyonun geri kazanılması adına hücre,doku ve organların gelişimine dair büyük çaplı araştırmalar yapılmakta. Konu üzerindeki genel düşünce; kaybedilen fonksiyonun kazanımında dokular ve organların, mekanik aletler ve kimyasal bileşiklerden çok daha başarılı olacağı yönünde. Son zamanlarda otolog birincil hücre izolasyonları ve çeşitli kök hücrelerden üretilen hücre terapilerini içeren çeşitli stratejiler de araştırılıyor. Bu küçük derlemede kök hücre türlerinin klinik uygulamalarının, üstesinden gelinmesi gereken problemlerin altını çizmeyi; bilim ve teknolojinin gelişimine bağlı olarak rejeneratif tıbbın rutin klinik alanı hâline gelmesini sağlayacak yolları belirtmeyi hedefliyoruz. Organ sistemleri içindeki farklılaşmış hücrelerin kaybıyla sonuçlanan yaralanmaların yol açtığı birçok hastalık ve fiziksel defeksiyon, organ sistemlerinin fonksiyonlarını yitirmelerine neden olur. Örn; Parkinson hastalığı beynin 'substantia nigra' bölgesindeki dopaminerjik nöronların kaybına bağlı gelişir ve motor fonksiyon-larını işlevsel hâle getiren distoni ve diskinezi ile sonuçlanır. Meniskal kopmalar ve omurilik hasarları da normal davranışları etkileyecek defektlere yol açabilir. Dokulara normal fonksiyonunu geri kazandıracak onarımı sağlamak adına hücre bazlı terapiler bu hastalıkların tedavisi için büyük bir umut kaynağı. Burada tartışacağımız çeşitli hücre tipleri ise şu şekilde tanımlanıyor: dokuya özgül farklılaşmış hücreler (örn; kondrositler), kemik iliği ya da nöral kök hücrelerden izole edilen progenitor hücreler ve iç hücre kitlesinden türetilen embriyonik kök hücreler. Otolog Hücre Terapisi Hasarlı dokunun onarımı için dokuya özgü farklılaşmış otolog hücreler, bireyin kendisinden alındıktan sonra ex vivoda kültüre edilir, çoğaltılır ve hücreler ikinci bir alana aktarılır. Otolog terapiye immünolojik perspektiften baktığımızda, hücrelerin bireyin kendisinden izole edilmesinin ne kadar ideal olduğunu fark ederiz. Bu, otolog terapi-

derleme

hükök yi allojenik uygulamalardan üstün kılan en önemli özelliklerden biridir. Son zamanlarda klinik uygulamaların yanı sıra çeşitli klinik öncesi modeller keşfediliyor ve bunlar kıkırdak onarımı için kondrositleri, yanıklar için keratinositleri ya da dermal fibroblastları, miyokardiyal onarım için miyositleri, MSS lezyonlarındaki miyelinlerin onarımı içinse Schwann hücre transplantasyonunu içeriyor. Sayılanlar içinde en gelişmiş iki tedavi, kıkırdak onarımı ve yanık tedavisidir. Otolog kondrosit kültürlerinden kıkırdak damar defektlerinin onarımında yararlanılabileceği ilk kez bir tavşan dizinde gösterildi. Ardından, bu teknik kliniğe uygulandı ve Genzyme Biyocerrahi desteğiyle FDA onayını aldı. Genzyme Biyocerrahi ayrıca bir otolog keratinosit kültür prosedürü geliştirdi ve bugünlerde 'Epicel' i yanık tedavisi için pazarlıyor. Otolog tedavide bireyin 'kendisinden' ifadesi her ne kadar cezbedici olsa da; dokunun çıkarılması ve hücrelerin kültürde çoğaltılmasıyla ilişkili birtakım kısıtlamalar bulunmakta. Özellikle, yetişkin dokularının yeterli sayıda hücre üretmek adına kültürde çoğalma yeteneklerinin sınırlı olduğunu biliyoruz. Bir diğer sınırlama ise, bu tip terapinin yalnızca çıkarılmaya dayanabilecek dokularda işlevsel olmasıdır, medikal markette sadece iki otolog hücre terapisinin FDA onayını almış olması da bu gerçeği doğrular nitelikte. Otolog progenitor hücrelere gelince, kaynak olarak en sık kemik iliğine başvururuz; çünkü kemik iliğindeki mezenkimal kompartmanda birçok doku tipine dönüşebilecek kapasitede hücreler vardır. Son araştırmalar da gösteriliyor ki,bu hücreler yalnızca kemik defektlerinde değil; kıkırdak, miyokardiyum, karaciğer, omurilik hasarı ve diyabette çok olumlu sonuçlar vermiştir. Fakat henüz klinik uygulamalardan bahsetmek için erken.

olmaktadır. Kadavra kaynaklı retinal pigment epitelyal hücreler de ilginç birer allojenik hücre tipleridir. İmmün bariyeri sağlamak adına kapsüllüdürler ve Parkinson tedavisinde kullanılmak üzere kültürlenmişlerdir. Titan farmasötik, bu araştırmayı kliniğe uygulamış ve bugünlerde pozitif sonuçlarla faz 2b aşamasını yürütmektedirler. Ticari amaçlı geliştirilmiş allojenik dokular, ticari otolog hücre terapileri ile benzer kısıtlamalara sahiptir. Ancak kapsülleme, doku işlemleri, tolerans geliştirilmesi ve genetik modifikasyonlar sayesinde hasta popülasyonu güvenli alıcılar hâline getirilebilecektir. Allojenik Kök Hücreler Allojenik kemik iliği transplantasyonu özellikle kan hastalıkları ve kanser tedavisinde klinikte sık kullanılan bir tekniktir. Yeni klinik denemelerse periferal kan kök hücrelerini kullanmaya odaklanmıştır. Fetüs ve yetişkin insan beyninden izole edilen nöral kök hücrelerin keşfi, nörolojik bozukluklar (Parkinson gibi) ve omurilik hasarı tedavisinde çok önemli gelişmelerdendir. Yetişkin kök hücrelerinin düşünülenden çok plastisiteye sahip olmalarına rağmen sınırlı farklılaşabilme kapasiteleri olduğu açıktır. Bu noktada embriyonik kök hücreler neredeyse tüm hücre tiplerine dönüşebilmeleriyle çok daha kullanışlıdırlar. Şu anki hedef, ksenoplantasyon stratejilerine benzer olarak, yönlendirilmiş farklılaşmayla istenen fenotipi elde edip, immün baskılayıcılar yokluğunda bunu nakletmektir.Bahsedilen iki sorunun da üstesinden gelmede en büyük avantajımız EKHlerin modifiye edilebilmesidir. Ksenotransplantasyon

Allojenik Dokular ve Hücre Dizileri Günümüzde sikloporin, FK506 ve rapamisin gibi immün baskılayıcı ilaç terapilerinin kullanımı allojenik doku transplantasyonunu klinik rutin hâline getirmiştir. Dokuların rahatlıkla transplantasyonu, immün sistemin ataklarına karşı dirençli hâle gelmeyi ya da immünosistemin azaltılmasını gerektirmektedir. Otolog hücre terapisinde olduğu gibi bu alanda da en yeni gelişmeler kıkırdak ve deri yedeklemede

Güvenilir doku kaynağı bulmaya dair yapılan araştırmalarda son 20 yıldır öne çıkan bir alan var: ksenotransplantasyon(türler arası transplantasyon). Bu alanda karşılaşılan en önemli bilimsel problem olaraksa patojen enfektivitesinin (ksenozoonosis) yanısıra immünolojik engellerin üstesinden gelinmesi gösterilir.

mayıs 2012 101

derleme mesi gösterilir. Transgenesis ve çekirdek transferi sayesinde türleri (genelde domuzları) genetik olarak modifiye edebilme olanağı doku/organ üretimi ve transplantasyonda umut vâdetmektedir. İlginçtir ki, diyabet ve nörolojik bozuklukların tedavisi için domuzdan insana FDA onaylı birçok ksenoplantasyon klinik denemeleri vardır. Ksenozoonosisin olası risklerinden korunmak adına içinde 160 insan transplant alıcının incelendiği retrospektif analizin de bulunduğu birçok araştırma yapılmaktadır. Ksenoplantasyon çalışmaları, enfeksiyon risklerini aşmak ve güvenli transplantasyon yapmak adına hâlâ FDA denetiminde yürütülmektedir. Gelecek Kök hücre diferansiyasyonu, doku mühendisliği ve ksenotransplantasyon her biri kendi alanlarında çok yüzlü problemlerle yüz yüze gelmektedir. Bununla birlikte bilim ve biyoloji ötesinde karşılaşılan en büyük sorunlardan biri,yukarıda bahsedilen FDA onaylı ürünlerin geliştirilmesi. Klinik uygulamalarda teknolojinin ilerlemesine bağlı olarak, düzenleyici prosedürler de gün geçtikçe değişmektedir. Yaptıkları deneylerle bu alandan en kârlı çıkacak olanlarsa Genzyme Biyocerrahi, Organogenesis, Diacrin, Layton Biyobilimleri ve diğer doku mühendisliği firmaları olacaktır.

102 mayıs 2012

hükök Referanslar: 1. Nerem RM, Cellular Engineering,Ann.Biomed Eng.19,1991 2. Langer R,Vacanti JP, Tissue Eng.Science 260,1993 3. Topics in Tissue Engineering 2005, Volume 2. Eds. N. Ashammakhi & R.L. Reis

hükök

tek sayfa

Berşan Özcan

ONKOGENLER nsan vücudunun normal gelişimi sırasında; anlaşılması bir hayli güç olan genetik sistemler hücre oluşumu, gelişimi ve ölümü arasındaki dengeyi büyüme sinyallerine, büyümeyi engelleyici sinyallere ve ölüm sinyallerine bağlı olarak düzenlemektedir. Hücre döngüsünün normal ve istenilen şekilde ilerlemesi için bu genetik sistemlerin doğru ve yeteri kadar çalışması çok önemlidir. Hücrede belirli genlerde ve dolayısıyla bu genlerin proteinlerinde ve ekspresyonlarında görülen değişiklikler birçok patoloji gibi kanser oluşumu için de kilit noktalarıdır.

Kanser vakalarının çoğuna, hatta hepsine neden olan hücredeki düzenin bozulması, sıklıkla tümör gelişimini indükleyen kimyasallara, hormonlara ve bazen virüslere dayanır. Bunlar gibi hücrenin genetiğini etkileyerek kanser oluşumu riskini arttıran bileşenlere karsinojen adı verilir. Kanser oluşumu (onkogenesis veya tümörigenesis), aslında, genetik ve çevre arasındaki ilişkiye bağımlıdır: Çoğu kanser, karsinojenlerle değişime ugramış genler veya DNA replikasyonundaki ve onarımındaki hatalar nedeniyle ortaya çıkar. “Hücre döngüsünü düzenleyen genetik sistemler” olarak ifade ettiğimiz başlığın altında 2 çok önemli gen grubu bulunmaktadır. Bunlar hücre döngüsünü

direkt olarak düzenleyen “proto-onkogenler” ve “tümör baskılayıcı genler”dir. Proto-onkogenler hücre büyümesi ve bölünmesinde rol oynayan, beklenildiği gibi büyüme faktörleri ve büyüme engelleyici faktörlere cevap verebilen, normal hücrelerde bulunan genlerdir. Proto-onkogenler mutasyonun etkisiyle onkogenlere dönüşerek çok fazla miktarda ifade edilirler ve böylece sınırsız hücre bölünmesine, kansere neden olurlar. Geçenlerde okuduğum bir yazıda protoonkogenleri sağlam olan hücreyi, gaz sistemi düzgün işleyen bir arabaya benzetmişlerdi ve bu gerçekten çok hoşuma gitti: proto-onkogenler sağlamsa araba sadece gaza basıldığında ilerleyecektir fakat eğer proto-onkogenler mutasyonla onkogenlere dönüştüyse araba artık gaza basılmasa bile hızlanmaya devam edecektir. Sonuç, kaza olacaktır. Onkogenler; düzensiz ve aşırı amplifikasyonlar (örn, erb2 /neu onkogenlerinin oluşumu), translokasyon düzensizlikleri, nokta mutasyonları (Örn, ras onkogenlerinin oluşumu) ve virüsler gibi dış ve iç etkenler ile aktive olabilirler. Onkogen proteinleri hücrede birçok yolakta yer almaktadırlar. Bu yolaklarda büyüme faktörü (örn, sis ve PDGF), büyüme faktörü reseptörü (Örn, erb B ve EGF reseptörleri), sinyal iletim yolu elemanı (örn, Ras), nükleer transkripsiyon faktörü (örn, cmyc) gibi görevler üstlenebilirler. Tümör baskılayıcı genler ise normalde hücre büyümesini ve proliferasyonunu engellerken, mutant olan tümör baskılayıcı genler inaktive olarak normal işlevlerini yerine getiremezler. Bunun sonucu da onkogenlerin hücreye etkisi ile aynı olur: sınırsız hücre bölünme ve büyümesi, kanser.

Şekil 1

Kanser oluşumunda etkisi olan diğer gen grubu ise, üzerinde görülen mutasyon ile kanser oluşumunu indirekt olarak indükleyen genlerdir. Bunlara mutator genler denilmektedir. Mutator genler mutasyona uğradıkları zaman diğer genlere de mayıs 2012 103

tek sayfa bunların işleyiş mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Tipik olarak birden çok gende olan mutasyon, devamlı olarak bölünen ve hücrenin normal döngüsünden çıkmayı başarabilen ve daha sık mutasyon geçiren hücreler oluşturur. Bahsettiğimiz genetik düzenin bozulması hücrede, Şekil 1'de şematik olarak görülen kanser hücrelerine özgü hücre anomalilerinin oluşumuna neden olur. Bu anomalilerin hepsinin oluşumundan tek bir gen sorumlu değildir. Yukarıda sözünü ettiğimiz üç grup gen içerisinden birkaç genin mutasyona uğramış olması, yani mutasyonların birikmiş olması gerekir.

Onkogenlerin Tarihçesi (Geçmişten Geleceğe) Rous Sarcoma Virüs'ün (RSV) Keşfi 1909'da Rockefeller Enstitüsü'nde (New York) çalışan Peyton Rous, Plymouth Rock ırkından bir tavuktaki büyük bir tümör vakasıyla işe başlamıştı. Rous, bu kanser vakasının bu soyun diğer bireylerine de geçebildiğini ve hatta bu soydan olmayan diğer tavuklara da bulaşabildiğini 1910 yılında ispatladı ve bu tömüre “Chicken Tumor No. 1” adını koydu. 1911 yılında ise bu kansere yol açan ajanın hücre bulunmayan süzüntü ile de taşınabildiğini (süzülmeye karşı koyabilen bir ajan) kanıtladı. 1914 yılında da Murphy ve Rous bu yolla geçen tümörlerin birbiriyle aynı özellikler ortaya çıkardıklarını görmüşlerdi. Bu sonuç, bu deneylerden belki de 30-40 yıl sonra keşfedilecek olan “virüslerin genetik özellik taşıdıkları” sonucu için o zamanlarda görülememiş bir ipucuydu aslında. Rous Sarcoma virüs birkaç on yıl boyunca kanser araştırmalarının dışında tutuldu fakat yine de laboratuvarlara dağıtılan RSV soylarından gelen bilgiler çoğaldıkça ço-ğaldı. Rous'un seyahatleri boyunca RSV'nin (ileride böyle adlandırılacaktı) hep en güçlü varyantları seçilmişti. En sürpriz gelişme ise 1950'lerin sonunda bu virüsün, sanıldığının aksine memelilerde de tümör oluşturabilme yeteneğinin yenidoğan fare ve sıçanlarda keşfedilmesiydi (Svet-Moldavsky, 1957, 1958; Zilber and Kryukova, 1957, 1958; Schmidt-Ruppin 1959). RSV'nin bazı varyantlarının memelilerde

104 mayıs 2012

hükök tümör oluşumunu tetiklemesi Src transforming proteinlerinin tanımlanması, yıllar sonra anlaşılabilecek kritik bir noktaydı. (Transforming gen ve proteinler, normal hücreleri tümör hücreleri oluşturmaya yatkın hale getirirler.) RSV Üzerinde Yapılan Deneylerle İlk Onkogenlerin Keşfi (c-Src ve v-Src) Santrifüj yöntemiyle yoğunluk farkına göre saflaştırılan RSV parçacıkları, bu virüslerin nükleik asitleri hakkında bir karara varılmasını sağladı. Böylece Crawford (1960) RSV'nin RNA genomu taşıdığını gösterdi. 1969'da Huebner ve Todaro, RNA tümör virüslerinin genetik olarak aktarılabileceği keşfine dayanarak, kanser için “onkogen hipotezi”ni öne sürdüler (Bu sürece kadar RNA tümör virüsleri ile ilgili çeşitli çalışmalar olmuş ve çeşitli RNA tümör virüsleri ortaya çıkarılmıştı.). Aynı zamanda hücre içerisinde kendilerini çoğaltarak ve diğer hücrelere de yayılarak tümör dokusu oluşturan bu virüslerin transforming genler/”onkogenler” taşıdıklarını ortaya koydular (Huebner and Todaro, 1969). RSV virüsünün transformasyon için bir gen içermesi fikri o dönemde Mike Bishop ve Harold Varmus'u, virüsün çoğalma döngüsünde işlevi olmayan (Goldé, 1970; Martin, 1970; Toyoshima et al., 1970) viral Src geni üzerinde düşünmeye teşvik etti. Mike Bishop ve Harold Varmus bu genin yaşamın önceki evrelerinde hücre genomundan alınmış olabileceğini de öne sürdüler. Bu fikri incelemek amacıyla Bishop-Varmus laboratuvarında çalışan Dominique Stehelin bu hipotezi inceledi ve viral Src (v-Src) genlerinin gerçekten de hücresel bir orijini (c-Src) olduğunu keşfetti (Stehelin et al., 1976). Böylece tümör oluşturan retrovirüslerin neden genelde belli bir türe özgü olduğu da anlaşıldı. Daha sonraları proto-onkogen kavramı yeni bir gen türünü tanımlamak için Huebner and Todaro tarafından icat edildi! Proto-onkogen kavramını, onkogen kavramından ayırabilmek ve onkogenlerin öncülü olduklarını belirtebilmek için büyük uğraşlar sonucu (!) icat ettiler (Ibaet al., 1984; Parker et al., 1984; Shalloway et al., 1984).

hükök

Transkripsiyon Faktörü Olarak Görev Yapan Onkogenlerin Farklılaşmayı Bloke Edebileceklerinin Gösterilmesi Dominique Stehelin, Martine Roussel, Hartmut Beug and Thomas Graf, avian leukemia virüs E26'nın ve AMV'nin (Avian Myeloblastosis Virus), fetal hematopoetik kök hücre oluşumunda gerekli olan bir transkripsiyon faktörüne karşılık gelen (Mucenski et al., 1991) v-Myb onkogen çeşidini içerdiğini gördüler (Roussel et al., 1979). İki tane vMyb içeren virüsler seçici olarak myeloblastları (granülositlerin ve makrofajların öncülü) kanser hücrelerine dönüştürürler (Beug et al., 1979). Ayrıca daha önemli olarak, v-Myb aynı zamanda makrofajların myeloblastlara dediferesensiayonunu indükleyeceği gösterildi (Beug et al., 1987; Ness et al., 1987). Ancak transkripsiyon faktörleriyle indüklenen transdiferensiasyonun aksine, hücre fenotipini değişmiş pozisyonda tutmak için vMyb'nin sürekli olarak ifade edilmesi gerekir, çünkü myeloblastlarda inaktive olduğu durumlarda bu hücreler fonksiyonel makrofajlara dönüşürler (Beug et al., 1984). Bu da onkogenlerin indüklemek yerine myeloid hücrelerinin farklılaşmasını seçici olarak bloke ettiğini gösterdi. Burada hücre farklılaşmasıyla ilgili v-Myb'nin davranışı çoğu kanserde onkogenlerin yaygın bir davranışı olarak görülmektedir.

tek sayfa

kan dokumuz gibi dokularda da kanserleşme görülebilmektedir. Burada kanserleşen doku farklılaşmış hücrelerin meydana getirdiği bir tümörden değil, bu hücrelerin atalarının oluşturduğu tümörden meydana gelmektedir. Bu öncü hücrelere progenitör hücreler denir. Aynen bir dokunun içinde farklılaşmış hücreler ve onların öncüllerinin bulunması gibi tümör dokularında da bölünmeyi kesmiş ve bölünmeye son hızıyla devam eden iki hücre tipi bulunur. Böyle tümör içerisinde de tümör dokusundaki diğer hücrelere oranla çok hızlı bölünme yeteneğine sahip olan hücrelere “tümör kök hücreleri” denir.

Tümör Kök Hücreleri Onkogenik mutasyonların kansere yol açabilmesi için bu mutasyonların bölünebilir hücrelerde olması ve dolayısıyla yeni bölünen hücrelere bu mutasyonların aktarılması gerekmektedir. Kas ve sinir dokuları gibi bölünmeyen dokularda meydana gelen onkogenik mutasyonların çoğunlukla kanser oluşturmamalarının nedeni de bölünmediklerinden dolayı tümör oluşumuna yatkın olmayışlarındandır. Fakat, yine de eritrositlerimiz ve lökositlerimiz gibi çoğunlukla farklılaşmış hücrelerden oluşan mayıs 2012 105

hükök

DERLEMELER Kök Hücre, Kanser ve Kanser Kök Hücreleri Damla Erimhan, Ülke Kocademir, Merve Cansu Kaya Kanser kök hücresi nedir? Özellikle son yıllarda birçok araştırmaya konu olan kanser kök hücreleri (KKH) tümör dokusu içinde veya hematolojik kanserlerde bulunan ve normal kök hücre özelliğine sahip olan kanser hücreleridir. Yani bu hücreler kanser hücrelerinin kendi kendilerini yenileme ve farklanma özelliği olan alt gruplarıdır. Bu özellikleriden dolayı tümör oluşturucu (tümörojenik) yapıdadırlar ve 'kanseri başlatan hücre ' olarak da adlandırılmaktadırlar. İlaç ve radyasyon tedavisine dirençli olan bu hücrelerin tümör dokusu içinde ayrı bir popülasyon olarak kaldıkları, yeni tümörler oluşturarak metastaza ve kanserin yenilenmesine sebep oldukları düşünülmektedir. Bu yüzden KHH spesifik tedavilerin geliştirilmesiyle özellikle metastatik kanserlerden kurtulma şansının artacağı ümit edilmektedir. KHH'nin tarihçesi: Kanser kök hücresiyle ilgili araştırmalar son yıllarda oldukça artış göstermiş olmakla beraber kanser

hücrelerinin kök hücreleri anımsatan özelliklere sahip olması fikri yeni bir teori değil. Bu teori ilk olarak 19. yüzyılda Rudolph Virchow ve Julius Cohnheim tarafından kabul edilmiş. Virchow 'embriyonal rest hypothesis' hipotezinde fetal dokuyla kanser hücreleri arasındaki yenilenme ve farklılaşma özellikleri bakımından benzerliklerini vurgulamıştır. Daha sonra Cohnheim ve Durante bu hipotezi mature organlardaki embryonik kalıntıların varlıklarını göstererek genişletmişler ve Beard kanserin aktifleşmiş germ hücrelerinden ya da plasental dokudan köken aldığı hipotezini savunmuştur. Tüm bu hipotezlerde kanserin kökeninin farklanabilmesi, yenilenebilmesi ve çoğalması bakımından gelişmekte olan embriyo hücrelerine benzeyen hücrelerden oluşturduğu fikri gelişmiştir.Tümör hücrelerinin diferansiye tümör oluşturucu özelliği olan hücreler içerdiği ilk olarak 1961 yılında kanıtlanmıştır. Southan ve Brunschwig hastalardan alınan rekürent kanser hücrelerini kültür ortamında yetiştirip ototransplantasyon yöntemiyle farklı bölgelere aktardığında görülmüş ki yeni bir tümör oluşturabilmek için en az bir milyon hücrenin enjekte edilmiş olması gerekiyor ve bu çalışmaların yaklaşık olarak da yüzde ellisi sonuç veriyor. Bu konuda daha sonra yapılan çalışmalar da benzer sonuçlar göstermiştir.Bu çalışmalar sonucunda tüm hücrelerin tümör oluşturucu özellikte olmadığı ve tümör oluşturan hücrelerin arasında bir hiyerarşinin mevcut olduğu öne sürülmüştür. Kanser hücrelerinin hiyerarşisi ilk olarak lösemi hakkında Lapidot ve meslektaşları tarafından 1994 yılında kanıtlanmıştır. Akut myeloid lösemi hastalarından izole edilen CD34+CD38- hücrelerinin nonobese/severe immun deficiency (NOD/SCID)

106 mayıs 2012

hükök farelere enjekte edildiğinde tümör gelişimi olurken daha çok farklanmış olan CD34+CD38+ hücreleri çok fazla miktarlarda verilse bile tümör oluşturmadığı ve hatta CD34+CD38- hücrelerinin morfolojik açıdan hastadaki orijinal hastalığa benzediği gösterilmiştir. Lösemi kök hücresi araştırmasında oldukça ilerlenmiş olmasına rağmen Al-Hajj , Clarke ve meslektaşları tarafından ilk olarak 2003 yılında meme kanser kök hücreleri rapor edilene kadar solid tümör kök hücreleri çok fazla dikkat çekmiyordu. Bu çalışmada CD44+CD24- yüzey belirteci olan insan meme kanseri örneklerinden izole edilen oldukça tümörojenik bir popülasyonun, NOD/SCID farelerde tümör oluşturma kapasitesinin çok yüksek olduğu görülmüştür. CD44+CD24- olan bu hücrelerin 100 tanesi bile tümör oluşturmaya yeterken on binlerce CD44-CD24+ hücre oluşturamamıştır. Daha sonra yine 2003 yılında Singh ve meslektaşları tarafından KKH'leri insan beyin tümörlerinde ,2007 yılında Ricci-Vitani ve meslektaşları tarafından kolon kanserinde ve Li ve meslektaşları tarafından pankreas kanserinde KKH'leri tanımlanmıştır. Bunların dışında KKH'leri prostat,karaciğer,baş ve boyun, akciğer ve deri gibi birçok kanserde de tanımlanmıştır. Ayrıca KKH'lerinin ilaçlara dirençliliği Dean, Fojo ve Bates tarafından 2005 yılında , radyoterapiye dirençliliği konusu Diehn ve Clarke tarafından 2007 yılında ,terapatik resistansı konusu Eyler ve Rich tarafından 2008 yılında çalışılmıştır. 2007 yılında Stingl ve Caldas tarafından yapılan 'Meme kanserinin moleküler heterojenitesi ve KKH hipotezi' 2008 yılında Li ve meslektaşları tarafından yapılan 'Meme KKH'lerinin kemoterapiye intirinsik resistansı' çalışmaları da bu konuda yapılan birçok önemli çalışmanın sadece birkaçıdır. KKH'lerinin kökeni : KKH'lerinin kökeni tam olarak bilinememekle birlikte hala bir araştırma konusudur. KKH'lerin normal kök hücrelerden veya çeşitli mutasyonlara maruz kalan progenitör hücrelerden köken aldığı düşünülmektedir. Lösemi kök hücreleri ve beyin kanseri kök hücreleri normal kök hücrelerle benzer yüzey belirteçlerine sahiptirler. Ayrıca bazı KKH türlerinin normal kök hücrelerdeki yenilenme (selfrenewal) yolaklarına (Notch , wnt , sonic hedgegog (Shh) gibi ) sahip olmaları KKH'lerinin kökeninin kök hücreler olduğunu düşündürmüştür. Ancak

derleme KKH'lerinin kök hücrelerden köken alması her zaman gerekmeyebilir.Mature hücrelerin hücre füzyonu veya horizontal gen transferiyle geri diferensiyasyona veya transdiferansiyasyona uğramasıyla da oluşabilirler. Hem genetik hem de epigenetik faktörler bu transformasyonda etkili olabilir. KKH'leri farklı maturasyon aşamalarından köken alıyor olabilirler. Bu hipotez hem beyin hem de meme kanseri araştırmalarından elde edilen bilgilerle desteklenmiştir. Bu çalışmalarda Ince ve meslektaşları aynı genetik kökenden gelen insan mammary (?) epiteli hücrelerinin ve birincil breast(?) epitel hücrelerinin transformasyonundan 2 farklı tümör elde etmiştir. Squamos hücre karsinomasına benzeyen ve MEGM kültür ortamında transforme olmuş insan mamary epitel hücrelerine kıyasla Wli olarak tanımlanan serumsuz kültür ortamında transforme olmuş birincil breast epitel hücreleri breast adenokarsinomaya çok daha fazla benzemekle birlikte tümörojenitesi ve metastatik yeteneği de daha fazladır. Aynı zamanda beyin tümörlerinin hem nöral öncüllerden hem de diferansiye hücrelerden oluştuğu rapor edilmiştir. Buna rağmen ilginç bir şekilde öncül hücrelerden köken alan tümörler astrositlerden köken alan tümörlere göre daha az malign bulunmuştur. Tümör hücreleri farklı hücre türlerinden köken aldığı için KKH'leri arasında bir hiyerarşiden söz edilebilir. Bu yüzden spesifik tümör türlerinde KKH'leri her zaman aynı yüzey belirteçlerine sahip olmayabilirler. Son zamanlarda yapılan çalışmalardan glioma kök hücrelerinin bir türünün CD133 yüzey belirtecini eksprese etmemesi bu hipotezi kanıtlar. Buradaki hiyerarşide hücresel heterojenite kastedilmiştir. Fakat buradaki heterojenite tümörü çevreleyen invaziv endotelial , hematopetik hücre veya diğer kanser olmayan hücre anlamında kullanılmamaktadır. Buradaki heterojenite daha çok tümördeki kanser hücrelerinin farklılığı anlamında kullanılmaktadır. Heterojenitenin nedeni farklılaşmış kanser hücrelerinin ya farklı kök hücrelerden kaynaklanmasından ve/veya farklı mutasyon profillerinin yansımasından kaynaklanmaktadır. Bu farklılıklarla hücrenin moleküler profillerinin belirlenebileceği ve böylece kanserin önlenmesi ve uygun tedavi stratejisinin geliştirilmesi için doğru hedefin seçilmesinin sağlanabileceği düşünülmektedir. Kendi-kendini yenileme, farklılaşma ve kanser mayıs 2012 108

derleme oluşumundaki sinyal ileti yolları: Kanser kök hücreleri kanser hücrelerinden birçok bakımdan farklıdır. Bu farklılık sadece KKH'lerinin oksijensiz çevreye, radyasyona ve standart kemoterapi ilaçlarına karşı dirençli olmalarından kaynaklanmaz. Aynı zamanda sinyal ileti yolları bakımından da farklılık gösterirler. Özellikle normal kök hücrelerin yenilenmesini düzenleyen Notch ,Wnt ,Sonic hedgegog (Shh) gibi gelişimsel ileti yollarının KKH'leri için önemli olduğu ileri sürülmüş ve birçok KKH'si için doğrulanmıştır. Bu ileti yollarının yenilenme üzerindeki etkilerinin anlaşılması tümör oluşumunun anlaşılmasına yeni ışık açmıştır. Normal ve transforme olmuş kök hücrelerin kendi-kendilerini yenileme mekanizmaları benzer sinyal ileti sistemleri ile, fakat farklı şekilde düzenlenmektedir. Lösemi ve hepatoseluler karsinoma kök hücreleri için önemli olduğu gösterilen Wnt sinyal ileti sistemi, reseptörlerinin bağlanması ile aktif hale gelir, β-cateninin yıkılımı kompleksinden ayrılmasını sağlar ve nükleusa geçer ve burada Cyclin D1 ve C-MYC gibi genlerin tarnskipsiyonunu düzenleyerek kök hücrelerin kendi-kendini yenilemesini ve farklılaşmasını sağlar. Transgenik farelerde yapılan in vivo çalışmalar, epidermal kök hücrelerde Wnt sinyal ileti sisteminin aktif hale gelmesiyle epitel hücre kökenli kanserlerin oluşumuna öncülük ettiğini göstermektedir. Wnt sinyal ileti sistemi, kök hücrelerin kendi-kendilerini yenilemesi mekaniz-

109 mayıs 2012

hükök masına sadece farklı epitel hücrelerinde değil, aynı zamanda hematopoetik kök hücrelerde de katılır. . Multiple myeloma , beyin ve meme kanserinde tümör kök hücresi bölümleri elde edilmesinde önemli olduğu rapor edilen Shh sinyal ileti sistemi de kendi-kendini yenileme mekanizmasının düzenlenmesine katılmaktadır. Normalde kök hücrelerinin kendi-kendilerini yenilemesini düzenleyen sinyal ileti sistemleri, sistemde aksilik olduğunda tümör oluşumuna öncülük eder. Lösemi-öncü hücrelerinde PTEN geninin tümör baskılayıcı geninin kaybı miyeloproliferatif hastalığa öncülük eder. Ayrıca, PTEN kaybı hematopetik kök hücrelerin çoğalmasını sağlamaktadır. Bununla birlikte, kendi-kendine yenilenmesinin baskılanması ise hematopoietik kök hücrelerinde azalmaya neden olmaktadır. Bu etki mTOR'un rapamycin ile baskılanmasıyla oluşur. Rapamycin bir yandan lösemi-öncü hücrelerinin azalmasına neden olurken diğer yandan normal hematopoietik kök hücrelerin fonksiyonunu yeniler. Kanser kök hücresi ile normal kök hücre arasındaki kendi-kendini yenilemenin mekanistik farklılığı kanser tedavisinde kullanılabilir, böylece normal kök hücrelere zarar vermeden kanser kök hücreleri hedef olarak kullanılabilir. Diğer bir örnek de, BCL- 2 onkogeninin ekspresyonuyla apoptozisin engellenmesi in vivo olarak hemapoetik kök hücre (HKH) sayısının artması ile sonuçlanır, bu da HKH'lerin homeostasisin düzenlenmesinde hücre

hükök ölümünün rol oynadığını göstermektedir. KKH'lerinin izolasyonu : KKH'lerini tanımlamak için altın standart bu hücrelerin tümörojenitesinin ve kendi kendini yenileme kabiliyetinin yüksek olmasıdır ve bu özellikler KKH'lerinin immün yetersizliği olan farelere transplante edilmesi sonucu anlaşılır. Son yıllarda KKH'lerini izole etmek veya zenginleştirmek için 3 metod yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu 3 metot flow sitometrisi kullanarak yüzey belirteçleri ekspresyonu, yan popülasyon ve sfer kültür. Ancak KKH'lerini kesin olarak tanımlamak için evrensel bir metot yoktur. Her yöntemin kendi avantajları ve kısıtlamaları vardır. Yüzey belirteçleri: İlk olarak birçok kanser hücresi yüzey belirteçlerine göre izole ediliyordu. Eğer doğru yüzey belirteci kullanılırsa saf KKH popülasyonu elde edilebilmesi bakımından avantajlı olan bu metot en çok kullanılan metottu fakat şu ana kadar bilinen yüzey belirteçleriyle ilgili potansiyel kısıtlamalar veya problemler ortaya çıkmıştır. KKH için rapor edilen (meme, kolon veya pankreatik karsinomalar için CD44 veya CD24, glioblastoma, kolon veya prostat için CD133, melanoma için CD20) yüzey belirteçlerinin dağılımının in-situ immunohistokimyasal analizleri KKHlerin tümör içindeki spesifik lokalizasyon paternlerini açığa çıkmasında başarısız olmuştur. Bu belirteçleri eksprese eden tümör hücreleri arasında tümörojeniteleri bakımından farklılık olmasına rağmen bu farklılığın birçok açıklaması vardır. Örneğin bu farklılık farelerdeki farklı büyüme paternleri ve farklı konak immun reaksiyonu dolayısıyla olmuş olabilir. Ayrıca transformasyon sırasında birçok mutasyon birikimi olabilir. Bu yüzden normal doku çalışmalarında yaygın olarak kullanılan yüzey belirteçleri kanser numunelerindeki biyolojik revelansını yansıtmayabilir. Ayrıca izolasyonun ilk basamağındaki tümör biyopsisinden tek hücre süspansiyonu elde ederken kullanılan proteolitik enzimlerin tümör hücrelerindeki bazı yüzey antijenlerini de parçalamış olabileceği düşünülmektedir. Buna ek olarak normak kök hücrelerin yüzey belirteçleri konusundaki bilgilerimiz de kısıtlıdır. Kanser kök hücrelerini izole etmek için günümüzde kullanılan yüzey belirteçleri KKHleri için spesifik değildir, normal hücrelerde de eksprese edilirler. Bu konuda birçok tartışma halen devam etmektedir. Yan Populasyon [Side population(SP)]: SP

derleme hücreleri ilk olarak hematopoietik sistemde tanımlanmıştır. SP fenotipinin oluşma mekanizması tam olarak anlaşılmamış olmasına rağmen bazı ABC(ATP-binding casette ) transportlarının (ABCG2 /BCRP , ABCB1/MDR ve ABCA3 gibi ) Hoechst 33342 isimli floresan boyayı hücre dışına pompalamaları veya KKH'lerinin bu hücrelere göre pasifliğinin bu boyayı hücre içine almasını kısıtlaması SP fenotipine neden olabilir. Hoeschst boyasının bu hücrelerde birikmemesi sebebiyle SP hücreleri flow sitometri yöntemiyle izole edilebilir ve bu hücrelerin lösemi , yumurtalık kanseri , tiroit kanseri , nasofaringeal karsinoma gibi birçok tümörde KKH'lerini zenginleştirdiği kanıtlanmıştır. SP hücreleri KKH'lerini zenginleştirmek için yaygın olarak kullanıldığı halde SP hücrelerinin kanser kök hücresi olduğunu iddia etme konusunda bazı endişeler vardır. SP analizi için kullanılan Hoeschst 33342 boyası hücreler için toksik bir maddedir ve SP hücreleri SP olmayan hücrelere göre daha az boya alırlar. Bu boyanın toksisitesi SP olmayan hücreleri daha çok etkilemesi bakımından bir sapmaya neden olabilir. Ayrıca SP fenotipi kök hücrelere özgü olmayabilir, farklı sürelerde bu boyaya maruz kalan hücrelerin geçici bir özelliğini belirtiyor olabilir. Bu yüzden boya konsantrasyonu ve boyama zamanı dışında da birçok parametre SP fenotipinin etkiler. Bugüne kadar SP kültürü için koşullar tanımlanmamıştır. Bu durum SP modelini kullanmayı oldukça zorlaştırmaktadır. Sfer kültür (sphere culture): Bu yöntem ilk olarak 1992'de nöral kök hücreleri kolonojenik olarak genişletmek için geliştirilmiştir.Birincil nöral hücrelerin içinde küçük bir popülasyon (<0.1%) nörosfer denilen farklanmamış hücre grubunu oluşturabilir. Nörosferlerin %4-20 sinin nöral kök hücrelerden oluştuğu gösterilmiştir. Popülasyonun kalanını farklanmanın farklı aşamalarındaki progenitör hücreler oluşturmaktadır.2003 yılında Dontu ve meslektaşı sfer kültür tekniğini meme kök/progenitör hücrelerini kültüre ekmek ve zenginleştirme yöntemine başarıyla uygulamışlardır. O zamandan beri sfer kültür tekniği beyin, kolon, meme KKH'leri ve melanoma kök hücreleri gibi birçok KKH çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsan meme kanseri hastalarından alınan örneklerde bu yöntemin CD44+CD24popülasyonunu %40'tan %98'e yükselttiği rapor edilmiştir. Bu sfer hücreler parental hücrelere göre belirgin olarak daha fazla tümörojeniteye ve mayıs 2012 110

derleme radyasyona karşı daha fazla dirence sahiptir. Sfer kültür tekniği yüzey belirteçlerine ve SP izolasyonuna dayanan diğer metotlara göre daha kullanışlı bir yöntem sağlar fakat bu yöntemin dezavantajı da sfer hücrelerinin heterojen olması ve sferdeki hücrelerin belli bir oranının yenilenme özelliği gösterip kök hücre popülasyonunu temsil etmesidir.Ayrıca nöral kök hücre araştırmalarında da gösterildiği gibi sfer içindeki kök hücrelerin zenginleştirilmesi sfer boyutuna, pasaja, kültür ortamı ve tekniğe göre değişebilir. KKH'leri ve tedaviye dirençlilik: Günümüzde kullanılan kanser kemoterapi ilaçları kontrolsüzce çoğalan kanser hücrelerini öldürerek yada inhibe ederek etkilerini gösterirler. Bu geleneksel yaklaşım tümör kitlesi içindeki minör bir popülasyon olan KKH'lerini görmezden gelmektedir. Dahası diğer kanser hücrelerinden farklı olarak KKH'leri bazı kendine has özelliklere sahiptir. Bu özellikler genellikle bilinen çeşitli tedavilere karşı kalıtsal dirençliliğe sebep olmaktadır. KKH'lerinin klinik ilaçlara karşı olan dirençliliği birçok farklı tümör tipinde gösterilmiştir. Akut myeloid lösemi (AML) kök hücreleri (CD44+CD38)hakkındaki çalışmalar. KKH'lerinin lösemi tedavisinde yaygın olarak kullanılan daunorubicin adlı ilaca CD44+CD38+ hücrelere göre daha dirençli olduklarını göstermiştir. Kronik myeloid lösemi (CML) kök hücreleri hakkındaki çalışmalar ise CML kök hücrelerinin (CD44+CD38-) son yıllarda geliştirilen ve en başarılı hedef temelli ilaç olan Imatinib mesylate (Gleevec ) 'e dirençli olduğunu ileri sürmüştür.Buna benzer birçok KKH türünün [myeloma kök hücreleri (CD138-),beyin KKH'leri (CD133+) ve hepatocelular karsinoma (HCC) (CD133+), meme KKH'leri (CD44+CD24-) gibi ] standart kemoterapi ilaçlarına ve radyoterapiye dirençli oldukları rapor edilmiştir. KKH'lerinin standart kemoterapiye dirençliliği, günümüzde kullanılan kanser tedavisine karşı olan çelişkili cevabının ve neden hayatta kaldığının açıklaması olabilir. İmatinib'in KKH'lerini yok edememesinin ve CML'yi relaps olmadan tamamen tedavi edememesinin en iyi açıklaması güncel kanser ilaçlarının sadece çoğalan kanser hücrelerini hedef almasıdır. KKH'lerinin ilaç dirençliliğini açıklayan birçok mekanizma mevcuttur. Normal kanser hücrelerin-

110 mayıs 2012

hükök den farklı olarak KKH'leri ABC transporterlarını yüksek oranda exprese etmeleri (temel olarak ABCG2/BCRP ve ABCB1/MDR1) , yüksek DNA tamir yeteneği , azaltılmış immünijeniteleri , kalıtsal antiapoptosis özelliği ve pasiflikleri sebebiyle ilacı hücre içine daha az aldıkları gibi tamir sistemleri ve antiimmün mekanizmaları ile ilacın etkisini de en aza indirirler ve böylece birçok geleneksel kemoterapiye karşı dirençli olurlar. KKH'lerini hedefleme: KKH'lerinin standart kemoterapiye dirençli olması sebebiyle sağ kalan KKH'leri yeni tümörler oluşmasına ve metastaza neden olabilir. Bu yüzden kanserin uzun vadede gerilemesi KKH'lerinin yok edilmesini gerektirmektedir. KKH'lerinin elimine etmek için birçok yaklaşım planlanabilir.KKH'leri tercihli olarak önemli olan sinyal ileti yolları inhibe edilerek veya bu hücrelerde öncelikli olarak aktif olan ABC transporterlarını inhibe ederek hedeflenebilir. Normal kanser hücreleri yerine KKH'leri üzerinde geleneksel hücre temelli ilaç taraması bir başka umut vadeden yaklaşımdır. Sinyal ileti yollarını hedefleme: Kanser hücreleri ve KKH'lerinin sinyal ileti yollarındaki farklılıkKKH'leri için terapatik hedefler sağlayabilir. KKH'leri için önemli olan Notch,Wnt,Shh,NFKB,PI3K,PTEN gibi sinyal ileti yollarının elimine edilmesi mümkündür. Bu yollara spesifik inhibitörler kullanılarak kritik öneme sahip genlerin fazla eksprese edilmesi veya baskılanması umut vadedicidir. ABC transporterlarının hedeflenmesi: KKH'leri genellikle ABC transporterlarını fazla eksprese ederler. Bu durum toksik maddelere ve oksijensizliğe karşı KKH'lerinin sahip olduğu kalıtsal koruyucu mekanizmasıdır ve KKH'lerinin ilaca dirençliliğinin en büyük nedenlerinden biri olarak sayılmaktadır.SP fenotibinin verapamil, fumitremorgin, C(FTC) ve reserpine gibi bazı ABC transporter spesifik inhibitörler tarafından bloke edildiği gösterilmiştir. ABC transporter ekspresyonunun inhibe edilmesi ile en azından KKH'lerinin ilaç dirençliliği fenotipini kısmen de olsa aksine çevirmesi mümkündür .Fakat bu yaklaşımdaki birçok deneme başarısızlığa uğramaktadır. KKH'lerinin tıp için önemi ve potansiyelleri:

derleme

hükök Referanslar:

1- http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer_stem_cell 2- Tannishtha Reya, Sean J. Morrison, Michael F. Clarke& Irving L. Weissman. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001 Nov 1;414(6859):105-11.

Hasta tümör dokusundan izole edilen son derece lösemik veya tümörijenik KKH'lerinin in vivo ve ex vitro olarak farklılaşmış kanser hücre kitlesi oluşturduğu ve bunların lösemi veya tümör oluşumundan sorumlu olduğunun gösterilmesi ile desteklenen KKH hipotezine göre kanser tümör dokusunda oluşan kök hücrelerden oluşur ve 'kanseri başlatan hücre' olarak da adlandırılan bu kanser öncü hücrelerinin kanserin başlaması, ilerlemesi ve klasik tedavi şekillerine direnç göstermesinden sorumludurlar. Ayrıca birçok kanser hücresinin yeni bir tümör oluşturma yeteneğine sahip olmadığı, sadece nadir olarak bulunan bu KKH'lerinin metastatik hastalıklara yol açtığı düşünülmektedir. Eğer öyleyse tedavinin amacı KKH populasyonunu tanımlamak ve öldürmek olmalıdır. Kanser tedavisinin KKH'lerini elimine etmekte başarısız olmasının tümörün tekrar oluşmasına neden olduğu ise kanıtlanmış bir gerçek ve bu gerçeğe dayanarak kitlenin tamamen yok edildiği ve kemoterapinin uygulandığı durumlarda kanserin tekrar etmesinin açıklaması KKH' lerinin tam olarak yok olmamasıdır denilebilir. Bu yüzden spesifik olarak KKH'lerini hedef alan stratejiler güncel tedavi yöntemlerine göre daha etkili olmakla birlikte kanserin yenilenmesi ve metastaz risklerini de azaltacağı düşünülmektedir.

3- Jiangbing Zhou,Ying Zhang.Cancer stem cells models mechanisim and implications for improved treatment.Landes Bioscience.2008 May Cell Cycle 7:10, 1360-1370 4- Jordan CT, Guzman ML, Noble M. Cancer stem cells.N Engl J Med. 2006 Sep 21;355(12):1253-61. 5- Musaffe TUNA. MD Anderson Cancer Center, Cancer Genetics, Houston, ABD. Solid tümörlerde ve lösemilerde kanser kök hücreleri.Türk Onkoloji Dergisi 2009, Cilt 24, Sayı 1, Sayfa(lar) 042-047 6- Brenton Thomas Tan1, Christopher Yongchul Park, Laurie Elizabeth Ailles and Irving L Weissman. The cancer stem cell hypothesis: a work in progress. Laboratory Investigation (2006) 86, 1203–1207. doi:10.1038/labinvest.3700488; published online 30 October 2006 7- Michael F. Clarke, John E. Dick, Peter B. Dirks, Connie J. Eaves, Catriona H.M. Jamieson, D. Leanne Jones, Jane Visvader, Irving L. Weissman, and Geoffrey M. Wahl. Cancer Stem Cells—Perspectives on Current Status and Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Res October 1, 2006 66; 9339.

mayıs 2012 111

derleme

hükök

Robert Allan Weinberg Kimdir?

1 Kasım 1942 Pittsburgh(Pennsylvania) doğumlu Amerikalı bilimadamı Massachusetts Teknoloji Enstitüsü(MIT)'de biyoloji dalında 1964 yılında B.S, 1965 yılında M.A, 1969 yılında ise PhD ünvanlarını aldı.Temel araştırma alanı onkojenler ve insan kanserinin genetik temeli olan Weinberg şu anda ise kanser hücre metastazlarıyla ilgili çalışmalarını sürdürmektedir.Ayrıca ünlü bilimadamı ilk insan onkojeni

Ras ve yine ilk insan tümör supresör geni olan Rb' yi bulmuştur. 1970'lere kadar kanserin kaynağının virüsler olduğu düşünülüyordu.Bilimadamları bu düşüncelerini kanıtlamak için birçok deney ve araştırma yaptılarsa da virüsler ile kanser arasında bir bağlantı kurulamadı.Bu durum kanser araştırmalarının başka yönlere çevrilmesini sağladı ve böylece günümüzde de bildiğimiz gibi kanserin asıl kaynağı olan 'onkojen'ler hakkında çalışmalar başlamış oldu. 1972-1973 yılları arasında Robert A. Weinberg MIT'nin Kanser Araştırma Merkezi'nde biyoloji bölümünde assistant prof. olarak çalışmalarını sürdürdü.1976 yılında ise MIT'de associate prof. oldu. 1970'lerin sonlarına gelindiğinde ise bir düzine onkojen tanımlanmasına rağmen kimse bu bu onkojenlerin virüsler tarafından aktif edilmeksizin kansere sebep olabileceklerini kanıtlayamadı. Sonunda Weinberg 1980 yılında bunu kanıtladı. Aktif bir kanserli insan hücresinden DNA alıp bunu normal fare hücresine transfer etti ve bu hücrelerin de kanserli hücre özellikleri gösterdiğini gözlemledi. Weinberg'in bir sonraki araştırması ise her kanser çeşidi için onkojen nitelikteki belirli genleri tanımlamak oldu.Weinberg ve arkadaşları 1981'de lösemi,kolon ve mesane kanseri için bu genleri belirlediler.Böylece karsinogenezin moleküler temeli kurulmuş oldu ve yine ilk kez spesifik onkojenler izole edilip karakterize edilmiş oldu.

Robert Allan Weinberg 112 mayıs 2012

1981'de mesane ve akciğer kanseri onkojenlerinin klonlanması sayesinde aslında, değişmiş olan bu genlerin normal hücrelerde de mevcut olduğunu

hükök kanıtladı. Ancak bu genlerin bazı nedenlerle aktifleşene kadar pasif durumda oldukları veya az miktarda aktif olduğu görüldü. Teoriye göre; karsinojenler genleri etkileyerek onların nükleik asit zincirinde küçük değişikliklere sebep oluyorlardı ve bu durum bir şekilde hücrenin normal regülatör mekanizmasını bozuyordu. Yine teoriye göre kanserin gelişimi için 2 aşamalı bir süreç mevcuttu; ilk olarak onkojenin oluşumu, ikinci olarak ise belki de yıllar sonra maruz kalınılabilecek herhangi bir karsinojen madde.Böylece bu iki aşamalı sistem kanser insidansının artan yaşla paralellik göstermesi durumuna da bazı açıklamalar sunabiliyordu. 1982'de Weinberg MIT'de biyoloji bölümünde profesör ünvanını aldı. Aynı yıl içerisinde kanser, AIDS, salgın ve kalıtımsal hastalıkları araştıran Whitehead Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü 'nü kurmuştur. Yine aynı yıl Discover dergisi tarafından yılın bilim adamı seçildi. 1983'te ise Warren Triennal ödülünü ve Robert Koch ödülünü almıştır. 1985'te ise Amerikan Kanser Topluluğu tarafından biyoloji dalında onursal profesör yapılmıştır. Bunu takip eden yıllar içerisinde de birçok uluslararası kuruluştan pek çok ödül almıştır. Bunlar içerisinde; 1997 yılında aldığı ABD'nin en önemli bilim ödülü olan Ulusal Bilim Madalyası ve aynı yıl Japonya'da seçkin bir ödül olan Keio Medical Science ödülünü alması önemli bir yer tutmaktadır.2004'te ise tıp alanında Wolf ödülünü, bilimsel ve tekniksel araştırmalar alanında ise Asturias ödülünü kanser araştırmalarına öncülük eden beş kişiden biri olarak almıştır.Weinberg ''insan onkojenlerini tanımlayan öncülerden biri'' olarak kabul görülmüştür.

derleme lerle birlikte 100 den fazla çeşitte kanser hücresi tanımlanırken bu kanser hücrelerinin ortak özelliklerini tanımlamak çok zordu.Bu sebeple R. Weinberg ve Douglar Hanahan(İsveç Deneysel Kanser Araştırma Enstitüsü) Ocak 2000'de Journal Cell'de yayımlanan ''The Hallmarks of Cancer'' isimli bir peer review yazmışlardır ve bu yazı en sık alıntı yapılmış peer view olmuştur. Weinberg ve Hanahan bu yazıda sağlıklı bir hücreden kanserli bir hücre oluşumundaki 6 ortak basamaktan bahsetmişlerdir. Bunlar şöyle sıralanmıştır;1-büyüme sinyalinin hücrenin kendi kendine üretmesi 2-antigrowth sinyallere karşı duyarsızlık 3-doku invazyonu ve metastazı 4-sınırsız replikasyon potensiyeli 5-sürekli olan angiogenesis 6-apoptosisten kaçınma. Mart 2011 de Weinberg ve Hannahan bu 6 hallmark' a 2 tane daha eklemiştir. Bunlar ise;1) tümör geliştiren inflamasyon 2) gen instabilitesi ve mutasyonu (bu madde tek başına kansere sebep olmayıp normal bir hücrenin kanserli bir hücreye dönüşümüne yardımcı oluyor) Tüm bunların yanı sıra bir çok bilimsel kitap ve raporun yazarı olan Weinberg 2006 yılında da kanserin moleküler ve hücresel temelini anlattığı ''The biology of Cancer''i yayımlamıştır.Robert A. Weinberg günümüzde MIT'de biyoloji dalında profesör olarak kanser çalışmalarına devam etmektedir.

1999 yılında Weinberg ve meslektaşları ilk kez sağlıklı insan hücresinin genetik değişimle kanserli bir hücreye dönüşümünü başarmıştır. Bu çalışmasından yola çıkarak Weinberg insan vücudundaki 4 geni kansere yol açan 'yapıcı blok' olarak belirlemiştir. Bunun yanı sıra 2004 yılında ise ''Twist'' adlı genin kanser metastazında kilit rol oynadığını tespit etmiştir. Normalde sadece embriyonik dönemde aktif olan bu genin metastaz yapan kanserli hücrelerde de aktif durumda olduğunu gözlemlemiştir. Farelerle yaptığı deneylerde ise metastaz özelliğe sahip meme kanseri hücrelerini almış ve Twist genini inaktif hale getirip tekrar fareye verdiğinde bu kanser hücrelerinin metastaza neden olmadığını görmüştür. 20. yüzyılın sonuna gelindiğinde, genetik gelişmemayıs 2012 113

derleme

hükök

Identification of Selective Inhibitors of Cancer Stem Cells by High-Throughput Screening

pesifik olarak epitel kanser kök hücreleri (KKH) öldürecek ajanlar bulmak,bu hücrelerin tümör dokusu içinde çok nadir bulunması ve kültür ortamında diğerhücrelere göre stabil olmaması sebebiyle mümkün değildi.Bu çalışmada epitel KKH-spesifik toksisitesi olan ajanları bulmaya yönelik bir yaklaşım tanımlanmaktadır. Bu amaçla kimyasal tarama metodu uygulanarak meme KKH'lerine karşı seçici toksisite gösteren bileşikler keşfedilmiştir.Bir bileşiğin (salinomycin) meme kanseri kemoterapisinde yaygın olarak kullanılan ilaç olan paclitaxel'e göre KKH oranını 100 kattan fazla azalttığı görülmüştür.Farelerin salinomycin ile tedavisiyle,canlı ortamda meme tümörü büyümesi inhibe olurken aynı zamanda tümör hücrelerinin epitel hücrelere farklılanmasının uyarıldığı görülmüştür.Buna ek olarak; salinomycin tedavisinin meme KKH genlerinin ekspresyonununkaybedilmesini sağladığı,global gen ekspresyon analizi (GGA) ile gösterilmiştir.Bu çalışma,epitelyum KKH'leri için spesifik toksisiteye sahip ajanların tanımlanabildiğini göstermiştir. Giriş Daha önce yapılan çalışmalarda,tümör içinde bulunan bazı popülasyonların tümörün büyümesini ve kendini yenilemesini sağladığı tespit edilmiştir.Bu popülasyonlara KKH denmiştir. KKH'leri, kemo- ve radyoterapi dahil mevcut kanser tedavilerine karşı dirençlidirler.Bu da,birçok kanser terapisinin tümör hücrelerinin çoğunu öldürürken yeni tümör gelişimine neden olan KKH'lerini elimine edemediği için başarısızlıkla sonuçlandığını fikrini vermiştir.Kanser hücre popülasyonundaki KKH'lerinin varlığı,in vivoda tümör oluşturabilme

114 mayıs 2012

yetenekleriyle gözlemlenmiştir.Aynı zamanda, KKH'sinden zengin kanser hücre popülasyonlarının in vitroda da belirli özellikler sergilediği görülmüştür: 1KKH'sinden zengin popülasyonlar ,''cellsurface marker'' profilleriyle izole edilebilirler. (Örneğin,memeKKH'leri CD44-high/CD24-low oranı yüksek hücrelerce zengindir.) 2KKH'sinden zengin popülasyonlar, süsfansiyon kültürlerinde tümör ''mammospheres'' veya ''tumorspheres'' adı verilen küresel koloniler oluşturur. 3KKH'sinden zengin popülasyonlar, kemoterapik ajanlara ve iyonize radyasyona karşı artmış direnç gösterir. Prensip olarak ''automatedscreening'' teknolojisinin kullanımı KKH-spesifik ajan tanımlanmasını kolaylaştırsa da,KKH'lerinin tümör içindeki oranlarının düşük olması,tümör kitlesine uygulanan ''standart high-through put cell viability assay'' lerin, KKH-spesifik ajanları tespit etmesini engellemiştir. KKH-spesifik ajanların tespit edilebilmesi, KKH popülasyonunun in vitroda kararlı bir şekilde çoğalmasına ve miktarını artırabilmesine bağlıdır. Ancak böyle bir popülasyonu elde etmek katı tümörlerin KKH'leri için halen mümkün değildir.Örneğin,meme KKH'lerinin çoğaltılması in vitroda hızlı bir şekilde kaybedilmiştir. Normal ve neoplastik meme epitel hücrelerinin 'epithelial-mesenchymaltransition'' (EMT)'ye uyarılmasıyla kök hücre benzeri hücrelerin arttığı görülmüştür. Normal de olsa kanserli de olsabir popülasyon EMT'ye uyarılırsa bu popülasyonun

hükök

kemoterapik ilaçlara olan direncinin arttığı deneylerle gözlenmiştir.Bu gözlemden, ''high through put screening'' metodu kullanılarak epitelyum KKH-spesifik ajanların tanımlanmasında yararlanılmıştır. Tarama sonuçları ve sonrasında yapılan deney sonuçları,meme KKH'leri için güçlü seçici toksisiteye sahip ajanların bulunması mümkündür. Sonuçlar EMT: ''Epithelial-mesenchymaltransition''.Farklı aracılar (shRNA veya twist) kullanılarak,epitele farklılaşmış hücrelerin mezenşime geri döndürülmesi sürecidir.Burada süreç,shRNA aracılığıyla gerçekleştiriliyor. shRNA:Önemli bir adhezyon proteini olan Ecadherin'i kodlayan insan CDH1 genini inhibe eder. HMLER:Neoplastik insan meme epitel hücresi. HMLE:İnsan meme epitel hücresi. HMLER-shEcad:EMT'ye uyarılmış HMLER.

derleme popülasyonu EMT'ye indüklenmiş ve CD44high/CD24-low oranının arttığı gözlemlenmiştir (şekil 1-B). HMLER-shEcad (EMT uygulanmış tümör hücreleri) popülasyonunun,HMLER-shcntrol (normal tümör hücreleri) popülasyonuna göre ''tumorsphere'' oluşturma yeteneklerinin 100 kat fazla olduğu görülmüştür ( şekil 1-C). Aynı zamanda in vivoda tümör oluşturma yeteneğinin HMLERshEcad popülasyonunda 100 kat daha fazla olduğu saptanmıştır.(şekil 1- D).Ayrıca bir başka deneyde,HMLER-shEcad popülasyonunun,kontrol grubuna oranla daha yavaş ürediği tespit edilmiştir (şekil 1-E).Tüm bu sonuçlar göstermektedir ki,EMT'ye indüklenen meme kanser hücresi populasyounda KKH oranı artmıştır. 2-EMT'ye Uyarılan Normal ve Neoplastic Hücrelerin İlaçlara Olan Direnci Artar EMT ile elde edilen, KKH'inden zengin popülasyonun, biyolojik olarak da KKH gibi davranıp davranmadığını görmek için ilaçlara olan dirençleri karşılaştırıldı. Bunun için,yaygın kullanılan iki kemoterapik ilaç(paclitaxel ve doxorubicin), HMLER-shEcad ve HMLER-shcntrl popülasyonları üzerinde denenmiştir. HMLER-shEcad hücrelerinin HMLER-shcntrl hücrelerine göre bu ilaçlara karşı daha dirençli olduğu görülmüştür(şekil 1-F).Bu direnç artışının nedeninin,neoplastik hücrelerin sahip oldukları atipik özelliklerin bir avantajı olup olmadığını tespit etmek için aynı ilaçlar HMLEshEcad ve HMLE-shcntrl grupları üzerinde dedenenmiiş ve HMLE-shEcad hücrelerinin de kontrol gruplarına göre ilaçlara daha dirençli olduğu görülmüştür.Böylece direnç artışının neoplastik hücrelerinin bir avantajı değil,EMT'nin sonucu olduğu anlaşılmıştır.Ayrıca paclitaxel uygulanan HMLE-shEcad popülasyonundaki hücre sayısında,kontrol grubuna oranla 4 kat fazla artış

HMLER-shcntrl:EMT'ye uyarılmayan HMLER. 1.EMT'ye Uyarılan Meme Kanser Hücrelerinde KKH Sayısı Artmıştır shEcad vektörü ile yapılan ça l ı ş m a l a rd a b u ve ktö r ü n , hücrelerin mezenşimal morfoloji kazanmasını sağladığı ve hücreleri EMT'ye uyardığı görülmüştür.Bir sonraki adımda HMLER kanser mayıs 2012 115

derleme

artış gözlenmiştir (şekil 1-H). 3-EMT-specific Toksisitesi Olan Bileşiklerin ''HighThroughput'' Taramasıyla Tanımlanması Yukarıda yapılan deneyler, HMLER-shEcad ve HMLE-shEcad popülasyonlarının ilaçlara verdklerii cevapların paralellik gösterdiğini kanıtlamıştır.O halde HMLE-shEcad-spesifik özellik gösteren bir ilaç bulunursa aynı etkiyi KKH'leri üzerinde vereceği de düşünülebilir fikriyle,içlerinde çeşitli ticari ajanlar ve doğal özlerin de bulunduğu 16.000 farklı bileşik,HMLE-shEcad ve HMLE-shcntrl grupları üzerindedenenmiştir. Bunların içinden; HMLE-sh Ecad yaşayabilirliğini azaltma, ulaşılabilirlik ve devamlı etki gösterme, özelliklerine bakılarak 4 ajan salinomycin, etoposide, abamectin,nigericin) seçilmiştir.Nigericin,diğer ajanlara oranla daha hafif etki göstermiştir (şekil 2-A).Bu ajanların aynı etkiyi HMLER-shEcad üzerinde de gösterip göstermediği araştırılmak istenmiş ve sadece salinomycin'in güçlü spesifik etkisini devam ettirdiği görülmüştür. 4-Salinomycin KKH'leri Seçici Olarak Öldürür Salinomycin'in farklı özellikleri üzerine yoğunlaşıl-

116 mayıs 2012

hükök

mış ve CD44-high/CD24-low oranı yüksek hücre popülasyonları üzerinde daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır.Bu yüzden,deneysel olarak oluşturulan EMT'ye uyarılmış popülasyonlar yerine,doğal HMLER meme kanser hücrelerinin arasında bulunan KKH'ler üzerindeki spesifik etkileri araştırılmak istenmiştir.Öncelikle CD44high/CD24-low antijenik fenotip incelenmesi yapılmış ve görülmüştür ki salinomycin bu oranı kontrol grubuna göre 20 kat azaltmıştır.Paclitaxel tedavisi ise bu oranı normalden 18 kat arttırmıştır.Yani sonuç olarak salinomycin tedavisi ,bu oranı paclitaxel'e göre 360 kat düşürüyor (şekil 4-A,HMLER-1).İkinci bir deneyde,doğal olarak KKH yüksek olan bir HMLER popülasyonu ve yine salinomycin ve paclitaxel kullanılmıştır.Salinomycin tedavisi sonucunda popülasyonun CD44-high/ CD24-low oranı kontrol grubuna göre 75 kat azalmıştır. Ayrıca salinomycin tedavisinde tümörsfer oluşumunun 10 kat azaldığı,paclitaxel tedavisinde ise tümörsfer sayısının değişmediği ancak tümörsfer büyüklüğünü arttırdığı gözlemlenmiştir (şekil 4-B).Paclitaxel tedavisinin tümörsfer sayısını arttırmama nedeninin,kullanılan popülasyonda zaten yüksek olan KKH oranının olduğu düşünülmüş ve bunu araştırmak içinKKH oranının azaltıldığı bir popülasyon oluşturulmak iste-

derleme

hükök artan duyarlılık göstermiştir.

5.Tümör oluşumu,Gelişimi ve Metastazında Salinomycin ve Paclitaxel'in Etkileri

nmiş. Buda,EMT'ye uyarılmış hücreler ile uyarılmamış kontrol grubunun karıştırılmasıyla sağlanmıştır (HMLER-Mx).Salinomycin'in HMLERMxhücrelerinin CD44-high/CD24-low oranını, kontrol hücrelerine oranla 4 kat azalttığı; paclitaxel'in ise 4 kat arttırdığı gözlemleniyor.Yani salinomycin paclitaxel'den 16 kat daha etkilidir.Benzeroranlar,HMLE-mx(''immortalizednontumorogenic'' hücreler) ile de gözlemlenmiştir (şekil 4C).Salinomycin,HMLER-Mxtümörsfer sayısını da 13 kat azaltırken;paclitaxel'in 2 kat arttırdığı ve ayrıca tümörsfer büyüklüğünü de arttırdığı gözlemlenmiştir.Aynı deney HMLE-Mx üzerinde yapılmıştır ve görülmüştür ki salinomycin tümörsfer sayısını 10 kattan fazla azaltmıştır.Buna karşın paclitaxel,tümörsfer sayısını etkilememiştir (şekil4 D).''Monolayer'' kültür çoğalmasının salinomycin ile inhibe edilememiş,yani salinomycin'in KKH öldürücü etkisinin,hücre çoğalması üzerindeki genel inhibisyonu nedeniyle olmadığı gösterilmiştir. Daha sonra,bu ilaçların (salinomycin, paclitaxel, DMSO) ek olarak 2 meme kanseri hücresi cizgisinde (fare meme kanser hücre çizgisi-4T1 ve insan meme kanser hücre çizgisi-MLF7Ras) daha etkileri gözlenmek istenmiştir.Salinomycin'in DMSOkontrol grubuna oranla MCF7Ras hücreleri için 3 kat,4T1 hücreleri için 2 kat KKH sayısını azalttığı gözlemlenmiştir.Buna zıt olarak paclitaxel,bu sayıları sırasıyla 3 ve 2 kat arttırmıştır.Hem 4T1 hem de MCF7Ras hücreleri için geçerli olarak salinomycin'in epitel farklılaşması fazla olan hücreler lehine selektif;paclitaxel'in ise mezenşimal ve ''migratory'' fenotipteki hücreler lehine selektif olduğu gözlemlenmiştir (şekil 4F).Başka bir deneyde ise paclitaxel ile tedavi edilen popülasyonun paclitaxel'e karşı direncinin arttığı görülmüştür.Aynı popülaşyon,salinomycin'e karşı

1.Salinomycin ile tedavi edilen HMLER ve 4T1 kanser çizgilerinde tümör oluşturma yeteneği, paclitaxel tedavisi uygulanan hücre çizgileirne oranla 100 kat azalmıştır. 2.Hem salinomycin hem paclitaxel tedavisi dokunulabilir tümör oluşumunu DMSO-kontrol grubuna göre 2 hafta kadar ertelemiştir. 3.Salinomycin ile tedavi edilip in vivo'ya enjekte edilen tümörler incelendiğinde,kontrol grubuna oranla,apoptoz ve nekrozun arttığı görülmüştür. 4.Normalde kontrol grubunda ekspresyonu olmayan E-cadherin proteininin,salinomycin ile tedavi edilen hücreler tarafından üretildiği gözlemlenmiştir.Buradan da salinomycin'in KKH'leri epitel hücrelerine farklılaşmaya götürdüğü sonucu çıkarılmıştır. 5.Metastazdan sorumlu olduğu bilinen KKH'lerinin sayısının azalmasının metastatik nodül oluşturma kabiliyetini de azaltıp azaltmadığı araştırılmıştır.Bu amaçla salinomyicn ile tedavi edilen 4T1 hücreleri,benzer genetiğe sahip başka bir farenin akciğerine enjekte edilmiştir.Kontrol grubuna oranla,salinomycin tedavisi metastaz oluşumunu 4 kat azaltırken paclitaxel tedavisi metastazı 2 kat arttırmıştır. Daha sonra deneğin akciğerleri vimentin ve Ecadherin için özel boyalarla boyanmıştır.Sonuçta salinomycin'in,doku hücrelerini bir arada tutan en önemli proteinlerden biri olan E-cadherin üretimini uyararak yeniden epitel hücreye farklılaşmayı sağladığı ve böylelikle metastazı engellediği görülmüştür.Paclitaxel'in ise vimentin (EMT için kullanılan bir marker) sentezini sağlayıp mezenşimal farklılaşmayı uyardığı anlaşılmıştır. 6.Salinomycin Tedavisinden Sonra KKH'nde Görülen Genlerin Ekspresyonu Azalır Salinomycin,uygulandığı popülasyonlarda yukarıda sıralanan sonuçları vermeyi başarmıştır; ancak salinomycin ile tedavi edilmiş hücrelerin genetiklerinin, KKH ve normal epitel hücre genetikleri ile benzerlikleri ve farklılıklarının araştırılması ve tedavinin, hücre genetiği üzerindeki etkisinin de gösterilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, KKH'lerinde aktif olan 3 gen seti incelenmiştir.Sonuçta salinomycin tedavisinin kontrol grubuna oranla,KKH'lerinde aktif bulunan mayıs 2012 117

derleme genlerin ekpresyonunu daha fazla azalttığını gösterilmiştir.

hükök direk olarak primer kanser hücreleri (hastadan alınan) üzerinde araştırma yapmak mümkün olabilir;ancak bunun için iki zorluk aşılabilmelidir:

Tartışma KKH'lerin çeşitli tedavilere direnç göstermesi,genel olarak apoptoza dirençli olduklarını ve KKH'yi hedef alacak bir ilacın geliştirilemeyeceği fikrini doğurmuştu.Ancak burada durumun böyle olmadığı,memeKKH'lere karşı spesifik ajanların sistemik bir şekilde tespit edilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir.Bu yaklaşım,diğer tip KKH'leri için de uygulanabilir. Yapılan deneylerde görüldüğü gibi salinomycin ,meme kanseri popülasyonunda,KKH'lere spesifik etki gösteriyor. Dahası salinomycin,kültür ortamında yapılan deneylerde KKH'lerde görülen gen setlerinin ekspresyonunu engelliyor.Ayrıca kültür hücrelerinde incelenen genler,iki ayrı hastadan alınan hücrelerin genleriyle de uyum gösteriyor.Bu iki durum,kültür ortamında incelenen hücrelerin in vivodakilerle benzer biyolojik özellikler gösterdiğini ortaya koyuyor.Ayrıca KKH'lerinde bulunan ve salinomycin tedavisi ile ekspresyonu azalan genler ,anti-KKH terapilerine cevap verecek tümörlerin tanımlanmasında da biomarker olarak kullanılabilir. Yapılan deneylerde,genetik olarak iyi tanımlanmış, tümör oluşturmayan ''immortalized'' hücreler kullanılıyor. Böylece tarama sırasında herhangi bir bileşiğin,bilinmeyen bir genetik alterasyonu hedef alarak EMT'ye uyarılmıs hücreler üzerinde spesifik etki göstermesi ihtimali en aza indiriliyor.Tümör oluşturmayan bu hücrelerle yapılan deneylerden elde edilen bileşiklerin KKH'lerinde de aynı etkiyi göstermeleri,EMT ve KKH arasındaki ilişkiyi destekler niteliktedir.Ayrıca bu yaklaşım,antitümör terapi geliştirilmesinde yeni bir yol da açar.Bugüne dek kanser terapileri hep belirli bir genetik alterasyonu hedef almıştır.Burada ise kanser hücrelerinin farklılaşma evreleri üzerine yoğunlaşılmıştır. Böylece gelecekte,hem genetik alterasyonlar hem de farklılaşma safhaları teşhis anında incelenerek,kişiye yönelik terapi ihtimali arttırılabilir. Ayrıca Salinomycin'in etkisini potasyum kanalları üzerinden gösterdiği anlaşılmış olsa da net ilişki henüz bulunamamıştır. İleride yapılacak olan önemli çalışmalar,burada elde edilen sonuçları daha da ileri taşıyabilir ve

118 mayıs 2012

1.Mevcut koşullarla,hastalardan alınan hücrelerin sadece %20'si immün sistemi baskılanmış farelere başarılı şekilde implante edilebilmektedir. 2.Farklı hastalardan alınan kanserli dokuların genetik ve histopatolojik açıdan farklılıkları, dokuların aktarıldıkları hayvanlar üzerinde yapılan deneylerde,ilaçların etkilerini karşılaştırmayı zorlaştırır.Bu da aynı kanser tipi için çok fazla hastadan örnek almayıgerektirir. KKH'leri hedeflemenin önemi,kemo- ve radyoterapik tedavilere dirençli olması ve tümör oluşturma yeteneğinin yüksek olmasından kaynaklanır. Burada ve daha önce yapılan deneylerde de görüldüğü gibi yaygın olarak kullanılan paclitaxel, KKH'lerin etkinliğini artırıcı etki gösterir.Yani paclitaxel tedavisi hastalığı tamamen söküp atmaktan çok uzaktır,aksine geride çok daha aktif bir hücre topluluğu bırakır.Tüm bunlar,tedavinin uzun dönemde etkili olabilmesi için KKH'leri hedef alması gerektiğini gösterir. KKH'leri kadar agresif olmasalar da normal kanser hücreleri de zaten oluşmuş olan tümörün devamlılığını sağlayabilir.Bu nedenle sadece KKH'lerini hedef alan ilaç da tamamen iyileştirici olmayabilir. Çözüm olarak,her iki hücreyi de hedef alan ilaçların geliştirilmesi veya ayrı spesifik etkiler gösteren ilaçların kombinasyonlarıyla tedavi düşünülebilir. Ulaşılabilirliği nedeniyle,mevcut çalışmalar salinomycin üzerine yoğunlaşmıştır.Ancak yapılan deneylerde, ilk taramada alınan KKH-spesifik etki,deneylerin sadece %30'unda ikinci seferde de alınabilmiştir. Bu da araştırmacılara, tarama kapsamının genişletilmesiyle yenibileşikler üzerinde yoğunlaşılabileceği fikrini veriyor.

hükök tek sayfa

tek sayfa

SOMATİK HÜCRE

KLONLAMA Fatma Deniz

omatik hücre çekirdek lerin den klonlamanın keşfi sitopl azmik belirteçlerin hücrenin programlanmasına ne katkısı olacağının araştırılması sırasında ortaya çıktı. Bu hikaye 1918'de gelişimci biologist Hans Spemann'ın Freiburg Üniversitesinde çalışırken totipotent zigotun çekirdeğini merak etmesiyle başladı. Şimdi bakınca inanılmaz kolay bir deney gibi. Spemann, 16 salamander embriyosunu kullandı ve onların çekirdeklerini bebek saçıyla sıkıştırarak hücrenin yan tarafında kalacak şekilde ayırdı. Sonra, aynı yumurtadan gelişen her bir yarım hücre nükleusu en son 4 bölünmeye kadar totipotent durumda kaldığını gösterdi.1938'de Spemann'ın farklılaşmış hücreler için sorduğu nükleer transplantasyonu kullanabilir miyiz sorusunu fantastik bir deney olarak tanımlanmasına rağmen Briggs ve King'in Rana pipienleri kullanarak nükleer transplantasyonu başarıyla gerçekleştirmesi 14 yıl aldı. Onlar, blastositlerin çekirdeklerinin balastositler elde edilebileceğini ancak potansiyel pluripotent-liğini kaybetmiş ileri gastrula evresinde alınan hücrelerin daha fazla özelleşmiş olduğunu buldular. Bu nedenle onlar yetişkin hücrenin çekirdeğinden ve gelişme sırasında genetik potansiyeli azalan hücrelerden klonlamanın imkansız olduğu sonucuna vardılar. Sonra John Gurdon bu fikre karşı kendi bulgularını öne sürdü. Bu bulgularda, Xenopus leavisi model hayvan olarak kullanarak, iribaşın bağırsak kültüründen alınan hücrelerin seri nükleer transplantasyonundan sonra ana hayvanın aynısını elde etti. (mature fertile animals) (Gurdon 1958, Gurdon ve Wehlinger 1966). Ama sadece farklı tipteki Xenopus hücrelerle, iribaşlar arasında verim elde ediliyordu. (Gurdon ve Byme 2003). Yani vertebralılar arasında klonlama 30 yıl aldı. Ian Wilmut ve Edinburg Üniversitesinden arkadaşları çekirdeksiz oositi ve epitelyum hücre kültüründen çekirdeği transplante ettiklerinde ünlü Dolly yaratıldı.(Wilmut 1997) Ve sadece bir yıl sonra ilk

fare de klonlandı(Wakayama 1998). Peki niçin Xenopustan vertabralılara sıçramak 30 yılımızı almıştı? Şu an görünen o ki çekirdek çıkarma işleminde kullanılan resipiyon hücre tipleriyle ilgiliydi. Önceki aşamalarda fare klonlamanın (Mc Grath ve Solter 1984) başarısızlığı ise muhtemelen interfazdaki hücrelerin nükleus içinde kalan nükleer faktörleriydi. Koyunda, farede ve diğer memeli türlerde yapılan başarılı deneylerde genellikle döllenmemiş Mayoz 2 aşamasındaki nükleuslar ki bunlarda nükleer faktörler henüz stoplazma içindeydi; çünkü nükleer membran parçalanmıştı(Yayınlanma 2007,Egli). Gurdon ve Wilmut'un deneyleri ise %1 veya daha az oranda başarılıydı (Wilmut 2007). Wakayama ve arkadaşları yalnızca küme hücre çekirdeklerini kullandıkları zaman başarılı oldular (Wakayama 1998). Bir şüpheyle küçük miktarlarda kök hücre içeren yetişkin hayvanlar üretmek için farklılaşmış hücre kullanmakta ısrar ettiler. Küme hücreler muhtemelen kök hücre benzeri hücrelerdir yoksa gerçekten farklılaşmış hücreler tekrar programlanamaz. Konrad Hochedlinger ve Rudolf Jaenisch MİT'teki fare blastositi ve yetişkin B ve T hücrelerinden alınan çekirdeği üretmekte başarılı oldular. Daha göze çarpan; faredeki tüm dokuların içerdiği immunoglobin veya T hücre reseptörü düzenlenmesini düşündüler (Hochedlinger ve Jaenisch, 2002). Diğer konu ise uzun süre çözünmemiş kalan insan somatik hücreleri nükleer transfer aracılığı ile tekrar programlanabilir. Bu yıla kadar, çekirdeksiz yumurta hücresi içine somatik hücre çekirdeği transferi blastosit düzeyinde asla başarılı olmadı. Hücre genellikle 4 veya 8 hücreli aşamada tutulu kaldı. Ama New York Kök hücre kurumundaki, Dieter Egli ve ekibi oosit çekirdeği deri hücresi çekirdeği transplantasyonundan sonra insan blastositini üretmayıs 2012 119

tek sayfa

hükök

menin mümkün olduğunu gösterdiler. Benzer ESC için, stabil 3n insan ESC dizilerinin somatik hücre nükleusları benze ESC'ler için yeniden programlanabilir (Noggle 2011).Bu deneyler insan somatik

hücrelerini kullanarak blastosit aşamasının daha üstünde yeniden düzenlenmenin mümkün olduğunu gösterir.

? ? GELECEK

2002

Hochedlinger ve Jaenisch yetişkin faredeki T ve L lenfositlerden fare üretti.

1997 Wilmut koyun hücre kültürünü klonlayarak Dolly'i yarattı.

1958 Gurdon iribaş çekirdeğinden yetikin kurbağa üretti.

1955 King ve Briggs transplante edilen balastosit hücre çekirdeğinden iribaş üretti. 120 mayıs 2012

hükök

MAKALE KÖK HÜCRE ETİĞİ Elif Reyhan Güneş

ök hücreler, teorik olarak sonsuz bölünme ve birçok hücre türüne farklılaşabilme özelliklerine sahip hücrelerdir. Döllenmiş yumurta hücresinden birkaç bölünme ile elde edilen hücreler totipotent nitelik taşır; sonrasında yine bölünmeyle oluşan hücrelerin plastisitesi azalmaktadır. Totipotent hücrelerden pluripotent hücreler oluşur. Bu tür hücreler plasenta hariç, vücudun herhangi bir tür hücresine dönüşebilir. Embriyonik kök hücrelerin elde edildiği blastosit, pluripotent niteliktedir. Embriyonik kök hücrelerin tedavi amaçlı kullanım açısından en iyi kaynak olabileceği düşünülmektedir. Ancak, insan embriyonik kök hücre çalışmaları, etik olarak tartışmaya açıktır; çünkü insan embriyolarının yok edilmesini içerir. Şu an için ek sık gündeme getirilen nokta, in vitro fertilizasyon süreçleri sonucunda oluşan artık/fazlalık embriyoların kök hücre elde etmek amacıyla kullanılıp kullanılamayacağı sorusudur. Bu soruya olumlu yanıt verilmesi halinde ise sadece kök hücre araştırması amacıyla kullanılmak üzere embriyo üretiminin yaratabileceği etik sorunlar gündeme gelmektedir. Bilim dünyasındaki ortak kanı: İnsan embriyonik kök hücre çalışmalarının çeşitli ciddi ve tedavi edilemeyen hastalıklar için yeni tedavi yöntemleri geliştirilmesini sağlayabileceğidir. Bu konudaki araştırmalarla ilgili dikkat çeken etik sorular: İnsan Embriyolarının Yok Edilmesi Ahlaki Açıdan Kabul Edilebilir Bir Durum mu? İnsan embriyonik kök hücre dizileri, erken zamanda, blastosit evresinde iç hücre kütlesinin fiziksel ve kimyasal yollarla ayrıştırılmasıyla elde edilir. Embriyada yaklaşık 200 hücre vardır ve farklılaşmış dış-plasental madde içerir. İç hücre kütlesi ise farklılaşmamış hücreler içerir ve bu hücreler pluripotenttir. İç hücre kitlesinin ayrıştırılmasını gerektiren bu prosedür sonunda embriyo ölür. İşte bu yüzden bu etik soru doğuyor:

Biz bile bile, kasten gelişmekte olan bir insanı bu aşamada, bilimsel bilgilerimizi genişletmek veya tıbbi fayda sağlamak için öldürme hakkına sahip miyiz? Embriyoya birbirinden farklı ahlaki statüler atfedilebilmektedir. Embriyonun oluşumundan itibaren erişkin bir insan gibi saygı görmesi gerektiğini düşünenler için embriyo üzerinde kök hücre araştırması yapılması kabul edilemez bir uygulama olmaktadır. Diğer taraftan, anne rahminde olmayan bir embriyonun artık büyüme ve erişkin bir kişi haline gelme potansiyelinin bulunmadığını ileri süren diğer bakış açısına göre, embriyonik kök hücre araştırmaları en azından kuramsal boyutta bir etik sorunu barındırmamaktadır. Farklı bir yöntem olan Tek blastomer biopsisi sırasında embriyo bir zarar görmemektedir. Ancak erken dönem blastomerlerden geliştirilecek hESC dizileri totipotent olabilir. Bu durumda, ikinci bir embriyo geliştirebilirler ve bu da embriyonun ahlaki statüsüne ilişkin tüm etik tartışmaların baştan başlaması anlamına gelir. Ayrıca günümüzde var olan bir çok embriyonik kök hücre (hESC) dizisi embriyoların yok edilmesiyle üretilmiştir ve dünyada hala, dondurulmuş embriyoların %10'u kök hücre üretiminde kullanılmaktadır. Bu gerçekler embriyonun ahlaki statüsü ve ve yapılması kabul edilemez bir uygulama olmaktadır. Diğer taraftan, anne rahminde olmayan bir embriyonun artık büyüme ve erişkin bir kişi haline gelme potansiyelinin bulunmadığını ileri süren diğer bakış açısına göre, embriyonik kök hücre araştırmaları en azından kuramsal boyutta bir etik sorunu barındırmamaktadır. Farklı bir yöntem olan Tek blastomer biopsisi sırasında embriyo bir zarar görmemektedir. Ancak erken dönem blastomerlerden geliştirilecek hESC dizileri totipotent olabilir. Bu durumda, ikinci bir embriyo geliştirebilirler ve bu da embriyonun ahlaki statüsüne ilişkin tüm etik tartışmaların baştan başlaması anlamına gelir. Ayrıca günümüzde var olan bir çok embriyonik kök hücre (hESc) dizisi embriyoların yok edilmesiyle mayıs 2012 121

makale

hükök hücre çalışmalarında kullanılabilecekken, yok edilmektedir. Peki zaten yok edilecek olan bu embriyolardan faydalanmak neden etik açıdan yanlış olarak görülüyor? Çünkü buna izin verilirse doğrudan bu amaç için embriyo üretileceği ve bunun hep devam edeceği düşünülüyor. Örneğin, çok az insan ölmek üzere olan bir çocuğun hayatını kurtarmak için ölmüş bir gencin organlarının kullanılmasına itiraz eder ve bu organ nakline izin verildi diye özellikle insanlar öldürülmez. Benzer şekilde kök hücre araştırmalarında da kontrol dahilinde, tüp bebek çalışmalarından arta kalan embriyoların kullanılmasına izin verilebilir.

üretilmiştir ve dünyada hala, dondurulmuş embriyoların %10'u kök hücre üretiminde kullanılmaktadır. Bu gerçekler embriyonun ahlaki statüsü ve bu yok edişin etik yönüyle ilgili bu soruyu gündemde tutmaktadır. iPSC Çalışmaları Etik Soruları Ortadan Kaldırıyor mu? 2007 yılında Yamanaka ve Thomson pluripotent kök hücre üretmek amacıyla gen transferi yapmayı başardılar. İnsanlar bunun kök hücre çalışmaları hakkındaki etik tartışmaları bitireceğini düşündü. Ancak bilimsel açıdan,fareler üzerinde yapılan deneyler sonucunda induced pluripotent kök hücrelerin yüksek tümör oluşum oranına sahip oldukları anlaşıldı. Ve bu hücrelerin transferinde kullanılan retroviral vektörler kanser oluşumuyla bağlantılı. Bu problemler çözümlenene dek etik olarak insanda iPScell kullanımı yanlış olacaktır. Yok Etmek Üzere Embriyo Üretebilir miyiz? Erken dönemdeki embriyonun bir insana eşit olduğunu savunanlar bu amaçla embriyo üretilip yok edilmesine karşı çıkıyor. Onlar, bu çalışmaların insanı maddeselleştireceğini düşünüyor. Bu tartışmalar şu soruyu akıllara getiriyor: Neden çiftlerin bebek sahibi olmasına yardım eden tüp bebek çalışmaları etik açıdan doğru kabul edilirken, insan hayatını kurtarmak için bu işlemi yapmak yanlış? Önceden Üretilmiş hESC Dizilerinden Faydalanabilir miyiz? Kök hücre dizisi üretiminde kullanılan embriyoların çoğu tüp bebek çalışmalarından elde edilmektedir. Bu çalışmalarda yerleştirilecek embriyo sayısından çok daha fazlası üretilir geriye kalanlar dondurularak saklanır veya yok edilir. Bu embriyolar kök

122 mayıs 2012

Klon Embriyo Üretmeli miyiz? ''Human therapeutic cloning'' bilinçli olarak, somatik hücre çekirdek transferi ile embriyo üretilen yöntemdir. Bu embriyolardan üretilen kök hücre dizileri bağışıklık sisteminde bir tepkiye neden olmaz çünkü annesinden alınan yumurtaya (mitokondri aynı) bireyin vücut hücresinin çekirdeği yerleştirilir yani birebir özdeş bir embriyo elde edilmiş olur. Bu embriyo rahme yerleştirilirse o kişinin klonu doğar (reproductive cloning); fakat therapeutic cloning yöntemiyle kişiye özgü embriyonik kök hücre dizileri üretilmektedir. Bu hücrelere verilen özel büyüme faktörleri ile ihtiyaç duyulan organ üretilir ve kişiye özgü olduğu için vücutta bir reddetme söz konusu olmaz. Peki bu yolla üretilen embriyo, insan embriyosu olarak mı kabul edilir? Her ikisinin de insana dönüşme potansiyeli var; ama sonuçta bu yöntemle döllenme olmaksızın üretildi. Ayrıca klon embriyolarda görülen yüksek ölüm oranı da belirgin bir fark yaratıyor. Klon embriyoya ahlaki açıdan biyolojik embriyo ile eşit görürsek aynı etik sorularla karşılaşırız. İnsan Embriyonik Kök Hücre Araştırmalarını Ertelemeli Miyiz? İnsan embriyolarının yok edilmesine karşı olanlar en azından aynı faydaları sağlayacak yeni bir yöntem (erişkin kök hücre dizisi vb.) geliştirilene kadar bu araştırmaların ertelenmesi gerektiğini savunuyor. Erişkin kök hücre araştırmalarının belirsizliği ise devam ediyor. Bilim insanları erişkin kök hücrelerinin kullanışsız oluşundan şikayet ediyor. Bu belirsizlik de ''embriyoları korumak ve saygı duymak konusundaki hassasiyet yüzünden çocuk ve yetişkin tedavileri ertelenmeli mi?'' sorusunu gündeme getiriyor. Birçok insan böyle bir ertelemenin olmaması gerektiğini, kök hücre

hükök

makale

terapileri için çeşitli yolların bilimsel ve ahlaki açıdan açık tutulması gerektiğini düşünüyor. Avrupa Birliği üyeleri embriyonun konumu nedeniyle konu ile ilgili farklı yaklaşımları içeren yasal düzenlemelere sahiptir. Polonya ve Slovak Cumhuriyeti embriyo üzerinde araştırma yapılmasını yasaklarken; İngiltere kök hücre çalışmaları için insan embriyosu üretimine izin vermektedir. Türk hukukunda embriyonik kök hücre çalışmaları konusunda herhangi bir düzenleme bulunmamaktadır. Ancak, Sağlık Bakanlığının 2005 tarihli “Embriyonik Kök Hücreler Genelgesinde” embriyonik kök hücre ile ilgili araştırmalrın durdurulması kararı yer almıştır. Bu bağlamda, konu ile ilgili çalışmalar sonuçlanana kadar embriyonik kök hücre çalışmaları durdurulmuştur. Bahsettiğimiz etik sorulara ortak bir cevap verilmesi beklenemez fakat bilimsel gelişmeyi sağlayabilmek adına en azından üniversite laboratuarlarında özel izin ve kontrol dahilinde, ebeveynlerden de izin alınarak, tüp bebek çalışmalarından arta kalan embriyolar ile embriyonik kök hücre araştırmaları yapılabilir.

mayıs 2012 123

hükök

RÖPORTAJ Ayşen Günel Özcan Röportajı Yusuf Yıldırım, Betül İçli Bize kendinizi tanıtır mısınız? İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi (Çapa) mezunuyum. 1994-97 yılları arasında YÖK bursuyla Imperial College London'da Moleküler Biyoloji ve Genetik üzerine eğitim aldım. Sonra Türkiye'ye dönerek Kırıkkale Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Genetik'i kurdum. 2010'da, oldukça geç bir dönemde de:D , doçentliğimi aldım. 2008 yılından beri de burda Hacettepe Üniversitesi'nde çalışıyorum. Sizin ilgilendiğiniz konular neler? Homeodomain transkripsiyon faktörlerinin kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerde nasıl bir profili var? Mezenkimal kök hücreler kemik iliğinde stromayı sağlayan mikroçevreye önemli katkısı olan hücreler,hastalıklı bir durumda bu stroma nasıl değişiyor ve transplantasyon sonrasında da bu stromaya ne oluyor ? Çünkü transplantasyonda kemik iliğini değiştiriyoruz ama hastanın stroması aynı kalıyor, sağlıklı kemik iliği gelince acaba hastanın stromasında düzelme oluyor mu, oluyorsa nasıl oluyor ve bunun hastalığın düzelmesine ne gibi bir katkısı var? Bu soruların yanıtlarını arıyoruz, şu anda sadece profilleme yapıyoruz, yıllara yayılacak bir araştırma süreci bu. Onun dışında benim özellikle yapmak istediğim şey mezenkimal kök hücrelerin genetik modifikasyonlarıyla uğraşmak, şu an bunun altyapısını oluşturmakla uğraşıyorum. Genetiğini değiştirerek bu hücrelerin tedavide kullanılması .Bunların immün baskılayıcı etkileri var, bu bazı hastalıklarda bir avantaj bazılarında dezavantaj olabiliyor. Çevreye göre de değişiyor bu özellikleri, immün baskılayıcı olarak verdiğiniz bir şey sonra immün

124 mayıs 2012

reaktivasyona da yol açabiliyor, bu hangi koşullarda gerçekleşiyor? Bütün dünyanın da üzerinde çalıştığı bir konu bu. Biz daha bunla ilgili projelere başlamadık ama mezenkimal kök hücrelerin immün modilasyon amaçlı kullanılmasıyla ilgili bir proje verdik eğer çıkarsa bu da en önemli ikinci ilgi alanımız olacak. Bir de microRNAlar var, genomun kodlamayan bölgelerinden üretilen, gen regulasyonunda önemli kısa nükleotit dizileri diyebiliriz. Hastalık durumlarında hangi miRNAlar farklılık gösteriyor, bunlar biomarker olarak kullanılabilir mi, tedaviye aktarılabilir mi gibi soruların yanıtlarını arıyoruz. Bu da üçüncü büyük çalışma alanımız olacak gibi gözüküyor. Bu COST aksiyonunda projemizin bir kısmı miRNAlarla ilgili zaten, önümüzdeki dönem çalışmalar başlayacak, onun için paramız var yani. Araştırma dediğiniz de bir anlamda para zaten, o olmadan olmuyor. Mesela bir projeniz var, bunun için maddi desteği nasıl sağlıyorsunuz, nerelere ne gibi gerekçelerle başvuruyorsunuz? Ben hep Tübitak projesi yazdım. Çok iyi

röportaj

hükök tanımlanmış bir sorunuz olmalı, yoksa fikirler geri dönüyor. O soruyla ilgili ayrıntılı bir proje hazırlamanız gerekiyor. Ben ilk Tübitak projesi yazarken şaşırmıştım, çok detaylandırmanız gerekiyor , bir sonuçları koymadığımız kaldı demiştik. Şimdi biraz daha esnediler. Kullandığınız malzemeleri vs ayrıntılı yazmanızı istiyorlar. Bütçenizi çıkartıyorsunuz, etik kurul gerekiyorsa etik kurul iznini almanız gerekiyor. Bazen projeler reddediliyor, özgün değeri yüksek ama ya grubun tecrübesini sınırlı bulabiliyorlar ya da alt yapı yetersiz denebiliniyor. Siz de bir danışman ekliyorsunuz, cihazı olan bir laboratuvarla işbirliğine girip o şekilde halletmeye çalışıyorsunuz çıkan problemleri. Çok iyi bir hipotezle başvurduysanız ordaki eleştirileri dikkate alarak yeniden deniyorsunuz ve sonunda kabul almış oluyorsunuz. Bazen özgün değeri çok yüksek olmasına rağmen literatürde hiç örnek olmadığı için red gelebiliyor. Bir şeyi ilk söylüyorsanız bu riskli bir iştir. Bir de ülkenin öncelikli alanlarına girmesine bakılıyor tabi. DPT genelde bir altyapı kurma amaçlı, daha büyük , rektörlük destekli projeleri üstleniyor. Ben hiç DPT'ye proje yazmadım ayrıntılarını o kadar bilmiyorum. Yurtdışında aldığınız eğitimin burda size ne gibi faydaları oldu? Siz dünyanın en önde gelen üniveristelerinden birinde doktora yapıyorsunuz, onların soruları , endişeleri, bilimsel ilgileriyle yeni kurulan bir üniversitenin öncelikleri çok farklı oluyor. Siz kendinizi oraya çektiğinizde de hayata döndürebilceğiniz şeyler çok sınırlı kalıyor. Böyle bir dezavantajı var tabi. Oysa bilimsel politikalar çapında düşünülüp de, belli mükemmeliyet merkezlerinde, büyük güdümlü projelerde çalışsaydık çok daha faydalı olurduk. Yine de fena değildik, Hacettepe'de moleküler klonlama yapılmazken biz Kırıkkale'de yapıyorduk, burdan onkoloji enstitüsünden doktora öğrencileri gelip bir kısmını orda yapıyorlardı sonra dönüp burada devam ediyorlardı. Şimdi yapılıyor tabi onkolojide de tıbbi biyolojide de. Orda da doktora öğrencisini bulamıyorduk dediğim gibi yeni kurulunca öncelikler farklı olabiliyor. Oradayken önce lisans programı oturttuk, tanı için bir laboratuvar kurduk bu kadar. Yine de şanslıydım diyorum, o dönemde bunları anlayabilen yurtdışında çalışmış bir dekanımız vardı da bunları hayata geçirebildik. Ben

yurtdışında aldığım eğitimin %10'unu geri getirebildim diyebilirim Yurtdışıyla anlaşmalı yapamıyor musunuz? Yapabilirisiniz yayın olur ama o orda kalır, sizin akademik kariyerinizde hızlı yükselmenizi sağlar. Öğrencinizi de yollarsınız insan yetişmiş olur, ama onun burda maddi olarak hayata geçmesi için burda yapmanız, burda onu oturtmanız gerekiyor ve tabi büyük bir mücadele vermeniz. Çalışmalarınızı yazılımlar üzerinde yapabiliyor musunuz? MicroRNA datalarımız çıkınca, o programları öğrenmeye başlıcaz öğrencilerimizle birlikte, biyoinformatikten başlıcaz ama sistem biyolojisi var mesela tamamen farklı bir konu. Sistem biyolojisinde deney yapıyorsunuz, o bilgileri giriyorsunuz sisteme, ordan yeni hipotezler çıkıyor,sonra tekrar deneye dönüyorsunuz, böyle çalışıyor aslında.Bunu da yapmak isterim ama benim yeterli altyapım yok bu konuda. Modellemeler için o alanda uzman birileri gelirse onlarla çalışmak çok güzel olur tabi. Pedi-stem nedir? Nelerle uğraşır? Siz nelerle uğraşıyorsunuz? Pedi-stem 2005 yılında Duygu Uçkan tarafından DPT'ye verilmiş bir proje. Pedi kısmı pediatrik hastalıkların örnekleri olmasından kaynaklanıyor. Duygu Hanım pediatrik transplantasyonla uğraştığı için kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri geliştirmeye başlıyor. Bununla ilgili de böyle bir proje verip biyobankayı büyütmek, burdaki mezenkimal kök hücreleri iyi bir şekilde karakterize etmek, başka hücrelerle etkileşiminde neler oluyor onları araştırmak, GMP koşullarında- yani hastaya verilecek özellikte- mezenkimal kök hücreleri üretmek gibi amaçlarını hayata geçirmeyi planlıyor. Türkiye akraba evlilikleri dolayısıyla nadir hastalıklar yönünden zengin bir ülke olduğundan çok önemli bir arşiv oluşuyor aslında burda biyobankanın genişlemesiyle. Çoğunluğu mezenkimal kök hücre olmakla birlikte hematopoetik kök hücre de oluyor ama o daha sınırlı. Hollanda'dan doktorasını almış bir post-doct var Fatima Artz Kaya(?), orda da Cell-PID projesinde aktif olarak çalışmış biri. Yakında o da sanırım öğretim görevlisi kadrosuna atanmış olur, o daha çok uğraşacak hematopoetik kök hücreyle. Ben dediğim gibi 2008 yılında geldim. 2010 yılında mayıs 2012 125

röportaj yazdığımız kök hücre bilimleri doktora programı YÖK'ün onayından geçtikten sonra da işte bu sene ilk öğrencilerimizi aldık. İlgi oldukça fazla, 8 tam kayıtlı öğrencimiz ve dışarıdan birkaç özel öğrencimiz var. İlk dönem “kök hücre bilimlerinde temel mekanizmalar” dersini aştık, bu dönem de “doku organ kök hücreleri, kök hücre laboratuvar yöntemleri” derslerini veriyoruz ağırlıklı olarak. 2 tane Avrupa Birliği projesine dahilim: COST ve Cell-PID (Advanced Cell-based Therapies for the treatment of Primary ImmunoDefiency) Cell-PID immün yetmezlik hastalarına gen tedavisi protokollerinin geliştirileceği daha geniş çaplı bir proje. Cell-PID'in Türkiye ayağını Duygu Uçkan yürütüyor.Ancak gen iletim vektörlerinden lentiviral konstractlar Avrupa'daki partnerlar tarafından yapılıyor. COST belli bir konuyla ilgili çalışan, dünyadaki ve özellikle Avrupa'daki grupları biraraya getirmeyi amaçlıyor. Amerika'dan gelen gruplar araştırma sonuçlarını anlatıyorlar genelde. Avrupa'daki gruplar ise laboratuvarlar arasında gidip gelerek edindikleri bilgileri paylaşabilme imkanı buluyorlar.COST'un birçok aksiyonu var, biz de onlardan birindeyiz: Sağlıkta ve hastalıklarda Hox tail transkripsiyon faktörleri. Bunlar gelişim esnasındaki transkripsiyon faktörleri, vucud aksini belirleyen genler hoxlar. Tailler de hoxların özgünlüğünü belirleyen genler. Bu genlerin evrimsel süreçte meyve sineğinden insana kadar çok iyi korunmuş olduğunu görüyoruz. O yüzden model organizmalar üzerinden ilerliyor daha çok, zebra balığında, meyve sineğinde vs çalışan gruplar var. Ne işe yaradığıyla ilgili de şu örneği verebilirim, hoxlarla ilgili bir geni kapadığınızda bacak olacağı yerde anten olabiliyor ya da kanat olcağı yerde bacak cıkabiliyor gibi. Yani gelişim sürecinde organların lokalizasyonunu belirleyen kısımlar bunlar, niye gözümüz başımızdanın cevabını arıyoruz biraz da. Gelişimden sonra da dokularda homeostasisin saglanmasında görev alıyor ama çok da iyi bilinmiyor açıkçası bu aşamadan sonraki özellikler. Biz de “acaba hastalıklarda ne oluyor?” diye sorup bunu inceliyoruz. Kök hücre ile ilgili ilginç bulduğunuz çalışmalar neler? Sizin beklentileriniz neler? Yakın ve uzun vadedeki planlarınızı bizimle paylaşır mısınız ? Primordial germ hücrelerinin büyük ilgiyi üstünde toplayacağını düşünüyorum. Mezenkimaller

126 mayıs 2012

hükök multipotent olmasına rağmen, bunlar pluripotent. Normalde vücütta pluripotent değillerken in vitro koşullarda bu özelliğe sahip olduklarını görüyoruz. Dünyada bununla ilgili çalışan gruplar çok sınırlı,buna rağmen ulaşılan sonuçlarda embriyonik kök hücrelerden farklı olarak teratom oluşturmadığı saptanmış. Embriyoniklerin kliniğe geçmesindeki en büyük engelin teratom oluşturması olduğunu biliyoruz ve belki de primordial kök hücreler buna bir çözüm getirebilcek diye düşünüyorum. IPS hücreleri de çok iyi ama onların da büyük problemleri var, genetic stabiliteleri , epigenetic değişiklikleri embriyoniklerle aynı değil. Ama toksikoloji çalışamaları için çok önemli bunlar da. IPSi biraz açıklamak gerekirse, fibroblastı alıyorsunuz 4 tane geni veriyorsunuz ve epigenomu geriye sarıyorsunuz, pluripotentlik sağlıyorsunuz. Mezenkimaller kliniğe transfer açısından en uygun olanlar Bazen tek başlarına, bazen genetic modifikasyonla ya da bazen başka bir molekülle birlikte verdiğinizde işe yarıyor. Mesela mezenkimal kök hücrelerin tumor oluşturma potansiyeli rağmen, tümör tedavisinde kullanılıyor. Gönderdiğimiz kök hücreler direk yaralı dokuya gittiği için bir intihar genini aktarıp dokuya yollayabiliyorsunuz . Tumor oluşturma riski de ortadan kaldırılırsa bence rejeneratif tıp açısından çok önemli mezenkimal kök hücreler. Biz de bu alana yönelmeye çalışıyoruz. Bu kök hücre çalışmalarına fizyopatolojinin aydınlatılması açısından da büyük görev düşüyor.Petridişte insanın kendi hastalık modelini oluşturup hiç model organizmalara gitmeden çalışmalarınızı yapabiliyor hale geliyorsunuz. İlgilendiğiniz alanlarda beklentileriniz neler? Türkiye'de mi dünyada mı? Türkiye'de ilerleme çok yavaş. Türkiye'de yapılan çalışmalar hemen kliniğe geçsin isteniyor. Temel bilimci olarak ne kadar ileri gidebiliriz kuşkularım var. Bunlar bireylerin tek başına yapabileceği şeyler değil. Bilim politikalarına ihtiyacımız var. Tabii ki translational (kliniğe uygulanabilir) olması çok önemli ama bir şey hemen kliniğe geçemiyor. Bir ilacın kullanılabilmesi bile en az 10 yıllık çalışma gerektiriyor, o da dünya ölçeğinde ilaç firmalarıyla tabii. Akademide bu çok daha yavaş tabii. Yani çok boyutlu düşünmek gerekiyor. Bizde bilim politikaları üretebilen, buna kafa yoran insanların olmadığı düşüncesindeyim, bizde yok yani. Dünyada bilim bakanlıkları var ve bu

röportaj

hükök bakanlıklarda çok yetkin insanlar var. Burada bilim bakanlığı kurulsa bile ne kadar etkin çalışır o da soru işareti. Bilim para yer. Siz toplum olarak günü kurtarmaya mı bakıyorsunuz geleceği mi kurtarmaya bakıyorsunuz? Günü kurtarmaya bakıyorsanız şu anda olduğu gibi para harcamazsınız. Aynı şekilde Türkiye'deki akademisyenlerin de böyle düşünmesi lazım. Türkiye'deki sistemde bugünü kurtarmaya yönelik bir sistem. Uzun vadeli yatırımlara kimsenin ne sabrı var ne de sistemden dolayı kimse girmek istiyor. Ama insanların uzun vadeli planlarının olması lazım. Ben doktoramı yaparken hocamın yıllara yayılan projesi vardı. Ben sadece orada vagondum, ben çıktım başka birileri geldi. Bu bir bayrak yarışıydı. Siz bırakıyorsunuz başka biri aynı projede devam ediyordu. Ve o proje belli bir yere gelince danışman tekrar hedefe yönelik çalışma yapıyordu. Ama kendi yapacağı işler için kollaborasyon kurmuyordu yani yapmayacağı işler için kollaborasyon kuruyordu. Bize mesela Amerika'dan kimyasal geliyordu ama biz o kimyasalı deniyorduk, ama projeyle bağlantılı olarak. Yani gidip biz üretmiyorduk tabii ki. Hem böyle kollaborasyona açık olmak gerekiyor ama Türkiye'de bir bakıyorsunuz herkes aynı işi yapıyor. Nasıl kollaborasyon bu diyorsunuz. Yani kollaborasyonların da çok iyi dengelendiğini düşünmüyorum. Bilim kültürü yıllara yayılan bir şey. Avrupa bunu Ortaçağ'dan çıktıktan sonra yapmaya başlamış. Bu bilim kültürünün oturması da bir süreç gerektiriyor. Dediğim gibi bilim politikalarıyla ve akademik camiada da günü kurtaracak değil ama ürün dediğimiz şey illa ki hastaya verilecek olması gerekmiyor. Bir yolağı tanımlamak da bir üründür. Anlatabiliyor muyum? Hep ubiquitini örnek veririm, ubiquitinle Nobel ödülünü alan kişi burada konuşma yapmıştı. İlk yayın yaptığında c grubu bir dergide yayın yapıyor ve 10 yıl boyunca hiç atıf almıyor. Türkiye'de böyle bir şey olduğunu düşünsenize, akademik hayatınız gider. Sonra Nobel alıyor ama. Yani böyle hiç kimsenin söylemediği bir şeyi söylemeye kimin cesareti var yani. Ya da bir konuya atılmanın. Aynı şekilde telomer. Ubiquitin ve telomer şu anda kanser için çok önemli. Telomerazla uğraşanın da bakın hikayesine. Zaten C. Elegans'la çalışıyor. Burada C. Elegans la çalışmaya çalıştığınızda bu translational mı diye önce önünüze bir şey çıkar ve tek merakı DNA'nın uçlarında ne var diye bir soruyla

yola çıkıyor ve bunun klinikle ne alakası var değil mi? Ama sonra kliniğe ne kadar önemli katkı sağlıyor. Onun için başlangıçtaki atılımı yaptıran temel araştırmalar çok önemli, temel araştırmalara kaynak aktarmak çok önemli ama maalesef temel araştırmalar hep para götüren yerler olarak görüldüğü için çok yavaş ilerliyoruz. Dünya ölçeğinde beklentileriniz neler? Dünya ölçeğinde gen tedavilerinin biraz daha hızlı ilerleyeceğini düşünüyorum. Bir dönem çok durdu çünkü ama gen tedavisini kök hücreden ayıramıyorsun zaten modifiye ettiğiniz hücre sonuçta hematopoietik kök hücre. Hücresel tedaviler daha eski aslında. Son yıllarda bu atılımın yapılmasının sebebi de kültür ortamlarının daha iyi geliştirilmesi çünkü kök hücreleri petride üretebilmek. Pluripotentliğin birçok şeye çare olması bekleniyor. Ama ondan da öte ben tissue engineering le ilgili ilerlemeler bekliyorum. Bizim alanımız değil ama sonuçta orada da kullanılan, doku mühendisliğinde de kullanılan hücreler. Orada kullanılması da büyük katkılar sağlayacak. Mesela renkli printer ı doku mühendisleri düşünüyor, youtube'dan falan bulursanız seyredin, mürekkep yerine belli oranlarda hücre püskürterek doku yapıyorlar. Bu müthiş bir şey tabi, bu alanın çok ilerleyeceğini düşünüyorum. Özellikle transplantasyon açısından. 3 boyutlu doku kültüründen böbrek yapmak, böbrek en karışık organlardan biri. Bu tabii mühendisliği de çok ilgilendiren bir şey. Tek başına hiçbir şeysiniz bu yüzyılda. Çok farklı birimlerin bir araya gelip ortak projelere imza atması gerekiyor, bizim beklentilerimiz o yönde. Buna da desteklerin verilmesi beklentimiz. Dünyayla ne kadar çok entegre olursak dünyadaki gelişmeleri buraya o kadar getirmek mümkün olabilecek. Dünyada benim izleyebildiğim bunlar, bu alanlarda transplantasyon ve rejeneratif tıp

mayıs 2012 127

röportaj açısından önümüzdeki yıllar çok önemli olacak gibi. Bu yüzyıla biyoloji yüzyılı deniyor, geçen yüzyıl fizik yüzyılı deniyordu. Yakın ve uzun vadedeki planlarınızı bizimle paylaşır mısınız? Yakın zamanda miRNA'lar var. Fanconi hastalığında. Onların kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinden hox profilleme ve miRNA prodilleme yapıyoruz. Önümüzdeki yıl, birkaç yılımızı bunlar alacak. Onların doğrulanması. Buradan biomarker çıkar mı? Biomarker bulmak tabii amacımız. Tabii bir de fizyopatolojiyi aydınlatmak amacımız. Buradan modellemelere geçebiliriz. Çünkü zebra balığının fanconi modeli var. Hatta bu zebra balığı yakın-uzun vade gibi oluyor. Mezenkimal kök hücrelerin immün modülasyonunu nasıl yaptığını araştırmak ikinci yakın-uzun, orta vadeli diyeyim planlarımız. Uzun vadede mutlaka ve mutlaka primordial germ hücrelerinin ve embryonik kök hücrelerle ilgili çalışma yapmak isterim. Buradaki çalışmaların kliniğe uygulamaları neler? Şu anda kliniğe uygulama yok. Mezenkimal hücrelerin temel karakterizasyonuyla ilgili çalışmalar bunlar. Ama bir biomarker bulursak, kliniğe uygulama hedeflerimizi bu yönde koyuyoruz. Ya da genetik modifikasyonlarının güvenli olduğunu gösterirsek bu da kliniğe tedavi amaçlı gidebilir. Verdiğimiz son projeyi söyleyeyim ben: mezenkimal kök hücreleri bir immün gen aktarıp onu kanserde kullanmaya yönelik. Çünkü kanser immün sistemden kaçan hücreler. Siz onu gönderdiğinizde ligandı var, siz reseptörü gönderdiğinizde ya da tam tersi orada immün toleransı yok edecek bir şekilde gen aktarırsanızçünkü mezenkimal tümöre gidecek- tümörü tedavi edebilirsiniz. Bu yoldan çıkarak bir proje yazdık eğer kabul olursa. Bizimki sadece tümörü immün sisteme tanıtma amaçlı bir proje olacak. Mesela bu tip şeyler kliniğe gitmesi için bir bilgi birimi sağlayacak çalışmalar. Bu şekilde çalışmalarımız var. Bir de Cell PID aslında. Cell PID projesi direkt kliniğe yönelik. Bu tip çalışmalar Avrupa'da yapılıyor. İmmun sistem defektlerine bağlı, kalıtsal hastalıklara yönelik gen tedavisi amaçlanıyor. Konstraktlar işte onların güvenli olup olmadığı. Bunların hepsi Avrupa'daki başka gruplar tarafından -lentiviral vektörlere takılması bu konstraktların- Avrupa'daki ülkelerde yapılıyor. Onlar buraya gelecek. Burda hasta örnekleri üzerinde bu gen tedavi konstraktları nasıl etki ediyor onlara bakacak. Ondan

128 mayıs 2012

hükök sonra zaten GMP koşullarında üretilip, güvenli ise hastaya verilecek. Cell PID'in amacı böyle. Yani oldukça büyük bir proje. Buradaki ayağı da zaten direkt klinikle alakalı. Onun dışındakiler hep klinikte kullanmaya hedefli. Ama kliniğe urun üretmek anlamında değil de iyi bir şekilde hücreleri tanımlamak ve fizyopatolojisini aydınlatmaya yönelik. Bulabilirsek tabii, biyomarker bulmak çok güzel olacak. Türkiye'deki kök hücre çalışmalarını değerlendirir misiniz? Türkiye'deki kök hücre çalışmalarından gittiğim birkaç kongre kapsamında bahsedeyim. Genellikle mezenkimal kök hücre çalışılıyor, embriyonik kök hücrede işte kurallar nedeniyle, bir dönem çalışılmış bir ara yasaklandığı için bırakılmış. Ankara Üniversitesi'nde bir grup var, Murat Elçin'lerin grubu. Histolojiden Akçan var galiba, Gata'da yine Ali Uğur Ural'ın bir laboratuvarı var. Onlar hematopoietik kök hücre ve mezenkimal çalışıyorlar sanırım. Ama orada tıbbı biyolojide doktora öğrencisi var. Onlar şimdi embriyonik kök hücre çalışmalarına başlıyorlar. Tabi fare embriyonik hücre hatları üzerinden onlar da bir takım hastalık modellerinde çalışmak istiyorlar. Yani fizyopatolojiyi aydınlatmaya yönelik çalışma olacak onlarınki de. Gata'daki o grup dışında embriyonik kök hücre çalışan başka bir grup var mı bilmiyorum. 9 Eylul'de nöronal kök hücre grubu var, o dediğim arkadaşlar. Onlar bayağı eskiden başladılar aslında yine farelerden, nöroloji üzerine bir tıbbi bİyoloji yapmış tıbbı biyologdur. Eşi de nöroloji üzerine fizyoloji yapmıştır. Nörofizyologdur. Oldukça iyi çalışmaları var onların. Manisa'da var İngiltere'den doktorasını almış bir histolog arkadaş. İstanbul grubunu çok bilmiyorum da İstanbul'da Acıbadem'de, Trabzon'dan oraya geçmiş bir hocanın kurduğu -bir de Bilkent'ten bir hoca geçti- onlar bir grup kurdu orda onu biliyorum . İTÜ'de, orada bir teknopark bünyesinde kök hücrelere yönelik bir şey kuruldu ama o da daha çok üretmeye yönelik sanırım. Trabzon'da var zaten biliyorsunuz. İlk orda başladı zaten ama üretime yönelik o da yine yani üretim farklı bir olay tabi. Onu ilaç bazında düşünmek gerekiyor onu. Bir işte Akdeniz Üniversitesi gen tedavi grubu var orada ama deneysel gen tedavi düzeyinde. Asıl şeyi unuttum Kocaeli var tabii ki Kocaeli aktif bir grup aslında. Onların baya bir projeleri var ama onlarda temel araştırma düzeyinde baya aktifler . Yani TÜBİTAK'ın var mı bilmiyorum yine. Kayseri bina yapıyor yani o daha yeni. Kayseri var da sempozyumlarla filan ön plana

hükök

röportaj

sempozyumlarla filan ön plana cıktı ama çalışma anlamında ne yapılıyor bilmiyorum açıkçası. Onlar da bir DPT projesi mi aldılar bilmiyorum. Orası da iyi bir merkez olacak gibi duruyor. Aslında hücre biyolojisi çalışan ile moleküler biyoloji çalışanı bir araya getirdiğinizde mutlaka bir şeyler çıkar ortaya. Asıl mesela Bilkent'te Can Akçalı var. Daha cok hayvan modelleri üzerinde çalışıyor. O da mezenkimal kök hücre üzerinde çalışıyor. Mezenkimaller tabi translational, Türkiye'de destek bulmak daha kolay. Kliniğe daha yakın hücreler. Hem de üretimleri avantajlı. Kemik iliği önemli bir kaynak ama buradan ulaşamıyorsanız yağ dokudan da ulaşırsınız. Bu dokudan da üretmeniz mümkün. karakterleri de öyle çok değişmiyor gibi görünüyor. Fenotip olarak değişmiyor ama moleküler düzeye indikçe mutlaka farklılıklar çıkacaktır. Özellikle bu hox profilleri konusunda ben çıkacağını düşünüyorum; yani karından aldığınız bir yağ ile yüzden aldığınız bir yağ aynı değil aslında. Bizim o anlamda değil çalışmalarımız ama o da ilginç bir alan olabilir. Adipoz kaynaklı çalışmadığımız için o bağlamda değil ama adipoz dokuya geçersek de mutlaka o tip bir çalışma yapmak gerekir, yayınlarda da var zaten. Türkiye'de başka, Ege'de var mı bilmiyorum. Ben 9 Eylül'de bir konuşma yapmaya gittiğimde Ege'den bayağı bir katılım vardı. Onlar da sanırım küçük küçük gruplar halinde başlıyorlar. Ben İzmir Yüksek Teknoloji'den bir şeyler bekliyorum. Orda temiz oda filan da yapmışlar ama daha bir şeye başlamamışlardı. Daha çok deneysel ortam için temiz oda yapılmıştı. Kültür odası değil de ventilasyonu, üretim koşulları, hepafiltreleri olan bir temiz oda. Başka, doğuda var mı bilmiyorum . Boğaziçi'nin de mesela moleküler biyolojisi kuvvetli. Oranın doku mühendisliği, medikal mühendisliği de çok iyi. Ordan da çıkması beklenebilir ama şu anda ilgilenen grup yok ya da bizim bildiğimiz yok. Ama mezenkimal kök hücre, embriyonik kök hücre, iPS çalışan bildiğim yok. Bundan sonra kliniğe uzak da olsa iPS'e başlamamız lazım. Dediğim gibi hastalıkları petride çalışmak için çok önemli iPS'ler.

mayıs 2012 129