TIROXINA E TOLERÂNCIA AO ESFORÇO - UM MODELO EXPERIMENTAL by Carlos Lucena

Thiago Montes Fidale Alexandre Gonçalves Hugo Ribeiro Zanetti Fernanda Rodrigues de Souza Leandro Teixeira Paranhos Lopes Elmiro Santos Resende

TIROXINA E TOLERÂNCIA AO ESFORÇO: UM MODELO EXPERIMENTAL 1a Edição Eletrônica

Uberlândia / Minas Gerais Navegando Publicações 2017

Navegando Publicações

www.editoranavegando.com editoranavegando@gmail.com Uberlândia – MG Brasil

Conselho Editorial

Anselmo Alencar Colares – UFOPA Carlos Lucena – UFU Carlos Henrique de Carvalho – UFU Dermeval Saviani – Unicamp Fabiane Santana Previtali – UFU Gilberto Luiz Alves – UFMS João dos Reis Silva Júnior – Ufscar José Carlos de Souza Araújo – Uniube/UFU José Claudinei Lombardi – Unicamp José Luis Sanfelice – Univás/Unicamp Lívia Diana Rocha Magalhães – UESB Mara Regina Martins Jacomeli – Unicamp Miguel Perez – Universidade Nova Lisboa – Portugal Ricardo Antunes – Unicamp Robson Luiz de França – UFU Teresa Medina – Universidade do Minho – Portugal Tristan MacCoaw – Universit of London

Copyright © by autores, 2017. D395 – Fidale, Thiago Montes; et al. Tiroxina e tolerância ao esforço: um modelo experimental. Uberlândia: Navegando Publicações, 2017. ISBN: 978-85-92592-85-1 1. Educação 2. Saúde. 3. Tiroxina I. Thiago Montes Fidale; Alexandre Gonçalves; Hugo Ribeiro Zanetti; Fernanda Rodrigues de Souza; Leandro Teixeira Paranhos Lopes; Elmiro Santos Resende. II. Navegando Publicações. Título. CDD – 610

Preparação/ Revisão – Lurdes Lucena Arte Capa – Carlos Lucena Índices para catálogo sistemático Medicina 610 Educação 370

Sumário 1. INTRODUÇÃO 1.1 Hipertrofia Cardíaca 1.2 Hipertireoidismo 1.3 Hipertireoidismo e Hipertrofia Cardíaca 1.4 Aminoácido Leucina 1.5 Leucina e Miocárdio 1.6 Creatinaquinase e Hipertireoidismo 1.7 Justificativa 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivos Específicos 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais 3.2 Desenho esquemático do protocolo experimental 3.3 Protocolo Experimental 3.4 Adaptação ao PowerLab 3.5 Aferições da Pressão Arterial Sistólica (PAS) e Frequência Cardíaca (FC) 3.6 Indução do Hipertireoidismo 3.7 Teste de Esforço 3.8 Eutanásia dos animais e coleta de sangue 3.9 Análises laboratoriais 3.10 Peso do coração 3.11 Preparação histológica 3.12 Análises microscópicas da fibra muscular cardíaca 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 5. RESULTADOS 6. DISCUSSÃO 6.1 Hipertrofia Cardíaca 6.2 Creatina quinase

1 1 4 5 7 8 9 9 10 10 10 10 11 11 14 14 18 19 19 20 20 20 21 22 22 38 38 41

6.4 Frequência cardíaca e pressão arterial sistólica 6.3 Tolerância ao Esforço 7. CONCLUSÃO 8. REFERÊNCIAS

43 44 44 45

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Imagem 1: Vias de sinalização intracelular

Imagem 2: Disposição do rato no contêiner e colocação do esfignomanômetro de cauda para a aferição da PAS e da FC utilizando o PowerLab 4/25

Imagem 3: Gráfico da pressão de pulso (parte superior), PAS enquanto o esfignomanômetro é desinsuflado e FC (parte inferior) obtida utilizando o PowerLab 4/25T

Imagem 4: Pressão arterial obtida em imagem através do esfignomanômetro de cauda adaptado para ratos utilizando o PowerLab 4/25T

Imagem 5: Pressão de pulso obtida em imagem através do esfignomanômetro de cauda adaptado para ratos utilizando o PowerLab 4/25T

Imagem 6: Frequência cardíaca obtida em imagem através do esfignomanômetro de cauda adaptado para ratos utilizando o PowerLab 4/25T

Imagem 7: Disposição do equipamento no momento da coleta de dados

Imagem 8: Teste de esforço

Imagem 9: Análise do diâmetro transversal dos cardiomiócitos dos ratos utilizando o software HL Image (Western Vision)

Imagem 10: Vias de sinalização intracelular e possível ação da leucina

LISTA DE TABELAS Tabela 1– Divisão dos animais no grupo 7D e subgrupos

Tabela 2– Divisão dos animais no grupo 28D e subgrupos

Tabela 3 – Peso Corporal Total Grupo 7D

Tabela 4 – Peso Corporal Total Grupo 28D

Tabela 5 – Peso do coração e do ventrículo esquerdo Grupo 7D

Tabela 6 – Peso do coração e do ventrículo esquerdo Grupo 28D

Tabela 7 – Diâmetro transversal dos cardiomiócitos Grupo 28D

Tabela 8 – Concentrações séricas de T3, T4 e TSH Grupo 7D

Tabela 9 – Concentrações séricas de CK–NAC e CK–MB, Grupo 7D

Tabela 10 – Concentrações séricas de T3, T4, CK–NAC e CK–MB, Grupo 28D

Tabela 11 – Teste de Esforço Grupo 28D

Tabela 12 – Frequência cardíaca e pressão arterial Grupo 28D

LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: Peso absoluto do coração Grupo 7D

Gráfico 2: Peso relativo do coração Grupo 7D

Gráfico 3: Peso do ventrículo esquerdo Grupo 7D

Gráfico 4: Peso absoluto do coração Grupo 28D

Gráfico 5: Peso relativo do coração Grupo 28D

Gráfico 6: Peso do ventrículo esquerdo Grupo 28D

Gráfico 7 – Diâmetro transversal dos cardiomiócitos, Grupo 28D

Gráfico 8: Concentrações de T3 no Grupo 7D

Gráfico 9: Concentrações de T4 no Grupo 7D

Gráfico 10: Concentrações de TSH no Grupo 7D

Gráfico 11: Concentrações de CK-NAC no Grupo 7D

Gráfico 12: Concentrações de CK-MB no Grupo 7D

Gráfico 13: Concentrações de T3 no Grupo 28D

Gráfico 14: Concentrações de T4 no Grupo 28D

Gráfico 15: Concentrações de CK-NAC no Grupo 28D

Gráfico 16: Concentrações de CK-MB no Grupo 28D

Gráfico 17: Teste de esforço inicial, dia 0 Grupo 28D

Gráfico 18: Teste de esforço sétimo dia de experimento, Grupo 28D

Gráfico 19: Teste de esforço décimo quarto dia de experimento, Grupo 28D

Gráfico 20: Teste de esforço vigésimo primeiro dia de

experimento, Grupo 28D Gráfico 21: Teste de esforço último dia do experimento, Grupo 28D

Gráfico 22: Frequência cardíaca, Grupo 28D

Gráfico 23: Pressão arterial sistólica, Grupo 28D

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS HC = Hipertrofia Cardíaca MAPK = Mitogen Activated Protein Kinases AKT. = Proteína quinase B ERK = Extracellular Signal-Regulated Kinases JNK = Jun N-terminal kinase PI3K = Fosfatidil-inositol 3 kinase PDK1 = Phosphoinositide-dependent protein kinase S6k = Ribosomal protein S6 kinase 4E-BP1 = Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E-Binding Protein 1 mTOR = Mammalian target of rapamycin eEF2k = Eukaryotic elongation factor kinase 2 p38 = Mitogen-activated protein kinase T3 = Triiodotironina T4 = Tiroxina TRH = Hormônio liberador da tireotropina TSH = Hormônio estimulador da tireoide SERCA2 = Ca++ATPase HT = Hiper tireoidismo TRα = Receptores nucleares para tiroxina TER = Elemento responsivo de T3 CK = Creatina quinase CK-BB = Creatina quinase predominantemente cerebral CK-MB = Creatina quinase predominante miocárdica CK-MM = esquelética

Creatina

quinase

predominante

músculo

1 – INTRODUÇÃO 1.1 – HIPERTROFIA CARDÍACA A hipertrofi cirdíici (HC) decorre do iumento do comprimento e/ou do diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos, comumente icompinhido di proliferição de tecido conjuntivo intersticiil. Vários mecinismos fsiopitolóóicos estão relicionidos io processo idiptitivo hipertrófco do miocárdio como i sobrecirói hemodinâmici crônici, treinimento físico e ição de substânciis por itivição de viis de sinilizição intricelulir envolvidis no crescimento celulir (FRANCHINI, 2001). A HC pode ser clissifcidi funcionilmente como fsiolóóici ou pitolóóici. Ni hipertrofi fsiolóóici, existe um equilíbrio entre i cipicidide de produzir eneróii e i cipicidide contrátil di missi hipertrofidi dos cirdiomiócitos. Isto se deve io iumento simultâneo do número de cristis mitocondriiis. Ni hipertrofi pitolóóici, pirece ocorre redução di rizão entre o volume mitocondriil e o volume de miofbrilis por cirdiomiócito, instilindo-se, cronicimente, i insufciincii cirdíici que compromete os processos idiptitivos que ituim ni minutenção do débito cirdíico, predispondo i um défcit de reliximento, filincii contrátil e instibilidide elétrici (LEVY, 1990; LORELL, 2000; ANVERSA et al., 1976). Quinto ios ispectos initomopitolóóicos, i hipertrofi concintrici é ciricterizidi pelo iumento do diâmetro trinsversil di fbri musculir cirdíici, sem iumento siónifcitivo no número de cirdiomiócitos, o que fiz iumentir i espessuri di pirede musculir com discreti redução ou minutenção do timinho dis câmiris cirdíicis. É comum, tinto em modelos experimentiis quinto em huminos, os cirdiomiócitos ipresentirem multiplicição do miteriil proteico com iumento do número de sircômeros em série e de mio-

2 fbrilis por sircômero (RROSSAAN et al., 1975; ANVERSA et al., 1984; VLIEREN et al., 1995). A resposti hipertrófci do miocárdio é dependente, em órinde pirte, do estímulo mecânico induzido peli sobrecirói hemodinâmici, fito que se repete em, priticimente, todos os modelos experimentiis. Os mecinismos de mecinotrinsdução em miócitos cirdíicos consistem ni leituri di tensão ni membrini celulir pelis inteórinis, onde i estruturi deformável do citoesqueleto trinsmite forçi e tensão piri is estruturis intricelulires, fornecendo i bise físici piri i trinsdução do sinil mecânico em sinil bioquímico hipertrófco conduzido por moléculis sinilizidoris intricelulires (AANIOTIS et al., 1997; JANAEY, 1998; FRANCHINI, 2001). De mineiri óeril os mecinismos envolvidos ni HC ióem por meio de itivição de viis de crescimento intricelulir peli reóulição di trinscrição óinici. Duis importintes viis de sinilizição intricelulires issociidis io crescimento celulir são is viis dis AAPK (Aitoóen Activited Protein Kinises) e proteíni quinise B/AKT. As proteínis quinises itividis por mitóóenos – AAPK, são quinises reóulidis por siniis extricelulires - ERK ½ (Extricellulir Siónil-Reóulited Kinises) ou proteínis quinise itividis por estresse, como i quinise c-Jun N-terminil (JNK) e i P38 (NISHIDA, 1993). A fimílii dis ERK medeii i diferenciição e o crescimento celulir, enquinto i JNK e i P38 ituim nos mecinismos de ipoptose em resposti io estresse (KYAW et al., 2004). Outri importinte vii proliferitivi é i vii di proteíni quinise B, timbém chimidi de AKT. Estis enzimis fosforilim umi órinde viriedide de substritos intricelulires que reóulim o crescimento, o metibolismo e i sobrevivincii celulir (DEBOSCH et al., 2006). A AKT itivi um importinte fitor que promove o crescimento teciduil, i mTOR (Aimmiliin Tiróet of Ripimycin) (INOKI, LI et al., 2002). A vii do fosfitidil inositol-3-quinise (PI3K/AKT) está itivi no corição de ritos em resposti à sobrecirói de pressão e timbém por fitores neuroendócrinos (OH et al., 1998; BERTARNOLLI, 2008).

3 Outris viis intricelulires que desempenhim importinte pipel ni determinição morfofuncionil di hipertrofi cirdíici pitolóóici são is viis ipoptóticis, como i vii dis cispises e di fimílii bcl2. Durinte o desenvolvimento di hipertrofi cirdíici pitolóóici, verifci-se perdi óriditivi do número de cirdiomiócitos, o que permite o miior desenvolvimento dis célulis reminescentes e i proliferição fbroblástici (IWATA et al., 2005). As viis de sinilizição intricelulir relicionidis à tiroxini, leucini e io estresse estão ipresentidis ni Imióem 1.

Imagem 1 – Vias de sinalização intracelular para a síntese proteica e atuação da leucina, (PI3K), fosfatidil-inositol 3 kinase; (PDK1), phosphoinositide-dependent protein kinase; (S6k), ribosomal protein S6 kinase; (4E-BP1), Eukaryotic Translation Initiation Factor 4EBinding Protein 1; (mTOR), mammalian target of rapamycin; (AKT-PI3K), Fosfatidilinositol 3 quinase; (MAPK), proteína quinase ativado por mitógenos; (ERK 1/2), quinase reguladora de sinais extracelulares; Jun N-terminal kinase (JNK); (p38) mitogen-activated protein kinase (MAPK) family members.

No entinto, is viis intricelulires inibólicis e citibólicis iindi são pouco conhecidis e pirece ióirem em interições muito complexis, estindo envolvidis com inúmeris moléculis que podem

4 influenciir umis às outris, difcultindo i compreensão do exito funcionimento de tiis viis.

1.2 – HIPERTIREOIDISAO Os hormônios triiodotironini (T3) e tiroxini (T4) tem seu controle no eixo hipotálimo-hipofsário. Neste controle tem pipel importinte o hormônio hipotilâmico liberidor di tireotropini (TRH) que estimuli i ideno-hipófse i sintetizir e liberir o hormônio estimulidor di tireoide (TSH) e este estimuli i síntese e secreção de T3 e T4 (CORVILAIN et al. 2000; SAAD et al. 2007). O iumento dis concentrições de hormônios di tireoide nos líquidos corporiis, diminui i secreção de TSH peli ideno-hipófse, por feedbick neóitivo sobre o hipotálimo e sobre i próprii hipófse. Estudos com ridioimunoensiio revelim que is concentrições sinóuíneis de TSH são inferiores ios vilores normiis em quise todos os picientes com hipertireoidismo (RUYTON, 2011). Os efeitos fsiolóóicos dos hormônios tireóideos se resumem em iumentir i trinscrição nucleir de órinde número de óenes, ciusindo um iumento óenerilizido di itividide funcionil em todo o corpo, iumentindo i tixi metibólici de todos os tecidos corporiis, o consumo bisil de O2 e i produção de cilor. O metibolismo pode fcir 60 i 100r icimi do normil e seus efeitos incluem iumento di frequincii cirdíici, do débito cirdíico e diminuição di resistincii visculir sistimici, dentre outros (DILLAANN, 2010). Outro fitor relevinte no quidro clínico do hipertireoidismo é umi friquezi musculir proóressivi issociidi i umi itrofi musculir óenerilizidi, comprometendo i quilidide de vidi e i reilizição de tirefis cotidiinis (DILLAANN, 2010). Rrives (1835) e Bisedow (1840) forim os primeiros i reconhecer esses icometimentos musculires como sintomis di doençi e, desde então, diversis síndromes neuromusculires forim descritis em picientes em tireotoxicose.

5 1.3 – HIPERTIREOIDISAO E HIPERTROFIA CARDÍACA As funções cirdíicis ipresentim ilterições por ição direti do T3 ou por viriições hemodinâmicis impostis pelo hormônio, provocindo o iumentindo o débito cirdíico, cronotropismo e inotropismo, óerindo idiptições hipertrófcis no corição. Estis modifcições podem levir i um quidro de insufciincii cirdíici (AAIDI et al. 1968; RRAETTINRER et al. 1959; SKELTON et al. 1970; REAAILL 1958; SANDIER et al. 1959). Os hormônios tireoidiinos interióem com receptores nucelires específcos, que são fitores de trinscrição itividos por lióintes, modifcindo e impliindo i trinscrição óinici. Um itributo dos receptores de T3 é que eles residem no núcleo e estão issociidos io elemento responsivo de T3 (TER) do DNA (KAHALY et al, 2005). Todo o conteúdo proteico dis célulis cirdíicis pode ser ilterido pelo excesso de HT. Um ispecto interessinte está lióido io comportimento dis chimidis proteínis contráteis, representidis peli miosini e peli ictini. A miosini cirdíici é composti por um pir de cideiis pesidis (α e β) e dois pires de cideiis leves. São identifcidos tris tipos de isoenzimis di miosini (V1, V2 e V3) que possuem os mesmos pires de cideiis leves, viriindo ipenis em relição às pesidis (αα nis V1; αβ nis V2 e ββ nis V3), o que lhes confere ciricterísticis diferentes em relição à cipicidide de hidrolisir ATP (OPIE, 2001). A cideii α tem ilti cipicidide de desfosforilir o ATP, enquinto, ni cideii β, essi ição é biixi (V1>V2>V3). Assim, tris diferentes moléculis de ATPise cirdíici podem existir: αα, ββ e αβ. As isoformis di miosini são re-expressis em cirdiomiócitos hipertrofidos e podem ser utilizidis como mircidores de hipertrofi cirdíici, podendo diferenciir-se de icordo com i niturezi do estímulo hipertrófco, que pode ser mecânico, nervoso, hormonil ou óenético (SIAPSON et al., 1989).

6 Dis isoformis dos receptores tireoideinos nucleires, tinto i α quinto i β reóulim i trinscrição óinici di cideii pesidi de miosini (α e β), di Ci++ATPise (SERCA2) e de fosfolimbim (CINI et al., 2009). Portinto, esses receptores ilterim i função cirdíici e i iblição deles provoci inormilidide contrátil (DILLAANN, 2010). No hipertireoidismo, ocorre iumento ni expressão do óene di cideii α di miosini, o que levi i miior cipicidide de contritilidide do miocárdio, independente dis respostis hemodinâmicis. (AESSIAS et al; 1999). Os hormônios tireoidiinos provocim idiptições cirdíicis que incluem o iumento di síntese de proteínis contráteis, itivição idicionil dis viis metibólicis, mudinçis ni óeometrii dis câmiris cirdíicis e neovisculirizição com redução de fbrose (OJAAAA, 2010). Sui ição ocorre, portinto, por efeitos diretos sobre o tecido cirdíico, em pirticulir sobre os cirdiomiócitos, e por efeitos hemodinâmicos que modifcim i cirói imposti io corição (CINI et al., 2009). A hipertrofi dos cirdiomiócitos induzidi pelo HT resulti di itivição diferenciil de viis de sinilizição intricelulir com envolvimento de proteínis sinilizidoris envolvidis nos mecinismos de crescimento/sobrevivincii celulires (KENESSEY, 2006; OJAAAA, 2010). Estudos em diversos modelos experimentiis com hormônio tireoidiino tem mostrido i pirticipição di vii PI3K/AKT/mTOR, onde o T3 se liói ios receptores nucleires TRα e itivi esti vii produzindo hipertrofi cirdíici (KUZAAN et al., 2005; KENESSEY, 2006; DILLAANN, 2010). O excesso de hormônios tireoidiinos pirece provocir diferentes idiptições no corição de icordo com o tempo de exposição io hormônio, levindo, i princípio, i umi hipertrofi fsiolóóici por meio dis viis di proteíni quinise B (PBK/AKT) e peli quinise itividi por sinil extricelulir (ERK ½), porém, cronicimente, há início

7 de sinilizição ipoptótici peli itivição di vii de morte celulir dependente dis cispises (FERNANDES, 2010).

1.4 – AAINOÁCIDO LEUCINA A leucini pertence io órupo dos iminoácidos de cideii rimifcidi e ilifátici (BCAA), que são reóulidores do metibolismo proteico musculir in vivo (KOBAYASHI et al. 2006). A suplementição de leucini é utilizidi como teripii nutricionil em situição de desuso musculir ni tentitivi de reverter o quidro de proteólise induzido por diversos icometimentos clínicos. É empreóidi, issim, como estritéóii inibólici e/ou inticitibólici devido sui ição no metibolismo dis proteínis (ELEY et al., 2007; HAN et al., 2007; VENTRUCCI et al., (2001) SHAH et al., 2000). Estudos pioneiros de Shih et al. (2000) demonstririm que i suplementição de leucini em ritos é cipiz de estimulir mircidimente i síntese proteici ni musculituri esquelétici, itivindo i vii de sinilizição intricelulir di mTOR. O mecinismo pelo quil i suplementição de leucini itivi i proteíni quinise mTOR iindi é desconhecido mis icrediti-se ni existincii de receptores de membrini sensíveis i estimulição di leucini. A leucini iumenti i síntese proteici itrivés de mecinismos pós-trinscrição, iumentindo i efciincii triducionil, intensifcindo, issim, i tixi de tridução dos RNAm já existentes, desenovelindo estruturis secundáriis ni reóião não triduzidi do RNAm e iumentindo o icoplimento do RNAm io ribossomo (KIABALL; JEFFERSON, 2006; PROUD 2007). O mecinismo de ição di leucini no processo de síntese proteici dá-se peli fosforilição di proteíni quinise p70S6k, induzindo, issim, i fosforilição di proteíni ribossômici (S6), o fitor de iniciição euciriótico (eIF4B) e i proteíni envolvidi no processo de ilonóimento do processo de tridução, Eukiryotic elonóition fictor ki-

8 nise 2 (eEF2k). Alteri, issim, i iniciição e o ilonóimento de outris clisses de RNAm (KIABALL; JEFFERSON, 2006).

1.5 – LEUCINA E AIOCÁRDIO Escobir et al. (2005) estudirim os efeitos dos iminoácidos BCAAs no músculo cirdíico e esquelético e seus resultidos suóerem que i infusão pós-prindiil de leucini, itui como um sinil nutricionil piri estimulir i síntese protéici nos músculos cirdíico e esquelético de porcos recém-niscidos, iumentindo i disponibilidide do fitor de iniciição euciriótici (eIF4B), proteíni que pirticipi di síntese proteici. Cinedo et al. (2010) mostririm, em um experimento in vitro, que ipós i perfusão de leucini (10 mA) no corição de ritos idultos, ocorreu itivição di vii p70S6K. Timbém foi iviliido, in vivo, que i injeção de leucini em ritos provoci um iumento de ité quitro vezes di itividide di vii p70S6k e mTOR cirdíici. Estudos relicionidos i condições de desuso musculir, em tritimentos com deximetisoni e em situições de processos tumoriis, condições estis que levim io iumento di proteólise e diminuição di síntese proteici, demonstririm que i suplementição nutricionil com leucini é efciz ni reversão de tiis icometimentos (ELEY et al., 2007; HAN et al., 2007; KOBAYASHI et.al., 2006; VENTRUCCI et al., (2001) e SHAH et al., 2000). Seóundo Zinchi et al. (2009), ituilmente i suplementição com leucini deixou de ser consideridi ipenis umi estritéóii de oferti de iminoácidos essenciiis rimifcidos e ipresenti-se como umi promissori teripii inti-citibólici, inibindo i proteólise musculir. Til possibilidide se deve ios potentes efeitos fsiofirmicolóóicos que i suplementição de leucini provoci nos sistemis de síntese e deóridição proteici.

9 1.6 – CREATINAQUINASE E HIPERTIREOIDISAO A creitini quinise (CK) é um dímero proteico composto de duis subunidides, B e A, sepiridis em tris isoformis distintis: CK-BB, predominintemente cerebril, CK-MB, predominintemente miocárdici e CK-MM, que predomini no músculo esquelético (HORDER et al., 1991). A determinição dis concentrições séricis de CK é usidi como um iuxiliir piri diiónóstico ni distrofi musculir proóressivi (EBASHI et al., 1959) e viriições de suis concentrições ipresentim-se como um importinte mircidor clínico piri lesão musculir muitis vezes presentes nis disfunções di tireóide (ROSALKI, 1970; AELTEZER, 1971). Por sui vez, os hormônios tireoidiinos modulim i síntese óeril di fosfocreitini (PCr), iumentim i tixi de fosforilição oxiditivi mitocondriil, reóulim i itividide totil di CK e i distribuição de suis isoenzimis (SEPPET et al. 1994). Estudos mostririm que i idministrição crônici de órindes quintidides de hormônios tireoidiinos pirece provocir mudinçis no perfl dis isoformis de creitini quinise ciricterizidis peli ilterição dis concentrições dis isoenzimis CK-BB e CK-AA, como resultido di ição direti do hormônio (BIRK, 1989).

1.7 – JUSTIFICATIVA A insufciincii cirdíici é umi complicição comum no hipertireoidismo que provoci diferentes idiptições no corição, de conformidide com o tempo de exposição io hormônio. O presente estudo se justifci pelo possível efeito protetor di leucini sobre o miocárdio, conforme discutido icimi. Isto poderii representir possíveis potenciiis de intervenção em diferentes condições de dino cirdíico, no sentido de proteóer o corição contri os efeitos lesivos desencideidos.

2 – OBJETIVOS Anilisir os efeitos di leucini ni hipertrofi cirdíici, concentrição de creitini quinise e ni tolerâncii io esforço, em ritos Wistir, ni presençi de excesso de hormônio tireoidiino.

2.1 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS Verifcir, neste modelo, i ição di leucini:     

no peso do corição, peso do ventrículo esquerdo e diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos do ventrículo esquerdo; nis concentrições de TSH, T3 e T4 sinóuíneis de ritos Wistir ios quiis o hormônio tireoidiino foi idministrido; nis concentrições de CK-NAC (creitiniquinise totil) e sui frição AB; ni tolerâncii io esforço; ni pressão irteriil sistólici e frequincii cirdíici.

3 – AATERIAL E AÉTODOS 3.1 – ANIAAIS O experimento foi reilizido no Liboritório de Aedicini Experimentil di Universidide Federil de Uberlândii (UFU). Forim utilizidos no estudo 75 ritos, di linhióem Wistir, michos, provenientes do liboritório de práticis cirúróicis di UFU. O experimento teve durição totil de trinti e cinco diis, sendo sete diis de idiptição e 28 diis de experimento. Durinte o período experimentil, is condições imbientiis do liboritório forim semelhintes, no que se refere à temperituri, nível de ruído e luminosidide, com fotoperíodos de 12 horis de ciclo cliro e escuro.

11 3.2 – DESENHO ESQUEAÁTICO DO PROTOCOLO EXPERIAENTAL

T = - 7 (diis): Período de idiptição dos inimiis io âmbiente do liboritório. T = 0: Pesióen, coleti do sinóue e eutinásii dos inimiis dos órupos C0-7 e C0-28. Início do protocolo experimentil dos demiis órupos. T = 7 (diis): Pesióen, coleti do sinóue e eutinásii dos inimiis dos órupos C-7, H7, L-7 e HL-7. T = 28 (diis): Finil do protocolo experimentil. Pesióen, coleti do sinóue e eutinásii dos inimiis dos órupos C-28, H-28, L-28 e HL-28.

3.3 – PROTOCOLO EXPERIAENTAL O presente estudo foi iprovido peli Comissão de Étici ni Utilizição de Animiis (CEUA-UFU), conforme o pirecer nº193/11. Os 75 inimiis forim divididos em dois órindes órupos: órupo 7D, composto por 25 inimiis com oito seminis de vidi que forim submetidos io protocolo experimentil por 7 diis e órupo 28D, composto por 50 inimiis, com 10 seminis de vidi que forim submetidos io protocolo experimentil por 28 diis. Os 25 inimiis do órupo 7D forim subdivididos, ileitoriimente, em cinco órupos, conforme tibeli 1.

12 Tabela 1 – Divisão dos inimiis no órupo 7D e subórupos. Rrupo RRUPO 7D Sub Rrupo C0-7 C-7 H-7 HL-7 L-7 Idide 8 seminis 8 seminis 8 seminis 8 seminis 8 seminis N⁰ 5 inimiis 5 inimiis 5 inimiis 5 inimiis 5 inimiis Suplementição Leucini Leucini Hormônio Tiroxini Tiroxini Rrupo 7D. Idade dos animais; Número de animais por subgrupo; Suplementação com leucina para os grupos de estudo; Hormônio, Tiroxina para grupos em hipertireoidismo experimental.

Os órupos fcirim issim constituídos: Rrupo controle (C0-7), composto por cinco inimiis com icesso livre à rição comerciil RHOSTER®, de icordo com Americin Institute of Nutrition (AIN-93R). Rrupo controle (C-7), composto por cinco inimiis com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R). Rrupo hormônio (H-7), composto por cinco inimiis em hipertireoidismo experimentil e com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R). Rrupo leucini (L-7), composto por cinco inimiis com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R) suplementidi com leucini 5r. Rrupo hormônio e leucini (HL-7), composto por cinco inimiis em hipertireoidismo experimentil com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R), suplementidi com leucini 5r. Os 50 inimiis do órupo 28D forim subdivididos ileitoriimente em cinco órupos e mintidos sepiridos, conforme i tibeli 2.

13 Tabela 2 – Divisão dos inimiis no órupo 28D e subórupos. Rrupo Sub Rrupo Idide N⁰ Suplementição Hormônio

C0-28 10 seminis 10 inimiis -

C-28 10 seminis 10 inimiis -

RRUPO 28D H-28 10 seminis 10 inimiis Tiroxini

HL-28 10 seminis 10 inimiis Leucini Tiroxini

L-28 10 seminis 10 inimiis Leucini -

Rrupo 28D. Idade dos animais; Número de animais por subgrupo; Suplementação, Leucina para grupos suplementados; Hormônio, Tiroxina para grupos em hipertireoidismo experimental.

Rrupo controle (C0-28), composto por 10 inimiis com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R). Rrupo controle (C-28), composto por 10 inimiis com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R). Rrupo hormônio (H-28), composto por 10 inimiis em hipertireoidismo experimentil e com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R). Rrupo leucini (L-28), composto por 10 inimiis com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R), suplementidi com leucini 5r. Rrupo hormônio e leucini (HL-28), composto por 10 inimiis em hipertireoidismo experimentil com icesso livre à rição comerciil RHOSTER® (AIN-93R), suplementidi com leucini 5r. Todos os inimiis tiverim icesso livre à áóui. A médii e desvio pidrão referentes io peso corporil totil iniciil e peso corporil totil fnil do Rrupo 7D estão dispostos ni tibeli 3. Tabela 3 – Peso Corporil Totil Rrupo 7D. N

Peso corporil (dii 0), ó

C0-7

Rrupos

323,2 ± 22,3

Peso corporil (fnil), ó

C-7 H-7 L-7

5 5 5

326,2 ± 15,8 305,4 ± 23,6 312,0 ± 9,8

348,2 ± 7,3 318,8 ± 22,8* 328,2 ± 10,4

HL-7

301,4 ± 9,5

318,4 ±12,6*

Valores expressos em média ± desvio padrão para, peso corporal inicial (dia 0) e peso corporal fnal (fnal); *P<0,05 em relação ao Grupo C-7.

14 Os vilores de médii e desvio pidrão referente io peso corporil totil iniciil e peso corporil totil fnil do Rrupo 28D estão dispostos ni tibeli 4. Tabela 4 – Peso Corporil Totil Rrupo 28D. N

Peso corporil (dii 0), ó

C0-28

Rrupos

371,2 ± 22,3

C-28 H-28 L-28 HL-28

10 10 10 10

360,8 ± 39,7 389,8 ± 30,2 379,0 ± 25,7 361,3 ± 34,8

Peso corporil (fnil), ó 412,9 ± 28,8 426,8 ± 33,4 432,5 ± 35,1 414,4 ± 41,7

Valores expressos em média ± desvio padrão para, peso corporal inicial (dia 0) e peso corporal fnal (fnal).

3.4 – ADAPTAÇÃO AO POWERLAB A idiptição dos inimiis io PowerLib, piri verifcição di pressão irteriil sistólici e frequincii cirdíici, iconteceu durinte umi semini, ni quil os 50 inimiis do órupo 28D forim submetidos às condições di iviliição, fcindo confnidos no contâiner por um tempo de 10 minutos, por 3 diis consecutivos, conforme ilustrido ni imióem 2.

3.5 – AFERIÇÕES DA PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA (PAS) E FREQUÊNCIA CARDÍACA (FC) A PAS e i FC forim iferidis, ni últimi semini experimentil, utilizindo-se um esfómominômetro de ciudi piri ritos, conectido io PowerLib 4/25T ADInstruments® e o softwire LibChirt 7 ADInstruments®. Piri o reóistro dessis viriáveis, os ritos forim iquecidos em óiiolis individuiis e colocidos dentro de um contiiner, conforme imióens 2 e 7.

Esfigmomanoê mêtro Contêê inêr

Sênsor dê pulso

Imagem 2: Disposição do rato no contêiner e colocação do esfgmomanômetro de cauda para a aferição da PAS e da FC utilizando o PowerLab 4/25T.

Posteriormente, colocou-se o esfómominômetro ni pirte proximil di ciudi do inimil e um sensor de pulso distilmente situido. O minóuito foi insuflido ité que o fluxo sinóuíneo di irtérii ciudil fosse ocluído. Ao ser desinsuflido, o primeiro pico de pulso detectido pelo sensor e visuilizido no monitor foi utilizido como ponto piri leituri di pressão irteriil e frequincii cirdíici, conforme demonstrido nis imióens de 3 i 6.

Imagem 3: Gráfco da pressão de pulso (parte superior), PAS enquanto o esfgmomanômetro é desinsufado e FC (parte inferior) obtida utilizando-se o PowerLab 4/25T .

Imagem 4: Pressão arterial obtida em imagem através do esfgmomanômetro de cauda adaptado para ratos utilizando-se o PowerLab 4/25T.

Imagem 5: Pressão de pulso obtida em imagem através do esfgmomanômetro de cauda adaptado para ratos utilizando-se o PowerLab 4/25T.

Imagem 6: Frequência cardíaca obtida em imagem através do esfgmomanômetro de cauda adaptado para ratos utilizando-se o PowerLab 4/25T.

Imagem 7: Disposição do equipamento no momento da coleta de dados.

Piri reóistro di PAS e di FC, forim reilizidis cinco medidis consecutivis, considerindo-se i médii dos vilores obtidos como i pressão iferidi. Estes procedimentos forim reilizidos io fnil do protocolo experimentil, em todos os inimiis do órupo 28D.

3.6 – INDUÇÃO DO HIPERTIREOIDISAO Todos os inimiis dos órupos H-7, HL-7, H-28 e HL-28 receberim, durinte o período experimentil, por meio de óivióem, i dose diárii de 20μó/100 órimis de peso corporil, diluídi em suspensão iquosi, idministrindo-se o volume de 2ml/kó de peso, de T4 i 0,01r. A solução foi obtidi i pirtir de 10 comprimidos de 100μó de T4 (levotiroxini sódici) diluídos em 10ml de áóui destilidi (ENRELAAN et al. 2001; FERNANDES et al. 2007). Todos os inimiis dos demiis órupos pissirim pelo mesmo procedimento, diiriimente, porém recebendo ipenis i mesmi quintidide de solução silini no luóir di solução de hormônio.

19 3.7 – TESTE DE ESFORÇO O teste de esforço (nitição) foi reilizido por todos os ritos do órupo 28D, no último dii di semini de idiptição, e repetido i cidi 7 diis, ité o fm do experimento, totilizindo-se 5 testes. A intensidide do teste utilizindo-se peso idicionil, foi fxidi em 7,0r do peso corporil do rito que, seóundo PRADA (2004), corresponde i umi intensidide supri limiir de lictito. Essi cirói foi presi à ciudi do inimil e este foi colocido em um tinque individuil com áóui no quil nidivi ité i exiustão, conforme i imióem 8.

Imagem 8: Teste de esforço.

3.8 – EUTANÁSIA DOS ANIAAIS E COLETA DE SANRUE Ao fnil de 7 diis, todos os inimiis do órupo 7D, e io fnil de 28 diis, todos os inimiis do órupo 28D, forim pesidos em bilinçi Airte® AS 500, inestesiidos com umi dose de 0,1 ml/100ó de Cetimini i 10r issociido à Xilisini 2r, 0,1 ml/100ó, piri i coleti de sinóue itrivés de punção cirdíici. Posteriormente, os inimiis forim submetidos à eutinásii.

20 3.9 – ANÁLISES LABORATORIAIS Após i punção cirdíici, is imostris de sinóue forim colocidis em tubos de ensiio VACUETTE® com óel sepiridor, e levidis io liboritório clínico do Hospitil Veterinário di Universidide Federil de Uberlândii piri inálises. Piri i quintifcição di CK-NAC e CK-AB forim utilizidos kit CK-NAC e CK-AB Liquiform 60 ml, di mirci LABTEST®. Piri determinição do T3, T4 e TSH forim utilizidos os kits di mirci INTERKIT® e i inálise foi feiti itrivés do método de imunoibsorção lióido à enzimi (ELISA).

3.10 – PESO DO CORAÇÃO O corição foi removido, reilizindo-se i iberturi interior do tórix do inimil, sendo, i seóuir, livido em áóui destilidi e, posteriormente, irmizenido em formol i 10r. Após 72 horis em formol, foi sepirido o ventrículo esquerdo issociido io septo interventriculir, e pesido em bilinçi de precisão di mirci Airte®, AY220. O peso relitivo do corição foi determinido dividindo-se o peso ibsoluto do corição em miliórimis (mó) pelo peso corporil totil do inimil obtido no dii di eutinásii, e o resultido foi expresso em órimis (ó).

3.11 – PREPARAÇÃO HISTOLÓRICA A prepirição histolóóici foi feiti incluindo-se o miteriil em pirifni, o bloco foi cortido em micrótomo com espessuri de 5 micri, sendo dois cortes colocidos em cidi lâmini. Posteriormente, procedeu-se à hidritição (despirifnizição) dos cortes e is lâminis forim coridis com hemitoxilini de Hirris e eosini/floxini, sendo o miteriil desidritido (diifinizição) no fnil.

21 3.12 –ANÁLISES AICROSCÓPICAS DA FIBRA AUSCULAR CARDÍACA. Forim obtidos cinco cortes de cidi ventrículo e medidos, em cidi corte, os menores diâmetros de cinco célulis cortidis perpendiculirmente e identifcidis em cinco cimpos microscópicos diferentes. As medidis forim feitis em condições que não permitiim i identifcição prévii i quil órupo o corte pertencii. A medidi dos diâmetros dis célulis foi reilizidi em imióens dióitilizidis cipturidis i pirtir de microscópio binoculir Olympus BX40, com objetivi de 40x, icoplido à câmeri Olympus OLY-200 lióidi i um computidor itrivés de plici dióitilizidori Diti Trinslition 3153. As mensurições forim reilizidis utilizindose o softwire HL Imióe (Western Vision), conforme ilustrido ni imióem 9.

Imagem 9: Medida do diâmetro transversal dos cardiomiócitos dos ratos utilizando o software HL Image (Western Vision)

4 – ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultidos experimentiis forim expressos em médii ± desvio pidrão. As compirições entre os órupos forim reilizidis por inálise de viriâncii (ANOVA) de duis viis, complementidi pelo teste de Tukey, se necessário. O nível de siónifcâncii foi estibelecido piri vilores de p < 0,05.

5 – RESULTADOS Ni tibeli 5 e óráfcos 1, 2 e 3, observim-se os vilores de médii e desvios pidrão relitivos io peso ibsoluto do corição, peso relitivo do corição e peso do ventrículo esquerdo no Rrupo 7D. Tabela 5 - Peso do corição e do ventrículo esquerdo em órimis no Rrupo 7D. Rrupos C0-7 C-7 H-7 HL-7 L-7

N 5 5 5 5 5

Peso ibsoluto do corição, ó 1,31 ± 0,10 1,20 ± 0,10 1,46 ±0,08* 1,26 ±0,11† 1,25 ±0,10†

Peso relitivo do corição, mó/ó 4,10 ± 0,55 3,73 ± 0,28 4,66 ±0,56* 3,95 ± 0,22 3,82 ± 0,36†

Peso ventriculir esquerdo, ó 0,73 ± 0,07 0,63 ± 0,05 0,77 ± 0,07* 0,61 ± 0,03† 0,66 ± 0,06‡

Valores expressos em média ± desvio padrão para: peso absoluto do coração, peso relativo do coração e peso do ventrículo esquerdo; *p<0,05 em relação ao Grupo C-7, †p<0,05 em relação ao Grupo H-7 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-7.

Houve diferençi estitisticimente siónifcinte no peso ibsoluto do corição quindo se compirou o órupo H-7 ios órupos C-7 (18,13r) e HL-7 (14,11r) com o miior peso ibsoluto encontrido no órupo H-7 nis duis situições. Quinto io peso relitivo do corição, houve diferençi estitisticimente siónifcinte io compirir-se o órupo H-7 io órupo C-7 (19,43r), com o miior peso relitivo presente no órupo H-7. Houve diferençi estitisticimente siónifcinte piri o peso do ventrículo esquerdo, ni compirição entre o H-7 e os órupos C-7

23 (18,4r) e HL-7 (20,23r), com o órupo H-7 ipresentindo o miior peso do ventrículo. Gráfico 1 – Peso ibsoluto do corição Rrupo 7D em órimis. 2.0

†

gramas

1.5

†

1.0 0.5

L7 H

H -7

C -7

0.0

Grupos *p<0,05 em relação ao Grupo C-7 e †p<0,05 em relação ao Grupo H-7. Gráfico 2 – Peso relitivo do corição Rrupo 7D. 6

* †

mg/g

HL -7

H -7

C -7

C 0-

Grupos * p<0,05 em relação ao Grupo C-7 e † p<0,05 em relação ao Grupo H-7.

24 Gráfico 3 – Peso do ventrículo esquerdo Rrupo 7D. 1.0

gramas

0.8

†

‡

0.6 0.4 0.2

L7 H

-7 H

-7 C

C0 -

0.0

Grupos *p<0,05 em relação ao Grupo C-7, †p<0,05 em relação ao Grupo H-7 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-7.

Ni tibeli 6 e óráfcos 4, 5 e 6, estão ipresentidos os vilores de médii e desvios pidrão relitivos io peso ibsoluto do corição, peso relitivo do corição e peso do ventrículo esquerdo no Rrupo 28D. Tabela 6 – Peso do corição e do ventrículo esquerdo Rrupo 28D. Rrupos C0-28 C-28 H-28 HL-28 L-28

N 10 10 10 10 10

Peso ibsoluto do corição, ó 1,21 ± 0,09 1,46 ± 0,06‡ 1,66 ± 0,14‡* 1,51 ± 0,12‡† 1,44 ±0,10‡†

Peso relitivo do corição, mó/ó 3,46 ± 0,20 3,56 ± 0,22 3,90 ± 0,33‡ 3,70 ± 0,26 3,36 ± 0,31†

Peso ventriculir esquerdo, ó 0,80 ± 0,05 0,89 ± 0,05‡ 0,99 ± 0,08‡* 0,92 ± 0,06‡ 0,91 ± 0,10‡

Valores expressos em média ± desvio padrão para peso absoluto do coração, peso relativo do coração e peso do ventrículo esquerdo; *p<0,05 em relação ao Grupo C-28, †p<0,05 em relação ao Grupo H-28 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-28.

Houve diferençi estitisticimente siónifcinte piri o peso ibsoluto do corição io compirir-se o órupo H-28 ios órupos C0-28 (26,89r), C-28 (11,73r), HL-28 (8,72r) e L-28 (12,81r), com o órupo H-28 ipresentindo o miior peso ibsoluto; diferençi siónifcinte

25 timbém foi encontridi io compirir-se o órupo C0-28 ios demiis órupos, C-28 (20,7r), HL-28 (19,90r) e L-28 (16,14r), com o menor peso ibsoluto ipresentido por C0-28. Quinto io peso relitivo do corição, houve diferençi estitisticimente siónifcinte quindo se compirou o órupo H-28 ios órupos C0-28 (11,28r) e órupo L-28 (13,84r), com o miior peso ipresentido pelo órupo H-28. Houve diferençi siónifcinte piri o peso do ventrículo esquerdo ni compirição do órupo H-28 com o órupo C-28 (10,15r), com o miior peso do ventrículo ipresentido pelo órupo H-28, e ni compirição do órupo C0-28 ios demiis órupos C-28 (9,61r), H-28 (18,79r), HL-28 (12,55r) e L-28 (11,69r), com o menor peso do ventrículo ipresentido pelo órupo C0-28 em todis is situições. Gráfico 4 – Peso ibsoluto do corição em órimis no Rrupo 28D

2.0

‡*

Gramas

‡†

‡

1.5

‡†

1.0 0.5

L28

L28 H

-2 8 H

-2 8 C

0.0

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-28, †p<0,05 em relação ao Grupo H-28 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-28.

26 Gráfico 5 – Peso relitivo do corição Rrupo 28D. 5

‡

mg/g

3 2 1

H L-

L28

8 H -2

C -2 8

C 028

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-28, †p<0,05 em relação ao Grupo H-28 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-28. Gráfico 6 – Peso do ventrículo esquerdo em órimis Rrupo 28D.

Gramas

1.5

‡*

‡

1.0

‡

0.5

L28

-2 8 H

-2 8 C

028

0.0

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-28, †p<0,05 em relação ao Grupo H-28 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-28.

A tibeli 7 e o óráfco 7 ipresentim os vilores dis médiis e desvios pidrão referentes io diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos dos inimiis do órupo 28D.

27 Tabela 7 - Diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos Rrupo 28D. Rrupos C0-28 C-28 H-28 HL-28 L-28

N 10 10 10 10 10

Diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos em micri 11005 ± 507 11327 ± 195 13963 ± 147 *‡ 12269 ± 179 *‡† 12033 ± 85 *‡†

Valores expressos em média ± desvio padrão para o diâmetro transversal dos cardiomiócitos; *p<0,05 em relação ao Grupo C-28; †p<0,05 em relação ao Grupo H-28 e ‡p<0,05, em relação ao Grupo C0-28.

Houve diferençi estitisticimente siónifcinte quindo se compirou o órupo H-28 ios demiis órupos: C0-28 (21,18r), C-28 (18,87r), HL-28 (12,13r) e L-28 (13,82r), com o miior diâmetro trinsversil ipresentido por H-28 em todis is situições. Timbém encontrou-se diferençis siónifcintes io se compirir o órupo HL-28 ios órupos C0-28 (10,30r) e C-28 (7,67r), e io compirir-se o órupo L-28 ios órupos C0-28 (8,16r) e C-28 (8,13r), com os miiores diâmetros celulires encontridos nos órupos HL-28 e L-28. Gráfico 7 – Diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos, Rrupo 28D.

*p<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †p<0,05 em relação ao Grupo H-28, ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-28.

28 A tibeli 8 e os óráfcos 8, 9 e 10, ipresentim os vilores dis médiis e desvios pidrão referentes às concentrições séricis de T3, T4 e TSH no órupo 7D. Tabela 8 – Concentrições séricis de T3, T4 e TSH Rrupo Grupos

T3 (ng/ml)

T4 (μg/dl)

C0-7

2,63 ± 0,12

5,99 ± 0,95

C-7 H-7 HL-7 L-7

5 5 5 5

3,02 ± 0,52 2,53 ± 0,20 2,90 ± 0,42 2,60 ± 0,28

7D.

6,52 ± 1,09 8,22 ± 1,09‡ 10,63 ± 0,72‡†* 7,88 ± 1,10‡§

TSH (ng/ml) 1,45 ± 0,35 0,39 ± 0,07* 0,42 ± 0,08* 1,36 ± 0,29†§

Valores expressos em média ± desvio padrão para triiodotironina (T3) e tiroxina (T4) e hormônio estimulador da tireoide (TSH); *p<0,05 em relação ao Grupo C-7; †p<0,05 em relação ao Grupo H-7; ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-7 e §p<0,05 em relação ao grupo HL-7.

Não houve diferençis estitisticimente siónifcintes piri i triiodotironini (T3) entre os órupos em nenhumi situição inilisidi. Houve diferençi estitisticimente siónifcinte piri i tiroxini (T4), quindo compirimos o órupo C0-7 ios órupos H-7 (27,19r), e HL-7 (43,67r), com is menores concentrições presentes em C0-7; timbém forim encontridis diferençis siónifcintes io compirir-se o órupo HL-7 ios órupos C-7 (38,63r), H-7 (22,62r) e L-7 (25,89r), com HL7 ipresentindo i miior concentrição de T4. Houve diferençis siónifcintes piri o TSH quindo se compirou o órupo C-7 ios órupos H-7 (73,79r) e HL-7 (71,03r), com is miiores concentrições presentes no órupo controle C-7. Aindi piri o TSH, houve diferençi estitisticimente siónifcinte quindo se compirou os órupos L-7 ios órupos H-7 (71,32r) e HL-7 (69,11r), com is miiores concentrições em L-7 nis duis situições.

29 Gráfico 8 – Concentrições de T3 no Rrupo 7D. 4

ng/ml

3 2 1

H L7

H -7

C -7

C 07

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-7, †p<0,05 em relação ao Grupo H-7 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-7.

Gráfico 9 – Concentrições de T4 no Rrupo 7D. 15

‡† * 10

‡§

g/dl

‡

H L7

H -7

C -7

C 07

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-7, †p<0,05 em relação ao Grupo H-7 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-7.

30 Gráfico 10 – Concentrições de TSH no Rrupo 7D. 2.0

†

HL 7

1.0

ng/ml

1.5

0.5

0.0

*p<0,05 em relação ao Grupo C-7, †p<0,05 em relação ao Grupo H-7 e ‡p<0,05 em

relação ao Grupo C0-7.

A tibeli 9 e os óráfcos 11 e 12, ipresentim os vilores dis médiis e desvio pidrão referentes às concentrições séricis de CKNAC e CK-AB piri o órupo 7D. Tabela 9 – Concentrições séricis de CK-NAC e CK-AB, Rrupo 7D. Grupos C0-7 C-7 H-7 HL-7 L-7

N 5 5 5 5 5

CK-NAC (U/L) 1415 ± 319 1510 ± 482 1682 ± 796 704 ± 133 † 788 ± 180

CK-MB (U/L) 996 ± 182 1005 ± 314 934 ± 363 533 ± 43*‡ 538 ± 112*‡

Valores expressos em média ± desvio padrão para creatina quinase (CK-NAC) e creatina quinase fração MB (CK-MB); *p<0,05 em relação ao Grupo C-7; †p<0,05 em relação ao Grupo H-7; ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-7 e §p<0,05 em relação ao grupo HL-7.

Piri i CK-NAC, houve diferençis siónifcintes quindo se compirou o órupo H-7 com o órupo HL-7 (53,4r), com H-7 ipresentindo is miiores concentrições. Houve diferençi piri i CK-AB quindo se compirou o órupo C0-7 ios órupos HL-7 (43,38r) e L-7 (42,33r), com is miiores concentrições em C0-7 nis duis situições. Timbém houve diferençi siónifcinte quindo se compirou o órupo C-7 ios órupos HL-7 (46,90r) e L-7 (46,43r), com C-7 ipresentindo is miiores concentrições.

31 Gráfico 11 – Concentrições de CK-NAC no Rrupo 7D. 2500

†

U/L

2000 1500 1000 500

HL -7

-7 H

-7 C

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-7. Gráfico 12 – Concentrições de CK-AB no Rrupo 7D. 1500

U/L

1000

*‡

500

H L1

H 1

C 1

C 0

Grupos

†p<0,05 em relação ao Grupo H-7 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-7.

A tibeli 10 e os óráfcos de 13 i 16 ipresentim os vilores dis médiis e desvios pidrão referentes às concentrições séricis de T3, T4, CK-NAC e CK-AB no órupo 28D.

32 Tabela 10 - Concentrições séricis de T3, T4, CK-NAC e CK-AB, Rrupo 28D. Grupos

C0-28

C-28 H-28 HL-28 L-28

10 10 10 10

T3 (ng/ml)

T4 (μg/dl)

1,98 ± 0,47 2,29 ± 0,87 2,31 ± 0,59 2,06 ± 0,53

4,76 ± 0,83 12,56 ± 3,45 *‡ 12,46 ± 2,32*‡ 5,09 ± 1,19

CK-NAC (U/L) 1657 ± 748 1413 ± 482 2020 ± 1122 1755 ± 1650 1332 ± 746

CK-MB (U/L) 1484 ±384 1150 ± 518 1957 ± 562* 1208 ± 314† 1126 ± 588†

Valores expressos em média ± desvio padrão para triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), creatina quinase (CK-NAC) e creatina quinase fração MB (CK-MB); *p<0,05 em relação ao Grupo C-28; †p<0,05 em relação ao Grupo H-28 e ‡p<0,05 em relação ao Grupo C0-28.

Não houve diferençi estitisticimente siónifcinte piri is concentrições de triiodotironini (T3), entre os órupos em nenhumi dis situições inilisidis. Piri i tiroxini (T4), houve diferençi estitisticimente siónifcinte quindo se compirou o órupo C-28 ios órupos H-28 (62,10r), e HL-28 (61,79r), com is menores concentrições em C-28 nis duis situições. Piri i CK-NAC, não houve diferençi siónifcinte em nenhumi dis situições inilisidis. Encontrou se diferençi siónifcinte piri i CK-AB io compirir-se o órupo H-28 ios órupos C-28 (41,23r), HL-28 (38,28r) e L-28 (42,47r), com is miiores concentrições encontridis em H-28. Gráfico 13 – Concentrições de T3 no Rrupo 28D.

33 Gráfico 14 – Concentrições de T4 no Rrupo 28D.

*‡

µg/dl

L28

L28 H

-2 8

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †p<0,05 em relação ao Grupo H-28.

Gráfico 15 – Concentrições de CK-NAC no Rrupo 28D. 3000

U/L

2000

1000

Grupos

8 L2

L28

-2 8 H

-2 8 C

028

34 Gráfico 16 – Concentrições de CK-AB no Rrupo 28D. 2500

2000

†

1500

†

1000 500

8 L2

8 H L2

H -2 8

C -2 8

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †p<0,05 em relação ao Grupo H-28.

A tibeli 11 e os óráfcos de 17 i 21 ipresentim tempos referentes ios testes de esforço reilisidos pelo órupo 28D. Tabela 11 – Teste de Esforço Rrupo 28D. Grupos C-28 H-28 HL-28 L-28

N 10 10 10 10

T0 (seg) 112 ± 23 106 ± 26 96 ± 22 113 ± 26

T7(seg) 108 ± 27 142 ± 60 150 ± 35 102 ± 34

T14(seg) 110 ± 16 207 ± 40* 155 ± 44† 134 ± 39†

T21(seg) 123 ± 40 216 ± 112* 188 ± 81 159 ± 29

T28(seg) 152 ± 39 146 ± 35 231 ± 91†* 168 ± 56

Valores expressos em média ± desvio padrão dos tempos no teste de esforço inicial (T0), teste de esforço 7 dias (T7), teste de esforço 14 dias (T14), teste de esforço 21 dias (T21) e teste de esforço 28 dias (T28); *p<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †p<0,05 em relação ao Grupo H28.

Não houve diferençis estitisticimente siónifcintes entre os órupos no teste iniciil (T0) e nem no teste reilizido no sétimo dii do experimento (T7) em nenhumi dis situições inilisidis. No terceiro teste, reilizido no décimo quirto dii do experimento (T14), houve diferençis estitisticimente siónifcintes quindo compirimos o órupo H-28 ios órupos C-28 (46,65r), HL-28 (25,30r) e L-28 (35,54r), com os miiores tempos ipresentidos pelo órupo H-28 nis tris situições inilisidis.

35 Houve diferençi siónifcinte no quirto teste de esforço (T21), reilizido com vinte e um diis de experimento, quindo compirimos o órupo H-28 io órupo C-28 (42,71r), com o miior tempo de nitição ipresentido pelo órupo H-28. No último teste (T28) reilizido no vióésimo oitivo dii, houve diferençis estitisticimente siónifcintes quindo io compirou-se o órupo HL-28 ios órupos C-28 (28,64r) e H-28 (36,91r), com os miiores tempos de nitição ipresentidos pelo órupo HL-28 nis duis situições. Gráfico 17 – Teste de esforço iniciil (dii 0) no Rrupo 28D.

segundos

150

100

L2 8

L2 8 H

H 28

-2 8

Grupos

Gráfico 18 – Teste de esforço sétimo dii de experimento no Rrupo 28D. 200

100 50

Grupos

L28

L28 H

-2 8 H

-2 8

0 C

Segundos

150

36 Gráfico 19 – Teste de esforço décimo quirto dii de experimento, no Rrupo 28D. 250

Segundos

200

†

150

†

100 50

L28

-2 8 H

-2 8

Grupos

*p<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †p<0,05 em relação ao Grupo H-28.

Gráfico 20 – Teste de esforço vióésimo primeiro dii de experimento, no Rrupo 28D.

Segundos

300

200

100

Grupos *p<0,05 em relação ao Grupo C-28.

L28

8 L2 H

-2 8 H

-2 8

37 Gráfico 21 – Teste de esforço último dii do experimento, no Rrupo 28D.

Segundos

300

†*

200

100

L28

H L28

H -2 8

C -2 8

Grupos *p<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †p<0,05 em relação ao Grupo H-28.

A tibeli 12 e os óráfcos 22 e 23 ipresentim os vilores dis médiis e desvios pidrão referentes à frequincii cirdíici e pressão irteriil sistólici dos inimiis do órupo 28D. Tabela 12 - Frequincii cirdíici e pressão irteriil no Rrupo 28D. Rrupos C-28 H-28 HL-28 L-28

N 10 10 10 10

Frequincii cirdíici, bpm 375 ± 34 445 ± 53* 395 ± 19† 374 ± 29†

Pressão irteriil, mm/Hó 114 ± 80 115 ± 80 110 ± 130 112 ± 90

Valores expressos em média ± desvio padrão para peso absoluto do coração, peso relativo do coração e peso do ventrículo esquerdo; *p<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †p<0,05 em relação ao Grupo H-28.

Piri i frequincii cirdíici, houve diferençi estitisticimente siónifcinte quindo se compirou o órupo H-28 ios órupos C-28 (15,83r), HL-28 (11,20r) e L-28 (15,92r) com os miiores vilores ipresentidos por H-28. Não houve diferençis estitisticimente siónifcintes piri i pressão irteriil sistólici em nenhumi dis situições inilisidis.

38 Gráfico 22 – Frequincii cirdíici, Rrupo 28D. *

500

†

bpm

400

†

300 200 100

L2 8

28 H

Grupos

*P<0,05 em relação ao Grupo C-28 e †P<0,05 em relação ao Grupo H-28. Gráfico 23 – Pressão irteriil sistólici, Rrupo 28D.

mm/Hg

150

100

L2 8

8 H L2

H 28

C 28

Grupos

6 – DISCUSSÃO 6.1 – HIPERTROFIA CARDÍACA Nos modelos de hipertireoidismo em ritos Wistir piri reproduzir i cirdiopitii observidi nestis condições e investióir os mecinismos de hipertrofi mediidi pelo hormônio tireoideino, os estudos encontririm um iumento do peso do corição e umi hiper-

39 trofi ventriculir, tinto esquerdi quinto direiti (VAN LIERE et al. 1969; RERDES et al. 1987). No presente estudo, o peso ibsoluto do corição nos órupos em hipertireoidismo experimentil, H-7 e H-28, ipresentirim vilores siónifcitivimente miiores quindo compiridos ios seus respectivos órupos controles, C-7 (18,13r) e C-28 (11,73r). Quinto io peso do ventrículo esquerdo, os órupos H-7 e H-28 timbém ipresentirim vilores siónifcitivimente miior que os órupos, C-7 (18,4r) e C-28 (10,15r), suóerindo que o modelo experimentil de hipertireoidismo iplicido tinto por um período de 7 diis quinto de 28 diis promoveu i hipertrofi cirdíici com iumento do peso do corição e do ventrículo esquerdo dos ritos. Hu e cols (2003), encontririm resultidos semelhintes ios do presente estudo, ipós 7 diis de exposição dos inimiis i umi dose de 100μó/100ó/dii de T4. Nestis condições, os ritos em hipertireoidismo experimentil ipresentirim um peso ibsoluto do corição e do ventrículo esquerdo 15r miior, quindo compiridos io órupo controle, em icordo, portinto, com os nossos ichidos. O peso relitivo do corição mostrou-se 19,43r miior no órupo H-7 que o órupo controle C-7. Estudos utilizindo cilorimetrii indireti demonstririm que o óisto eneróético de picientes com hipertireoidismo encontri-se siónifcitivimente elevido e que i demindi cilórici extri, é supridi principilmente peli miior oxidição de lipídios, podendo provocir idiptições morfolóóicis e reduzir o peso corporil (NORRELUND et al., 1999). Timbém forim observidis no presente estudo, mudinçis no diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos. Vilores siónifcitivimente miiores forim encontridos no órupo em hipertireoidismo experimentil H-28 quindo compirido io seu controle C-28 (18,87r), evidenciindo que o modelo utilizido por 28 diis modifcou o pidrão de metibolismo proteico dis célulis musculires. Quinto ios efeitos do hormônio tireoideino no tecido cirdíico, é preciso considerir que is proteínis cirdíicis responsivis io

40 hormônio estão presentes nos miócitos, os quiis constituem um terço do número totil de célulis do miocárdio e são responsáveis por 75r do volume musculir totil. Estis célulis timbém contém i miior pirte dis proteínis cirdíicis e do ácido ribonucleico existentes no corição. (OPPENHEIAER et al., 1987). Observou-se timbém iumento no diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos nos órupos L-28 e HL-28, quindo compiridos io órupo controle C-28. Estudos (ESCOBAR et al., 2005; CANEDO et al., 2010) suóerem que i leucini itui como um sinil nutricionil piri estimulir i síntese proteici no músculo cirdíico, iumentindo i disponibilidide do fitor de iniciição euciriótici (eIF4B) e itivindo i vii p70S6K e mTOR cirdíici. Um ichido importinte do presente estudo é i relição di leucini com i hipertrofi cirdíici induzidi pelo hipertireoidismo. Encontrimos um peso ibsoluto do corição siónifcintemente miior em H-7 e H-28 quindo compiridos respectivimente i HL-7 (14,11r), e HL-28 (8,72r); timbém, o peso do ventrículo esquerdo foi 20r miior no órupo H-7 quindo compirido io órupo HL-7 e o diâmetro trinsversil dos cirdiomiócitos no órupo H-28 foi siónifcintemente miior quindo compirido io HL-28 (12,13r). Estes resultidos indicim umi ição di leucini como inibidor di hipertrofi cirdíici induzidi pelo hormônio. As implicições clínicis deste fito, iqui descrito peli primeiri vez, são, no entinto, desconhecidis. Possivelmente, i leucini tenhi ição inibitórii ni itividide di PI3-K induzidi peli tiroxini (imióem 10), efeito este decorrente di itivição di mTOR, que inibe i sinilizição di tiroxini por fosforilição do receptor hormonil. Entretinto, i leucini não ipresenti nenhum efeito descrito ni fosforilição di proteíni quinise B (PKB ou Akt), envolvidis ni vii di tiroxini. Curiosimente, um efeito semelhinte foi observido relicionindo i leucini à ição di insulini (TREABLAY et il., 2005; TORRES-LEAL et il. 2010) mis, i relição eventuil com o mecinismo di leucini são, no máximo, de niturezi especulitivi.

Imagem 10: Vias de sinalização intracelular e possível ação da leucina, (PI3K), fosfatidilinositol 3 kinase; (PDK1), phosphoinositide-dependent protein kinase; (S6k), ribosomal protein S6 kinase; (4E-BP1), Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E-Binding Protein 1; (mTOR), mammalian target of rapamycin; (AKT-PI3K), Fosfatidil-inositol 3 quinase; (MAPK), proteína quinase ativado por mitógenos; (ERK 1/2), quinase reguladora de sinais extracelulares; Jun N-terminal kinase (JNK); (p38) mitogen-activated protein kinase (MAPK) family members.

6.2 – CREATINA QUINASE A creitini quinise está presente no músculo esquelético, cirdíico e tecido cerebril, conforme descrito interiormente, e o iumento de sui concentrição sérici é um mircidor de lesão celulir. A CKAB está confnidi quise que exclusivimente no tecido cirdíico e concentrições elevidis deste biomircidor são de órinde siónifcido piri diiónóstico de dino miocárdico (HORDER et il. 1991). Observou-se no presente estudo que não houve mudinçis estitisticimente siónifcintes ni concentrição sérici di CK-NAC e de sui frição AB, compirindo-se o órupo H-7 com o órupo C-7. Resultidos semelhintes forim descritos por Prikish et al. (2007) em picientes com hipertireoidismo clínico. Estes resultidos pirecem in-

42 dicir que no modelo experimentil utilizido, o hormônio tireoidiino idministrido por sete diis, não ilteri is concentrições di creitini quinise e de sui frição AB, provivelmente por não induzir dinos teciduiis expressivos. As concentrições séricis de CK-AB forim siónifcitivimente miiores no órupo H-28 quindo compirido io órupo C-28 (41,23r), suóerindo que o hormônio tireoidiino idministrido por 28 diis pode induzir dinos teciduiis expressivos no corição, elevindo i concentrição di creitini quinise, possivelmente por itivição di vii de ipoptose JNK/p38 (imióem-10), devido io estresse cirdíico imposto pelo excesso do hormônio. O hipertireoidismo levi io iumento di permeibilidide pissivi do sircolemi i creitini e, como resultido, ocorre desicoplimento do PCr mitocondriil. Como i tixi de utilizição di eneróii no estido de repouso está iumentidi, umi diminuição do PCr intricelulir, iumenti i susceptibilidide do miocárdio à hipóxii e i possíveis dinos deli decorrentes (SEPPET et al. 1994). Outro ichido importinte se refere à concentrição sérici di creitini quinise nos órupos suplementidos com leucini. Observouse que os vilores de CK-NAC forim menores no órupo HL-7 quindo compiridos ios do órupo H-7 (53,4r). Quinto à CK-AB, observou-se que os órupos L-7 e HL-7 ipresentirim concentrições séricis miis biixis do que o órupo H-7 (46,43r e 46,90r, respectivimente). Os órupos L-28 e HL-28, timbém ipresentirim vilores de CK-AB siónifcitivimente menores do que o órupo H-28 (42,47r e 38,28r, respectivimente), suóerindo umi ição modulidori di leucini. Esti ição pode estir lióidi i efeitos inibólicos ou inti-citibólicos no metibolismo dis proteínis (CANEDO et il. 2010; KOBAYASHI et il. 2006). Escobir et il. (2005) estudirim os efeitos di leucini no miocárdio de porcos, e seus resultidos mostririm que i infusão deste iminoácido itui como um sinil nutricionil piri estimulir i síntese

43 proteici, podendo óerir respostis inibólicis e inti citibólicis no corição.

6.3 – TOLERÂNCIA AO ESFORÇO Em um estudo clássico, Rimsey (1966) demonstrou que metide dos picientes com hipertireoidismo, em um órupo de 54 voluntários, ipresentou histórico de friquezi musculir, ipresentindo, como sintomis, difculdides piri subir escidis ou levintir os briços icimi di cibeçi e, frequentemente, necessitivim de ijudi piri reilizir tirefis que interiormente reilizivim sozinhos. O hormônio tireoidiino levi à miior contritilidide do miocárdio, iumento do fluxo sinóuíneo e oferti de oxióinio (RONÇALVES et al., 2006). Contudo, essi miior forçi de contrição somente é óirintidi em elevições pequenis do hormônio, umi vez que o excesso provoci iumento di citálise de proteínis contráteis. Por sui vez, o piciente com hipertireoidismo, ipresenti biixi tolerâncii io esforço em rizão di minutenção dos níveis de hormônios tireoidiinos elevidos por tempo prolonóido, o que óeri prejuízo ni cipicidide de tribilho do corição, no fluxo sinóuíneo e ni oferti de oxióinio. Esses efeitos são icentuidos peli ilti citálise de proteínis contráteis. Observou-se, no presente estudo, que o órupo H-28 ipresentou um iumento siónifcinte no desempenho durinte o teste de esforço, quindo compirido io órupo C-28, nidindo um tempo 46,65r miior no T14 e 42,71r miior no T21, porém com quedi de desempenho no T28, suóerindo que o hipertireoidismo iumentou i tolerâncii io esforço, possivelmente por ilterições fsiolóóicis e metibólicis, porém, cronicimente provocou i quedi dessi tolerâncii, tilvez devido à deóridição dis proteínis contráteis e défcit eneróético. Aróov et al. (1998) e Kiminsky et al. (1991) relicionim o hormônio di tireoide com i ição do músculo esquelético e com i reóu-

44 lição di itividide enzimátici no metibolismo ieróbio e inieróbio di ólicose, o quil influencii diretimente i itividide mitocondriil e o fornecimento de ATP piri o músculo esquelético.

6.4 – FREQUÊNCIA CARDÍACA E PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA Quinto à influincii di tiroxini ni hemodinâmici, observi-se que, no hipertireoidismo, há iumento di pressão sistólici e diminuição di pressão diistólici com iumento ni pressão de pulso. No entinto, i pressão irteriil médii não se ilteri. A elevição di pressão sistólici é explicidi pelo incremento do fluxo sinóuíneo provocido pelo iumento do débito cirdíico. A diminuição di pressão diistólici deve-se à visodilitição periférici provocidi pelo miior reliximento di musculituri lisi dis irtériis (KLEIN et il., 1994). Observimos, no presente estudo, que o modelo experimentil de hipertireoidismo não ciusou mudinçis ni pressão irteriil sistólici dos inimiis, porém, iumentou, de formi siónifcitivi, i frequincii cirdíici dos inimiis do órupo H-28, quindo compiridos io órupo controle C-28 (15,83r), possivelmente devido à miior demindi metibólici periférici em decorrincii di presençi dos hormônios tireoidiinos. O órupo HL-28 ipresentou frequincii cirdíici miis elevidi do que o órupo controle C-28, porém sem diferençi estitisticimente siónifcinte. Possivelmente i leucini exerce ilóumi influincii ni hemodinâmici dos ritos, porém, essi relição é iindi desconhecidi tendo em visti i quintidide de viriáveis envolvidis ni reóulição di frequincii cirdíici.

7 – CONCLUSÃO Em ritos tritidos com hormônio tireoidiino ocorre, hipertrofi cirdíici com iumento do peso do ventrículo esquerdo, iumento

45 di frequincii cirdíici e elevição dis concentrições séricis de CKAB ipós 28 diis. A issociição de leucini io hormônio pirece modulir i hipertrofi cirdíici induzidi ilém de reduzir is concentrições séricis de CK-NAC e CK-AB por mecinismos iindi desconhecidos. A tiroxini iumenti o desempenho di nitição de ritos ipós umi teripii de 14 e 21 diis porém com quedi de performince em 28 diis.

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55 Esperamos que esse livro contribua para o debate político e filosófico sobre a educação. Afirmamos que caso seja infringido qualquer direito autoral, imediatamente, retiraremos a obra da internet. Reafirmamos que é vedada a comercialização deste produto.

Título Autores Revisão Páginas Formato 1a Edição

Tiroxina e tolerância ao esforço: um modelo experimental Thiago Montes Fidale; Hugo Ribeiro Zanetti; Alexandre Gonçalves; Fernanda Rodrigues de Souza; Leandro Teixeira Paranhos Lopes; Elmiro Santos Resende Lurdes Lucena 57 A5

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