วารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ปีที่ 24, ฉบับที่ 2 (2559): พฤษภาคม - สิงหาคม 2559 by Naresuan University Journal

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

บทความวิจยั Indirect effects of calcium and phosphate ions releasing from Polycaprolactone – Biphasic Calcium Phosphate scaffolds on osteoblastic activities ธรรมารักษ์ ลัน่ เต้ง, ณัฐวุฒิ เทือกสุบรรณ และนฤภร มนต์มธุรพจน์...........................................................................1 Evaluation of pluripotency gene in Thai human dental pulp stem cells ญาดา อนันตวัฒน์, คัดเค้า วงษ์สวรรค์, หทัยทิพย์ ศรีธนอุดมชัย, เข็มทอง มิตรกูล, ทวีพงศ์ อารยะพิศิษฐ และเพชรรัตน์ ไกรวพันธุ.์ ...................................................................................................................................13 Integron Analysis of Multidrug-Resistant Diarrheagenic E. coli Isolates from Travelers in Thailand สุภาพร รักษาสิริ, ลดาภรณ์ โพธิทตั , อรลักษณ์ เสรีฉนั ทฤกษ์, คาร์ล เจ เมสัน และชาญ์วทิ ย์ ตรีพุทธรัตน์.........................24 Influence of Polyvinylpyrrolidone K30 on The Complexation of Tetrahydrocurcumin with Hydroxypropyl β-Cyclodextrin ศรีกญ ั ญา ทองใหญ่, นัฏฐา แก้วนพรัตน์ และศรัณยู สงเคราะห์.................................................................................34 Improvement of Symmetrical Gait Index in People with Chronic Stroke ชัชวลัย สนธิกุล, สุนีย์ บวรสุนทรชัย, จารุกลู ตรีไตรลักษณะ และทิพย์วดี บรรพระจันทร์................................................43 การจํ าลองมอนติคาร์โลสําหรับคํานวณปริมาณรังสีของอุปกรณ์กาํ หนดพื้ นทีข่ นาดมาตรฐานของอิเล็กตรอนพลังงาน 9 เมกะอิเล็กตรอนโวลต์ คณิต พงษ์พิริยะเดชะ, จีระภา ตันนานนท์, กิตติพล เดชะวรกุล, จีรศักดิ์ คําฟองเครือ และนันทวัฒน์ อู่ดี......................52 การลดสิง่ แปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จากอุปกรณ์สอดใส่แร่ชนิด แสตนเลสสตีลของหุ่นจํ าลอง อุง้ เชิงกรานในงานรังสีรกั ษาระยะใกล้ วิมลมาศ ทองงาม, ฐิติพงศ์ แก้วเหล็ก และนันทวัฒน์ อู่ดี.........................................................................................61 วิธีการแก้ค่าโปรไฟล์หนึง่ มิติของปริมาณรังสีจากภาพพอร์ทลั ในพื้ นที่ลาํ รังสีแบบสมมาตรสําหรับรังสีโฟตอน 6 เมกะโวลต์ นิพนธ์ สายโย แสงอุทิศ ทองสวัสดิ์ และภัสสุรีย์ ชีพสุมนต์........................................................................................72 ความสัมพันธ์ในแบบประเมินฟลักเมเยอร์–แอสเซสเมนท์, ดัชนีบาร์เทล, และสโตรกอิมแพค สเกล-16ในผูป้ ่ วย โรคหลอดเลือดสมองชนิดเรื้ อรังที่อาศัยอยู่ในชุมชน วาริสา ทรัพย์ประดิษฐ, วิมลวรรณ เหียงแก้ว และชุติมา ชลายนเดชะ..........................................................................80 ผลของสารเฮสเพอริดินต่อการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสและการเปลีย่ นแปลงโครงสร้างของลําไส้เล็กในหนู เบาหวาน พิจิตรา อ๊ อดเอก, อิ ทธิพล พวงเพชร, วันทณี หาญช้าง และสะการะ ตันโสภณ.............................................................88 BRCA1 and BRCA2 Large Genomic Rearrangements Screening in Thai Familial Breast Cancer Patients by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) สุณิชญา จาดศรี, ถกล เจริญศิ ริสุทธิกุล, บุษบา ฤกษ์อํานวยโชค, ดลนิภทั ร เดชสุพงศ์, อัจฉรา ธัญธีรธรรม และสุรคั เมธ มหาศิ ริมงคล................................................................................................................................100 Correlation of gyrA/B mutations with level of susceptibility to fluoroquinolone of Mycobacterium tuberculosis isolates ณัฐพร นาคเกิด, ศิ ริพร โอทอง, รัทตาภา จีนหลี, พบชัย งามสกุลรุ่งโรจน์, พิริยาภรณ์ จงตระกูล และศุภร ฟุ้ งลัดดา..........................................................................................................................................106 Preparation and physical properties of chitosan scaffolds coated collagen from the skin of shark for bone tissue engineering กนกวรรณ ศรีขาํ , จิรฐั มีเสน และสุทธาทิพย์ กมลมาตยากุล...................................................................................114 การศึกษายีน mating type และความสัมพันธ์กบั การสร้าง biofilm ของเชื้ อ Aspergillus fumigatus จากสิง่ ส่งตรวจ จากโรงพยาบาลศิริราชและโรงพยาบาลสงขลานครินทร์ อิ มรัน สะมะแอ, มิ่งขวัญ ยิ่งขจร และณัฏฐนันท์ ปิ่ นชัย...........................................................................................123 Analytical solution of a 3D model for the airflow in a human oral cavity ฉัตรวารินทร์ ตาสว่าง และสุพชั ระ คงนวน...........................................................................................................132

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

บทความวิจยั Effects of Sintering Behavior on Structure and Properties of B 2 O 3 doped (Bi 0.5 Na 0.5 ) 0.94 Ba 0.06 TiO 3 Lead-Free Ceramics ศุภลักษณ์ มะโนธรรม, ภาราตรี ใจตา, ทวี ตันฆศิ ริ และกอบวุฒิ รุจิจนากุล...............................................................142 อิทธิพลของอุณหภูมิที่อบต่อสมบัติทางเทอร์โมอิเล็กทริกของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์แบบบิดงอได้เตรียมโดย วิธีอาร์เอฟแมกนีตรอนสปั ตเตอริง กมลมาศ สิงคเสลิต, อาภาภรณ์ สกุลการะเวก และราชศักดิ์ ศักดานุภาพ...................................................................148 ระบบ Human Machine Interface (HMI) สําหรับคํานวณประสิทธิภาพหม้อไอนํ้าโดยใช้ Visual C# และ OPC Server จิตพร เหล่าอิ่ มจันทร์ และวุฒิชยั อัศวินชัยโชติ.....................................................................................................156 การประเมินผลกระทบของแรงดันตกชัว่ ขณะโดยใช้หลักการระบุตําแหน่งความผิดพร่องในระบบจํ าหน่ายด้วยเส้นโค้ง ITIC ฤทธิพฒ ั น์ โพธิ์ศรี และสมพร สิริสาํ ราญนุกุล.......................................................................................................167 ความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างจุลภาคและสมบัติทางกลของเหล็กกล้า Fe-Cr-Mo ทีผ่ ่านการซิ นเตอริง่ วณานุรตั น์ ศรีจาํ พันธุ,์ เรืองเดช ธงศรี, ธัญพร ยอดแก้ว, นาตยา ต่อแสงธรรม, มนภาส มรกฎจินดา, รุ่งทิพย์ กระต่ายทอง และอัมพร เวียงมูล.........................................................................................................................................175 การออกแบบตัวควบคุมพีไอดี+ฟัซซีสําหรับการหลบหลีกสิง่ กีดขวางของหุ่นยนต์เคลื่อนที่ภายในอาคาร ไกรศักดิ์ โพธิ์ทองคํา และมนูศักดิ์ จานทอง..........................................................................................................183 คุณสมบัติทางเคมีและชีวภาพของสารสกัด lignin และประสิทธิภาพทางพลังงานของกากอ้อยทีเ่ หลือหลังจาก การสกัดแยก lignin ด้วยกรดและด่าง ชุติมา บุญเรืองรอด, ศิ ริลกั ษณ์ เลี้ยงประยูร และสุมลั ลิกา โมรากุล..........................................................................195 การศึกษาฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระและการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดสของสารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ดชนิดต่างๆ และการประยุกต์ใช้ในกุง้ ขาว (Litopenaeus vannamei) เพือ่ ยับยั้งการเกิดเมลาโนซิ ส ประภัสสร แสนธิ, จีรวรรณ มณีโรจน์ และเปรมวดี เทพวงศ์....................................................................................207

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Research Articles Indirect effects of calcium and phosphate ions releasing from Polycaprolactone – Biphasic Calcium Phosphate scaffolds on osteoblastic activities Thunmaruk Luntheng, Nuttawut Thuaksuban and Naruporn Monmaturapoj..............................................................1 Evaluation of pluripotency gene in Thai human dental pulp stem cells Yada Anantawat, Kadkao Vongsavan, Hathaitip Sritanaudomchai, Kemthong Mitrakul, Taweepong Arayapisit and Petcharat Kraivaphan.................................................................................................................................13 Integron Analysis of Multidrug-Resistant Diarrheagenic E. coli Isolates from Travelers in Thailand Supaporn Ruksasiri, Ladaporn Bodhidatta, Oralak Serichantalergs, Carl J. Mason and Chanwit Tribuddharat.............24 Influence of Polyvinylpyrrolidone K30 on The Complexation of Tetrahydrocurcumin with Hydroxypropyl β-Cyclodextrin Srikanya Thongyai, Nattha Kaewnopparat and Sarunyoo Songkro.........................................................................34 Improvement of Symmetrical Gait Index in People with Chronic Stroke Chatwalai Sonthikul, Sunee Bovonsunthonchai, Jarugool Tretriluxana and Tipwadee Bunprajan...............................43 Monte carlo simulation for dose calculation of standard applicator of 9 MeV electron beam Khanit Phongphiriyadecha, Chirapha Tannanon, Kittipol Dechaworakul, Chirasak Khamfongkhruea and Nuntawat Udee..........................................................................................................................................52 Metal Artifact Reduction on CT Pelvis Phantom Images from Stainless Steel Applicators in Brachytherapy Wimonmart Tong-Ngarm, Titipong Kaewlek and Nuntawat Udee.........................................................................61 1D Beam Profile Correction Method of Portal Image Dosimetry in Symmetric Square Field for 6 MV Photon Beams Nipon Saiyo, Sangutid Thongsawat and Patsuree Cheebsumon............................................................................72 Association of Fugl-Meyer Assessment, Barthel index, and Stroke Impact Scale-16 in individuals with chronic stroke living in community Warisa Suppradist, Vimonwan Hiengkaew and Chutima Jalayondeja.....................................................................80 Inhibitory Effect of Hesperidin on α−Glucosidase Activity and Small Intestinal Morphology in Diabetic Rats Phichittra Od-ek, Ittipon Phoungpetchara, Wantanee Hanchang and Sakara Tunsophon...........................................88 BRCA1 and BRCA2 Large Genomic Rearrangements Screening in Thai Familial Breast Cancer Patients by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) Sunichya Jadsri, Takol Chareonsirisuthigul, Budsaba Rerkamnuaychoke, Donniphat Dejsuphong, Atchara Tunteeratum and Surakameth Mahasirimongkol.....................................................................................100 Correlation of gyrA/B mutations with level of susceptibility to fluoroquinolone of Mycobacterium tuberculosis isolates Nuttaporn Nakkerd, Siriporn O-thong, Rattapha Chinli, Popchai Ngamskulrungroj, Piriyaporn Chongtrakool and Suporn Foongladda..................................................................................................................................106 Preparation and physical properties of chitosan scaffolds coated collagen from the skin of shark for bone tissue engineering Kanokwan Srikhum, Jirut Meesane and Suttatip Kamolmatyakul........................................................................114 Study on mating type and association with pathogenesis of Aspergillus fumigatus from clinical isolates collected at Siriraj hospital and Songklanagarind hospital Imran Sama-ae, Mingkwan Yingkajorn and Nadthanan Pinchai..........................................................................123 Analytical solution of a 3D model for the airflow in a human oral cavity Chatvarin Tasawang and Supachara Kongnuan..................................................................................................132

ISSN 0858 â&#x20AC;&#x201C; 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Research Articles Effects of Sintering Behavior on Structure and Properties of B 2 O 3 doped (Bi 0.5 Na 0.5 ) 0.94 Ba 0.06 TiO 3 Lead-Free Ceramics Supalak Manotham, Pharatree Jaita, Tawee Tunkasiri and Gobwute Rujijanajul....................................................142 Effect of Annealing Temperature on Thermoelectric Properties of Flexible Bi 2 Te 3 Thin Film Prepared by RF Magnetron Sputtering Kamolmad Singkaselit, Aparporn Sakulkalavek and Rachsak Sakdanuphab..........................................................148 Human Machine Interface (HMI) for Boiler Efficiency Calculation using Visual C# and OPC Server Chittaporn Hlaoimchan and Wudhichai Assawinchaichote..................................................................................156 Evaluation of Voltage Sag Impact by Method of Fault Position in Distribution System with ITIC curve Rittipad Posree and Somporn Sirisumrannukul.................................................................................................167 Relationship between Microstructure and Mechanical Property of Sintered Fe-Cr-Mo Steels Wananurat Srijampan, Ruangdaj Tongsri, Thanyaporn Yotkaew, Nattaya Torsangthum, Monnapas Morakotjinda, Rungtip Krataitong and Amporn Wiengmoon...................................................................................................175 PID+Fuzzy Controller Design for Obstacle Avoidance of Indoor Mobile Robot Kraisak Phothongkum and Manusak Janthong...................................................................................................183 Chemical and Biological Characteristics of Lignin and Energy Efficiency of Acid and Alkali Delignified Bagasse Chutima Boonruangrod, Siriluck Liengprayoon and Sumallika Morakul..............................................................195 A study of the antioxidant activities and polyphenoloxidase inhibitory effects of several commercial mushroom trimming extracts and its application on inhibiting melanosis in white shrimp (Litopenaeus vannamei) Praphatsorn Santhi, Jirawan Maneerote and Pramvadee Tepwong........................................................................207

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

บทบรรณาธิการ วารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ISSN 0858-7418 ฉบับนี้เป็ น ปี ที่ 24 ฉบับที่ 2 เน้ นเนื้อหาด้ านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี เผยแพร่ ผลงานวิจัยและบทความปริทัศน์ด้านการเกษตร วิศวกรรม วิทยาศาสตร์ เทคโนโลยีสารสนเทศ โลจิสติกส์และโซ่ อุปทาน พลังงาน สิ่งแวดล้ อม สถาปั ตยกรรม ศิลปะและการ ออกแบบ การแพทย์ เภสัชกรรม เครื่องสําอางและผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ การพยาบาล สาธารณสุขศาสตร์ การแพทย์ แผนไทยประยุกต์ สหเวชศาสตร์ ทันตกรรม วิทยาศาสตร์การแพทย์ หรืออื่นๆ ที่เกี่ยวข้ อง วารสารนี้ได้ รับการรับรอง มาตรฐานโดยศูนย์ดัชนีการอ้ างอิงวารสารไทย (Thai-Journal Citation Index: TCI) กลุ่มที่ 1 (ผลการรับรองตั้งแต่ 1 มกราคม 2558 – 31 ธันวาคม 2562) ในฉบับนี้ประกอบด้ วย บทความวิจัยดีเด่น จากงานประชุมวิชาการเสนอ ผลงานวิจัยระดับบัณฑิตศึกษาแห่ งชาติ ครั้งที่ 38 “บัณฑิตศึกษากับการพัฒนาสู่โลกาภิวัฒน์” ที่จัดโดย บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยนเรศวร ร่วมกับคณะผู้บริหารบัณฑิตศึกษามหาวิทยาลัยของรัฐและมหาวิทยาลัยในกํากับของรัฐ (ทคบร.) และสํา นั ก งานคณะกรรมการการอุ ด มศึ ก ษา (สกอ.) กระทรวงศึ ก ษาธิก าร ประกอบด้ ว ย บทความวิ จั ย สาขา วิทยาศาสตร์สขุ ภาพ จํานวน 14 เรื่อง และวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี จํานวน 9 เรื่อง ผู้สนใจบทความใดของวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี สามารถดาวน์โหลดบน เว็บไซต์ของวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวรที่ www.journal.nu.ac.th ภายใต้ ระบบ ThaiJo ของศูนย์ดัชนีการอ้ างอิง วารสารไทย ปัจจุบนั รับบทความเพื่อเข้ ากระบวนการพิจารณาลงตีพิมพ์ในระบบ Online Submission เท่านั้น สามารถ ส่งบทความได้ ท่ี www.journal.nu.ac.th โดยลงทะเบียนผู้ใช้ แล้ วใช้ Username และ Password ดังกล่าว ตามขั้นตอน การส่งบทความง่ายๆ หากมีปัญหาในกระบวนการสามารถติดต่อสอบถามได้ ท่ี 0-5596-8835

รองศาสตราจารย์ ดร.ศักดิ์ชัย วิทยาอารีย์กุล บรรณาธิการ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Indirect effects of calcium and phosphate ions releasing from Polycaprolactone – Biphasic Calcium Phosphate scaffolds on osteoblastic activities Thunmaruk Lunthenga*, Nuttawut Thuaksubana and Naruporn Monmaturapojb

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Faculty of Dentistry, Prince of Songkla University, Hatyai, Songkhla, Thailand, 90112 b National Metal and Materials Technology Center, Thailand Science Park, Pathumthani, Thailand, 12120 * Corresponding author. E-mail address: thunmaruk@hotmail.com Abstract Objective: To evaluate indirect effects of calcium and phosphate ions releasing from the Polycaprolactone (PCL) – Biphasic Calcium Phosphate (BCP) scaffolds fabricated by modified Melt Stretching and Multilayer Deposition (mMSMD) technique on proliferation and differentiation of osteoblasts. Materials and Methods: The scaffolds were prepared as group A; PCL-20%BCP and group B; PCL-30%BCP (%wt). Amount of calcium and phosphate ions releasing from the scaffolds of both groups which immersed in culture medium (αMEM) were assessed over 30 days. The effects of those ions on proliferation and differentiation of the osteoblasts cell lines (MC3T3-E1) were assessed using ELISA after culturing the cells in the medium with the immersed scaffolds over 21 days. The medium without scaffolds was used as the control group for all experiments. Results: The release of calcium and phosphate ions from both groups remarkably increased on day 7 (p<0.05) and then stable since day 14. No difference of their releasing profiles between the groups was detected (p>0.05). The accumulative increase of those ions in both groups corresponded to their profiles of the cell proliferation and the levels of osteocalcin (OCN), but, the relationship was not found with the profiles of alkaline phosphatase (ALP). The ALP activity of group A increased with time and it was significantly higher than those of group B and the control group on day 21 (p<0.05). In addition, the OCN levels of group A were higher than those of the other groups over the observation period. Conclusion: PCL-BCP mMSMD scaffolds can sustain the releases of calcium and phosphate ions over the period of bone formation which are essential for supporting proliferation and differentiation of the osteoblasts. Those ions released from the PCL-20%BCP scaffolds would support the early and late phase of osteoblastic differentiation better than the PCL-30%BCP scaffolds, whereas, their effects on the cell proliferation are not different. Keywords: Scaffold, Biphasic calcium phosphate, Hydroxyapatite, Tricalcium phosphate, calcium and phosphate ions

Introduction For several decades, autogenous bone grafting for reconstructing large bone defects in maxillofacial region is still considered to be the gold standard, nevertheless, its requiring donor site operations sometimes increase patient morbidities. Therefore, several researchers play attention to develop synthetic biodegradable scaffolds used as bone substitutes instead of the autogenous bone aiming for reconstructing intra-oral bone defects. Ideally, the

scaffolds should act as temporary matrices for extracellular matrix deposition until the new bone is totally restored. The rate of degradation should be commensurate with bone regeneration whilst mechanical strength of the scaffolds should be maintained during this period. In addition, their structures should consist of appropriate pore size and interconnecting pore systems for transporting nutrition and bone cell in-growth throughout the scaffolds (Salgado, Coutinho, & Reis, 2004). For those purposes, our research team developed the novel

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

technique of Melt Stretching and Multilayer Deposition (MSMD) specifically for fabricating the biodegradable polymer-based scaffolds (Thuaksuban, Nuntanaranont, Pattanachot, Suttapreyasri, & Cheung, 2011; Thuaksuban et al., 2013). The MSMD scaffolds are designed to be an appropriate interconnecting pore system for enhancing osteogenesis. A microgroove pattern, typically found on their surfaces has proved to support attachment of osteoblasts (Thuaksuban et al., 2011). In addition, the mechanical properties of the scaffolds are suitable for withstanding forces occurring in real circumstances of the reconstruction in the oral and maxillofacial region (Thuaksuban et al., 2013). Recently, to make that fabricating process more practical, the steps of MSMD were simplified and so was renamed “modified MSMD (mMSMD)”. A three-dimensional (3-D) scaffold can be fabricated only by compressing a single filament into a glass mold and immersing in warm water. The mMSMD technique is easier to process which allowing any surgeons to instantly build up the 3-D scaffolds on chair side of the surgical operations. Therefore, time spending for the processing is remarkably reduced. In addition, fabricating the scaffold within the glass mold is a close environment that can prevent contamination during the processing. The concept of melt-blending of two materials which are Poly εcaprolactone (PCL) as a major component and Biphasic Calcium Phosphate (BCP) as a filler is used for fabricating the composite scaffold. PCL has been approved by the Food and Drug Administration (FDA) as a medical and drug delivery device, with extensive support both in vitro and in vivo studies (Engelberg & Kohn, 1991; Lei, Rai, Ho, & Teoh, 2007; Rai, Teoh, & Ho, 2005; Schantz et al., 2003; Tay et al., 2007). It is degraded by a hydrolytic mechanism under physiological conditions and produces a less acidic environment when

compared to other polyesters. However, PCL normally takes more than 24 months for complete degrading, which is not commensurate with the bone remodeling process (Lam, Hutmacher, Schantz, Woodruff, & Teoh, 2009). BCP is a combination of a stable phase of hydroxyapatite (HA) and a soluble phase of beta-tricalcium phosphate (β-TCP) in different concentrations that offering controlled bioactivities and balanced biodegradation (Dorozhkin, 2010). Although the various composition ratios of these two materials have been studied extensively, the optimum ratio of BCP for clinical applications is still obscure. Most of the previous studies fabricated BCP using the ratios of HA higher than β-TCP which are mainly for improving mechanical stability of the materials, however, some studies demonstrated better results of those with the higher ratios of TCP (Arinzeh, Tran, Mcalary, & Daculsi, 2005; Ebrahimi, Pripatnanont, Suttapreyasri, & Monmaturapoj, 2014; Lomelino Rde et al., 2012; Nery, LeGeros, Lynch, & Lee, 1992). Arinzeh et al (Arinzeh et al., 2005) performed an in vivo study to determine the optimum ratio of HA and TCP for supporting human mesenchymal stem cells (hMSC) and inducing bone formation. Six types of ceramic including 100% HA, 100% TCP and BCP with the ratios of HA/TCP at 76/24, 63/37, 56/44, and 20/80 were seeded with hMSC and implanted subcutaneously into the backs of severely immunodeficient genetically disordered mice. The authors found that the BCP 20/80 had the better results when compared with the other proportions with the higher ratios of HA. Lomelino, et al (Lomelino Rde et al., 2012) evaluated the suitability of BCP granules (β-TCP/HA = 70:30) as potential carriers for cell-guided bone therapy. Calvarial bone defects (5 mm in diameter) of Wistar rats were filled with autogenous bone graft, the BCP granules combined with human bone cells and the BCP

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

granules alone. After 45 days, the new bone formation of the defects filled with the combination of the BCP granules and the cells were similar to those filled with the autogenous bone. Although the amounts of new bone formation in the group BCP granules alone were less than those of the other groups, but no significant difference was detected. Recently, in cooperation with The National Metal and Materials Technology Center of Thailand (MTEC), BCP particles were prepared as bone substitutes in different compositions of HA/ β-TCP including 30/70, 40/60 and 50/50 (Ebrahimi et al., 2014). Proliferation and differentiation of mouse osteoblast cells (MC3T3-E1) responding to those particles was assessed in vitro over 19 days. The results indicated that the cells which were seeded on the BCP 30/70 grew faster and expressed the highest alkaline phosphatase activity earlier than the other groups, whereas, the highest Osteocalcin activity was detected in the 50/50 group followed by 30/70 and 40/60 respectively. Therefore, it implies that the BCP containing higher ratios of TCP (30/70) would support proliferation and the early phase of differentiation of the osteoblast cells, whilst, higher HA ratios (50/50) would support the later phase. Those effects would be due to calcium and phosphate ions which can be released from the BCP particle. Ma et al (Ma et al., 2005) monitored dissolution behaviors of those ions released from plasma-sprayed HA coatings coating disks and assessed their effects on osteoblast precursor cell lines. The authors concluded that the cells responded differently to the different concentration of calcium and phosphate in the medium. In our opinion, BCP 30/70 is suitable to be used as the filler in the PCL-based scaffolds, not only for increasing bioactivities, but also for improving degradation property of the scaffolds. Regarding the mMSMD technique, BCP, which being stable within the temperature between 100-120oC,

is appropriate for the melt blending with PCL and the monofilaments of PCL-BCP blends can be fabricated homogenously via an extruding machine (Thuaksuban et al., 2011). In this study, the bioactivities of the PCL-BCP scaffolds for supporting bone-forming cells were evaluated. Relations between the releasing ions from the scaffolds and growth and differentiation of the cells were observed and discussed. Materials and Methods Scaffold fabrication and study groups The study groups were divided group A using the ratio of PCL: BCP = 80:20 (PCL-20%BCP) and group B = 70:30 (PCL-30%BCP). The PCL-BCP scaffolds were fabricated using the mMSMD technique as follows. In brief, PCL pellets ( M n 80,000 PC, Sigma Aldrich, USA) and BCP particles (HA: β-TCP 30/70, particle sizes< 75 µm, MTEC, Pathumthani, Thailand) were used as raw materials. The two materials were mixed together in the ratios of PCL: BCP = 80:20 and 70:30 by weight and melted in a melting-extruding machine (Thuaksuban et al., 2011). The PCL-BCP monofilaments were made by extruding the PCLBCP blend through the nozzle tip of the machine. After that, the filaments were stretched to decrease their diameter and then they were stocked for fabricating the scaffolds. To fabricate a 3-D scaffold (Figure 1), the single filament was cut into 50 cm in length and put into a 5 cc-glass syringe, and then, the plunger of the syringe was pushed until reaching the reference point of 3 mm above the bottom of the syringe. The tip of the syringe was sealed by polyvinyl siloxane (3M ESPE, USA), and then, it was immerged into warm double distilled water. By using this method, contacted surfaces of the filaments could be fused together and the 3-D scaffold (diameter: 11 mm, height: 3 mm) was built.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Morphologies of the scaffold specimens of all groups sterilized using ethylene oxide gas 2 weeks prior to were demonstrated in figure 2. The specimens were the experiments. A

Figure 1 The fabrication process of the PCL-BCP scaffolds using the mMSMD technique; A: the PCL-BCP filament was put into a glass mold and compressed, B: the mold was immersed into warm water allowing the contact points of the filament to fuse together and form a 3-D scaffold. A

C C

Figure 2 The stereomicroscope images demonstrated the morphologies of the PCL-BCP scaffold specimens; A: superior view, B: lateral view, C: cross-sectional view and D: the magnified picture focuses on the rough surface architecture of the scaffold.

Release of Calcium and Phosphate ions The scaffolds of each group were left in the proliferation culture medium [Alpha-Minimum Essential Medium (Îą-MEM; Gibco, Invitrogen,

USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Invitrogen, USA), 10000 units/ml penicillin/streptomycin (Gibco, Invitrogen, USA), and 250 Âľg/mL fungizone (Gibco, Invitrogen,

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

USA)] (n=25/group) for detecting release of calcium and phosphate ions over 30 days. In brief, the scaffolds were immersed in 2 mL of the medium per well in a tissue culture plate and the plate was incubated at a constant temperature of 37◦C, whilst, the mediums without the scaffolds were used as a control group. On day 3, 7, 14, 21 and 30 thereafter, the scaffolds were moved into the next wells and the fresh medium was added. The solution of each previous well was collected for measuring calcium and phosphate ions using a Calcium and Phosphate Colorimetric Assay Kit (Biovision, USA) (n=5/group/time point/testing). To detect the calcium ion, 90 μL of the Chromogenic Reagent and 60 μL of the buffer solution were added into 50 μL of each sample solution and mixed gently in a 96well plate. The plate was incubated away from light for 5 min at room temperature. The absorbance (OD) of the chromophore was measured using a microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Germany) at 575 nm. To detect the phosphate ion, 200 μL of the sample solutions were placed in the 96-well plate. Thirty microliters of phosphate reagent were added into each well and mixed gently, and then, the plate was incubated at room temperature for 30 min. The absorbance of Malachite Green and Ammonium Molybdate which formed a chromogenic complex with phosphate ions was measured at 700 nm. The levels of OD were compared with a standard curve to calculate the concentrations of calcium and phosphate released from the scaffolds. Biocompatibility in vitro Cell culture Osteoblast cell lines (MC3T3-E1, subclone 4, ATCC, USA) were grown in the proliferation medium. The cells were cultivated in 5% CO 2 at 37 ◦C until reaching confluence, and then, subculturing was conducted. The cells between passages 3–6 were used for the experiments.

Cytocompatibility tests The indirect cytocompatibility experiments were performed in order to evaluate an influence of the releasing ions from the scaffolds on proliferation and differentiation of the osteoblast cells. On day 21, 14, 7 and 3 prior to the experiment, 1 x 104 cells were seeded into each well of the 48- well culture plates and then 200 μL of the proliferation medium were added (n=5/ group/ time point/ testing). The plate were left for 3 h in 5% CO 2 at 37◦C to allow for the cell attachment. After that, the scaffolds of both groups were immerged into each well and secured as close to the bottom of the well as possible. Five wells without the scaffold were reserved as the control group. The plates were cultivated in 5% CO 2 at 37◦C and the medium was changed every 3 days until the experiments. Cell proliferation; On the day of the experiment, the cell proliferative reagent (WST-1; Roche, Germany) was used to measure an activity of mitochondrial dehydrogenases for reflecting the number of viable cells as per the following protocol. For each well, the scaffold and culture medium were removed and replaced with 200 μL of the fresh culture medium without FBS and 20 μL of WST-1 solution. The well plates were incubated for 4 h in 5% CO 2 at 37◦C. After that, 100 μL of the solution of each well was transferred to a 96-well plate in duplicate and the absorbance of the formazan product of each well was measured at 440 nm using a micro-plate reader. The levels of OD were compared with a standard curve to infer the amounts of the cells. Cell differentiation; On the day of experiment, after removing the medium and the scaffold, the cells on the bottom of each well were washed two times using PBS, and then, they were lysed by freezing and thawing for three cycles (1 cycle: at - 20 oC for 15 min and at room temperature for 15 min). After that,

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

200 µL of 1% Triton X-100 (Sigma, USA) in PBS were added and the mixtures were transferred into micro-centrifuge tubes. All tubes were centrifuged at 2000 x g for 10 min, and then, the supernatant of each tube was collected and kept at -80 oC as the cell lysis solution used for an analysis of total cellular protein content, alkaline phosphatase activity (ALP) and osteocalcin assay (OCN). The quantification of total protein in the solutions were performed according to the manufacturer’s instructions (BioRad protein assay, USA) based on the method of Bradford. The absorbance at 750 nm was read using the micro-plate reader. The ALP activities were measured according to instructions using the commercial kit of Alkaline Phosphatase, AMP Buffer (Human, Germany) according to the recommendation of the International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Levels of the activity were calculated per one milligram of the total cellular protein [(U/L)/mg protein]. Quantification of OCN was performed according to the manufacturer instructions using the commercial kit of osteocalcin enzyme-linked immunosorbent assay (Biomedical Technologies Inc., USA). The solutions were read at 450 nm absorbance using the microplate reader and their concentrations were calculated with the serial diluted standard solution. The OCN levels were demonstrated as ng/mg protein.

Statistical analysis The data was analyzed using statistics analysis software (SPSS, version 14.0, USA). One-way Analysis of Variance (ANOVA) followed by Tukey HSD was applied to compare the differences of the amounts of ions and the parameters of cytocompatibility tests among the experiment groups and the control group. Dunnett’s T3 was performed when equal variances were not assumed. The level of statistical significance was set at a p < 0.05. Results Release of Calcium and Phosphate ions The concentrations of calcium and phosphate ions released from the scaffolds were demonstrated in figure 3. The results demonstrated that the scaffolds of both groups could release those ions over the observation periods when immerged in the culture medium. In addition, there was no significant difference between the experiment groups over the time points (p > 0.05). It was noted that the releasing concentrations on day 7 were significantly increased more than other days (p < 0.05) and then decreased thereafter. The cumulative data demonstrated that the accumulation of those ions continued increasing with time and no significant difference was found between the experiment groups (p > 0.05).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

40.80 38.18 *

* *

51.86 48.95

48.85 44.85

1.80 1.74

1.80 1.82

1.69 1.93

2.30 2.30 1.69 1.66

124.40 113.43

86.56 78.40

* *

Figure 3 A and B; The graphs demonstrate profiles of calcium and phosphate ions released from the scaffolds over 30 days. The maximum release of both ions were detected on day 7, which was significantly greater than the other days (*, #; ANOVA, p < 0.05). The releasing decreased thereafter until reaching the lowest level on day 30. C and D; Accumulation of the released ions rapidly increased on day 7 and continued increasing with time thereafter. Since day 7, the amounts of those ions of the experiment groups were significantly greater that those in the culture medium (*; ANOVA, p < 0.05). In addition, there was no significant difference of those ions between the experiments groups over the observation periods.

Cytocompatibility tests Cell proliferation The amounts of the viable cells at all observation time points were demonstrated in figure 4. It was found that the amounts of the cells of the experiment groups slightly decreased on day 7, and then continued increasing thereafter to reach the maximum

growth on day 21. For the control group, the amounts of the cells on day 7 and 14 were significantly greater than those of the experiment groups (p < 0.05). The maximum growth of the cells was detected on day 14, but, it decreased on day 21 (significantly less than the experiment groups; p =0.00)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ÂĽ #

Figure 4 The bar graph shows that amounts of the cells in all groups slightly decreased on day 7, and then remarkably increased on day 14. On day 21, the amounts of the cells in proliferation medium + PCL-20% BCP scaffold and proliferation medium + PCL-30% BCP scaffold continued increased, whilst, those of the cells in proliferation medium alone decreased. (* and # = the viable cell number in proliferation medium was significantly greater than the other groups; ANOVA, p = 0.00 and 0.01 respectively. ÂĽ = the viable cell number in proliferation medium was significantly less than the other groups; ANOVA, p = 0.00).

Cell differentiation The ALP activities of the cell-scaffold constructs were demonstrated in figure 5. The results demonstrated that the ALP levels of group A remarkably increased with time until reaching the maximum level on day 21 (p>0.05). The maximum ALP level of group B was found only on day 3, but, it significantly decreased on day 7 and seemed to be stable on the following days (p>0.05). The ALP levels of the control group seemed to be stable during

the observation periods. The OCN levels of those scaffolds were demonstrated in figure 6. It was found that the OCN levels of the experiment groups slightly decreased on day 14, but they remarkably increased thereafter. The maximum OCN level of the control group was detected on day 7, and then it decreased thereafter. It was noted that the OCN levels of the experiment groups were greater than those of the control group since day 14.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

β *

€

-3

Figure 5 The bar graphs demonstrate ALP activities of the cell-scaffold constructs over 21 days. On day 3, the lowest levels of ALP were detected in proliferation medium + PCL–20% BCP scaffold, whilst, the maximum level was found in proliferation medium + PCL-30% BCP scaffold (significantly greater than the other groups, *; p = 0.00). On day 7, ALP activity of proliferation medium + 20% BCP scaffold significantly increased (#; p = 0.029), whilst, that of proliferation medium + PCL-30% BCP scaffold significantly decreased (β; p = 0.001). On day 14, the levels of all groups slightly increased. On day 21, the ALP activity of proliferation medium + PCL–20% BCP scaffold significantly increase greater than those of the other groups (¥; p = 0.00), whilst, the ALP activity of proliferation medium + PCL-30% BCP scaffold and the cells in proliferation medium alone significantly decreased (€ and £; p = 0.003).

-3

Figure 6 The bar graphs demonstrate the OCN levels of the cell-scaffolds constructs over 21 days. On day 7, the maximum level of OCN was detected in proliferation medium + PCL–20% BCP scaffold followed by the cells in proliferation medium alone and proliferation medium + PCL-30% BCP scaffold. On day 14, the levels of all groups slightly decreased. On day 21, those levels of proliferation medium + PCL–20% BCP scaffold and proliferation medium + PCL-30% BCP scaffold remarkably increase (* = significantly greater than the cells in proliferation medium, p = 0.006), whilst, the OCN level of the cells in proliferation medium alone was stable.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Discussion This study revealed the indirect effects of the calcium and phosphate ions released from the PCLBCP mMSMD scaffolds on the growth and differentiation of the osteoblasts. Similar to the MSMD technique, the maximum amounts of the BCP filler are not exceed 30 % due to an increase of fracture of the filaments (Thuaksuban et al., 2011). Therefore, the ratios of PCL-BCP at 70:30 and 80:20 were used for the experiments to evaluate the activities of the BCP filler. The result showed that the scaffolds of both ratios could sustain release of calcium and phosphate ions throughout 30 days. Although the maximum releasing of the ions was detected on day 7 and the rates of releasing decreased thereafter, the amount of those ions still cumulatively increased with time. Moreover, the cumulative concentrations of the experiment groups were significantly greater than those of the standard culture medium since day 7. Interestingly, there were no significant differences of the amounts of those ions and the profiles of their releasing between the experiment groups over the observation periods. Therefore, it implies that the ratio of 70:30 did not show any evident of more advantage in term of releasing more calcium and phosphate ions when compared with the ratio of 80:20. Regarding the result of the cell proliferation, the concentration of the calcium and phosphate ions seemed to correlate with the profiles of the cell growth. The burst releasing ions on day 7 seemed to produce an inappropriate environment for the growth of the cells, but decrease of the releasing rate thereafter would promote the cell proliferation until the day 21. Regarding the results of the cell differentiation, the ALP levels of the ratio of 80:20 continued increasing with time until reaching the maximum level on day 21, while, this profile was not found in

the groups of the ratio 70:30 and in the proliferation medium alone. The OCN levels of the experiment groups demonstrated the correlation of the ion concentrations and the changing profiles of OCN expression. It was found that the OCN levels of the ratio of 80:20 were higher than those of the ratio 70:30 over all time points. Therefore, it can be concluded that the ions released form the PCL20%BCP scaffolds would be more suitable for supporting both of the early and late differentiation of the osteoblasts when compared with the PCL30%BCP scaffolds, whilst, the effects of the two ratios on the cell proliferation were not different. Some previous studies demonstrated the effect of calcium and phosphate ions on behaviors of bone cells (Beck, Moran, & Knecht, 2003; Bingham & Raisz, 1974; Godwin & Soltoff, 1997; Maeno et al., 2005). For the effect of calcium ion, Maeno, et al (Maeno et al., 2005) investigated the effect of various concentrations of calcium ion on functions of cultured mouse primary osteoblasts. The result showed that the low concentration of calcium ion of 2-4 mM and 6-8 mM providing suitable conditions for proliferation and differentiation of the cells respectively. Godwin and Soltoff (Godwin & Soltoff, 1997) reported a relationship between extracellular calcium concentration and chemotaxis of MC3T3-E1 osteoblast cell line. They found that the rate of chemotaxis of the cells correlated with an increase of the calcium concentration within the range of 1.8 to 5 mM. For the effect of phosphate ion, Beck, et al (Beck et al., 2003) reported that inorganic phosphate is a signaling molecule for altering gene expression of the osteoblast cells during their differentiation. By using microarray analysis of phosphate-treated MC3T3-E1 osteoblast cell, they identified that some multiple genes such as Nrf2 which associating with the osteoblast differentiation were upregulated by an increase in the concentration

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

of phosphate ion. Bingham and Raisz (Bingham & Raisz, 1974) examined the effect of increasing phosphate ion in the range of 1.5 to 4.5 mM on bone growth and mineralization by using fetal rat long bones in organ cultures. They also found that increasing amounts of phosphate ion resulted in increased collagen content and calcification of the cultures. Regarding the results of our study, it can implies that the accumulative concentrations of calcium ion in the medium since day 14 are in the ranges of suitable environment for supporting growth of the osteoblast (Godwin & Soltoff, 1997; Maeno et al., 2005), whilst, those of the phosphate ion seem to be less than the optimum levels. Regarding economical and practical aspect in terms of saving the filler material and easier fabricating process, the ratio of PCL: BCP at 80: 20 is considered to be more suitable and it will be used for our future experiments.

cell-induced bone formation. Biomaterials, 26(17), 3631-3638. Beck, G. R., Jr., Moran, E., & Knecht, N. (2003). Inorganic phosphate regulates multiple genes during osteoblast differentiation, including Nrf2. Exp Cell Res, 288(2), 288-300. Bingham, P. J., & Raisz, L. G. (1974). Bone growth in organ culture: effects of phosphate and other nutrients on bone and cartilage. Calcif Tissue Res, 14(1), 31-48. Dorozhkin, S. V. (2010). Bioceramics of calcium orthophosphates. Biomaterials, 31(7), 1465-1485. doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.11.050

Ebrahimi, M., Pripatnanont, P., Suttapreyasri, S., & Monmaturapoj, N. (2014). In vitro biocompatibility analysis of novel nano-biphasic calcium phosphate Conclusion scaffolds in different composition ratios. J Biomed The technique of mMSMD is very practical to Mater Res B Appl Biomater, 102(1), 52-61. doi: fabricate PCL-BCP 3-D scaffolds. This study proves 10.1002/jbm.b.32979 that the PCL-BCP mMSMD scaffolds have the osteoinductive property due to their sustainable Engelberg, I., & Kohn, J. (1991). Physicorelease of the essential calcium and phosphate ions mechanical properties of degradable polymers used in for supporting proliferation and differentiation of the medical applications: a comparative study. osteoblasts over the period of normal bone formation. Biomaterials, 12(3), 292-304. The concentration of those ions released from the PCL-20%BCP scaffolds would be better for supporting Godwin, S. L., & Soltoff, S. P. (1997). the entire phases of the osteoblastic differentiation Extracellular calcium and platelet-derived growth factor promote receptor-mediated chemotaxis in when compared with the PCL-30%BCP scaffolds. osteoblasts through different signaling pathways. J Biol Chem, 272(17), 11307-11312. References Arinzeh, T. L., Tran, T., Mcalary, J., & Daculsi, G. Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Schantz, J. T., (2005). A comparative study of biphasic calcium Woodruff, M. A., & Teoh, S. H. (2009). phosphate ceramics for human mesenchymal stem- Evaluation of polycaprolactone scaffold degradation for 6 months in vitro and in vivo. J Biomed Mater

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Res A, 90(3), 906-919. doi: 10.1002/ jbm.a. 107(2), 330-342. doi: 10.1016/j.jconrel. 2005. 07.002 32052 Lei, Y., Rai, B., Ho, K. H., & Teoh, S. H. (2007). In vitro degradation of novel bioactive polycaprolactoneâ&#x20AC;&#x201D; 20% tricalcium phosphate composite scaffolds for bone engineering. Mater Sci Eng C, 27(2), 293-298. doi: 10.1016/j.msec. 2006.05.006

Salgado, A. J., Coutinho, O. P., & Reis, R. L. (2004). Bone tissue engineering: state of the art and future trends. Macromol Biosci, 4(8), 743-765. doi: 10.1002/mabi.200400026

Schantz, J. T., Hutmacher, D. W., Lam, C. X., Lomelino Rde, O., Castro, S., II, Linhares, A. B., Brinkmann, M., Wong, K. M., Lim, T. C., . . . Alves, G. G., Santos, S. R., Gameiro, V. S., . . . Teoh, S. H. (2003). Repair of calvarial defects with Granjeiro, J. M. (2012). The association of human customised tissue-engineered bone grafts II. primary bone cells with biphasic calcium phosphate Evaluation of cellular efficiency and efficacy in vivo. (betaTCP/HA 70:30) granules increases bone Tissue Eng, 9 Suppl 1, S127-139. doi: 10. 1089/ repair. J Mater Sci Mater Med, 23(3), 781-788. 10763270360697030 doi: 10.1007/s10856-011-4530-1 Tay, B. Y., Zhang, S. X., Myint, M. H., Ng, F. L., Ma, S., Yang, Y., Carnes, D. L., Kim, K., Park, S., Chandrasekaran, M., & Tan, L. K. A. (2007). Oh, S. H., & Ong, J. L. (2005). Effects of Processing of polycaprolactone porous structure for dissolved calcium and phosphorous on osteoblast scaffold development. J Mater Process Technol, responses. J Oral Implantol, 31(2), 61-67. doi: 182(1-3), 117-121. doi: 10.1016/j.jmatprotec. 2006.07.016 10.1563/0-742.1 Thuaksuban, N., Nuntanaranont, T., Pattanachot, W., Suttapreyasri, S., & Cheung, L. K. (2011). Biodegradable polycaprolactone-chitosan threedimensional scaffolds fabricated by melt stretching and multilayer deposition for bone tissue engineering: assessment of the physical properties and cellular response. Biomed Mater, 6(1), 015009. doi: Nery, E. B., LeGeros, R. Z., Lynch, K. L., & Lee, K. 10.1088/1748-6041/6/1/015009 (1992). Tissue response to biphasic calcium phosphate ceramic with different ratios of HA/beta TCP in Thuaksuban, N., Nuntanaranont, T., Suttapreyasri, periodontal osseous defects. J Periodontol, 63(9), S., Pattanachot, W., Sutin, K., & Cheung, L. K. (2013). Biomechanical properties of novel 729-735. doi: 10.1902/jop. 1992.63. 9. 729 biodegradable poly epsilon-caprolactone-chitosan Rai, B., Teoh, S. H., & Ho, K. H. (2005). An in scaffolds. J Investig Clin Dent, 4(1), 26-33. doi: vitro evaluation of PCL-TCP composites as delivery 10.1111/j.2041-1626.2012.00131.x systems for platelet-rich plasma. J Control Release,

Maeno, S., Niki, Y., Matsumoto, H., Morioka, H., Yatabe, T., Funayama, A., . . . Tanaka, J. (2005). The effect of calcium ion concentration on osteoblast viability, proliferation and differentiation in monolayer and 3D culture. Biomaterials, 26(23), 4847-4855. doi: 10.1016/j.biomaterials. 2005.0 1.006

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Evaluation of pluripotency gene in Thai human dental pulp stem cells Yada Anantawata, Kadkao Vongsavana, Hathaitip Sritanaudomchaib*, Kemthong Mitrakula, Taweepong Arayapisitc and Petcharat Kraivaphand a

Department of Pedriatic Dentistry, Faculty of Dentistry, Mahidol University, Bangkok, 10400 Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, Mahidol University, Bangkok, 10400 c Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, Mahidol University, Bangkok, 10400 d Department of Pharmacology, Faculty of Dentistry, Mahidol University, Bangkok, 10400 * Corresponding author. E-mail address: hathaitip.sri@mahidol.ac.th Abstract The introduction of stem cells in regenerative medicine have given us valuable opportunities to repair the disfunctional tissues and organs of human. The more variety of cell types stem cells can give rise to the more diseases and disability we can overcome. â&#x20AC;&#x2DC;Pluripotencyâ&#x20AC;&#x2122; refers to the ability of stem cells to differentiate into all three germ layers. The aim of this study was to evaluate the expression of pluripotency markers in Thai human dental pulp stem cells. Stem cells was isolated and cultured from dental pulp tissue of 3 permanent teeth (DPSC 1-3) and 3 human exfoliated deciduous teeth (SHED1-3). The total RNA was extracted from the dental pulp stem cells in passage 3-5. The cDNA of DPSCs and SHEDs was measured the gene expression level of OCT-4, NANOG, SOX-2, and HNF-3b by RT-qPCR. The statistical difference was determined by MannWhitney U test (P-value<0.05). The result showed variation in level of pluripotency gene expression among both DPSC 1-3 and SHED 1-3. Comparatively, the expression of OCT-4, NANOG, SOX-2 gene appeared to demonstrate higher trend in SHEDs. Whereas, higher trend of HNF 3b gene expression was detected in DPSCs. The genetic investigation of stem cell can reveal many useful data for the future of stem cell research and regenerative medicine. This study was the first to provide comparative pluripotency markers information between SHED and DPSC of selected Thai patients. b

Keywords: Pluripotency markers, Dental pulp stem cells, Thai, Primary teeth, Permanent teeth

in dental pulp tissue inside both permanent (Gronthos, 2000) and exfoliated deciduous teeth Stem cells are a class of undifferentiated cells (Miura, 2003). Stem cells found in dental pulp capable of self-renewal and differentiation. The tissue have demonstrated promising potential beyond pluripotency of stem cells is the potential of stem the quality of other adult stem cells. Several studies cells to differentiate into any of the three germ layers: have shown that dental pulp stem cells can be ectoderm, mesoderm or endoderm. Pluripotent stem cultivated into many types of cells from the same cells can develop into any fetal or adult cell types. germ layer such as osteocytes, odontocytes With such ability, pluripotent stem cells are (Kitagawa, 2007), chondrocytes (Iohara, 2006; considered an important key to the future of Yu, 2010), adipocytes (Lee, 2014), and myocytes regenerative medicine. Regenerative medicine may (Nakatsuka, 2010), and also have shown potentials lessen the invasiveness of dental procedure such as to differentiation into cells from different germ layers pulp vascularization lowering the likeliness of tooth such as ectoderm (Srisawasdi, 2007; Arthur, 2008; extraction, or maximize the treatment success such as Govindasamy, 2010) and endoderm (Govindasamy, localized bone regeneration extending the longevity 2011; Ishkitiev, 2012). This indicates that of prosthetic implants. These stem cells can be found pluripotency are no longer restricted only within Introduction

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

embryonic stem cells, but also can be found in adult stem cells such as DPSC and SHED. Not all pluripotent stem cells are exactly the same. There may be differences in morphology, ability to contribute to chimeras, and gene expression profiles (Rossant, 2008). Describing the difference in gene expression profiles will be helpful in the process of investigating the ability of stem cells. Several genetic studies have identified many pluripotency marker genes (Calloni, 2013; Miang-Lon, 2011). The well-recognized marker genes are OCT-4, NANOG, and SOX-2. They are the core of a transcription factor network regulating the cell pluripotency in early embryos (Pesce, 1999; Niwa, 2007). These three transcriptional factors co-occupy putative enhancer elements of other pluripotency promoting genes, and repress differentiation (Ralston, 2010). The study of Huang et al. in 2014 suggested that the signaling of OCT4-NANOG is a regulatory switch to maintain properties such as cell proliferation, osteogenic/chondrogenic/adipogenic differentiation of DPSCs (Huang, 2014). HNF3b (FOXA2) is a member of the HNF-3/fork head family of transcription factors. One of the same family members is also an important pluripotency marker, FOXD3. HNF-3b was previously found to be essential in visceral endoderm for normal primitive streak morphogenesis (Dufort, 1998). Later in the year 2002, a study have found that not only HNF3b definitely exists at early stage of embryos but HNF-3b also plays an integral role in the formation of axial mesendoderm (Hallonet, 2002). Moreover, the profiling of transcriptional and epigenetic changes during directed endothelial differentiation of human embryonic stem cells astonishingly identified HNF3b as a marker of early mesoderm commitment (Howard, 2013). Stem cells from dental pulp has shown great potentials to give rise to various cell types of mesoderm and ectoderm, but few have

demonstrated the ability to differentiate into endodermal cells. The molecular investigation on pluripotency marker expression in Thai human dental pulp stem cells has not been clearly established. A comparative study of dental pulp stem cells in Thai population has been done in 2010, but no investigation was done molecularly (Guan, 2011). The genetic investigation of pluripotency markers in DPSC and SHED will clarify the pluripotency level in DPSC and SHED. Unpublished studies have been conducted at the faculty of Dentistry, Mahidol University, prior to this proposal research. Those studies have found characteristics of stem cell such as proliferation rate, surface markers and differentiation in both the dental pulp cells isolated from permanent and primary teeth. The results had confirmed to characteristics of stem cells. The present study was focusing on evaluating the pluripotency gene markers (OCT-4, NANOG, SOX-2, and HNF-3b) in those dental pulp stem cells isolated from permanent and primary teeth using RT-qPCR technique. Materials and Methods Tooth samples collection Six of extracted caries-free permanent (n=3, patientâ&#x20AC;&#x2122;s age = 18-25 years) and exfoliated deciduous teeth (n=3, patientâ&#x20AC;&#x2122;s age = 5-12 years) were collected from selected Thai subjects at faculty of Dentistry, Mahidol University. Teeth with previous restorations, history of trauma, and/or signs of pulpal pathology, were not a part of this study. The experiment was approved by the Ethics Committee on Human rights Related to Human Experimentation of Faculty of dentistry of Mahidol University (COE. No. MU-DT/PY-IRB 2014/ 036.0310). Isolation and culturing of dental pulp stem cells

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Within 24 hours of tooth extraction, fragments of dental pulp tissues were extracted and submerged in culture medium using 25 mm2 culture flasks (Jet Biofil). The culture media consisted of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/ high-glucose (Hyclone), 10% Fetal bovine serum (Biochrome) and 1% Penicillin streptomycin (Gibco). The dental pulp stem cells were obtained using the outgrowth methods and incubating condition of 37◦C, 5%CO2 and 95% humidity. The culture medium was changed every 2 days. The obtained stem cells were continually cultured in a 75 mm2 culture flask (Jet Biofil). When primary culture reached 80% confluent, cells were collected by trysinization using 0.25% Trypsin solution (Gibco) and processed for subsequent passages. Three lines of DPSCs and three lines of SHEDs in Passage 3-5 were collected to investigate the genetic expression of pluripotency gene markers using RT-qPCR technique. The evaluation of plutipotency gene expression using RT-qPCR The total RNA was extracted from the three lines of DPSCs and three lines of SHEDs in passage 3-5 using RNeasy®Mini Kit (Qiagen). The RNA was

reversed-transcribed into cDNA using iScript™ Select cDNA Synthesis Kit (BioRad) according to the manufacturer’s instruction. For the real-time PCRs, cDNA amplification was performed in the C1000TM thermal cycler of CFX96 real time system (Bio-Rad) by using KAPA SYBR® Fast qPCR Kit (Kapa Biosystem). Using 25 ng of DNA per capillary, 40 PCR cycles were monitored with SYBR green I at the annealing temperatures (50-61°C). After the PCR cycles, melting curve analysis was performed by heating to 95°C for 10 seconds, followed by cooling to 65°C for 5 seconds and gradual heating to 95°C at 0.2°C/second. All PCRs were done in triplicates. All measurements were normalized by the expression level of the housekeeping genes, GAPDH. Primers of OCT-4, NANOG, SOX-2, HNF-3b, and GAPDH were referenced from other previous human stem cell researches (Atari, 2011; Kim, 2013). The relative quantification of gene expression was assessed by ∆∆Cq method.

Table 1 Primers used in this study Forward primer (F) Reverse primer (R) OCT-4 NANOG SOX-2 HNF-3b GAPDH

F: GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG R: CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC F: AAAGAATCTTCACCTATGCC R: GAAGGAAGAGGAGAGACAGT F: GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG R: TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG F: CTACGCCAACATGAACTCCA R: GAGGTCCATGATCCACTGGT F: GTCAGTGGTGGACCTGACCT R: AGGGGAGATTCAGTGTGGTG

Base pairs

Annealing temperature

144

61.0°C

110

50.0°C

151

50.0°C

199

55.1°C

395

50-61°C

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Data and statistical analysis Statistical analyses were performed by using PASW Statistics 18 (SPSS, New York, U.S.A.). The data of relative normalized expression was presented by descriptive analysis. Difference among the two groups was analyzed using Mann-Whitney U test. Significant differences was set at 95% confidence. Result

Fragments of dental pulps were extracted and immersed in culture medium for 7-14 days before the spindle shape cells were seen migrating from the fragments. This occurred both in dental pulps extracted from permanent teeth and from exfoliated deciduous teeth (Figure 1-2). The morphology of the cells have remained the same as fibroblastic-like appearance throughout the passage 0-5 (P0-P5). The stem cells in P3-P5 were collected as pellets and continued with the RT-qPCR.

Isolation and culturing of dental pulp stem cells

Figure 1 Primary cells outgrowth from dental pulp fragment of a exfoliated deciduous tooth on day 7-14

Figure 2 Morphology of the dental pulp cells from permanent and primary teeth

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Expression of pluripotency markers in denta lpulp stem cells Total RNA was extracted from the stem cell pellets which was later reverse-transcribed into cDNA. The cDNA amplification and quantification was performed using qPCR. Each pluripotency gene marker of dental pulp stem cells was evaluated relatively to GAPDH, and all PCRs were performed in triplicates. DPSC: The gene expression of OCT-4, NANOG, SOX-2, HNF-3b have been detected in all

DPSCs cell lines (Figure3). Comparison within the group of DPSCs, DPSC 3 had the highest expression level of NANOG and SOX-2. The second highest was DPSC 2 and the lowest was DPSC 1, respectively. For the expression of OCT-4, the highest expression was found in DPSC 2, DPSC 1, and DPSC 3 accordingly. For the expression of HNF-3b, DPSC 1 showed a very high level of expression, 3 folds of the expression level of DPSC 2 and DPSC 3.

Figure 3 The relative normalized expression of pluripotency markers in dental pulp stem cells from permanent teeth (DPSC 1-3).

SHED: The gene expression of OCT-4, NANOG, SOX-2, HNF-3b have been detected in all SHED cell lines (Figure 4). Comparison within the SHED group, SHED 3 had the highest expression level of NANOG and SOX-2. The second highest was SHED 2 and the lowest was SHED 1. For the

expression of OCT-4, the highest expression was found in SHED 2, SHED 3, and SHED 1 respectively. For the expression of HNF-3b, SHED 1-3 demonstrated similar level of gene expression with the highest from SHED 1 to SHED 2, and SHED 3 respectively.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Figure 4 The relative normalized expression of pluripotency markers in dental pulp stem cells from primary teeth (SHED 1-3).

Comparison of pluripotency gene expression between DPSCs and SHED The study of gene expression in-between groups of DPSCs and SHEDs had indicated the higher trend of OCT-4, NANOG, and SOX-2 expression in SHEDs than in DPSCs. On the other hand, DPSCs

had shown the higher expression trend of HNF-3b gene when compared to SHEDs. The overall data of comparative gene expression was exhibited in Figure 5. However, no statistically difference was found between the two groups in the expression of OCT-4, NANOG, SOX-2 and HNF-3b.

Figure 5 (a-d): The overall data of comparative gene expression in DPSC 1-3 and SHED 1-3

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

had investigated the physiological functions of OCT4 and NANOG expression in DPSCs. They have Our research colleague at faculty of Dentistry, found that down-regulation of OCT-4 and NANOG Mahidol University have investigated the co-expression significantly reduced the cell mesenchymal stem cell property in the isolated dental proliferation of DPSC. Contrastingly, the copulp cells. We have found that the primary cells overexpression of OCT-4 and NANOG have from the outgrowth methods have demonstrated all enhanced the proliferation rate of DPSC. SOX-2 is also one of the essential pluripotency the required characteristics of mesenchymal stem cell (Lanza, 2014, pp.255-256), including plastic- markers that together with OCT-4 and NANOG adhesion when maintained in standard culture plays an important role in maintenance the conditions, formation of CFU-Fs, and expression of pluripotency, controlling the expression of a numbers CD105, CD73, CD44 surface molecules, lack of genes involved in cell proliferation. The study of expression of CD34 molecules, and the ability to SOX-2 effects on proliferation of human dental pulp differentiate in vitro into committed mesoderms such stem cells was done by Liu et al. in October of 2015 (Liu, 2015). In the study, they have found that the as osteoblasts. The significant correlation between our previous overexpression of SOX-2 resulted in the obvious studies of proliferation rate by Dr. Aiyared increase in cell proliferation, migration, and adhesion (unpublished data) (Figure 6-7) and the level of of DPSCs. The same data correlates to our results NANOG and SOX-2 expression was found in this from this study. The DPSC 3 and SHED 3 displayed study. This can be explained by the main function of high proliferation rate as they have expressed high NANOG in mesenchymal dental pulp stem cells NANOG and SOX-2 gene expression. (Huang, 2014). In 2014, Huang and his colleagues Discussion

Figure 6 The proliferation rate of dental pulp stem cells from permanent teeth (DPSC 1-3).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Figure 7 The proliferation rate of dental pulp stem cells from primary teeth (SHED 1-3).

A study on isolated dental pulp stem cells has reported that even though the age of patients at the time of stem cell harvesting was not an important factor regarding the maximal cell division potential, it showed an impact on the doubling time (Kellner, 2014). Another study also indicated higher activities of dental pulp stem cells during the physiologic root resorption (Zhu, 2012). The teeth used in this study were collected from healthy Thai donors of different ages and at the different root stages. Consequently, the different levels of gene expression within each sample were observed in this study. A further investigation should be conducted with limitation criteria of age and the stage of root resorption in order to find the true relation of the age or the degree of root resorption to the level of pluripotency gene expression. The relevance of HNF-3b to the endodermal commitment of human embryos may suggest the likelihood of DPSC 1 toward endodermal differentiation, as a research conducted in Chulalongkorn have been able to differentiate DPSCs into insulin-producing cells in 2014 (Sawangmake, 2014). The result from this study in Thai patients resembles the result studied in Malaysian population.

The study from University of Malaya reported OCT4, NANOG, and SOX-2 to be higher in SHED as compared with DPSCs (Govindasamy, 2010). However, the study was done using pooled samples which was different from our method of analysis using pulp cells from different individual pulps without pooling. As a result, we also found different expression levels of pluriotency markers among each individual sample. Further studies should continue to focus on individual pulp cells and more samples should be collected in order to represent the major trend of Thai population. Conclusions The genetic investigation of stem cell can reveal many useful data for the future of stem cell research and regenerative medicine. The comparable gene expression of pluripotency markers provides basic information on proliferation and differentiation of dental pulp cells in Thai population. The result from this study indicates that pulp cells from both permanent and deciduous teeth may also be beneficial for the future of regenerative dentistry.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Acknowledgement The authors would like to thank Mahidol University, Faculty of Dentistry for the great support. The research would be impossible without the significant collaboration between the department of pediatric dentistry and the department of oral biology at Mahidol Univeresity and their valuable staffs, especially Ms Chareerut Phruksaniyom. This study was funded by the Mahidol University, Faculty of Dentistry 2015 and also the Mahidol postgraduate alumni scholarship. For excellent technical support, we thank the research center at faculty of Dentistry, Mahidol University.

3015-3025. Retrieved from http://dev.biologists.org/ content/125/ 16/3015.long Govindasamy, V., Abdullah, A. N., Ronald, V. S., Musa, S., Ab. Aziz, Z. A. C., Zain, R. B., … Abu Kasim, N. H. (2010). Inherent differential propensity of dental pulp stem cells derived from human deciduous and permanent teeth. Journal of Endodontics, 36(9), 1504-1515. Govindasamy, V., Ronald, V. S., Abdullah, A. N., Ganesan Nathan, K. R., Aziz, Z. A. C. Ab., Abdullah M., … Bhonde, R.R. (2011). Differentiation of dental pulp stem cells into islet-like aggregates. Journal of Dental Research, 90(5), 646-652.

References Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S.A., & Gronthos, S. (2008). Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells, 26, 1787–1795. Atari, M., Barajas, M., Hernandez-Alfaro, F., Gil, C., Fabregat, M., & Ferres Padro, E. (2011). Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histology and histopathology, 26(8), 1057-1070.

Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., & Shi, S. (2000). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo, 97(25), 1362513630. Guan, Z., Shi, S., & Kamolmatyakul S. (2011). Proliferation and mineralization ability of dental pulp cells derived from primary and permanent teeth. Songklanakarin J Sci Technol, 33(2), 129-134.

Hallonet, M., Kaestner, K. H., Martin-Parras, L., Sasaki, H., Betz, U. A. K., & Ang, S-L. (2002). Calloni, R., Cordero, E. A. A., Hendriques, J. A. P., Maintenance of the specification of the anterior & Bonato, D. (2013). Reviewing and updating the definitve endoderm and forebrain depends on the major molecular markers from stem cells. Stem cells axial mesendoderm: A study using HNF-3b and development, 22(9), 1455-1475. conditional mutants. Development Biology, 243, 20-33. Dufort, D., Schwartz, L., Harpal, K., & Rossant, J. (1998). The transcription factor HNF3beta is Howard, L., Mackenzie. R. M., Pchelintsev. N. A., required in visceral endoderm for normal primitive McBeyan, T., McClure. J. D., McBride. M. W., … streak morphogenesis. Development, 125(16), Baker, A. H. (2013). Profiling of transcriptional and

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

epigenetic changes during directed endothelial differentiation of human embryonic stem cells identifies FOXA2 as a marker of early mesoderm commitment. Stem cell research & Therapy, 4(36), 1-7.

pulp cells with odontoblastic differentiation. Archives of Oral Biology, 52, 727-731.

Huang, C. E., Hu, F. W., Yu, C. H., Tsai, L. L., Lee, T. H, Chou, M. Y., & Yu, C. C. (2014). Concurrent expression of Oct4 and Nanog maintains mesenchymal stem-like property of human dental pulp cells. International Journal of Molecular Sciences, 15, 18623-18639.

Lee, Y. M., Shin, S. Y., Jue, S. S., Kwon, I. K., Cho, E. H., Cho, E. S., … Kim, E. C. (2014). The role of PIN1 on odontogenic and adipogenic differentiation in human dental pulp stem cells. Stem Cells Development, 23, 618–630.

Iohara, K., Zheng, L., Ito, M., Tomokiyo, A., Matsushita, K., & Nakashima, M. (2006). Side population cells isolated from porcine for dentinogenesis chondrongenesis, adipogenesis, and neurogenesis. Stem Cells, 24, 2493-2503.

Lanza, R., & Atala, A. (2014). Essentials of stem cell biology (3rd ed.). San Diego, CA: Elsevier.

Liu, P., Cai, J., Dong, D., Chen, Y., Liu, X., Wang, Y., & Zhou, Y. (2015). Effects of SOX2 on Proliferation, Migration and Adhesion of Human Dental Pulp Stem Cells. PLOS ONE, 10(10), 117.

Miura, M., Gronthos, S., Zhao, M., Lu, B., Fisher, Ishkitiev, N., Yaegaki, K., Imai, T., Tanaka, T., L. W., Robey, P. G., & Shi, S. (2003). Proceedings Nakahara, T., Ishikawa, H., … Haapasalo, M. of the National Academy of Sciences of the United (2012). High-purity hepatic lineage differentiated States of America. SHED: stem cells from human from dental pulp stem cells in serum-free medium. exfoliated deciduous teeth, 100(10), 5807-5812. J. Endod, 38, 475–480. Miang-Lon Ng, P., & Lufkin, T. (2011). Kellner, M., Steindorff. M. M., Strempel. J. F., Embryonic stem cells: protein interaction networks. Winkel, A., Kuhnel. M. P., & Stiesch, M. (2014). Biomoecular Concepts, 2(1-2), 13-25. Differences of isolated dental stem cells dependent on donor age and consequences for autologous tooth Nakatsuka, R., Nozaki, T., Uemura, Y., Matsuoka, replacement. Journal of Oral Biology, 59, 559-567. Y., Sasaki, Y., Shinohara, M., … Sonoda, Y. (2010). 5-Aza-2'-deoxycytidine treatment induces Kim, H., Kim, Y. Y., Ku, S. Y., Kim, S. H., Choi, skeletal myogenic differentiation of mouse dental Y. M., & Moon, S. Y. (2013). The effect of pulp stem cells. Arch. Oral Biol, 55, 350–357. estrogen compounds on human embryoid bodies. Reproductive Sciences, 20(6), 661-669. Niwa, H. (2007). How is pluripotency determined and maintained? Development, 134, 635-646. Kitagawa, M., Ueda, H., Iizuka, S., Sakamoto, K., Oka, H., Kudo, Y., … Takata, T. (2007) Pesce, M., Anasteasiadis, K., & Scholer, H. R. Immortalization and characterization of human dental (1999). Ovt-4 lessons of totipotency from

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

embryonic stem cells. Cell tissue organs, 165, 144-152. Ralston, A., & Rossant, J. (2010). The genetics of induced pluripotency. Reproduction, 139, 35-44. Rossant, J. (2008). Stem cells and early lineage development. Cell, 132, 527-531. Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., & Osathanon, T. (2014). A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissuederived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 452, 581587.

Srisawasdi, S., & Pasavant, P. (2007) Different roles of dexamethasone on transforming growth factor-beta1-induced fibronectin and nerve growth factor expression in dental pulp cells. Journal of Endodontics, 33, 1057-1060. Yu, J., He, H., Tang, C., Zhang, G., Li, Y., Wang, R., â&#x20AC;Ś Jin, Y. (2010). Differentiation potential of STRO-1+ dental pulp stem cells changes during cell passaging. BMC Cell Biol, 11, 32. doi: 10.1186/ 1471-2121-11-32. Zhu, Y., Shang, L., Chen, X., Kong, X., Liu, N., Bai, Y., â&#x20AC;Ś Jin, Y.(2012). Deciduous dental pulp stem cells are involved in osteoclastogenesis during physiologic root resorption. Journal of Cellular Physiology, 228, 207-215.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Integron Analysis of Multidrug-Resistant Diarrheagenic E. coli Isolates from Travelers in Thailand

Supaporn Ruksasiria, b, Ladaporn Bodhidattab, Oralak Serichantalergsb, Carl J. Masonband Chanwit Tribuddharata* a

Department of Microbiology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand Armed Forces Research Institute of Medical Science, Bangkok 10400, Thailand * Corresponding author. E-mail address: chanwit.tri@mahidol.ac.th Abstract Multidrug resistant (MDR) diarrheagenic Escherichia coli (DEC) is an important agent of traveler’s diarrhea. However, the reports on genetic mechanism conferring antimicrobial resistance among MDR-DEC of travelers in Thailand are limited. The aim of this study was to determine the prevalence and characterization of class 1 integrons among 49 MDR-DEC isolates from international travelers in Thailand in 2001-2004 and 2010. The majority (85%) of the isolates exhibited resistance to tetracycline, sulfisoxazole, ampicillin, streptomycin, and trimethoprim/sulfamethoxazole in both travelers with diarrhea and nondiarrhea. The most frequent phenotype was resistant to ampicillin-streptomycin-sulfisoxazole-trimethoprim/sulfamethoxazoletetracycline. Using PCR specific primers to class 1 integrase (intI1) gene, 5′- and 3′-conserved sequences (5′CS-3′CS), and dot-blot hybridization, 37 (75.5%) isolates harbored class 1 integrons, which were high prevalent in both of isolates from diarrhea and non-diarrhea groups. Resistance gene cassettes identified in this study were aadA1and aadA2 (for streptomycin resistance) and linF (for lincosamide resistance). The presence of class 1 integrons carrying aadA2-linF is described for the first time from clinical sample in Thailand. This study emphasized an important role of class 1 integrons dissemination among community acquired MDR-DEC isolates in Thailand during the past 10 years and suggested the circulation of these resistance elements in this community. Therefore, further studies of the genetic and epidemiology of these organisms will be relevant for public health to limit the emergence of bacterial resistance. b

Keywords: Multidrug resistant (MDR), Diarrheagenic Escherichia coli (DEC), Integron, Resistance gene cassette

Introduction Traveler’s diarrhea (TD) is a major public health concern causing significant morbidity and disability. TD is considered as individuals travel from industrialized countries to developing regions with low hygiene such as Latin America, the Middle East, South and Southeast Asia, and Africa, and susceptible to enteric infectious agents (de la Cabada Bauche & Dupont, 2011). Certainly, Diarrheagenic E. coli (DEC) are one of the most common causes of foodborne diseases in travelers as well as children under five years old in developing countries (Farthing et al., 2013).

The antimicrobial resistance in DEC is an increasing problem (Kalantar, Soheili, Salimi, & Soltan Dallal, 2011; Kargar, Mohammadalipour, Doosti, Lorzadeh, & Japoni-Nejad, 2014; Meng et al., 2011; Mosquito et al., 2012; Nguyen, Le, Le, & Weintraub, 2005); moreover, the global trade and travel provides opportunities for the distribution of antimicrobial resistant bacteria; consequently, a serious threat to public health. For instance, the CTX-M-15-producing enteroaggregative E. coli (EAEC) caused diarrhea in travelers who had traveled from Spain to India (Guiral et al., 2011). Horizontal gene transfer plays a major role in bacterial evolution and dissemination of multidrug resistance, since most of resistance genes are located

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

on mobile genetic elements, e.g., plasmids and transposons. For multidrug resistance, integrons are an important part in the wide spread of multidrug resistance in Gram-negative bacteria (Stalder, Barraud, Casellas, Dagot, & Ploy, 2012). Integrons are genetic elements able to incorporate open reading frames (ORFs) of mobile cassettes carrying antimicrobial resistance genes by site-specific recombination and convert them into functional genes as gene-capturing and expression systems. Integron platform comprises three functional elements necessary for the systemic operation; an integrase encoded by intI, which encodes a site-specific tyrosine recombinase, a primary recombination site, attI, and a strong promoter, Pc (Cambray, Guerout, & Mazel, 2010). Despite integrons are not selfmobilized, they are usually found in association with mobile genetic elements, e.g., plasmids and transposons, facilitating their spread (Stalder et al., 2012). Among five different classes of integrons based on the sequence homology of integrases, the class 1 integrons has been reported the most in Gram-negative bacteria, including E. coli (Yu, Li, Liu, Zhao, & Li, 2013). In Thailand, the high prevalence of class 1 integrons among E. coli has been reported in hospitalized and non- hospitalized patients (Phongpaichit, Tunyapanit, & Pruekprasert, 2011), healthy human (Phongpaichit, Wuttananupan, & Samasanti, 2008), and foodproducing animal (Chaisatit, Tribuddharat, Pulsrikarn, & Dejsirilert, 2012). However, little is known about genetic mechanism conferring antimicrobial resistance among MDR-DEC in view of travelers in Thailand. This study therefore aimed to determine the prevalence and characterization of class 1 integrons in MDR-DEC isolated from 20012004 and 2010 of international travelers in Thailand.

Materials and Methods Bacterial strains Forty-nine MDR-DEC isolates collected from international travelers with diarrhea (n=42) and non diarrhea (n=7) in 4 regions of Thailand (Central, West, East, and Northeast) were obtained in this study. Isolates were collected from 2001-2004 and 2010, which belong to 6 enteroaggregative E. coli (EAEC), 28 enteropathogenic E. coli (EPEC), 13 enterotoxigenic E. coli (ETEC), 1 enteroinvasive E. coli (EIEC), and 1 Shiga-like toxin producing E. coli (STEC). DEC isolates were kindly provided by Armed Forces Research Institute of Sciences (AFRIMS), which had been identified by using colony blot hybridization with specific digoxigeninlabeled polynucleotide probes and subjected to antimicrobial susceptibility testing (AST) by disk diffusion method that interpreting results had obtained according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines of each AFRIMS’s year project. The antimicrobials included ampicillin (10 µg), chloramphenicol (30 µg), cefotaxime (30 µg), ceftriaxone (30 µg), gentamicin (10 µg), kanamycin (30 µg), neomycin (30 µg), streptomycin (10 µg), nalidixic acid (30 µg), ciprofloxacin (5 µg), sulfisoxazole (250 µg), trimethoprim-sulfamethoxazole (1.25/23.75 µg), and tetracycline (30 µg). MDR phenotype was considered as non-susceptible to ≥1 agent in ≥3 antimicrobial categories (Magiorakos et al., 2012). DNA extraction The total DNA of DEC was extracted using Gentra® Puregene® Yeast/Bact. kit (Qiagen, USA) according to manufacturer’s instructions. Extracted DNA was subjected to all experiments in this study. Integrons detection and characterization Polymerase chain reaction (PCR)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Genomic DNA from DEC isolates were conducted in PCR with specific primers for the presence of integrase gene (intI1) and 5′- and 3′-conserved sequences (5′CS-3′CS) for internal segments of integron element. The intI1 primer sequences were intI1-F: 5′-GCCTTGCTGTTCTTCTACGG-3′ and intI1-R: 5′-GATGCCTGCTTGTTCTACGG-3′ (Ng, Mulvey, Martin, Peters, & Johnson, 1999), which produced a 558-bp amplicon size. PCR was performed in a 20 µl reaction mixture containing 1X standard buffer with 1.5 mM MgCl 2 (New England Biolabs, UK), 200 µM dNTPs, 0.5 µM each primer, 1 unit Taq polymerase (New England Biolabs, UK), and 1-10 ng/µl template DNA. Amplification cycles consisted of pre-denaturation at 95°C for 5 minutes followed by 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 58°C for 30 seconds, and extension at 68°C for 1 minute, and final extension at 68°C for 5 minutes. For 5′CS-3′CS, the primer sequences used were 5′CS: 5′-GGCATCCAAGCAGCAAG-3′ and 3′CS: 5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′ (Ng et al., 1999), which produced variable amplicon sizes. The reaction mixture contained 1X ThermoPol buffer with 2 mM MgCl 2 (New England Biolabs, UK), 1 M betain, 200 µM dNTPs, 0.5 µM each primer, 1 unit Taq polymerase (New England Biolabs, UK), and 1-10 ng/µl template DNA in a final volume 20 µl. The PCR was carried out with pre-denaturation at 95°C for 5 minutes followed by 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 58°C for 30 seconds, and extension at 68°C for 3 minutes, and final extension at 68°C for 5 minutes. E. coli EC114, an integron containing dfrA17-

aadA5 strain and E. coli Top10 were used as a positive and negative control, respectively. The PCR products were characterized for the resistance gene cassettes by cloning before sequencing using TA Cloning Kit (Invitrogen, USA). Nucleotide sequences were compared using the BLAST program supported by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (http://www.ncbi.nlm. nih.gov). Dot blot hybridization A PCR product with specific primer to intI1 was used to synthesize and label for intI1 probe by using DIG High Prime DNA Labeling kit and Detection Starter I (Roche Applied Science, Germany). Hybridization procedure and condition were performed according to the manufacturer’s instructions. E. coli EC114, an integron containing dfrA17-aadA5 strain and E. coli Top10 were used as a positive and negative control, respectively. Results Antimicrobial resistance pattern Of the 49 MDR-DEC isolates, all of them exhibited resistance to tetracycline and sulfisoxazole followed by ampicillin (89.8%), streptomycin (89.8%), and trimethoprim-sulfamethoxazole (87.8%), respectively. The most frequent phenotype was resistant to ampicillin-streptomycinsulfisoxazole-tetracycline. The resistance pattern was similar in both diarrhea and non-diarrhea group. Antimicrobial resistance profile of all E. coli isolates is shown in Table 1.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Table 1 Antimicrobial resistance profile of DEC isolates by disk diffusion method Percentage of isolate with antimicrobial resistancea (%) Sample (n) AM Diarrhea (42) 88.1 Non-diarrhea (7) 100 Total (49) 89.8 a

C 42.9 57.1 44.9

CTX 2.4 0 2

CRO GN 2.4 14.3 0 14.3 2 14.3

K 14.3 0 12.2

N 11.9 0 10.2

S 90.5 85.7 89.8

NA 35.7 28.6 34.7

CIP 7.1 0 6.1

G 100 100 100

SXT 88.1 85.7 87.8

TE 100 100 100

AM, ampicillin; C, chloramphenicol; CTX, cefotaxime; CIP, ciprofloxacin; CRO, ceftriaxone; G, sulfisoxazole; GN, gentamicin; K, kanamycin; N, neomycin; NA, nalidixic acid; S, streptomycin; SXT, trimethoprim/sulfamethoxazole; TE, tetracycline.

Detection and characterization of class 1 integrons PCR with specific primers for intI1 and 5′CS3′CS was performed for the presence of integrase gene and internal segment of integron element. Of 49 MDR-DEC isolates, 69% (29/42) and 42.9% (3/7) were intI1 positive for isolates from diarrhea and non-diarrhea group, respectively. 5′CS-3′CS were detected in 61.9% (26/42) of traveler with diarrhea and 42.9% (3/7) of traveler without diarrhea (Table 2). PCR products showed expected size of 558 bp for intI1 (Figure 1) and variable sizes for 5′CS-3′CS sequences (Figure 2). Dot blot hybridization was carried out to confirm the presence of class 1 integrase gene by using intI1 specific probe. The positive results presented purple dot for each sample (Figure 3). Dot-blot hybridization could restore the PCR result for ET050 and ET052, which

are non-diarrhea group (Table 3) with the detection rate of 71.4% (5/7). By using combination of all detection method, the presence of class 1 integrons was detected at rate of 75.5% (37/49). However, internal segment of integron element with specific 5′CS-3′CS primers was detected for 3 integrase negative E. coli isolates, whereas 8 integrase positive isolates didn’t present product of 5′CS-3′CS. EA011 and EA016 isolates were selected to be characterized for resistance gene cassettes. Sequence analysis indicated the presence of gene cassettes containing aadA2-linF, which amplicons size was 1,947 bp (accession no. JQ414042.1) for resistant to streptomycin and lincosamide in EA011, and aadA1 conferring resistant to streptomycin, which 1,011 bp size (accession no. FJ855126.1) were identified in EA016.

Figure 1 PCR using specific primers for intI1. Lane M, GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder; Lane 1, negative control, E. coli Top10; Lane 2-15, samples; Lane 16, positive control, EC114 E. coli carrying dfrA17 and aadA5.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Figure 2 PCR amplification for variable size of 5′CS-3′CS. Lane M, GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder; Lane 1, negative control, E. coli Top10; Lane 2-15, samples; Lane 16, positive control, EC114 E. coli carrying dfrA17 and aadA5.

Figure 3 Dot blot hybridization in duplicates of E. coli isolates by using intI1 specific probe. “+”, positive control, EC114 E. coli carrying dfrA17- aadA5; and “-”; negative control, E. coli Top10. Table 2 Class 1 integrons determination by PCR and dot blot hybridization Sample (n) Diarrhea (42) Non-diarrhea (7) Total (49)

Class 1 integrons by PCR intI1 (%) 29 (69) 3 (42.9) 32 (65.3)

5′CS-3′CS (%) 26 (61.9) 3 (42.9) 29 (59.2)

Class 1 integrons by dot blot hybridization (%)

Presence of class1 integrons (combined methods) (%)

29 (69) 5 (71.4) 34 (69.4)

30 (71.4) 7 (100) 37 (75.5)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Year

Nationalityb

Symptomc

Duration of stayd

EA003 EA004 EA005 EA006 EA007 EA008 EA009 EA010 EA011 EA012 EA013 EA014 EA015 EA016 EA017 EA019 EA020 EA021 EA022 EA023 EA024 EA026 EA027 EA028 EA029 EA030 EA031 EA032 EA033 EA034 EA035 ET037 ET042 ET043 ET044 ET045 ET046 ET047 ET048 ET049 ET050 ET051

2004 2004 2004 2004 2004 2010 2001 2001 2001 2001 2001 2001 2001 2002 2002 2002 2002 2002 2003 2003 2004 2004 2001 2001 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2004 2001 2001 2001 2001 2001 2002 2002 2001 2001 2001 2001

N C C C C C P P P P P P P S S S S S Pr Pr N N P P S S S S S S N B B B B B B B B B B B

A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A J J E E J J A E J J J

D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D ND ND ND ND

ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 1m 24d 3d 4d 3d 3d 1m 2y 1y 4y 7m

Pathotype

Strain

Locationa

Table 3 Class 1 integrons determination and demographic information of MDR-DEC isolates Class1 integrons

Resistance phenotypee

EAEC EAEC EAEC EAEC EAEC EAEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC ETEC ETEC EPEC ETEC ETEC ETEC ETEC ETEC ETEC EIEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC EPEC

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

AM,C,S,G,SXT,TE AM,C,S,G,SXT,TE AM,C,S,G,SXT,TE AM,GN,G,SXT,TE AM,GN,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE S,G,SXT,TE NA,AM,S,G,TE NA,AM,C,K,N,S,G,SXT,TE AM,C,S,G,TE C,S,G,SXT,TE AM,C,S,G,SXT,TE C,S,G,SXT,TE NA,CIP,AM,C,GN,K,S,G,SXT, NA,AM,C,K,N,S,G,SXT,TE NA,AM,S,G,SXT,TE AM,C,S,G,SXT,TE NA,AM,C,K,N,S,G,SXT,TE AM,C,K,N,S,G,SXT,TE NA,AM,C,S,G,SXT,TE AM,S,G,TE NA,AM,GN,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE NA,CIP,AM,C,S,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE AM,S,G,TE AM,S,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE AM,S,G,SXT,TE NA,S,G,SXT,TE AM,S,G,TE AM,C,K,N,S,G,SXT,TE NA,AM,C,S,G,SXT,TE,CTX,C NA,AM,GN,G,SXT,TE NA,CIP,C,GN,S,G,SXT,TE AM,C,S,G,SXT,TE NA,AM,C,S,G,TE AM,C,GN,G,SXT,TE NA,AM,S,G,SXT,TE

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Pathotype

Duration of stayd

Symptomc

Year

Nationalityb

Strain

Locationa

Table 3 (Cont.) Class1 integrons

Resistance phenotypee

ET052 2003 B C ND 1y EPEC + AM,C,S,G,SXT,TE ET075 2001 B A D 1y5m ETEC + AM,S,G,SXT,TE ET076 2002 B J D 3d ETEC + NA,AM,S,G,SXT,TE ET077 2002 B J D 7d ETEC + NA,AM,S,G,SXT,TE ET078 2002 B J D 8d ETEC + AM,S,G,SXT,TE ET079 2001 B J ND 1y ETEC + AM,S,G,SXT,TE ET089 2002 B A ND 3d STEC + AM,S,G,SXT,TE a B, Bangkok; C, Chonburi; N, Nakorn Ratchasima; P,Pitsanulok; Pr, Prachuap Kkiri Khan; S, Sakaeo province. b A, American; C; Canadian; E, English; J, Japanese. c D, Diarrhea; ND, Non-diarrhea. d d, day; m, month; y, year; ND, no data. e Abbreviations are in Table 1.

Discussion MDR-DEC have been reported in many developing countries (Kalantar et al., 2011; Kargar et al., 2014; Meng et al., 2011; Mosquito et al., 2012; Nguyen et al., 2005), which are considered high-risk destination for travelers (Diemert, 2006). In this study, DEC isolates more than 85% were resistant to tetracycline, sulfisoxazole, ampicillin, streptomycin, and trimethoprim-sulfamethoxazole. This similar resistance pattern was reported in commensal E. coli from human stool in Thailand (Phongpaichit et al., 2008). These antimicrobials are widely used in human and animals even if they are old antimicrobial compounds due to low cost and ready availability (Nguyen et al., 2005; Tadesse et al., 2012), which select the antimicrobial resistance bacteria and followed by their dissemination. We determined the presence of class 1 integrons to better understand genetic mechanism conferring antimicrobial resistance. The high prevalence of class 1 integrons in MDR-DEC was evidenced (75.5%), which was similar to that reported in Iran (Kargar

et al., 2014). The higher rate of class 1 integrons was noted in dot-blot hybridization technique, when compared with PCR, suggesting higher sensitivity of the homologous probe in dot-blot hybridization. However, a drawback of this technique is that it has more complicated process and takes longer time than PCR technique. Three integrase negative isolates, which were positive for 5′CS-3′CS may indicate the possible intI1 gene truncation. On the other hand, 8 int11-positive isolates which had no amplicon of 5′CS-3′CS can be explained by the long arrays containing many gene cassettes or the deletion of 3′CS caused by insertion elements (Dawes et al., 2010). Interestingly, class 1 integrons were present in all isolates from travelers without diarrhea, which all of them stayed in Thailand at least 7 months; excepting ET089, which stayed only 3 days in Thailand and returned from Cambodia (Table 3). Although only 2 representative isolates were characterized for resistance gene cassettes, aadA conferring resistant to streptomycin, which commonly found in class 1 integrons (Chang, Chang, & Chang, 2007) were identified in this study. It is noteworthy

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

that, the rare cassettes type of aadA2-linF conferring streptomycin and lincosamide resistance was detected in EA011 isolated from American traveler in 2001. This similar cassette previously has been reported in Norway from clinical specimen collection during 1995-1996 (Heir, Lindstedt, Leegaard, Gjernes, & Kapperud, 2004), in Malaysia, 2009-2010 (Kor, Choo, & Chew, 2013), and in Thailand from chicken meat, 2010-2011 (Chaisatit et al., 2012). This finding indicated an occurrence of resistance gene cassettes might transfers between different bacterial species in different hosts under selective pressure, which happened more than 10 years apart. To our knowledge, this is the first report of aadA2linF cassette array in DEC isolated from clinical sample in Thailand. It is well known that international travel and immigration contribute to dissemination of resistant bacteria, which might be horizontal or vertical gene transfer. Further studies to investigate whether the high prevalence of class 1 integron-harboring isolates in Thailand was due to clonal spread or to horizontal gene transfer will be relevant to control of their spread.

Siriraj Hospital, Mahidol University and Armed Forces Health Surveillance Center-Global Emerging Infections Surveillance (AFHSC-GEIS), Washington, DC, USA.

Conclusion

Chang, L. L., Chang, T. M., & Chang, C. Y. (2007). Variable gene cassette patterns of class 1 integron-associated drug-resistant Escherichia coli in Taiwan. Kaohsiung J Med Sci, 23(6), 273-280. doi: 10.1016/S1607-551X(09)70409-7

This study emphasized an important role of class 1 integrons dissemination among community acquired MDR-DEC isolates in Thailand during the past 10 years and suggested the circulation of these resistance elements in this community. Therefore, further studies of the genetic and epidemiology of these organisms is essential for public health to limit the emergence of bacterial resistance. Acknowledgements This study was supported by grants from Siriraj graduate thesis scholarship from Faculty of Medicine

Disclaimers The views expressed in this article are those of the authors and do not reflect the official policy of the Department of the Army, Department of Defense, or the U.S. Government. References Cambray, G., Guerout, A. M., & Mazel, D. (2010). Integrons. Annu Rev Genet, 44, 141-166. doi: 10.1146/annurev-genet-102209-163504 Chaisatit, C., Tribuddharat, C., Pulsrikarn, C., & Dejsirilert, S. (2012). Molecular characterization of antibiotic-resistant bacteria in contaminated chicken meat sold at supermarkets in Bangkok, Thailand. Jpn J Infect Dis, 65(6), 527-534.

Dawes, F. E., Kuzevski, A., Bettelheim, K. A., Hornitzky, M. A., Djordjevic, S. P., & Walker, M. J. (2010). Distribution of class 1 integrons with IS26-mediated deletions in their 3'-conserved segments in Escherichia coli of human and animal origin. PLoS One, 5(9), e12754. doi: 10.1371/journal.pone.0012754

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

de la Cabada Bauche, J., & Dupont, H. L. (2011). Multidrug-Resistant Diarrheagenic Escherichia coli in New Developments in Traveler's Diarrhea. Southwest of Iran. Osong Public Health Res Perspect, 5(4), 193-198. doi: 10.1016/j.phrp.2014.06.003 Gastroenterol Hepatol (N Y), 7(2), 88-95. Kor, S. B., Choo, Q. C., & Chew, C. H. (2013). New integron gene arrays from multiresistant clinical isolates of members of the Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa from hospitals in Malaysia. Farthing, M., Salam, M. A., Lindberg, G., Dite, P., J Med Microbiol, 62(Pt 3), 412-420. doi: Khalif, I., Salazar-Lindo, E., . . . Wgo. (2013). 10.1099/jmm.0.053645-0 Acute diarrhea in adults and children: a global perspective. J Clin Gastroenterol, 47(1), 12-20. Magiorakos, A. P., Srinivasan, A., Carey, R. B., Carmeli, Y., Falagas, M. E., Giske, C. G., . . . doi: 10.1097/MCG.0b013e31826df662 Monnet, D. L. (2012). Multidrug-resistant, Guiral, E., Mendez-Arancibia, E., Soto, S. M., extensively drug-resistant and pandrug-resistant Salvador, P., Fabrega, A., Gascon, J., & Vila, J. bacteria: an international expert proposal for interim (2011). CTX-M-15-producing enteroaggregative standard definitions for acquired resistance. Clin Escherichia coli as cause of travelers' diarrhea. Microbiol Infect, 18(3), 268-281. doi: Emerg Infect Dis, 17(10), 1950-1953. doi: 10.1111/j.1469-0691.2011.03570.x 10.3201/eid1710.110022 Meng, C. Y., Smith, B. L., Bodhidatta, L., Richard, Heir, E., Lindstedt, B. A., Leegaard, T. M., Gjernes, S. A., Vansith, K., Thy, B., . . . Mason, C. J. E., & Kapperud, G. (2004). Prevalence and (2011). Etiology of diarrhea in young children and characterization of integrons in blood culture patterns of antibiotic resistance in Cambodia. Pediatr Enterobacteriaceae and gastrointestinal Escherichia Infect Dis J, 30(4), 331-335. doi: 10.1097/INF. coli in Norway and reporting of a novel class 1 0b013e3181fb6f82 integron-located lincosamide resistance gene. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 3, 12. doi: 10.1186/ Mosquito, S., Ruiz, J., Pons, M. J., Durand, D., Barletta, F., & Ochoa, T. J. (2012). Molecular 1476-0711-3-12 mechanisms of antibiotic resistance in diarrhoeagenic Kalantar, E., Soheili, F., Salimi, H., & Soltan Dallal, Escherichia coli isolated from children. Int J M. M. (2011). Frequency, antimicrobial susceptibility Antimicrob Agents, 40(6), 544-548. doi: and plasmid profiles of Escherichia coli pathotypes 10.1016/j.ijantimicag.2012.07.021 obtained from children with acute diarrhea. Ng, L. K., Mulvey, M. R., Martin, I., Peters, G. A., Jundishapur J Microbiol, 4(1), 23-28. & Johnson, W. (1999). Genetic characterization of Kargar, M., Mohammadalipour, Z., Doosti, A., antimicrobial resistance in Canadian isolates of Lorzadeh, S., & Japoni-Nejad, A. (2014). High Salmonella serovar Typhimurium DT104. Prevalence of Class 1 to 3 Integrons Among Diemert, D. J. (2006). Prevention and selftreatment of traveler's diarrhea. Clin Microbiol Rev, 19(3), 583-594. doi: 10.1128/CMR.00052-05

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Antimicrob Agents Chemother, 43(12), 30183021.

human stools. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 39(2), 279-287.

Nguyen, T. V., Le, P. V., Le, C. H., & Weintraub, A. (2005). Antibiotic resistance in diarrheagenic Escherichia coli and Shigella strains isolated from children in Hanoi, Vietnam. Antimicrob Agents Chemother, 49(2), 816-819. doi: 10.1128/AAC. 49.2.816-819.2005

Stalder, T., Barraud, O., Casellas, M., Dagot, C., & Ploy, M. C. (2012). Integron involvement in environmental spread of antibiotic resistance. Front Microbiol, 3, 119. doi: 0.3389/fmicb. 2012.00119

Tadesse, D. A., Zhao, S., Tong, E., Ayers, S., Singh, A., Bartholomew, M. J., & McDermott, P. F. Phongpaichit, S., Tunyapanit, W., & Pruekprasert, P. (2012). Antimicrobial drug resistance in Escherichia (2011). Antimicrobial resistance, class 1 integrons coli from humans and food animals, United States, and extended-spectrum B-lactamases in Escherichia 1950-2002. Emerg Infect Dis, 18(5), 741-749. coli clinical isolates from patients in South Thailand doi: 10.3201/eid1805.111153 Journal of Health Science, 57(3), 281-288. Yu, G., Li, Y., Liu, X., Zhao, X., & Li, Y. Phongpaichit, S., Wuttananupan, K., & Samasanti, (2013). Role of integrons in antimicrobial W. (2008). Class 1 integrons and multidrug resistance: A review. African Journal of resistance among Escherichia coli isolates from Microbiology Research, 7(15), 1301-1310. doi: 10.5897/AJMR11.1568

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Influence of Polyvinylpyrrolidone K30 on The Complexation of Tetrahydrocurcumin with Hydroxypropyl β-Cyclodextrin Srikanya Thongyaia*, Nattha Kaewnopparatb and Sarunyoo Songkroc a

Student in Master degree, Cosmetic Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Prince of Songkla University, Hat-Yai, Songkhla, Thailand, 90112. b Associate Professor, Drug Delivery System Excellence Center, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Prince of Songkla University. Hat-Yai, Songkhla, Thailand, 90112. c Assistant Professor, Drug Delivery System Excellence Center, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Prince of Songkla University. Hat-Yai, Songkhla, Thailand, 90112. * Corresponding author. E-mail address: srikanya_thongyai@hotmail.com Abstract Tetrahydrocurcumin (THC) is a polyphenolic compound which exhibits strong antioxidant and tyrosinase inhibition activities. The use of THC in cosmetic or pharmaceutical formulations is limited because THC is slightly soluble in water. Ternary complexes consist of drug-cyclodextrin and polymer as ternary component can enhance drug solubility. The objective of this present study was to evaluate the potential synergistic effect of a ternary component, polyvinylpyrrolidone K30 (PVP K30), on the solubility and physicochemical properties of THC-hydroxypropyl β-cyclodextrin (HPβCD) inclusion complex. Phase solubility analysis was used to investigate the interaction of THC in both binary (THC-HPβCD) and ternary systems (THCHPβCD-PVP K30). The phase solubility curves were classified as A L-type with indicated a stoichiometry of 1:1 molar ratio between THC and HPβCD. By adding the PVP K30 (ternary system), the stability constant was enhanced. The binary and ternary inclusion complexes in 1:1 molar ratio were prepared by kneading and coevaporation methods. The solubility of THC from both systems was determined and the physicochemical properties were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), differential scanning calorimetry (DSC) and powder X-ray diffractometry (PXRD) compared with pure THC and their corresponding physical mixtures. The results revealed that the solubility of THC in ternary systems was significantly greater than binary complexes, physical mixtures and pure THC. Ternary inclusion complex prepared by coevaporation method was found to be most effective in increasing the THC solubility. From FTIR, DSC and PXRD studies, the binary and ternary coevaporated samples gave THC in amorphous state and stronger complex formation than that of kneaded samples and physical mixtures. Keywords: Tetrahydrocurcumin, Hydroxypropyl β-cyclodextrin, polyvinylpyrrolidone K30, Complexation, Solubility

Introduction Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides containing 6, 7 or 8 D-(+) glucopyranose units attached by α-(1, 4) glucosidic bonds. CDs consist of hydrophilic outer surface and a hydrophobic central cavity which inner cavity of hydrophobic CDs forms non covalent inclusion complexes with a large variety of guest molecules while the hydrophilic exterior enhances CDs solubility in water (Chowdary

& Srinivas, 2006; Dos Santos et al., 2011). In general, CDs has been widely used in pharmaceutical filed to improve physicochemical properties of drugs, able to reduce their irritancy and toxicity (Jullian et al., 2008). Nevertheless, application of CDs is limited by its rather low aqueous solubility. Therefore, many chemical modified CDs such as 2-hydroxylpropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), methylated-β-cyclodextrin has been developed to counter the solubility limits and safety concerns of

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

the parent CDs. HPβCD is a hydroxyalkyl derivative of β-cyclodextrin. It is higher water solubility and safety than β-cyclodextrin. Complexation with HPβCD dramatically increased the aqueous solubility of many poorly water soluble compounds (Chowdary & Srinivas, 2006; Lavecchia & Zuorro, 2009). THC is a phenolic compound which exhibited strong antioxidative activity (Nakamura et al., 1998; Khopde et al., 2000). It possesses a wide range of pharmacological and biological activities (Okada et al., 2001), including anti-inflammatory, antiviral, antimicrobial and anticancer. It is used in cosmetic preparations as antioxidant and skin lightening agent because of efficiently inhibit tyrosinase enzyme. THC is slightly soluble in water which appears to be limiting factor in formulation development especially in water-based formulations or hydrogels that suitable for oily or acne-prone skin. To overcome this problem, increasing THC solubility is needed. It has been reported that the combination of cyclodextrin and hydrophilic polymers such as PVP K30, hydroxypropyl methylcellulose can significantly enhance cyclodextrin complexation and increase drug solubility. To our literature reviews, there is no report available about the effect of addition of PVP K30 on HPβCD solubilization of THC. The purpose of the present study was attempted to enhance the THC solubility by preparing ternary complex consisted of THC-HPβCD-PVP K30. The binary and ternary inclusion complexes were prepared by kneading and coevaporation methods. The influence of PVP K30 on THC solubility was determined and the physicochemical properties were characterized by DSC and PXRD compared with physical mixtures and pure THC.

Materials and Methods Experimental Materials Tetrahydrocurcumin was purchased from Sabinsa Corporation (Missouri, USA). HPβCD, degree of substitution per anhydroglucose unit about 0.6, was kindly provided by Wacker-chemie GmbH (Munich, Germany). PVP K30 by BASF (Bangkok, Thailand). Absolute ethanol by RIC Labscan Limited (Bangkok, Thailand). Other chemicals and solvents used in this study were of analytical reagent grade. Phase solubility study Phase-solubility studies were performed according to the method described by Higuchi and Connors (Higuchi & Connors, 1965). Briefly, excess amount of THC (10 mg) was added to 10 ml of aqueous solutions containing various concentrations of HPβCD (0-40 mM) with and without 2.5%w/v of PVP K30. The contents were shaken in shaking water bath at 32±0.5°C until equilibrium (48 hours). Then, the dispersions were filtered through 0.45 µm membrane filter and properly diluted with distilled water. The concentration of THC was determined by spectrophotometer at 282 nm. Each experiment was carried out in triplicate. The phase-solubility diagrams were obtained by plotting between the solubility and concentrations of HPβCD with and without adding PVP K30 concentrations. Preparation of solid inclusion complexes Inclusion complexes of THC-HPβCD were prepared in molar ratio of 1:1 by kneading and coevaporation methods in the absence and presence of 2.5%w/w of PVP K30.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Physical mixtures Physical mixtures were prepared by simple mixing THC and HPβCD in molar ratio of 1:1 in the absence and presence of 2.5%w/w of PVP K30 for 3 minutes. Kneading method HPβCD with and without adding PVP K30 were triturated in a mortar with a small volume of distilled water. Then, THC was slowly added while grinding. The slurry formed was kneaded for 1 hour and then dried at 50°C for 2 h. The dried complexes were then powdered and stored in airtight containers, protected from light until use. Coevaporation method THC and HPβCD with and without adding PVP K30 were dissolved in absolute ethanol. The solvent was evaporated by rotary evaporation at 50°C. Then, the inclusion complexes were kept in vacuum oven until dry. The dried complexes were then powdered and stored in airtight containers, protected from light until use. Aqueous solubility study The solubility of THC, physical mixtures and the inclusion complexes were determined in distilled water. Each sample (10 mg) was added in 10 ml of the distilled water. The samples were kept at equilibrium for a period of 48 hours in shaking water bath at 32 ± 0.5°C. Then, the contents were filtered through 0.45 µm membrane filter and analyzed by UV spectrophotometer at 282 nm. The experiment was carried out in triplicate. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) Infrared spectra of samples were carried out using a FTIR spectrometer (Spectrum One, PerkinElmer, United Kingdom). The procedure consisted of grinding the sample with potassium bromide (KBr) into a fine powder, then placing into a pellet-forming

die and compressing the powder using a compressing gauge. The scanning range was 400-4000 cm-1. Differential scanning calorimetry Differential scanning calorimetry (DSC) was performed using a differential scanning calorimeter (DSC-8000, PerkinElmer). Samples (3-5 mg) were sealed into aluminum pans and hermetically sealed. The scanning rate was 10˚C/min, and the scanning temperature range was between 30˚C to 150˚C under a nitrogen gas flow of 20 ml/min. Powder X-ray diffractometry (PXRD) Powder X-ray diffractograms were recorded using Powder X-ray diffractometer (Philips X’Pert MPD, Netherlands) with tube anode Cu over the interval 560°/2 with a scan speed of 3/min and a step size of 0.01. Statistical analysis The solubility data were expressed as means ± standard deviation (SD). The statistical comparison was performed using Student’s t-test or one-way analysis of variance (ANOVA). Differences were considered statistically significant at p < 0.05. Results and Discussion The phase solubility diagrams of THC in various concentrations of HPβCD with and without 1.5%w/v of PVP K30 are shown in Figure 1. It has been observed that the solubility of THC was increased linearly as a function of HPβCD concentrations in range of 0-40 mM and can be classified as AL type according to Higuchi and Connors (1965). Because the slope of the straight lines are lower than one in each case, the increase in solubility was due to the formation of a 1:1 M complex in solution with HPβCD in the presence and absence of PVP K30. The apparent stability constant

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

(Ks) was calculated from the slope and intercept of straight line of the phase solubility diagram according to equation Ks = slope / Intercept (1- slope), where the intercept is the intrinsic solubility of THC in the absence of HPβCD. The estimated Ks values of inclusion complexes of THC-HPβCD in the presence of PVP K30 was 514 M-1 while Ks value of THCHPβCD in the absence of PVP K30 was 455 M-1. These values are within the range of 200–5,000 M-1 indicated that complex formation of THC and HPβCD with and without PVP K30 are quite stable

and capable of improving the solubility and stability of THC (Sapkal et al., 2010). The higher value of Ks indicated that the ternary system was more stable than binary system. The addition of PVP K30 enhanced only the Ks but did not show any change in type of phase solubility diagram. A synergistic effect on THC solubility observed in presence of PVP K30 may be due to the hydrophilic property of PVP K30 which was capable of increasing THC wettability and the formation of hydrogen bonding between THC and PVP K30.

Figure 1 Phase solubility diagrams of THC in HPβCD solutions with and without adding PVP K30.

The water solubility of pure THC, physical mixtures and inclusion complexes at 32±0.5°C are shown in Table 1 The solubility of THC from physical mixtures and all inclusion complexes are significantly higher (p<0.05) than pure THC (23.27 µg/ml). The solubility of THC from binary physical mixture (PM), ternary physical mixture (PM_PVP) was increased about 1.7 folds compared with pure THC while solubility of THC from binary kneaded (KN), ternary kneaded (KN_PVP), binary coevaporated (CO) and ternary coevaporated (CO_PVP) samples were increased in 2.4, 2.8, 2.9 and 4.9 folds, respectively, compared with pure

THC. The ternary coevaporated sample gave the highest solubility of THC and significantly higher (p<0.05) solubility than other samples. The enhanced in THC solubility especially with addition of PVP K30 could be attributed to weak polymerdrug interaction such as hydrogen bonding (Patel & Vavia, 2006). In addition, amorphous state which obtained only in both binary and ternary coevaporated samples was responsible for increase solubility of THC. According to the solubility data, it can be concluded that PVP K30 and HPBCD exhibited synergistic effect in improving of THC solubility.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Table 1 Water solubility of THC, physical mixtures, kneaded and coevaporated samples at 32 ± 0.5°C Samples Solubility (µg/ml)* 23.27 ± 0.51 THC 39.38 ± 1.33 PM 41.99 ± 1.61 PM_PVP 55.70 ± 3.51 KN 65.07 ± 3.92 KN_PVP 67.06 ± 3.08 CO 113.30 ± 3.08 CO_PVP *mean ± SD (n = 3)

The FTIR spectra of pure THC, physical mixtures, kneaded and coevaporated samples are given in Figure 2 Pure THC is showing peaks at 3414 cm-1 (aromatic and aliphatic-CH stretching vibration), 1614 and 1602 cm-1 (C=Cring), 1515 cm-1 (C-H in aromatic ring), 1277 cm-1 (stretching vibrations of enolic C-O), 1155 and 1114 cm-1 (C-O-C stretching vibration), 1032 cm-1 (C-O-H stretching vibration), etc. There were not presence of any peaks in the region of 1650-1800 cm-1, carbonyl group (C=O) region (Mohan et al., 2012), indicated that THC still presence in the keto-enol tautomeric form (Pan et al., 1998). The FTIR spectrum of HPβCD exhibited absorption bands at 3402 cm-1 (OH), 1084 cm-1 (C-O), 2929 cm-1 (C-H). The H-O-H deformation bands of water present in cyclodextrins are shown at 1650 cm-1. Absorption band in the region of 1300–700 cm-1 assigned to skeletal C-C vibrations and that at 1156 cm-1 refer to C-O-C vibrations. The FTIR spectrum of PVP K30 exhibited characteristic peaks at 2955 cm-1 (C-H stretching vibration), 1662 cm-1 (C=O stretching vibration) and 1463 cm-1 (N-H band). A very broad peak was also visible at 3436 cm-1 that was attributed to the presence of water (Sammour

et al., 2006). The binary system and ternary system of THC-HPβCD complexation, namely physical mixtures and kneaded sample with and without PVP K30 (PM, PM_PVP, KN, KN_PVP), THC still presence in the keto-enol tautomeric form. These FTIR spectrums was summation of THC and HPβCD spectra, and the intense peak of THC located at 3414 cm-1 (O-H groups) was shifted to the lower frequency. These results may be due to the intermolecular hydrogen bonding between THC and HPβCD or this band was hidden from the board OH peak of HPβCD. The low intensity of the absorption peaks at 1616 and 1602 cm-1 for physical mixtures, kneaded sample and coevaporated sample assumed the aromatic ring (C=Cring) of THC might be entrapped inside the hydrophobic cavity of HPβCD, while the other part may remain outside of the HPβCD. However, the stretching vibration of ketone (C=O) groups were observed in coevaporated sample both of binary and ternary system. This result indicated the formation of intermolecular hydrogen bonding between ketone group and hydroxyl group of HPβCD.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Figure 2 The FTIR spectrum of THC, HPβCD, binary and ternary physical mixtures (PM, PM_PVP), binary and ternary kneaded samples (KN, KN_PVP) and binary and ternary coevaporated samples (CO, CO_PVP).

In this study, DSC is used to characterize interaction between THC-HPβCD inclusion complexes in the presence and absence PVP K30. The DSC thermograms of THC, physical mixtures, kneaded and coevaporated samples are shown in Figure 3 The DSC thermogram of THC showed a single sharp endothermic peak at 99.8°C, corresponding to its melting point while HPβCD showed a very broad endotherm in the temperature range of study. The DSC thermograms of physical mixtures and kneaded samples showed the melting endothermic peaks which shifted to lower

temperature, indicating the interaction between THC and polymer in physical mixtures and kneaded samples but THC from these samples remained in crystalline form. On the other hand, the completely disappeared of endothermic peak of THC in binary and ternary coevaporated samples was observed, indicating the change of crystalline form to amorphous form and a strong interaction between THC and polymer. This result may indicate molecular encapsulation of THC inside the HPβCD cavities (Chowdary & Srinivas, 2006).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Figure 3 The DSC thermograms of THC, HPβCD, binary and ternary physical mixtures (PM, PM_PVP), binary and ternary kneaded samples (KN, KN_PVP) and binary and ternary coevaporated samples (CO, CO_PVP).

Powder X-ray diffractograms of THC, HPβCD, physical mixtures and inclusion complexes are illustrated in Figure 4 The complete absence of any diffraction peaks in PXRD diffractogram of HPβCD, indicating its amorphous nature. THC exhibited several diffraction peaks revealing its crystalline nature. Some diffraction peaks due to THC crystals are still detectable in physical mixtures and kneaded

samples. On the other hand, all of THC diffraction peaks are completely disappeared in the diffractograms of coevaporated samples. These findings demonstrated that the amorphous inclusion complexes are formed in both binary and ternary inclusion complexes. The results can be verified by DSC analysis.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Figure 4 Powder X-ray diffractograms of THC, binary and ternary physical mixtures (PM, PM_PVP), binary and ternary kneaded samples (KN, KN_PVP) and binary and ternary coevaporated samples (CO, CO_PVP).

Conclusions

Acknowledgements

The solubility of THC was increased as the function of HPÎ˛CD concentration in range of 0-40 mM in the presence and absence of PVP K30 and classified as AL-type phase solubility diagrams. THC is able to from more stable inclusion complex with HPÎ˛CD in the presence of PVP K30. The ternary inclusion complex prepared by coevaporation method demonstrated a superior water solubility of THC. In conclusion, the ternary system of THC and PVP K30 is a promising alternative for increasing the aqueous solubility of THC that lead to be valuable application in pharmaceutical and cosmetic formulations especially water-based formulations and hydrogels.

The authors are grateful to Faculty of Pharmaceutical Sciences and Prince of Songkla University, Thailand for financial support. Special thanks to all staff of Faculty of Pharmaceutical Sciences for contributions of facilities throughout this study. References Chowdary, K. P. R., & Srinivas, S. V. (2006). Influence of hydrophilic polymers on celecoxib complexation with hydroxypropyl beta-cyclodextrin. AAPS PharmSciTech, 7, 79.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Dos Santos, C., Buera, M. del P., & Mazzobre, M. F. (2011). Phase solubility studies of terpineol with β-cyclodextrins and stability of the freeze-dried inclusion complex. Procedia Food Science, 1, 355– 362. Higuchi, T., & Connors, K.A. (1965). Phase Solubility Techniques. Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation, 4, 117-212.

in leukocytes in vitro and in vivo. Japanese Journal of Cancer Research, 89, 361–370. Okada, K., Wangpoengtrakul, C., Tanaka, T., Toyokuni, S., Uchida, K., & Osawa, T. (2001). Curcumin and especially tetrahydrocurcumin ameliorate oxidative stress-induced renal injury in mice. The Journal of Nutrition, 131, 2090–2095.

Pan, M. H., Huang, T. M., & Lin, J. K. (1998). Hirlekar, R. S., Sonawane, S. N., & Kadam, V. J. Biotransformation of curcumin through reduction and (2009). Studies on the Effect of Water-Soluble glucuronidation in mice. The American Society for Polymers on Drug–Cyclodextrin Complex Solubility. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 27, 486-494. AAPS PharmSciTech, 10, 858–863. Jullian, C., Morales-Montecinos, J., Zapata-Torres, G., Aguilera, B., Rodriguez, J., Arán, V., & OleaAzar, C. (2008). Characterization, phase-solubility, and molecular modeling of inclusion complex of 5nitroindazole derivative with cyclodextrins. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16, 5078– 5084. Khopde, S. M., Priyadarsini, K. I., Guha, S. N., Satav, J. G., Venkatesan, P., & Rao, M. N. (2000). Inhibition of radiation-induced lipid peroxidation by tetrahydrocurcumin: possible mechanisms by pulse radiolysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 64, 503–509. Lavecchia, R., & Zuorro, A. (2009). Experimental study of the inclusion of triclosan in hydroxypropylβ-cyclodextrins. Chemical Engineering Transactions, 17, 1083–1087. Nakamura, Y., Ohto, Y., Murakami, A., Osawa, T., & Ohigashi, H. (1998). Inhibitory effects of curcumin and tetrahydrocurcuminoids on the tumor promoter-induced reactive oxygen species generation

Patel, A. R., & Vavia, P. R. (2006). Effect of hydrophilic polymer on solubilization of fenofibrate by cyclodextrin complexation. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 56, 247– 251. Sammour, O. A., Hammad, M. A., Megrab, N. A., & Zidan, A. S. (2006). Formulation and optimization of mouth dissolve tablets containing rofecoxib solid dispersion. AAPS PharmSciTech, 7, E1-E9. Sapkal, N. P., Kilor, V. A., Shewale, B. D., Bhusari, K. P., & Daud, A. S. (2010). Study of the Complexation Behaviour of Fexofenadine with βCyclodextrin. Indian J Pharm Sci, 72, 318–323. Savolainen, J., Järvinen, K., Taipale, H., Jarho, P., Loftsson, T., & Järvinen, T. (1998). Coadministration of a water-soluble polymer increases the usefulness of cyclodextrins in solid oral dosage forms. Pharmaceutical Research, 15, 1696–1701.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Improvement of Symmetrical Gait Index in People with Chronic Stroke Chatwalai Sonthikula, Sunee Bovonsunthonchaib*, Jarugool Tretriluxanab and Tipwadee Bunprajanb a

Master student of the Faculty of Physical Therapy, Mahidol University, Nakhon Phatom, Thailand Faculty of Physical Therapy, Mahidol University, Nakhon Phatom, Thailand * Corresponding author. E-mail address: sunee.bov@mahidol.ac.th Abstract Objective: To compare the effect of the forward and the backward partial body weight support (PBWS) treadmill training on gait symmetrical index (SI) in people with chronic stroke. Methods: Twenty people with chronic stroke were allocated into two groups; the forward (n = 10) and the backward (n = 10) PBWS treadmill training groups. Participants in both groups were matched by age range and severity score assessing by the Brunnstrom stage. They received the training program for 80 minutes over at least 2 sessions per week for 12 sessions. The program consisted of 60 minutes of the conventional physical therapy treatment and 20 minutes of the treadmill training (backward or forward). Gait SI variables were assessed and were compared within and between groups. Results: For within group comparisons, the forward PBWS treadmill training showed significant differences of the step length symmetry (p-value = 0.009) and the single support time symmetry (p-value = 0.037) between pre- and post-training. Whereas, no significant difference of any gait SI variables was found between pre- and post-training in the backward PBWS treadmill training group. In between groups comparison, participants in the forward PBWS treadmill training group showed greater walking improvement than those of the backward PBWS treadmill training group in step length symmetry (pvalue=0.019). While, participants in the backward PBWS treadmill training group showed greater improvement than those of the forward PBWS treadmill training group in the step time symmetry (p-value = 0.049). Conclusions: After 12 sessions of training, the forward PBWS treadmill training group showed significant improvement in the step length symmetry and the single support time symmetry. Whereas, the backward PBWS treadmill training group show no significant improvement in all gait SI. When compare difference between groups, the forward PBWS treadmill training group showed greater improvement than those of the backward PBWS treadmill training group in the step length symmetry. Whereas, the backward PBWS treadmill training group showed greater improvement than those of the forward PBWS treadmill training group in the step time symmetry. b

Keywords: Stroke, Forward walking, Backward walking, Treadmill training with partial body weight support, Gait asymmetry

Introduction Although 60-85% of people with stroke can walk independently after 6 months of post stroke but the recovery expressed with a wide range of walking deviated pattern (Wade, Wood, Heller, Maggs, & Langton Hewer, 1987, pp. 25-30). One of common waking deviations in people with stroke is gait asymmetry. It exhibited with 55.5% of temporal asymmetry and 33.3% of spatial asymmetry (Patterson et al., 2008, pp. 304-310). People with

stroke preferred to bear their weight on the unaffected limb more than the affected limb when compared with the healthy persons. This led the affected limb had shorter stance time than that of the un-affected limb. Gait asymmetry also lead to the increased energy expenditure and risk of falls. Consequently, improvement in gait symmetry is play as the important clinical marker of rehabilitation recovery as it is associated with better motor functioning and functional independence (Yavuzer, 2006).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Several treatments have recommended to improve symmetrical gait pattern such as facilitation of weight bearing by therapists (Hesse et al., 1998, pp. 515522), verbal and visual feedbacks of individualsâ&#x20AC;&#x2122; weight distribution (Van Peppen, Kortsmit, Lindeman, & Kwakkel, 2006), and musical motor feedback (Schauer & Mauritz, 2003, pp. 713722). Besides, treadmill training is one of the recommended treatment techniques to restore gait symmetry. It is an effective method to achieve more symmetrical gait pattern and improve gait performance in people with stroke (Ivey, HaferMacko, & Macko, 2008, pp. 249-259). Specifically, it facilitates weight bearing on the affected limb, resulting in improved motor control, providing an opportunity to improve symmetry (Beauchamp et al., 2009, pp. 154-160). Other advantages of the treadmill training together with the partial body weight support (PBWS) usage is increased confidence during individuals performed walking function (Carr & Shepherd, 2010). Backward walking training is a recently challenging task in people with stroke. It facilitates neuromuscular function (Chaloupka, Kang, Mastrangelo, & Donnelly, 1997, pp. 302-306), muscle strength (Chewwasung, Boonsinsukh, Bannarat, Thumpapong, & Meesukh, 2011, pp. 1016), and balance (Weng et al., 2006, pp. 26352638). Furthermore, it has been recommended as the treatment strategy to improve forward walking function (Yang, Yen, Wang, Yen, & Lieu, 2005, pp. 264-273). Previous studies reported that the backward walking training enhanced gait performances as shown by improvement in the affected step length (Kim, Lee, & Lee, 2014, pp. 1923-1927), stride length (Takami & Wakayama, 2010, pp. 177-187; Yang et al., 2005, pp. 264-273), cadence (Takami & Wakayama, 2010, pp. 177-187; Yang et al.,

2005, pp. 264-273), affected step time (Kim et al., 2014, pp. 1923-1927), gait cycle (Yang et al., 2005, pp. 264-273), walking velocity (Takami & Wakayama, 2010, pp. 177-187; Yang et al., 2005, pp. 264-273), symmetrical index (SI) (Kim et al., 2014, pp. 1923-1927; Yang et al., 2005, pp. 264-273), Berg Balance Scale (Takami & Wakayama, 2010, pp. 177-187) and Rivermead Mobility Index score (Takami & Wakayama, 2010, pp. 177-187), However, very limited information about the effect of training between the forward and backward PBWS treadmill training (Kim et al., 2014, pp. 1923-1927). Hence, the present study aimed to compare the effect between the forward and the backward PBWS treadmill training on gait SI in people with chronic stroke. Materials and Methods Participants Twenty people with chronic stroke were recruited from Physical Therapy Center, Faculty of Physical Therapy, Mahidol University, Bangkok, Thailand between January and August 2015. Participants were included if they fulfilled the following 7 criteria; 1) first stroke onset more than 12 months, 2) age range between 40 to 80 years old, 3) unilateral motor and/ or sensory deficits 4) lower limb motor function assessed by the Brunnstrom motor recovery stage from 2 to 5, 5) ability to independently walk 6 m with or without using gait aids or orthoses with a time of 35 seconds or lesser, 6) did not having cognitive impairment assessed by the Mini Mental State Examination-Thai (MMSE-Thai) score > 23, and 7) able to follow all testing procedures and intervention program. Participants were excluded if they had any of the following 2 conditions; 1) unstable medical condition and 2) having other neurological, cardiopulmonary, and lower limb

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

musculoskeletal problems which might affect testing or training. All participants were allocated into either the forward (n=10) or the backward (n=10) PBWS treadmill training groups. Both groups were individually matched by age range and motor recovery by the Brunnstrom score. This study was approved by the Mahidol University Central Institutional Review Board (COA.No. 2014/160. 1112). All participants received a written description and signed the informed consent prior to participate in the study. Assessment All participants were assessed and trained at the Neurological Clinic, Physical Therapy center, Mahidol University. The assessments were investigated at pre- and post-training. The participants were tested on a force distribution measurement platform (The zebris FDM-System – Gait Analysis, 1243020-0015-0816, Allgãu, Germany) with 100 Hz sampling frequency and synchronized with one video camera. The participants were instructed to walk with comfortable walking velocity. Four steps in three successful walking trials were recorded for calculating the mean score of spatiotemporal parameters. They included step length (m), step time (s), single support time (s), stance phase (%gait cycle), and swing phase (%gait cycle) were documented for the affected and un-affected limbs. The spatiotemporal parameters were calculated to obtain the absolute data of gait SI of the variables (X) with the following equation; SI of X = (l Xunaffected – Xaffected l /0.5(Xun-affected + Xaffected))x100 (Blazkiewicz, Wiszomirska, & Wit, 2014, pp. 2935); where X referred to any spatiotemporal variables. Values of gait SI can be ranged from 0200. Zero value indicated a perfectly symmetrical gait pattern. While the greater SI value, the greater asymmetrical gait pattern was presented.

Intervention Participants in both groups received intervention program for 80 minutes over at least 2 sessions per week for 12 sessions. The intervention program consisted of 60 minutes of conventional physical therapy training and 20 minutes of the treadmill training with PBWS (forward or backward). The physiotherapy program was individual’s specific and consisted of strengthening, proprioceptive neuromuscular facilitation, function and mobility training, and gait training. For the treadmill training, it was started with a low load and progressed the difficulty by increase treadmill velocity. For the firstthree sessions of training, gait speed was set at 25% of individual comfortable walking velocity performance. Velocity was increased 5% in every 3 sessions of training as summarized below; - 1st to 3rd sessions: 25% of individual comfortable walking velocity - 4th to the 6th sessions: 30% of individual comfortable walking velocity - 7thto the 9th sessions: 35% of individual comfortable walking velocity - 10thto the 12th sessions: 40% of individual comfortable walking velocity The participants’ comfortable walking velocity at baseline ranged from 0.23 to 0.82 m/s and ranged from 0.19 to 0.82 m/s for the forward group and the backward group, respectively. There was no significant difference of the comfortable walking velocity between two groups. For the forward group, the treadmill training’ velocities were started at the ranged from 0.06 to 0.21 m/s and ended at the ranged from 0.09 to 0.33 m/s. For the backward group, it started at the ranged from 0.05 to 0.21 m/s and ended at the ranged from 0.08 to 0.33 m/s. During training, they were allowed to use abled their hands for support as needed. Two physical therapists provided assistance to move the

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

participant's limb in the correct pattern. The amount of body weight support was fixed at 30% of individual body weight and treadmill inclination was set at 00in all sessions. During treadmill training, participants were asked about their rate of perceived exertion (RPE) by therapist and were investigated heart rate and blood pressure at every 10 minutes. All intervention sessions were performed by qualified and experienced physical therapists. Treadmill training and other interventions were stopped if participants demonstrated the following conditions;1) systolic blood pressure (SBP) >160 mmHg and diastolic blood pressure (DBP) >110 mmHg for intracerebral hemorrhage individuals and SBP >200 mmHg and DBP >110 mmHg for ischemic stroke individuals, 2) mean blood pressure increased by 30 mmHg or decreased by 20 mmHg, 3) heart rate >110 beats/min at rest or increased 30%, and 4) rating perceived exertion >15scores from a full score of 20. Data analysis Based on the sample size calculation from our pilot study with the number of participants of five, the number of participants for each group was at least nine participants. Thus, a total of ten participants was used for the comparisons in the study. However, the number of participants of the study was small, the non-parametric statistics was used to compare the variables within and between groups. Continuous data were given as median and IQR (ranged from the 25th to the 75th percentile). While, the discrete data were given as counts and percentages. The MannWhitney U test and chi-square test were used to compare demographic and clinical characteristics between groups. Comparisons between pre- and post-training gait SI data within each group were analyzed by using the Wilcoxon Signed-Rank test. In order to investigate the effectiveness of whether the

backward or the forward PBWS treadmill training was superior, the different values (subtracting of the data between pre- and post-training) were compared by using the Mann-Whitney U test. All statistical analyses were analyzed using the SPSS statistical package version 19 for windows. Statistically significant for all analyses were set at p-value <0.05. Results Demographics and clinical characteristics of the forward and backward PBWS treadmill training groups are presented in Table1. Results show median and interquartile range for age and the stroke onset and show frequency count and percentage for gender, affected limb, and Brunnstrom stage of the lower limb. There was no significant difference in any variables between two groups. Table 2 present comparisons of gait SI data between pre- and post-training in each group. The forward PBWS treadmill training group demonstrated partial improvement between pre- and post-training in the step length symmetry (p = 0.009) and the single support time symmetry (p = 0.037). While, there was no significant improvement (p > 0.05) in all gait SI variable between pre- and post-training in the backward PBWS treadmill training group. Table 3 present comparisons of the gait SI between the forward and backward PBWS treadmill training groups. Results demonstrated significant differences of the step length symmetry (p = 0.019) and the step time symmetry (p = 0.049) between two groups. Whereas, no significant differences were found in the single support time symmetry (p = 0.821), stance phase symmetry (p = 0.496), and swing phase symmetry (p = 0.650).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Table 1 Demographic and clinical characteristics for both groups Forward PBWS treadmill Variables training group (n=10) Age (years)a 58.50 (53.50, 63.25) a

Onset (months) 43.00 (24.25, 58.25) b Gender Male 9 (90%) Female 1(10%) Affected limbb Left 5 (50%) Right 5 (50%) Brunnstrom stage of the lower limbb Stage 3 2 (20%) Stage 4 4 (40%) Stage 5 4 (40%) a Median (first to third quartile), tested by the Mann-Whitney U test b Tested by the chi-square test (Ď&#x2021;Â˛)

Backward PBWS treadmill Training group (n=10) 61.50 (56.00, 67.25) 30.00 (17.50, 60.25)

p-value 0.404 0.910

8 (80%) 2(20%)

0.545

6 (60%) 4 (40%)

0.655

2 (20%) 4 (40%) 4 (40%)

1.000

Table 2 Comparisons of gait SI between pre- and post-training in the forward and the backward PBWS treadmill training groups Forward PBWS treadmill training group Backward PBWS treadmill training group Gait SI Pre-training Post-training p-value Pre-training Post-training p-value Step length 33.74 14.06 10.10 11.63 0.009** 0.799 symmetry (19.55,57.55) (5.21,39.08) (1.80,26.05) (4.72,19.03) Step time 23.34 35.35 28.93 21.11 0.508 0.114 symmetry (13.67,47.12) (16.88,49.02) (13.33,38.32) (6.36,39.04) Single support time 60.25 47.25 29.52 26.66 0.037* 0.074 symmetry (33.34,66.72) (36.92,58.31) (19.65,59.79) (4.08,43.73) Stance phase 21.91 15.71 13.44 10.40 0.169 0.169 symmetry (10.87,27.14) (7.04,26.43) (9.04,18.29) (4.02,19.82) Swing phase 57.42 59.26 45.75 29.55 0.799 0.139 symmetry (43.39,64.36) (36.15,66.84) (13.21,64.43) (11.37,45.11) Median (first to third quartile), *p<0.05, **p<0.01 tested by the Wilcoxon Signed-Rank test Table 3 Comparisons of different values of gait SI between the forward and the backward PBWS treadmill training groups Forward PBWS treadmill training Backward PBWS treadmill training p-value Gait SI group group Step length symmetry -14.42 (-21.98,-6.03) -2.64 (-9.25,8.61) 0.019* Step time symmetry

2.60 (-6.53,13.88)

-7.90 (-10.46,-0.71)

0.049*

Single support time symmetry Stance phase symmetry

-9.39 (-16.28,2.00) -1.89 (-8.54,2.06)

-9.79 (-18.59,-0.68) -4.52 (-7.48,2.88)

0.821 0.496

-11.32 (-20.63,9.50)

0.650

Swing phase symmetry 1.12 (-13.46,4.60) Median (first and third quartile), *p<0.05 tested by the Mann-Whitney U test

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

symmetry in the forward PBWS treadmill training group may improve because velocity of treadmill In this study, we examined the effect of forward training program was set at 25-40% of individualâ&#x20AC;&#x2122;s and backward PBWS treadmill training on gait SI in comfortable walking velocity. The participants had people with chronic stroke. According to the results, more time to bear their weight on the affected limb, the forward PBWS treadmill training showed this led to the increased quadriceps muscle strength significant improvement in the step length symmetry (Zaky & Hassan, 2013, pp. 413-418) and and the single support time symmetry. Comparisons confident to weight bearing on the affected limb. Although, there was no significant difference of the gait SI between two groups showed significant difference in the step length symmetry and the step improvement in all gait SI in the backward PBWS treadmill training group but there was a tendency of time symmetry. Significant improvements of the step length gait SI improvement. In contrast to the previous symmetry and the single support time symmetry was study, Yang and colleague (Yang et al., 2005, pp. found in the forward PBWS treadmill training group. 264-273) studied in 25 chronic stroke people who These result are consistent with the results of a study allocated into the experimental group that performed conducted by Pheung-phrarattanatrai and colleagues backward over ground walking training plus (Pheung-phrarattanatrai,Bovonsunthonchai, Heingkaew, conventional physical therapy and the control group Prayoonwiwat, & Chotik-anuchit, 2015, pp. 113- that only received conventional physical therapy. 118). They found that the effect of motor imagery Both groups were trained at a frequency of 3 times able to enhance step length symmetry in people with per week for 3weeks. After 3 weeks, the stroke. Kim and colleagues (Kim et al., 2014, pp. experimental group showed significance improvement 1923-1927) studied effect of training in 36 chronic in single support time SI between pre- and poststroke people. They were divided into 3 groups; the training. We think the gait SI was not improved forward and backward progressive body weight significantly in the backward PBWS treadmill supported treadmill training, the backward training group because the backward walking training progressive body weight supported treadmill training, was not a real task-oriented training. Although and the forward progressive body weight supported backward walking was near a mirror image of treadmill training groups. They found significance forward walking(Winter, Pluck, & Yang, 1989, pp. improvement of single support time SI after training 291-305) and may contribute to the improvement in all groups. However, no difference was found of the affected limb to be move easily from repetitive alternating flexion with extension of lower extremity among groups after training. Asymmetry in the step length and the single limb training (Yang et al., 2005, pp. 264-273). support is assumed to be related with a decreased However, explanation may relate with the ability to bear weight on the affected limb (Hsu, improvement of gait SI mainly be focused on the Tang, & Jan, 2003, pp. 1185-1193). Weight shift task-oriented training approach rather than on the to the affected limb is essential in walking as it movement pattern (Yavuzer, 2006). When compare the different values between two allows the un-affected limb to be moved and, consequently, a step to be taken. The individualâ&#x20AC;&#x2122;s groups, there were significant differences in the step step length symmetry and single limb support length symmetry and the step time symmetry. The Discussion

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

forward PBWS treadmill training group showed more significant improvement in the step length symmetry than the backward PBWS treadmill training group. This may come from the forward PBWS treadmill training was closely to the task-related training more than the backward PBWS treadmill training. It induced a higher activation of brain reorganization and bring to improvement of step length symmetry (Van Peppen et al., 2004, pp. 833-862). Whereas, the backward PBWS treadmill training group showed more significant improvement in the step time symmetry more than the forward PBWS treadmill training group. Many studies reported that step time asymmetry was associated with impaired joint position sense, increase plantarflex or spasticity, and decreased dorsiflex or strength (Hsu et al., 2003, pp. 1185-1193; Lin, Yang, Cheng, & Wang, 2006, pp. 562-568). The step time symmetry can be increased in the backward PBWS treadmill training group may explained by higher activation of the ankle dorsiflex or muscle during training with the backward walking when compared to the forward walking (Chewwasung et al., 2011, pp. 10-16). Furthermore, backward walking can eliminate visual cues, it required greater reliance of neuromascular control and may stimulate joint proprioceptive sense (Yang et al., 2005, pp. 264-273). The limitations of this study include the number of participants was small, no follow up was taken, and mainly measure quantities of gait performance. In addition, further study should investigate in a larger amount of participants, be assessed the long term effects, and should be considered to investigate other parameters such as muscle activity, kinematics, and kinetics.

Conclusions After 12 sessions of training, the forward PBWS treadmill training group showed significant improvement in the step length symmetry and the single support time symmetry. Whereas, the backward PBWS treadmill training group show no significant improvement in all gait SI. When compare difference between groups, the forward PBWS treadmill training group showed greater improvement than those of the backward PBWS treadmill training group in the step length symmetry. Whereas, the backward PBWS treadmill training group showed greater improvement than those of the forward PBWS treadmill training group in the step time symmetry. Acknowledgements This study is supported by the National Research Council of Thailand. References Beauchamp, M. K., Skrela, M., Southmayd, D., Trick, J., Kessel, M. V., Brunton, K., . . . McIlroy, W. E. (2009). Immediate effects of cane use on gait symmetry in individuals with subacute stroke. Physiotherapy Canada, 61, 154-160. Blazkiewicz, M., Wiszomirska, I., & Wit, A. (2014). Comparison of four methods of calculating the symmetry of spatial-temporal parameters of gait. Acta Bioeng Biomech, 16, 29-35. Carr, J. H., & Shepherd, R. B. (2010). Neurological rehabilitation: optimizing motor performance. India: Elsevier.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Chaloupka, E. C., Kang, J., Mastrangelo, M. A., & Donnelly, M. S. (1997). Cardiorespiratory and metabolic responses during forward and backward walking. Journal of Orthopaedic & Sports Physical Therapy, 25, 302-306.

Lin, P. Y., Yang, Y. R., Cheng, S. J., & Wang, R. Y. (2006). The relation between ankle impairments and gait velocity and symmetry in people with stroke. Arch Phys Med Rehabil, 87, 562-568. Patterson, K. K., Parafianowicz, I., Danells, C. J., Closson, V., Verrier, M. C., Staines, W. R., . . . McIlroy, W. E. (2008). Gait asymmetry in community-ambulating stroke survivors. Arch Phys Med Rehabil, 89, 304-310.

Chewwasung, C., Boonsinsukh, R., Bannarat, S., Thumpapong, K., & Meesukh, P. (2011). Comparison of Vastus medialis, Semitendinosus, Tibialis anterior, Peroneus longus and Gastrocnemius muscle activities between forward and backward walking. Thai Journal of Physical Therapy, 33, 10-16. Pheung-phrarattanatrai, A., Bovonsunthonchai, S., Heingkaew, V., Prayoonwiwat, N., & ChotikHesse, S., Jahnke, M. T., Schaffrin, A., Lucke, D., anuchit, S. (2015). Improvement of Gait Symmetry Reiter, F., & Konrad, M. (1998). Immediate effects in Patients with Stroke by Motor Imagery. J Med of therapeutic facilitation on the gait of hemiparetic Assoc Thai, 98, 113-118. patients as compared with walking with and without a cane. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 109, Schauer, M., & Mauritz, K. H. (2003). Musical 515-522. motor feedback (MMF) in walking hemiparetic stroke patients: randomized trials of gait Hsu, A. L., Tang, P. F., & Jan, M. H. (2003). improvement. Clin Rehabil, 17, 713-722. Analysis of impairments influencing gait velocity and asymmetry of hemiplegic patients after mild to Takami, A., & Wakayama, S. (2010). Effects of moderate stroke. Arch Phys Med Rehabil, 84, partial body weight support while training acute 1185-1193. stroke patients to walk backwards on a treadmill-a controlled clinical trial using randomized allocation. Ivey, F. M., Hafer-Macko, C. E., & Macko, R. F. Journal of physical therapy science, 22, 177-187. (2008). Task-oriented treadmill exercise training in chronic hemiparetic stroke. J Rehabil Res Dev, 45, Van Peppen, R. P., Kortsmit, M., Lindeman, E., & 249-259. Kwakkel, G. (2006). Effects of visual feedback therapy on postural control in bilateral standing after Kim, K., Lee, S., & Lee, K. (2014). Effects of stroke: a systematic review. J Rehabil Med, 38, 3-9. Progressive Body Weight Support Treadmill Forward and Backward Walking Training on Stroke Patientsâ&#x20AC;&#x2122; Van Peppen, R. P., Kwakkel, G., Wood-Dauphinee, Affected Side Lower Extremityâ&#x20AC;&#x2122;s Walking Ability. S., Hendriks, H. J., Van der Wees, P. J., & Dekker, Journal of physical therapy science, 26, 1923- J. (2004). The impact of physical therapy on 1927. functional outcomes after stroke: what's the evidence? Clin Rehabil, 18, 833-862.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Wade, D. T., Wood, V. A., Heller, A., Maggs, J., & Langton Hewer, R. (1987). Walking after stroke. Measurement and recovery over the first 3 months. Scand J Rehabil Med, 19, 25-30.

Yang, Y. R., Yen, J. G., Wang, R. Y., Yen, L. L., & Lieu, F. K. (2005). Gait outcomes after additional backward walking training in patients with stroke: a randomized controlled trial. Clin Rehabil, 19, 264-273.

Weng, C., Wang, J., Pan, X., Yu, Z., Wang, G., Gao, L., & Huo, C. (2006). Effectiveness of backward walking treadmill training in lower extremity function after stroke. Zhonghua yi xue za zhi, 86, 2635-2638.

Yavuzer, M. G. (2006). Walking after stroke: Interventions to restore normal gait pattern: Erasmus MC: University Medical Center Rotterdam.

Winter, D. A., Pluck, N., & Yang, J. F. (1989). Backward walking: a simple reversal of forward walking? Journal of motor behavior, 21, 291-305.

Zaky, L. A., & Hassan, W. F. (2013). Effect of partial weight bearing program on functional ability and quadriceps muscle performance in hemophilic knee arthritis. Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 14, 413-418.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

การจํ าลองมอนติคาร์โลสําหรับคํานวณปริมาณรังสีของอุปกรณ์กําหนดพื้ นทีข่ นาด มาตรฐานของอิเล็กตรอนพลังงาน 9 เมกะอิเล็กตรอนโวลต์ คณิต พงษ์พิริยะเดชะ1, จีระภา ตันนานนท์2, กิตติพล เดชะวรกุล2, จีรศักดิ์ คําฟองเครือ2 และนันทวัฒน์ อู่ดี1*

Monte carlo simulation for dose calculation of standard applicator of 9 MeV electron beam Khanit Phongphiriyadecha1, Chirapha Tannanonta2, Kittipol Dachaworakul2, Chirasak Khamfongkhruea2 and Nuntawat Udee1*

สาขาวิชาฟิ สิกส์การแพทย์ ภาควิชารังสีเทคนิค คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยนเรศวร อ.เมือง จ.พิษณุโลก 65000 งานรังสีรักษา โรงพยาบาลจุฬาภรณ์ กรุงเทพมหานคร 10210 1 Medical Physics Program, Department of Radiological Technology, Faculty of Allied Health Sciences, Naresuan University, Muang, Phitsanulok, Thailand 65000 2 Radiation Oncology Unit, Chulabhorn Hospital Bangkok 10210 * Corresponding author. E-mail address: nuntawatu@nu.ac.th บทคัดย่อ การรักษาผู้ป่วยโรคมะเร็งด้ วยวิธีการทางรังสีรักษาต้ องการความถูกต้ องสูงเนื่องจากปริมาณรังสีท่ผี ้ ูป่วยได้ รับมีค่าสูง โดยเฉพาะการ รักษาด้ วยการฉายลําอิเล็กตรอนพลังงานสูงจากเครื่องเร่ งอนุภาคที่มีการเกิดอันตรกิริยาในตัวกลางค่ อนข้ างซับซ้ อนกว่ าการฉายด้ วยรังสี เอกซ์พลังงานสูง การศึกษาวิจัยครั้งนี้ทาํ การคํานวณค่ าปริมาณรังสีในหุ่นจําลองนํา้ ด้ วยวิธีการจําลองมอนติคาร์โลเปรียบเทียบกับการวัด ด้ วยหัววัดรังสีไอออไนเซชัน โดยทําการจําลองมอนติคาร์โลลําอิเล็กตรอน พลังงาน 9 MeV พื้นที่ลาํ รังสีมาตรฐานขนาด 15x15 ตาราง เซนติเมตร จากเครื่องเร่ งอนุภาคด้ วยโปรแกรมมอนติคาร์โล EGSnrc ซึ่งประกอบด้ วยโปรแกรม BEAMnrc สําหรับจําลองอันตรกิริยาที่ เกิดขึ้นในเครื่องเร่งอนุภาคและโปรแกรม DOSXYZnrc สําหรับจําลองอันตรกิริยาในหุ่นจําลองนํา้ ด้ วยอนุภาคที่มาจากเครื่องเร่ งอนุภาค สําหรับการจําลองมอนติคาร์โลได้ ทาํ การจําลองอันตรกิริยาด้ วยค่าพลังงานตั้งต้ นเฉลี่ยตั้งแต่ 9.4-11 MeV และจําลองลําอิเล็กตรอนด้ วย ค่าการกระจายตัวแบบเกาส์เซียนตั้งต้ นขนาด 0.05-0.15 เซนติเมตร จากนั้นเปรียบเทียบค่ าที่คาํ นวณได้ จากมอนติคาร์โลกับค่ าที่ได้ จาก การวัดจริงในหุ่นจําลองนํา้ ที่ระดับความลึก R 90 , R 50 และ R p ผลการวิจัยพบว่าค่าที่คาํ นวณได้ จากการจําลองมอนติคาร์โลด้ วยพลังงานตั้ง ต้ นเฉลี่ย 10.8 MeV และลําอิเล็กตรอนแบบเกาส์เซียนขนาด 0.05 เซนติเมตร มีความใกล้ เคียงกับค่ าที่ได้ จากการวัดจริงมากที่สดุ ด้ วย ความแตกต่างของระยะ R 90 , R 50 และ R p เท่ากับ 0.047, 0.004 และ 0.004 เซนติเมตร ตามลําดับ การศึกษาวิจัยครั้งนี้ทาํ ให้ ทราบว่ า การจําลองมอนติคาร์โลสามารถคํานวณค่าปริมาณรังสีได้ สอดคล้ องกับการวัดจริงด้ วยหัววัดรังสีซ่ งึ อาจนําไปใช้ ในการประเมินความถูกต้ อง ของการกําหนดปริมาณรังสีท่ใี ช้ ในการรักษาผู้ป่วยได้ 2

คําสําคัญ: การจําลองมอนติคาร์โล ลํารังสีอเิ ล็กตรอน อีจีเอสเอ็นอาร์ซี Abstract Radiation therapy for cancer patients requires high accuracy in beam delivery due to high dose being delivered to the patients especially treatment with high energy electron beam of linear accelerator. The interactions between electrons and medium are more complex than those of high-energy X-rays. This study aimed to compare dose distribution in water phantom from measured doses detected by ionization chamber with calculated doses computed by Monte Carlo method. In this study, the Monte Carlo simulation of 9 MeV electron beam used a standard field size of 15x15 cm2 for linear accelerator (LINAC) with EGSnrc code system which included BEAMnrc for simulating interactions within LINAC head and DOSXYZnrc code for simulating interactions of electrons in water phantom. The Monte Carlo simulation indicated averaged initial interaction energy ranged from

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

9.4 to 11 MeV and used Gaussians distribution of electron beam ranged from 0.05 to 0.15 cm. The results of Monte Carlo simulation and measurement data was compared at depth R 90 , R 50 and practical range (R p ) in water phantom. The result showed an averaged initial interaction energy of 10.8 MeV with Gaussians distribution of electron beam of approximately 0.05 cm which was similar to measurement data with difference at the depth of R 90 , R 50 and R p , which were 0.047, 0.004, and 0.004 cm, respectively. The study showed that Monte Carlo simulation is capable of calculating dose distribution in accordance with measurement data and can be used to assess accuracy of prescribed doses for patient treatment. Keywords: Monte Carlo simulation, electron beam, EGSnrc

บทนํา การรักษาโรคมะเร็งด้ วยวิธกี ารทางรังสีรักษาต้ องการ ความถู ก ต้ องในการกํา หนดปริ ม าณรั ง สี อ ย่ า งมาก เนื่องจากรังสีท่ใี ช้ ในการรักษามีพลังงานและปริมาณที่สงู มาก หากเกิดความผิดพลาดเพียงเล็กน้ อยอาจส่งผลให้ ผู้ป่วยเกิดภาวะข้ างเคียงจากการได้ รับปริมาณรังสีสูงได้ ดังนั้น เพื่อให้ การรักษามีความถูกต้ องและเป็ นสากลจึง ได้ มกี ารกําหนดมาตรฐานการกําหนดปริมาณรังสีข้ นึ เพื่อ ป้ องกั น ความผิ ด พลาดจากการรั ก ษาด้ วยรั ง สี รั ก ษา สําหรับ การรั กษาด้ ว ยวิ ธีก ารทางรั งสีรั กษาส่ วนใหญ่ ใ ช้ วิ ธี ก ารรั ก ษาด้ วยรั ง สี เ อกซ์ ห รื อ แกมมาในกรณี ท่ี ก้ อนมะเร็งอยู่ลึกใต้ ผวิ หนัง และใช้ อเิ ล็กตรอนพลังงานสูง ในการรั ก ษาโรคมะเร็ง ที่อ ยู่ ร ะดับ ตื้ นจากผิว หนั ง การ ถ่ายเทพลังงานรังสีให้ กับเนื้อเยื่อจะมีความแตกต่างกัน ระหว่ า งรั ง สี แ ต่ ล ะชนิ ด และการคํา นวณเพื่ อกํา หนด ปริ ม าณรั ง สี ดั ง กล่ าวมี ค วามซั บ ซ้ อนแตกต่ างกั น นอกจากนี้ การถ่ า ยเทพลั ง งานของอิ เ ล็ก ตรอนให้ กั บ เนื้ อเยื่ อ ทํา ให้ เกิ ด อั น ตรกิ ริ ย าที่ มี ค วามซั บ ซ้ อนมาก เนื่องจากอิเล็กตรอนเป็ นอนุภาคที่มีมวลและประจุส่งผล ให้ เกิดการกระเจิงค่อนข้ างมาก กรณีดังกล่าวไม่สามารถ คํานวณปริมาณรังสีด้วยวิธกี ารอย่างง่ายได้ สําหรับความ ถู ก ต้ อ งของการกํา หนดปริ ม าณรั ง สี ดั ง กล่ า วสามารถ ตรวจสอบได้ ด้วยการวัดค่าปริมาณรังสีในนํา้ ด้ วยหัววัด รังสีแต่ด้วยขั้นตอนการตรวจสอบค่อนข้ างยุ่งยากและใช้ เวลามากจึ ง ทํา ให้ เกิด การละเว้ น การตรวจสอบความ ถูกต้ องของปริมาณรังสีดงั กล่าว อย่ างไรก็ตามการคํานวณปริม าณรังสีด้ว ยหลักการ จํา ลองมอนติคาร์ โลเป็ นวิ ธีก ารที่ใ ห้ ผ ลการคํา นวณที่มี ความถู ก ต้ อ งสูง โดยการจํา ลองมอนติค าร์ โ ลเป็ นการ ประยุกต์ใช้ ทฤษฎีทางฟิ สิกส์รังสีและสถิติเพื่อศึกษาการ

เคลื่ อนที่ ข องอนุ ภาคและอั น ตรกิ ริ ย าในตั ว กลาง (interaction with matter) ที่เกิดขึ้นในช่วงพลังงานที่ใช้ ทางรั ง สี รั ก ษา รู ป แบบการคํา นวณดั ง กล่ า วจึ ง ทํา ให้ สามารถคํานวณการกระจายของปริมาณรังสีท่ีเคลื่อนที่ ผ่ า นตั ว กลางต่ า งๆ ได้ อ ย่ า งถู ก ต้ อ งแม่ น ยํา (Chetty et al., 2007; O'Shea, 2012) การศึกษาวิจัยที่เกี่ยวข้ อง กับการจําลองมอนติคาร์โลเพื่อคํานวณปริมาณรังสีในทาง รังสีรักษาเริ่มมีบทบาทมากยิ่งขึ้นและมีแนวโน้ มในการ นํามาใช้ เป็ นซอฟต์แวร์คอมพิ วเตอร์วางแผนการรักษา ได้ (Stern et al., 2011) การศึกษาวิจัยครั้งนี้เป็ นการ คํานวณค่าปริมาณรังสีด้วยวิธกี ารจําลองมอนติคาร์โลลํา อิเล็กตรอนพลังงาน 9 MeV จากเครื่องเร่ งอนุ ภาคเพื่อ ประเมิน ความถูก ต้ องของการคํานวณปริมาณรัง สีด้ว ย วิธีก ารจํา ลองมอนติคาร์ โลเปรียบเทียบกับการวัด ด้ ว ย หั ว วั ด รั ง สี ซ่ึ ง เป็ นวิ ธี ก ารมาตรฐานในการตรวจสอบ ปริมาณรังสีในปัจจุบนั วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ 1. การจํ า ลองมอนติ ค าร์โ ลสํ า หรับ คํ า นวณค่ า ปริมาณรังสี การจํา ลองมอนติค าร์ โลเพื่ อคํานวณค่ า ปริ มาณ รังสีท่เี กิดจากการฉายลําอิเล็กตรอนในนํา้ จากเครื่องเร่ ง อนุภาคพลังงาน 9 MeV ทําโดยใช้ โปรแกรมมอนติคาร์ โล EGSnrc code system ซึ่งเป็ นโปรแกรมที่นิยมใช้ ใน การจํา ลองอัน ตรกิริ ย าของรั ง สีช นิ ดต่ า งๆ ในตัว กลาง (Rogers, Kawrakow, Seuntjens, Walters, & MainegraHing, 2003) ประกอบด้ วยโปรแกรม BEAMnrc ใช้ สํา หรั บ จํ า ลองการเกิ ด อั น ตรกิ ริ ย าภายในเครื่ อ งเร่ ง อนุ ภ าคและโปรแกรม DOSXYZnrc ใช้ ส าํ หรั บ จํา ลอง อันตรกิริยาของอิเล็กตรอนในตัวกลางนํา้ โดยการคํานวณ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ค่ า ปริ ม าณรั ง สี ด้ วยวิ ธี ก ารจํ า ลองมอนติ ค าร์ โ ลด้ วย EGSnrc code system ประกอบด้ วยขั้นตอนดังต่อไปนี้ 1.1 การสร้ างส่วนประกอบเครื่องเร่งอนุภาค การจําลองมอนติคาร์โลของลําอิเล็กตรอน จากเครื่องเร่ งอนุ ภาค CLINAC รุ่น 2100CD บริษัท Varian ทําโดยการสร้ างโครงสร้ างและส่วนประกอบของ เครื่องเร่งอนุภาคตามรูปร่างและขนาดจริงด้ วยโปรแกรม BEAMnrc ประกอบด้ วย component module (CMs) ชนิด CONS3R, SLABS, CONESTAK, CHAMBER, MIRROR, JAWS และ APPLICATOR สําหรับสร้ าง เป็ นส่ ว นประกอบภายในเครื่ อ งเร่ ง อนุ ภ าค primary collimator, vacuum window , upper และ lower

scattering foil, monitor chamber, mirror, secondary collimator, applicator และ insert cutout ตามลําดับ (Antolak, Bieda, & Hogstrom, 2002; Lakkhana., 2012; Turian, Smith, Bernard, Griem, & Chu, 2004) ผลการสร้ างส่ ว นประกอบภายในเครื่ อ งเร่ ง อนุภาคด้ วยโปรแกรม BEAMnrc แสดงดังรูปที่ 1 โดย โครงสร้ างและอุปกรณ์ท้ังหมดกําหนดให้ เป็ นวัสดุชนิด เดี ย วกั น กั บ เครื่ องเร่ ง อนุ ภ าค สํา หรั บ ขนาดพื้ นที่ มาตรฐานของลํา อิ เ ล็ก ตรอนในการศึ ก ษาวิ จั ย ครั้ ง นี้ กําหนดให้ electron applicator มีขนาด 15x15 ตาราง เซนติเมตร ที่ร ะยะจากต้ นกํา เนิ ดรั งสีถึงผิวนํ้า (SSD) เท่ากับ 100 เซนติเมตร

รูปที่ 1 แสดงโครงสร้ างและส่ว นประกอบของเครื่อ งเร่ งอนุ ภาค Varian Clinac 2100CD เมื่อ ใช้ โปรแกรม BEAMnrc สร้ า ง ส่วนประกอบต่ าง ๆ ได้ แก่ primary collimator, vacuum window, upper และ lower scattering foil, monitor chamber, mirror, secondary collimator และ applicator ตามลําดับ

1.2 การจํ า ลองอั น ตรกิ ริ ย าของอิ เ ล็ ก ตรอน ภายในเครื่องเร่งอนุภาค จําลองอันตรกิริยาของอิเล็กตรอนที่เคลื่อนที่ ผ่านส่วนประกอบต่างๆ ภายในเครื่องเร่งอนุภาค โดย กําหนดค่าพารามิเตอร์ท่ีต้องทําการประเมินเพื่อให้ การ

คํานวณมีความถูกต้ องประกอบด้ วยค่าพลังงานเฉลี่ยตั้ง ต้ นตั้งแต่ 9.4, 9.6, 9.8, 10.0, 10.2, 10.4, 10.6 10.8 และ 11 MeV ตามลําดับ และค่าความกว้ างของลํา อิเล็กตรอนตั้งต้ น (FWHM) ซึ่งกําหนดให้ ค่าความกว้ าง ของลําอิเล็กตรอนตั้งต้ นมีลักษณะ Gaussian distribution

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ที่มขี นาด 0.05, 0.1 และ 0.15 เซนติเมตร ตามลําดับ สํา หรั บ การประเมิ น ความถู ก ต้ อ งของการคํา นวณใช้ วิธกี ารตรวจสอบจากค่าปริมาณรังสีท่ีระดับความลึกร้ อย ละ 90, 50 และ practical range (R 90 , R 50 และ R p ) ของค่า percentage depth dose (PDD) และ relative beam profile กําหนดให้ จาํ นวนอนุ ภาคเริ่มต้ น (initial particle) ที่ใช้ ในการจําลองอันตรกิริยาเท่ากับ 5 x 108 อนุภาค เพื่อให้ การคํานวณมีความถูกต้ องสูง นอกจากนี้ ยังมีพารามิเตอร์อ่นื ที่ใช้ ในการจําลองอันตรกิริยาที่เกิดใน ส่วนหัวของเครื่องเร่งอนุภาคประกอบด้ วยพลังงานขั้นตํ่า ที่กาํ หนดให้ อนุ ภาคเคลื่อนที่หรือหยุ ดซึ่งการศึกษาวิจัย ครั้งนี้กาํ หนดค่ า transport parameters ด้ วยวิธี BCA แบบ EXACT และกําหนดค่า electron step algorithm ชนิด PRESTA-II ประกอบด้ วย ECUT เท่ากับ 0.521 MeV และ PCUT เท่ากับ 0.01 MeV (Antolak et al., 2002; Faddegon, Perl, & Asai, 2008; Lakkhana., 2012) 1.3 การสร้ างหุ่ น จํา ลองนํ้า สํา หรั บ คํา นวณค่ า ปริมาณรังสีดูดกลืน สร้ างหุ่นจําลองนํา้ สําหรับใช้ ในการคํานวณ ค่าปริมาณรังสีดูดกลืนจากส่วนหัวของเครื่องเร่ งอนุภาค ด้ วยโปรแกรม DOSXYZnrc ซึ่งมีขนาด 67.5 x 64.5 x

56 ลู กบาศก์เ ซนติเ มตร ดัง แสดงในรูป ที่ 2 โดย หุ่นจําลองนํา้ ที่สร้ างขึ้นสําหรับจําลองมอนติคาร์โลมีขนาด เท่ากับหุ่นจําลองนํา้ ที่ใช้ ในการวัดปริมาณรังสีในนํา้ ด้ วย หั ว วั ด รั ง สี ช นิ ด ไอออไนเซชั น แชมเบอร์ (ionization chamber) ขนาด 0.13 cc 1.4 การคํานวณค่าปริมาณรังสีในหุ่นจําลองนํา้ ทําการคํานวณหาค่า percentage depth dose (PDD) และ relative beam profile ในหุ่นจําลองนํา้ ด้ วย โปรแกรม DOSXYZnrc โดยแบ่ งขนาดของวอกเซล สําหรับการคํานวณค่า percentage depth dose ตามแนว กึ่งกลางลํารังสีออกเป็ น 3 ช่วงเพื่อลดเวลาในการคํานวณ ประกอบด้ วย วอกเซลขนาด 0.5x0.5x0.2 ลูกบาศก์ เซนติเ มตร ที่ระดับผิวนํ้าถึง ความลึก 6 เซนติเ มตร จากนั้นกําหนดให้ มขี นาด 0.5x0.5x0.5 ลูกบาศก์เซนติเมตร จนถึงความลึก 16 เซนติเมตร และให้ มีขนาด 0.5x0.5x40 ลู ก บาศก์ เ ซนติ เ มตรที่ ฐ านหุ่ น จํา ลองนํ้ า ตามลํ า ดั บ สําหรับค่ า relative beam profile กําหนดวอกเซลใน แนวแกน x ให้ มีขนาดตั้งแต่ 0.25 ถึง 0.5 เซนติเมตร แกน y กําหนดวอกเซลขนาด 0.5 เซนติเมตรตลอดพื้นที่ ลํารังสี และแกน z ใช้ วอกเซลขนาดตั้งแต่ 0.1 ถึง 1 เซนติเมตร ตลอดระยะลึกที่เก็บค่าปริมาณรังสีดังแสดง ในรูปที่ 2

รูปที่ 2 แสดงการออกแบบหุ่นจําลองนํา้ ขนาด 67.5 x 64.5 x 56 ลูกบาศก์เซนติเมตรด้ วยโปรแกรม DOSXYZnrc

1. การวิ เ คราะห์ผลการคํานวณปริ มาณรังสี ดว้ ย วิธีการจํ าลองมอนติคาร์โล ทําการวิเคราะห์ผลการจําลองมอนติคาร์โล EGSnrc ในส่วนของเครื่องเร่ งอนุ ภาคด้ วยโปรแกรม BEAMnrc และคํ า นวณค่ าปริ ม าณรั ง สี ใ นนํ้ า ด้ วยโปรแกรม DOSXYZnrc ผลที่ได้ จากการประเมินหาค่าพลังงานตั้ง ต้ น ที่เ หมาะสมสํา หรั บ การจํา ลองมอนติค าร์ โ ลด้ ว ยค่ า

ปริ ม าณรั ง สีท่ีร ะดับ ความลึ ก ร้ อ ยละ 90, 50 และ practical range (R 90 , R 50 และ R p ) จาก percentage depth dose เปรียบเทียบค่าปริมาณรังสีระหว่ างค่าจาก การจําลองมอนติคาร์โลและการวัดปริมาณรังสีในนํา้ ด้ วย หั ว วั ด รั ง สี โดยทํา การวิ เ คราะห์ จ ากค่ า ความแตกต่ า ง ระหว่างค่าระดับความลึกร้ อยละ 90, 50 และ practical range สําหรับค่า relative beam profile ใช้ การวิเคราะห์

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ค่าปริมาณรังสีภายในพื้นที่ร้อยละ 80 ของลํารังสีท้งั หมด เมื่ อ ใช้ พลั ง งานเฉลี่ ย ตั้ ง ต้ น ของอิ เ ล็ ก ตรอนจากช่ ว ง โดยประเมิ น ด้ ว ยค่ า เฉลี่ ย เปอร์ เ ซ็น ต์ ค วามแตกต่ า งที่ พลังงาน 9.4 ถึง 11 MeV เมื่อกําหนดค่าความกว้ างของ ระดับความลึกร้ อยละ 90 และ 50 ตามลําดับ ลําอิเล็กตรอนตั้งต้ นเท่ากับ 0.1 มิลลิเมตร และใช้ พ้ ืนที่ ลํารั งสีข นาด 15x15 ตารางเซนติเมตรที่ระยะ SSD เท่ า กับ 100 เซนติเ มตร ผลการเปรี ย บเทีย บค่ า ผลการศึกษา percentage depth dose ระหว่างการวัดค่าปริมาณรังสี จากการคํ า นวณปริ ม าณรั ง สี ข องลํ า อิ เ ล็ ก ตรอน ด้ วยหัววัดรังสีและจําลองมอนติคาร์โลแสดงผลดังรูปที่ 3 พลังงาน 9 MeV ในนํา้ ด้ วยวิธกี ารจําลองมอนติคาร์โล

รูปที่ 3 แสดงการเปรียบเทียบค่า percentage depth dose จากการวัด (N Mea.) และจําลองมอนติคาร์โล (N MC) ของอิเล็กตรอน พลังงาน 9 MeV กําหนดขนาด FWHM เท่ากับ 0.1 เซนติเมตร พลังงานเฉลี่ยเริ่มต้ นตั้งแต่ 9.4 – 11 MeV ดังรูป ก – ฌ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

จากรูปที่ 3 เมื่อเปรียบเทียบค่ าที่ได้ จากการจําลอง จําลองมอนติคาร์โลของอิเล็กตรอนพลังงานเฉลี่ยตั้งต้ น มอนติคาร์โลด้ วยค่าพลังงานเฉลี่ยตั้งต้ น 9.4-11 MeV 10.8 MeV มีความใกล้ เคียงกับค่าที่ได้ จากการวัดจริง ซึ่งมีค่าความกว้ า งของลําอิเล็กตรอนตั้งต้ นเท่ากับ 0.1 มากที่สดุ โดยมีค่าความแตกต่างของ R 90 , R 50 และ R p เซนติเมตร กับค่าจากการวัดด้ วยหัววัดรังสีไอออไนเซชัน เท่ากับ 0.047, 0.004 และ 0.004 เซนติเมตร จากเครื่องเร่งอนุ ภาคได้ ผลดังตารางที่ 1 โดยพบว่าการ ตามลําดับ ตารางที่ 1 ค่ าความแตกต่ างของ percentage depth dose ระหว่ างการวัดและการจําลองมอนติคาร์โลที่ระยะ R 90 , R 50 และ R p ของ อิเล็กตรอนพลังงาน 9 MeV เมื่อใช้ พ้ ืนที่ลาํ รังสี 15x15 ตารางเซนติเมตร Initial energy Depth (cm) of 9 MeV R 90 R 50 Rp Measured Monte Diff. Measured Monte Diff. Measured Monte Diff. Carlo Carlo Carlo 9.4

2.651

2.311

0.34

3.484

2.692

0.792

4.199

3.191

1.008

9.6

2.651

2.345

0.306

3.484

2.879

0.605

4.199

3.429

0.77

9.8

2.651

2.362

0.289

3.484

3.03

0.454

4.199

3.621

0.578

2.651

2.497

0.154

3.484

3.206

0.278

4.199

3.845

0.354

10.2

2.651

2.511

0.14

3.484

3.268

0.216

4.199

3.923

0.276

10.4

2.651

2.552

0.099

3.484

3.312

0.172

4.199

3.98

0.219

10.6

2.651

2.667

-0.016

3.484

3.408

0.076

4.199

4.101

0.098

10.8

2.651

2.698

-0.047

3.484

3.488

-0.004

4.199

4.203

-0.004

2.651

2.775

-0.124

3.484

3.548

-0.064

4.199

4.28

-0.081

เมื่อทําการประเมินค่าความกว้ างของลําอิเล็กตรอน ตั้งต้ นระหว่าง 0.05 - 0.15 เซนติเมตร ด้ วยพลังงาน เฉลี่ยตั้งต้ น 10.8 MeV ได้ ผลการเปรียบเทียบระหว่าง การจําลองมอนติคาร์โลและการวัดด้ วยหั ววัดรังสีแสดง ดังรูปที่ 4 พบว่ าค่าความกว้ างของลําอิเล็กตรอนเท่ากับ

0.05 เซนติเมตร มีค่าใกล้ เคียงกับค่าที่วัดจริงมากที่สดุ ดังแสดงในตารางที่ 2 โดยมีค่ าเฉลี่ย เปอร์ เซ็น ต์ค วาม แตกต่ างระหว่ างค่ าปริมาณรังสีท่รี ะดับความลึกร้ อยละ 90 และ 50 เท่ากับ 0.715 และ 1.342 ตามลําดับ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รู ปที่ 4 แสดงการเปรียบเทียบค่ า relative beam profile ระหว่ างการวัด (Measured) และจําลองมอนติคาร์โล (MC) ของอิเล็กตรอน พลังงาน 10.8 MeV เมื่อเปลี่ยนแปลงค่า FWHM เท่ากับ 0.5, 0.1 และ 0.15 เซนติเมตร ที่ความลึก R 90 และ R 50 ดังรูป ก – ฉ ตารางที่ 2 ค่าเฉลี่ยความแตกต่ างของ relative beam profile ระหว่ างการวัดและการจําลองมอนติคาร์โลที่ความลึก R 90 และ R 50 ของ อิเล็กตรอนพลังงานเฉลี่ย 10.8 MeV เมื่อใช้ พ้ ืนที่ลาํ รังสี 15x15 ตารางเซนติเมตร สําหรับค่ าความกว้ างของลําอิเล็กตรอน ตั้งต้ น 0.05, 0.1 และ 0.15 เซนติเมตร Average difference (%) FWHM(cm)

R 90

R 50

0.05

0.715

1.342

0.1

0.962

1.552

0.15

1.004

1.720

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

อภิปรายผลการศึกษา การศึกษาวิจัยในครั้งนี้ได้ ทาํ การหาค่าพลังงานเฉลี่ย ตั้ ง ต้ นและค่ า ความกว้ างของลํ า อิ เ ล็ ก ตรอนตั้ ง ต้ นที่ เหมาะสมสําหรับคํานวณค่าปริมาณรังสีในตัวกลางนํา้ จาก เครื่องเร่งอนุภาคพลังงาน 9 MeV ด้ วยโปรแกรมมอนติ คาร์โล EGSnrc ซึ่งได้ ทาํ การสร้ างส่วนหัวของเครื่องเร่ ง อนุ ภาคให้ มีส่วนประกอบต่ างๆ ที่เหมือนกับเครื่องเร่ ง อนุ ภาคจริงเพื่อความถูกต้ องของการจําลองอันตรกิริยา ของอิเล็กตรอนในตัวกลาง ปัจจัยที่ส่งผลต่อความถูกต้ อง ของการจํา ลองมอนติค าร์ โ ลประกอบด้ ว ยการกํา หนด จํานวนอนุภาคเริ่มต้ นในการจําลองซึ่งจะต้ องมีจาํ นวนที่ มากพอเพื่ อให้ ค่าทางสถิติมีความสอดคล้ องกับการวัด จริง การศึกษาวิจัยครั้งนี้กาํ หนดค่าจํานวนอนุภาคที่ใช้ ใน การจําลอง 5x108 อนุ ภาค ทําให้ ค่าการคํานวณมีความ ถูกต้ องค่อนข้ างสูง โดยเมื่อทําการเปรียบเทียบค่าปริมาณ รังสีด้วยค่า percentage depth dose และ relative beam profile ระหว่ างการจําลองมอนติคาร์โลและการวัดจริง พบว่าค่าพลังงานเฉลี่ยเริ่มต้ นเท่ากับ 10.8 MeV และค่า ความกว้ างของลําอิเ ล็กตรอนตั้งต้ น 0.05 เซนติเ มตร พื้ นที่ลํา รั ง สีข นาด 15x15 ตารางเซนติ เ มตรมี ค่ า ใกล้ เคียงกับการวัดด้ วยหัววัดรังสีมากที่สดุ สอดคล้ องกับ ผลการวิจัยของ Anna et al. (Rodrigues, Sawkey, Yin, & Wu, 2015) ที่ท าํ การจํา ลองมอนติค าร์ โ ลลํา อิเล็กตรอนจากเครื่องเร่ งอนุภาครุ่น TureBeam พบว่ามี ความแตกต่างระหว่างการวัดจริงกับการจําลองอยู่ภายใน ร้ อยละ 2 ในพื้นที่ลาํ รังสีขนาด 3x3 ถึง 25x25 ตาราง เซนติเมตร การศึกษาวิจัยในครั้งนี้แสดงให้ เห็นว่ าการ จํา ลองมอนติ ค าร์ โ ลของพื้ นที่ ลํ า รั ง สี ม าตรฐานมี ค่ า ใกล้ เคียงกับค่าปริมาณรังสีท่ไี ด้ จากการวัดจริงด้ วยหัววัด รังสีซ่ึงใช้ เป็ นค่าอ้ างอิงในการคํานวณปริมาณรังสี ดังนั้น การคํานวณค่ าปริมาณรังสีด้วยวิธีการจําลองมอนติคาร์ โลสามารถนําไปใช้ เพื่ อตรวจสอบความถู กต้ องของค่ า ปริมาณรังสีได้

หุ่นจําลองนํา้ ด้ วยค่ า percentage depth dose และ relative beam profile โดยทําการหาค่าพลังงานเฉลี่ยและ ค่ า ความกว้ า งของลํา อิเ ล็ก ตรอนตั้ง ต้ น ที่เ หมาะสมใน ตัวกลางนํา้ ของเครื่องเร่งอนุภาคพลังงาน 9 MeV ด้ วย โปรแกรมมอนติคาร์โล EGSnrc พบว่ าค่าพลังงานเฉลี่ย เริ่มต้ น 10.8 MeV และค่าความกว้ างของลําอิเล็กตรอน ตั้งต้ น 0.05 เซนติเมตร ของพื้นที่ลาํ รังสีขนาด 15x15 ตารางเซนติเมตรที่ระยะจากจุดกําเนิดรังสีถึงผิวนํา้ 100 เซนติเ มตรมีค่า ใกล้ เคียงกับ การวั ดด้ ว ยหั ววั ดรั งสีมาก ที่สุดซึ่งมีค่าร้ อยละความแตกต่ างของค่ า percentage depth dose ที่ความลึก R 90 , R 50 และ R p และค่าเฉลี่ย ร้ อยละความแตกต่างของ relative beam profile ระหว่าง การวัดและการคํานวณที่ความลึก R 90 และ R 50 ไม่เกิน 2 ดังนั้นการจําลองมอนติคาร์โลสามารถนําไปใช้ ในการ คํานวณปริมาณรังสีเพื่อตรวจสอบความถูกต้ องของการ คํานวณปริมาณรังสีได้ อย่ างไรก็ตามควรศึกษาผลการ จําลองมอนติคาร์โลที่พ้ ื นที่ลาํ รังสีขนาดอื่น ๆ ที่ใช้ งาน จริงเพื่อประเมินความถูกต้ องของการจําลองมอนติคาร์โล สําหรับคํานวณค่าปริมาณรังสีให้ กบั ผู้ป่วยได้ อย่างถูกต้ อง ต่อไป กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุ ณ นายกฤษณะ อุ ท าพรม สํา หรั บ ความ ช่วยเหลือในการเก็บข้ อมูลและอํานวยความสะดวกในทุก ด้ านขณะทําการศึกษาวิจัย เอกสารอ้างอิง Antolak, J. A., Bieda, M. R., & Hogstrom, K. R. (2002). Using Monte Carlo methods to commission electron beams: A feasibility study. Medical Physics, 29(5), 771-786.

Chetty, I. J., Curran, B., Cygler, J. E., DeMarco, J. สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ J., Ezzell, G., Faddegon, B. A., . . . Ma, C.-M. C. (2007). Report of the AAPM Task Group No. 105: การศึกษาวิจัยในครั้งนี้ได้ ทาํ การจําลองมอนติคาร์โล Issues associated with clinical implementation of เปรี ย บเทีย บกับ การวั ด ปริ ม าณรั ง สีด้ ว ยหั ว วั ด รั ง สีใ น Monte Carlo-based photon and electron external

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

beam treatment planning. Medical Physics, 34(12), 4818-4853.

42(5), 2389-2403. doi:doi:http://dx.doi.org/10. 1118/1.4916896

Faddegon, B. A., Perl, J., & Asai, M. (2008). Rogers, D., Kawrakow, I., Seuntjens, J., Walters, Monte Carlo simulation of large electron fields. B., & Mainegra-Hing, E. (2003). NRC user codes for EGSnrc. NRCC Report PIRS-702 (Rev. B). Physics in medicine and biology, 53(5), 1497. Ottawa, Canada: National Research Council Canada. Lakkhana., A. (2012). Estimation of surface dose from therapeutic 6 mv photon beams. (Doctoral Stern, R. L., Heaton, R., Fraser, M. W., Goddu, S. M., Kirby, T. H., Lam, K. L., . . . Zhu, T. C. dissertation). Chulalongkorn University, Bangkok. (2011). Verification of monitor unit calculations for O'Shea, T. (2012). Monte Carlo Simulation of non-IMRT clinical radiotherapy: report of AAPM Medical Accelerator Electron Treatment Heads. Task Group 114. Medical Physics, 38(1), 504Retrieved from http://hdl.handle.net/10379/2712 530. Rodrigues, A., Sawkey, D., Yin, F.-F., & Wu, Q. (2015). A Monte Carlo simulation framework for electron beam dose calculations using Varian phase space files for TrueBeam Linacs. Medical Physics,

Turian, J. V., Smith, B. D., Bernard, D. A., Griem, K. L., & Chu, J. C. (2004). Monte Carlo calculations of output factors for clinically shaped electron fields. Journal of Applied Clinical Medical Physics, 5(2).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

การลดสิง่ แปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จากอุปกรณ์สอดใส่แร่ชนิด แสตนเลสสตีลของหุ่นจํ าลองอุง้ เชิงกรานในงานรังสีรกั ษาระยะใกล้ วิมลมาศ ทองงาม1*, ฐิติพงศ์ แก้ วเหล็ก2 และนันทวัฒน์ อู่ดี1,2

Metal Artifact Reduction on CT Pelvis Phantom Images from Stainless Steel Applicators in Brachytherapy Wimonmart Tong-Ngarm1*, Titipong Kaewlek2 and Nuntawat Udee1,2

สาขาวิชาฟิ สิกส์การแพทย์ ภาควิชารังสีเทคนิค คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยนเรศวร อ.เมือง จ.พิษณุโลก 65000 ภาควิชารังสีเทคนิค คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยนเรศวร อ.เมือง จ.พิษณุโลก 65000 1 Medical Physics Program, Department of Radiological Technology, Faculty of Allied Health Sciences, Naresuan University, Muang, Phitsanulok, Thailand 65000 2 Department of Radiological Technology, Faculty of Allied Health Sciences, Naresuan University, Muang, Phitsanulok, Thailand * Corresponding author. E-mail address: nuntawatu@nu.ac.th บทคัดย่อ สิ่งแปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ ลองการรักษาที่เกิดจากอุปกรณ์สอดใส่แร่ ชนิดแสตนเลสสตีลส่งผลให้ การวาง แผนการรัก ษาเพื่อกํา หนดขอบเขตของก้ อนมะเร็งและอวัยวะปกติเกิดความผิดพลาดและอาจส่งผลต่ อความถู กต้ องของการคํานวณ ปริมาณรังสีสาํ หรับรักษาผู้ป่วยมะเร็ง อย่ างไรก็ตาม สิ่งแปลกปลอมโลหะดังกล่ าวสามารถลดได้ ด้วยการใช้ อัลกอริทมึ ทางคณิตศาสตร์ท่ี เหมาะสม การศึกษาวิจัยในครั้งนี้จึงได้ พัฒนาอัลกอริทมึ สําหรับลดสิ่งแปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์หุ่นจําลองอุ้งเชิงกราน ที่ใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่ชนิดแสตนเลสสตีล โดยใช้ วิธกี ารประมวลผลภาพดิจิทลั เพื่อจําแนกข้ อมูลภาพโลหะด้ วยเทคนิค k-mean clustering จากข้ อมูลภาพต้ นฉบับ และทําการประมาณค่ าเชิงเส้ นของค่ าข้ อมูลเพื่อทดแทนข้ อมูลไซโนแกรมให้ สมบูรณ์ ผลการประเมินคุณภาพเชิง ปริมาณระหว่างภาพก่อนและหลังการใช้ อัลกอริทมึ ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะ พบว่ าสามารถลดสิ่งแปลกปลอมโลหะที่เกิดขึ้นในภาพได้ ท้งั บริเวณที่มีเฉพาะ tandem และบริเวณที่มี tandem และ ovoids อัลกอริทมึ ที่พัฒนาขึ้นสามารถลดสิ่งแปลกปลอมโลหะชนิด hypodense streak ได้ ดี แต่ไม่สามารถลดสิ่งแปลกปลอมโลหะชนิด hyperdense streak อย่างสมบูรณ์ อย่างไรก็ตามอัลกอริทมึ ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะ ที่พัฒนาขึ้นสามารถเพิ่มคุณภาพของภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ และนําไปใช้ ในการลดสิ่งแปลกปลอมโลหะที่เกิดจากอุปกรณ์สอดใส่แร่ ชนิดแสตนเลสสตีลในงานรังสีรักษาระยะใกล้ ได้ 2

คําสําคัญ: เครื่องเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ รังสีรักษาระยะใกล้ อัลกอริทมึ ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะ อุปกรณ์สอดใส่แร่ Abstract Metal artifacts from stainless steel applicators in computed tomography (CT) images can complicatedly delineate of tumor and organs at risk (OARs) and cause critical errors in dose calculation of treatment planning. However, appropriate algorithms can be applied to minimize these artifacts. The purpose of this study was to develop and evaluate a metal artifact reduction algorithm for radiotherapy treatment planning using pelvis phantom images inserted stainless steel applicator. This study used the digital image processing to segment metal objects in initial image, k-mean clustering technique was used. Linear interpolation was restored the data to complete sinogram data. Quantitative image quality of metal artifact reduction comparisons between the initial image and the processed images by using sinogram completion algorithm showed significant reduced both the images containing a tandem and the images containing both a tandem and the ovoids. This algorithm can eliminated hypodense streaks but not completely in hyperdense streaks. However, the sinogram completion algorithm can improve image quality in metal artifact-affected CT images caused by the stainless steel applicator in brachytherapy. Keywords: Computed Tomography, Brachytherapy, Metal Artifacts Reduction Algorithm, Applicator

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

บทนํา โรคมะเร็งเป็ นสาเหตุการเสียชีวิตของประชากรไทย อันดับ 1 และมีแนวโน้ มเพิ่ มสูง ขึ้นทุก ปี เมื่อทําการ จําแนกตามเพศพบว่ าโรคมะเร็งเต้ านมพบมากที่สุดใน เพศหญิงตามด้ วยโรคมะเร็งปากมดลูก(National Cancer Institute department of Medical services ministry of public health, 2013) การรักษาโรคมะเร็งโดยทั่วไป สามารถทําการรักษาได้ หลายวิธที ้งั การผ่าตัด เคมีบาํ บัด ยาฮอร์ โ มนบํา บั ด และการรั ก ษาด้ ว ยรั ง สีรั ก ษา โดย วัตถุประสงค์ของการรักษาแบ่งออกเป็ นการรักษาเพื่อให้ ห า ย ข า ด ห รื อ บ ร ร เ ท า อ า ก า ร ( Srimuninnimit, Sriuranpong, & Laohavinij, 1999) ปั จจุบันการรักษา โรคมะเร็งปากมดลูกด้ วยวิธกี ารทางรังสีรักษาเป็ นวิธีท่ีมี ประสิทธิภาพสูง โดยอาจใช้ วิธกี ารรักษาด้ วยรังสีระยะไกล ซึ่งเป็ นการฉายรังสีจากภายนอกจากเครื่องเร่ งอนุ ภาค (Linac) เพื่อผลิตเอกซเรย์พลังงานสูงสําหรับการรักษา ใ น บ ริ เ ว ณ ก ว้ า ง ห รื อ ก า ร รั ก ษ า ด้ ว ย ก า ร ใ ส่ แ ร่ (intracavitary brachytherapy) ซึ่งสามารถให้ ปริมาณรังสี สูงที่ก้อนมะเร็งในขณะที่เนื้อเยื่อสําคัญบริเวณข้ างเคียง เช่ น กระเพาะปั สสาวะหรือไส้ ตรง ได้ รับปริมาณรังสีต่ าํ (Asakit, 2011) สํา หรั บ การรั ก ษาด้ ว ยเทคนิ ค การใส่ แ ร่ เ ป็ นการให้ ปริมาณรังสีท่กี ้ อนมะเร็งด้ วยการสอดใส่สารกัมมันตรังสี ไปยังก้ อนมะเร็งด้ วยอุปกรณ์สอดใส่แร่ (applicator) เพื่อ นําเม็ดแร่ เข้ าไปยังก้ อนมะเร็งอย่ างถูกต้ องและแม่ นยํา โดยวั ส ดุ ท่ีใ ช้ ใ นการผลิ ต อุ ป กรณ์ ส อดใส่ แ ร่ ดั ง กล่ า วมี หลายประเภท เช่น ไทเทเนียม พลาสติกและแสตนเลสส ตีล สําหรับโรงพยาบาลทั่วไปนิยมใช้ อุปกรณ์สอดใส่แร่ ชนิ ด แสตนเลสสตีล เนื่ อ งจากมีร าคาถู ก และคงทนกว่ า ประเภทวั ส ดุ ป ระเภทอื่น การวางแผนการรั ก ษาด้ ว ย การสอดใส่ แ ร่ ใ นปั จ จุ บั น ได้ พั ฒ นาให้ มี ป ระสิท ธิภ าพ สูง ขึ้น ด้ ว ยการวางแผนการรั ก ษาแบบ 3 มิติ ซึ่ ง ใช้ เครื่ อ งเอกซเรย์ ค อมพิ ว เตอร์ จํา ลองการรั ก ษา (CT simulator) สําหรับสร้ างภาพถ่ายเอกซเรย์ตัดขวางเพื่อ ประโยชน์ ใ นการกํา หนดตํา แหน่ ง การรั ก ษาได้ อ ย่ า ง ถู ก ต้ องแต่ ด้ วยเหตุ ท่ี อุ ป กรณ์ ส อดใส่ แ ร่ ผลิ ต จาก แสตนเลสสตีลซึ่งมีค่าเลขอะตอมสูง จึงส่งผลให้ เกิดสิ่ง แปลกปลอมโลหะขึ้นบนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ โดย

สิ่งแปลกปลอมที่เกิดขึ้นมีสาเหตุจากการดูดกลืนโฟตอน ของวัสดุท่ีมีค่าเลขอะตอมสูงส่งผลให้ เหลือโฟตอนส่วน น้ อยเท่า นั้นที่มาถึงตัวรั บภาพ (detector) ทําให้ เกิดสิ่ง แปลกปลอมโลหะขึ้นในภาพตัดขวางซึ่งปรากฏลักษณะ ทั้งแถบสีดาํ (Hypodense) และสีขาว (Hyperdense) (Barrett & Keat, 2004) ผลของสิ่งแปลกปลอมโลหะที่ เกิ ด ขึ้ นบนภาพส่ ง ผลต่ อ การกํา หนดขอบเขตของ ก้ อนมะเร็ง และอวัยวะข้ างเคียงซึ่งอาจทําให้ เกิดความ ผิ ด พลาดและส่ ง ผลต่ อ ปริ ม าณรั ง สี ท่ี ผ้ ู ป่ วยได้ รั บ (O'Daniel et al., 2007) อย่ า งไรก็ต ามสามารถลดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะที่ เกิดขึ้นได้ ด้วยการพั ฒนาอัลกอริทึมทางคณิตศาสตร์ ท่ี เหมาะสมซึ่ ง สามารถแก้ ไขได้ ในขั้ น ตอนการสร้ าง ภาพตั ด ขวาง (image reconstruction) ของ เครื่องเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ ลองการรักษา การลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะดังกล่าวสามารถลดความคลาดเคลื่อน จากการวางแผนการรักษาซึ่งทําให้ ลดความผิดพลาดจาก การให้ ปริมาณรังสีแก่ผ้ ปู ่ วย ปัจจุบนั อัลกอริทมึ ที่ใช้ ลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ท่ีใช้ ใน เชิงพาณิชย์สามารถลดสิ่งแปลกปลอมได้ เช่ น OMAR (Orthopedic Metal Artifact Reduction) ซึ่งเป็ น อัลกอริทมึ ที่ใช้ เฉพาะสําหรับเครื่องเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ ยี่ห้อฟิ ลิปส์ สามารถลดสิ่งแปลกปลอมที่เกิดจากอวัยวะ โลหะเที ย มขนาดใหญ่ ไ ด้ ดี นอกจากนี้ อั ล กอริ ทึ ม FSMAR (Frequency Split Metal Artifact Reduction) ของเครื่องเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ย่ีห้อซีเมนต์สามารถใช้ งานลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะได้ ค่ อ นข้ า งดี (Bar, Schwahofer, Kuchenbecker, & Haring, 2015; Philips, 2012) แต่ด้วยเหตุท่ีอลั กอริทมึ เหล่านี้มีราคา แพงทํา ให้ โ รงพยาบาลทั่ว ไปไม่ ส ามารถซื้ ออัล กอริ ทึม เหล่านี้ใช้ งานได้ จากการศึกษางานวิจัยที่เกี่ยวข้ องพบว่ า ฐิ ติพงศ์ แก้ วเหล็ก และคณะ (Kaewlek et al., 2012) ได้ ท าํ การพั ฒ นาอัล กอริ ทึม ลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะที่ เกิ ด ขึ้ นบริ เ วณกระดู ก สั น หลั ง ส่ ว นเอวในภาพถ่ า ย เอกซเร ย์ ค อมพิ วเต อร์ ส่ ง ผลใ ห้ ส ามา รถล ดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะออกจากภาพได้ ดงั นั้นหากนําหลักการ ดั ง กล่ า วมาใช้ สํา หรั บ ลดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะชนิ ด แสตนเลสสตีลได้ อาจช่ วยลดความคลาดเคลื่อนจากการ รั ก ษาได้ การศึ ก ษาวิ จั ย ในครั้ งนี้ จึ ง ทํ า การพั ฒ นา

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

อัลกอริทมึ สําหรับใช้ ในการลดสิ่งแปลกปลอมโลหะที่เกิด จากอุปกรณ์สอดใส่แร่ ชนิดแสตนเลสสตีลด้ วยหลักการ แก้ ค่าข้ อมูลไซโนแกรม (sinogram) ในขั้นตอนการสร้ าง ภาพตัดขวางของเครื่องเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ ลองการ รักษาเพื่อช่วยให้ สามารถกําหนดขอบเขตของก้ อนมะเร็ง และอวัยวะใกล้ เคียงได้ ชัดเจนมากยิ่งขึ้นเพื่อเพิ่ มความ ถูกต้ องในการรักษาผู้ป่วยด้ วยวิธกี ารสอดใส่แร่ วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ 1. วิธีการศึกษา 1.1 การเก็บข้ อมูลภาพ (data acquisition) ทํา การสร้ างภาพหุ่ น จํ า ลองอุ้ ง เชิ ง กราน (pelvis phantom) ด้ วยเครื่องเอกซเรย์คอมพิ วเตอร์ จําลองการรักษา รุ่น Brilliance Big Bore ยี่ห้อฟิ ลิปส์ 16 slices โดยหุ่นจําลองอุ้งเชิงกรานผลิตจากยางพารามี ค่าความหนาแน่นเท่ากับ 1 kg/m3 ซึ่งมีค่าใกล้ เคียงกับ เนื้อเยื่อมนุ ษย์ ภายในประกอบด้ วยยางพาราและกล่ อง อะคลิลิค (acrylic) บรรจุ นาํ้ ขนาด 12x12x15 cm3 สํา หรั บ ใส่ อุ ป กรณ์ส อดใส่ แ ร่ ช นิ ด สแตนเลสสตีล ของ บริษัท Variesource Fletcher - style Applicator Set (j)

โดยกําหนดให้

J = ∑kj=1 ∑ni=0 �xi (j)

− cj �

รุ่น AL13122005 เทคนิคการตั้งค่าถ่ายภาพเอกซเรย์ คอมพิวเตอร์ประกอบด้ วยค่าความต่างศักย์ไฟฟ้ า 140 kVp ค่ากระแส 300 mAs และค่าความหนาของสไลด์ (slice thickness) เท่ากับ 2 มิลลิเมตร การศึกษาวิจัยใน ครั้งนี้ได้ แบ่งชุดข้ อมูลภาพออกเป็ น 3 ชุด ประกอบด้ วย ข้ อมู ล ภาพหุ่ น จํ า ลองที่ ไ ม่ มี อุ ป กรณ์ ส อดใส่ แ ร่ เ ป็ น ข้ อมูลภาพมาตรฐาน (ground truth : GT) ข้ อมูลภาพ หุ่นจําลองที่มอี ปุ กรณ์สอดใส่แร่โดยไม่มกี ารใช้ อลั กอริทมึ ลดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะ (uncorrected image) และ ข้ อ มู ล ภาพที่มีอุ ป กรณ์ส อดใส่ แ ร่ ท่ีใ ช้ อัล กอริ ทึม ลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะที่พัฒนา (corrected image) 1.2 การพัฒนาอัลกอริทมึ เพื่อลดสิ่งแปลกปลอม โลหะบนภาพถ่ายเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ ลองการรักษา ทํา การพั ฒ นาอั ล กอริ ทึ ม ด้ วยโปรแกรม แมตแลบ โดยอั ล กอริ ทึ ม ประกอบด้ วยขั้ น ตอนการ จําแนกข้ อมูลภาพโลหะ (metal segmentation) แบบ อัตโนมัติ โดยใช้ เทคนิค k-mean clustering เพื่อทําการ จําแนกชุดข้ อมูลในส่วนของโลหะออกจากข้ อมูลอากาศ เนื้อเยื่อ หรือกระดูกภายในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ ดัง สมการที่ 1

(1)

คือการวัดระยะทางระหว่างจุด xi(j) กับจุดศูนย์กลางกลุ่ม 𝑐j k คือ จํานวนกลุ่ม n คือ จํานวนข้ อมูล �xi

− cj �

สําหรับการจําแนกข้ อมูลภาพโลหะ (metal sinogram segmentation) ใช้ วิธกี ารแปลงค่าข้ อมูลทั้งส่วนของโลหะ และเนื้อเยื่อที่ปรากฏบนภาพให้ เป็ นข้ อมูลภาพชนิดไซโน แกรมจากนั้น ทําการหาขอบเขตของไซโนแกรมเฉพาะ ส่วนที่เป็ นโลหะด้ วยหลักการ variable thresholding ดัง สมการที่ 2 – 4 การวิเคราะห์ขอ้ มูลภาพเพื่อจําแนกส่ วน

โลหะในภาพไซโนแกรมใช้ วิ ธีก ารคํา นวณหาค่ า ส่ ว น เบี่ยงเบนมาตรฐาน (σ) และค่าเฉลี่ยของชุดข้ อมูลภาพ โดยการพิ จารณาค่ าข้ อมูลของไซโนแกรมเฉพาะส่วนที่ เป็ นโลหะประเมิน จากจากค่ า ที่ม ากกว่ าส่ ว นเบี่ย งเบน มาตรฐานและค่ า เฉลี่ ย ของชุ ด ข้ อ มู ล ภาพ ตารางที่ 1 สําหรับพารามิเตอร์ท่ใี ช้ การคํานวณสมการที่ 2-4

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

St u,θ = aσ u,θ + bm u,θ

Q ( σ u,θ , m u , ) = θ

 true if   false

St (u , θ ) =

1  0

(2) Sm ( u , θ ) > σ

AND Sm ( u , θ ) > m u,θ

u, θ

, otherwise

(3)

if Q ( σ

,m ) = true u,θ u , θ , ortherwise

โดย

(4)

St (u,θ) คือ ค่า variable thresholding ของไซโนแกรม a และ b คือ พารามิเตอร์สาํ หรับ thresholding m u,θ คือ ค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้ อมูล σ u,θ คือ ค่าส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของเซท ข้ อมูลซึ่งอยู่ในแต่ละ pixel ซึ่งเป็ น บริเวณที่อยู่ใกล้ เคียงไซโนแกรมของโลหะ Sm (u, θ) ตารางที่ 1 แสดงค่าพารามิเตอร์ซ่ึงใช้ ในอัลกอริทมึ ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะในภาพถ่ายเอกซเรย์คอมพิวเตอร์หุ่นจําลองการรักษา Metal thresholding (HU) Large size a1 b1 200 0.05 1 3,000-3,500 Small size a2 b2 15 0.01 1

ทําการทดสอบประสิทธิภ าพของอัลกอริทึม หลั ง จากการจํา แนกข้ อ มู ล ภาพโลหะในภาพไซโน แกรมส่งผลให้ ข้อมูลภาพบางส่วนขาดหายไปจากภาพตั้ง ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะบนภาพเอกซเรย์คอมพิ วเตอร์ ต้ น ซึ่ ง สามารถทํา การประมาณค่ า ใหม่ เ ชิ ง เส้ น (linear หุ่นจําลองอุ้งเชิงกรานด้ วยการเปรียบเทียบผลของการลด interpolation) เพื่อทําการประมาณค่าข้ อมูลที่ขาดหายไป สิ่งแปลกปลอมโลหะด้ วยอัลกอริทมึ ที่พัฒนาขึ้นกับภาพที่ จากนั้นทําการสร้ างภาพใหม่ด้วยเทคนิค Filtered back ไม่ได้ ใช้ อลั กอริทมึ โดยทําการเปรียบเทียบภาพเอกซเรย์ projection ทําให้ ภาพที่ได้ สามารถลดสิ่งแปลกปลอม คอมพิ วเตอร์ในระดับของหุ่ นจําลองจํานวน 2 ระดับ โลหะและทําการคืนค่าข้ อมูลโลหะกลับไปยังตําแหน่งเดิม ได้ แก่ ระดับ A ซึ่งเป็ นตําแหน่งที่ใช้ ในการกําหนดค่า ปริมาณรังสีเพื่อการรักษาผู้ป่วย (point A) โดยปรากฏ เพื่อให้ ภาพมีความสมบูรณ์ย่ิงขึ้น เฉพาะอุปกรณ์สอดใส่แร่ชนิด tandem และระดับ B ที่ 1.3 การประเมินประสิทธิภาพอัลกอริทมึ ลดสิ่ง อยู่ต่าํ กว่า A เป็ นระยะห่ าง 4 เซนติเมตร ซึ่งปรากฏ แปลกปลอมโลหะ อุปกรณ์สอดใส่แร่ชนิด tandem และ ovoids ดังรูปที่ 1

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

(ก)

(ข)

(ค)

รูปที่ 1 รูป ก แสดงภาพถ่ายเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ด้านข้ างหุ่นจําลอง (scout view) เส้ นทึบแสดงตําแหน่งที่ทาํ การวัดระดับ A ซึ่งเป็ น ตําแหน่งที่มีแท่ง tandem และเส้ นประแสดงระดับ B ซึ่งอยู่ต่าํ กว่าระดับ A เป็ นระยะห่าง 4 เซนติเมตรและเป็ นตําแหน่งที่มี tandem และ ovoids รูป ข แสดงภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ระดับ B ที่ปรากฏสิง่ แปลกปลอมโลหะที่เกิดจาก tandem และ ovoids, รูป ค แสดงภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ท่รี ะดับ A ซึ่งปรากฏสิง่ แปลกปลอมโลหะที่เกิดจาก tandem

การเปรียบเทียบผลการลดทอนสิ่งแปลกปลอมโลหะ ใช้ วิธกี ารประเมินค่าเลขซีที (CT number) ในพื้นที่ท่สี นใจ (ROI) ซึ่งกําหนดให้ มีขนาด 30 pixel บนภาพถ่าย เอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ นวน 4 ตําแหน่งในบริเวณรอบ แท่งอุปกรณ์สอดใส่แร่ ดังแสดงในรูปที่ 2 กําหนดให้ hypodense1 และ hypodense2 เป็ นบริเวณที่ปรากฏสิ่ง แปลกปลอมโลหะที่มลี ักษณะความเข้ มภาพสีดาํ มากที่สดุ (hypodense streak) สําหรับ hyperdense1 และ hyperdense2 เป็ นบริเวณที่ปรากฏสิ่งแปลกปลอมโลหะที่

มี ลั ก ษณะความเข้ ม ภาพสี ข าวมากที่ สุ ด (hyperdense streak) โดยทํา การวั ดในภาพเอกซเรย์ คอมพิ วเตอร์ มาตรฐาน ภาพก่อน และหลังใช้ อัลกอริทึม หลังจากนั้น คํา นวณค่ า รากที่ส องของความคลาดเคลื่ อ นกํา ลั ง สอง เฉลี่ย (root mean square error : RMSE) และค่าส่วน เบี่ยงเบนมาตรฐาน (standard deviation: SD) เพื่อ ประเมิ น ประสิ ท ธิ ภ าพการลดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะที่ เกิดขึ้น

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

(ก)

(ข)

รูปที่ 2 ก และ ข แสดงตําแหน่ง ROI ในการวัดค่าเลขซีทใี น regions ทั้ง 4 บริเวณบนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์หุ่นจําลองอุ้งเชิงกราน ที่ใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่ตาํ แหน่ง hypodense1 และ hypodense2 สําหรับวัดค่าในบริเวณที่มีส่งิ แปลกปลอมโลหะที่เป็ นสีดาํ ตําแหน่ง hyperdense1 และ hyperdense2 สําหรับวัดค่าในบริเวณที่มีส่งิ แปลกปลอมโลหะสีขาว

ทําการคํานวณหาค่า RMSE ในภาพเอกซเรย์ การประเมินคุณภาพเชิ งปริ มาณอัลกอริ ทึมลดสิ่ง คอมพิวเตอร์มาตรฐาน ภาพก่อนการแก้ ค่า และภาพหลัง แปลกปลอมโลหะ การแก้ ค่ า ด้ ว ยอัล กอริ ทึม ลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะโดย 1. ค่ารากที่สองของความคลาดเคลือ่ นกําลังสอง คํานวณ ดังสมการที่ 5 เฉลีย่ (Root mean square error : RMSE) 𝑅𝑀𝑆𝐸 =

1 �∑𝑗∈Ω�𝑓𝑗𝑐 𝑁Ω

− 𝑓𝑗𝑜 �

(5)

เมื่อ N Ω คือ จํานวนพิกเซลบริเวณที่สนใจที่วัดบนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ ลองการรักษา 𝑓𝑗𝑐 คือ ค่า CT number บนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ในบริเวณที่สนใจ จากภาพก่อนการแก้ ค่า และภาพหลังการแก้ ค่า 𝑓𝑗𝑜 คือ ค่า CT number บนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ในบริเวณที่สนใจ จากภาพมาตรฐานซึ่งไม่มี สิ่งแปลกปลอมโลหะ ทําการวัดค่า SD ในบริเวณที่สนใจในภาพก่อน 2. ค่ า ส่ ว น เ บี่ ย ง เ บ น ม า ต ร ฐ า น ( standard และหลังใช้ อลั กอริทมึ ที่พัฒนาขึ้นที่ตาํ แหน่งเดียวกันของ deviation: SD) หุ่นจําลองอุ้งเชิงกราน คํานวณได้ จากสมการที่ 6 2 1 𝑆𝐷 = � ∑𝑗∈Ω �𝑓𝑗𝑐 − 𝑓Ω̅ 𝑐 � 𝑁 Ω

เมื่อ

(6)

N Ω คือ จํานวนพิกเซลบริเวณที่สนใจ ที่วัดบนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ ลองการรักษา 𝑓𝑗𝑐 คือ ค่า CT number บนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ในบริเวณที่สนใจ 𝑓Ω̅ 𝑐 คือ ค่าเฉลี่ย CT number บนภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ในบริเวณที่สนใจ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ผลการศึกษา 3.1 ผลการแก้ค่าเพือ่ ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะด้วย อัลกอริทึมที่พฒ ั นาขึ้ น ภาพถ่ายเอกซเรย์คอมพิ วเตอร์หุ่ นจําลองที่ไม่ ใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่ท่รี ะดับที่ A และ B แสดงดังรูป 3 (ก) และ 3 (ง) ตามลํา ดับ ภาพถ่ า ยเอกซเรย์

GT image

คอมพิวเตอร์หุ่นจําลองที่ใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่ โดยไม่ใช้ อัลกอริทึมลดสิ่งแปลกปลอมโลหะที่ระดับ A และ B แสดงดังรูป 3 (ข) และ 3 (จ) ตามลําดับ ภาพถ่าย เอกซเรย์คอมพิ วเตอร์หุ่ นจําลองที่ใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่ โดยใช้ อลั กอริทมึ ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะที่ระดับ A และ B แสดงรูป 3 (ค) และ 3 (ฉ) ตามลําดับ

Uncorrected image

Corrected image

รูปที่ 3 รูป ก แสดงระดับ A ในภาพมาตรฐานไม่ใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่, รูป ข แสดงภาพหลังจากใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่ซ่ งึ ปรากฏเฉพาะ อุปกรณ์สอดใส่แร่ชนิด tandem , รูป ค แสดงรูปหลังจากใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่และแก้ ค่าด้ วยอัลกอริทมึ ลดสิ่งแปลกปลอม โลหะ, รูป ง แสดงระดับ B ในภาพมาตรฐานซึ่งไม่มอี ุปกรณ์สอดใส่แร่, รูป จ แสดงรูปหลังจากใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่ซ่ งึ ปรากฏ อุปกรณ์สอดใส่แร่ชนิด tandem และ ovoids และรูป ฉ แสดงรูปหลังจากใส่อุปกรณ์สอดใส่แร่และหลังแก้ ค่าด้ วยอัลกอริทมึ ลด สิ่งแปลกปลอมโลหะ

3.2 ผลการประเมิ น ประสิ ท ธิ ภ าพการลดสิ่ ง พื้นที่ท่ีสนใจในภาพเอกซเรย์คอมพิ วเตอร์หุ่ นจําลองที่ ระดับ A และระดับ B แสดงในตารางที่ 2 และ 3 และรูป แปลกปลอมโลหะจากอัลกอริทึมที่พฒ ั นาขึ้ น ผลการวิ เ คราะห์ ป ระสิ ท ธิ ภ าพการลดสิ่ ง ที่ 4 และ 5 ตามลําดับ แปลกปลอมโลหะของอัลกอริทึมที่พัฒนาขึ้นในบริเวณ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ตารางที่ 2 แสดงค่ า CT number, SD, RMSE ที่ได้ จากการวัดในบริเวณที่สนใจ hypodense1, hypodense2, hyperdense1, hyperdense2 ซึ่งเป็ นการวัด ROI ในภาพมาตรฐานภาพที่ยังไม่ทาํ การแก้ ค่าและภาพที่ทาํ การแก้ ค่าแล้ ว ณ ตําแหน่งเดียวกัน ในภาพที่ระดับ A ซึ่งปรากฏอุปกรณ์สอดใส่แร่ tandem GT Uncorrected Corrected ROI CT number SD CT number SD RMSE CT number SD RMSE *Hypodense1

-0.76

9.09

-29.32

35.13

45.89

20.05

17.96

29.75

*Hypodense2

-1.25

7.89

-24.39

34.37

37.05

18.45

8.77

19.91

**Hyperdense1

-7.88

10.51

54.13

36.21

70.54

31.05

17.03

39.36

**Hyperdense2

-1.74

9.24

44.15

24.39

51.11

35.15

13.95

38.76

หมายเหตุ * คือ hypodense streak ** คือ hyperdense streak

ตารางที่ 2 แสดงผลการวัดค่า CT number และ SD ในพื้ น ที่ ที่ สน ใจ hypodense1, hypodense2, hyperdense1 และ hyperdense2 ในภาพเอกซเรย์ คอมพิวเตอร์หุ่นจําลองที่ระดับ A สําหรับภาพมาตรฐาน มีค่าเท่ากับ -0.76± 9.09, -1.25±7.89, -7.88±10.51 และ -1.74±9.24 ตามลําดับ สําหรับภาพที่ยังไม่แก้ ค่า มี ค่ า เท่ า กั บ -29.32±35.13, -24.39±34.37, 54.13±36.21 และ 44.15±24.39 ตามลํา ดั บ

ภาพที่ ท ํา การแก้ ค่ า แล้ วมี ค่ า เท่ า กั บ 20.05±17.96, 18.45±8.77, 31.05±17.03 และ 35.15±13.95 ตามลําดับ สําหรับค่ า RMSE ที่บริเวณที่สนใจ hypodense1, hypodense2, hyperdense1 และ hyperdense2 สําหรับ ภาพที่ยังไม่แก้ ค่ามีค่าเท่ากับ 45.89, 37.05, 70.54 และ 51.11 ตามลําดับ ส่วนภาพที่แก้ ค่าแล้ วมีค่าเท่ากับ 29.75, 19.91, 39.36 และ 38.76 ตามลําดับ

รูปที่ 4 แสดงการวัดค่า CT number ในบริเวณที่สนใจตําแหน่ง hypodense1, hypodense2, hyperdense1 และ hyperdense2 เปรียบเทียบระหว่างภาพมาตรฐาน ภาพก่อนใช้ อลั กอริทมึ ภาพหลังใช้ อลั กอริทมึ ที่ได้ จากการวัดในระดับ A

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ตารางที่ 3 แสดงค่า CT number , SD , RMSE ที่ได้ จากการวัดในบริเวณที่สนใจ hypodense1, hypodense2, hyperdense1, hyperdense2 ซึ่งเป็ นการวัด ROI ในภาพระดับ B ซึ่งมี tandem และ ovoids โดยทําการวัด ROI ในภาพมาตรฐานภาพที่ยัง ไม่ทาํ การแก้ ไขและภาพที่ทาํ การแก้ ไขแล้ วที่ตาํ แหน่งเดียวกัน GT Uncorrected Corrected ROI CT number SD CT number SD RMSE CT number SD RMSE *Hypodense1

-4.58

10.43

-37.28

168.18

152.14

5.48

13.51

22.17

*Hypodense2

-5.34

9.73

-487.42

398.83

591.567

1.69

6.37

11.66

**Hyperdense1

-2.32

10.48

80.20

52.40

88.797

41.97

25.19

43.00

**Hyperdense2

-4.56

9.97

131.01

104.06

157.11

45.06

42.27

50.92

หมายเหตุ * คือ hypodense streak ** คือ hyperdense streak

ตารางที่ 3 แสดงผลการวัดค่า CT number และ SD ในพื้นที่ท่สี นใจ hypodense1, hypodense2, hyperdense1, hyperdense2 ในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์หุ่นจําลองที่ ระดับ B สําหรับภาพมาตรฐานมีค่าเท่ากับ -4.58± 10.43, -5.34±9.73, -2.32±10.48 และ -4.56±9.97 ตามลํ า ดั บ สํา หรั บ ภาพที่ ยั ง ไม่ แ ก้ ค่ า มี ค่ า เท่ า กั บ 37.28±168.18, -487.42±398.83, 80.20±52.40 และ 131.01±104.06 ตามลําดับ ส่วนภาพที่แก้ ค่าแล้ ว

รูปที่ 5

มี ค่ า เ ท่ า กั บ 5.48±13.51, 1.69±6.37, 41.97±25.19 และ 45.06±42.27 ตามลําดับ สําหรับค่ า RMSE ที่บริเวณที่สนใจ hypodense1, hypodense2, hyperdense1 และ hyperdense2 สําหรับ ภาพที่ยั งไม่ ไ ด้ แ ก้ ค่ ามีค่า เท่ ากับ 152.14, 591.57, 88.79 และ 157.11 ตามลําดับ ส่วนภาพแก้ ค่าแล้ วมีค่า เท่ากับ 22.17, 11.66, 43.00 และ 50.92 ตามลําดับ

แสดงการวัดค่ า CT number ในบริเวณที่สนใจตําแหน่ ง hypodense1, hypodense2, hyperdense1 และ hyperdense2 เปรียบเทียบระหว่ างภาพมาตรฐาน ภาพก่อนใช้ อัลกอริทมึ และภาพหลังใช้ อัลกอริทมึ แสดงค่ าในระดับ B ซึ่งตํ่ากว่ าระดับ A เป็ นระยะห่าง 4 เซนติเมตร

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

อภิปรายผลการศึกษา การศึกษาครั้งนี้ได้ ทาํ การพัฒนาอัลกอริทมึ เพื่อลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์ ค อมพิ ว เตอร์ หุ่ น จํา ลองอุ้ง เชิ ง กรานที่ใ ส่ อุป กรณ์ส อดใส่ แ ร่ ช นิ ด แส ตนเลสสตี ล ผลการประเมิ น คุ ณ ภาพเชิ ง ปริ ม าณของ อัลกอริทึมที่พัฒนาขึ้นด้ วยการประมาณค่า RMSE ใน บริเวณที่เป็ นสิ่งแปลกปลอมชนิด hypodense streak และ hyperdense streak ผลการประเมิน ภาพเอกซเรย์ คอมพิวเตอร์หุ่นจําลองอุ้งเชิงกรานที่มีส่งิ แปลกปลอมที่ เกิดจาก tandem เพียงอย่างเดียว พบว่าการใช้ อลั กอริทมึ ลดสิ่งแปลกปลอมโลหะสามารถลดสิ่งแปลกปลอมโลหะ ได้ ท้งั แบบ hypodense streak และ hyperdense streak ส่ ง ผลให้ คุ ณ ภาพของภาพดี ข้ ึ นสํ า หรั บ การลดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ท่ปี รากฏ tandem และ ovoids พบว่ าอัลกอริทึม ที่พัฒ นาขึ้น สามารถลดสิ่งแปลกปลอมโลหะได้ ดีโดยเฉพาะบริเวณ hypodense streak ที่ตาํ แหน่ ง hypodense2 ซึ่งให้ ค่า RMSE เท่ากับ 11.66 เมื่อเปรียบเทียบกับภาพก่อนทํา การแก้ ไขซึ่งมีค่า RMSE เท่ากับ 591.567 อย่างไรก็ตาม บริเวณที่มีส่งิ แปลกปลอมโลหะชนิด hyperdense streak สามารถลดสิ่งแปลกปลอมโลหะได้ น้อยกว่าภาพระดับที่มี เฉพาะ tandem เนื่องจากภาพที่มี tandem และ ovoids เกิดสิ่งรบกวนในภาพที่มากกว่า จากการศึกษาวิจัยในครั้งนี้ได้ พัฒนาอัลกอริทมึ ขึ้นโดย ใช้ วิ ธี การจํา แนกข้ อมู ล ภาพโลหะด้ ว ยเทคนิ ค k-mean clustering และ filtered back projection ซึ่งสอดคล้ องกับ ผลการศึกษาของ Roesk, et al ซึ่งใช้ เทคนิค projection interpolation พบว่าอัลกอริทึมสามารถลดสิ่งแปลกปลอม โลหะที่มี tandem เพี ยงอย่ างเดี ยวได้ ดี กว่ า ภาพที่มี tandem และ ovoids แต่ข้อเสียของอัลกอริทมึ ดังกล่ าว ส่ ง ผลให้ ภาพเกิด การ distortion บริ เ วณเนื้ อเยื่ อ ที่อ ยู่ รอบๆ อุปกรณ์สอดใส่แร่ เป็ นผลจากการสร้ างภาพและ การประมาณค่าใหม่ (Roeske, Lund, Pelizzari, Pan, & Mundt, 2003) สําหรับการแก้ ไขข้ อมูลโลหะที่ขาดหาย จากไซโนแกรมด้ วยวิธี sinogram completion ซึ่งแทนที่ ข้ อมู ล ด้ วยการประมาณค่ า ใหม่ ด้ วยข้ อมู ล เนื้ อเยื่ อ ข้ างเคียงกับขนาดของ tandem ใกล้ เคียงกับของจริ ง สอดคล้ องกั บ ฐิ ติ พ งศ์ และคณะ ที่ ป ระยุ ก ต์ ใ ช้

อัลกอริทึม sinogram completion ในภาพเอกซเรย์ คอมพิ วเตอร์ท่ีมีโลหะแท่งเหล็กยึดสกรู พบว่ าสามารถ ช่ ว ยลดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะได้ และมี ป ระสิ ท ธิ ภ าพ ใกล้ เคี ย งกั บ อั ล กอริ ทึ ม ลดสิ่ ง แปลกปลอมโลหะ Gemstone Spectral Imaging (GSI) ของเครื่องเอกซเรย์ คอมพิวเตอร์ย่ีห้อจีอี (GE) (Kaewlek 2015) แต่ อย่างไรก็ตามเนื่องจากเทคนิค sinogram completion มี การประมาณค่ าระหว่ างข้ อมูลที่มีการขาดหายไปทําให้ ขอบของโลหะขาดความคมชั ด ซึ่ ง ให้ ผ ลคล้ า ยคลึ ง กับ เทคนิค inpainting (Meyer, Raupach, Lell, Schmidt, & Kachelrieß, 2012) นอกจากนี้อลั กอริทมึ OMAR (Orthopedic Metal Artifacts Reduction) ของ เครื่ องเอกซเรย์คอมพิ วเตอร์ย่ี ห้อ ฟิ ลิป ส์ ซึ่ งใช้ เทคนิ ค iterative reconstruction ภาพเพื่อลดสิ่งแปลกปลอม โลหะที่เกิดจากผู้ป่วยที่ใช้ อวัยวะโลหะเทียมขนาดใหญ่ สามารถลดสิ่งแปลกปลอมโลหะได้ ดี แต่ มีข้ อจํากัดใน กรณี ท่ี เ ป็ นอุ ป กรณ์ ข นาดเล็ก เช่ น น๊ อ ตหรื อ สกรู ที่ อั ล กอริ ทึ ม ไม่ ส ามารถลดสิ่ ง แปลกปลอมได้ ทั้ ง หมด (Philips, 2012) สํา หรั บ อัล กอริทึม ที่พั ฒ นาขึ้น ใน การศึกษาวิจัยครั้งนี้สามารถลดสิ่งแปลกปลอมขนาดเล็ก ได้ ค่อนข้ างดีโดยเฉพาะแท่ง tandem โดยอัลกอริทึมที่ พัฒนาขึ้นนี้สามารถนําไปใช้ ปรับปรุงคุณภาพของภาพ เอกซเรย์คอมพิวเตอร์ได้ ทุกยี่ห้อ ใช้ เวลาในการคํานวณที่ สั้นเพี ยง 4-6 วิ นาที โดยสามารถใช้ อัล กอริ ทึม ที่ พัฒนาขึ้นสําหรับลดสิ่งแปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์ คอมพิวเตอร์จาํ ลองการรักษาของผู้ป่วยมะเร็งปากมดลูก ที่รักษาด้ วยรังสีรักษาระยะใกล้ เพื่อลดสิ่งแปลกปลอมใน บริเวณมดลูกและลําไส้ ตรงได้ ซึ่งช่ วยให้ แพทย์สามารถ กําหนดขอบเขตก้ อนมะเร็งและอวัยวะต่างๆได้ ดขี ้ นึ สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ การศึกษาวิจัยในครั้งนี้ได้ พัฒนาอัลกอริทมึ เพื่อลดสิ่ง แปลกปลอมโลหะที่เกิดจากอุปกรณ์สอดใส่แร่ในภาพถ่าย เอกซเรย์คอมพิวเตอร์จาํ ลองการรักษาทางรังสีรักษา ผล การลดสิ่งแปลกปลอมโลหะในภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ ของหุ่นจําลองอุ้งเชิงกรานพบว่ าอัลกอริทึมที่พัฒนาขึ้น สา มา ร ถล ด สิ่ ง แ ป ล กป ล อมใ น ภ า พ ที่ ป ร า กฏสิ่ ง แปลกปลอมโลหะได้ โดยอั ล กอริ ทึ ม ที่ พั ฒ นาขึ้ นใน

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

การศึกษาวิจัยครั้งนี้สามารถนําไปใช้ งานเพื่อประโยชน์ใน (2012). Metal Artifacts Reduction of Pedicle Screws on การเพิ่ ม ความถู ก ต้ อ งของการรั ก ษาผู้ ป่ วยมะเร็ง ปาก Spine Computed Tomography Images Using Variable มดลูกในการรักษาด้ วยการใส่แร่ต่อไป ThresholdingTechnique. Phitsanulok: Naresuan University. กิตติกรรมประกาศ

Meyer, E., Raupach, R., Lell, M., Schmidt, B., & Kachelrieß, M. (2012). Frequency split metal ผู้วิจัยขอขอบพระคุณแผนกรังสีรักษา โรงพยาบาล artifact reduction (FSMAR) in computed มหาวิทยาลัยนเรศวร สําหรับการเอื้ออํานวยในการเก็บ tomography. Medical physics, 39(4), 1904-1916. ข้ อ มูล ภาพที่ใช้ ใ นการศึ กษาครั้ ง นี้ คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยนเรศวร สําหรับการเอื้อเฟื้ อสถานที่ในการ National Cancer Institute Department of Medical วิเคราะห์ข้อมูลผลงานวิจัย Services Ministry of Public Health. (2013). National Cancer Control Programmes 2013 – 2017. N.P.: เอกสารอ้างอิง Printing agriculture cooperatives of thailand. Asakit, T. (2011). The preliminary results of HighDose-Rate intracavitary brachytherapy with small-sized O'Daniel, J. C., Rosenthal, D. I., Garden, A. S., Barker, cobalt-60 radioisotope in carcinoma of cervix uteri : J. L., Ahamad, A., Ang, K. K., . . . Holsinger, F. C. The fi rst results of Thailand from Lampang regional (2007). The effect of dental artifacts, contrast media, cancer center. Thai Society of Therapeutic Radiology and experience on interobserver contouring variations in and Oncology, 17(1 Jan -June 2011), 13-24. head and neck anatomy. American journal of clinical oncology, 30(2), 191-198. Bar, E., Schwahofer, A., Kuchenbecker, S., & Haring, P. (2015). Improving radiotherapy planning Philips. (2012). Metal Artifact Reduction for in patients with metallic implants using the iterative Orthopedic Implants (O-MAR). Retrieved from metal artifact reduction (iMAR) algorithm. http://clinical. netforum.healthcare.philips.com/us_en Biomedical Physics & Engineering Express, 1(2), /Explore/White-Papers/CT/Metal-Artifact-Reduction025206. doi: 10.1088/2057-1976/1/2/025206 for-Orthoped ic-Implants-(O-MAR) Barrett, J. F., & Keat, N. (2004). Artifacts in CT: Roeske, J. C., Lund, C., Pelizzari, C. A., Pan, X., & recognition and avoidance 1. Radiographics, 24(6), Mundt, A. J. (2003). Reduction of computed 1679-1691. tomography metal artifacts due to the Fletcher-Suit applicator in gynecology patients receiving intracavitary Kaewlek , T. ( 2015). The Comparison of Metal brachytherapy. Brachytherapy, 2(4), 207-214. doi: Artifacts Reduction between the Commercial Tool http://dx.doi.org/ 10.1016/j.brachy. 2003.08.001 Gemstone Spectral Imaging and NUMAR Program on Lumbar Spine Computed Tomography Images. Srimuninnimit, V., Sriuranpong, V., & Laohavinij, Songkla Med J, 33(4), 177-185. S. (1999). Recognize the cancer as well (1 ed.). American Cancer Society and Pfizer Foundation [In Kaewlek, T., Koolpiruck, D., Thongvigitmanee, S., thai]: Thai Society of Clinical Oncology. Mongkolsuk, M., Chiewvit, P., & Thammakittiphan, S.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

วิธีการแก้ค่าโปรไฟล์หนึง่ มิติของปริมาณรังสีจากภาพพอร์ทลั ในพื้ นทีล่ ารังสีแบบ สมมาตรสาหรับรังสีโฟตอน 6 เมกะโวลต์ นิพนธ์ สายโย1 แสงอุทศิ ทองสวัสดิ์2 และภัสสุรีย์ ชีพสุมนต์1*

1D Beam Profile Correction Method of Portal Image Dosimetry in Symmetric Square Field for 6 MV Photon Beams Nipon Saiyo1, Sangutid Thongsawat2 and Patsuree Cheebsumon1* 1

ภาควิชารังสีเทคนิค คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยนเรศวร จังหวัดพิษณุโลก 65000 งานรังสีรักษา โรงพยาบาลจุฬาภรณ์ กรุงเทพมหานคร 10210 1 Department of Radiological Technology, Faculty of Allied Health Science, Naresuan University Phitsanulok 65000 2 Radiation Oncology Unit, Chulabhorn Hospital Bangkok 10210 * Corresponding author. E-mail address: patsureec@nu.ac.th บทคัดย่อ งานวิ จัยนี้มี วัตถุ ป ระสงค์เพื่ อ หาค่ าแก้ โ ปรไฟล์แบบ 1 มิติ ของลารังสี โฟตอนพลังงาน 6 เมกะโวลต์ ของการวั ดปริม าณรังสีจาก อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ในพื้นที่ฉายแบบสมมาตร ที่มีผลทาให้ การตอบสนองของรังสีตามระยะทางจากกึ่งกลางของลารังสีท่ไี ด้ จาก การวัดรังสีด้วยอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์มีค่าใกล้ เคียงกับปริมาณรังสีจากการคานวณสาหรับใช้ ในอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ ตาม เกณฑ์การยอมรับค่าแกมมาร้ อยละ 2 ในระยะ 2 มิลลิเมตร และร้ อยละ 3 ในระยะ 3 มิลลิเมตร โดยทาการทดสอบวัดปริมาณรังสีด้วย อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ในพื้นที่ฉายแบบสมมาตรขนาดตั้งแต่ 5x5 ถึง 25x25 ตารางเซนติเมตร ทั้งในการประยุกต์ใช้ โปรไฟล์ท่ที า การแก้ ค่าด้ วยวิธีแบบ 1 มิติ (Corrected profile) และไม่ แก้ ค่า (Uncorrected profile) ให้ กับอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ ผลการ ทดลองพบว่า การแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีแบบหนึ่งมิติ ให้ ค่าร้ อยละการเพิ่มขึ้นของอัตราการผ่านค่าแกมมาในการวัดปริมาณรังสีของ อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ ตั้งแต่ -0.32 ถึง +95.47 ตามเกณฑ์การยอมรับร้ อยละ 2 ในระยะ 2 มิลลิเมตร และตั้งแต่ +0.31 ถึง +46.75 ตามเกณฑ์การยอมรับร้ อยละ 3 ในระยะ 3 มิลลิเมตร ตามลาดับ โดยสรุปการประยุกต์ใช้ วิธีการแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีแบบ หนึ่งมิติในอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ สามารถช่วยเพิ่มความถูกต้ องในการวัดปริมาณรังสีของอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ได้ 2

คาสาคัญ: อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ การแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีแบบหนึ่งมิติ ปริมาณรังสีของภาพพอร์ทลั Abstract The aim of this study was to determine the one dimensional profile correction values of EPID dosimetry for various symmetric field sizes in 6 MV photon beam when considered to gamma criteria of 2%, 2 mm, and 3%, 3mm respectively. Several symmetry field sizes, range 5x5 to 25x25 cm2, were applied to 1D profile correction in EPID and measured, including uncorrected profile data. The results showed that the percent improving after applied profile correction was -0.32 to +95.47 in gamma criteria 2%, 2 mm, and +0.31 to +46.75 ingamma criteria 3%, 3 mm, respectively. In conclusion, EPID portal dose after applied to 1D profile correction would assist to improve the accuracy of portal dosimetry. Keywords: Electronic portal imaging device, 1D beam profile correction, Portal imagedosimetry

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

บทนา ในปั จจุ บันสถาบันด้ านรังสีรักษาหลายแห่ งมีการนา อุป กรณ์ รั บ ภาพอิเ ล็ก ทรอนิ ก ส์ (Electronic portal imaging device: EPID) มาใช้ เป็ นอุปกรณ์วัดรังสีเพื่อวัด ปริมาณรังสีท่รี ่างกายผู้ป่วยได้ รับ (In vivo dosimetry) หรื อ เพื่ อประกั น คุ ณ ภาพก่ อ นการฉายรั ง สี ( Patient specific quality assurance)เนื่องด้ วยอุปกรณ์รับภาพ อิ เ ล็ ก ทรอนิ ก ส์ น้ั น ติ ด อยู่ กั บ เครื่ อ งเร่ ง อนุ ภ าคแบบ เส้ นตรง (Linear accelerator: LINAC) ทาให้ สามารถใช้ งานได้ สะดวก รวดเร็ว และไม่ ต้องเชื่อมต่อกับอุปกรณ์ ประมวลผลใดๆ นอกจากนี้ ภายหลังการวัดปริมาณรังสี เสร็ จ สิ้ น ยั ง สามารถวิ เ คราะห์ ข้ อมู ล ด้ วยพี ดี ไ อพี อัลกอริทมึ (PDIP algorithm) ได้ ทันทีโดยอัลกอริทมึ นี้ จะถูก ติดตั้งอยู่ ใ นระบบวางแผนการรักษา (Treatment planning system)ซึ่ ง จะทาหน้ าที่คานวณปริมาณรัง สี ให้ กบั อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ และเปรียบเทียบกับ ภาพพอร์ทัล (Portal image) ระหว่ างภาพที่ได้ จากการ วั ด ปริ ม าณรั ง สี ด้ วยอุ ป กรณ์ รั บ ภาพอิ เ ล็ ก ทรอนิ ก ส์ (Measured doseimage) และภาพพอร์ ทัลจากการ คานวณปริมาณรังสี (Predicted dose image)อย่ างไรก็ ตา มค่ า ป ริ มา ณ รั งสี ท่ี วั ดไ ด้ จา กอุ ป กร ณ์ รั บ ภ า พ อิเล็กทรอนิกส์ยังคงไม่ ถูุ กต้ องเพี ยงพอที่จะนาอุปกรณ์ ดังกล่าวมาใช้ ในทางคลินกิ เนื่องจากข้ อจากัดของอุปกรณ์ รับภาพอิเ ล็กทรอนิกส์บางประการที่ส่ง ผลต่ อค่ าความ ถูกต้ องของปริมาณรังสีท่ีวัดได้ โดยเฉพาะความคลาด เคลื่อนของปริมาณรังสีท่ีเกิดจากการตอบสนองต่อรังสี ของอุ ป กรณ์รั บ ภาพอิเ ล็ก ทรอนิ ก ส์ท่ีต าแหน่ ง นอกจุ ด กึ่งกลาง (Off-axis distance) ของอุปกรณ์รับภาพ จากงานวิ จั ย ที่ ผ่ า นมาได้ มี ผ้ ู ท าการศึ ก ษาการ ตอบสนองต่ อรังสีของอุปกรณ์รั บภาพอิเล็กทรอนิกส์ท่ี ตาแหน่งนอกจุดกึ่งกลาง (Greer, 2005) พบว่าอุปกรณ์ รับภาพอิเล็กทรอนิกส์จะมีการตอบสนองต่อรังสีสูงเมื่อ เปรียบเทียบกับการวัดปริมาณรังสีในนา้ ด้ วยไอออนไน เซชั่นแชมเบอร์ (Ionization chamber) ของขั้นตอนการ ตรวจสอบและนาเข้ าข้ อมูล (Commissioning process) ดังนั้น บริษัทผู้ผลิตจึงแนะนาให้ ทาการสอบเทียบอุปกรณ์ รับภาพอิเล็กทรอนิกส์( EPID calibration) ก่อนการใช้ งาน เพื่ อแก้ ค่าปั จจัย ต่ างๆที่ส่งผลต่อความถูกต้ องของ

ปริ มาณรั ง สีท่ีวัด ได้ จ ากอุป กรณ์รับ ภาพอิเ ล็ก ทรอนิ ก ส์ อย่ า งไรก็ดี แม้ ว่ า จะทาการสอบเทีย บอุป กรณ์รั บภาพ อิเ ล็ก ทรอนิ ก ส์แ ล้ ว แต่ ค่ า ปริ ม าณรั ง สีท่ีวั ด ได้ ยั ง คงไม่ ถูกต้ อง เนื่องจากอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ทาจากอะ มอร์ฟัสซิลิคอน (Amorphous silicon: aSi) ที่มีเลข อะตอม ความหนาแน่ น และคุ ณ สมบั ติ ข องการ ตอบสนองต่ อรั งสีแ ตกต่ า งจากน้า ที่สมมุติเป็ นตัวแทน ผู้ป่วย จากค่าความคลาดเคลื่อนต่างๆ ที่กล่ าวไว้ ในข้ างต้ น ทาให้ มกี ารศึกษาวิธตี ่างๆ หลายวิธเี พื่อแก้ ปัญหาดังกล่าว ในปี ค.ศ. 2009 ได้ มี ก ารศึ ก ษาวิ ธี แ ก้ ค่ า ความ คลาดเคลื่อนของปริมาณรังสี ณ ตาแหน่งถัดจากกึ่งกลาง พร้ อมทั้งหักลบรังสีกระเจิงจากแขนของอุปกรณ์รับภาพ ด้ วยการแก้ ค่าโปรไฟล์ด้วยวิธีหนึ่งมิติ ซึ่งเป็ นการแก้ ค่า โปรไฟล์ของลารังสีท่ีได้ จากการวัดปริมาณรังสีในน้าให้ เป็ นโปรไฟล์ของลารังสีท่ีได้ จากการวัดด้ วยอุปกรณ์รับ ภาพอิเล็กทรอนิกส์ในพื้นที่ลารังสีขนาด 40x30 ตร.ซม. แล้ วนาผลที่ได้ ไปทาการหาอัตราส่วนระหว่างปริมาณรังสี ที่วัดได้ จากอุปกรณ์รับภาพจริงต่อปริมาณรังสีท่ีคานวณ ได้ จากพีดไี อพีอลั กอริทมึ แล้ วนาค่าแก้ ท่ไี ด้ ไปประยุกต์ใช้ กั บ อุ ป ก ร ณ์ รั บ ภ า พ อิ เ ล็ ก ท ร อ นิ ก ส์ (Bailey, Kumaraswamy, & Podgorsak, 2009) ในปี ค.ศ. 2013 ได้ มีการพัฒนาซอฟแวร์ท่เี รียกว่ า แพ็คเกจพีดพี ีซี (PDPC package) ซึ่งเป็ นซอฟต์แวร์ท่ใี ช้ ส าหรั บ แก้ ค่ า ปั จ จั ย ต่ า งๆ ที่มีผ ลต่ อ ความถู ก ต้ อ งของ ปริมาณรังสีท่ีวัดได้ จากอุปกรณ์รับภาพแบบอัตโนมัติท่ี อาศัยหลักการแก้ ค่าสองมิติ (Van Esch, Huyskens, Hirschi, & Baltes, 2013) อีกด้ วย นอกจากนี้ในปี ค.ศ. 2015 Hobson และคณะ (Hobson & Davis, 2015) พบว่ า การแก้ ค่าแบบหนึ่งมิติเป็ นวิธีพ้ ืนฐานที่ทาได้ ง่าย และให้ ผลเช่ นเดียวกับการแก้ ค่าสองมิติ กับซอฟแวร์พีดี พีซี จากการทบทวนวรรณกรรม ทาให้ คณะผู้วิจัยสนใจที่ จะศึกษาการหาค่าแก้ โปรไฟล์ของลารังสีด้วยวิธกี ารแก้ ค่า แบบหนึ่งมิติของการวัดปริมาณรังสีด้วยอุปกรณ์รับภาพ อิเล็กทรอนิกส์ในพื้นที่ลารังสีแบบสมมาตรสาหรับรังสีโฟ ตอนพลังงาน 6 เมกะโวลต์เพื่อนาไปใช้ ประโยชน์ใ นการ ตรวจสอบความถู ก ต้ องของการวั ด ปริ ม าณรั ง สี ด้ ว ย

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

อุป กรณ์รั บภาพอิเ ล็กทรอนิกส์ใ นกระบวนการประกัน คุณภาพก่อนการรักษา

การปรั บ ค่ า นั บ วั ด ของอุ ป กรณ์ รั บ ภาพอิเ ล็ก ทรอนิ ก ส์ (Dose normalization) เป็ นการปรับค่านับวัดปริมาณรังสี ของอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ในหน่วยแคลลิเบชั่นยู นิต (Calibration unit: CU) ให้ สอดคล้ องกับหน่วยที่ใช้ เครื่องมือ และวิธีการทดลอง ในทางคลินิก ที่เรียกว่ ามอนิเตอร์ยูนิต (Monitor unit: MU) โดยต้ องทาการสอบเทียบแยกตามค่าปริมาณรังสี เครื่องมือ เครื่ อ งมื อ ที่ใ ช้ ในงานวิ จั ย ประกอบด้ ว ยเครื่ อ งเร่ ง ต่อเวลาที่ใช้ งานของขนาดพื้นที่ฉายเท่ากับ 10× 10 ตร. อนุ ภาครุ่น ไตรโลจี (Trilogy) ยี่ห้อวาเรียน (Varian) ซม. โดยทั่วไปจะทาการสอบเทียบปริมาณรังสีท่ใี ช้ ในทาง เพื่ อฉายรั ง สี โ ฟตอนพลั ง งาน 6 เมกะโวลต์ คลินิก 100 มอนิเตอร์ยูนิต ให้ เป็ น 100 แคลลิเบชั่นยู (Megavoltage: MV) พร้ อ มกับ อุป กรณ์รั บ ภาพ นิต และ 3.2) การแก้ ค่ า โปรไฟล์ ข องล ารั ง สี (Beam อิเ ล็กทรอนิ กส์รุ่น อะมอร์ ฟั ส ซิ ลิ ค อน 1000 (aSi- profile correction) เพื่ อแก้ ค่าความคลาดเคลื่อนของ 1000) ระบบวางแผนการรักษาอีคลิป เวอร์ช่ัน 10.0 ความเข้ มของรังสีโฟตอนหลังจากผ่าน Flattening filter (ECLIPS10.0) อัลกอริทมึ พีดีไอพีเวอร์ช่ัน 10.0.28. ณ ตาแหน่ งถัดจากกึ่งกลาง โดยใช้ โปรไฟล์ของลารังสีท่ี และโปรแกรมส าหรั บ สอบเทีย บอุ ป กรณ์ รั บ ภาพภาพ ได้ จากการวัดปริมาณรังสีในน้าที่ระยะความลึกที่ได้ รับ ปริมาณรังสีสงู สุด(Depth of dose maximum) จาก อิเล็กทรอนิกส์ร่นุ ไอโฟร์เอ็มวี (I4MV) ขั้ น ตอนการตรวจสอบและน าเข้ าข้ อมู ล จากนั้ น จึ ง วิธีการทดลอง 1. การสอบเที ยบอุ ป กรณ์รบั ภาพอิ เล็ก ทรอนิ ก ส์ ประยุกต์ใช้ ให้ กบั อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ 2. การหาค่าอัตราส่วนระหว่างโปรไฟล์ของลารังสี (EPID calibration) งานวิ จั ย นี้ ได้ ทาการสอบเทีย บอุ ป กรณ์รั บภาพ ที่ ไ ด้จ ากการวัด ปริ ม าณรัง สี ด ้ว ยอุ ป กรณ์ ร ับ ภาพ อิเล็กทรอนิกส์ก่อนการวัดปริมาณรังสีโฟตอนพลังงาน 6 อิ เล็กทรอนิ กส์ และโปรไฟล์ของลารังสี ที่ ได้จากการ เมกะโวลต์ ตามคู่ มือการใช้ งานของบริษั ทผู้ผ ลิต ซึ่ ง มี คานวณ มีข้นั ตอนดังนี้ 1) สร้ างแผนการรักษาสาหรับใช้ การวัดรังสีด้วย หลักการสอบเทียบสอดสอดคล้ องกับงานวิจัยของ Bailey และคณะ (Bailey et al., 2009) โดยแบ่งขั้นตอน อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ และคานวณปริมาณรังสี ออกเป็ น 3 ขั้นตอนหลัก ได้ แก่ 1) สอบเทียบดาร์คฟิ ลด์ ในอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ด้วยเครื่องคอมพิวเตอร์ (Dark field uniformity) เป็ นการแก้ ค่าสัญญาณรบกวน สาหรั บวางแผนการรักษา (Computerized treatment จากส่วนประกอบอิเล็กทรอนิกส์ของอุปกรณ์รับภาพใน planning) โดยกาหนดพื้ นที่ฉ ายรัง สีข นาด 40× 30 ตร. ขณะที่ไม่ มีการฉายรังสี 2) การสอบเทียบฟลัดฟิ ลด์ ซม. และใช้ ค่าปริมาณรังสี 100 มอนิเตอร์ยูนิต 2) วัดรังสีโดยใช้ อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ (Flood field uniformity) เป็ นการแก้ ค่าความแตกต่าง ของความไวในการตอบสนองต่ อ รั ง สีข องพิ ก เซลใน ตามแผนการรั ก ษาที่สร้ า งไว้ จากนั้ น วิ เ คราะห์ ผ ลด้ ว ย อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ โดยขั้นตอนนี้ต้องทาการ โปรแกรมพีดีไอพีในระบบวางแผนการรักษา โดยทาการ สอบเทีย บตามในแต่ ล ะค่ าปริ มาณรั ง สีต่ อเวลา (Dose ลากโปรไฟล์ในแนวทแยงทามุม 45 องศาจากจุดกึ่งกลาง rate) ที่ใช้ ง านและวัดปริมาณรังสีท่ีขนาดพื้ นที่ฉ ายรัง สี บนภาพของปริมาณรังสีท่วี ัดได้ จากการคานวณ และจาก เท่ากับ 40× 30 ตร.ซม. กาหนดค่าระยะจากแหล่งกาเนิด อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ แสดงดังรูปที่ 1 จากนั้น รังสีถึงอุปกรณ์รับภาพเท่ากับ 100 เซนติเมตรและ 3) จะได้ โปรไฟล์ของภาพปริมาณรังสีดังกล่าวในตาแหน่งที่ การสอบเทีย บค่ า นับวัด ปริมาณรั งสี (Imaging dose สัมพันธ์กนั calibration) ประกอบด้ ว ย 2 ขั้น ตอนย่ อยได้ แ ก่ 3.1)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูปที่ 1 กระบวนการเปรียบเทียบโปรไฟล์ในแนวทแยงมุมของปริมาณที่วัดได้ จากการคานวณ และวัดได้ จากอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์

3) หาค่ า อัต ราส่ วนระหว่ า งปริ มาณรั ง สีท่ีวัด ได้ จากอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ต่อปริมาณรังสีจากการ คานวณในอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ด้วยระบบวาง แผนการรั กษา โดยอัต ราส่ วนดังกล่ า วต้ องสัมพั นธ์กับ ตาแหน่งโปรไฟล์ลารังสีท่ไี ด้ จากนา้ 4) แก้ ค่าโปรไฟล์ลารังสีท่ีได้ จากการวัดปริมาณ รั ง สี ใ นน้ า โดยใช้ วิ ธี แ ก้ ค่ า แบบหนึ่ ง มิ ติ ก่ อ นน าไป ประยุกต์ใช้ ในอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ซ่ึงทาได้ โดย นาค่าอัตราส่วนระหว่ างปริมาณรังสีท่วี ัดได้ จากอุปกรณ์ รั บ ภาพอิเ ล็ก ทรอนิ ก ส์ และปริ ม าณรั ง สีท่ีไ ด้ จ ากการ คานวณในอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ (ขั้นตอนที่ 3) ไปทาการแก้ ค่าปริมาณรังสีของโปรไฟล์ท่ไี ด้ จากนา้ ในแต่ ละตาแหน่ งที่สัมพันธ์กัน จากนั้นจะได้ โปรไฟล์ใหม่ท่ที า การแก้ ค่ า แล้ ว จึ ง น าไปประยุ กต์ ใ ช้ ใ นอุป กรณ์ รั บภาพ อิเล็กทรอนิกส์ต่อไป

3. การทดสอบการวัดปริมาณรังสีดว้ ยอุปกรณ์รบั ภาพอิเล็กทรอนิกส์ ทดสอบการวัด ปริมาณรังสีของอุป กรณ์รับภาพ อิเ ล็กทรอนิ กส์ใ นพื้ นที่ฉ ายรั ง สีแ บบสมมาตรสี่เ หลี่ ย ม จัตุรัส ขนาดตั้งแต่ 5x5, 10x10, 15x15, 20x20 และ 25x25 ตร.ซม. ตามลาดับ โดยทาการวางแผนการรักษา ด้ ว ยระบบวางแผนการรั ก ษาส าหรั บ พลั ง งาน 6 เมกะ โวลต์ จากนั้น จึงทาการฉายรังสีด้วยการประยุกต์ใช้ โปร ไฟล์ของลารังสีต่อไปนี้ได้ แก่ 3.1) การประยุ กต์ใช้ โปร ไฟล์ ข องล ารั ง สี ท่ีไ ด้ จ ากน้า โดยไม่ แ ก้ ค่ า (Uncorrected Profile) และ 3.2) การประยุกต์ใช้ โปรไฟล์ท่แี ก้ ค่าให้ กบั อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ด้วยวิธี1 D (Corrected Profile) ทาการวัด ปริมาณรั งสีตามแผนการประกัน คุณภาพที่วางแผนไว้ และเปรียบเทียบค่าปริมาณรังสีท่ไี ด้ กับค่าที่ได้ จากการคานวณด้ วยพีดีไอพีอลั กอริทมึ แสดง ดังรูปที่ 3

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูปที่ 2 กระบวนการทดสอบการวัดปริมาณรังสีของอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ในพื้นที่ฉายรังสีแบบสมมาตร โดยการ แก้ ค่า และไม่แก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสี

4. วิธีวิเคราะห์ขอ้ มูล เปรียบเทียบค่ า ร้ อยละการเพิ่มขึ้นของอัตราการ ผ่านค่าแกมมา (Percent gamma pass rate improving) ที่ได้ จากการวิเคราะห์ผลของพีดไี อพีอลั กอริทมึ โดยใช้ ค่า การยอมรับของค่าการดัชนีแกมมาเท่ากับ ร้ อยละ 2 ใน ระยะ 2 มิลลิเมตร และร้ อยละ 3 ในระยะ 3 มิลลิเมตร

ตามลาดับ รวมทั้งค่าเฉลี่ย และค่าความแปรปรวนของค่า ร้ อยละการผ่ านแกมมาของการประยุ กต์ใช้ โปรไฟล์ท่ีมี การแก้ ค่าด้ วยวิธี 1D และไม่มกี ารแก้ ค่าให้ กบั อุปกรณ์รับ ภาพอิเล็กทรอนิกส์ โดยค่าร้ อยละการเพิ่มขึ้นของอัตรา การผ่านค่าแกมมาหาได้ จากสมการที่ (1)

(1) โดยที่ %𝞬correct คือ ค่าร้ อยละการผ่านของค่า แกมมาในกรณีท่ปี ระยุกต์ใช้ โปรไฟล์ท่มี กี ารแก้ ค่าให้ กบั อุปกรณ์รับภาพ และ %𝞬uncorrect คือ ค่าร้ อยละการ ผ่านของค่าแกมมาในกรณีท่ปี ระยุกต์ใช้ โปรไฟล์ท่ไี ม่มี การแก้ ค่าให้ กบั อุปกรณ์รับภาพ ผลการศึกษา รูปที่ 3 กราฟความสัมพันธ์ระหว่างค่าอัตราส่วนของ ปริมาณรังสีท่วี ัดได้ จากอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ต่อ ปริมาณรังสีท่ไี ด้ จากการคานวณในหน่วยแคลลิเบชั่นยูนิต (Calibration unit: CU) และระยะทางนอกจุดกึ่งกลาง (Off-axis distance) โดยการสร้ างกราฟโพลิเนียลที่เริ่ม จากจุ ด กึ่ง กลางอุป กรณ์รั บภาพไปจนถึง ระยะนอกจุ ด

กึ่งกลางที่ระยะประมาณ 17 เซนติเมตร ของพื้นที่ฉาย รังสีขนาด 40x30 ตร.ซม. รูปที่ 4 กราฟความสัมพันธ์ ระหว่ างค่ า ปริมาณรัง สีใ นหน่ ว ยแคลลิ เ บชั่ น ยู นิต และ ระยะทางนอกจุดกึ่งกลางของโปรไฟล์ลารังสีท่ไี ด้ จากการ วั ด ปริ มาณรั ง สีใ นน้า โดยไม่ มีการแก้ ค่ า (Uncorrected profile) และมีการแก้ ค่า (Corrected profile) สาหรับ การประยุกต์ใช้ ในอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ ตารางที่ 1 แสดงผลการทดสอบการวัดปริมาณรังสี ด้ วยอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ท่มี กี ารประยุกต์ใช้ โปร ไฟล์ ข องล ารั ง สีท่ีไ ด้ จ ากการการวั ด ปริ ม าณรั ง สีใ นน้า เปรียบเทียบกับโปรไฟล์ท่แี ก้ ค่า ที่ระดับพลังงาน 6 เมกะ โวลต์ ในพื้นที่ฉายรังสีสมมาตรขนาดต่างๆ จากผลการ ทดลองพบว่า เมื่อพิจารณาค่าร้ อยละการผ่านค่าแกมมาที่ เกณฑ์การยอมรับร้ อยละ 2 ในระยะ 2 มิลลิเมตร ค่าร้ อย

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ละการเพิ่ ม ขึ้ นของอั ต ราการผ่ า นค่ า แกมมาของการ ประยุกต์ใช้ โปรไฟล์ท้งั สอง ที่พ้ ืนที่ฉายรังสีสมมาตรขนาด 5x5, 10x10, 15x15, 20x20 และ 25x25 ตร.ซม. มี ค่ าเท่ากับ ร้ อยละ 0.32, 6.67, 44.51, 73.98 และ 95.47 ตามลาดับ และเมื่อพิจารณาค่าร้ อยละการผ่าน ค่ า แกมมาที่ เ กณฑ์ ก ารยอมรั บ ร้ อยละ 3 ในระยะ 3 มิล ลิ เ มตร ค่ าร้ อยละการเพิ่ มขึ้น ของอัตราการผ่ า นค่ า แกมมาของการประยุ กต์ใช้ โปรไฟล์ท้ัง สองมีค่ าเท่ากับ ร้ อ ยละ 0.31, 0.10, 14.30, 24.42 และ 46.75

ตามลาดับ จะเห็นได้ ว่า การแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีจะ สามารถเพิ่ มค่ าร้ อยละการผ่ านค่ าแกมมาได้ มากยิ่งขึ้น อย่ า งเห็ น ได้ ชั ด โดยเฉพาะในพื้ นที่ ฉ ายรั ง สี ข นาด 15x15, 20x20, และ 25x25 ตร.ซม. อย่างไรก็ตาม จะ สังเกตเห็นว่าที่พ้ ืนที่ฉายขนาดเล็กจะมีค่าร้ อยละการผ่าน ค่าแกมมาเพิ่ มขึ้นเพียงเล็กน้ อย คือ ในพื้ นที่ฉายขนาด 5x5 ตร.ซม. พบค่าร้ อยละการผ่านค่าแกมมา เท่ากับ 0.32% และ +0.31% สาหรับเกณฑ์การยอมรับ 2%, 2 mm และ 3%, 3 mm ตามลาดับ

รูปที่ 3 กราฟแสดงความสัมพันธ์ระหว่างค่าอัตราส่วนของปริมาณรังสีท่วี ัดได้ จากอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ต่อปริมาณรังสีท่ไี ด้ จาก การคานวณในหน่วยแคลลิเบชั่นยูนิต (Calibration unit: CU) และระยะทางนอกจุดกึ่งกลาง (Off-axis distance) โดยการสร้ าง กราฟโพลิเนียล

รูปที่ 4 กราฟแสดงความสัมพันธ์ระหว่างค่าปริมาณรังสีในหน่วยแคลลิเบชั่นยูนิต (Calibration unit: CU) และระยะทางนอกจุดกึ่งกลาง (Off-axis distance) ของโปรไฟล์ลารังสีท่ไี ด้ จากการวัดปริมาณรังสีในนา้ โดยไม่มีการแก้ ค่า (Uncorrected profile) และที่มีแก้ ค่า (Corrected profile) สาหรับการประยุกต์ใช้ อุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ตารางที่ 1 การทดสอบการวัดปริมาณรังสีด้วยอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ท้งั กรณีท่มี ีการประยุกต์ใช้ โปรไฟล์ของลารังสีท่ไี ด้ จากการ วัดปริมาณรังสีในนา้ และโปรไฟล์ท่แี ก้ ค่าที่ระดับพลังงาน 6 เมกะโวลต์ในพื้นที่ฉายรังสีสมมาตรขนาดต่างๆ Field size Uncorrected profile Corrected profile % Improving 2 (cm ) % Gamma pass rate value % Gamma pass rate value 2%,2 mm 3%,3 mm 2%,2 mm 3%,3 mm 2%,2 mm 3%,3 mm 5x5 92.4 95.7 92.1 96.0 -0.32 0.31 10x10 85.5 97.1 91.2 97.0 6.67 -0.10 15x15 63.8 83.9 92.2 95.9 44.51 14.30 20x20 53.8 77.8 93.6 96.8 73.98 24.42 25x25 46.4 66.1 90.7 97.0 95.47 46.75

เพี ยงทิศทางเดียว โดยให้ ถือว่ าทิศทางตรงข้ ามมีความ สมมาตรกัน ซึ่ ง เมื่อเปรี ยบเทีย บค่ า ร้ อยละการผ่ านค่ า จากผลการทดลองข้ างต้ น พบว่ า การแก้ ค่าโปรไฟล์ แกมมาแบบหนึ่งมิติและสองมิติ พบว่ า มีค่าไม่แตกต่าง ของล ารั ง สี ก่ อ นน าไปประยุ ก ต์ ใ ช้ กั บ อุ ป กรณ์ รั บ ภาพ กันอย่ างมีนัยสาคัญทางสถิติท่ีระดับ 0.05ทาให้ การใช้ อิเล็กทรอนิกส์ จะสามารถช่ วยเพิ่มค่าร้ อยละการผ่านค่า วิธกี ารแก้ ค่าแบบหนึ่งมิติ อาจทาได้ สะดวกกว่าในแง่ของ แกมมาได้ อย่ า งเห็น ได้ ชั ด ในทั้ง สองเกณฑ์การยอมรั บ การแก้ ปัญหาความคลาดเคลื่อนของปริมาณรังสีนอกจุ ด การแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีจะช่วยเพิ่มความถูกต้ องของ กึ่งกลาง ต่อมาได้ มีการพัฒนาวิธีการแก้ ค่าปั จจัยที่มีผล การวั ด ปริ มาณรั งสีด้ วยอุปกรณ์รั บภาพอิเ ล็กทรอนิ ก ส์ ต่อโปรไฟล์ของลารังสี โดยพัฒนาขึ้นเป็ นแพ็คเกจพีดีพีซี มากยิ่งขึ้น โดยจากการทดลองในพื้นที่ฉายรังสีสมมาตร (Portal dose pre-configuration: PDPC)ที่สามารถแก้ ขนาด 20x20 และ 25x25 ตร.ซม. พบว่า ค่าร้ อยละการ ค่าปั จจัยที่มีผลต่ อความถูกต้ องของปริมาณรังสีท่วี ัดได้ เพิ่มขึ้นของการผ่านของค่าแกมมาในวิธที ่ปี ระยุกต์ใช้ โปร จากอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ โดยอาศัยหลักการแก้ ไฟล์ ข องล ารั ง สี ท่ี มี ก ารแก้ ค่ า ให้ กั บ อุ ป กรณ์ รั บ ภาพ ค่ าโปรไฟล์ ของลารัง สีแบบสองมิติ และสามารถแก้ ค่ า อิเล็กทรอนิกส์จะเพิ่ มขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับค่ าร้ อยละ ความแตกต่ างของความไวในการตอบสนองต่ อรังสีไ ด้ การเพิ่มขึ้นของการผ่านของค่าแกมมาในวิธที ่ปี ระยุกต์ใช้ อัตโนมัติ โดยเฉพาะรังสีกระเจิงที่มาจากแขนของอุปกรณ์ โปรไฟล์ ท่ีไ ม่ ไ ด้ แ ก้ ค่ า ถึ ง ร้ อ ยละ 73.98 และ 95.47 รับภาพได้ อย่างไรก็ดีผลที่ได้ หลังจากการแก้ ค่าโปรไฟล์ พิ จ ารณาที่ เ กณฑ์ ก ารยอมรั บ ร้ อยละ 2 ในระยะ 2 ของลารังสีด้วยวิธนี ้ ี จะให้ ค่าร้ อยละการผ่านค่าแกมมาที่ มิลลิเมตร และมีค่าร้ อยละ 24.42 และ 46.75 พิจารณา ใกล้ เคียงกับวิธกี ารแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีแบบสองมิติ ในปี ค.ศ. 2015 Hobson และคณะ (Hobson & ที่เ กณฑ์ ก ารยอมรั บ ร้ อ ยละ 3 ในระยะ 3 มิ ล ลิ เ มตร (ตารางที่ 1) สาหรับพื้นที่ฉายรังสีขนาด 20x20 และ Davis, 2015) ได้ ทาการศึกษาการวัดปริมาณรังสีท่พี ้ ืนที่ ฉายรังสีแบบสมมาตร พื้นที่ฉายรังสีแบบปรับความเข้ ม 25x25 ตร.ซม. ตามลาดับ การแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีน้ัน นอกจากวิธีการแก้ (IMRT field) และพื้ นที่ฉ ายรั ง สีป รั บ ความเข้ ม เชิ ง ค่าแบบหนึ่งมิตแิ ล้ ว ยังมีวิธกี ารแก้ ค่าอื่นๆ อีกหลายวิธที ่ี ปริมาตร (VMAT field) โดยที่มีการแก้ ค่าโปรไฟล์ของ สามารถนามาใช้ ได้ เช่น งานวิจัยของ Bailey และคณะ ลารังสีแบบหนึ่งมิติตามหลักการของ Bailey และคณะ (Bailey et al., 2013)ได้ ศึกษาวิธกี ารแก้ ค่าแบบสองมิติ (Bailey et al., 2009)และสองมิตโิ ดยใช้ แพ็คเกจพีดีพีซี ที่พัฒนาต่อเนื่องมาจากวิธีการแบบหนึ่งมิติของพวกเขา (Van Esch et al., 2013)สาหรับการแก้ ค่าโปรไฟล์แบบ โดยวิธีการแก้ ค่าแบบสองมิติน้ ีจะใช้ หลักการเหมือนการ หนึ่ ง มิติน้ั น จะท าการเก็บ ข้ อ มู ล ทั้ง พื้ นที่ฉ ายรั ง สีข นาด แก้ ค่าแบบหนึ่งมิติ แต่จะทาการแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสี 40x30 ตร.ซม. และ 20x20ตร.ซม. เพื่อแก้ ค่าความไม่ ในทุกๆ ทิศทางของอุปกรณ์รับภาพ ซึ่งในวิธีการแก้ ค่า ถูกต้ องในกรณีท่ตี ้ องการฉายรังสีในพื้นที่ขนาดเล็ก จาก หนึ่งมิติจะทาการแก้ ค่า โปรไฟล์ของลารังสีในแนวเฉียง การทดลองพบว่ าค่ าร้ อยละการผ่านของค่ าแกมมาของ อภิปรายผลการศึกษา

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

วิธีการแก้ ค่าแบบหนึ่งมิติท่เี ก็บข้ อมูลในพื้นที่ฉายขนาด 40x30 ตร.ซม. กับแพ็คเกจพีดีพีซีน้ันให้ ค่าที่ใกล้ เคียง กัน ซึ่งสอดคล้ องกับผลงานวิจัยที่นาเสนอในบทความนี้ สาหรับวิธกี ารแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีท้งั สองวิธดี ังกล่าว นั้น สามารถช่ วยเพิ่ มค่ าร้ อยละการผ่ านค่ าแกมมาอย่ า ง ชั ด เจนเมื่อ เทีย บกับ วิ ธีท่ีไ ม่ มี ก ารแก้ ค่ า (ตารางที่ 1) นอกจากนี้ในทางกลับกัน การแก้ ค่าแบบหนึ่งมิติท่ีเก็บ ข้ อมูลพื้ นที่ฉายรังสีขนาด 20x20 ตร.ซม. กลับให้ ค่าที่ แตกต่างจากวิธแี พ็คเกจพีดีพีซี อย่างไรก็ตามจากผลการ ทดลองในงานวิจัยนี้ได้ แสดงให้ เห็นว่ าการที่ใช้ วิธีการแก้ ค่ า แบบหนึ่ง มิติท่ีเ ก็บ ข้ อ มูล ในพื้ นที่ฉ ายขนาด 40x30 ตร.ซม.เพียงพอที่จะแก้ ปัญหาความไม่ถูกต้ องในกรณีท่ี ต้ องการฉายรังสีในพื้นที่ขนาดเล็กได้ เช่นกัน สรุปผลการศึกษา วิ ธีการแก้ ค่ า โปรไฟล์ ข องล ารั ง สีแ บบหนึ่ ง มิ ติต าม หลักการของ Bailey (Bailey et al., 2009)สามารถ น ามาประยุ ก ต์ ใ ช้ ในการตรวจสอบปริ ม าณรั ง สี ข อง แผนการรักษาแบบสมมาตรเพื่ อเพิ่ มความถูกต้ องของ การวัดปริมาณรังสีด้วยอุปกรณ์รับภาพอิเล็กทรอนิกส์ได้ การแก้ ค่าโปรไฟล์ของลารังสีแบบหนึ่งมิติสามารถเพิ่ ม ความถูกต้ องในการวัดปริมาณรังสีของอุปกรณ์รับภาพ อิเล็กทรอนิกส์ ที่ขนาดพื้นที่5x5 ตร.ซม.ถึง 25x25 ตร. ซม.ได้ ในช่ ว งร้ อยละ-0.32 ถึง +95.47 ที่เกณฑ์ การยอมรับเท่ากับร้ อยละ 2 ในระยะ 2 มิลลิเมตร และ ร้ อยละ+46.75 ถึง +0.31 ที่เกณฑ์การยอมรับร้ อยละ 3 ในระยะ 3 มิลลิเมตรซึ่งผลการวิจัยดังกล่าวสอดคล้ องกับ งานวิจัยอื่นๆ ที่เกี่ยวข้ อง อย่างไรก็ดี งานวิจัยนี้ได้ ทาการ ทดสอบการวัดปริมาณรังสีในพื้นที่ฉายรังสีแบบสมมาตร เพี ย งอย่ า งเดี ย ว หากต้ องการน าอุ ป กรณ์ รั บ ภาพ อิเล็กทรอนิกส์น้ ีไปใช้ ในการวัดปริมาณรังสีในทางคลินิก จะต้ องมีการเพิ่มการทดสอบด้ วยการวัดปริมาณรังสีใน พื้นที่ฉายรังสีในเทคนิคการฉายรังสีต่างๆ เพิ่มเติมด้ วย เช่น พื้นที่ฉายรังสีปรับความเข้ ม หรือ พื้นที่ฉายรังสีปรับ ความเข้ มเชิงปริมาตร เป็ นต้ น เพื่อตรวจสอบว่าวิธกี าร แก้ ค่ าดังกล่ าวจะสามารถเพิ่ มความถูกต้ องของการวั ด ปริ มาณรั ง สีด้ ว ยอุป กรณ์รั บภาพอิเ ล็กทรอนิ กส์ไ ด้ จ ริ ง และนาไปประยุกต์ใช้ ได้ ทางคลินิก

กิตติกรรมประกาศ งานวิจัยนี้สาเร็จลุล่วงไปได้ ด้วยดี ต้ องขอขอบพระคุณ คณาจารย์ และบุคลากรแผนกรังสีรักษาโรงพยาบาลจุฬา ภรณ์ กรุงเทพมหานคร ที่ให้ ความอนุ เคราะห์คาปรึกษา ต่ า งๆ และขอขอบพระคุ ณ โรงพยาบาลที่ จุ ฬ าภรณ์ ท่ี เอื้อเฟื้ อสถานที่ในการเก็บข้ อมูลและวิเคราะห์ผลการวิจัย ในครั้งนี้ เอกสารอ้างอิง Bailey, D. W., Kumaraswamy, L., Bakhtiari, M., & Podgorsak, M. B. (2013). A two-dimensional matrix correction for off-axis portal dose prediction errors. Medical physics, 40(5), 051704. Bailey, D. W., Kumaraswamy, L., & Podgorsak, M. B. (2009). An effective correction algorithm for off-axis portal dosimetry errors. Medical physics, 36(9), 4089-4094. Greer, P. B. (2005). Correction of pixel sensitivity variation and off-axis response for amorphous silicon EPID dosimetry. Medical physics, 32(12), 35583568. Hobson, M. A., & Davis, S. D. (2015). Comparison between an in-house 1D profile correction method and a 2D correction provided in Varian’s PDPC Package for improving the accuracy of portal dosimetry images. Journal of Applied Clinical Medical Physics,16(2). Van Esch, A., Huyskens, D. P., Hirschi, L., & Baltes, C. (2013). Optimized Varian aSi portal dosimetry: development of datasets for collective use. Journal of Applied Clinical Medical Physics, 14(6).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ความสัมพันธ์ในแบบประเมินฟลักเมเยอร์–แอสเซสเมนท์, ดัชนีบาร์เทล, และสโตรกอิมแพค สเกล-16ในผูป้ ่ วยโรคหลอดเลือดสมองชนิดเรื้ อรังทีอ่ าศัยอยู่ในชุมชน วาริสา ทรัพย์ประดิษฐ*, วิมลวรรณ เหียงแก้ ว และชุติมา ชลายนเดชะ

Association of Fugl-Meyer Assessment, Barthel index, and Stroke Impact Scale-16 in individuals with chronic stroke living in community Warisa Suppradist*, Vimonwan Hiengkaew and Chutima Jalayondeja สาขาวิชากายภาพบาบัด คณะกายภาพบาบัด มหาวิทยาลัยมหิดล อาเภอพุทธมณฑล จังหวัดนครปฐม 73170 Physical Therapy Department, Faculty of Physical Therapy, Mahidol University, Phuttamonthon, NakhonPathom 73170 * Corresponding author. E-mail address: warisa.suppradist@gmail.com บทคัดย่อ International Classification of Functioning, Disability and Health หรือ ICF Model ขององค์การอนามัยโลก (WHO) ถูกนามา อธิบายในผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมองเกี่ยวกับความสัมพันธ์ของระหว่างความบกพร่องของร่างกาย และข้ อจากัดในการทากิจกรรม พบว่ามี ความสัมพันธ์ซ่ ึงกันและกัน แบบประเมิ น Fugl-Meyer Assessment เป็ นหนึ่งในแบบประเมินความบกพร่ องของร่ างกายที่มีความ น่าเชื่อถือ มีความแม่นยาและประเมินได้ อย่างครอบคลุมในทุกๆ ความบกพร่อง ส่วนแบบประเมิน Barthel Index และ Stroke Impact Scale-16 เป็ นแบบประเมินข้ อจากัดในการทากิจกรรมที่ประเมินได้ ง่ายและใช้ เวลาน้ อย การศึกษาก่อนหน้ านี้มีการศึกษาความสัมพันธ์ ระหว่างแบบประเมิน Fugl-Meyer Assessment และแบบประเมินBarthel Index แต่ยังไม่มีการศึกษาถึงความสัมพันธ์กับแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16 การวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ของแบบประเมิน Fugl-Meyer Assessment, Barthel Index และ Stroke Impact Scale-16 ในผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมองชนิดเรื้อรังในชุมชนโดยเก็บข้ อมูลในผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมองชนิดเรื้อรัง ทั้งผู้ชายและผู้หญิงที่อาศัยในเขตกรุงเทพและปริมณฑลด้ วยแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) ซึ่งประเมิน 5 ด้ านได้ แก่ การ ควบคุมการเคลื่อนไหว (motor function), การรับความรู้สกึ ผิวกายและตาแหน่งข้ อต่อ (sensory function), มุมองศาการเคลื่อนไหวของ ข้ อต่อของแขนและขา (joint range of motion), ความเจ็บปวดของข้ อต่อขณะเคลื่อนไหว (joint pain), และการทรงตัว(balance) แบบ ประเมินBarthel Index (BI)ฉบับภาษาไทยเก็บข้ อมูลโดยการสัมภาษณ์ และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16)ฉบับ ภาษาไทยโดยการสัมภาษณ์เช่นกัน พบว่า มีค่าความสัมพันธ์ของแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) กับแบบประเมิน Barthel Index (BI) หัวข้ อการควบคุม การเคลื่อ นไหว (motor function) ทั้งในส่ว นของแขน (upper limb)(0.634)และขา(lower limb)(0.605), มุมองศาการเคลื่อนไหวของข้ อต่อของแขนและขา (joint range of motion)(0.443) และระดับคะแนนรวมของแบบ ประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA)(0.637) มีค่าความสัมพันธ์กับแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16)ในหัวข้ อที่ เหมือนกันคือ การควบคุมการเคลื่อนไหว (motor function) ทั้งในส่วนของแขน (upper limb)(0.597) และขา(lower limb)(0.592), มุมองศาการเคลื่อนไหวของข้ อต่อของแขนและขา (joint range of motion)(0.401), และระดับคะแนนรวมของแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA)(0.673)ซึ่งสอดคล้ องกับ ICF model และยังพบว่าแบบประเมิน Barthel Index และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16ต่างก็มีความสัมพันธ์ท่ดี ีเยี่ยม (0.846) ซึ่งกันและกันด้ วย สรุปได้ ว่า แบบประเมินทั้งสามมีความสัมพันธ์กนั โดยสามารถใช้ ประเมินความบกพร่องของร่างกาย และข้ อจากัดในการทากิจกรรมที่ เป็ นหัวข้ อได้ ตาม ICF model และยังสามารถเลือกแบบประเมิน Barthel Index หรือ Stroke Impact Scale-16 ในการประเมินข้ อจากัดใน การทากิจกรรมก็ได้ คาสาคัญ: ความสัมพันธ์ แบบประเมิน โรคหลอดเลือดสมอง ชุมชน Abstract International Classification of Functioning, Disability and Health (ICF) by World Health Organization (WHO) was taken to explain stroke patient about impairment and activity limitation. Fugl-Meyer Assessment is a measurement of impairment for stroke patients that it had good reliability, validity, and covers all impairments. Barthel Index and Stroke Impact Scale-16

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

assessment are measurements of activity limitation that they are easy to assess and take less time to complete. Previous studies found correlation between Fugl-Meyer Assessment and Barthel Index in chronic stroke but there is no study in correlation with Stroke Impact Scale-16. The objective of the present study was to investigate the correlation between Fugl-Meyer Assessment, Barthel Index, and Stroke Impact Scale-16 in individuals with chronic stroke who live in community. This study collected in male and female individuals with chronic stroke living in Bangkok by three measurements. Fugl-Meyer Assessment was used to assess 5 domains include motor function of upper and lower extremity, sensory function, balance, joint range of motion and joint pain. Barthel Index Thai version was used to assess by interview as well as Stroke Impact Scale-16Thai version. The result found that Barthel Index and Fugl-Meyer Assessment had significant correlation with motor function (upper limb)(0.634)and (lower limb)(0.605), range of motion(0.443), and total scores of Fugl-Meyer Assessment)(0.637). Stroke Impact Scale-16 andFugl-Meyer Assessment had significant correlation with motor function (upper limb)(0.597) and (lower limb)(0.592) range of motion (0.401), and total scores of Fugl-Meyer Assessment)(0.673). Moreover, the result found good to excellent correlation (0.846) between Barthel Index andStroke Impact Scale-16. Insummary, three measurements had correlation to assess impairment and activity limitation follow ICF model. Both Barthel Index and Stroke Impact Scale-16 could be used to assess of activity limitation as well. Keywords: correlation, measurement, stroke, community

ต่อคุณภาพชีวิตและเศรษฐกิจต่อไปในอนาคต (Sandin, 1996, pp. 43-49) แบบประเมิน Fugl-Meyer Assessment (FMA) International Classification of Functioning, Disability and Health หรือ ICF Model ขององค์การ เป็ นหนึ่ งในแบบประเมิน ความบกพร่ องของร่ า งกายที่ อนามัยโลก (WHO) อธิบายความสัมพันธ์ของสุขภาพ ประเมินการควบคุมการเคลื่อนไหว (motor function), และสภาวะที่ส่งผลต่อสุขภาพ โดยอธิบายความสัมพันธ์ การรับความรู้สึกผิวกายและตาแหน่ งข้ อต่อ (sensory ของความบกพร่ อ งการท างานหรื อโครงสร้ า งร่ า งกาย function), มุมองศาการเคลื่อนไหวของข้ อต่อของแขน (Impairments of body functions and structures) และขา (joint range of motion), ความเจ็บปวดของข้ อ ข้ อ จ ากัด ในการทากิจ กรรม (Activity limitations) ต่ อขณะเคลื่ อนไหว (joint pain), และการทรงตัว อุ ป ส ร ร ค ก า ร มี ส่ ว น ร่ ว ม ใ น สั ง ค ม ( Participation (balance)(Fugl-Meyer et al., 1975, pp. 13-31) restrictions) สิ่งแวดล้ อม (Environmental factors) และ แบบประเมินนี้ มีความน่ าเชื่อถือและความแม่ นยามาก ปั จจัยส่วนบุคคล (Personal factors)ว่ ามีความสัมพันธ์ (ค่าความน่าเชื่อถืออยู่ท่ี 0.95-0.99) (Duncan et al., และส่งผลซึ่งกันและกัน (World Health Organization, 1983, pp. 1606-1610)(Sanford et al., 1993, 2001) จากรูปแบบดังกล่าวเมื่อนามาใช้ อธิบายในผู้ป่วย pp.447-454) แบบประเมินBarthel Index (BI) เป็ นแบบประเมิน โรคหลอดเลือดสมอง พบว่ามีความสัมพันธ์ระหว่างความ บกพร่องของร่ างกาย การทากิจกรรมและการมีส่วนร่วม ข้ อจากัดในการทากิจกรรม (Activity limitations) โดย ในสังคม (Sveen et al., 1999, pp. 372-377) โดย ประเมิน การดูแลตนเอง (personal care) และการ โรคหลอดเลื อ ดสมองก่ อ ให้ เกิ ด ความบกพร่ อ งของ เคลื่อนไหว (mobility) (Mahoney&Barthel, 1965, pp. ร่างกายในด้ านต่างๆเช่น ภาวะอ่อนแรง การสูญเสียการ 61-65) แบบประเมินนี้เป็ น ที่นิยมใช้ เนื่องจากประเมิน รับความรู้สึก ปั ญหาด้ านการสื่อสาร ความจา ความคิด ได้ ง่ายและใช้ เวลาในการประเมินน้ อย อย่างไรก็ตามแบบ และอารมณ์ ซึ่งความบกพร่ องดังกล่ าวส่งผลต่ อการใช้ ประเมิ น นี้ มี ข้ อ จ ากั ด เรื่ อ งความไวการเปลี่ ย นแปลง งานของแขนขา การควบคุ ม ท่ า ทาง การเดิ น การท า คะแนนที่ค่อนข้ างช้ า (Dromerick&Diringer, 2003, pp. กิจวัตรประจาวัน และการมีส่วนร่วมของสังคม ซึ่งส่งผล 401-408) และไม่ ส ามารถจ าแนกความสามารถที่ แท้ จริงในผู้ป่วยที่ฟ้ ื นตัวดีได้ (ceiling effect)(Sarker บทนา

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

et al., 2012, pp. 1362-1369) ต่อมามีแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16 (SIS-16) ที่แก้ ข้อจากัดความ ไวการเปลี่ ย นแปลงคะแนนและความสามารถในการ จ าแนกความสามารถของผู้ ป่ วยเมื่ อ ใช้ แบบประเมิ น Barthel Index และมีหัวข้ อที่ประเมินระดับความยากของ กิจกรรมมากขึ้น (Duncan et al., 2003, pp. 291-296) การศึ กษาก่ อนหน้ า พบความสัมพั น ธ์ร ะหว่ า งแบบ ประเมิน Fugl-Meyer Assessment (FMA) และ Barthel Index (BI)(Dettmann et al., 1987, pp. 7790;Oliveira et al., 2006, pp. 731-735)แต่ยังไม่มี การศึ ก ษาความสัม พั น ธ์ร ะหว่ า งแบบประเมิ น FuglMeyer Assessment (FMA)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) ดังนั้นวัตถุประสงค์ของ การศึ ก ษาคื อ ศึ ก ษาความสัม พั น ธ์ ข องแบบประเมิ น Fugl-Meyer Assessment (FMA), Barthel Index (BI) และ Stroke Impact Scale-16(SIS-16)ในผู้ป่วยโรค หลอดเลือดสมองชนิดเรื้อรังในชุมชน

ผิดปกติ มองเห็นภาพซ้ อน, มีunilateral neglect หรือ aphasia, และมีประวัติกระดูกแขนหรือขาหักในช่ วง 6 เดือนที่ผ่านมาโดยมีข้นั ตอนการเก็บข้ อมูลดังนี้ ขั้นตอนที่ 1 การคัดเลือกผูเ้ ข้าร่วมงานวิจยั ผู้วิจัยจะ คัดกรองโดยสัมภาษณ์ ข้ อมูลทั่วไป เช่น อายุ และข้ อมูล สุ ข ภาพ จากนั้ น ผู้ สนใจที่ ผ่ า นการคั ด กรองโดยการ สัมภาษณ์เบื้องต้ นจะได้ รับการทดสอบสมรรถภาพสมอง โดย MTMSE การทดสอบ unilateral neglect โดย star cancellation test การทดสอบลานสายตาโดย confrontation visual fields testing และการตรวจการ มองเห็นภาพซ้ อนด้ วยการสัมภาษณ์ ขั้นตอนที่ 2การเก็บข้อมู ลกระบวนการเก็บข้ อมูลจะ ใช้ แบบประเมิน Fugl Meyer Assessment, Barthel index, และ Stroke Impact scale-16 โดยผู้วิจัยทาหน้ าที่ เก็บข้ อมูลจากแบบประเมินทั้งหมดเพี ยงคนเดียว การ เก็บข้ อมูลจะเรียงลาดับ จากแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment, Barthel index, และ Stroke Impact scale16 ตามล าดับ ข้ อ มู ล ทั้ง หมดที่ได้ จ ะถู ก บันทึก ในแบบ วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ บันทึกข้ อมูลและแบบสอบถาม ระหว่างการเก็บข้ อมูลแต่ ละหัวข้ อ ผู้ร่วมวิจัยจะได้ น่ังพักหรือนอนพัก 3-5 นาที การศึกษานี้เก็บข้ อมูลในผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมอง หรื อจนกระทั่ง ผู้เ ข้ า ร่ ว มวิ จั ยพร้ อ มที่จะรับ การทดสอบ ชนิ ด เรื้ อรั ง ในเขตกรุ ง เทพและปริ ม ณฑลที่ เ ข้ า ร่ ว ม หัวข้ อต่อไป โครงการบริการผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมองในชุมชน ซึ่ง เครื่ อ งมื อ ที่ ใ ช้ใ นการวิ จั ย ประกอบไปด้ ว ยแบบ เป็ นความร่ ว มมื อ ของส านั ก งานหลั ก ประกั น สุ ข ภาพ ประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) ซึ่งประเมิน 5 แห่ งชาติและ คณะกายภาพบาบัด มหาวิทยาลัยมหิ ดล ด้ า นได้ แ ก่ การควบคุ ม การเคลื่ อ นไหว (motor โดยมีเกณฑ์การคัดเลือกดังนี้ เป็ นโรคหลอดเลือดสมอง function), การรับความรู้สึกผิวกายและตาแหน่ งข้ อต่ อ ตามค านิ ย ามขององค์ ก ารอนามั ย โลกที่ว่ า เป็ นความ (sensory function), มุมมององศาการเคลื่อนไหวของข้ อ ผิด ปกติอ ย่ า งเฉี ย บพลั น ของระบบประสาทที่เ กิด จาก ต่อของแขนและขา (joint range of motion), ความ หลอดเลื อ ด ส่ ง ผลให้ เกิด อาการอย่ า งเฉี ย บพลั น โดย เจ็บปวดของข้ อต่อขณะเคลื่อนไหว (joint pain), และ อาการสัมพันธ์กบั บริเวณของสมองที่ได้ รับความเสียหาย การทรงตัว (balance) แบบประเมิน Barthel Index และมี อ าการนานมากกว่ า 24 ชั่ ว โมง(World (BI)ฉบับภาษาไทย (Dajpratham et al., 2006, pp. HealthOrganization, 2001), เป็ นมา 6-12 เดือน, มี 1-9) เก็บข้ อมูลโดยการสัมภาษณ์ และแบบประเมิน อายุ ระหว่ าง 18-80 ปี , เป็ นครั้งแรก, มีระดับความ Stroke Impact Scale-16(SIS-16) ฉบับภาษาไทย พิการตามแบบประเมิน modified Rankin scale อยู่ใน (Jalayondeja et al., 2011, pp. 1005-1013) โดยการ ระดับ 2-4, และมีค ะแนนการทดสอบด้ ว ย Modified สัมภาษณ์ สถิติ ห รื อ วิ ธี ก ารอื่ น ๆที่ ใ ช้ใ นการวิ เ คราะห์ข อ้ มู ล Thai Mental State Examination (MTMSE) อย่างน้ อย 23 คะแนน และมีเกณฑ์การคัดออกคือ มีภาวะของโรค (Data Analysis) Descriptive statistics สาหรับสรุป ทางระบบประสาทอื่นๆร่วมด้ วย เช่น โรคพาร์กนิ สัน เนื้อ ข้ อมูลในภาพรวมในรูปของร้ อยละ สัดส่วน ค่าเฉลี่ย และ งอกในสมอง, มี ปั ญ หาการมองเห็น เช่ น ลานสายตา การกระจายของข้ อมูลสถิติ Spearman’s rank correlation

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

coefficient ใช้ ทดสอบความสัมพันธ์ของคะแนนแต่ละ แบบประเมิ น ระหว่ า งคะแนนแต่ ล ะหั ว ข้ อของแบบ ประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) กับคะแนน รวมของแบบประเมิน Barthel Index (BI) และแบบ ประเมินStroke Impact Scale-16(SIS-16) ตั้งค่ า p value ไว้ ท่ี p<0.05 การคานวณขนาดตัวอย่าง (Sample size calculation) เข้ าสูตรคานวณกลุ่มตัวอย่ างจากสถิติ Spearman rank correlation coefficients ตามสูตรด้ านล่ างแล้ วได้ ขนาด ตัวอย่าง 25 ราย n=

( Zα/2 + Z β) [ F(Z0) + F(Z1) ]

ตารางที่ 1 ลักษณะผู้เข้ าร่วมวิจัย ข้อมูลทัวไป ่ เพศ ชาย หญิง ความถนัดของแขน ซ้ าย ขวา ประวัติการสูบบุหรี่ สูบบุหรี่ เคยสูบบุหรี่ ไม่สบู ประวัติการดืม่ เครื่องดืม่ แอลกอฮอล์ ดื่ม เคยดื่ม ไม่ด่มื ข้อมูลทัวไป(N=25) ่ อายุ นา้ หนัก ส่วนสูง ค่าดัชนีมวลกาย ( BMI) ระยะเวลาที่เป็ นโรคหลอดเลือดสมอง (วัน)

งานวิ จั ย นี้ ได้ รั บ การรั บ รองจากคณะกรรมการ จริ ย ธรรมการวิ จั ย ในคนชุ ด กลาง มหาวิ ทยาลั ย มหิ ด ล (MU Central-IRB) เรียบร้ อยแล้ ว ผลการศึกษา งานวิจัยนี้เก็บข้ อมูลจากผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมอง ชนิดเรื้อรังที่อาศัยอยู่ในชุมชนจานวน 25 คน โดยมี ผู้เข้ าร่วมวิจัยมีลักษณะดังแสดงในตารางที่ 1

จานวน(คน) (N=25)

คิดเป็ นร้อยละ

21 4

84.0 16.0

1 24

4.0 96.0

2 13 10

8.0 52.0 40.0

0 13 12

จานวน(คน) ชนิดของโรค หลอดเลือดตีบ (ischemic) หลอดเลือดแตก (hemorrhage ) ข้างที่อ่อนแรง ซ้ าย ขวา

0 52.0 48.0 ค่าเฉลีย่ ± ค่าเบีย่ งเบนมาตรฐาน( mean ± SD ) 62.45 ± 9.54 60.88 ± 9.75 162.48 ± 8.69 23.09 ± 3.59 233 ± 65.08 คิดเป็ นร้อยละ

21 4

84.0 16.0

18 7

72.0 28.0

ตารางที่ 1 (ต่อ) ระดับความพิการตามแบบประเมิน mRs* 2 3 4 ประเภทอุปกรณ์ช่วยเดิน ไม่ใช้ 3-point cane 4-point cane walker * modified Rankin scale

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

10 4 11

40.0 16.0 44.0

14 9 1 1

56.0 36.0 4.0 4.0

ความสัม พั น ธ์ข องระดั บ คะแนนจากแบบประเมิ น Fugl Meyer Assessment(FMA)กับแบบประเมิน Barthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16)พบว่ า คะแนนในแต่ ล ะหั ว ข้ อของ แบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) มี ความสัมพันธ์อย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ (p<0.05) กับ แบบประเมิน Barthel Index (BI) ยกเว้ นหัวข้ อการรับ ความรู้ สึ ก ผิ ว กายและต าแหน่ ง ข้ อต่ อ (sensory

function), ความเจ็บปวดของข้ อต่ อขณะเคลื่อนไหว (joint pain), และการทรงตัว (balance)ส่วนคะแนนใน แต่ ล ะหั ว ข้ อของแบบประเมิ น Fugl Meyer Assessment(FMA) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสาคัญทาง สถิติ (p<0.05) กับแบบประเมิน Stroke Impact Scale16(SIS-16)ยกเว้ นหัวข้ อความเจ็บปวดของข้ อต่อขณะ เคลื่อนไหว (joint pain), และการทรงตัว(balance)ดัง แสดงในตารางที่ 2

ตารางที่ 2 ความสัมพันธ์ของแต่ละหัวข้ อของแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA)กับแบบประเมินBarthel Index (BI)และ แบบประเมินStroke Impact Scale-16(SIS-16) Correlation coefficient (sig.) Fugl Meyer Assessment(FMA) Barthel Index (BI) Stroke Impact Scale-16(SIS-16) ROM 0.443* (0.027) 0.401*(0.047) Pain 0.281 (0.174) 0.315 (0.126) Lower limb motor 0.605* (0.001) 0.592* (0.002) Upper limb motor 0.634* (0.001) 0.597* (0.002) Sensation 0.335 (0.102) 0.404* (0.045) Balance 0.337 (0.099) 0.170 (0.418) Total score 0.637* (0.001) 0.673* (0.000) *มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ (p<0.05)

ส่วนความสัมพั นธ์ระหว่ างแบบประเมิน Barthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-

16(SIS-16)พบว่า มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสาคัญทาง สถิติ (p<0.01)เช่นเดียวกันดังแสดงในตารางที่ 3

ตารางที่ 3ความสัมพันธ์ระหว่างแบบประเมิน Barthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) Correlation coefficient (sig.) 0.846* ( 0.000) Barthel Index (BI)&Stroke Impact Scale-16(SIS-16) *มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ (p<0.01)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

อภิปรายผลการศึกษา ผลการศึกษาพบว่ า หั วข้ อการควบคุมการเคลื่อนไหว (motor function)ทั้งในส่วนของแขน (upper limb)และขา (lower limb), มุมองศาการเคลื่อนไหวของข้ อต่อของแขน และขา (joint range of motion)และระดับคะแนนรวมของ แบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) มี ความสัมพันธ์กบั แบบประเมิน Barthel Index (BI) ขณะที่ หัวข้ อการควบคุมการเคลื่อนไหว (motor function)ทั้งใน ส่วนของแขน (upper limb)และขา(lower limb), มุมองศา การเคลื่อนไหวของข้ อต่อของแขนและขา (joint range of motion),การรั บ ความรู้ สึ ก ผิ ว กายและต าแหน่ ง ข้ อต่ อ (sensory function), และระดับคะแนนรวมของแบบ ประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA)มีความสัมพันธ์ กับแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16)จะ เห็นได้ ว่าแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS16) มีความสัมพันธ์กบั หัวข้ อการรับความรู้สกึ ผิวกายและ ตาแหน่งข้ อต่อ (sensory function) ของแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) ซึ่งไม่พบความสัมพันธ์หัวข้ อนี้ กับแบบประเมิน Barthel Index (BI)ซึ่งอาจส่งผลให้ ค่า ความสัมพันธ์ของคะแนนรวมระหว่ าง FMA กับ SIS16(0.673) มีค่ามากกว่าของ BI (0.637) จาก ICF model ความบกพร่ องการทางานหรือ โครงสร้ างร่างกาย(Impairments of body functions and structures) มีค วามเชื่ อ มโยงกับ ข้ อ จ ากัด ในการท า กิจกรรม (Activity limitations) ผลการศึกษานี้แสดงให้ เห็นว่า เมื่อประเมินด้ วยแบบประเมินที่ใช้ ประเมินหัวข้ อ ดังกล่าว จะมีความสัมพันธ์ของความบกพร่องการทางาน หรือโครงสร้ างร่างกาย(Impairments of body functions and structures) กับข้ อจากัดในการทากิจกรรม (Activity limitations) พบว่ า หากการควบคุ ม การเคลื่ อนไหว (motor function)ทั้งในส่วนของแขน (upper limb)และ ขา(lower limb), มุมองศาการเคลื่อนไหวของข้ อต่อของ แขนและขา (joint range of motion) ของผู้ป่วยโรค หลอดเลื อ ดสมองน้ อ ย ท าให้ การท ากิจ กรรมได้ น้ อ ย เช่ น กั น ซึ่ ง ปรากฏทั้ ง การทดสอบด้ ว ยแบบประเมิ น Barthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) ยิ่ ง ไปกว่ า นั้ น การรั บความรู้สึกผิ ว กายและตาแหน่ งข้ อต่อ (sensory function)ที่ลดลงยัง

ส่งผลต่อการทากิจกรรมดังแสดงให้ เห็นในความสัมพันธ์ ของหั ว ข้ อการรั บความรู้สึกผิว กายและตาแหน่ ง ข้ อต่ อ (sensory function) กับแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) ผลดั ง กล่ า วสะท้ อ นว่ า ถ้ าผู้ ป่ วย ได้ รั บ การแก้ ไ ขเรื่ อ งความบกพร่ อ งการท างานหรื อ โครงสร้ างร่างกาย(Impairments of body functions and structures) ให้ น้ อ ยลง จะท าให้ ข้ อจ ากัด ในการท า กิ จ กรรม (Activity limitations) น้ อยลงไปด้ วย การศึกษาก่อนหน้ า นี้ของ Dettmann (1987) พบ ความสัมพันธ์ระหว่างแบบประเมิน Barthel Index (BI) และแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) ใน ส่ ว นการควบคุ ม การเคลื่ อ นไหวของแขนและระดั บ คะแนนรวมซึ่งสอดคล้ องกับผลการศึกษานี้ คว า ม สั ม พั น ธ์ ที่ ไ ม่ พ บ ใ น กา ร ศึ กษ า นี้ ไ ด้ แ ก่ ความสั ม พั นธ์ ข องแบบประเมิ น Fugl Meyer Assessment(FMA) ในหั วข้ อการรับความรู้สึกผิวกายและ ตาแหน่งข้ อต่อ (sensory function) กับแบบประเมิน Barthel Index (BI) ซึ่งอธิบายได้ จากการศึกษาก่อนหน้ านี้ท่พี บว่ า การรับความรู้สกึ ผิวกาย (sensory function) ไม่ได้ เป็ นปั จจัย หลั ก ที่ ส่ ง ผลต่ อ ข้ อจ ากั ด ในการท ากิ จ กรรม (Activity limitations) แต่ มีปัจจัยอื่นๆที่ส่งผลมากกว่ า เช่ น ความ แข็งแรงของกล้ ามเนื้อ การควบคุมความแข็งแรง และ ภาวะ เกร็ง (spasticity) เป็ นต้ น (Sommerfeld et al.,2004,pp. 134-139;Hill et al.,2014, pp. 339-346)นอกจากนี้ยัง ไม่ พบความสัมพั นธ์ของแบบประเมิ น Fugl Meyer Assessment(FMA) ในหัวข้ อการทรงตัว(balance) กับแบบ ประเมิน Barthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) อธิบายได้ จากการประเมินการ ทรงตัวจะประเมินในท่าทางการนั่ง ยืน และการยืนขาเดียว ซึ่ ง เป็ นท่ า ทางที่ ไ ม่ มี ก ารเคลื่ อนไหว แต่ แ บบประเมิ น Barthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale16(SIS-16) เป็ นการประเมินการทากิจวั ตรประจาวันใน ท่าทางที่มกี ารเคลื่อนไหวเป็ นส่วนใหญ่ เช่น การเดิน การขึ้น บันได การเข้ าห้ องนา้ การเคลื่อนย้ ายตัว การทางานบ้ าน เป็ นต้ น ส่วนความสัมพันธ์ระหว่างแบบประเมิน Barthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS16)พบในระดั บ ดี เ ยี่ ย ม (0.846) แสดงให้ เ ห็น ว่ า สามารถเลือกแบบประเมิน Barthel Index (BI) หรือแบบ ประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16)เพื่อใช้ ใน

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

การประเมิ น ข้ อจ ากั ด ในการท ากิ จ กรรม( Activity limitations) ได้ ท้งั สองแบบประเมิน อย่ างไรก็ตามแบบ ประเมินStroke Impact Scale-16(SIS-16) จะมีหัวข้ อการ ประเมินที่เหนือและแตกต่างจากแบบประเมิน Barthel Index (BI) ได้ แก่ การไปซื้อของ การทางานบ้ าน การเดินเร็ว การ เข้ าและออกจากรถ และการถือของหนักโดยใช้ มือข้ างอ่อน แรง ซึ่งเป็ นกิจกรรมที่ยาก แต่เป็ นกิจกรรมที่เราต้ องใช้ ใน กิจวัตรประจาวันเมื่อต้ องออกสู่ชุมชน แตกต่ างจาก แบบ ประเมิน Barthel Index (BI) ที่ประเมินเฉพาะกิจกรรมที่อยู่ แต่ในบ้ านเท่านั้น นอกจากนี้แบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) ยั งมี ความสั มพั นธ์ กั บหั วข้ อ การรั บ ความรู้สึกผิวกายและตาแหน่ งข้ อต่อ (sensory function) ของแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) ซึ่งไม่ พบความสัมพันธ์หัวข้ อนี้กับแบบประเมิน Barthel Index (BI) ดังนั้นดูเหมือนแบบประเมิน Stroke Impact Scale16(SIS-16) น่ า จะได้ เ ปรี ย บกว่ า แบบประเมิ น Barthel Index (BI) ในความเชื่อมโยงกับความบกพร่ องการทางาน หรือโครงสร้ างร่างกาย (Impairments of body functions and structures) จุ ดแข็งของการศึ กษานี้ คื อ เลื อกใช้ แบบประเมิ นที่ ประเมินได้ ง่าย ไม่ยุ่งยาก ใช้ เวลาน้ อย ใช้ อุปกรณ์น้อยและ สามารถน าไปใช้ ประเมิ นได้ ในชุ มชน ส่ วนจุ ดอ่ อนของ การศึ กษาคือ ผลการศึ กษาไม่ สามารถน าไปอ้ างอิงกลุ่ ม ประชากรได้ ท้งั หมด ข้ อเสนอแนะในการทาวิจัยครั้งต่ อไป คือ ควรเก็บในกลุ่มประชากรที่หลากหลายมากขึ้น ทั้งระดับ ความพิ การและระยะเวลาที่ เ ป็ นโรคหลอดเลื อ ดสมอง นอกจากนี้ควรศึกษาความสัมพั นธ์ของแบบประเมินตาม หัวข้ ออื่นๆของ ICF model ทั้งอุปสรรคการมีส่วนร่วมใน สังคม (Participation restrictions) สิ่งแวดล้ อม (Environmental factors) และปั จจัยส่วนบุคคล (Personal factors) เพื่อจะได้ ความสัมพันธ์ในมิตอิ ่นื ๆเพิ่มมากขึ้น ประโยชน์ ท่ี ไ ด้ รั บ จากการศึ ก ษานี้ คื อ ได้ ทราบ ความสัมพันธ์ท่เี กิดขึ้นจากการประเมินด้ วยแบบประเมิน ที่ใช้ ประเมินหั วข้ อของICF model ทาให้ ทราบว่ าถ้ า สามารถประเมิ น พบความบกพร่ อ งการท างานหรื อ โครงสร้ างร่างกาย (Impairments of body functions and structures) แล้ วสามารถแก้ ไขได้ จะลดข้ อจากัดในการทา กิจ กรรม (Activity limitations) ให้ น้ อ ยลงไปด้ ว ย นอกจากนี้ยังพบว่าแบบประเมิน Stroke Impact Scale-

16(SIS-16)ซึ่งเป็ นแบบประเมินที่เกิดขึ้นใหม่ สามารถ นามาใช้ ประเมิน ข้ อจากัด ในการทากิจกรรม (Activity limitations) ได้ เช่นเดียวกับแบบประเมิน Barthel Index (BI) ที่นิยมใช้ ในปัจจุบนั ได้ สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ การศึกษาครั้งนี้ศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างแบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA)กับแบบประเมินBarthel Index (BI)และแบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS16)ในผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมองชนิดเรื้อรังที่อาศัยอยู่ใน ชุมชน พบว่า แบบประเมิน Fugl Meyer Assessment(FMA) สัมพันธ์กับแบบประเมิน Barthel Index (BI)และแบบ ประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) แต่แตกต่างกัน ในหั วข้ อย่ อยของแบบประเมิ น Fugl Meyer Assessment(FMA) ผลที่ได้ สอดคล้ องกับ ICF model เรื่อง ความสัมพั นธ์ของความบกพร่ องการทางานหรือโครงสร้ าง ร่างกาย (Impairments of body functions and structures) ข้ อจากัดในการทากิจกรรม(Activity limitations) นอกจากนี้ ความสัมพันธ์ของแบบประเมิน Barthel Index (BI)และแบบ ประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) ที่อยู่ในเกณฑ์ดี เยี่ยม ยังแสดงให้ เห็นว่าสามารถใช้ แบบประเมินใดก็ได้ ในการ ประเมินข้ อจากัดในการทากิจกรรม(Activity limitations) แต่ แบบประเมิน Stroke Impact Scale-16(SIS-16) มีบางหัวข้ อ ประเมินที่ยากกว่ า ซึ่งเป็ นกิจกรรมที่สาคัญเมื่อผู้ป่วยต้ อง กลับไปอยู่ในชุมชน กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุ ณ สมาคมศิ ษ ย์ เ ก่ า บั ณ ฑิ ต วิ ท ยาลั ย ที่ ส นั บ ส นุ น ทุ น วิ จั ย บ า ง ส่ ว น แ ล ะ ข อ ข อ บ คุ ณ นั ก กายภาพบาบัดในโครงการกายภาพบาบัดชุ มชนที่ช่ว ย แนะนาผู้เข้ าร่วมวิจัยเบื้องต้ น เอกสารอ้างอิง Dajpratham, P., Meenaphan, R., Junthon, P.,Pianmanakij, S.,Jantharakasamjit, S., &Yuwan, A. (2006). The interrater reliability of Barthel Index(Thai version) in stroke patients. J Thai Rehabil., 16(1), 1-9.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Dettmann, M.A., Linder, M.T.,& Sepic, S.B. (1987). Relationships among walking performance, postural stability, and functional assessments of the hemiplegic patient. Am J Phys Med., 66, 77-90.

Oliveira, R.,Cacho,E.W.A., &Borges, G. (2006). POST-STROKE MOTOR ANDFUNCTIONAL EVALUATIONS :A clinical correlation using FuglMeyer assessment scale, Berg balance scale and Barthel index. Arq Neuropsiquiatr, 64, 731-735.

Dromerick, A.W.,& Diringer, M.N. (2003). Sensitivity to changes in disability after stroke: A comparison of four scales Sandin, K. J., & Mason, K. D. (1996). Manual of useful in clinical trials. Journal of Rehabilitation Research and Stroke Rehabilitation, Boston: Butterworth-Heinemann. Development., 401-408. Sanford, J.M., Laurie, R.S., Stratford, P.W., Duncan, P.W., Lai, S.M., Bode, R.K., Perera, S., &Gowland, C. (1993). Reliability of the Fugl-Meyer &DeRosa, J. (2003). Stroke Impact Scale-16: A brief Assessment for Testing Motor Performance in Patients assessment of physical function. Neurology, 60, 291-296. Following Stroke. PHYS THER, 73, 447-454. Duncan, P.W., Propst, M.,& Nelson, S.G. (1983). Reliability of the Fugl-Meyer assessment of sensorimotor recovery following cerebrovascular accident. Phys Ther., 63, 1606-1610.

Sarker, S., Rudd, A.G.,& Douiri, W. C. (2012). Comparison of 2 Extended Activities of Daily Living Scales With the Barthel Index and Predictors of Their Outcomes: Cohort Study Within the South London Stroke Register(SLSR). Stroke., 43, 1362-1369.

Fugl-Meyer, A.R., Jaasko, L., Leyman, I., Olsson, S.,& Steglind, S. (1975). The post stroke hemiplegic patient. Sommerfeld, D.K., Eek, E.U., Svensson, A.K., I. A method for evaluation of physical performance. Holmqvist, L.W., &Arbin, M.H., (2004) Spasticity After Scand J Rehabil Med, 7, 13-31. Stroke Its Occurrence and Association With Motor Impairments and Activity Limitations. Stroke., 35, 1334Hill, V.A., Fisher, T., Schmid, A.A., Crabtree, J., & 1339. Page, S.J. (2014). Relationship between Touch Sensation of the Affected Hand and Performance of Sveen, U., Bautz-Holter, SĂŠ Dring, K. M., Wyller, T. Valued Activities in Individuals With Chronic Stroke. B.,& Laake, K. (1999) Association between impairments, Topics in stroke rehabilitation,21, 339-346. self-care ability and social activities 1 year after stroke. disability and rehabilitation, 21(8), 372-7. Jalayondeja, C., Sullivan, P.E., Nidhinandana, S., Pichaiyongwongdee, S., & Jareinpituk, S. (2011). World Health Organization. (2001). International Factors related to community participation by stroke Classification of Functioning, Disability and Health victims six month post-stroke. Southeast Asian J (ICF). Retrieved from http://www.who.int/ Trop Med Public Health, 42, 1005-1013. classifications/icf/en/ Mahoney, F.I., &Barthel, D.W. (1965). Functional Evaluation: The Barthel Index. Md State Med J., 14, 61-65.

World Health Organization. (2001). Stroke, Cerebrovascular accident. Retrieved from http://www.who. int/topics/cerebrovascular_accident/en

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ผลของสารเฮสเพอริดินต่อการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสและ การเปลีย่ นแปลงโครงสร้างของลําไส้เล็กในหนู เบาหวาน

พิจิตรา อ๊อดเอก1, อิทธิพล พวงเพชร2, วันทณี หาญช้ าง1 และสะการะ ตันโสภณ1*

Inhibitory Effect of Hesperidin on α−Glucosidase Activity and Small Intestinal Morphology in Diabetic Rats

Phichittra Od-ek1, Ittipon Phoungpetchara2, Wantanee Hanchang1 and Sakara Tunsophon1* 1

ภาควิชาสรีรวิทยา คณะวิทยาศาสตร์การแพทย์ มหาวิทยาลัยนเรศวร จังหวัดพิษณุโลก 65000 ภาควิชากายวิภาคศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์การแพทย์ มหาวิทยาลัยนเรศวร จังหวัดพิษณุโลก 65000 1 Department of Physiology, Faculty of Medical Science, Naresuan University, Phitsanulok 65000 2 Department of Anatomy, Faculty of Medical Science, Naresuan University, Phitsanulok 65000 * Corresponding author. E-mail address: sakarat@nu.ac.th บทคัดย่อ ่ สารเฮสเพอริดินเป็ นสารในกลุ่มฟลาโวนอยด์ทพี บได้ ในส้ มโอ จากการศึกษาที่ผ่านมาพบว่าสามารถลดระดับนํา้ ตาลในเลือด ลดไขมัน และต้ านอนุมูลอิสระ ซึ่งอาจนําไปใช้ ในการรักษาโรคเบาหวานได้ อย่างไรก็ตามยังไม่มีงานวิจัยศึกษาผลการลดนํา้ ตาลของสารเฮสเพอริดิน ต่ อ การยั บ ยั้ ง การทํา งานของเอนไซม์ แอลฟากลู โ คซิ เ ดส ซึ่ งเป็ นเอนไซม์ ท่ีสาํ คั ญ เกี่ ย วข้ อ งกับ การย่ อ ยคาร์ โ บไฮเดรต รวมถึ ง การ เปลี่ยนแปลงลักษณะโครงสร้ างของลําไส้ เล็ก งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อทดสอบการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสของสารเฮสเพอริ ดิน โดยทําการศึกษาในหลอดทดลองเพื่อดูผลของสารเฮสเพอริดินต่อการยับยั้งการทํางานของเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสเมื่อเปรียบเทียบ กับสารมาตรฐานอะคาร์ โบส (Acarbose) และเพื่ อศึกษาผลของสารเฮสเพอริดินต่ อ ลักษณะโครงสร้ างลําไส้ เล็กของหนู ทดลองที่ถู ก เหนี่ยวนําให้ อยู่ในภาวะเบาหวาน โดยการแยกลําไส้ เล็กส่วนต้ นของหนูทดลองที่ได้ รับสารเฮสเพอริดินในปริมาณต่ างๆ เพื่อเปรียบเทียบ การเปลี่ยนแปลงลักษณะโครงสร้ างของลําไส้ เล็กส่วนต้ นในหนูกลุ่มควบคุม หนูเบาหวานและหนูเบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดิน จาก การศึกษาการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสพบว่ า ที่ความเข้ มข้ น 100 และ 200 ไมโครกรัม/มล. เฮสเพอริดินสามารถยับยั้งการ ทํางานของเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสได้ (ร้ อยละ 21.35±5.56 และ 21.98±9.67) ไม่ แตกต่ างจากอะคาร์โบสที่ความเข้ มข้ นเดียวกัน (ร้ อยละ 13.32±5.10 และ 34.55±20.92) แต่เมื่อเพิ่มความเข้ มข้ นถึง 2,000 ไมโครกรัม/มล. สารเฮสเพอริดินแสดงฤทธิ์การยับยั้ง เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสได้ ร้อยละ 33.46±4.24 เมื่อเปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอะคาร์โบส ที่ความเข้ มข้ นเท่ากันมีร้อยละการยับยั้ง การทํางานของเอนไซม์ 83.22±16.69 (P<0.01) ดังนั้นสารเฮสเพอริดินที่ความเข้ มข้ นตํ่ามีความสามารถในการยับยั้งเอนไซม์แอลฟา กลูโคซิเดส โดยมีป ระสิทธิภาพเทียบเท่ากับสารมาตรฐานอะคาร์โบส แต่ อย่ างไรก็ตามประสิท ธิภาพของเฮสเพอริดินจะน้ อยกว่ าสาร มาตรฐานอะคาร์โบสเมื่อความเข้ มข้ นเพิ่มขึ้น นอกจากนี้ ในการศึกษาผลของเฮสเพอริดินต่ อโครงสร้ างของลําไส้ เล็กของหนูทดลองพบว่า หนูเบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดิน ปริมาณ 50 มก./กก.นํา้ หนักตัวและ 100 มก./กก.นํา้ หนักตัว ไม่พบการเปลี่ยนแปลงของความยาว ของวิลไลและโครงสร้ างอื่นๆ แต่เป็ นที่น่าสนใจว่าหนูเบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดีน 100 มก./กก. นํา้ หนักตัวมีจาํ นวนกอบเบลทเซลล์ ลดลงอย่างมีนัยสําคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับหนูเบาหวาน (7.70+3.51 และ 13.67+4.00 ที่ P<0.001 ตามลําดับ) จากผลการ ทดลองที่ได้ สรุปว่าสารเฮสเพอริดินสามารถยับยั้งการทํางานของเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสได้ บางส่วน ซึ่งอาจมีผลต่ อการลดระดับนํา้ ตาล ในเลือดในหนูเบาหวานและมีผลในการลดจํานวนกอบเบลทเซลล์ซ่ ึงอาจมีผลเกี่ยวข้ องกับการลดการระคายเคือง ดังนั้นเฮสเพอริดินอาจ สามารถนํามาประยุกต์ใช้ ในการรักษาผู้ป่วยเบาหวานได้ 2

คําสําคัญ: เฮสเพอริดิน เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส โรคเบาหวาน เซลล์ลาํ ไส้ เล็ก Abstract Hesperidin is a flavonoid found in citrus fruits. It has been reported to decrease plasma glucose, lipids and exhibit strong antioxidant activity. Its benefits could be used for treatment of Diabetes Mellitus (DM). The purposes of this study were to evaluate the effect of hesperidin on α-glucosidase by using in vitro study of difference concentration of hesperidin on α-

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

glucosidase activity compared to acarbose. Secondly, the morphological change of small intestinal structure was observed by using in vivo study of streptozotocin induced diabetic rats. The results demonstrated that hesperidin at low concentration of 100 and 200 µg/ml inhibited α-glucosidase activity by 21.35±5.56 and 21.98±9.67% and showed no significance difference inhibition of enzyme activity when compared to acarbose at the same concentration (13.32±5.10 and 34.55±20.92%). However, at high concentration of 2,000 µg/ml of hesperidin and acarbose, the percentage of inhibition of hesperidin was significantly lower than that of acarbose at P value<0.01 (33.46±4.24 and 83.22±16.69%), respectively. Therefore, the efficiency of α-glucosidase inhibition at low concentration of hesperidin was not difference than acarbose whereas the inhibition efficiency was lower than acarbose at high concentration. In addition, the in vivo study of small intestinal structure showed no difference in amount, length and structure of villi when compared with rats in control, diabetic, diabetic with 50mg/kgBW and 100mg/kgBW hesperidin. However, the amount of goblet cells showed significant increased in diabetic group when compared to control group. Interestingly, the goblet cells were significantly decreased in diabetic group with 100mg/kgBW hesperidin when compared with diabetic group at P value<0.001 (7.70+3.51 and 13.67+4.00), respectively. In conclusion, hesperidin partially inhibited α-glucosidase activity that might reduce plasma glucose level. The treatment of hesperidin at 100mg/kgBW in diabetic rat decreased goblet cells that possibly involve in irritation mechanism of GI tract. Therefore, hesperidin might be useful for clinical application in DM treatment. Keywords: Hesperidin, α-glucosidase, diabetes mellitus, intestinal cell

บทนํา โรคเบาหวานเป็ นความผิดปกติข องร่ างกายที่ผ ลิ ต ฮอร์โมนอินซูลินไม่เพียงพอต่อความต้ องการซึ่งเกิดจาก ความผิดปกติของเบต้ าเซลล์ท่อี ยู่บริเวณไอเลตส์ออฟแลง เกอร์ฮานส์ (Islets of Langerhans) ที่ตับอ่อน โดยปกติ นํ้า ตาลจะเข้ า สู่ เ ซลล์ เ พื่ อ ใช้ เป็ นพลั ง งานภายใต้ ก าร ควบคุมของฮอร์โมนอินซูลิน ในกรณีผ้ ูป่วยโรคเบาหวาน อินซูลินจะไม่ สามารถทํางานได้ อย่ างเต็มประสิทธิภาพ หรื อ การตอบสนองต่ อ อิ น ซู ลิ น ของอวั ย วะเป้ าหมาย ผิด ปกติ ส่ ง ผลให้ ร ะดั บ นํ้า ตาลในเลื อ ดสูง ตลอดเวลา (Mohammed, Koorbanally, & Islam, 2015, pp. 518-527) หากไม่ได้ รับการรักษาอย่างเหมาะสมอาจ นําไปสู่สภาวะของโรคแทรกซ้ อน โดยปกติอนิ ซูลินจะถูก หลั่งออกมาในปริมาณมากหลังรับประทานอาหาร โดยมี หน้ าที่ควบคุมระดับนํ้าตาลในเลือด เก็บสะสมกลูโคสที่ ตับและกล้ ามเนื้อในรูปแบบไกลโคเจน และยับ ยั้งการ เปลี่ ย นไกลโคเจนไปเป็ นกลู โ คส รวมถึ ง กระตุ้ น การ สังเคราะห์โปรตีน โดยเป็ นตัวเคลื่อนย้ ายกรดอะมิโนเข้ าสู่

เ ซ ล ล์ ดั ง นั้ น เ ป้ า ห มา ย ห ลั กใ น กา ร รั ก ษ า ผู้ ป่ ว ย โรคเบาหวาน คือ การลดระดับนํ้าตาลให้ อยู่ ในระดับที่ ใกล้ เคียงกับระดับปกติด้วยการใช้ ยารับประทานและการ ฉีดอินซูลิน ควบคู่ไปกับการควบคุมอาหารและการออก กําลังกาย (Huang et al., 2015) นอกจากนี้ ยังมี ทางเลือกหนึ่งของการรักษาโรคเบาหวาน ได้ แก่ การใช้ ยา ที่มคี ุณสมบัตยิ ับยั้งการทํางานของเอนไซม์ท่เี กี่ยวข้ องกับ การผลิตนํา้ ตาลกลูโคส เช่น เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส และเอนไซม์แอลฟาอะไมเลส (Loh & Hadira, 2011) เอนไซม์ แ อลฟากลู โ คซิ เ ดสซึ่ ง เป็ นเอนไซม์ ท่ี อ ยู่ บริ เ วณผนั ง เซลล์ ข องลํา ไส้ เ ล็ก เอนไซม์ช นิ ด นี้ จะย่ อ ย นํ้า ตาลโพลี แ ซคคาไรด์ ซึ่ ง ประกอบด้ ว ยโมเลกุ ล ของ นํา้ ตาลโมเลกุลเดี่ยวมากกว่า 10 โมเลกุลขึ้นไป เชื่อมต่อ กันด้ วยพั นธะแอลฟาไกลโคซิดิกด้ วยปฏิกิริยาไฮโดรไล ซิส ได้ ผลิตภัณฑ์เป็ นนํ้าตาลโมเลกุลเดี่ยว เช่ น นํ้าตาล กลูโคส เข้ าสู่กระแสเลือดและไปเลี้ยงส่วนต่ าง ๆ ของ ร่างกาย (Zhao et al., 2015, pp. 122–127) ดังรูป ที่ 1

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูปที่ 1 ปฏิกริ ิยาไฮโดรไลซิสของเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส (ปนัดดา ทินบุตร และจินดารัตน์ พิมพ์สมาน, 2554)

ดังนั้นจุ ดประสงค์ในการทําวิจัยนี้จึงมีเพื่อศึกษาวิจัย เกี่ยวกับการออกฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาของเฮสเพอริดินที่มี ต่อการทํางานของแอลฟากลูโคซิเดส เฮสเพอริดินเป็ น สารในกลุ่มฟลาโวนอยด์ พบได้ ในพืชจําพวกสกุลส้ ม จาก การทบทวนวรรณกรรมพบว่าเฮสเพอริดิน มีฤทธิ์ในการ ต้ า นอนุ มู ล อิส ระ ยั บ ยั้ ง การอัก เสบ ลดระดับ ไขมั น ใน เลือดและลดความดัน (Peterson et al., 2006, pp. 7478; Agrawal et al., 2014, pp. 1-2) สารเฮสเพอริดิน

อาจมีฤทธิ์ล ดนํ้าตาลในเลือดและลดภาวะแทรกซ้ อนที่ เกิด จากเบาหวาน โดยผลที่ไ ด้ อ าจเกิด จากการยั บ ยั้ ง เอนไซม์ แ อลฟากลู โ คซิ เ ดส ซึ่ ง สามารถใช้ เป็ นอี ก ทางเลื อกหนึ่ งที่ใช้ ในการลดระดับนํ้าตาลในเลื อดของ ผู้ ป่ วยโรคเบาหวาน การศึ ก ษาฤทธิ์ก ารยั บ ยั้ ง แอลฟา กลูโคซิเดสในงานวิจัยนี้จะใช้ เทคนิคทางสเปกโทรสโคปี เพื่ อติ ด ตามปฏิ กิ ริ ย าไฮโดรไลซ์ ส ารตั้ ง ต้ นไปเป็ น ผลิตภัณฑ์ดงั รูปที่ 2

รูปที่ 2 ปฏิกริ ิยาไฮโดรไลซ์สารตั้งต้ น (ปนัดดา ทินบุตร และจินดารัตน์ พิมพ์สมาน, 2554)

จากรูปที่ 2 พารา-ไนโตรฟี นิล-แอลฟา-ดี-กลูโคไพรา โนไซด์ (p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside: pNPG) เป็ นสารละลายไม่ มีสี ทําหน้ าที่เป็ นซับสเตรทในปฏิกิริยา เมื่อมีเอนไซม์แอลฟากลู โคซิ เดสจะถู กไฮโดรไลซ์ไปเป็ น พารา-ไนโตรฟี นอล (p-nitrophenol) ซึ่งเป็ นสารละลายใสสี เหลืองและนํา้ ตาลกลูโคส ซึ่งสามารถตรวจสอบผลิตภัณฑ์ท่ี เกิดขึ้นโดยวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโน เมตร ถ้ าการทดลองมี ค่ าการดู ดกลื นแสงมากแสดงว่ า

เอนไซม์ แ อลฟากลู โ คซิ เ ดสสามารถทํา งานได้ อย่ า งมี ประสิทธิภาพ แต่ถ้าการทดลองให้ ค่าการดูดกลืนแสงน้ อย แสดงว่ าเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส ไม่ สามารถทํางานได้ อย่างเป็ นปกติ นั่นคือ เอนไซม์ถูกยับยั้งการทํางานด้ วยสาร สมุ นไพรชนิ ดนั้ นๆ ดั งนั้ นการทดสอบกิจกรรมเอนไซม์ แอลฟากลูโคซิเดสจึงเป็ นวิธีการเบื้องต้ นในการทดสอบพืช สมุนไพรได้ อย่างมีประสิทธิภาพ (Lu, Demleitner, Song, Rychlik, & Huang, 2016, pp. 463–471)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ การวิ จั ย เรื่ องนี้ เป็ นการวิ จั ย เชิ ง ทดลอง โดยมี วัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลของเฮสเพอริดินในการยับยั้ง แอลฟากลูโคซิเดส แล้ วศึกษาผลที่มีต่อลําไส้ เล็กที่แยก จากหนู แรทที่ได้ รับ การป้ อนสารเฮสเพอริดิน และการ เปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้น สารเฮสเพอริดิน เอนไซม์แอลฟา กลู โ คซิ เ ดสและสารมาตรฐานอะคาร์ โ บสที่ใ ช้ ใ นการ ทดลองสั่งมาจาก Sigma-Aldrich, MO, USA โดยมี วิธกี ารทดลองดังนี้ การทดลองที่ 1 In vitro study: การทดสอบฤทธิ์ ยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส การทดลองการยับยั้งการทํางานของเอนไซม์แอลฟา กลูโคซิเดสโดยการเปรียบเทียบสารเฮสเพอริดนิ ที่ความ เข้ มข้ น 0, 100, 200, 400, 600, 800, 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 1,800 และ 2,000 มก./มล. เปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอะคาร์โบส 1. In vitro: การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์แอลฟา กลูโคซิเดสของสารเฮสเพอริดนิ 1.1 เติมส่วนผสม ดังนี้

โดย A blank คือ ค่าการดูดกลืนแสง ของสารละลาย phosphate buffer A sample คือ ค่าการดูดกลืนแสงของสารยับยั้ง เอนไซม์ 2. In vivo study: การศึกษาผลของสารเฮสเพอริดินที่ มีต่อลักษณะโครงสร้ างของลําไส้ เล็กส่วนต้ นในหนูทดลอง สัตว์ทดลอง การทดลองนี้ ได้ รั บ การอนุ มั ติ ใ ห้ ดํา เนิ น การ ทดลองโดยคณะกรรมการกํากับและดูแลการเลี้ยงและใช้ สัตว์ มหาวิทยาลัยนเรศวรเรียบร้ อยแล้ ว โดยหนูทดลองที่ นํ า มาใช้ ในการทดลองครั้ ง นี้ เป็ นหนู พั น ธุ์ Sprague Dawley อายุ 2 เดือน โดยสั่งซื้อจากศูนย์สตั ว์ทดลอง แห่ งชาติ ม.มหิ ด ล ต.ศาลายา อ.พุ ท ธมณฑล จ. นครปฐม และนํามาเลี้ยงที่สถานสัตว์ทดลองเพื่อการวิจัย มหาวิทยาลัยนเรศวร หนู ถูกนําพั กและปรับสภาพก่อน การทดลองเป็ นเวลา 1 สัป ดาห์ โดยหนู ท ดลองถู ก

เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเ ดส (2.5 หน่ วย/มล.) 2 ไมโครลิตร สารยับยั้งเอนไซม์ (เฮสเพอริดิน และสาร มาตรฐานอะคาร์โบส) 18 ไมโครลิตร 50 มิลลิโมลาร์ phosphate buffer (pH 6.8) 50 ไมโครลิตร 1.2 นํา ไปบ่ ม ในตู้ ค วบคุ ม อุ ณ หภูมิ 37 องศา เซลเซียส เป็ นเวลา 5 นาที 1.3 จากนั้นเติมส่วนผสม ดังนี้ 1 มิลลิ โมลาร์ p-Nitrophenyl α-Dglucoside (initiate reaction) 20 ไมโครลิตร 50 มิลลิโมลาร์ phosphate buffer (pH 6.8) 50 ไมโครลิตร 1.4 นํา ไปบ่ ม ในตู้ ค วบคุ ม อุ ณ หภูมิ 37 องศา เซลเซียส เป็ นเวลา 20 นาที 1.5 เติม 1 โมลาร์ Sodium carbonate 50 ไมโครลิตร แล้ วนําไปวัดด้ วยเครื่อง Microplate reader โดยวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโน เมตร และใช้ phosphate buffer เป็ น blank โดย เปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอะคาร์โบสซึ่งเป็ นยารักษา โรคเบาหวาน นําไปคํานวณหาร้ อยละของการยับยั้ง (% inhibition) โดยคํานวณได้ จากสมการต่อไปนี้

แบ่งกลุ่มเพื่อแยกเลี้ยงในกรง ๆ ละ 2-3 ตัว เลี้ยงโดย ควบคุมอุณหภูมิและแสงสว่ างตามมาตรฐานของสถาน สัตว์ทดลองเพื่อการวิจัย หนู ทดลองถูกแบ่งออกเป็ น 2 กลุ่มใหญ่ คือหนู กลุ่มควบคุมและหนู กลุ่มเบาหวานซึ่ง เ ห นี่ ย ว นํ า ใ ห้ เ กิ ด ภ า ว ะ เ บ า ห ว า น โ ด ย ก า ร ฉี ด Streptozotocin ขนาด 60 มก./กก.นํา้ หนักตัว เข้ าช่อง ท้ อง เป็ นเวลา 4 สัปดาห์ หนูท่เี ข้ าเกณฑ์เป็ นเบาหวานมี ระดับนํ้า ตาลในเลื อ ดมากกว่ า 200 มก./ดล. การ ทดลองนี้ สัตว์ทดลองจะถูกแบ่งออกเป็ น 4 กลุ่มย่อย คือ 1. กลุ่มควบคุม 2. กลุ่มเบาหวาน คือหนู ท่ีถูกเหนี่ยวนําให้ เป็ น โรคเบาหวาน 3. กลุ่มหนู ท่ีถูกเหนี่ยวนําให้ เป็ นเบาหวานและ ได้ รับ สารเฮสเพอริดิน ขนาด 50 มก./กก.นํ้าหนักตัว เป็ นเวลา 4 สัปดาห์

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

4. กลุ่มหนู ท่ีถูกเหนี่ยวนําให้ เป็ นเบาหวานและ ได้ รับสารเฮสเพอริดิน ขนาด 100 มก./กก.นํา้ หนักตัว เป็ นเวลา 4 สัปดาห์ การเก็บตัวอย่าง ทําการตัดลําไส้ เล็กส่วนต้ น (Duodenum) ซึ่งเป็ นส่วน ที่ติดกับกระเพาะอาหารออกมา 15 เซนติเมตร แล้ วตัด ท่อนละ 1 เซนติเมตร จํานวน 2 ท่อน แช่ ใน 10% Neutral buffered formalin การศึกษาเนื้อเยื่อของลําไส้ (Morphology) ในการศึกษานี้เลือกใช้ Paraffin technique ซึ่งเป็ นวิธี ที่นิ ย มใช้ ใ นการเตรี ย มชิ้ นเนื้ อเยื่ อ เพื่ อ ศึ ก ษาลั ก ษณะ โครงสร้ าง การเปลี่ ย นแปลงทางโครงสร้ างหรื อ การ วิ นิ จ ฉั ย ด้ ว ยกล้ อ งจุ ล ทรรศน์ ซึ่ ง ประกอบด้ ว ยขั้น ตอน ต่างๆ ดังนี้ 1. Fixation เป็ นการนําลําไส้ ท่ใี ช้ สาํ หรับการศึกษา morphology มา fix ใน fixative ทันทีเพื่อป้ องกันการเน่า เปื่ อยของเนื้อเยื่อ (tissue autolysis) ซึ่งเป็ นขั้นตอนการ คงสภาพเนื้อเยื่อ ทําให้ เนื้อเยื่อที่เป็ น semi-fluid เป็ น semi-solid ซึ่งง่ ายต่อขั้นตอนการตัด (trim) ชิ้นเนื้อ และทําให้ เห็นองค์ประกอบภายในเนื้อเยื่อได้ ดี โดยใน

การศึกษานี้เลือกใช้ 10% neutral buffer formalin เป็ น fixation 2. หลังจาก fixation นําเนื้อเยื่อมาผ่านขั้นตอน ดังนี้ 2.1 Washing เป็ นการล้ าง fixation ส่วนเกิน ออกจากเนื้อเยื้อโดยการล้ างด้ วย 70% Ethanol 2.2 Dehydration เป็ นขบวนการทําให้ ช้ ินเนื้อ แห้ งนํ้ า โดยการดึ ง นํ้ า ออกจากเซลล์ โดยการใช้ dehydrant เช่น acetone, ethanol, isopropyl alcohol ใน การทดลองนี้ใช้ ethanol ทั้งนี้เริ่มจากความเข้ มข้ นตํ่าไป หาความเข้ มข้ นสูง เช่น 70%, 80%, 90% และ 100% ethanol ตามลําดับ 2.3 Clearing เป็ นการนําชิ้นเนื้อที่แห้ งนํา้ ไปแช่ ใน xylene เพื่อเป็ นการนํา dehydrant ออกจากเนื้อเยื่อ โดยให้ clearing agent เข้ าไปแทนที่ 2.4 Infiltration เป็ นขั้ น ตอนที่ นํ า สาร embedding media (paraffin) เข้ าสู่เนื้อเยื่อ 2.5 โดยในขั้ น ตอนในหั ว ข้ อ 2.2 จนถึ ง 2.4 เป็ นขั้นตอนที่ใช้ ในการเตรียมเนื้อเยื่อซึ่งใช้ การทํางาน ของเครื่ อ งเตรี ย มเนื้ อเยื่ อ อัต โนมั ติ โดยผู้ วิ จั ย เตรี ย ม สารเคมี และตั้งค่าเวลาในการแช่เนื้อเยื่อไว้ ในสารเคมีแต่ ละโถดังตารางที่ 1

ตารางที่ 1 แสดงกระบวนการเตรียมเนื้อเยื่อสําหรับการศึกษาทางด้ านเนื้อเยื่อ ตําแหน่งโถ สารเคมี 1 2 70% Ethanol 3 80% Ethanol 4 90% Ethanol 5 95% Ethanol 6 95% Ethanol 7 100% Ethanol 8 100% Ethanol 9 Xylene 10 Xylene 11 Paraffin 12 Paraffin

เวลา (นาที) 45 45 45 45 45 45 45 45 45 60 120

3. Embedding โดยใช้ เครื่องทําพาราฟิ นบล็อก วิธกี าร 4. Sectioning of tissue เป็ นการตัด paraffin คือวางเนื้อเยื่อใน mold ซึ่งประกอบด้ วย molten paraffin section ด้ วยเครื่อง Microtome หนา 5 micron ลอยใน wax (embedded) จากนั้นจึงปล่อยให้ เย็นและแข็งตัว อ่ า งนํ้า อุณ หภูมิป ระมาณ 40 องศาเซลเซี ย ส ใช้ ส ไลด์ เคลือบด้ วย 3-aminopropyltriethoxysilane เพื่อป้ องกัน

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ชิ้นเนื้อหลุด รอให้ section แห้ งสนิท โดยทิ้งไว้ ค้างคืน จากนั้นจึงเริ่มทําการย้ อมสี H&E Staining 5. Tissue staining หรือการย้ อมสี ใช้ วิธกี ารย้ อมสี แบบมาตรฐาน โดยใช้ สี Hematoxylin และ Eosin ในการ ย้ อม เรียกการย้ อมนี้ว่า H&E Staining ขั้นตอนในการ ย้ อมสีเนื้อเยื่อ มีวิธดี งั นี้ 5.1 Deparaffinization โดยการดึง paraffin ออก ด้ วย xylene 5.2 Rehydration โดยผ่านสารละลาย ethanol ในความเข้ มข้ นสูง (100% ethanol) ลงไปหาความ เข้ มข้ นตํ่า (70% ethanol) เพื่อเป็ นการเตรียมให้ เซลล์มี ความพร้ อมในการที่จะใช้ ย้อม

5.3 Staining เป็ นการย้ อมสีซ่ึงทําให้ Nucleus และ Nucleolus ติดสีนาํ้ เงินหรือม่วงด้ วย การจุ่มใน Hematoxylin แล้ วตามด้ วยการชะออกด้ วยนํ้าประปา เพื่ อนําสีส่วนเกิน ออกจากเซลล์ แ ละเนื้ อเยื่ อ ตามด้ ว ยจุ่ มสไลด์ ใ น 70% ethanol ก่อนจุ่มลงใน Eosin เพื่อย้ อม cytoplasm 5.4 Dehydration โดยผ่านสารละลาย ethanol ในความเข้ มข้ นตํ่าไปหาความเข้ มข้ นสูงตามลําดับ 5.5 Clearing ใช้ แช่ใน xylene ซึ่งเป็ นตัว clearing agent เพื่อให้ section มีดรรชนีการหักเหน้ อยลงและมี ความโปร่งใสของชิ้นเนื้อมากขึ้นกระบวนการในการย้ อมสี H&E Staining แสดงดังตารางที่ 2

ตารางที่ 2 แสดงกระบวนการย้ อมสี H&E Staining ในลําไส้ เล็กที่แยกจากหนูแรทที่ได้ รับการป้ อนสารเฮสเพอริดิน ลําดับ สารเคมี Deparaffinization 1 Xylene 2 Xylene 3 Xylene Rehydration 1 Absolute Ethanol 2 Absolute Ethanol 3 95% Ethanol 4 70% Ethanol 5 Distiiled water Staining 1 Hematoxylin 2 Tap water 3 70% Ethanol 4 Eosin Dehydration 1 80% Ethanol 2 95% Ethanol 3 Absolute Ethanol 4 Absolute Ethanol Clearing 1 Xylene 2 Xylene 3 Xylene

เวลา 5 min 5 min 5 min 3 min 3 min 3 min 3 min 5 min 3.30 min 10 min 1 min 8 min 1 min 1 min 3 min 5 min 5 min 5 min 2 min

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

5.6 ทํ า การปิ ดสไลด์ โ ดยการหยด mounting medium แล้ วปิ ดด้ วย coverslip เพื่ อป้ องกันการขีดข่วน เพิ่ มความชั ดเจนในการส่ องกล้ องจุ ลทรรศน์และสามารถ เก็บไว้ ได้ นาน 5.7 วิเคราะห์ข้อมูล 5.7.1 ทํา การศึ ก ษาสไลด์ ภ ายใต้ กล้ อง จุ ลทรรศน์ โดยใช้ กาํ ลังขยายตํ่าสุดก่อนคือ 4x เพื่อดู รายละเอียดส่วนต่างๆ อย่างคร่าว ๆ ของลําไส้ จากนั้นจึง เพิ่ มกําลังขยายเป็ น10x และ 40x ตามลําดับ เพื่ อ ทําการศึกษาอย่างละเอียดในส่วนอื่น ๆ ของลําไส้ 5.7.2 นํา สไลด์ท่ีไ ด้ ไ ปศึ ก ษาภายใต้ ก ล้ อ ง จุลทรรศน์ท่มี กี ารเชื่อมต่อกับโปรแกรมการถ่ายภาพ และ ทําการบันทึกภาพที่ได้ เพื่อนําไปประกอบการอธิบายใน การนําเสนอ การวิเคราะห์ทางสถิติ ผลการทดลองที่ได้ จะนําไปวิเคราะห์ค่าความแตกต่าง โดยใช้ โปรแกรมสําเร็จรูป SPSS 17.0 การเปรียบเทียบ ค่าระหว่างกลุ่มจะใช้ Student’s t test หรือ One Way ANOVA ในการวิเคราะห์ผล ค่าความแตกต่างแสดงใน รูปของ mean+SD ที่ P value<0.05

ผลการศึกษา ตอนที่ 1 In vitro study: ผลการทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสของสารเฮสเพอริดนิ จากผลการวิเคราะห์ร้อยละการยับยั้งเอนไซม์แอลฟา กลู โ คซิ เ ดสของสารเฮสเพอริ ดิ น มี ร้ อยละการยั บ ยั้ ง 33.46±4.24 ที่ความเข้ มข้ น 2000 ไมโครกรัม/มล. แสดงฤทธิ์ในการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสได้ ดี ที่สดุ รองลงมาคือความเข้ มข้ น 1800 ไมโครกรัม/มล. โดยยับยั้งได้ ร้อยละ 27.30±0.73 แต่เมื่อเปรียบเทียบ สารเฮสเพอริดินกับสารมาตรฐานอะคาร์โบส พบว่ ามีค่า ร้ อ ยละการยั บ ยั้ ง น้ อ ยกว่ า มาก อย่ า งไรก็ต ามที่ค วาม เข้ มข้ นตํ่า 100 และ 200 ไมโครกรัม/มล. พบว่าร้ อยละ การยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสของสารเฮสเพอริดิน มีค่าไม่แตกต่างจากอะคาร์โบส โดยค่าร้ อยละการยับยั้ง ของสารเฮสเพอริดินอยู่ท่ี 21.35±5.56, 21.98±9.67 ในขณะที่ ค่ า ร้ อยละการยั บ ยั้ งของอะคาร์ โ บสอยู่ ท่ี 13.32±5.10, 34.55±20.92 ตามลําดับ (ตารางที่ 3)

ตารางที่ 3 แสดงผลร้ อยละการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสของสารเฮสเพอริดินและอะคาร์โบส ความเข้มข้น ร้อยละการยับยั้งของ ร้อยละการยับยั้งของ (ไมโครกรัม/มล.) สารอะคาร์โบส สารเฮสเพอริดิน 100 13.32±5.10 21.35±5.56 200 34.55±20.92 21.98±9.67 400 56.98±18.44 20.50±10.59a 600 57.42±9.92 20.39±9.75aa 800 66.09±16.09 22.24±6.63aa 1000 65.43±10.95 18.15±8.37aa 1200 70.59±7.34 23.45±17.16aa 1400 74.28±16.40 17.01±1.83aa 1600 76.47±12.73 25.31±10.90aa 1800 79.60±4.18 27.30±0.73aaa 2000 83.22±16.69 33.46±4.24aa,b a,aa,aaa แสดงความแตกต่ างทางสถิติท่ ี P value<0.05, 0.01 และ 0.001 ตามลําดับ เมื่อเปรียบเทียบร้ อยละการยับยั้งการทํางานของ เอนไซม์ระหว่างสารอะคาร์โบสและสารเฮสเพอริดิน ค่าร้ อยละการยับยั้งของเอนไซม์แสดงในรูป mean+SD b แสดงความแตกต่างทางสถิติท่ี P value<0.05 เมื่อเปรียบเทียบร้ อยละการยับยั้งการทํางานของเอนไซม์ระหว่ างสารเฮสเพอริดินที่ความ เข้ มข้ น 100 ไมโครกรัม/มล. กับความเข้ มข้ นต่าง ๆ ค่าร้ อยละการยับยั้งของเอนไซม์แสดงในรูป mean+SD

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ตอนที่ 2 In vivo study: การศึกษาผลของสารเฮสเพ อริดินที่มีต่อลักษณะโครงสร้ างของลําไส้ เล็กส่วนต้ นใน หนูทดลอง A1

ผลการศึกษาเนื้อเยื่อของลําไส้เล็กของหนูแรทที่ได้ รับสาร เฮสเพอริดนิ

60 µm

200 µm

20 µm

60 µm

200 µm

20 µm

60 µm

200 µm

20 µm

60 µm

20 µm

รูปที่ 3 แสดงการเปลี่ยนแปลงของลักษณะโครงสร้ างของลําไส้ เล็กในหนูแรทที่ได้ รับสารเฮสเพอริดิน โดยภาพ A คือกลุ่มควบคุม ภาพ B คือกลุ่มเบาหวานที่ไม่ ได้ รับสารเฮสเพอริดิน ภาพ C คือกลุ่มเบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดิน 50 มก./กก. ภาพ D คือกลุ่ม เบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดิน 100 มก./กก. (1 2 และ 3 คือกําลังขยาย 4X 10X และ 40X ตามลําดับและลูกศรชี้ ที่ ตําแหน่งของกอบเบลทเซลล์)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ตารางที่ 4 แสดงค่าความยาว ความหนาบริเวณฐาน กลางและปลายของวิลไล และจํานวนกอบเบลทเซลล์ในลําไส้ หนูแรทที่ได้ รับสารเฮส เพอริดิน ความกว้าง จํ านวนกอบเบลท กลุ่มหนู ทดลอง ความยาว เซลล์ต่อวิลลัส ส่วนฐาน ส่วนกลาง ส่วนปลาย 494.82± กลุ่มควบคุม 122.41±10.31 110.71±14.13 64.86±20.38 6.60±3.16 121.01 614.81± 134.50±8.27 122.07±6.80 71.99±8.51 13.67±4.00aaa กลุ่มเบาหวาน 51.85 กลุ่มเบาหวานที่ได้ รับสาร 720.05± 115.00±19.87 113.17±8.70 67.69±2.42 12.70±5.08aaa เฮสเพอริดิน 50 มก./กก. 46.27 กลุ่มเบาหวานที่ได้ รับสาร 646.06± 120.63±12.25 104.15±19.97 68.44±21.99 7.70±3.51 bbb เฮสเพอริดนิ 100 มก./กก. 91.34 aaa แสดงความแตกต่ างทางสถิติท่ ี P value<0.001 ตามลําดับ เมื่อเปรียบเทียบจํานวนกอบเบลทเซลล์ระหว่ างหนูกลุ่มควบคุมและหนูใน กลุ่มต่าง ๆ จํานวนกอบเบลทเซลล์แสดงในรูป mean+SD bbb แสดงความแตกต่ างทางสถิติท่ ี P value<0.001 ตามลําดับ เมื่อเปรียบเทียบจํานวนกอบเบลทเซลล์ระหว่ างหนูกลุ่มเบาหวานและหนู เบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดีน 50 และ 100 มก./มล. จํานวนกอบเบลทเซลล์แสดงในรูป mean+SD

จากการสัง เกตการเปลี่ ย นแปลงของลํา ไส้ เ ล็ก โดย กล้ องจุลทรรศน์ (รูปที่ 3) พบว่าลักษณะของวิลไลทั้ง 4 กลุ่มการทดลองมีความคล้ ายคลึงกัน ไม่แสดงให้ เห็นถึง การเปลี่ ย นแปลง จํา นวนของกอบเบลทเซลล์ จากการ สังเกตด้ วยกล้ อ งจุ ลทรรศน์ในแต่ ละกลุ่มการทดลองมี จํานวนใกล้ เคียงกัน เมื่อทําการวิเคราะห์ผลความยาวของ วิลไล ความกว้ างบริเวณฐาน กลางและปลายของวิลไล และจํานวนกอบเบลทเซลล์ในแต่ละวิลไล (ตารางที่ 4) พบว่าวิลไลในกลุ่มเบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดิน 50 มก./กก.นํ้ า หนั ก ตั ว มี ค วามยาวมากที่ สุ ด คื อ 720.05±46.27 รองลงมาคือกลุ่มเบาหวานที่ได้ รับสาร เฮสเพอริดนิ 100 มก./กก.นํา้ หนักตัวและกลุ่มเบาหวาน มี ค ว า ม ย า ว ข อ ง วิ ล ไ ล 6 4 6 . 0 6 ± 9 1 . 3 4 แ ล ะ 614.81±51.85 ตามลําดับ กลุ่มที่มีความยาวของวิลไล น้ อ ยที่สุด คื อ กลุ่ ม ควบคุ ม มี ค วามยาวของวิ ล ไลเพี ย ง 494.82±121.01 แต่ อย่ า งไรก็ต ามผลที่ได้ ไม่ มีความ แตกต่างกันทางสถิติ ส่วนความกว้ างของวิลไลบริเวณฐาน กลางและปลายของวิลไลนั้นไม่ มีความแตกต่ างกันทาง สถิตเิ ช่ นเดียวกับความยาวของวิลไล นอกจากนี้ จากผล การศึกษาพบว่าจํานวนกอบเบลทเซลล์ในหนูแต่ละกลุ่มมี ความแตกต่ างกัน โดยในกลุ่มเบาหวานพบจํานวนกอบ เบลทเซลล์มากที่สุด (13.67±4.00, P<0.001 เมื่อ เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม) รองลงคือ กลุ่มเบาหวานที่ ได้ รั บ สารเฮสเพอริ ดิ น 50 มก./กก.นํ้ า หนั ก ตั ว

(12.70±5.08, P<0.001 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม ควบคุม) ในขณะที่หนูกลุ่มเบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริ ดิน 100 มก./กก.นํา้ หนักตัวนั้นมีจาํ นวนกอบเบลทเซลล์ ใกล้ เคียงกับกลุ่มควบคุม โดยพบกอบเบลทเซลล์จาํ นวน, 7.70±3.51 และ 6.60±3.16 เซลล์ต่อวิลลัส ตามลําดับ เมื่ อ เปรี ย บเที ย บจํา นวนกอบเบลทเซลล์ ร ะหว่ า งหนู เบาหวานและหนูท่ไี ด้ รับสารเฮสเพอริดิน 100 มก./กก. นํา้ หนักตัว พบว่าจํานวนของกอบเบลทเซลล์ลดลงอย่างมี นัยสําคัญทางสถิตทิ ่ี P<0.001 อภิปรายผลการศึกษา จากการทดสอบสารยั บ ยั้ ง เอนไซม์ แ อลฟากลู โ คซิ เดสของเฮสเพอริดนิ โดยเปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอะ คาร์โบสซึ่งเป็ นยารักษาโรคเบาหวาน พบว่าสารเฮสเพอริ ดินซึ่งจัดเป็ นสารในกลุ่มฟลาโวนอยด์ แสดงฤทธิ์ในการ ยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสได้ ดีท่สี ดุ ที่ความเข้ มข้ น 2,000 ไมโครกรัม/มล. โดยการยับยั้งเอนไซม์แอลฟา กลูโคซิเดสคิดเป็ นร้ อยละ 33.46±4.24 เมื่อเปรียบเทียบ ผลกับการศึกษาของ Li et al. (2009, pp. 1496– 1503) ที่ทาํ การศึกษาผลการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโค ซิ เ ดสของสารสกั ด ในกลุ่ ม ฟลาโวนอยด์ ใ นใบของ ฮอร์ธอร์น (Hawthorn) โดยใช้ เอนไซม์แอลฟากลูโคซิ เดส 0.2 หน่วย/มล. พบว่าสารสกัดในกลุ่มฟลาโวนอยด์

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

จากใบฮอร์ธอร์นสามารถยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเด สได้ ร้อยละ 86 เมื่อเปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอะคาร์ โบส และจากการศึกษาของ Yao, Zhu, Chen, Tian, and Wang (2013, pp. 59–66) ได้ ศึกษาการยับยั้งเอนไซม์ แอลฟากลูโคซิเดสของ Total Flavonoids (TFs) จาก เมล็ด Cichorium glandulosum โดยใช้ TFs ความเข้ มข้ น 8, 16, 32 และ 64 มก./มล.จากผลการทดลองแสดงให้ เห็นว่า TFs ที่ความเข้ มข้ น 8-64 มก./มล. มีค่าร้ อยละ การยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส 36.59 ± 2.51, 69.36 ± 9.52, 74.72 ± 9.10 และ 95.93 ± 2.34 ตามลําดับ ซึ่งเมื่อเปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอะคาร์ โบสที่ความเข้ มข้ น 10 มิลลิกรัม พบว่ า TFs ที่ความ เข้ มข้ น 16-64 มก./มล. มีค่าร้ อยละการยับยั้งเอนไซม์ แอลฟากลูโคซิเดสมากกว่ าสารมาตรฐานอะคาร์โบสที่มี ค่ า ร้ อ ยละการยับ ยั้ งเอนไซม์แ อลฟากลูโ คซิ เดสเท่า กับ 43.50 ± 3.08 อย่างมีนัยสําคัญทางสถิติ นอกจากนี้ การศึกษาถึงผลการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสของ Proanthocyanidins ในเมล็ดกระเจี๊ยบเขียว พบว่าที่ความ เข้ มข้ นตํ่าสุด (2 ไมโครกรัม/มล.) มีค่า IC50 เท่ากับ 16.88 ± 0.26 ไมโครกรัม/มล. เมื่อเปรียบเทียบกับอะ คาร์โบส ซึ่งมีค่า IC50 = 35.60 ± 1.47 ไมโครกรัม/ มล. (Lu et al., 2016, pp. 463–471) จากผล การศึกษาในหลายงานวิจัยดังกล่าวอาจสรุปได้ ว่าสารใน กลุ่ ม ฟลาโวนอยด์บางชนิ ดอย่ า ง เช่ น เฮสเพอริ ดิน สามารถยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส ซึ่งอาจมีผลต่อ การลดระดับนํา้ ตาลในเลือดในผู้ป่วยเบาหวาน ซึ่งผลการ ทดลองการยับยั้งการทํางานของเอนไซม์แอลฟากลูโคซิ เดสในหลอดทดลอง (in vitro study) นี้ให้ ผลที่ สอดคล้ องกับผลการทดลองในหนู เบาหวาน (in vivo study) ที่ได้ รับสารเฮสเพอริดนิ ในปริมาณ 100 มก./กก. พบว่าสามารถลดระดับนํา้ ตาลในเลือดของหนู เบาหวาน ได้ อย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ(personal communication กับดร.วั นทณี หาญช้ าง) ซึ่ งการยั บยั้ง เอนไซม์แอลฟา กลู โ คซิ เ ดสมีความสํา คัญ ต่ อการย่ อ ยนํ้า ตาลโมเลกุ ล คู่ ชนิดต่างๆ ถ้ าเอนไซม์น้ ีถูกยับยั้งจะทําให้ ลดการดูดซึม นํา้ ตาลกลูโคสเข้ าสู่ร่างกาย (Shihabudeen, Priscilla, & Thirumurugan, 2011, pp. 2-3) อย่างไรก็ตามกลไกที่ แน่ชัดในการยับยั้งการทํางานของแอลฟากลูโคซิเดสของ สารเฮสเพอริดนิ นั้นคณะผู้วจิ ยั จะได้ ทาํ การศึกษาต่อไป

เมื่ อศึ ก ษาผลของสารเฮสเพอริ ดิ น ต่ อ ลั ก ษณะ โครงสร้ างลําไส้ เล็กของหนูทดลอง พบว่าจํานวนของกอบ เบลทเซลล์ ใ นลํา ไส้ เ ล็ก ของหนู ท่ีถู ก เหนี่ ย วนํา ให้ เป็ น โรคเบาหวานเพิ่ ม ขึ้น เมื่อ เปรี ย บเทีย บกับ กลุ่ม ควบคุ ม โดยหนูกลุ่มเบาหวานที่ไม่ได้ รับสารเฮสเพอริดินมีจาํ นวน กอบเบลทเซลล์สูงสุดคือ 13.67±4.00 เซลล์ ต่อวิ ลลั ส แต่ เมื่อได้ รับสารเฮสเพอริ ดินปริมาณ 50 และ 100 มก./กก.นํา้ หนักตัว จํานวนกอบเบลทเซลล์ลดลงเหลือ 12.70±5.08 และ 7.70±3.51 เซลล์ ต่ อ วิ ล ลั ส ตามลําดับ ซึ่งในหนู กลุ่มเบาหวานที่ได้ รับเฮสเพอริดิน 100 มก./กก.นํา้ หนักตัว มีจาํ นวนกอบเบลทเซลล์ลดลง ใกล้ เคียงกับหนู กลุ่มควบคุมที่มีจํานวนกอบเบลทเซลล์ เท่ากับ 6.60±3.16 เซลล์ต่อวิลลัส ผลการทดลองนี้ สอดคล้ องกับงานวิจัยของ Diani และคณะ (1976) ที่ พบว่ าหนูท่ถี ูกเหนี่ยวนําให้ อยู่ในภาวะเบาหวานจะมีการ เปลี่ยนแปลงโครงสร้ างของลําไส้ เล็กเกิดขึ้นโดยพื้นที่ผิว ของลําไส้ เล็กเพิ่ ม มากขึ้น ในขณะเดียวกันจํานวนกอบ เบลทเซลล์ ต่ อ วิ ล ลั ส มีจํา นวนเพิ่ ม ขึ้น การเพิ่ ม ขึ้น ของ จํา นวนกอบเบลทเซลล์ ใ นหนู ท่ี ถู ก เหนี่ ย วนํา ให้ เป็ น เบาหวานอาจเกี่ยวข้ องกับการอักเสบหรือระคายเคืองที่ เพิ่มมากขึ้น เนื่องจากกอบเบลทเซลล์มหี น้ าที่สงั เคราะห์ และหลั่งสารเมือกออกมาเพื่อป้ องกันการบาดเจ็บทั้งทาง กายภาพและทางเคมี (Specian & Oliver, 1991) รวมถึ ง งานวิ จั ย นี้ มี ค วามสอดคล้ องกั บ งานวิ จั ย ของ Elmansy และ Almasry (2013, p. 233) ที่พบว่าหนูใน กลุ่มเบาหวานมีจาํ นวนของกอบเบลทเซลล์ เยื่อเมือกและ พื้นที่ผิวของกอบเบลทเซลล์เพิ่มมากขึ้น ซึ่งส่งผลต่อการ เกิดภาวะระคายเคืองต่อระบบทางเดินอาหารและทําให้ เกิดภาวะท้ องเสีย แต่เมื่อมีการให้ สาร thymoquinone ใน หนูเบาหวานพบว่า สารนี้ทาํ ให้ พ้ ืนที่ผิวกอบเบลทเซลล์ ลดลงซึ่งอาจส่งผลดีต่อการลดการเกิด GI complication จากผลการศึกษาของคณะผู้วิจัยในครั้งนี้ พบว่ าหนู กลุ่ม เบาหวานที่ได้ รับสารเฮสเพอริดินปริมาณ 100 มก./กก. นํา้ หนักตัว มีจาํ นวนของกอบเบลทเซลล์ลดลง อาจคาด เดาได้ ว่า สารเฮสเพอริ ดิน มีผ ลต่ อ การลดกระบวนการ อักเสบหรือการระคายเคือง เนื่องจากในเนื้อเยื่อที่มีการ อักเสบจะมีจาํ นวนกอบเบลทเซลล์เพิ่มขึ้นและต่อมเมือก มีการขยายใหญ่ ข้ ึน ทําให้ มีการสร้ างเมือกออกมามาก และเหนียวกว่าปกติ เพื่อปกป้ องเยื่อบุผิวทางเดินอาหาร

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

โดยกอบเบลทเซลล์จะหลั่ง mucin ซึ่งเป็ นไกลโคโปรตีน โดยจะถูกเก็บไว้ ในกอบเบลทเซลล์และจะหลั่งออกเมื่อ เกิดการระคายเคือง (Johansson & Hansson, 2013, pp. 305-309) ถ้ าจํานวนกอบเบลทเซลล์ลดลงอาจ เนื่องมาจากการที่เฮสเพอริดินทําให้ เกิดการอักเสบหรือ ระคายเคืองน้ อยลง จึงทําให้ การสร้ างจํานวนกอบเบลท เซลล์ลดลง จากผลการทดลองที่ได้ สรุปว่ าสารเฮสเพอริ ดินสามารถยับยั้งการทํางานของเอนไซม์แอลฟากลูโคซิ เดสได้ บางส่ว น ซึ่ งอาจมีผลต่ อการลดระดับนํ้า ตาลใน เลือดในหนูเบาหวานและมีผลในการลดจํานวนกอบเบลท เซลล์ ซ่ึ ง อาจมี ผ ลเกี่ย วข้ อ งกับ การลดการระคายเคือ ง ดังนั้น เฮสเพอริดนิ เป็ นสารที่มศี ักยภาพในการพัฒนาต่อ เพื่อประยุกต์ใช้ ในการรักษาผู้ป่วยโรคเบาหวานได้ สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ

ประเทศไทย ครัง้ ที ่ 21, 10-11 พฤศจิกายน 2554. สงขลา: ม.ป.พ. [1] Agrawal, Y. O., Sharma, P. K., Shrivastava, B., Ojha, S., Upadhya, H. M., Arya, D. S., & Goyal, S. N. (2014). Hesperidin produces cardioprotective activity via PPAR-γ pathway in ischemic heart disease model in diabetic rats. PLoS ONE, 9(11), e111212. doi:10.1371/journal.pone.0111212 Diani, A. R., Gerritsen, G. C., Stromsta, S., & Murray, P. (1976). A study of the morphological changes in the small intestine of the spontaneously diabetic Chinese hamster. Diabetologia, 12(2), 101-109.

Elmansy, R. A., & Almasry, S. M. (2013). สารเฮสเพอริดนิ สามารถยับยั้งการทํางานของเอนไซม์ Morphological and immunohistochemical analysis of แอลฟากลูโคซิเดสได้ บางส่วน ซึ่งอาจมีผลยับยั้งการย่อย the effects of thymoquinone on the neurovascular สารอาหารพวกคาร์ โ บไฮเดรต ส่ ง ผลต่ อ การลดระดับ component of jejunal submucosa of diabetic rat นํา้ ตาลในเลือดในหนูเบาหวาน นอกจากนี้การให้ สารเฮส model. Journal of American Science, 9(7). เพอริ ดิ น มี ผ ลในการลดจํา นวนกอบเบลทเซลล์ เ มื่ อ เปรียบเทียบกับหนูในกลุ่มเบาหวาน ซึ่งอาจเกี่ยวข้ องกับ Huang, X. L., Pan, J. H., Chen, D., Chen, J., Chen, กลไกในการลดการระคายเคือ งของลําไส้ ได้ อย่ า งไรก็ F., & Hu, T. T. (2015). Efficacy of lifestyle ตาม ควรมีการศึกษาเพิ่มเติมถึงกลไกในการทํางานของ interventions in patients with type 2 diabetes: A systematic review and meta-analysis. European เฮสเพอริดนิ ในเชิงลึกต่อไป Journal of Internal Medicine, (in press). กิตติกรรมประกาศ Johansson, M. E. V., & Hansson, G. C. (2013). คณะผู้วิจัยขอขอบคุณนางสาวปวีนันทร์ สินไชย ที่ให้ Mucus and the goblet cell. Digestive Diseases, 31, ความรู้แ ละคําแนะนําในกระบวนการและวิธีก ารศึกษา 305-309. โครงสร้ า งของลํา ไส้ เ ล็ก ทํา ให้ ก ารวิ จั ย สํา เร็จ ลุ ล่ ว งไป Li, H., Song, F., Xing, J., Tsao, R., Liu, Z., & Liu, ด้ วยดี S. (2009). Screening and structural characterization of alpha-glucosidase inhibitors from hawthorn leaf เอกสารอ้างอิง flavonoids extract by ultrafiltration LC-DAD-MSn ปนัดดา ทินบุตร และจินดารัตน์ พิมพ์สมาน. (2554). and SORI-CID FTICR MS. the American Society for ฤทธิ์ ยั บ ยั้ ง แอลฟา-กลู โ คซิ เ ดสของสารสกั ด จากพื ช Mass Spectrometry, 20(8), 1496–1503. ตระกูลเฟิ นเพื่อใช้ บาํ บัดโรคเบาหวาน. ใน การประชุม วิชาการนานาชาติ วิศ วกรรมเคมี และเคมี ป ระยุ กต์แห่ ง

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Loh, S. P., & Hadira, O. (2011). In vitro inhibitory glucose excursion in diabetic rats. Nutrition and potential of selected Malaysian plants against key Metabolism, 8(1), 1-11. enzymes involved in hyperglycemia and hypertension. Specian, R. D., & Oliver, M. G. (1991). Functional Malaysian Journal of Nutrition, 17(1), 77-86. biology of intestinal goblet cells. American Journal of Lu, Y., Demleitner, M. F., Song, L., Rychlik, M., & Physiology, 260(2 Pt 1), C183-C193. Huang, D. (2016). Oligomeric proanthocyanidins are the active compounds in Abelmoschus esculentus Yao, X., Zhu, L., Chen, Y., Tian, J., & Wang, Y. Moench for its α-amylase and α-glucosidase (2013). In vivo and in vitro antioxidant activity and inhibition activity. Functional Foods, 20, 463–471. α -glucosidase, α -amylase inhibitory effects of flavonoids from Cichorium glandulosum seeds. Food Mohammed, A., Koorbanally, N. A., & Islam M. S. Chemistry, 139, 59–66. (2015). Ethyl acetate fraction of Aframomum melegueta fruit ameliorates pancreatic β-cell Zhao, D. G., Zhou, A. Y., Du, Z., Zhang, Y., dysfunction and major diabetes-related parameters in Zhang, K., & Ma, Y. Y. (2015). Coumarins with a type 2 diabetes model of rats. Environmental α-glucosidase and α-amylase inhibitory activities from the flower of Edgeworthia gardneri. Fitoterapia, Psychology, 175, 518-527. 107, 122–127. Peterson, J. J., Beecher, G. R., Bhagwat, S. A., Dwyer, J. T., Gebhardt, S. E., Haytowitz, D. B., & Translated Thai Reference Holden, J. M. (2006). Flavanones in grapefruit, lemons, and limes: A compilation and review of the Tinabutr, P., & Pimsaman, J. (2011). Inhibitory data from the analytical literature. Journal of Food effect of Fern on alpha-glucosidase activity in the Composition and Analysis, 19, S74-S80. treatment of diabetes mellitus. In the 21st international conference on chemical engineering and Shihabudeen, M. S., Hansi Priscilla, D., & applied chemistry 10-11 November 2011. Songkla: Thirumurugan, K. (2011). Cinnamon extract inhibits n.p. [in Thail] [1] α-glucosidase activity and dampens postprandial

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

100

BRCA1 and BRCA2 Large Genomic Rearrangements Screening in Thai Familial Breast Cancer Patients by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) Sunichya Jadsria, Takol Chareonsirisuthigula*, Budsaba Rerkamnuaychokea, Donniphat Dejsuphongb, Atchara Tunteeratumc and Surakameth Mahasirimongkold a

Department of Pathology, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, Thailand 10400 Research Center, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, Thailand 10400 c Department of Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, Thailand 10400 d Medical Genetics Section, National Institute of Health, Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Nonthaburi, Thailand 11000 * Corresponding author. E-mail address: takol.cha@mahidol.ac.th Abstract Breast Cancer has now become the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer death in females. BRCA1 and BRCA2 inherited mutations account for 5%-10% of all female breast cancers. However, prevalence of BRCA genes mutation is vary in between difference populations. In Thailand, there are no previous studies of BRCA1 and BRCA2 large genomics rearrangement (LGRs) have been reported. In this study, we screened the ‘‘high-risk’’ group consisted of 100 individuals who met clinical criteria for genetic examination of BRCA1/2 using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Among a total of 100 selected cases, one duplication of BRCA1 exon 15 was determined but none of any LGRs were found in BRCA2. Similar to the other studies in Asian population, the prevalence of LGRs in Thailand likely to be low. The information of BRCA1 and BRCA2 LGRs from this study can be used as a nationwide of Thai database which will be useful for further study of the familial breast cancer. b

Keywords: Breast Cancer, BRCA1/2 Mutation, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)

on Cancer, 2013). In Thailand, estimated 13653 new cases and 5092 deaths were reported in 2012. Breast cancer is one of the most important public (Youlden et al., 2014). The breast cancer new case health problems. It has now become the most accounts for more than 39% of all cancer new cases frequently diagnosed cancer; accounts for 1 in 4 (National Center Institute Department of Medical cancers diagnosed and the leading cause of cancer Services Ministry of Public Health, 2014). BRCA1 and BRCA2 are human genes that death among females (International Agency for Research on Cancer, 2013). In 2012, estimated 1.7 produce tumor suppressor proteins. Genetic million breast cancer new cases and 5.2 million alterations of these two genes account for 5%-10% breast cancer deaths were reported worldwide of all breast cancers and estimate 15%-20% of (International Agency for Research on Cancer, familial breast cancers worldwide (Petrucelli, 2012; Ferlay et al., 2015). When comparing with 2013). A germline pathogenic alterations in this two previous world cancer statistics in 2008, the rise of gene are well-known as a cause of hereditary breast more than 20% of incidence and 14% of mortality and ovarian cancer syndrome (HBOC) which have been noticed (International Agency for Research Introduction

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

characterized by an increased risk for breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer and pancreatic cancer. Two patterns of BRCA1 or BRCA2 gene mutation consist of 1) small mutations which refers to a single or multiple nucleotide sequence alteration and 2) large genomic rearrangements (LGRs) which refer to a large part of nucleotide sequence have new arranging such as deletion or duplication. Recently, BRCA genes mutation testing is available in many countries. The first choice of the methods is DNA sequencing for small mutation and Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) for LGRs. The Prevalence of BRCA 1 and BRCA 2 genes mutation is vary in between difference populations. A few studies in BRCA 1 and BRCA 2 mutation in Asian population have been reported (Lim et al., 2007; Kang et al., 2010; Kwong et al., 2012; De Silva, Tennekoon, Karunanayake, Amarasinghe, & Angunawela, 2014; Seong et al., 2014). In view of to date, there are no frequency reports of BRCA1 and BRCA2 LGRs in Thai population. The aim of this study is to investigate whether a similar situation holds for BRCA1/2 LGRs in Thailand. We accordingly screened for BRCA1/2 LGRs among the high-risk group of Thai familial breast cancer patients using MLPA testing. Materials and Methods Population A total of 685 familial breast cancer patients were recruited to Ramathibodi Hospital for clinical analysis of BRCA1 and 2 mutation. All patient data regarding clinical history and ancestry were obtained by health care provider report on test requisition forms and questionnaire. The ‘‘high-risk’’ group consisted of 100 individuals who met at least one of clinical criterias predicting a relatively high

101

probability of carrying a mutation in BRCA1 or BRCA2: (1) families with three or more first-degree relatives with breast and/or ovarian cancer in two successive generations, (2) individual or family history of bilateral breast cancer, (3) two firstdegree relatives diagnosed with breast cancer including at least one case diagnosed before the age of 50, (4) two affected first-degree relatives consisting of one case diagnosed with premenopausal breast cancer under the age of 50 years, and another with ovarian cancer, (5) one woman with ovarian cancer and breast cancer diagnosed before the age of 60 years, (6) breast cancer before the age of 36 years, (7) a male individual diagnosed with breast cancer, or (8) two first-degree relatives diagnosed with ovarian cancer regardless of age (NCCN, 2015). Research ethics has been reviewed and approved by the Committee on Human Rights Related to Research Involving Human Subjects, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, based on the Declaration of Helsinki. DNA extraction and quantification Briefly, DNA were extracted from whole blood specimen using QuickGene-810 automation system (Fujifilm, Japan). DNA concentration and absorbance at 280 and 260 nm were measured using NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers (Thermo Scientific, USA). Multiplex ligation-dependant probe amplification (MLPA) Between 50 and 100ng of DNA was used for the analysis of each case as suggested by the manufacturer’s instructions for the SALSA® MLPA® probemix P002-D1 BRCA1 and SALSA® MLPA® probemix P045/P045B BRCA2 (MRC Holland, Netherlands). SD024 DNA Sample (MRC Holland, Netherlands), an artificial positive duplication DNA sample were used as a positive control. Analysis was

102

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

as described previously by Seong et al., 2014. The peak heights of each probe were normalized by dividing each peak height by the total peak heights of all probes in the sample of interest. This normalized value was divided by the average normalized value of that probe (obtained from all samples in the experiment). Data were normalized to 1 from the control probes; thresholds of 1.3 and 0.7 were set for identifying single copy gain or loss respectively.

cancer or male breast cancer diagnosed at any age, in conjunction with 2 or more relatives similarly affected criteria. The characteristics of the cases and their family histories are summarized in Table 1. Among these patients, the median age was about 58 years, ranging from 38 to 84 years. There were 22% under 50 years, 41% between 50-60 years and 37% over 60 years of age, respectively. MLPA had been performed in all 100 individuals. After analysis of normalized data, we observed 1% (1/100) of cases that positive for Results BRCA1 large genomic rearrangements. The From a total of 685 Thai familial breast cancer calculated probe ratios of this patient showed an patients, 100 individuals of high-risk group were increased copy number for BRCA1-15-332 nt selected for BRCA1 and BRCA2 LGRs detection segment probe which indicated duplication in exon using MLPA. Mutation screening was performed if 15 of BRCA 1 gene (Figure 1). However, none of an index case or family fulfilled one of the following any large genomic rearrangements was detected in criteria. Simply stated, most patients met these high- BRCA2 gene. The breakpoints of the duplication in risk criteria if they had invasive or in situ breast BRCA1 exon 15 should be further confirmed and cancer diagnosed under age 50 years, or ovarian fully characterized at the sequencing level. Table 1 The information of 100 high-risk Thai familial breast cancer patients which were screened for BRCA1 and BRCA2 large genomic rearrangements by MLPA Age <50 22% 50-60 41% >60 37% Median age (yrs) 58 History of ovarian cancer in Family

Yes No

15% 85%

No. of 1st Degree relative affected with breast cancer

0 1 2 3 5

7% 70% 14% 6% 3%

History of early onset < 50 breast cancer in family

Yes No

63% 37%

103

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2) Table 1 (Cont.) History of bilateral breast cancer in family

Yes No

3% 97%

> 3 family member with HBOC*

Yes No

23 % 77 %

No. of family member affected with HBOC*

0 1 2 3 4 5

1% 57% 28% 7% 1% 3%

*HBOC: Hereditary breast and ovarian cancer syndrome

Figure 1 Calculated probe ratios of the positive sample: arranging probes by chromosomal location shows an increased copy number for BRCA1-15-332 nt segment probe in exon 15 of BRCA 1 gene.

Discussion The prevalence, penetrance and spectrum of BRCA1/2 mutations all differ between populations and are influenced by ethnicity and geographical location. In some populations, genomic deletions and/or rearrangements of the gene reportedly represent about 10% of all deleterious BRCA1 mutations identified, and in one study from the Netherlands two rearrangements accounted for 23% of mutations (Mazoyer, 2005). In our MLPA

screening study, only one case from high-risk group (1%) was found duplication in exon 15 of BRCA 1 gene. Although MLPA has the ability for detection of variations in the copy number of gene, but MLPA is just screening method. Therefore, the positive finding from MLPA need to be confirm with other methods for example, long-range PCR, Fluorescent in situ hybridization (FISH) or Comparative genomic hybridization (CGH) (Ewald et al., 2009; Youlden et al., 2014).

104

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Similar to the previous studies in Asian country, the prevalence of LGR in Thailand likely to be low. The Prevalence of 14.51% of BRCA1/2 mutations, 6.79% of BRCA1 small mutations, 6.79% BRCA2 small mutations, 0.62% of BRCA1 LGRs and 0.31 % of BRCA2 LGRs were observed in 324 Malaysian patients considered in high-risk and medium-risk group (Kang et al., 2010). Study from 555 clinically high-risk breast and/or ovarian cancer probands in southern Chinese population showed that prevalence of 12.43% of BRCA1/2 mutations, 4.86% of BRCA1 small mutations, 6.85% of BRCA2 small mutations, 0.36% of BRCA1 LGRs and 0.36 % of BRCA2 LGRs were observed (Kwong et al., 2012). A cohort study in 57 familial breast cancer patients, 25 risk individuals and 23 healthy controls using MLPA to detect BRCA1 and BRCA2 large genomic rearrangements but none of any large genomic rearrangements were found in Sri Lankan familial breast cancer patients (De Silva et al., 2014). Seong et al. examined 221 Korean familial breast cancer patients and found 36.65% of BRCA1/2 mutations, 16.74% of BRCA1 small mutations, 18.55% BRCA2 small mutations, 1.36% of BRCA1 LGRs when BRCA2 LGRs were not found. Lim et al. (2007) demonstrated 2 % of BRCA1 and 1% of BRCA2 LGRs in Singaporean unrelated early-onset and familial breast and/or ovarian patients who previously tested negative for deleterious BRCA mutations by conventional PCRbased mutation detection. Interestingly, this study was done in patients who previously tested negative for BRCA small mutations which induced the highest prevalence of both BRCA1 and BRCA2 LGRs among all studies in Asian population. This supports that the prevalence also seems difference depend on population group and selected criteria. There are some limitation in this study including: 1) Family history information was collected from

patients by the questionnaire which may misunderstood from unclear questions. So, inaccurate answer may affect familial breast-risk assessment and 2) Analysis of MLPA data is from a limited number of samples. Conclusion and Suggestion To our knowledge, this study is the first report of BRCA1 and BRCA2 large genomic rearrangements in Thai familial breast cancer population. The finding will be as a nationwide of Thai database which will be useful for further study of the familial breast cancer. However, because of a small sample size, more samples with highly selective breast cancer risk-assessment criteria should be done. For further study, we plan to confirm and characterize the duplication region in exon 15 of BRCA1 gene using long-range PCR and sequencing. The data may be correlated with prognosis or risk of developing familial breast cancer. Acknowledgements This research was supported by Department of Medical Sciences, Ministry of Health, Thailand. References De Silva, S., Tennekoon, K. H., Karunanayake, E. H., Amarasinghe, I., & Angunawela, P. (2014). Analysis of BRCA1and BRCA2 large genomic rearrangements in Sri Lankan familial breast cancer patients and at risk individuals. BMC Research Notes, 7, 344. doi: 10.1186/1756-0500-7-344. Ewald, I. P., Ribeiro, P. L., Palmero, E. I., Cossio, S. L., Giugliani, R., & Ashton-Prolla, P. (2009). Genomic rearrangements in BRCA1 and BRCA2: a literature review. Genet Mol Biol., 32, 437â&#x20AC;&#x201C;446.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Ferlay, J., Soerjomataram, I., Dikshit, R., Eser, S., Mathers, C., Rebelo,M., … Bray, F. (2015). Cancer Incidence and Mortality Worldwide: Sources, Methods and Major Patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer, 136, E359–E386. doi: 10. 1002/ijc.29210.Epub2014Oct 9. International Agency for Research on Cancer. Latest world cancer statistics Global cancer burden rises to 14.1 million new cases in 2012: Marked increase in breast cancers must be addressed. Retrieved from https://www.iarc.fr/en/media-centre/pr/2013/pdfs /pr223_E.pdf International Agency for Research on Cancer GLOBOCAN. (2012). Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012. Retrieved from http://globocan.iarc.fr/Pages/fact _sheets_cancer.aspx?cancer=all

105

rearrangements in Singapore Asian breast and ovarian patients with cancer. Clin Genet, 71, 331–342. doi: 10.1111/j.1399-0004.2007. 00773.x Mazoyer, S. (2005). Genomic rearrangements in the BRCA1 and BRCA2 genes. Hum Mutat, 25(5), 415-22. National Center Institute Department of Medical Services Ministry of Public Health (2014). Hospital based cancer registry annual report 2012. Bangkok, Thailand: Eastern Printing Public. Petrucelli, N., Daly, M. B., & Feldman, G. L. (2013). BRCA1 and BRCA2 Hereditary Breast and Ovarian Cancer. GeneReviews® Retrieved from http://www.ncbi.nlm. nih.gov/books/NBK1247/

Seong, M. W., Cho, S. I., Kim, K. H., Chung, I. Y., Kang, E., Lee, J. W, … Kim, S. W. (2014). A Kang, P., Mariapun, S., Phuah, S. Y., Lim, L. S., multi-institutional study of the prevalence Liu, J. , Yoon, S. Y., … Teo, S. H. (2010). Large of BRCA1 and BRCA2 large genomic BRCA1 and BRCA2 genomic rearrangements in rearrangements in familial breast cancer patients. Malaysian high risk breast-ovarian cancer families. BMC Cancer, 14, 645. doi: 10.1186/1471Breast Cancer Res Treat, 124, 579–584. doi: 2407-14-645. 10.1007/s10549-010-1018-5. Epub 2010 Jul 9. Stuppia, L., Antonucci, I., Palka, G., & Gatta, V. Kwong, A., Ng, E. K., Law, F. B., Wong, H. N., (2012). Use of the MLPA Assay in the Molecular Wa, A., Wong, C.L., … Ma, E. S. K. (2012). Diagnosis of Gene Copy Number Alterations in Novel BRCA1 and BRCA2 genomic rearrangements Human Genetic Diseases. Int J Mol Sci, 13(3), in Southern Chinese breast/ovarian cancer patients. 3245–3276. doi: 10.3390/ijms13033245 Breast Cancer Res Treat, 136, 931–933. doi: 10.1007/s10549-012-2292-1. Epub 2012 Oct 26 Youlden, D. R., Cramb, S. M., Yip, C. H., & Baade, P. D. (2014). Incidence and mortality of Lim, Y. K., Iau, P. T. C., Ali, A. B., Lee, S. C., female breast cancer in the Asia-Pacific region. Wong, J. E-L., Putti, T. C., Sng, J-H. (2007). Cancer Biol Med, 11, 101-115. doi: 10.7497/j. Identification of novel BRCA large genomic issn.2095-3941.2014.02.005

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

106

Correlation of gyrA/B mutations with level of susceptibility to fluoroquinolone of Mycobacterium tuberculosis isolates Nuttaporn Nakkerd, Siriporn O-thong, Rattapha Chinli, Popchai Ngamskulrungroj, Piriyaporn Chongtrakool and Suporn Foongladda* Department of Microbiology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University * Corresponding author. E-mail address: suporn.foo@mahidol.ac.th Abstract Since fluoroquinolones (FQ), such as ofloxacin (OFX) and moxifloxacin (MXF) have been widely used for tuberculosis treatment. Resistance to FQ has emerged and leading to cases of untreatable tuberculosis. In mycobacteria, FQ bind to DNA gyrase and inhibit DNA replication leading to bacterial cell death. DNA gyrase encoded by gyrA and gyrB. Mutations in the two short regions known as quinolone-resistant determining regions (QRDRs) have been associated with FQ resistance in M. tuberculosis (MTB). Therefore, the aim of this study was to determine the level of FQ susceptibility with mutation of gyrA and gyrB genes from 116 multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) clinical isolates (including six XDR-TB) in Siriraj hospital, Thailand. The gyrA and gyrB sequence performed on MTB clinical isolates were compared with FQ susceptibility by the standard agar proportion method on Middlebrook 7H10 (APM) and minimal inhibitory concentration (MIC) by microbroth dilution method. Our data revealed that 23.3% of MDR-TB was resistant to FQ. The most common substitution in gyrA occurred at position D94, resulted in D94G (n=14, 51.9%), D94Y (n=3, 11.1%) and D94H (n=1, 3.7%). The following common substitution occurred at position A90V (n=5, 18.5%) and S91P (n=4, 14.8%). In addition, double mutations in both gyrA/B, S91P/E501D were found in one isolate (3.7%). There were linked to moderate to high level OFX and MXF resistance ranged from 4 to ≥32 µg/ml and 2 to ≥8 µg/ml, respectively. All of these mutations were occurred exclusively in FQ-resistant isolates. A combination of these 6 mutations exhibited the 100 % of sensitivity and 100 %, specificity for detection of OFX, and 100 % of sensitivity and 98.88 % specificity for MXF resistances in MDR-TB. Keywords: tuberculosis, fluoroquinolones, MDR-TB

tuberculosis strains which are resistant to at least isoniazid and rifampicin, called multidrug-resistant Tuberculosis (TB) is the main cause of tuberculosis (MDR-TB) (CLSI, 2011). Therefore, worldwide death infectious disease. Of the 480,000 MDR-TB has become the main threat for cases of multidrug-resistant TB (MDR-TB), tuberculosis control strategies. While extensively resistance to at least rifampicin and isoniazid, drug-resistant TB (XDR-TB) is MDR-TB isolates estimated to have occurred in 2014. The incidence resistant to fluoroquinolones (FQ) and one of the rate of TB cases in Thailand in 2014 was second-line injectable drugs such as, kanamycin 22/100,000 with a mortality rate of 6.6/100,000. (KAN), amikacin (AMK) and capreomycin (CAP) Estimation of MDR-TB occurred at a frequency of (Caminero, Sotgiu, Zumla, & Migliori, 2010) 2% and 19% among new TB cases and retreatment However, FQ have been widely used for TB treatment and served routinely as monotherapy for the TB cases (WHO, 2015). The most efficient drugs for TB treatment are empirical treatment of numerous respiratory isoniazid (INH) and rifampicin (RIF). M. infections. The main target of FQ in M. tuberculosis Introduction

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

is the DNA gyrase, encoded by gyrA and gyrB (Yin & Yu, 2010). Mutations in the two short regions known as quinolone-resistant determining regions (QRDRs) have been associated with FQ resistance in M. tuberculosis (Pitaksajjakul et al., 2005). To date, a variety of molecular base techniques are used to determine FQ resistant. Therefore, we determined the mutations in gyrA and gyrB genes of M. tuberculosis clinical isolates with the level of ofloxacin and moxifloxacin susceptibility by detection of minimum inhibitory concentration (MIC) and the standard agar proportion method. Our data provide prominence to combined genes sequencing in the investigation of drugs susceptibility in M. tuberculosis and challenge the validity of the current phenotypic approach as the diagnostic gold standard for determining drugs resistance. Materials and methods Mycobacterium tuberculosis clinical isolates In total, 116 MDR-TB clinical isolates (including 6 XDR) had been obtained from the Mycobacteriology Service Unit, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok, Thailand during 2012-2015. In addition, M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) was used as an internal control, since it was susceptible to all tested drugs. All MTB were cultured on Lowenstein-Jensen (LJ) medium at 37°C for 3 weeks before the following studies. Standard agar proportion method Drug susceptibility against ofloxacin (OFX) and moxifloxacin (MXF) of the isolates were determined using standard agar proportion method (APM) according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011) methods. Stock solutions of drugs were prepared from reference powders and then used for preparation of the critical concentrations.

107

OFX at 2 µg/ml and MXF at 0.5 µg/ml. Middlebrook 7H10 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD), supplemented with 10% OADC (Difco, Livonia, MI) were prepared. For preparation of bacterial inoculum, a 1.0 McFarland standard isolate suspension was serially diluted 10-fold, from 10−1 to 10−4, in sterile distilled water. Several dilutions of inoculums (10⁻²and 10⁻⁴) were dropped onto both control (without drugs) and drug containing media, M7H10 with 10% OADC and incubated at 37°C. Results were read at 21 days and up to 28 days, depending on control growth. All isolates were considered as resistant to a given drug when growth of 1% or more above the control was observed in drug-containing media. Quality was controlled by using M. tuberculosis H37Rv as a reference strains for each set of APM tested. Minimum inhibitory concentration detection MIC of OFX and MXF were detected by broth dilution microtiter method using TREK Sensititre® MYCOTB MIC plate (TREK Diagnostic Systems, USA) as described by manufactured instruction. Several colonies were selected from LJ medium using a sterile loop and inoculated into a test tube containing saline-Tween and glass beads (TREK Diagnostics). After being vortex for 30 to 60 s, the inoculum was allowed to settle for 15 min and adjusted to a 0.5 McFarland standard equivalent using a nephelometer. The numbers of colony forming unit (CFU) were determined for each isolate tested to verify that the inoculum was within a specific targeted amount (∼105 CFU/ml). One hundred microliters of the inoculum was transferred to 11 ml of Middlebrook 7H9 broth containing OADC (TREK Diagnostics) and vortex for 20 s. One hundred microliters was transferred to the 96 well MYCOTB plate containing the preparedness of 10-fold diluted antibiotics. MYCOTB plates were

108

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

covered with plastic seals provided by the manufacturer. Plates were incubated at 37°C and MICs were examined at 10 and 21 days using a manual read aided by a mirrored viewer. The MIC is recorded as the lowest antibiotic concentration that reduces visible growth. DNA sequencing Genomic DNA was extracted from freshly cultured bacteria. A loopful of M. tuberculosis culture was suspended in microcentrifuge tube containing 500 µl of sterilized water and then heated in a 95°C water bath for 30 min. followed by centrifugation at 13,500 rpm for 2 min. The supernatant was transferred to another microcentrifuge tube. Template DNA was prepared by QIAGEN QIAmp DNA mini kit

(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) and preserved at –20°C until use. The primers for PCR amplification of gyrA and gyrB were designed with reference to gene sequences (GenBank accession number NC_000962.3) by the Primer 3 program. GyrA was amplified with the use of the gyrA F (5’-CCTGCGTTC GATTGCAAAC-3’) and gyrA R (5’- CTTCGGTGTACCTCATCGCC3’) primers. GyrB was amplified with the use of the gyrB F(5’-CAAATCGTTTGTGCAGAAGG-3’) and gyrB R (5’-ATGGTGGTCTCCCACAACTC-3’) primers. The PCR products of gyrA and gyrB were 423 and 738 bps in size, respectively, as shown in Figure1.

Figure 1 The PCR products of gyrA (A) and gyrB (B) were 423 and 738 bp in size, respectively. M; marker, Rv; M. tuberculosis H37Rv, S1-S5 show that the PCR product was generated from the MTB clinical isolates and Neg; negative control.

After amplification PCR products were purified to remove unincorporated nucleotides and primers with QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Germany) and used as the template for DNA sequencing. PCR products were sequenced with a forward primer by 1st BASE Sequencing INT, Malaysia. Mutations in gyrA and gyrB were identified by comparison with M. tuberculosis H37Rv GenBank accession number NC 000962 by ClustalX program. Statistical analysis SPSS software (SPSS Inc. – Chicago, IL, USA) was used for the statistical analysis. Test results were

based on comparison of MICs derived from the MYCOTB plate to critical concentrations found using the APM as reference method. For each drug, receiver operating characteristic (ROC) analysis was performed to estimate MYCOTB cutoff values. Sensitivity and specificity were calculated by using two by two table analyses. Results Distribution of gyrA and gyrB mutations among FQ-resistant and susceptible MTB isolates

109

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

FQ susceptibility testing by APM revealed that 27 of 116 (23.3%) isolates were resistant to both OFX and MXF at 2 and 0.5 µg/ml, respectively. Mutations were observed in QRDR of gyrA and gyrB genes among FQ-resistant isolates. Amino acid position S95T mutation in gyrA, which was a natural polymorphism was occurred in both FQ-resistant and FQ–susceptible isolates. The single amino acid mutation sites were in codons A90V, S91P, D94G, D94H and D94Y of gyrA gene, the relative

frequencies of these codons were 5 (18.5%), 3 (11.1%), 14 (51.9%), 1 (3.7%) and 3 (11.1%), respectively (Table 1). One isolate had mutations in both gyrA/B genes, S91P/E501D (3.7%). These mutations were not observed among 89 (76.7%) FQ-susceptible isolates. The mutation in T4R, T5E and T4E occurred in 2 (2.2%) of FQ-susceptible isolates, implied that these mutation do not relate to FQ resistance in MTB.

Table 1 Substitutions in gyrA and gyrB among FQ-resistant and FQ-susceptible MTB clinical isolates Substitutions No. of isolates gyrA gyrB FQ-R (n=27) FQ-S (n=89) A90V 5 S91P E501D 1 S91P 3 D94G 14 D94H 1 D94Y 3 T4R/T5E 1 T4E 1 Total 27 2

Level of MIC with mutation of gyrA and gyrB The different mutations of gyrA/B and OFX, MXF MICs of the total MTB clinical isolates are shown in Table2. The most common substitution conferring FQ resistance among MDR-TB occurred at position D94. The second most common substitution occurred at position A90V and S91P.

% of total substitutions 18.5 3.7 11.1 51.9 3.7 11.1 1.1 1.1 100

These linked to moderate to high level OFX and MXF resistance ranged from 4 to ≥32 µg/ml and 2 to ≥8 µg/ml, respectively. While FQ-susceptible isolates with and without mutations, the OFX MICs were ≤0.25 to 2 µg/ml and MXF MICs were ≤0.06 to 1 µg/ml (Table 2).

Table 2 Substitutions in gyrA/B found in 116 MDR-TB clinical isolates with the MIC of MXF/OFX and standard agar proportion method (APM). Substitutions gyrA A90V

gyrB WT

S91P

E501D

S91P

No. of isolates by MICs to drugs (µg/ml) APM R S R S R S

MXF ≤0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 >8 3 2

Total (%) OFX ≤0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 >32 2 3 5(4.3)

1 1

1 1 1 1

1 (0.9) 3 (2.6)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

110

Table 2 (Cont.) Substitutions

No. of isolates by MICs to drugs (µg/ml) APM

MXF gyrA gyrB ≤0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 >8 D94G WT R 4 6 3 1 S D94H WT R 1 S D94Y WT R 1 2 S T4R/T5E WT R S 1 T4E WT R S 1 WT WT R S 3 8 47 25 3 1 Total 3 9 48 25 3 8 10 6 4

Total (%) OFX ≤0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 >32 1 5 6 1 1 14 (12.1) 1

1 (0.9)

1 1 1

3 (2.6)

1 (0.9)

1 3 3

38 40 6 39 41 6 4 10 9 2

1 (0.9) 87 (75.0) 2

116

WT= wild type, R=resistant, S=susceptible

Figure 2 Receiver operating characteristic (ROC) curves for each tested drug. Number in bold are MYCOTB plate minimum inhibitory concentrations.

Correlation of MIC and AMP results The range of agreement between MYCOTB results and APM results was considered in ROC curve results (Figure 2). OFX showed the higher agreement, with a large area under the curve (AUC) of 1.00, while MXF had an AUC of 0.99. The MIC cutoff values were defined as 4 and 2 µg/ml for

OFX and MXF resistance, respectively. MYCOTB plate sensitivity and specificity, using APM results as the reference comparator are shown in Table 3. OFX at 2 µg/ml exhibited the sensitivity of 100% and specificity of 100%, MXF at 0.5 µg/ml exhibited the sensitivity of 100% and specificity of 98.88%.

111

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2) Table 3 Resistance pattern of 116 MDR-TB clinical isolates using the MYCOTB MIC plate and agar proportion method. Drug Ofloxacin

Moxifloxacin

MYCOTB plate result

No. of isolates with each APM Resistance

Susceptible

Resistance

Susceptible

Resistance

Susceptible

Discussion Fluoroquinolones (FQ) are the most effective antimicrobial agents used as the major drugs for treatment of MDR-TB. The poorly controlled use of FQ can contribute to the emergence of FQ resistance in M. tuberculosis (MTB), which may influence the clinical outcome of MDR tuberculosis patients. DNA gyrase are the target of FQ in M. tuberculosisis, consisting of two A and two B subunits encoded by the gyrA and gyrB genes. The mutations within the QRDR, including a conserved region of gyrA (codons 88 to 94) (Maruri et al., 2012) and gyrB (codons 500 to 538) (Von Groll et al., 2009), have been identified as the primary mechanism conferring FQ resistance (Aubry, Pan, Fisher, Jarlier, & Cambau, 2004). Frequency of mutation in this study was observed in gyrA position 94 (66.7%), 90 (18.5%) and follow by 91 (13.33%) as previous reports from China and Russian Federation that 64.5-75.6% of OFX-resistant isolates carried mutation gyrA positions 94 and 90 (Zhang, Lu, Wang, Pang, & Zhao, 2014). They also reported high-level FQ resistance, with six different amino acid substitutions D94H, Y, N, A, G or C which accounted for 32.6% of FQ resistant in MTB. Whereas, we found high level MIC of MFX (>16 mg/liter) in S91P and D94G in 4 isolates (13.33%). Few single mutation

Sensitivity (%)

Specificity (%)

100

98.88

in gyrB gene have been reported in 2.9-15.5% of OFX-resistant strains, including R485H, D500N, and D500A (Zhang et al., 2014). However, we found only one isolates at E501D. We also found double substitutions in both gyrA/gyrB (S91P/E501D) with high level of MIC in one isolates. These have been reported such as A90V/S486Y, D94N/D538T and D94A/D538T with high-level FQ resistance (≥16 mg/liter) (Zhang et al., 2014). In this study, gyrA/B mutations were classified into 6 types, with A90V, S91P, S91P/E501D, D94G, D94H and D94Y, respectively. All of these were occurred exclusively in FQ-resistant isolates. Analysis of these mutations exhibited the sensitivity 100%, specificity 100% and accuracy 100%, respectively, for detection of FQ resistance in MTB. The most common substitution conferring FQ resistance among MDR-TB occurred at position D94. The second most common substitution occurred at position 90 and 91. The MIC cutoff values are the averages of two consecutive test values, were defined as 4 and 2 µg/ml for OFX and MXF resistance, respectively. These mutations were linked to moderate to high level OFX and MXF resistance ranged from 4 to ≥32 µg/ml and 2 to ≥8 µg/ml, respectively. While FQ-susceptible isolates with and without mutations, the OFX MICs were ranged from

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

112

≤0.25 to 2 µg/ml and MXF MICs were ranged from ≤0.06 to 1 µg/ml. Although the mutation in gyrB that related to FQ resistance were infrequent, E501D was observed in one FQ-resistant isolate consistent with findings from Vietnam, reported to 12 µg/ml for gyrB with the E540D mutation (difference numbering system) (An et al., 2009). The present data show that FQresistant MTB isolates with mutation in both gyrA and gyrB did not differ from FQ-resistant MTB isolates with only single mutation in gyrA. Recent study performed in the Russian Federation reported mutations a novel mutation 1457 C→T was found in the gyrB gene (Kontsevaya et al., 2011). Founded on the current study, more than 30% of FQ-resistant strains did not harbor the mutations in the QRDRs of gyrA and gyrB, suggesting that another mechanism, including an active drug efflux pump and decreased cell wall permeability to the drug, may also confer the FQ resistance of these strains. In conclusions, the MIC data purpose the cutoff information at 4 µg/ml for OFX and 2 µg/ml for MXF resistance. This MIC data could provide clinical impact for FQ resistant detection within 10 to 14 days. Mutation in gyrA S91P, D94G and gyrA together with gyrB were associated with high-level resistance to FQ among the MDR-TB isolates circulating in Thailand. Acknowledgments We thank the microbiology laboratory technicians and Mycobacteriology Service Unit, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Siriraj hospital, Mahidol university, Bangkok Thailand. This work was supported by National Institutes of Health grant R01 AI093358.

References An, D. D., Duyen, N. T. H., Lan, N. T. N., Ha, D. T. M., Kiet, V. S., Chau, N. V. V., & Caws, M. (2009). Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis is significantly associated with highlevel fluoroquinolone resistance in Vietnam. Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(11), 4835-4839. Aubry, A., Pan, X. S., Fisher, L. M., Jarlier, V., & Cambau, E. (2004). Mycobacterium tuberculosis DNA gyrase: interaction with quinolones and correlation with antimycobacterial drug activity. Antimicrobial agents and chemotherapy, 48(4), 1281-1288. Caminero, J. A., Sotgiu, G., Zumla, A., & Migliori, G. B. (2010). Best drug treatment for multidrugresistant and extensively drug-resistant tuberculosis. The Lancet infectious diseases, 10(9), 621-629. Clinical Laboratory Standards Institute. (2011). Susceptibility testing of mycobacteria, nocardia, and other aerobic actinomycetes: approved standard. Clinical Laboratory Standards Institute, 31(5), M24-A2. Kontsevaya, I., Mironova, S., Nikolayevskyy, V., Balabanova, Y., Mitchell, S., & Drobniewski, F. (2011). Evaluation of two molecular assays for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to fluoroquinolones in high-tuberculosis and-multidrug-resistance settings. Journal of clinical microbiology, 49(8), 2832-2837. Maruri, F., Sterling, T. R., Kaiga, A. W., Blackman, A., van der Heijden, Y. F., Mayer, C., & Aubry, A. (2012). A systematic review of gyrase mutations

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

associated with fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis and a proposed gyrase numbering system. Journal of antimicrobial chemotherapy, 67(4), 819-831.

113

Von Groll, A., Martin, A., Jureen, P., Hoffner, S., Vandamme, P., Portaels, F., & da Silva, P. A. (2009). Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis and mutations in gyrA and gyrB. Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(10), 4498-4500.

World Health Organization. (2015). Global tuberculosis report 2015. WHO/HTM/TB/2015.22. Geneva, Switzerland: World Health Organization. Yin, X., & Yu, Z. (2010). Mutation Retrieved from http://apps.who.int/iris/bitstream/ characterization of gyrA and gyrB genes in 10665/191102/1/ 9789241565059_eng.pdf levofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Guangdong Province in China. Pitaksajjakul, P., Wongwit, W., Punprasit, W., Journal of Infection, 61(2), 150-154. Eampokalap, B., Peacock, S., & Ramasoota, P. (2005). Mutations in the gyrA and gyrB genes of Zhang, Z., Lu, J., Wang, Y., Pang, Y., & Zhao, Y. fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis (2014). Prevalence and molecular characterization of from TB patients in Thailand. Southeast Asian fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis journal of tropical medicine and public health, 36, isolates in China. Antimicrobial agents and 228-37. chemotherapy, 58(1), 364-369.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

114

Preparation and physical properties of chitosan scaffolds coated collagen from the skin of shark for bone tissue engineering Kanokwan Srikhum a, Jirut Meesaneb and Suttatip Kamolmatyakulc* a,c

Department of Preventive dentistry, Faculty of Dentistry, Prince of Songkla University, Hatyai, Songkhla, Thailand 90110 Biological Materials for Medicine Research Unit (BMM), Faculty of Medicine, Prince of Songkla University, Hatyai, Songkhla, Thailand 90110 * Corresponding author. E-mail address: suttatip.k@psu.ac.th b

Abstract Secondary alveolar bone grafting is routinely practiced as the alveolar cleft treatment in cleft lip and cleft palate patient. Most commonly, bone for alveolar bone grafting is harvested from the iliac crests. As such, iliac crest harvesting procedures can result in paresthesia, hypersensitivity, infection and pelvic instability. In order to avoid these adverse effects, tissue engineering strategies may eliminate donor site morbidity by resorbable collagen sponge resulted in reduced donor site morbidity and decreased donor site pain intensity and frequency. The aim of this study was to investigate the effects of pepsin soluble collagen (PSC) from skin of brownbanded bamboo shark on the physical property of chitosan scaffolds. The collagen was characterized as type I collagen by Fourier transform infrared (FTIR) spectra and physical properties were studied in terms of morphology, water swelling and biodegradation of scaffolds. Physical property data were analyzed by Mann-Whitney U Test and using SPSS statistics version 16.0 program. The result of FTIR showed triple-helical structure of collagen type I. SEM demonstrated homogeneous microstructure and presence of interconnected micropores of both groups. Water swelling of PSC coated chitosan scaffolds was lower than chitosan scaffolds (p<0.001), whereas biodegradation tend to be lower (p>0.05). Biodegradation rates of both groups between different time points were statistically significant (p<0.05). In conclusion, PSC collagens improve physical properties of our novel chitosan scaffolds. (Supported by PSU grant # 950/427) Keywords: Cleft lip and palate, Bone tissue engineering, Chitosan scaffold, Collagen

Introduction The alveolar cleft is a bony defect that is present in 75% of the patients with cleft lip and palate (Aranaz et al., 2009). Secondary alveolar bone grafting is routinely practiced as the alveolar cleft treatment to allow proper eruption of the lateral or canine teeth through the cleft segment and to close the oronasal fistula. Most commonly, bone for alveolar bone grafting is harvested from the iliac crests (Cho-Lee et al., 2013; Goudy, Lott, Burton, Wheeler, & Canady, 2009; Moreau, Caccamese, Coletti, Sauk, & Fisher, 2007). Therefore, iliac crest has been described as being the gold standard for secondary grafting. However, the harvest procedure imposes a heavy burden on the patient especially at

the donor site (Swan, 2006). As such, iliac crest harvesting procedures can result in paresthesia, hypersensitivity, infection and pelvic instability (Kortebein, Nelson, & Sadove, 1991; Younger & Chapman, 1989; Janssen, Weijs, Koole, Rosenberg, & Meijer, 2014). In order to avoid these adverse effects, tissue engineering strategies may eliminate donor site morbidity by bypassing the harvesting procedure, such as synthetic bone or stem cells with scaffold. Tissue engineering (TE) is a multidisciplinary field that attempts to restore the function of diseased or damaged tissues through the use of cells, biomaterials and biologically active molecules (Becker & Jakse, 2007; Drosse et al., 2008; Meyer, Joos, & Wiesmann, 2004; Vacanti & Langer, 1999). Bone tissue engineering is the

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

process of regeneration of functional tissue that can be used to treat a bony defect (Peppo et al., 2013). The scaffolds should act as a framework for supporting growth and functions of desired tissue as well as maintaining shape and contour of the organ (Kim, Kim, Oh, Han, & Shin, 2009). Two features of the scaffolds that influence cellular responses are 3-D architecture and the physico-chemical properties of their surfaces. The scaffolds should have the 3-D structures with highly porous and interconnected pore network for cell in-growth and transporting nutrients and metabolic waste. Chitosan presents superior tissue biocompatibility due to its structure being similar to glycosaminoglycan in an extracellular matrix (Arpornmaeklong, Suwatwirote, Pripatnanont, & Oungbho, 2007). Moreover, it has been proven to demonstrate properties needed for bone tissue engineering which include having biodegradability, a porous structure, suitability for cell ingrowth, osteoconduction, and an intrinsic antibacterial nature (Thuaksuban, Nuntanaranont, Pattanachot, Suttapreyasri, & Cheung, 2011). Collagen is a natural protein that is the main component in extracellular matrix (ECM) in tissue. Especially, in bone tissue, collagen acts as the template for calcium phosphate deposition. Collagen can enhance stability and strength of the bone (Matsuura et al., 2014). Therefore, collagen is a popular material for tissue regeneration because collagen has biological functionality that cells can recognize. Such functionality can enhance cell adhesion lead to induce tissue regeneration. Alternative sources of collagen especially from the shark skin can be used as an excellent source of collagen with the unique characteristics. The aim of this study is to produce a chitosan scaffolds coated collagen from the skin of shark for bone tissue engineering in cleft palate patients.

115

Materials and methods 1. Fabrication of chitosan scaffold To construct the scaffolds, chitosan (Sea Fresh Chitosan [Lab] Co., Thailand, DD=85%, Mw=57,000 Dalton) was dissolved in 0.2 M acetic acid in the final concentrations of 2% (v/w). Then they were injected with syringe into 1 M NaOH. Under these conditions a fibril-like chitosan was formed. The fibril-like chitosan was filtered through a sheet cloth, and placed in 15 ml centrifuge tubes and centrifuged at 4,500 rpm for 40 min then kept at 4°C for 24 hr and subsequently frozen at -20°C. After 24 hr, the scaffolds were stabilized by immersing in 96% alcohol for 1 hr, 1 M NaOH for 5 min, and 70% alcohol for 12 hr. The thus formed scaffolds were sectioned into slices with 3 mm of thickness. They were dried at 37°C for 12 hr. 2. Isolation of Pepsin soluble collagen (PSC) from the skin of brownbanded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum) 2.1 Shark skin preparation Skin of brownbanded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum) with the size of 70–100 cm was obtained from Blue Ocean Food Products Co., Ltd. in Samutsakhon Province of Thailand. The frozen shark skin (10 kg) packed in polyethylene bags (1 kg/bag) was placed in ice at a ratio of skin to ice of 1:2 (w/w) using a polystyrene box as a container. The skin was kept at -20◦C until use, usually within one week. To prepare collagen from shark skin, the frozen skin was thawed with running water until the core temperature reached 5◦C. Thereafter, it was washed with cold tap water (≤10°C). The residual meat on shark skin was removed by knife and washed with cold tap water

116

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

until any residual smell of ammonia disappeared. The clean shark skin was cut into small pieces (1.0 × 1.0 cm2) using a pair of scissors. 2.2 Pretreatment of shark skin To remove non-collagenous proteins, the prepared shark skin was mixed with 0.1 M NaOH to alkali solution at the ratio of 1:10 (w/v). The mixture was continuously stirred for 6 hr. The alkali solution was changed every 2 hr. Then, the deproteinised skin was washed with cold water until a neutral or faintly basic pH of wash water was reached. 2.3 Extraction of Pepsin Soluble Collagen (PSC) Pretreated skin was soaked in 0.5 M acetic acid with a solid to solvent at the ratio of 1:15 (w/v) for 48 hr with continuous stirring using an overhead stirrer model W20 (IKA - Werke GmbH & CO.KG, Stanfen, Germany). The mixtures were filtered with two layers of cheesecloth. The residue was soaked in porcine pepsin (20 unit/g of residue) solution. The mixtures were continuously stirred at 4◦C for 48 hr, followed by filtration with two layers of cheesecloth. The collagen in the filtrate was precipitated by adding NaCl to a final concentration of 2.6 M in the presence of 0.05 M tris (hydroxymethyl) aminomethane at pH 7.5. The resultant precipitate was collected by centrifugation at 20,000 g at 4◦C for 60 min using a refrigerated centrifuge model Avanti J-E (Beckman Coulter, Inc., Palo Alto, CA, USA). The pellet was dissolved in a minimum volume of 0.5 M acetic acid and dialysed against 25 volumes of 0.1 M acetic acid for 12 hr. Thereafter, it was dialysed against 25 volumes of distilled water for 48 hr. The resulting dialysate was freeze-dried and referred to as ‘‘Pepsin soluble collagen, PSC” (Benjakul et al., 2010). 2.4 Fabrication of PSC coat 2% chitosan scaffold

2% chitosan scaffold was transferred to 0.05% PSC solution in 24 well-plate (PSC was dissolved in acetic acid and adjusted volume by PBS), kept at room temperature for 4 hr, then kept at 4◦C for 24 hr, subsequently frozen at -20◦C for 24 hr and transferred to freeze-dried machine (SCANVAC) for 24 hr. 3. Scaffolds characterization 3.1 Fourier-Transformed Infra-Red Spectroscopy (FTIR) Infra-red spectra of the prepared collagen was obtained in a spectrometer (Spectrum 100 PERKIN ELMER) at the range of 4000 to 650 cm–1. Spectra were registered using attenuated total reflection infra-red spectroscopy (ATR-FTIR). 3.2 Scanning Electron Microscope (SEM) The morphology of the scaffolds were observed using a JEOL JSM 6460 LV microscope under 20 kV. All samples were coated with a thin gold layer using a EMITECH K550 sputter coater. 3.3 Water swelling of scaffold PSC coated chitosan scaffolds for test group and uncoated-PSC chitosan scaffolds for control group (n/group =9) were weighed using an electronic balance and placed in PBS for 5 min. After this period, all excessive water was removed and the scaffolds were weighed again. Water swelling of scaffolds were determined by using the following equation: Swelling ratio = (Ww-Wd)/ Wd Wd represents initial dry weight and Ww represents wet weight of scaffold. 3.4 Biodegradation of scaffold To analyze the biodegradation of scaffold, they were incubated in a solution containing lysozyme, an enzyme taken to be essential in the dissolvement of chitosan. Scaffolds (n=9) were incubated for 7,14 and 21 days in 1× 104 U/ml lysozyme in PBS (pH 7.4) at 37◦C. At the different

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

117

time intervals, the scaffolds were washed with double distilled water and were dried at 37◦C 48 hr. All scaffolds were weighed again. Biodegradation of scaffold were determined by using the following equation: Percentage weight loss = (Wo-Wt)/ Wo × 100 Wo represents the original weight and Wt represents the weight at the different time interval.

shows the existence of hydrogen bonds. When the NH group of a peptide is involved in a hydrogen bond, the position is shifted to lower frequencies. Amide B band of both collagens was observed at 2939 cm-1, in agreement with that reported by Nagai et al. The sharp amide I band of PSC was observed at 1630 cm-1, respectively. This band is associated with C=O stretching vibration or hydrogen bond coupled with COO- (Payne & Veis, 1988). The amide I peak underwent a decrease in absorbance, Results and Discussion followed by a broadening accompanied by the appearance of additional shoulders when collagen was Scaffolds characterization 1. Fourier-Transformed Infra-Red Spectroscopy (FTIR) heated at higher temperature (Bryan et al., 2007). FTIR spectra of PSC from the shark skin is This was reconfirmed by the ratio of approximately 1 shown in Figure1. The major peaks in the spectra of between amide III and 1454 cm-1 band of both PSC from the skin of brownbanded bamboo shark collagens. Ratio of approximately 1 revealed the were similar to those of collagen from others fish triple-helical structure of collagen (Krimm & species (Muyonga, Cole, & Duodu, 2004; Nagai, Bandekar, 1986). The amide II of collagens Suzuki, & Nagashima, 2008; Wang, An, Xin, Zhao, appeared at 1546 cm-1, resulting from N–H bending & Hu, 2007). The amide A band PSC was found at vibration coupled with CN stretching vibration (Yan 3299 cm-1, respectively. This band is generally et al., 2010). associated with the N–H stretching vibration and

Amide I Amide II

Amide III

Amide A

Amide B

Figure 1 FTIR spectra of PSC from the skin of brownbanded bamboo shark.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

118

2. Scanning Electron Microscope (SEM) Figure 2 shows SEM micrographs of the chitosan and PSC coated chitosan scaffolds. Open pore structure with a high degree of interconnectivity can be observed. An ideal scaffold used for tissue engineering should possess the characteristic of a

(a)

homogenous microstructure and suitable pore aperture. Scaffolds must be porous to allow ingrowths of cells and migration of vascular tissue. Since the addition of collagen increased chitosan pore sizes, cell viability and proliferation in these scaffolds might be improved.

(b)

Figure 2 SEM micrographs a) PSC coated chitosan scaffold b) chitosan scaffold

3. Water swelling of scaffold Swelling ratio is shown in Figure 3. The chitosan scaffold showed the high water binding capacity and this property plays an important role in tissue regeneration (Park, Lee, Lee, & Suh, 2003). It could preserve a high volume of liquid within the porous structure, maintained their dimension, and further enhance the penetration of cells into the inner area of scaffold (Ngamwongsatit, Banada, Panbangred, & Bhunia, 2008; Park, Park, Kim,

Song, & Suh, 2002; Shanmugasundaram et al., 2001). The PSC coated chitosan scaffold seem to decreasthe swelling ratio. As the morphological structure of scaffolds had fibril network structure in the porous. Such fibril network effected on decreasing of swelling ratio. This result was similar to the previous study that the swelling property of sponge-like matrice dependent on the network porous structure and microstructure of scaffold (Park et al., 2002).

Figure 3 The swelling ratio of scaffold in each group. Compairisons among group, analyzed by Mann-Whitney U test, n=9, (*P<0.05)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

4. Biodegradation The PSC coated chitosan scaffold had more stability from biodegradation than the chitosan scaffold. The result indicted that collagen could improve biodegradation of scaffold. Chitosan is mainly degraded by lysozyme (Vårum, Myhr,

119

Hjerde, & Smidsrød, 1997) which is present in various human body fluids and tissue (Köse, Kenar, Hasirci, & Hasirci, 2003). The rate of scaffold degradation should mirror the rate of new tissue formation or be adequate for the controlled release of bioactive molecules(Aranaz et al., 2009).

100

weight loss (%)

80 60

chitosan 40

PSC coated chitosan

20 0 day0

day7

day14

day21

Figure 4 Biodegradation of scaffold after digestion with lysozyme at Day 7, 14 and 21. Between different time point in each group, P< 0.05, analyzed by Kruskal Wallis test, n=9

Conclusions

References

By using the centrifuge method porous chitosan scaffold was successfully produced. Extraction of collagens from the skin of brownbanded bamboo shark could be achieved by pepsin solubilization. Modification of chitosan scaffolds by coatings with PSC from shark skin for bone tissue engineering was proposed in this study. PSC improved our novel chitosan scaffold physical properties. Further biological property investigations need to be carried out prior to in vivo studies in animal and cleft palate patients for future clinical applications.

Aranaz, I., Mengibar, M., Harris, R., Panos, I., Miralles, B., Acosta, N., … Heras, A. (2009). Functional Characterization of Chitin and Chitosan. Current Chemical Biology, 3(2), 203–230. doi: org/10.2174/187231 309788166415 Arpornmaeklong, P., Suwatwirote, N., Pripatnanont, P., & Oungbho, K. (2007). Growth and differentiation of mouse osteoblasts on chitosan-collagensponges. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 36(4), 328–337. doi: org/10.1016/ j.ijom.2006.09.023

Acknowledgements This work was supported by Princes of Songkla University, Songkhla, Thailand. Becker, C., & Jakse, G. (2007). Stem cells for regeneration of urological structures. European

120

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Urology, 51(5), 1217–1228. doi: org/10.1016/ j.eururo.2007.01.029

Janssen, N. G., Weijs, W. L. J., Koole, R., Rosenberg, A. J. W. P., & Meijer, G. J. (2014). Tissue engineering strategies for alveolar cleft Benjakul, S., Thiansilakul, Y., Visessanguan, W., reconstruction: a systematic review of the literature. Clinical Roytrakul, S., Kishimura, H., Prodpran, T., & Oral Investigations, 18(1), 219–226. doi: org/10.1007/ Meesane, J. (2010). Extraction and characterisation of s00784-013-0947-x pepsin-solubilised collagens from the skin of bigeye snapper (Priacanthus tayenus and Priacanthus Kim, S.-J., Kim, M.-R., Oh, J.-S., Han, I., & Shin, macracanthus). Journal of the Science of Food and S.-W. (2009). Effects of polycaprolactone-tricalcium Agriculture, 90(1), 132–138. doi: org/10.1002/ phosphate, recombinant human bone morphogenetic proteinjsfa.3795 2 and dog mesenchymal stem cells on bone formation: pilot study in dogs. Yonsei Medical Journal, 50(6), 825–831. Bryan, M. A., Brauner, J. W., Anderle, G., Flach, doi: org/10. 3349/ymj.2009.50.6.825 C. R., Brodsky, B., & Mendelsohn, R. (2007). FTIR studies of collagen model peptides: complementary Kortebein, M. J., Nelson, C. L., & Sadove, A. M. experimental and simulation approaches to conformation (1991). Retrospective analysis of 135 secondary and unfolding. Journal of the American Chemical Society, alveolar cleft grafts using iliac or calvarial bone. 129(25), 7877–7884. doi: org/10.1021/ja071154i Journal of Oral and Maxillofacial Surgery: Official Journal of the American Association of Oral and Cho-Lee, G.-Y., Garcí a-Dí ez, E.-M., Nunes, R.- Maxillofacial Surgeons, 49(5), 493–498. A., Martí -Pagè s, C., Sieira-Gil, R., & Rivera-Baró, A. (2013). Review of secondary alveolar cleft Köse, G. T., Kenar, H., Hasirci, N., & Hasirci, V. repair. Annals of Maxillofacial Surgery, 3(1), 46– (2003). Macroporous poly(3-hydroxybutyrate -co50. doi: org/10.4103/2231-0746.110083 3-hydroxyvalerate) matrices for bone tissue engineering. Biomaterials, 24(11), 1949–1958. Drosse, I., Volkmer, E., Capanna, R., De Biase, P., Mutschler, W., & Schieker, M. (2008). Tissue Krimm, S., & Bandekar, J. (1986). Vibrational engineering for bone defect healing: an update on a multi- spectroscopy and conformation of peptides, component approach. Injury, 39 Suppl 2, S9–20. doi: polypeptides, and proteins. Advances in Protein org/10.1016/S0020-1383(08)70011-1 Chemistry, 38, 181–364. Goudy, S., Lott, D., Burton, R., Wheeler, J., & Canady, J. (2009). Secondary alveolar bone grafting: outcomes, revisions, and new applications. The Cleft PalateCraniofacial Journal: Official Publication of the American Cleft Palate-Craniofacial Association, 46(6), 610–612. doi: org/10.1597/ 08-126.1

Matsuura, T., Tokutomi, K., Sasaki, M., Katafuchi, M., Mizumachi, E., & Sato, H. (2014). Distinct Characteristics of Mandibular Bone Collagen Relative to Long Bone Collagen: Relevance to Clinical Dentistry. BioMed Research International, 2014, e769414. doi: org/10.1155/2014/769414

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

121

Meyer, U., Joos, U., & Wiesmann, H. P. (2004). Biological and biophysical principles in extracorporal bone tissue engineering. Part III. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 33(7), 635– 641. doi: org/10.1016/j.ijom.2004.04.006

Park, S.-N., Park, J.-C., Kim, H. O., Song, M. J., & Suh, H. (2002). Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide crosslinking. Biomaterials, 23(4), 1205–1212.

Moreau, J. L., Caccamese, J. F., Coletti, D. P., Sauk, J. J., & Fisher, J. P. (2007). Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery: Official Journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons, 65(12), 2503–2511. doi: org/10.1016/ j.joms. 2007.06.648

Payne, K. J., & Veis, A. (1988). Fourier transform ir spectroscopy of collagen and gelatin solutions: Deconvolution of the amide I band for conformational studies. Biopolymers, 27(11), 1749–1760. doi: org/10. 1002/bip.360271105

Muyonga, J. H., Cole, C. G. B., & Duodu, K. G. (2004). Characterisation of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus). Food Chemistry, 85(1), 81–89. doi: org/10.1016/j.food chem.2003.06.006 Nagai, T., Suzuki, N., & Nagashima, T. (2008). Collagen from common minke whale (Balaenoptera acutorostrata) unesu. Food Chemistry, 111(2), 296–301. doi: org/10.1016/j.foodchem.2008.03. 087 Ngamwongsatit, P., Banada, P. P., Panbangred, W., & Bhunia, A. K. (2008). WST-1-based cell cytotoxicity assay as a substitute for MTT-based assay for rapid detection of toxigenic Bacillus species using CHO cell line. Journal of Microbiological Methods, 73(3), 211–215. doi: org/10.1016/ j.mimet. 2008.03.002 Park, S.-N., Lee, H.-J., Lee, K.-H., & Suh, H. (2003). Biological characterization of EDCcrosslinked collagen-hyaluronic acid matrix in dermal tissue restoration. Biomaterials, 24(9), 1631– 1641.

Peppo, G. M. de, Marcos-Campos, I., Kahler, D. J., Alsalman, D., Shang, L., Vunjak-Novakovic, G., & Marolt, D. (2013). Engineering bone tissue substitutes from human induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(21), 8680–8685. doi: org/10. 1073/pnas.1301190110 Shanmugasundaram, N., Ravichandran, P., Neelakanta Reddy, P., Ramamurty, N., Pal, S., & Panduranga Rao, K. (2001). Collagen–chitosan polymeric scaffolds for the in vitro culture of human epidermoid carcinoma cells. Biomaterials, 22(14), 1943–1951. doi: org/10.1016/S0142-9612(00) 00220-9 Swan, M. C. (2006). Morbidity at the iliac crest donor site following bone grafting of the cleft alveolus. The British Journal of Oral &amp; Maxillofacial Surgery, 44(2), 129–33. doi: org/ 10.1016/j.bjoms. 2005.04.015 Thuaksuban, N., Nuntanaranont, T., Pattanachot, W., Suttapreyasri, S., & Cheung, L. K. (2011). Biodegradable polycaprolactone-chitosan threedimensional scaffolds fabricated by melt stretching and multilayer deposition for bone tissue engineering:

122

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

assessment of the physical properties and cellular response. Biomedical Materials (Bristol, England), 6(1), 015009. doi: org/10.1088/1748-6041/6/ 1/015009 Vacanti, J. P., & Langer, R. (1999). Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation. Lancet (London, England), 354 (Suppl 1), SI32–34. Vårum, K. M., Myhr, M. M., Hjerde, R. J., & Smidsrød, O. (1997). In vitro degradation rates of partially N-acetylated chitosans in human serum. Carbohydrate Research, 299(1-2), 99–101.

Wang, L., An, X., Xin, Z., Zhao, L., & Hu, Q. (2007). Isolation and characterization of collagen from the skin of deep-sea redfish (Sebastes mentella). Journal of Food Science, 72(8), E450– 455. doi: org/10.1111/j.1750-3841.2007.00478.x Yan, L.-P., Wang, Y.-J., Ren, L., Wu, G., Caridade, S. G., Fan, J.-B., … Reis, R. L. (2010). Genipin-cross-linked collagen/chitosan biomimetic scaffolds for articular cartilage tissue engineering applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 95A(2), 465–475. doi: org/10. 1002/jbm.a.32869 Younger, E. M., & Chapman, M. W. (1989). Morbidity at bone graft donor sites. Journal of Orthopaedic Trauma, 3(3), 192–195.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

123

การศึกษายีน mating type และความสัมพันธ์กบั การสร้าง biofilm ของเชื้ อ Aspergillus fumigatus จากสิง่ ส่งตรวจจากโรงพยาบาลศิริราชและโรงพยาบาลสงขลานครินทร์ อิมรัน สะมะแอ1, มิ่งขวัญ ยิ่งขจร2 และณัฏฐนันท์ ปิ่ นชัย1*

Study on mating type and association with pathogenesis of Aspergillus fumigatus from clinical isolates collected at Siriraj hospital and Songklanagarind hospital Imran Sama-ae1, Mingkwan Yingkajorn2 and Nadthanan Pinchai1* 1

ภาควิชาจุลชีววิทยา, คณะแพทยศาสตร์ศริ ิราชพยาบาล, มหาวิทยาลัยมหิดล, กรุงเทพ 10700 ภาควิชาพยาธิวิทยา, คณะแพทยศาสร์, มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์, สงขลา 90112 1 Department of Microbiology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand 2 Department of Pathology, Faculty of Medicine, Prince of Songkla University, Songkhla 90112, Thailand * Corresponding author. E-mail address: nadthanan.pin@mahidol.ac.th 2

บทคัดย่อ การสืบพั นธุ์แบบอาศัยเพศของเชื้อราหลายชนิด ในสกุล Aspergillus ได้ ถูก ค้ นพบเมื่อไม่ นานมานี้ การค้ น พบคุณสมบัติ ของการ สืบพันธุแ์ บบอาศัยเพศดังกล่าวก่อให้ เกิดคาถามถึงบทบาทสาคัญของการสืบพันธุแ์ บบอาศัยเพศต่อการอยู่รอดของเชื้อจุลชีพนี้ ตลอดจน ผลกระทบอย่างมีนัยสาคัญทางการแพทย์ อาทิเช่น การนาไปสู่ความรุนแรงในการก่อโรคที่มากขึ้นหรือมีความดื้อต่อยาต้ านเชื้อรามากขึ้น ในบรรดาเชื้อราในตระกูล Aspergillus พบว่า Aspergillus fumigatus เป็ นเชื้อราฉวยโอกาสที่พบว่ ามีอุบัติการณ์สงู สุดในผู้ป่วยภูมิค้ ุมกัน บกพร่องโดยเฉพาะอย่างยิ่งในผู้ป่วยที่มีภาวะบกพร่องเม็ดเลือดขาวชนิด neutrophil (neutropenia) ซึ่งการสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศของ A. fumigatus นี้ มียีนที่เกี่ยวข้ องอยู่สองยีน ได้ แก่ยีน mating type 1-1 (MAT1-1) และยีน mating type 1-2 (MAT1-2) และต้ องอาศัย กระบวนการ crossing ระหว่างสายพันธุ์ท่มี ีชนิดของยีน mating type ที่ต่างกัน ที่น่าสนใจคือ จากการศึกษาที่ผ่านมาพบว่ า ชนิดของยีน MAT มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสาคัญกับพยาธิกาเนิด เนื่องจากมีปัจจัยก่อโรค (virulence factor) หลายปั จจัยที่ทาให้ เชื้อ A. fumigatus มีความสามารถในการก่อโรคในมนุษย์ได้ อาทิเช่ น ความสามารถในการเกาะติดกับเซลล์เยื่อบุถุงลมปอด ความสามารถในการลบหลีก ภูมิค้ มุ กันและความสามารถในการสร้ างไบโอฟิ ล์มในปอดเป็ นต้ น ดังนั้นการศึกษาในครั้งนี้ จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อ ตรวจสอบชนิดของยีน mating type ในเชื้อ A. fumigatus จากสิ่งส่งตรวจที่ได้ รับจากโรงพยาบาลศิริราชและโรงพยาบาลสงขลานครินทร์ ตลอดจนเปรียบเทียบ ความสัมพันธ์ระหว่างชนิดของยีน MAT กับพยาธิกาเนิดของเชื้อ A. fumigatus ซึ่งการศึกษาในครั้งนี้ ได้ เน้ นไปที่ความสามารถในการ สร้ างไบโอฟิ ล์มของเชื้อราสายพันธุ์น้ ี ในการศึกษาครั้งนี้ได้ ทาการระบุสปี ชีย์ของเชื้อ Aspergillus ที่ได้ จากสิ่งส่งตรวจด้ วยวิธีตรวจสอบ สัณฐานวิทยาของเชื้อและทาการยืนยันสปี ชีย์ด้วยการหาลาดับเบสของดีเอ็นเอ (DNA sequencing) จากนั้นทาการตรวจสอบชนิดของยีน MAT ด้ วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส (polymerase chain reaction) และทา biofilm formation assay เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง ชนิดของยีน MAT กับการสร้ างไบโอฟิ ล์ม ผลจากการศึกษาสัณฐานวิทยาและ DNA sequencing แสดงว่าเชื้อราที่ได้ รับจากสิ่งส่งตรวจ จานวน 23 ตัว เป็ นเชื้อ A. fumigatus ซึ่ง 5 ตัว มียีนชนิด MAT1-1 ในขณะที่ 18 ตัว มียีนชนิด MAT1-2 ผลของ biofilm formation assay พบว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสาคัญระหว่างการสร้ างไบโอฟิ ล์มของเชื้อ A. fumigatus ที่มียีน MAT1-1 และยีน MAT1-2 ผลของการทดลองในครั้งนี้แสดงให้ เห็นว่าไม่มีความสัมพันธ์กันระหว่างชนิดของยีน MAT กับการสร้ างไบโอฟิ ล์มของเชื้อ A. fumigatus อย่างไรก็ตามการศึกษาต่อไปเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างยีน MAT กับปัจจัยก่อโรคอื่นๆของเชื้อ A. fumigatus มีความสาคัญที่จะทาให้ เข้ าใจพยาธิกาเนิดของจุลชีพนี้มากขึ้น คาสาคัญ: Aspergillus fumigatus ไบโอฟิ ล์ม ปัจจัยก่อโรค พยาธิกาเนิด

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

124

Abstract In recent years, a sexual cycle of several fungal species in the genus Aspergillus were described. The description of heterothallic sexuality in Aspergillus species raised questions such as the role of sexual reproduction in the survival of this microorganism and whether it could have significant medical implications, such as contribution to increased virulence or increased antifungal drug resistance. Among species in the genus Aspergillus, Aspergillus fumigatus is the most common cause of opportunistic fungal infection in immunocompromised host, especially in those with neutropenia. Sexual reproduction in this species is governed by two different mating-type genes, mating-type 1-1 gene (MAT1-1) and mating-type 1-2 gene (MAT1-2), and requires a crossing between isolates of different mating-type gene.Interestingly, a significant association between the type of MAT gene and pathogenesis has been recently reported. As there are several virulence factors that contribute to ability of A. fumigatus to cause diseases in human, such as ability to adhere to the mucus membrane of alveoli, ability to evade host immunity and ability to form biofilm in the lung, . Thus, this study aimed to determine the mating type gene of A. fumigatus from clinical isolates collected at Siriraj Hospital and Songklanagarind Hospital and to study the relationship between gene MAT and pathogenicity of A. fumigatus, focused on biofilm formation. In this study, phenotypic examinations were performed to identify the species of Aspergillus from clinical isolates and confirmed species identification by DNA sequencing. Polymerase chain reaction (PCR) was performed to determine mating type gene and biofilm formation assay was carried out to study the relationship between the gene MAT and biofilm formation. The result from phenotypic method and DNA sequencing revealed that 23 isolates were identified as A. fumigatus by. Among them, 5 isolates revealed MAT1-1 type, while 18 isolates were of MAT1-2 type. The result of the biofilm formation assay showed no statisticallysignificance difference between A. fumigatus MAT1-1 and MAT1-2. This result suggests that there is no relationship between mating type gene and biofilm formation. Further study about relationship between MAT gene and other virulence factors of A. fumigatus are important for better understanding pathogenesis of this microorganism. Keywords: Aspergillus fumigatus, biofilm, virulence factor, pathogenesis

required for sexual reproduction. In ascomycetes, a sexual reproduction is governed by two different Aspergillus species are commonly found mating-type genes, mating-type 1-1 gene (MAT1saprophytic fungi that are important causes of 1) and mating-type 1-2 gene (MAT1-2). The infection among patients with immunodeficiency or mating type gene MAT1-1 encodes a protein with patients receiving immunosuppressive agents. the so-called Îą box domain, whereas the gene Infection begins with inhalation of airborne conidia, product of MAT1-2 contains a high mobility group which are widely distributed in the environment. (HMG) domain. In homothallic fungi, both MAT1Once the conidia reach the alveoli of susceptible 1 and MAT1-2 are present, while in heterothallic hosts, they initiate the germination process to produce fungi, only one mating-type gene is required for a angioinvasive hyphae that can invade tissue and crossing between isolates of opposite mating-type. endothelial cells, causing severe tissue necrosis. In Aspergillus fumigatus, the most common The ascomycetes Aspergillus species have been pathogenic member in the genus Aspergillus, previously regarded as asexual fungi. Recent genome genome-wide screening revealed 215 genes analysis (Nierman et al., 2005; Mogensen, Nielsen, implicated in sexual development, including the Hofmann, & Nielsen, 2006), however, revealed that high-mobility group (HMG)-domain gene which is the genome of certain Aspergillus species includes typically required for sexual reproduction (Mogensen mating-type (MAT) locus and a set of genes et al., 2006), suggesting that Aspergillus fumigatus Introduction

125

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

may be capable of sexual reproduction. Later on, sexual cycle of A. fumigatus was discovered and sexual reproduction was successfully induced (O'Gorman, Fuller, & Dyer, 2009). Furthermore, MAT genes have also been identified in many other Aspergillus species including A. oryzae, A. nomius, A. caelatus, A. tamarii, A. sojae, A. bombycis, A. nigerand A. clavatus (KwonChung & Sugui, 2009; Pal, 2007). This finding indicates possible significance of the sexual reproduction. Classification of the teleomorph (sexual stage) of the genus Aspergillus is based on the presence of cleistothecia, ascospores and the phylogenetic relatedness, such as Neosartoya fumigata and Petromyces flavus being the teleomorph of Aspergillus fumigatus (O'Gorman, 2009) and Aspergillus flavus (Ramirez-Prado, Moore, Horn, & Carbone, 2008), respectively. Recent discovery of sexual reproduction in Aspergillus spp. has initiated exciting discussion regarding significance of fungal sexual reproduction, such as whether the progeny from sexual reproduction will have increased virulence or increased resistance to antifungal agent (O'Gorman et al., 2009). The existence of two different mating types in the genome of Aspergillus spp. (either MAT1-1 or MAT1-2) also raises the question about association between mating type and pathogenesis of Aspergillus spp. Interestingly, the mating type of the opportunistic yeast Cryptococcus neoformans was shown to be associated with virulence (Kwon-Chung, Edman, & Wickes, 1992). This discovery raises the question of whether such relationship between mating type and virulence also exist in Aspergillus spp. In 2010, Alvarez-Pé rez et al. indeed observed a relationship between mating type and invasiveness in Aspergillus fumigatus, whereby MAT1-1 was shown to be significantly associated with elastase activity (Galagan et al., 2005). As elastase promotes tissue

invasion and serves as important virulence factor in several pathogenic microorganism, it is possible that Aspergillus spp. with MAT1-1 gene may reveal higher virulence than those with MAT1-2. In addition, Cheema & Christians reported that virulence of A. fumigatus in the larvae of the wax moth Galleria mellonella as an in vivo model was different among the mating types (Cheema & Christians, 2011). The survival rate of Galleria mellonella larvae injected with MAT1-1 Aspergillus fumigatus isolates was lower than those injected with MAT1-2 isolates, suggesting that variation concerning virulence may exist between different mating types. Several virulence factors have been previously described in Aspergillus spp., including capability to form biofilm (Abad, 2010). For better understanding the pathogenesis of aspergillosis, this study aimedto determine the mating type gene of Aspergillus fumigatus clinical isolates collected at Department of Microbiology, Siriraj Hospital and Songklanagarind Hospital and to investigate association with biofilm formation. Materials and methods Fungal isolates and culture conditions Fungal clinical isolates obtained from Siriraj Hospital and Songklanagarind Hospital that were identified by culture-based method as Aspergillus fumigatus were sub-cultured on Sabouraud dextrose agar plate at 37°C for 7 days. Species identification will be confirmed by DNA sequencing. Genomic DNA extraction For genomic DNA extraction, Aspergillus fumigatus clinical isolates were sub-cultured on Sabouraud dextrose agar plate at 37°C for 3 days. After that the fungal conidia were cultured and shaken in glucose minimum media broth (GMM broth) at 37°C and 250 rpm for overnight. Then,

126

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

after centrifugation at 4500 rpm for 15 min at room temperature, 600 µl TENS buffer and sterile glass beads were added to the cell pellet and mixed by homogenizer. The cell suspension was incubated at 65°C for 1 h prior to genomic DNA extraction using plant genomic DNA extraction kit following the manufacturer instructions (Viogene, Taiwan). The obtained DNA was quantified by UVspectrophotometer. DNA sequencing DNA sequencing was performed to confirm species identification of the Aspergillus fumigatus isolates. For DNA sequencing, genomic DNA wasamplified by PCR, using the primer set ITS1 (5´-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3´) and ITS4 (5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3´) which target the conserved internal spacer (ITS) region of the ribosomal DNA. Cycle parameters were 5 minutes at 95°C (initial denaturation), 35 cycles of 30 seconds at 95°C (denaturation), 1 minute at 55°C (annealing), and 1 minute at 72°C (extension) before 5 minutes at 72°C (final extension). Depending on species, the expected size of the amplicon was in the range of 300-500 bp. PCR products were checked on agarose gel electrophoresis,

and purified using PCR fragment purification kit. Finally, the PCR products were send to a company for sequencing using the same primer set. Mating type determination For determination of mating type, genomic DNA was subjected to multiplex PCR as previously described by Paoletti et al., 2005. The multiplex PCR will contain MAT1-1 specific primer AFM1 (5´-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3´), MAT1-2 specific primer, AFM2 (5´CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3´), and a common primer, AFM3 (5´CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3´) that targets the flanking region of MAT locus (Figure 1). In cases of no result, alternative primer sets were used such as MAT1-1-specific (AF52 [5´GGAGGATGCCGGTCTTGG-3´] and AF32 [5´TGGAGGCCGTTGAACAGG-3´]) or MAT1-2specific (AF51 [5´-CCTCCCCATCAATGTGACC3´] and AF31 [5´-CTCGTCTTTCCACTGCTTCC3´]). Finally, gel electrophoresis was performed to check the size of the amplicons with the expected sizes being 834 bp and 438 bp for the MAT1-1 and MAT1-2, respectively.

Figure 1 Diagram shows position of primers AFM1, AFM2 and AFM3, used for amplification of idiomorph regions.

127

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Quantification of biofilm formation Biofilm quantification was performed with slightly modification as described by Mowat et al. (Mowat, Butcher, Lang, Williams, & Ramage, 2007). Briefly, Aspergillus fumigatus clinical isolates were sub-cultured on Sabouraud dextrose agar plate at 37°C for 3 days. After that fungal conidia were harvested and diluted to 106 conidia/200 µl GMM broth. The diluted conidia were then inoculated into a 96 well culture plate and incubated at 37°C for 24h. The media was removed and the attached conidia were washed 3 times with 200 µl PBS. Biofilm formation were quantified by staining with 200 µl 0.5 % (w/v) crystal violet solution for 5 min, followed by removal of excess stain by keeping the plate under running water. Then, a

biofilm was destained with 200 µl of absolute ethanol and the destained suspension was subjected to absorbance reading at 590 nm. The experiment were done in triplicate and repeated twice with independent conidia preparations. Results Morphology of A. fumigatus A. fumigatus of both mating types showed dark blue-green colonies on SDA plates (Figure 2a) with white to tan-colored reverse (Figure 2b). Microscopic morphology of A. fumigatus showed columnar conidial heads with uni-seriate conidia and smooth walled conidiophore (Figure 2c).

Figure 2 Macroscopic and microscopic examination of the Aspergillus fumigatus. (a = surface colony appearance on SDA, b = reverse colony appearance on SDA, c = conidiophore with conidia-covered vesicle)

2 (Figure 3). Distribution of the mating type gene of Mating type determination A single band of 834 bp was obtained for the 23 isolates of A. fumigatus is shown in Table 1. MAT1-1 type and 438 bp was obtained for MAT1-

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

128

834 bp

438 bp

Figure 3 PCR product of mating type gene of Aspergillus fumigatus 3a = MAT1-1, 3b = MAT1-2. Table 1 Specimen and mating type of A. fumigatus clinical isolates Mating type frequency

Specimen type Sputum Bronchoalveolar lavage Pus from abdominal wound Pus from nasal cavity discharge Pus from frontal bone Pus from other site Tissue biopsy from cervical lymph node Tissue biopsy from mastoid Tissue biopsy from right frontal bone Tissue biopsy from right dural bone Tissue biopsy from right temporal bone Tissue biopsy from other site aqueous humor abdominal wound lung effusion mass at nasal cavity Total

MAT1-1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 5

Quantification of biofilm formation Biofilm formation of A. fumigatus MAT1-1 and MAT1-2 showed no statistically significant

MAT1-2 4 2 1 1 0 1 1 0 2 2 0 1 1 0 1 1 18

difference (p-value=0.491435) (Figure 4).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

129

Figures 4 Biofilm formation of A. fumigatus of different mating type a = absorbance reading at 590 nm of 3 isolates of A. fumigatus MAT1-1. b = absorbance reading at 590 nm of 3 isolates of A. fumigatus MAT1-2.

Discussion A. fumigatus is the most common cause of opportunistic fungal infection in immunocompromised host, especially in host with neutropenia and in bone marrow transplant recipients (Singh, 2005). Previously, A. fumigatus wasconsidered as asexual species, but recently, sexual cycle was discovered and sexual reproduction was successfully induced (O'Gorman et al., 2009). This finding raises the question whether it could have significant medical implications. In this study, we investigated relationship between mating type and biofilm formation as one of the virulence factor of A. fumigatus. As there are many steps involved in pathogenesis of A. fumigatus, basic knowledge of pathogenesis of this organism are important to prevent and treat infection in immunocompromised patients. Infection begins with inhalation of airborne conidia, which are widely distributed in the environment. Sometimes biofilm is formed after inhalation to evade from host immune response and

antifungal drug. As relationship between mating type and virulence in A. fumigatus has not been much reported. In this study, we focused on the relationship between mating type and biofilm formation in A. fumigatus. The results revealed that A. fumigatus clinical isolates collected at Siriraj Hospital and Songklanagarind Hospital showed a higher proportion of MAT1-2 isolates than MAT1-1 isolates, in the ratio of about 3:1. This result correlated well with recent study that reported higher proportion of MAT1-2 than MAT1-1 in the ratio of about 2:1 (Bain et al., 2007). However, the result did not comply with those from Paoletti et al., 2005 who reported similar proportion between MAT1-1 and MAT1-2 isolates, both in environmental and clinical isolates. In addition, we found that both MAT1-1 and MAT1-2 were distributed in fungal isolates obtained from several organs such as lung, nasal cavity, lymph node, mastoid and wounds (Table 1). For biofilm formation, we found no significant difference between the different mating types (pvalue=0.491435). As all isolates that we used in

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

130

this study derived from clinical specimen, it is possible that ability of biofilm formation may be affected by antifungals. Another possibility is that, mating type gene is in fact not involved in biofilm formation, but may play role in other more prominent virulence factors. Conclusion and Suggestion To our knowledge, this is the first study about relationship between mating type and biofilm formation in A. fumigatus. The results suggested that there is likely no relationship between mating type gene and biofilm formation. As there are several virulence factors that make A. fumigatus a successful pathogenic fungi, future study about relationship between MAT gene and others virulence factors of A. fumigatus may lead to better understanding of pathogenesis of this organism.

(2007). Multilocus sequence typing of the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. Journal of clinical microbiology, 45(5), 1469-1477. Cheema, M. S., & Christians, J. K. (2011). Virulence in an insect model differs between mating types in Aspergillus fumigatus. Medical mycology, 49(2), 202-207. Galagan, J. E., Calvo, S. E., Cuomo, C., Ma, L. J., Wortman, J. R., Batzoglou, S., Kapitonov, V. (2005). Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A. fumigatus and A. oryzae. Nature, 438(7071), 1105-1115. Kwon-Chung, K. J., & Sugui, J. A. (2009). Sexual reproduction in Aspergillus species of medical or economical importance: why so fastidious? Trends in microbiology, 17(11), 481-487.

Kwon-Chung, K. J., Edman, J. C., & Wickes, B. L. (1992). Genetic association of mating types and The authors would like to express special thanks to virulence in Cryptococcus neoformans. Infection and laboratory service, Department of Pathology, Immunity, 60(2), 602-605. Songklanagarind hospital and laboratory service, Department of Microbiology, Siriraj Hospital for kindly Mogensen, J., Nielsen, H. B., Hofmann, G., & Nielsen, J. (2006). Transcription analysis using providing fungal isolates. high-density micro-arrays of Aspergillus nidulans wild-type and creA mutant during growth on glucose References or ethanol. Fungal Genetics and Biology, 43(8), Abad, A., FernĂĄndez-Molina, J. V., Bikandi, J., 593-603. RamĂ rez, A., Margareto, J., Sendino, J., ... Rementeria, A. (2010). What makes Aspergillus Mowat, E., Butcher, J., Lang, S., Williams, C., & fumigatus a successful pathogen? Genes and Ramage, G. (2007). Development of a simple molecules involved in invasive aspergillosis. Revista model for studying the effects of antifungal agents on multicellular communities of Aspergillus iberoamericana de micologia, 27(4), 155-182. fumigatus. Journal of Medical Microbiology, 56(9), Bain, J. M., Tavanti, A., Davidson, A. D., Jacobsen, 1205-1212. M. D., Shaw, D., Gow, N. A. R., & Odds, F. C. Acknowledgements

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

131

Nierman, W. C., Pain, A., Anderson, M. J., Wortman, J. R., Kim, H. S., Arroyo, J.,& Bennett, J. (2005). Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus. Nature, 438(7071), 151-1156.

Paoletti, M., Rydholm, C., Schwier, E. U., Anderson, M. J., Szakacs, G., Lutzoni, F., ... Dyer, P. S. (2005). Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology, 15(13), 1242-1248.

Oâ&#x20AC;&#x2122;Gorman, C. M., Fuller, H. T., & Dyer, P. S. (2009). Discovery of a sexual cycle in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Nature, 457(7228), 471-474.

Ramirez-Prado, J. H., Moore, G. G., Horn, B. W., & Carbone, I. (2008). Characterization and population analysis of the mating-type genes in Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Fungal Genetics and Biology, 45(9), 1292-1299.

PĂĄl, K., Van Diepeningen, A. D., Varga, J., Hoekstra, R. F., Dyer, P. S., & Debets, A. J. M. (2007). Sexual and vegetative compatibility genes in the aspergilli. Studies in Mycology, 59, 19-30.

Singh, N. (2005). Invasive aspergillosis in organ transplant recipients: new issues in epidemiologic characteristics, diagnosis, and management. Medical mycology, 43(suppl. 1), 267-270.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

132

Analytical solution of a 3D model for the airflow in a human oral cavity Chatvarin Tasawang* and Supachara Kongnuan

Department of Mathematics and Statistics, Faculty of Science and Technology, Thammasat University Rangsit Center, Khlong Luang, Pathum Thani, 12121 * Corresponding author. E-mail address: chatvarin.ts@gmail.com Abstract Understanding characteristic of the airflow in a human respiratory tract is very important factor to treatment in the respiratory disease. In this paper, we propose a three-dimensional mathematical modelling for the airflow in a human oral cavity. The airflow is assumed to be axially symmetric flow and driven by the oscillating pressure gradient. The governing equations for describing the behavior of airflow are composed the Navier-Stokes equations and the continuity equation in a cylindrical coordinates system. To solve the model, we presented method of analytical solution for the airflow velocity. We obtained a solution in a Fourier-Bessel series form. Then, we simulated the airflow field on a three-dimensional geometry of the oral cavity area. The obtained results show that the characteristic of magnitude and direction of the airflow correspond to the fact of the airflow in human airway and the previous research works. Keywords: three-dimensional mathematical model, oral cavity, human upper respiratory tract, Navier-Stokes equations, analytical solution,

Introduction In medical research, the aerosolized medicine is used to being the highly effective treatment for the respiratory disease because droplet particles are directly transported into the respiratory position. The droplet particles have also slight side effects. However, the success of the aerosolized treatment depends on the airflow behavior which is an important factor that transports droplet particles in respiratory position. The airflow is also determined trajectory and final location of the particles. Therefore, the characteristic of airflow and particle trajectory are studied extensively both in medical and mathematics. But the medical studies must take a lot of time and high-performance computers in the laboratory experiments, most of researchers use the mathematical model to describe the problem instead. Since the air is one of fluids, a lot of researchers tend to express the airflow velocity by the NavierStokes equations. There are many works that presented a numerical method for finding solution of

these equations and simulate the airflow field especially in a human respiratory tract, such as the research of Wang, Denney, Morrison, and Vodyanoy (2005) presented a numerical simulation of airflow in the human nasal cavity with computational fluid dynamics software and Qingxing, Fong, and ChiHwa (2009) studied the numerical solution of the Navier-Stokes equations for airflow and simulated particle trajectories in a human airway. However, the numerical analysis is quite complex as well as using a high-performance computers, some researchers tried to solve of the Navier-Stokes equations by an analytical method for saving time and computing resources. We can see from some works, for instance, Tsangaris and Vlachakis (2003) presented an analytical solution for the fully developed laminar flow in duct of a cross-section of right-angled isosceles triangle. They have obtained solution in a Fourier series form. Otarod and Otarod (2006) studied an analytical solution for the twodimensional laminar incompressible flow. Mohyuddin Siddiqui, Hayat, Siddqui, & Asghar (2008)

133

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

presented the solutions of the Navier-Stokes equations governing the unsteady incompressible flow. The solutions have been obtained using Hodograph-Legendre transform method. Emin and Erdem (2009) showed an analytical solution of the Navier-Stokes equations governing for flow over a moving plate bounded by two side walls. Furthermore, Kongnuan and Pholuang (2012) proposed an analytical solution of the Navier-Stokes equations for the oscillating airflow in a human upper airway. Nevertheless, the analytical simulation for the three-dimensional model of the oscillating airflow in the human upper respiratory tract has never been presented. Due to we interest the problem of the oscillating airflow in a human upper airway in the research of Kongnuan and Pholuang (2012), we then to develop the two-dimensional human upper airway model of these research to the three-dimensional model for a more realistic geometry. For this work, we will show the three-dimensional model of a human upper respiratory tract including oral cavity until the end of trachea. We propose the mathematical model that the governing equations are described by the NavierStokes equations and the continuity equation in Table 1 Parameters of a human upper respiratory tract. Parameter The diameter of inlet (L1) The length of oral cavity (L2) The diameter of upper trachea (L3) The length of upper trachea (L4) The length of lower trachea (L5) The diameter of outlet (L6)

cylindrical coordinates for axially symmetric case with suitable boundary conditions. Then we present the method of analytical solution for the airflow velocity. The airflow field is simulated in the oral cavity area. Methodology and Solution Construction of Model Because of the complex geometry of a human upper airway as shown in Figure 1(a), which is barrier to create a realistic domain and difficult to derive an analytical expression for the solution of the airflow, therefore, we look a three-dimensional airway in simple model that while the oral is opening wide, the inside of oral cavity seem like an ellipsoid tube shape and connect to trachea tube straight down. To simplify the simulation the airflow field on a 3Dmodel, we consider the oscillating airflow in the human upper airway for the axially symmetric flow case. Here, the domain of our model is started from the beginning of the oral cavity to the end of the trachea in a human upper airway as shown in Figure 1(b). The 3D-model generated from the parameters in Table 1 (Kongnuan & Pholuang, 2012).

Length (cm) 3.125 7.0 2.5 7.0 9.0 2.0

134

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

(a) (b) Figure 1 (a) The construction of a real human upper airway (Image source: Shier et al., Holeâ&#x20AC;&#x2122;s Essentials of Human Anatomy and Physiology) and (b) 3D- human upper respiratory model.

For convenience to derive the analytical expression for the solution of the airflow velocity,

we divide the domain of a upper airway into 4 areas as shown in Figure 2.

Figure 2 Division of the domain

Governing equations and boundary conditions In this paper, we simulate the problem of the airflow only the oral cavity area under the assumptions that the air is an incompressible Newtonian fluid which has constant viscosity and density. The airflow is assumed that there is no effect from any external force and it is driven by the oscillating pressure gradient within the pulmonary.

Therefore, we can use the Navier -Stokes equations and the continuity equation to be the governing equations to describe the airflow in airway. Hence, the governing equations for the threedimensional airflow model are composed the NavierStokes equations and the continuity equation in cylindrical coordinates system. These equations are

135

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

given in terms of velocity components ur , uφ , u x in cylindrical coordinates u = ur er + uφeφ + u xex , where er , eφ , ex are standard unit vectors in radial, angular, and axial direction, respectively. By assumption that the flow is axially symmetric, we search for the axially symmetric solution, the

angular velocity component uφ set to zero. Then, the airflow velocity depends on only the radial direction r and the axial direction x . Therefore, the governing equations can be now written as follows form:

∂u ∂ur 1 + ur + x = 0 , ∂r r ∂x  ∂2u ∂u ∂u  1 ∂ur ur ∂ 2 ur ∂p  ∂u r  r + ur r + u x r  = − + µ  2r + − +  ∂r ∂r ∂x  ∂r r ∂r r 2 ∂x 2  ∂t 

(1)    

 ∂2u ∂u ∂u   ∂u ∂p 1 ∂u x ∂ 2 u x r  x + ur x + u x x  = − + µ  2x + +  ∂r ∂r ∂x  ∂x r ∂r ∂x 2  ∂t 

where u x is the axial component of the flow velocity, ur is the radial component of the flow velocity, p is the pressure, r and µ are the density and dynamic viscosity of the air, respectively. The boundary conditions are described as follows: The non-slip boundary condition, u (= = u x , ur ) (0, 0), is assigned to the inner walls. The pressure at the inlet is zero, while the pressure at outlet is an oscillating function sine of time, = p (t ) P sin(ωt ), (Kongnuan & Pholuang, 2012) where P is the amplitude of the oscillating pressure (Hranitz, 2009). 2

(2)  ,  

(3)

From equations (1)-(3) combine with the above boundary conditions, we now have a boundary value problem (BVP). Then we will find a solution of the BVP in the following section. The method of analytical solution To find the analytical solution in cylindrical coordinates for the oscillating airflow conditions in area 1 (Figure 2), we firstly transform model of area 1 which is in rectangular coordinates system ( x, y, z ) into cylindrical coordinates system ( x, r ) as the following: Since the model in area 1 is look like the elliptic tube, we can consider the ellipsoid equation that is

 x′   y′   z′  1; x′= x − x1 , y′= y − y1 , z′= z − z 1.  a  + b  + c  =      

This equation is transformed to cylindrical coordinates system by defining x′= x′, y′= r cos ϕ, z′= r sin ϕ ϕ = tan −1 ( zy′′ ), and we let c = b , we then get this equation as the following new form:

 x′   r  r 2 ( y′)2 + ( z′)2 . 1; =  a  +b =    

Now we obtain the model of area 1 in cylindrical coordinates as shown in Figure 3, which is confined by

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

136 x = 0,

x= a= L2 ,

= b rupper ( x) − rlower ( x),

r= rupper ( x)= b1 (1 − ( ax′ )2 ) + ( L5 + L4 ),

r= rlower ( x) = −b1 (1 − ( ax′ )2 ) + ( L5 + L4 )

where

a= 1 x= 1

(

L2 2 ) 2

/ 1 − ( 41 )2 , L

and

b= 1 L5 − L4 .

Figure 3 The oral cavity model in cylindrical coordinates system

Next, we use the analytical expression which is based on the Fourier-Bessel series form for the airflow in the oral cavity as shown in Figure 3. From equations (1)-(3), we see that these equations are three partial differential equations with three unknowns u x, ur and p as functions of three independent variables x, r and t . By assuming fully

developed flow on area 1, so that ur = 0 and u x = u x (t , r ). The continuity equation is satisfied and when developed flow conditions across the x − axis, equation (2) is omitted. We are interested in the cases of the airflow which is driven by the oscillating pressure gradient, then the following partial differential equations satisfied:

∂u x 1 ∂p µ  ∂ 2u x 1 ∂u x  = − +  + , r ∂r  ∂t r ∂x r  ∂r 2

where

P a

is the amplitude of the pressure gradient,

is the length on x − axis of the considered region and ω is the cyclic frequency of the oscillating pressure

∂p P = sin(ωt ) ∂x a

gradient. The solution function as

u x is

(4) defined to be periodic the follow:

(5)

(r , t ) us (r )sin(ωt ) + uc (r )cos(ωt ). u x=

In order to the accurately solution, dimensionless variables r =

r , b

x =

x′ , a

= u x

Pb2

x , r, u x and α are

µa,

α =b

ωr , µ

introduced as (6)

Equation (4) together with equation (5) are where=b b= ( x) rupper ( x) − rlower ( x), is the length of reduced to a system of non-homogeneous Helmholtz r − axis of the considered region and α is the reduced frequency. After the introducing equations in one dimension (Rosu & Romero, dimensionless variables, each region is transformed to 1999): be a one-unit region. α 2us=

The boundary conditions for

d 2uc 1 duc , + r dr dr 2

us and uc

−α 2uc = −1 +

are stated as follows:

d 2us 1 dus + . r dr dr 2

(7)

137

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2) us (0) = 0,

us (1) = 0,

uc (0) = 0,

(8)

uc (1) = 0.

∞ The analytical solution of equation (7) which (11) 1 ∑ Cm J 0 (α m r ), = satisfies the boundary conditions (8) can be m =1 determined by using a Fourier-Bessel analysis of where J 0 is the Bessel function of order zero which have us , uc for r . Hence, us , uc and 1 are expressed an infinite number of positive roots αm . The term J 0 (Gockenbach, 2011) as Fourier expansions: ∞ given by (9) = us ∑ Am J 0 (α m r ), m =1 ∞

uc =

∞

∑B m =1

∑

J 0 (α m r ) =

(10)

m J 0 (α m r ),

n =0

(−1) n  α m r    . (n!)2  2 

Substituting the above expansions (9)-(11) in the system of differential equations (7), we get the unknown coefficients Am and Bm as follows:  1 Am =  − 4  α  1 Bm =  2 α

We can calculate coefficient

  (2n)(α m )3 (α m (2n − 1) + 1)    4n2 − [(α m )3 (α m (2n − 1) + 1)]2

4n    2 3   4n − [(α m ) (α m (2n − 1) + 1]2

Cm by

∫ J (α ∫

  Cm ;  

(12) n = 0,1, 2,... , m = 1, 2, 3,...

the usual formula: 1

Cm =

 C ,  m 

  m r )rdr

  [ J 0 (α m r )]2 rdr

m = 1, 2, 3,...

;

The resulting periodic velocity can be written as: = ua

= u x ua sin(ωt ),

where ua is the amplitude resulting from the expression of substituting u x back into equation (6) , we get ux =

u x .

us + uc ,

We then can obtain the airflow velocity

Pb2 u x . µa

(13) (14) u x by

(15)

Finally, we have obtained the analytical solution three-dimensional oral cavity which is the one part of in cylindrical coordinates. We can transform back a human upper airway. into the rectangular coordinates system as follows: Results Discussion and = the u y ur cos ϕ, ux = ux , = u z ur sin ϕ, components of the flow velocity in x − axis, y − In this paper, the analysis is carried out with and = r 1.148 × 10 −3 g / m3 ,= µ 1.82 × 10 −5 Pa.s axis, and z − axis, respectively. We then use the amplitude of the oscillating intrapulmonary pressure obtained solution to simulate the airflow field in the

138

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

from the research in medical literatures of Zhang and Kleinstreuer (2004), they found that the period of human breathing is about 4s. Therefore, we use ω = π2 . In order to show the realistic simulation, we present the 3D arrow plot for airflow field. In Figures 4-5, we demonstrate the 3D arrow plots of airflow field in the breathing period at t = 1.4s and t = 2.5s, respectively. In addition, to see more clearly the airflow field, the arrow plot of airflow field is also plotted in the XZ-plane for the central cavity ( y′ = 0) , left side ( y′ = 1) and right side ( y′ = −1) of the oral cavity at t = 1.4s and t = 2.5s as shown in Figures 6-7. For the present magnitude of the velocity, the contour P = −133.32 Pa.

plot of the airflow velocity for the central cavity ( y′ = 0) of the oral cavity at = 1.4s and t = 2.05s are shown in Figure 8. When we consider the 3D arrow plot of the airflow velocity as shown in Figures 4-5, it is found that the air flows into the oral cavity at t = 1.4s which corresponds to the pulmonary relaxation. In contrast, the air flows out the oral cavity at t = 2.5s which corresponds to pulmonary contraction. At the same locations, the velocity of airflow has size and direction different by each time. The maximum velocity occurs in the central area of the oral cavity and reduces to the zero value close to the walls.

Figure 4 The 3D arrow plot of airflow field in the oral cavity at t = 1.4 s

Figure 5 The 3D arrow plot of airflow field in the oral cavity at t = 2.5 s

139

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

In addition, the arrow plot of airflow field in the XZ-plane at the central cavity as shown in Figures 6(a)-6(b), we see clearly the flow that the velocity profiles become flat in the central area and reduce to the zero for the area which is more close to the walls. When air flows into the oral cavity at t = 1.4s, the velocity shows the maximum value that about 549 cm/s in the central area and when air flows out the oral cavity at t = 2.5s, the maximum velocity value have about 480 cm/s. At the sides of cavity as shown in Figures 7(a)(d), the cross-sectional sides of oral cavity are less than central oral cavity. We found that when t = 1.4s air flows into the oral cavity and the velocity have maximum value that about 273 cm/s in the central of the plane. In contrast, when t = 2.5s air flows out the oral cavity and the velocity have maximum value that about 238 cm/s in the central of the plane. We can see that the central oral cavity have maximum value of the velocity more than at the side of oral cavity. When we consider the contour plot of magnitude of the airflow velocity in the central cavity ( yâ&#x20AC;˛ = 0) at t = 1.4s and t = 2.05s as shown in Figures 8(a)8(b), it is found that the velocity magnitude become

(a)

flat in the central of the oral cavity. This shows a boundary layer behavior with a high velocity gradient close to the boundaries. The magnitude of velocity always shows the maximum value in the central area and reduces to the zero value for the area which is more close to the walls, which correspond to the arrow plot. When compare the velocities at different times are different and when t = 2.05s, the direction of the flow is changing to become the out flow, their magnitudes of the velocity are less than other times and close to zero. From the previous results, we can conclude that (1) the airflow has changed both magnitude and direction according to the breathing period. By during the first two seconds, the air flows into the oral cavity and the direction of the flow is changing to become the out flow at the beginning of the third seconds. (2) At the same locations, the magnitude and direction of airflow velocity are changed and depend on time. The maximum velocity occurs in the central area of the oral cavity and reduces to the zero value to the wall. The obtained velocities are in the range of [0,900] cm/s which agree to other publications (Kongnuan & Pholuang, 2012; Zhang & Kleinstreuer, 2004).

(b)

Figure 6 The XZ-plane arrow plot of airflow field in central of the oral cavity ( yâ&#x20AC;˛ = 0) at (a) t = 1.4 s and (b) t = 2.5 s

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

140

(a)

(b)

(c) (d) Figure 7 The XZ-plane arrow plot of airflow field in the side of oral cavity at t = 1.4 s (left) and t = 2.5 s (right) for: (a) and (b) right side of the oral cavity ( y′ = −1) , (c) and (d) left side of the oral cavity ( y′ = 1) .

(a)

(b)

Figure 8 The XZ-plane contour plot of magnitude of the airflow velocity in central of the oral cavity ( y′ = 0) at (a) t = 1.4 s and (b) t = 2.05 s.

Conclusions

continuity equations in cylindrical coordinates are carried out as the objective of this research. The An analytical expression for the axially symmetric analytical solution of the oscillating airflow is given solution of the airflow in human oral cavity model in a Bessel series form. The three-dimensional which is described by the Navier-Stokes and mathematical model is sophisticated to simulate the

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

141

airflow velocity. The obtained airflow profiles are Hodograph-Legendre transformation method. Tamsui reasonable and correspond to the previous works Oxford Journal of Mathematical Sciences, 24(3), (Kongnuan & Pholuang, 2012; Zhang & 257-268. Kleinstreuer, 2004). Qingxing, X., Fong, Y. L., Chi-Hwa, W. (2009). Acknowledgements Transport and deposition of inertial aerosols in bifurcated tubes under oscillatory flow. Chemical The authors would like to thank Department of Engineering Science, 64, 830-846. Mathematics and Statistics, Thammasat University for giving the facilities support this work. Otarod, O., & Otarod, D. (2006). Analytical References

solution for Navier-Stokes equations in two dimensions for laminar incompressible flow. Retrieved from http://arxiv.org/physics/0609186

Emin, M., & Erdem, C. (2009). An analytical Solution of the Navier-Stokes Equation for Flow Rosu, H., & Romero, J. L. (1999). Ermakov over a Moving Plate Bounded by Two Side Walls. approach for the one-dimensional Helmholtz Journal of Mechanical Engineering, 55(12), 749-754. Hamiltonian. Nuovo Cimento, 114, 569-574.

Gockenbach, M. S. (2011). Partial differential equations: analytical and numerical methods (2nd Tsangaris, S., & Vlachakis, N. W. (2003). Exact solution of the Navier-Stokes equations for the ed.). The United States of America: The Society for oscillating flow in duct of a cross-section of rightIndustrial and Applied Mathematics. angled isosceles triangle. Z. angew. Math. Phys., 54, Hranitz, M. J. (2009). APHNT: Respiratory 1094-1100.

Physiology Outlines. Retrieved from http://facstaff. Wang, K., Denney, T. S., Morrison, E. E., & bloomu.edu/jhranitz/Courses/APHNT/Outlines/ Vodyanoy, V. J. (2005). Numerical simulation of Respir air flow in the human nasal cavity. Retrieved Kongnuan, S., & Pholuang, J. (2012). A Fourier from http://ieeexplore.ieee.org/xpl/articleDetails.js Series-Based Analytical Solution for the oscillating p?arnumber=1615757 Airflow in a Human Respiratory Tract. International journal of pure and applied mathematics, 78(5), Zhang, Z., & Kleinstreuer, C. (2004). Airflow 721-733. structures and nano-particle deposition in a human upper airway model. Journal of Computational Mohyuddin, M. R., Siddiqui, A. M., Hayat, T., Physics, 198, 178-210. Siddqui, J., & Asghar, S. (2008). Exact solutions of time-dependent Navier-Stokes equations by

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

142

Effects of Sintering Behavior on Structure and Properties of B2O3 doped (Bi0.5Na0.5)0.94Ba0.06TiO3 Lead-Free Ceramics Supalak Manotham1, Pharatree Jaita1,2*, Tawee Tunkasiri1,3and Gobwute Rujijanajul1,3 1

Department of Physics, Faculty of Science, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand Science and Technology Research Institute, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand 3 Materials Science Research Center, Faculty of Science, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand * Corresponding author. E-mail address: pharatree@gmail.com 2

Abstract The effect of sintering temperature on phase structure, densification and room temperature dielectric properties of B 2O3 doped (Bi0.5Na0.5)0.94Ba0.06TiO3(BNBT) lead-free ceramics prepared by a solid-state mixed oxide method was investigated and presented in this work. The X-ray diffraction analysis of the ceramics suggests that all samples exhibited a single perovskite structure without any secondary phase. The coexisting of both rhombohedral and tetragonal phases was identified over the entire sintering temperature range. The optimum sintering temperature for preparation of high-density BNBT + 2 wt% B2O3 ceramic was found to be 1050C. Room temperature dielectric measurement data showed that the dielectric constant and dielectric loss values were increased with increasing the sintering temperature. Keywords: BNBT, Lead-free ceramics, Sintering, Phase, Dielectric Properties

Introduction Piezoelectric materials are commonly used as actuators and sensors in various sensors, actuators, and micro-electromechanical devices (Maqbool et al., 2014). Lead oxide materials such as lead zirconate titanate or Pb(Zr,Ti)O3 (PZT) and its solid solutions have excellent electrical properties and are most commonly used in the modern piezoelectric devices (Hussain et al., 2014). However, the waste products containing lead oxide (PbO) can cause serious human health and environment problems, making lead-free piezoelectric materials far more desirable than PZT (Acharya et al., 2014; Panda, 2009). It is well known that bismuth sodium titanate or Bi0.5Na0.5TiO3 (BNT) was found to be ferroelectric with a perovskite structure at room temperature in 1960 by Smolenskii et al. (Smolensky, Isupov,

Agranovskaya, & Kainik, 1961). BNT is considered as one of promising lead-free piezoelectric materials due to a large remnant polarization (Pr = 38 µC/cm2) at room temperature and a high Curie temperature (Tc = 320 ºC). However, pure BNT ceramics is difficult to be fully poled owing to its high coercive field (Ec = 73 kV/cm), to be sintered and has relatively low piezoelectric properties (Kim et al., 2007; Chen & Hu, 2009). To improve its properties, some modifications on BNT composition have been performed. Previous studies indicate that BNT-based composition modified with BaTiO3 has better piezoelectric property and easier treatment in polling process as compared with pure BNT ceramics (Gao, Huang, Hu, & Du, 2007; Takenaka, Maruyama, & Sakata, 1991; Chu, Chen, Li, & Yin, 2002; Xu, Lin, & Kwok, 2008). Among them, BaTiO3 is well-known lead-free piezoelectric materials with a tetragonal

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

phase, and MPB (morphotropic phase boundary) compositions exist in the case of x = 0.06 - 0.07 for (1-x)Bi0.5Na0.5TiO3-xBaTiO3 system (abbreviated as BNBT). Moreover, the (Bi0.5Na0.5)0.94Ba0.06TiO3 exits on the rhombohedral side around the MPB region and shows fairy satisfactory electrical response (Takenaka et al., 1991). Among, boron oxide or B2O3 has a low melting point of 450ºC and has been widely used as a glass additive to gain a substantial sintering temperature reduction (Liu et al., 2015). Rhim et al. (Rhim, Hong, Bak, & Kim, 2000) reported that the addition of B2O3 helped to improve the dielectric constant of Ba0.7Sr0.3TiO3 ceramics. Later in 2004, Qi et al. (Qi, Chen, Wang, & Chan, 2004) reported that the dielectric properties of BaTiO3 ceramics can be improved by B2O3 vapor addition. Jarupoom in 2010 (Jarupoom, Pengpat, & Rujijanagul, 2010) also reported that piezoelectric properties of Ba(Zr0.07Ti0.93)O3 ceramics were improved by adding B2O3. It was found that the ceramics added with 2 wt% B2O3 presented the highest piezoelectric properties. In this work, the B2O3 doped on lead-free BNBT ceramics was fabricated by a solid solution method. The effect of sintering temperature on phase structure, densification and room temperature dielectric properties was investigated and discussed in details. The optimum sintering condition will be given which is expected to provide material with better electrical properties. Experimental The 0.94Bi0.5Na0.5TiO3-0.06BaTiO3 powders were prepared by solid solution method. The starting materials used in this study were Na2CO3 (99.5%), TiO2 (99%), BaCO3 (98.5%). The raw materials

143

were stoichiometrically weighted and mixed by ball milling for 24 h in ethanol. The dried powders were calcined in closed Al2O3 crucible at 800 °C for 6 h. In order to improve the densification behaviour, 2 wt% boron oxide (B2O3) was added into the calcined powders and then ball milling again in ethanol for 24 h. Then, the dried powder mixed with 4wt% polyvinyl alcohol (PVA) binder and pressed in to disc-shape pellets 10 mm in diameter. The green pellets were sintered at temperature ranging from 1000 °C to 1150 °C for 2 h dwell time with a heating/cooling rate of 5 °C /min in a covered alumina crucible. Phase formation of all samples was identified by X-ray diffractometer (XRD) technique. The bulk density of sintered ceramics was determined by Archimedes’ method with distilled water as the media. For the electrical study, silver pasts were painted on both sides of the samples for electrical contacts. Room temperature dielectric property was determined via a LCZ-meter with frequencies ranging from 20 Hz2000 kHz. Results and discussion X-ray diffraction patterns of the ceramic sintered at various temperatures are shown in Fig. 1. It can be seen that all ceramics possessed a pure pervoskite phase. B2O3 phase or other impurity phases were not observed for all sintering temperatures. This suggests that B2O3 diffused into the BNBT lattice, may be due to their very small ion size. The B3+ ions can act as interstitial ions in ABO3 lattice and formed a completely homogenous solid solution. At lower sintering temperature of 1000°C, a slight spitted peaks at 44 - 46º correspond to the rhombohedral(1ī1)R/(111)Rand tetragonal (002)T/

144

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

(200)T symmetries were observed which confirmed the coexistence of both rhombohedral and tetragonal phases (Takenaka et al., 1991; Chu et al., 2002; Xu et al., 2008). With increasing sintering up to 1150°C, the

coexisting of both rhombohedral and tetragonal phases was maintained but showed a domination of tetragonal over rhombohedral structure.

Figure 1 X-ray diffraction patterns of the ceramics sintered at various temperatures

Figure 2 presents the density and porosity values of the ceramics sintered at different sintering temperatures. The ceramic sintered at 1000 °C had a density value of 5.23 g/cm3. The density value increased with increasing the sintering temperature and reached the maximum value of 5.56 g/cm3 at the sintering temperature of 1050 °C and then slightly decreased at

higher sintering temperature of 1100 - 1150 °C. In addition, the porosity value showed the opposite trend to that of density data. The maximum percentage of porosity value of 3.22% was obtained for the sample sintered at 1000 °C. The porosity value gradually decreased to 0.23 % with increasing the sintering temperature up to 1100 - 1150°C.

Figure 2 Plots of density and porosity values of the ceramics sintered at different sintering temperatures.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Figure 3 illustrates room temperature dielectric constant (εr) as a function of frequency. It can be seen that εr decreased with increasing frequency for all samples. The observed high values of εr at low frequencies may be due to the active presence of all types of polarization (i.e. atomic, ionic, dipolar and space charge polarization), however, with an increase in frequency, some of these contributions lagged behind and did not follow the field variation and became inactive. At high frequencies, all the other modes of polarization fade away and electronic polarization becomes the dominant mode of polarization, therefore, εr decreased at high frequencies (Moulson & Herbert, 1996).

145

Furthermore, the dielectric constants initially increased with increasing sintering temperature and reached the maximum value of 885 (1 kHz) at the sintering temperature of 1150°C. The frequency dependence of the dielectric loss (tan ) at various sintering temperatures is also illustrated in Fig. 4. At high frequencies the samples showed an increase in dielectric loss, especially for the high sintering samples. In addition, the dielectric loss value showed the similar trend to that of dielectric constant value. At a frequency of 1 kHz, the dielectric loss initially increased with increasing sintering temperature and reached the maximum value of 0.04 at the temperature of 1150°C.

Figure 3 Room temperature dielectric constant (r) as a function of frequency for the samples sintered at different sintering temperatures.

Figure 4 Room temperature dielectric loss (tan) as a function of frequency for the samples sintered at different sintering temperatures.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

146

Conclusion In

this work, lead-free B2O3 doped (Bi0.5Na0.5)0.94Ba0.06TiO3 ceramics were successfully synthesized by a simple conventional mixed-oxide and ordinary sintering method. The ceramic samples presented a pure perovskite structure. The optimum density was noted for the sintering temperature of 1050 °C. The dielectric constant increased with an increasing sintering temperature and showed the maximum value of 885 at the sintering temperature of 1150°C. Acknowledgments This work was supported by the National Research University Project under Thailand’s Office of the Higher Education Commission, The National Research Council of Thailand, 50th CMU anniversary Ph.D. Program Chiang Mai University, Department of Physics and Materials Science, Faculty of Science and Graduate School, Chiang Mai University. Science and Technology Research Institute, Chiang Mai University, Thailand is also acknowledged.

Chu, B. J., Chen, D. R., Li, G. R., & Yin, Q. R. (2002). Electrical properties of Na1/2Bi1/2TiO3– BaTiO3 ceramics. Journal of the European Ceramic Society, 22, 2115–2121. Gao, L., Huang, Y., Hu, Y., & Du, H. (2007). Dielectric and ferroelectric properties of (1x)BaTiO3–xBi0.5Na0.5TiO3 ceramics. Ceramics International, 33, 1041–1046. Hussain, A., Rahman, J. U., Zaman, A., Malik, R. A., Kim, J. S., Song, T. K., … Kim, M. H. (2014). Field-induced strain and polarization response in leadfree Bi1/2(Na0.80K0.20)1/2TiO3-SrZrO3 ceramics. Materials Chemistry and Physics, 143, 1282-1288. Jarupoom, P., Pengpat, K., & Rujijanagul, G. (2010). Enhanced piezoelectric properties and lowered sintering temperature of Ba(Zr0.07Ti0.93)O3 by B2O3 addition. Current Applied Physics, 10, 557–560. Kim, B. H., Han, S. J., Kim, J. H., Lee, J. H., Ahn, B. K., & Xu, Q. (2007). Electrical properties of (1-x) (Bi0.5Na0.5)TiO3–xBaTiO3 synthesized by emulsion method. Ceramics International, 33, 447–452.

References Acharya, S. K., Ahn, B. G., Jung, C. U., Koh, J. H., Choi, I. H., & Lee, S. K. (2014). Effect of Rb doping on ferroelectric and piezoelectric properties of Bi0.5Na0.5TiO3–BaTiO3thin films. Journal of Alloys and Compounds, 603, 248–254. Chen, Z., & Hu, J. (2009). Piezoelectric and dielectric properties of (Bi0.5Na0.5)0.94Ba0.06TiO3Ba(Zr0.04Ti0.96)O3 lead-free piezoelectric ceramics. Ceramics International, 35, 111-115.

Liu, B., Yi, L., Li, L., & Chen, X. M. (2015). Densification and microwave dielectric properties of Ca1.15Sm0.85Al0.85 Ti0.15O4 ceramics with B2O3 addition. Journal of Alloys and Compounds, 653, 351-357. Maqbool, A., Hussain, A., Rahman, J. U., Song, T. K., Kim, W.J., Lee, J., & Kim, M. H. (2014). Enhanced electric field-induced strain and ferroelectric behavior of (Bi0.5Na0.5)TiO3–BaTiO3–SrZrO3 leadfree ceramics. Ceramics International, 40, 11905– 11914.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Moulson, A. J., & Herbert, J. M. (1996). Electroceramics. New York: Chapman and Hall Press. Panda, P. K. (2009). Review: Environmental friendlyl-free piezoelectric Materials. Journal of Materials Science, 44, 5049-5062. Qi, J. Q., Chen, W. P., Wang, Y., & Chan, H. L. W. J. (2004). Dielectric properties of barium titanate ceramics doped by B2O3 vapor. Applied Physics, 96, 6937-6939. Rhim, S. M., Hong, S., Bak, H., & Kim, O. K. (2000). Effects of B2O3 addition on the dielectric and ferroelectric properties of Ba0.7Sr0.3TiO3 ceramics. Journal of the American Ceramic Society, 83, 11451148.

147

Smolensky, G. A., Isupov, V. A., Agranovskaya, R. I., & Kainik, N. N. (1961). New ferroelectrics of complex composition. Soviet physics, Solid state, 2, 2651â&#x20AC;&#x201C;2654. Takenaka, T., Maruyama, K., & Sakata, K. (1991). (Bi1/2Na1/2)TiO3-BaTiO3 system for lead-free piezoelectric ceramics. Japanese Journal of Applied Physics, 3, 2236-2239. Xu, C., Lin, D., & Kwok, K. W. (2008). Structure, electrical properties and depolarization temperature of (Bi0.5Na0.5)TiO3-BaTiO3 lead-free piezoelectric ceramics. Solid State Sciences, 10, 934-940.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

148

อิทธิพลของอุณหภูมิทีอ่ บต่อสมบัติทางเทอร์โมอิเล็กทริกของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ แบบบิดงอได้เตรียมโดยวิธีอาร์เอฟแมกนีตรอนสปั ตเตอริง กมลมาศ สิงคเสลิต1*, อาภาภรณ์ สกุลการะเวก1 และราชศักดิ์ ศักดานุภาพ2

Effect of Annealing Temperature on Thermoelectric Properties of Flexible Bi2Te3 Thin Film Prepared by RF Magnetron Sputtering Kamolmad Singkaselit1*, Aparporn Sakulkalavek2 and Rachsak Sakdanuphab3 1

ภาควิชาฟิ สิกส์ คณะวิทยาศาสตร์ สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้ าเจ้ าคุณทหารลาดกระบัง เขตลาดกระบัง กรุงเทพมหานคร 10520 วิทยาลัยนวัตกรรมการจัดการข้ อมูล สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้ าเจ้ าคุณทหารลาดกระบัง เขตลาดกระบัง กรุงเทพมหานคร 10520 1 Department of Physics, Faculty of Science, King Mongkut’s Institute of Technology Ladkrabang, Ladkrabang, Bangkok 10520 2 College of Data Storage Innovation, King Mongkut’s Institute of Technology Ladkrabang, Ladkrabang, Bangkok 10520 * Corresponding author. E-mail address: go_odgracious@hotmail.com บทคัดย่อ งานวิจัยนี้ได้ เตรียมฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ (Bi2Te3) เคลือบลงบนวัตถุรองรับโพลีอิมมิ ด โดยใช้ เทคนิคอาร์เอฟแมกนีตรอน สปัตเตอริง (RF magnetron sputtering) สมบัติเชิงโครงสร้ างและสมบัติทางเทอร์โมอิเล็กทริกของฟิ ล์มถูกนามาศึกษาภายใต้ อุณหภูมิท่ใี ช้ ในการอบ โดยนาฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ท่ ไี ด้ ไปอบที่อุณหภูมิแตกต่ างกันตั้งแต่ อุณหภูมิ 300, 350 และ 400 ºC ภายใต้ ความดัน บรรยากาศของก๊าซไนโตรเจนเป็ นเวลา 1 ชั่วโมง โครงสร้ างผลึกและโครงสร้ างระดับจุลภาคของฟิ ล์มถูกนามาวิเคราะห์ด้วยใช้ เครื่อง ทดสอบการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ (XRD) และกล้ องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดความละเอียดสูง (FESEM) ตามลาดับ ค่า สัมประสิทธิ์ซีเบคและค่าสภาพนาไฟฟ้ าของฟิ ล์มถูกวัดตั้งแต่อุณหภูมิห้องถึง 150 ºC ด้ วยเครื่องวัดค่ าสัมประสิทธิ์ซีเบคและ ค่าสภาพนา ไฟฟ้ า (ZEM3) ผลการศึกษาพบว่าค่าสัมประสิทธิ์ซีเบคและค่าสภาพนาไฟฟ้ าจะเพิ่มขึ้นเมื่ออุณหภูมิการอบเพิ่มขึ้น โดยการอบที่ 400 ºC จะมีค่าเพาเวอร์แฟกเตอร์สงู สุดคือ 1.41 x 10-3 W/m K2 วัดที่อุณหภูมิ 150 ºC 2

คาสาคัญ: บิสมัสเทลลูไรด์ โพลีอมิ มิด เทอร์โมอิเล็กทริก อาร์เอฟแมกนีตรอนสปัตเตอริง Abstract Bismuth telluride (Bi2Te3) thermoelectric thin films were deposited on polyimide substrate by RF magnetron sputtering technique. The structural and thermoelectric properties of the films were investigated under the annealing temperatures. Asdeposited films were annealed in the vacuum chamber with the N2 flow gases at three different temperatures of 300, 350, and 400 °C for 1 hour. The crystal structures and microscopy of the films were characterized by X-ray diffraction (XRD) and Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM), respectively. Seebeck coefficient and electrical conductivity of the films were simultaneously measured at room temperature and up to 150 C by dc four-terminal method (ZEM3). It was found that the Seebeck coefficient and electrical conductivity increased with increasing temperature. The film annealed at 400 C has a maximum PF value of 1.41 x 10-3 W/m.K2 at the applied temperature of 150 C. Keywords: Bismuth telluride, Polyimide, Thermoelectric, RF magnetron sputtering

บทนา ภาวะโลกร้ อนเป็ นปั ญ หาที่ส าคั ญ และจะทวี ค วาม รุนแรงขึ้นเรื่อยๆ สาเหตุหลักมาจากการเผาไหม้ เชื้อเพลิง

ต่างๆ เช่ น นา้ มัน ก๊าซธรรมชาติ ถ่านหิน เป็ นต้ น โดยที่ เชื้ อเพลิ ง เหล่ า นี้ นั บ วั น จะยิ่ ง หายากและมี ร าคาแพง นักวิจัยจึงได้ พยายามหาพลังงานทางเลือกใหม่ท่ชี ่วยลด ปั ญหาภาวะโลกร้ อนและเป็ นมิตรต่ อสิ่งแวดล้ อม วัส ดุ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

เทอร์โมอิเล็กทริก (Thermoelectric material) คือวัสดุท่ี สามารถเปลี่ยนพลังงานความร้ อนเป็ นพลังงานไฟฟ้ าได้ การประกอบวั ส ดุ เทอร์ โ มอิเ ล็ก ทริ ก ให้ เ ป็ นอุป กรณ์ ท่ี สามารถนาไปใช้ เป็ นแหล่ งพลังงานได้ น้ันเรียกว่ าเทอร์ โมอิเล็กทริกโมดูล(Thermoelectric module) โดยการนา สารกึ่งตัวนาชนิดเอ็น (N-type) และชนิดพี (P-type) ชิ้นเล็กๆมาต่ อกันเป็ นคู่ ๆ วางสลับกัน โดยมีแ ผ่ นเซรา มิกประกบทั้งสองด้ าน เมื่อนาเทอร์โมอิเล็กทริกโมดูลมา สัมผัสกับแหล่งความร้ อนและต่อกับโหลดภายนอกจะทา ให้ เกิดการไหลของกระแสไฟฟ้ า ข้ อดีของวัสดุเทอร์โมอิ เล็ก ทริ ก คื อ มี ข นาดเล็ก น้า หนั ก เบา ไม่ มี ส่ ว นที่ เคลื่อนไหวจึงไม่เกิดเสียงดัง ค่าใช้ จ่ายในการบารุงรักษา

149

ต่า และที่สาคัญเป็ นมิตรกับสิ่งแวดล้ อม Terry (2001); Riffat and Xiaoli (2003); Rowe (1999). อย่างไรก็ ตามเทอร์ โ มอิ เ ล็ก ทริ ก โมดู ล ที่ใ ช้ กัน ในปั จ จุ บั น จะไม่ สามารถสัมผัสกับแหล่ งความร้ อนที่มีรูปร่ างโค้ งหรือผิว ขรุขระ (เช่ น ท่อไอเสียรถยนต์ ความร้ อนจากร่ างกาย มนุ ษย์) ได้ เนื่องจากมีลักษณะทางกายภาพที่แข็งจึงไม่ สามารถบิดงอได้ (ดังรูปที่ 1(ก)) ปัญหาดังกล่าว จึงเป็ น ปัญหาหลักที่ทาให้ การประยุกต์ใช้ งานมีขีดจากัด ปั จจุบัน จึงมีแนวคิดที่จะผลิตเทอร์โมอิเล็กทริกโมดูลแบบบิดงอ ได้ (Flexible) ดังรูปที่ 1 (ข) เพื่อสามารถประยุกต์ใช้ กับแหล่งความร้ อนรูปแบบต่างๆได้ อย่างมีประสิทธิภาพ Goncalves et al. (2007)

(ก) (ข) รูปที่ 1 (ก) เทอร์โมอิเล็กทริกโมดูลที่ใช้ ในปัจจุบัน Kumpeerapun (2009) (ข) เทอร์โมอิเล็กทริกโมดูลแบบบิดงอได้ Isaac (2014)

ประสิทธิภาพของวัสดุเทอร์โมอิเล็กทริกถูกกาหนดด้ วย จากสมการที่ (1) จะพบว่าวัสดุเทอร์โมอิเล็กทริกที่ดี ค่า ZT (Thermoelectric figure of merit) แสดงดังสมการ นั้นจะต้ องมีค่ าสัมประสิทธิ์ซีเบคและสภาพนาไฟฟ้ าสูง (1) แต่ สภาพนาความร้ อนต่ า อย่ างไรก็ตามเป็ นที่ทราบกัน โดยทั่วไปว่ าค่าสัมประสิทธิ์ซีเบคจะแปรผกผันกับความ 2 หนาแน่นพาหะ (Carrier concentration) ในขณะที่สภาพ S  ZT = T (1) นาไฟฟ้ าจะแปรผันตรงกับความหนาแน่ นพาหะ ในทาง K ปฎิบัติจึ ง ไม่ ส ามารถทาให้ ค่า สัมประสิ ท ธิ์ซี เ บคและค่ า เมื่อ S คือ ค่าสัมประสิทธิ์ซเี บค (Seebeck สภาพนาไฟฟ้ าสูงขึ้นพร้ อมกันได้ ดังนั้นจึงต้ องหาวัสดุท่มี ี coefficient, V/K) มิติต่า (Low dimensional) เพื่อให้ มีสภาพการนาความ ร้ อน (K) ที่น้อยลง Alexander (2000) จึงจะสามารถ σ คือ สภาพนาไฟฟ้ า (Electrical เพิ่มประสิทธิภาพของวัสดุเทอร์โมอิเล็กทริกได้ conductivity, Ω.m-1) บิส มัส เทลลู ไ รด์ (Bi2Te3) เป็ นสารกึ่ง ตัว น าที่มี K คือ สภาพนาความร้ อน (Thermal ประสิทธิภาพในการเปลี่ยนความร้ อนเป็ นไฟฟ้ าเนื่องจาก conductivity, W/mK) มีค่า ZT สูงที่อุณหภูมิห้อง Julian Goldsmid (2014) T คือ อุณหภูมิ (Temperature, K) ปั จ จุ บั น มี ก ารสั ง เคราะห์ Bi2Te3 อยู่ ห ลายวิ ธี ท้ั ง การ เตรียมแบบก้ อนผลึก (Bulk) และแบบฟิ ล์มบาง (Thin

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

150

film) Xinfeng, Xenjie, Han, Wenyu, and Qingjie (2007) ซึ่งการเตรียมแบบฟิ ล์มบางจะทาให้ ได้ วัสดุมีมิติ ต่า Heremans (2005) จากการศึกษาพบว่าการเตรียม โดยวิ ธี อ าร์ เ อฟแมกนี ต รอนสปั ต เตอริ ง จะเป็ นวิ ธี ท่ี เหมาะสมเนื่องจากสามารถควบคุม โครงสร้ างและความ หนาของ ฟิ ล์มบาง ตลอดจนสามารถเตรียมฟิ ล์มให้ มีพ้ ืนที่ ใหญ่ (Large scale) เพื่อสามารถนาไปประยุกต์ใช้ งานจริง ได้ Yuan et al. (2011) งานวิจัยนี้สนใจเตรียมฟิ ล์มบาง Bi2Te3 โดยวิธอี าร์ เอฟแมกนีตรอนสปัตเตอริงลงบนวัสดุท่สี ามารถโค้ งงอได้ ในที่น้ ีเลือกโพลิอมิ มิด (Polyimide, PI) เนื่องจากเป็ น วัสดุท่ีมีค่าสภาพนาความร้ อนค่ อนข้ างต่ าเท่ากับ 0.12 W/(m.K) ทนต่ ออุณหภูมิได้ สูงและมีค่าการขยายตัว เนื่องจากความร้ อน (Thermal expansion) ที่ใกล้ เคียง กับ Bi2Te3 Summary of Properties for Kapton Polyimide Films. (2012) โดยตัวแปรที่จะศึกษาคือ อุณหภูมิท่ใี ช้ ในการอบ (Annealing temperature) ซึ่งจะ เปลี่ยนแปลงอุณหภูมิในช่วง 300°C - 400°C การอบ จะกระทาภายใต้ บรรยากาศของก๊าซไนโตรเจน จากนั้นจะ ศึกษาอิทธิพลของอุณหภูมิท่ีอบต่อสมบัติเชิงโครงสร้ าง และสมบัตทิ างเทอร์โมอิเล็กทริกของฟิ ล์มบาง Bi2Te3 วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ถูกเคลือบลงบนวัสดุรองรับ ที่เป็ นโพลีอมิ มิด โดยวิธอี าร์เอฟแมกนีตรอนสปั ตเตอริง โ ดยใ ช้ เ ป้ า บิ ส มั ส เ ทล ลู ไ รด์ ( 9 9 . 9 9 % ) ขนาด เส้ นผ่ าศู นย์ กลาง 3 นิ้ ว มีระยะห่ างระหว่ างเป้ าและวั สดุ รองรับ 50 mm. โดยก่อนนาชิ้นงานไปติดตั้ง ได้ นาแผ่นโพ

ลีอิมมิดไปอัลตร้ าโซนิคในแอลกอฮอล์เป็ นเวลา 15 นาที เพื่ อขจัดสิ่งสกปรกและทาความสะอาดผิวหน้ าของชิ้นงาน กาหนดกาลังไฟฟ้ าที่จ่ายให้ เป้ า Bi2Te3คือ 45 วัตต์ มีความ ดันพื้นใน การเคลือบ 2× 10-5 mbar และความดันที่ใช้ ใน การเคลือบฟิ ล์มคือ 5x10-3 mbar โดยใช้ กา๊ ซอาร์กอน เวลา ในการเคลื อบ 30 นาที จากนั้ นจึ งน าไปอบที่ อุ ณหภู มิ แตกต่างกัน (300, 350 และ 400 °C) ภายใต้ ความดัน บรรยากาศของก๊าซไนโตรเจน (6 x 10-3 mbar) เป็ นเวลา 1 ชั่วโมง ฟิ ล์มบางที่ได้ ถูกนาไปวิเคราะห์โครงสร้ างผลึก โดยใช้ เครื่ อ งทดสอบการเลี้ ยวเบนของรั ง สี เ อกซ์ (X-ray diffraction, XRD ยี่ห้อ Bruker รุ่น D8-Discover) ซึ่ง ใช้ รังสีเอกซ์ CuKα ความยาวคลื่น 1.54056 อังสตรอม, กล้ องจุลทรรศน์อเิ ล็กตรอนแบบส่องกราดความละเอียด สูง (Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM รุ่น JSM-7001F) โดยใช้ หั ว วั ด Secondary Electron Detector ถ่ายภาพออกมาในโหมด Secondary Electron Image (SEI) และเชื่อมต่อกับอุปกรณ์วิเคราะห์ ธาตุ เ ชิ ง พลั ง งาน (Energy Dispersive X-Ray Spectrometer, EDS) โดยแสดงผลเป็ นสเปกตรั ม พลังงานของธาตุต่างๆพร้ อมกับระบุ สดั ส่วนปริมาณของ แต่ละส่วนประกอบและ วัดสมบัติทางเทอร์โมอิเล็กทริก ของฟิ ล์มโดยใช้ เครื่องวัดคุณสมบัติทางไฟฟ้ า (Seebeck Coefficient/ Electrical Resistance Measurement System, ZEM-3 ยี่ห้อ ULVAC-RIKO) ผลการศึกษาและอภิปรายผลการศึกษา

(a) (b)

รูปที่ 2 (a) ภาพถ่ายแผ่นโพลิอมิ มิดและ (b) โพลิอมิ มิดที่เคลือบด้ วยฟิ ล์มบิสมัสเทลลูไรด์

จากรูปที่ 2 (a) แสดงภาพถ่ายแผ่นโพลิอมิ มิดก่อน เคลือบฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลู ไรด์ พบว่ ามีลักษณะเป็ นสี

เหลืองทองและเมื่อนามาเคลือบด้ วยฟิ ล์มบิสมัสเทลลูไรด์ พบว่ามีสเี งิน ดังแสดงในรูปที่ 2(b)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ฟิ ล์ มบางบิส มัส เทลลู ไ รด์ ถูกน าไปทาการวิ เ คราะห์ ลักษณะโครงสร้ า งผลึ ก ด้ วยเทคนิ คการเลี้ ยวเบนของ รั ง สีเ อกซ์ (XRD) จากรูป ที่ 3 พบว่ า เมื่อ พิ จ ารณา รูปแบบการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ของฟิ ล์มบางบิสมัส เทลลูไรด์ จะแสดงระนาบของโครงสร้ างผลึกที่พบ คือ (015), (1010) และ (110) ตรงกับมุม 2θ เท่ากับ 27.66 º, 37.83 º และ 41.15 º ตามลาดับ โดยเทียบ กับฐานข้ อมูล JCPDF 15-0863 และนอกจากนี้ยัง 10 300

151

พบว่าจากการคานวณขนาด ของผลึก (grain size) ของ ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ พบว่าขนาดของผลึกของฟิ ล์มที่ ไม่ ผ่ า นการอบและอบที่อุ ณ หภูมิ 300-400 ºC มี ค่ า เพิ่ มขึ้นจาก 5.52 – 28.51 nm แสดงให้ เ ห็น ว่ า โครงสร้ างเป็ นบิสมัสเทลลูไรด์ท่สี มบูรณ์มากขึ้น ดังรูปที่ 3 ซึ่งสอดคล้ องกับงานวิจัยของ Xing, Hngcai, Ning, and Lei (2013) เมื่อทาการอบฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ ที่อณ ุ หภูมิ 150-350 ºC ขนาดของผลึกจะใหญ่ข้ นึ

(b) annealed at 400 C (015)

200

(1010)

100

(110)

Intensity (counts/s)

100 (a) As-deposited 50

100

0 10

2

รูปที่ 3 รูปแบบการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ (a) As-deposited (b) อบที่อุณหภูมิ 400 °c โดยเทียบกับฐานข้ อมูลมาตรฐาน (JCPDF 15-0863)

ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ ถูกนาไปวิเคราะห์ ลักษณะ พื้ นผิว ด้ วยกล้ อ งจุ ล ทรรศน์ อิเ ล็กตรอนแบบส่ องกราด

ความ ละเอียดสูง (FESEM) รุ่น JSM-7001F ด้ วย ก าลั ง ขยายระดั บ 50,000 เท่ า แสดงดั ง รู ป ที่ 4

(a) ๗)

รูปที่ 4 ภาพพื้นผิวของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์จากเครื่อง FESEM อบที่อณ ุ หภูมิต่างๆ (a) As-deposited (b) 300 °c (c) 350 °c (d) 400 °c

(b)

152

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

(c)

(d)

รูปที่ 4 (ต่อ)

โดยรูปที่ 4(a), 4(b), 4(c) และ 4(d) แสดงพื้นผิว ของฟิ ล์มที่ไม่ผ่านการอบ อบที่อุณหภูมิ 300 ºC อบที่ อุณหภูมิ 350 ºC และอบที่อุณหภูมิ 400 ºC ตามลาดับ จากรู ป พบว่ า ฟิ ล์ ม จะแสดงรู ป ร่ า งของเกรนแบบ หก เหลี่ยมที่ชัดเจนเมื่ออบที่อณ ุ หภูมิ 300-350 ºC และเมื่อ

อุณหภูมิของการอบเป็ น 400 ºC ลักษณะของพื้นผิวจะ เรียบมากขึ้น เนื่องจากเมื่ออุณหภูมิการอบเพิ่มขึ้น ผลึก ของฟิ ล์มบางส่วนจะเกิดการหลอมรวมกัน ซึ่งสอดคล้ อง กับงานวิจัยของ Xing et al. (2013)

รูปที่ 5 แสดงสเปกตรัมพลังงานของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์

รูปที่ 5 แสดงการวิเคราะห์ธาตุเชิงพลังงาน (EDS) ของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์โดยอัตราส่วนของ Bi : Te ของฟิ ล์มที่นาไปอบที่อุณหภูมิต่างๆ แสดงดังตารางที่ 1 จากตารางที่ 1 พบว่าฟิ ล์มที่ไม่ผ่านกระบวนการอบจะมี อัตราส่วนของ Bi : Te เป็ น 2.53 : 2.47 ซึ่งอัตราส่วน ดังกล่าวจะแตกต่างจากอัตราส่วนของ Bi : Te ของเป้ า สารเคลือบ (Bi : Te = 2 : 3) ซึ่งเกิดจากอัตราการ เคลือบของอะตอม Bi สูงกว่าอะตอม Te Ar Sputter Yields. (2005) เมื่อนาฟิ ล์มไปอบที่อุณหภูมิ 300 –

400 ºC พบว่าฟิ ล์มจะมีอตั ราส่วนของ Bi : Te ใกล้ เคียง อัตราส่วน 2 : 3 มากขึ้นเพราะจากจุดหลอมเหลวของ Bi ซึ่งเท่ากับ 271.3 ºC Bismuth. (2015) จุดหลอมเหลว Bi2Te3 = 586 ºC Bismuth telluride. (2015) เมื่อ นาไปอบในช่วงอุณหภูมิ 300-400 ºC จะทาให้ อะตอม ของ Bi ระเหยออกไป ทาให้ ได้ อตั ราส่วนของ Bi : Te ใกล้ เคี ย งกั บ 2 : 3 จากผลดั ง กล่ า วชี้ ให้ เห็ น ว่ า กระบวนการอบฟิ ล์มจะช่วยปรับอัตราส่วนของ Bi : Te ให้ ใกล้ เคียงกับ Bi2Te3 มากขึ้น

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

153

ตารางที่ 1 แสดงอัตราส่วนขององค์ประกอบธาตุของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์อบที่อณ ุ หภูมิต่างๆ Annealing Temperature (ºC) Bi/Te atomic ratio As-deposited 2.53/2.47 300 2.35/2.65 350 2.28/2.72 400 2.13/2.87

ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ถูกนาไปวิเคราะห์ สมบัติทาง เทอร์โมอิเล็กทริกโดยใช้ เครื่องวัดค่ าสัมประสิ ทธิ์ซีเบค และ ค่ า สภาพต้ า นทานไฟฟ้ า (ZEM3) ถู ก วั ด ตั้ ง แต่ อุณหภูมหิ ้ องถึง 150 ºC จากรูปที่ 6 พบว่า เมื่ออุณหภูมิ การอบเพิ่มขึ้น การนาไฟฟ้ าจะดีข้ นึ อาจเนื่องจากความ เป็ นผลึกของฟิ ล์มสูงขึ้น ส่งผลให้ การนาไฟฟ้ าดีข้ นึ จาก รูปที่ 7 จะพบว่าฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์อบที่ 400 ºC มี ค่าสภาพนาไฟฟ้ าดีท่สี ดุ เท่ากับ 2.30 x 105 Ωm-1 วัด

ที่อณ ุ หภูมิห้อง ซึ่งสอดคล้ องกับงานวิจัยของ Huang and Wei-ling (2009) เมื่อทาการอบฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลู ไรด์ท่อี ณ ุ หภูมิ 100-300 ºC ภายใต้ ความดันบรรยากาศ ของก๊าซไนโตรเจน เป็ นเวลา 1 ชั่วโมง ฟิ ล์มบางบิสมัส เทลลูไรด์อบที่อุณหภูมิสูงสุด (300 ºC) มีค่าสภาพนา ไฟฟ้ าดีท่สี ดุ เท่ากับ 7.1 Ωm-1 วัดที่อณ ุ หภูมหิ ้ อง

2.4x10

2.2x10

2.0x10

1.8x10

As-deposited o 300 C o 350 C o 400 C

1.4x10

1.2x10

1.0x10

8.0x10

6.0x10

4.0x10

100

120

140

160

Temp ( C)

รูปที่ 6 ค่าสภาพนาไฟฟ้ าของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ อบที่อุณหภูมิต่างๆ -5

-4.5x10

-5

-5.0x10

Seebeck coefficient (V/K)

-1

ohm.m )

1.6x10

-5

-5.5x10

As-deposited o 300 C o 350 C o 400 C

-5

-6.0x10

-5

-6.5x10

-5

-7.0x10

-5

-7.5x10

-5

-8.0x10

-5

-8.5x10

100

120

140

160



Temp ( c) 

temp ( c) รูปที่ 7 ค่าสัมประสิทธ์ซีเบคของฟิ ล์มบางบิ สมัสเทลลูไรด์ อบที่อุณหภูมิต่างๆ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

154 -3

1.4x10

-3

1.3x10 2

Power factor (W/m K )

-3

1.2x10

-3

1.1x10

-3

1.0x10

As-deposited o C o C o 400 C

-4

300

-4

350

9.0x10 8.0x10

-4

7.0x10

-4

6.0x10

-4

5.0x10

-4

4.0x10

-4

3.0x10

-4

2.0x10

-4

1.0x10

100

120

140

160



Temp ( c)

รูปที่ 8 ค่าเพาเวอร์แฟคเตอร์ของฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ อบที่อุณหภูมิต่างๆ

จากรูปที่ 7 แสดงผลการวัดค่าสัมประสิทธิ์ซีเบคของ ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ ทาการวัดตั้งแต่อุณหภูมิห้องถึง 150 ºC พบว่าทุกช่วงอุณหภูมิค่าสัมประสิทธิ์ซีเบคแสดง ค่าเป็ นลบ ซึ่งแสดงพฤติกรรมของสารกึ่งตัวนาชนิดเอ็น โดยมีพาหะอิสระส่วนมากเป็ นอิเล็กตรอน ค่าสัมประสิทธิ์ ซีเบคจะลดลงเมื่ออุณหภูมิสงู ขึ้นเนื่องจากค่าสัมประสิทธิ์ ซีเบคจะแปรผกผันกับปริมาณความหนาแน่นของพาหะ เมื่ออุณหภูมสิ งู ขึ้นปริมาณความหนาแน่นของพาหะที่มาก ขึ้น ทาให้ ค่าสัมประสิทธิ์ซีเบคลดลง ในงานวิจัยนี้พบว่ า ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์อบที่อุณหภูมิ 400 ºC จะมีค่า สัมประสิทธิ์ซีเบคต่าสุด คือ -7.88 x 10-5 V/K รูปที่ 8 แสดงค่าแฟคเตอร์กาลังไฟฟ้ า (PF) ของ ฟิ ล์ มบางบิส มัส เทลลู ไ รด์ อบที่อุณ หภูมิต่ า งๆ โดยค่ า เพาเวอร์แฟคเตอร์น้ ี คานวณได้ จากค่าสัมประสิทธิ์ซีเบค (S) และค่ าสภาพการนาไฟฟ้ า (σ) พบว่ าฟิ ล์มบาง บิสมัสเทลลูไรด์อบที่อุณหภูมิ 400 ºC จะมีค่าเพาเวอร์ แฟกเตอร์ คือ 9.65 x 10-4 W/m K2 ที่อุณหภูมิห้อง และ มีค่าเพาเวอร์แฟกเตอร์สูงสุด คือ 1.41 x 10-3 W/m K2 ที่อุณ หภูมิ 150 ºC ในขณะที่ฟิล์ มอบที่ อุณหภูมิ 300-350 ºC และฟิ ล์มที่ไม่ผ่านการอบ จะมี ค่ าเพาเวอร์แฟกเตอร์ อยู่ ในช่ วงไม่ เ กิน 4 x 10-4 W/mK2 ซึ่งมีค่าใกล้ เคียงกับงานวิจัยของ Huang and Wei-ling (2009) เมื่ออบฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ท่ี อุณหภูมิ 300 ºC มีค่าเพาเวอร์แฟกเตอร์สงู สุดเท่ากับ 4 x 10-4 W/mK2

สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ จากการศึกษาการเคลื อบฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลู ไรด์ โดยวิธอี าร์เอฟแมกนีตรอนสปั ตเตอริงลงบนวัสดุรองรับ โพลี อิ ม มิ ด เพื่ อศึ ก ษาอุ ณ หภู มิ ท่ี อ บต่ อ สมบั ติ เ ชิ ง โครงสร้ า งและสมบัติทางเทอร์ โ มอิเ ล็กทริ ก โดยอบที่ อุณหภูมิ แตกต่างกันตั้งแต่อุณหภูมิ 300 ºC 350 ºC และ 400 ºC ภายใต้ ความดันบรรยากาศของก๊า ซ ไนโตรเจนเป็ นเวลา 1 ชั่วโมง จากการวิเคราะห์สมบัติเชิง โครงสร้ าง พบว่าเมื่อทาการอบฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์ท่ี อุณหภูมิ 400 ºC ฟิ ล์มจะมีโครงสร้ างผลึกที่สมบูรณ์มาก ขึ้น มีข นาดของเกรนที่เพิ่ มขึ้น และจะมีความหนาแน่ น มากกว่ าฟิ ล์มที่ไม่ ผ่านการอบและอบที่อุณหภูมิ 300350 ºC ส่ ง ผลให้ ค่ า สภาพน าไฟฟ้ าสู ง ขึ้ น จากการ วิเคราะห์ธาตุเชิงพลังงาน (EDS) ของฟิ ล์มบางบิสมัส เทลลูไรด์ พบว่ ากระบวนการอบฟิ ล์มจะปรับอัตราส่วน ของ Bi : Te ให้ ใกล้ เคียงกับ Bi2Te3 มากขึ้น โดยค่า สัมประสิทธิ์ซีเบคที่การอบที่ 400 ºC จะมีค่าสัมประสิทธิ์ ซีเบคต่าสุด คือ -7.88 x 10-5 V/K ในขณะที่มีค่า เพาเวอร์แฟคเตอร์สงู สุด คือ 1.41 x 10-3 W/m K2 วัด ที่อุณหภูมิ 150 ºC จากค่าเพาเวอร์แฟคเตอร์จะเห็นได้ ว่ า ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลู ไรด์ท่เี หมาะสมจะนาไปใช้ เป็ น วัสดุเทอร์โมอิเล็กทริก คือ ฟิ ล์มบางบิสมัสเทลลูไรด์อบที่ อุณหภูมิ 400 ºC กิตติกรรมประกาศ งานวิจัยนี้ได้ รับทุนสนับสนุนจากเงินรายได้ ประจาปี 2559 คณะวิ ทยาศาสตร์ สถาบัน เทคโนโลยี พ ระจอม เกล้ าเจ้ าคุณทหารลาดกระบัง

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

เอกสารอ้างอิง Alexander, B. (2000). Thermal Properties of Semiconductor Low-dimensional Structures. Phys. LowDim. Structures, 1/2, 1-43. Ar Sputter Yields. (2005). Retrieved from http://www.npl.co.uk/upload/pdf/arsputtergroups45.pdf

155

Kumpeerapun, T. (2009). Thermoelectric. Retrieved from http://webstaff.kmutt.ac.th/~ivorthip/TE Riffat, S. B., & Xiaoli, M. (2003). Thermoelectric: A review of present and potential applications. Applied thermal Engineering, 23, 913-935.

Rowe, D. M. (1999). Thermoelectrics, an environmentally-friendly source of electrical power. Bismuth. (2015) Retrieved from https://en. Renewable Energy, 16, 1251-1256. wikipedia.org/wiki/Bismuth Summary of Properties for Kapton Polyimide Films. Bismuth telluride. (2015) Retrieved from (2012). Retrieved from http://www.dupont.com /content /dam/dupont/products-and-services/membranes-andhttps://en.wikipedia.org/wiki/Bismuth_telluride films/polyimde-films/documents/DEC-Kapton-summaryGoncalves, L. M., Rocha, J. G., Couto, C., Alpuim, P., of-properties.pdf Gao Min, Rowe, D. M., & Correia, J. H. (2007). Fabrication of flexible thermoelectric microcoolers using Terry, M. (2001). Recent Trends in Thermoelectric planar thin-film technologies. Journal of micromechanics Materials Research II. USA: San Diego. and microengineering, 17, 168-173. Xing, W., Hngcai, H., Ning, W., & Lei, M. Heremans, J. P. (2005). Low-dimensional (2013). Effects of annealing temperature on Thermoelectricity. Acta physica polonica a, 180, thermoelectric properties of Bi2Te3 films prepared by co-sputtering. Journal of applied surface science, 609-632. 276, 539-542. Huang, H., & Wei-ling, L. (2009). Influence of annealing on thermoelectric properties of bismuth Xinfeng, T., Xenjie, X., Han, L., Wenyu, Z., & telluride films grown via radio frequency magnetron Qingjie, Z. (2007). Preparation and thermoelectric transport properties of high-performance p-type sputtering. Thin Solid Films, 517, 3731-3734. Bi2Te3 with layered nanostructure. Journal of Isaac, L. (2014). Retrieved from http://www. applied physics letters, 90, 012102. electronicsnews.com.au/news/researchers-improveYuan, D., Hui-min, L., Yao, W., Zhi-wei, Z., Ming, thin-film-energy-harvester-eff T., & Jiao-lin, C. (2011). Growth and transport Julian Goldsmid, H. (2014). Bismuth Telluride and properties of oriented bismuth telluride films. Journal of Its Alloys as Materials for Thermoelectric Generation. alloys and compounds, 509, 5683-5687. Materials, 7, 2577-2592.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

156

ระบบ Human Machine Interface (HMI) สําหรับคํานวณประสิทธิภาพหม้อไอนํ้า โดยใช้ Visual C# และ OPC Server จิตพร เหล่าอิ่มจันทร์* และวุฒิชัย อัศวินชัยโชติ

Human Machine Interface (HMI) for Boiler Efficiency Calculation using Visual C# and OPC Server Chittaporn Hlaoimchan* and Wudhichai Assawinchaichote

สาขาวิศวกรรมอิเล็กทรอนิกส์และโทรคมนาคม คณะวิศวกรรมศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้ าธนบุรี กรุงเทพฯ 10140 Department of Electronic and Telecommunication Engineering, Faculty of Engineer, KMUTT, Bangkok, 10140 * Corresponding author. E-mail address: tomrewriter@yahoo.com, wudhichai.asa@kmutt.ac.th บทคัดย่อ บทความนี้นําเสนอ การออกแบบระบบ Human Machine Interface (HMI) เพื่อคํานวณหาประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้ โดยใช้ Programmable Logic Control (PLC) ควบคุมเและรับค่าจากเครื่องมือวัด ใช้ Visual C# เขียนโปรแกรมแสดงผล คํานวณ และติดต่อกับ PLC ผ่านทาง OPC Server ค่ าจากเครื่องมือวัดที่รับเข้ ามาที่เวลาเดียวกัน ถูกนํามาคํานวณหาประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้ และแสดงผล แบบ Online ให้ ผ้ ูปฎิบัติงานทราบทันที ทําให้ ทราบสภาพปั จจุ บันของหม้ อไอนํา้ ง่ ายต่ อการวางแผนในการซ่ อมบํารุง เพื่อให้ หม้ อไอนํา้ ทํางานได้ อย่างมีประสิทธิภาพ ส่งผลให้ ประหยัดค่าใช้ จ่ายในด้ านเชื้อเพลิง การทดลองรับส่งค่ าระหว่าง HMI กับ PLC ผ่านทาง Port Ethernet ที่ Computer จะติดตั้งโปรแกรม OPC Server เพื่อสร้ าง Tag ติดต่ อกับ Address ของ PLC ใช้ Visual C# ที่ติดตั้ง Component COPC.DLL เขียนโปรแกรมรับส่งค่ าจาก OPC Server นําค่ า Digital/Analog input มาแสดงผลที่หน้ าจอ และทดลองส่งค่าจาก HMI ออกไปที่ Digital/Analog output ของ PLC ส่วนการทดลองเพื่อ คํานวณประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้ ค่า Input จะถูกป้ อนเข้ าไปที่ OPC Server เพื่อส่งค่ าให้ กับ HMI โดยมี Input บางส่วนที่ต้องกําหนด เองตามประเภทของหม้ อไอนํา้ จากนั้นจะนํามาคํานวณหาประสิทธิภาพ และแสดงผลที่หน้ าจอ HMI เมื่อค่ า Input เปลี่ยนแปลง ค่ า ประสิทธิภาพที่คาํ นวณได้ จะเปลี่ยนแปลงไปด้ วย ผลการทดลองพบว่า การเขียน HMI โดยใช้ Visual C# สามารถรับค่ า Input เข้ ามาคํานวณได้ โดยไม่ ต้องไปแก้ ไขในโปรแกรม PLC ทําให้ ไม่เปลืองหน่วยความจําของ PLC ค่า Input ที่นาํ มาคํานวณ เป็ นค่าที่เวลาเดียวกัน ช่ วยลดความผิดพลาดจากการให้ ผ้ ูปฎิบัติงานเดิน จดค่าจากเครื่องมือวัดซึ่งทําให้ เวลาไม่ ตรงกัน จากเดิมที่คาํ นวณประสิทธิภาพนานๆ ครั้ง งานวิจัยนี้ทาํ ให้ ทราบค่ าประสิทธิภาพได้ อย่ าง รวดเร็ว และลดความผิดพลาดจากการคํานวณโดยผู้ปฎิบตั ิงาน HMI ที่เขียนด้ วย Visual C# สามารถนําข้ อมูลไปใช้ ในรูปแบบอื่นๆ ได้ อีก เช่น เก็บค่าใว้ ใน Database เพื่อดูข้อมูลย้ อนหลัง หรือให้ แสดงผลผ่านทาง Website คําสําคัญ: หม้ อไอนํา้ ประสิทธิภาพ เครื่องมือวัด Abstract This article presents a design of Human Machine Interface (HMI) for computing the boiler efficiency using PLC such that it can control and obtain the measured values from the measurement tools. The program, display and calculation are based on Visual C# while contacting with PLC was made through OPC Server so that several PLC could be simutaneously contacted. All measured values obtaining from the measurement tools at the same time were calculated to identify the boiler efficiency. The results were displayed online to inform operators. As a result, this could show the current condition of the boiler so it was easy for maintenance which could maximize the boiler efficiency and reduce fuel cost. To conduct a transmission test between HMI and PLC via port Ethernet, OPC Server is installed in a computer to create Tag connected to PLC Address. Visual C# installed in Component COPC.DLL writes a program that transmits the values from OPC Server and displays Digital/Analog input on screen. HMI is transmitted through PLC Digital/Analog output. To conduct a test of

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

157

the boiler efficiency calculation, the input value is transmitted through OPC Server to transfer the values to HMI. Some input is identified according to types of boilers. After that the boiler efficiency is calculated and displayed on HMI screen. When Input values change, efficiency values change accordingly. The results show that using Visual C# to write HMI can receive Input value calculation without making any changes in PLC program. As a result, this can save PLC memory. Input values retrieved at the same time which is used for calculation can reduce errors caused by an operator who records values from measuring instrument. This study enables quick efficiency values and reduces calculating errors caused by an operator. HMI written by Visual C# can apply data in different formats. For instance, the values can be recorded in Database to enable retrieving previous information or to display the results via Website. Keywords: HMI, Boiler, Visual C#, PLC

บทนํา

นอกจากนั้น การนํา HMI ไปต่อกับ PLC โดยตรง หรือติดต่อผ่านทาง Serial port ยังทําได้ ยาก เนื่องจาก ปั จจุบัน PLC มีการเชื่อมโยงเป็ นระบบ Network ผ่าน ทาง Port Ethernet จึงจําเป็ นต้ องเขียนโปรแกรมให้ สามารถเชื่อมโยงกับ PLC ได้ หลายตัวผ่ านทาง OPC Server โดยนําสัญญาณจาก PLC เข้ ามาเก็บใว้ ท่ี OPC Server แล้ วแจกจ่ายให้ กบั Computer ในอดีต Li and Sun (2011) ได้ นาํ OPC Server มาใช้ สามารถติดต่อ กับ PLC โดยไม่ทาํ ให้ สญ ั ญาณขาดๆหายๆ จากงานวิจัยในอดีต สามารถนําระบบ HMI มาแสดง สถานะเครื่องจักร และค่าจากเครื่องมือวัด โดยติดต่อกับ PLC ผ่านทาง Port Ethernet งานวิจัยนี้จะเปลี่ยนจาก โปรแกรม WinCC มาใช้ Visual C# ในการเขียน HMI เพื่ อให้ สามารถคํานวณได้ หลากหลายมากขึ้น โดยที่ไม่ ต้ องเข้ าไปแก้ ไขโปรแกรมใน PLC และ OPC Server ยัง สามารถนํามาใช้ เป็ นตัวกลางในการรับส่งข้ อมูลระหว่ าง PLC และ HMI เพื่อให้ สามารถติดต่อกับ PLC ได้ หลาย ยี่ห้อ และ Simulate ค่า Input ส่งไปให้ HMI คํานวณ บทความนี้มีวัตถุ ประสงค์ เพื่ อเขียนโปรแกม HMI โดยใช้ Visual C# ติดต่อกับ PLC ส่งสัญญาณไปควบคุม การทํา งานของเครื่ อ งจั ก ร และรั บ สัญ ญาณจาก PLC นํามาแสดงผลที่หน้ าจอ นําค่ า Input จาก PLC มา คํานวณหาประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้ และแสดงผลให้ ทราบแบบ Online

ปั จ จุ บัน ประเทศไทยมีก ารใช้ ห ม้ อ ไอนํ้า ในโรงงาน อุตสาหกรรมกันอย่างแพร่หลาย ปั ญหาหม้ อไอนํา้ ระเบิด ได้ ส ร้ างความเสี ย หายต่ อ ชี วิ ต ของผู้ ป ฎิ บั ติ ง าน และ ทรัพย์สินของโรงงานเป็ นจํานวนมาก ตามกฎกระทรวง ของกรมโรงงานอุตสาหกรรม (2549) ได้ มีการกําหนด มาตรการความปลอดภัยเกี่ยวกับหม้ อไอนํ้า ให้ ทาํ การ ตรวจสอบ และทดสอบเพื่อให้ หม้ อไอนํา้ อยู่ในสภาพ พร้ อมใช้ งาน ถ้ าชํารุดหรือใช้ งานไม่ ได้ ก็ให้ ดาํ เนินการ ซ่ อ มบํา รุ ง หรื อ ยกเลิ ก การใช้ ง านก่ อ นที่จ ะเกิ ด ความ เสียหาย การคํา นวณหาประสิทธิภ าพจึง มีค วามสํา คัญ เพื่ อ ให้ ทราบสถานะปั จ จุ บั น ของเครื่ อ งจั ก ร แต่ ก าร คํานวณโดยให้ ผ้ ูปฎิบัติงานเดินจดค่าเครื่องมือวัดแต่ละ ตัว แล้ วนํามาคํานวณ จะทําให้ ค่าที่จดไม่ ใช่ ค่า ณ เวลา เดียวกัน ส่งผลให้ การคํานวณคลาดเคลื่อนไปด้ วย Human Machine Interface (HMI) คือระบบที่ใช้ แสดงผล บอกสถานะ การทํางานของเครื่องจักร ผ่านทาง หน้ าจอ Computer หรือ Touchscreen โดยมี Programmable Logic Control (PLC) ควบคุมการทํางานของเครื่องจักร แล้ วส่งค่าสัญญาณต่างๆมาแสดงผลที่ HMI ในอดีตได้ มี การนําระบบ HMI มาใช้ โดย Erwin, Francis, and Ofosu (2014) ทําให้ เครื่องจักรสามารถทํางานได้ แบบ อัต โนมัติ ผู้ ป ฎิบัติง านสามารถควบคุ ม อยู่ ภ ายในห้ อ ง โดยไม่ต้องเข้ าไปไกล้ เครื่องจักร ช่วยลดความเสี่ยงและ วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ อันตรายจากเครื่องจักร แต่ Software HMI ซึ่งเป็ น Software เฉพาะทาง ยังมีข้อจํากัดหลายๆอย่าง การนํา การเขียนโปรแกรม HMI ติดต่อกับ PLC มีรูปแบบ ค่า Input เข้ ามาคํานวณ ต้ องเข้ าไปแก้ โปรแกรมใน PLC ดังรูปที่ 1 โดย Computer จะติดต่อ PLC ผ่านทาง Port หรือ HMI ด้ วย

158

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

Ethernet ใช้ โปรโตคอล TCP/IP ที่ Computer จะติดตั้ง HMI โดยใช้ Visual C# ที่ติด ตั้ง Component โปรแกรม OPC Server ชื่อว่า KEPServerEx เพื่อรับ COPC.DLL เพื่อรับค่าจาก OPC Server มาคํานวณ และ สัญญาณจาก PLC มาเก็บอยู่ในรูปของ Tag จากนั้นเขียน แสดงผล

รูปที่ 1 รูปแบบการเขียนโปรแกรม HMI ติดต่อกับ PLC ผ่านทาง OPC Server

Hardware PLC ที่นาํ มาใช้ เป็ นของบริษัท Siemens เป็ น 192.168.0.1 รุ่น S7-300 ประกอบด้ วย CPU 317-2 PN/DN 192.168.0.10 ติดต่อ Computer โดยใช้ Port Ethernet, Set IP Address

Computer

Set

เป็ น

รูปที่ 2 Computer OPC Server ต่อกับ PLC ทาง Port Ethernet

Input และ Output จะแบ่งเป็ น 1. Analog รับส่งค่า การวัดต่างๆ สัญญาณจะอยู่ในรูปกระแสหรือแรงดัน เช่น 4-20 mA, 0-10 VDC เป็ นต้ น 2. Digital มี 2 สถานะ คือ On/Off ใช้ สาํ หรับเปิ ดปิ ด Valve, Start/Stop Motor หรือรับ Feedback เพื่อแสดงสถานะเครื่องจักร การวิจัยนี้ จะใช้ Digital Input 16 ช่อง, Digital Output 16 ช่อง, Analog Input 8 ช่อง, Analog Output 4 ช่อง การส่ง

และรับค่าระหว่าง HMI และ PLC สามารถรับส่งค่าจาก PLC ได้ โดยตรงโดยที่ไม่ต้องเขียนโปรแกรมใน PLC ยกเว้ นการส่ งค่ าไปที่ Analog output จะต้ องเขีย น โปรแกรมใน PLC เพื่อปรับ Scale และส่งออกทาง Output เป็ นค่ากระแส 4-20 mA

รูปที่ 3 สัญญาณที่รับเข้ ามาทาง Input PLC และสัญญาณที่ส่งออกทาง Output PLC

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูป ที่ 4 เป็ นการเขีย นโปรแกรมเพื่ อ ส่ ง ค่ า ออกทาง Analog output ต้ องทําการแปลงค่าจาก Double integer เป็ น Floating-point จากนั้นจะนําค่ าไปเข้ า Function

159

block FC106 (UNSCALE CONVERT) เพื่อปรับ scale แล้ วส่งออกทาง Analog output เป็ นค่ากระแส 420 mA

รูปที่ 4 การส่งค่าจาก HMI ไปที่ PLC เพื่อส่ง Output ออกเป็ นกระแส 4-20 mA

รูปที่ 5 โปรแกรมใน PLC รับค่าจาก HMI ส่งออกทาง Analog Output ของ PLC

โปรแกรมที่ใช้ เป็ น OPC Server คือ KEPServerEX มีการสร้ างใว้ 2 Channel คือ Channel ที่ 1 ใช้ สาํ หรับ ทดสอบการติดต่ อระหว่ าง HMI และ PLC ภายใน Channel จะมี Tag ที่ Link ไปที่ Address PLC, Channel

ที่ 2 ใช้ ทดสอบการคํานวณ โดยสามารถกําหนดค่า Input เพื่อที่จะส่งให้ HMI ข้ อดีของ OPC Server คือสามารถ ติดต่อกับ PLC ได้ หลายรุ่นหลายยี่ห้อ และยังสามารถ แจกจ่ายค่าสัญญาณให้ กบั Computer ได้ หลายเครื่อง

รูปที่ 6 KEPServerEx แบ่งเป็ น 2 Channel เพื่อติดต่อกับ PLC และรับค่าเข้ ามาคํานวณ

จากข้ อมูลของ EDA International Ltd. (n.d.) ระบุ น้ อ ย ทํา ให้ ไ ม่ เ ปลื อ งทรั พ ยากรระบบ กํา หนดจํา นวน ว่า COPC.DLL เป็ น Component ติดตั้งเพื่อให้ Visual Input/Output ได้ ตามการใช้ งานจริง ซึ่ง Software ที่ใช้ C# สามารถติดต่อกับ OPC Server ใช้ หน่ วยความจํา เขียน HMI โดยทั่วไปจะจํากัดจํานวน Input/Output

160

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

การเขียนโปรแกรม Visual C# รับส่งค่าสัญญาณจาก PLC เริ่มแรกต้ องประกาศใช้ cpcUnlimited, เรียกใช้ Class, กําหนดจํานวน Tag using cpcUnlimited; copc1 = new copcClass(); copc1.datChange += new_copc Class_dat Change Event Handler(copc1_datChange); copc1.tagAmount = 200; จากนั้นกําหนด OPC ที่ต้องการเชื่อมต่อ กําหนด Channel กําหนด TAG ดังตัวอย่างเป็ นการติดต่อกับ

โปรแกรม KEPServer.KEPServerEx.V4, Channel ชื่อ Siemens. S7-300, TAG ชื่อ NALOG_INPUT มาเก็บ ใว้ ใน copcl.tgVal (1) copc1.svrName= "KEPware.KEPServerEx.V4"; copc1.setItm(1, "Siemens.S7-300.DIGITAL_ INPUT.ZI00"); การรับสัญญาณ Analog input และDigital input จาก PLC จะกําหนดเหมือนกัน คือทําการแปลงให้ อยู่ในรูป String แล้ วนํามาแสดงใน label เป็ นแบบข้ อความ label1.Text = copc1.tgVal(1).ToString();

รูปที่ 7 การเขียนโปรแกรมรับค่าจาก Analog input และ Digital input ของ PLC ไปที่หน้ าจอ HMI

การส่งสัญญาณไปออกที่ Analog output ทําได้ โดยรับ copc1.opcWrt(ตําแหน่งที่ต้องการ) ซึ่งต้ องมีการกําหนด ข้ อมู ล จาก Textbox จากนั้ นจะส่ ง ออกไปที่ ใว้ ก่อนว่าเชื่อมโยงกับ Tag ใน OPC Server ตัวไหน copc1.opcWrt(50, int.Parse(textBox24.Text));

รูปที่ 8 การเขียนโปรแกรมส่งค่าจากหน้ าจอ HMI ไปออกที่ Analog output ของ PLC

การส่งสัญญาณ Digital output คือการ Write ค่า 1 หรือ 0 ไปที่ตาํ แหน่งที่ต้องการ

copc1.opcWrt(30, 0); copc1.opcWrt(30, 1);

รูปที่ 9 การเขียนโปรแกรมส่งค่าจาก HMI ไปที่ Digital output ของ PLC

การเขีย นหน้ า จอแสดงผลติด ต่ อ กับ PLC หน้ า จอแสดงผลจะแสดงค่า Input/Output PLC เพื่อทดสอบ การติดต่อสื่อสารกับ PLC แบ่งเป็ น 1. Digital Input ทดสอบโดยจ่ายไฟ 24VDC เข้ าที่ Digital Input PLC ที่

หน้ าจอ HMI จะเปลี่ยนจาก False เป็ น True 2. Digital Output เมื่อกดปุ่ ม On ที่หน้ าจอ HMI ไฟที่ Digital Output PLC จะติด วัดไฟได้ 24 VDC, กด Off ไฟที่ Digital Output PLC จะดับ วัดไฟได้ 0 VDC 3. Analog

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

161

Input จ่ ายกระแสตั้งแต่ 4-20 mA เข้ าไปที่ Analog Analog Output ใส่ค่าที่หน้ าจอ HMI ตั้งแต่ 0-100 วัด Input PLC ที่หน้ าจอ HMI จะแสดงค่าตั้งแต่ 0-100 4. กระแสที่ Analog Output PLC จะได้ ค่าตั้งแต่ 4-20 mA

รูปที่ 10 การทดสอบรับส่งค่าระหว่าง HMI และ PLC

รูปที่ 11 หน้ าจอทดสอบการรับส่งค่าระหว่าง PLC และ HMI

การเขียนหน้ าจอคํานวณประสิทธิภาพหม้ อไอนํา้ ค่า Input ที่รับเข้ ามามีดังนี้ อุณหภูมิและอัตราการไหลของ Feed water, ความดัน Steam pressure, ความนําไฟฟ้ า

Blowdown EC, ความนําไฟฟ้ า Feed water EC, ปริมาณเชื้อเพลิง ค่าที่ต้องกําหนดเองตามประเภทของ หม้ อไอนํา้ คือ ประเภทของ Burner, Fuel oil No.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

162

รูปที่ 12 การรับค่า Input เข้ ามาคํานวณ จาก KEP Server Ex และค่าที่ต้องกําหนดเอง

หาค่ า Enthalpy โดยนําค่า Steam pressure มา ของ Klein and Alvarado (1995) แล้ วนําค่าต่างๆมา เปลี่ยนเป็ น Absolute pressure นําไปหาค่า Saturated คํานวณหาประสิทธิภาพ โดยใช้ สตู รของส่วนเทคโนโลยี liquid h f และ Saturated vapor h g จาก Steam table นํา้ อุตสาหกรรม (2549)

รูปที่ 13 หน้ าจอแสดงการคํานวณประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้

ผลการศึกษา

หน้ าจอจะแสดงผลเป็ น 0-100 เมื่อปรับกระแส Input เพิ่มขึ้นตั้งแต่ 4 mA ไปจนถึง 20 mA หน้ าจอ HMI จะ ทดสอบการติดต่อระหว่าง HMI และ PLC โดยการ แสดงค่ า ตั้ง แต่ 0-100 เมื่อ นําไปบวก,ลบ,คูณ ,หาร จ่ายกระแส 4-20 mA เข้ าที่ PLC Address PIW102 ผลลัพธิ์ท่ไี ด้ แสดงใว้ ในดังตารางที่ 1

รูปที่ 14 หน้ าจอแสดงการนําค่า Analog input มาคํานวณ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2) ตารางที่ 1 ค่า Analog input ที่ได้ จากการคํานวณ กระแส (mA) HMI PIW102 PIW102 +100 4 0 100 8 25 125 12 50 150 16 75 175 20 100 200

ทดสอบการคํ า นวณประสิ ท ธิ ภ าพ โดยใช้ OPC Server Simulate กําหนดค่า Input ดังนี้ Feed water Temperature 60 °C, Steam pressure 5 kg/cm2, ความ นําไฟฟ้ าของนํา้ Blowdown 11,860 µS/cm, ความนํา

PIW102 -100 -100 -75 -50 -25 0

163

PIW102 *100 0 2500 5000 7500 10000

PIW102 /100 0 0.25 0.5 0.75 1

ไฟฟ้ าของ Feed water 2,150 µS/cm, อัตราการไหล Feed water 137 m3/h และปริมาณเชื้อเพลิง 9,390 lit ส่งเข้ ามาที่ HMI ได้ ค่าประสิทธิภาพ เท่ากับ 75% ซึ่ง เท่ากับการคํานวณโดยใช้ สตู ร

รูปที่ 15 การ Simulate จาก OPC Server

รูปที่ 16 หน้ าจอแสดงประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้

ทดลองเปลี่ยนค่าอุณหภูมิ Feed water โดยที่ค่าอื่นๆ Input เปลี่ยนแปลง โดยเมื่ออุณหภูมิลดลงประสิทธิภาพ ยังคงที่ ค่าประสิทธิภาพที่คาํ นวณได้ จะเปลี่ยนแปลงเมื่อ จะสูงขึ้น และเมื่ออุณหภูมเิ พิ่มขึ้นประสิทธิภาพจะลดลง ตารางที่ 2 แสดงค่าอุณหภมิ Feed water, Enthalpy และประสิทธิภาพ FW Temp Enthalpy (°C) FW Hf (kJ/kg) 40 167.53 50 209.34 60 251.18 70 293.07 80 335.02

Efficiency % 78.15 76.67 75.19 73.70 72.22

164

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูปที่ 17 ความสัมพันธ์ระหว่าง Feed water Temp. ที่มีต่อประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้

ทดลองเปลี่ยนค่า Feed water EC โดยที่ค่าอื่นๆยังคงที่ ค่าประสิทธิภาพจะตํ่าลงเมื่อค่า Feed water EC มากขึ้น

รูปที่ 18 ความสัมพันธ์ระหว่าง Feed water EC ที่มีต่อประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้

ทดลองเปลี่ยนค่า Blowdown EC โดยที่ค่าอื่นๆยังคงที่ ค่าประสิทธิภาพจะสูงขึ้นเมื่อค่า Blowdown EC เพิ่มขึ้น

รูปที่ 19 ความสัมพันธ์ระหว่าง Blowdown EC ที่มีต่อประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้

ทดลองเปลี่ยนค่าปริมาณการใช้ เชื้อเพลิง โดยที่ค่าอื่นๆยังคงที่ ค่าประสิทธิภาพจะตํ่าลงเมื่อปริมาณการใช้ เชื้อเพลิงสูงขึ้น

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

165

รูปที่ 20 ความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณเชื้อเพลิง ที่มีต่อประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้

ทดลองเปลี่ยนค่าอัตราการไหลของ Feed water โดยที่ค่าอื่นๆยังคงที่ ค่าประสิทธิภาพจะสูงขึ้นเมื่ออัตราการไหลเพิ่มขึ้น

รูปที่ 21 ความสัมพันธ์ระหว่างอัตราการไหลของ Feed water ที่มีต่อประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้

การนํา HMI ไปใช้ กบั PLC รุ่นอื่น ทําได้ โดยเปลี่ยน ค่า Config ใน OPC Server ให้ ตรงกับ PLC รุ่นนั้นๆ ซึ่ง จากผลการทดสอบพบว่ า HMI สามารถติดต่อกับ ไม่ ต้อ งเข้ า ไปแก้ ไขที่ HMI การติด ต่ อ ผ่ า นทาง Port Digital input, Digital output, Analog input ได้ โดยตรง Ethenet สามารถติดต่อผ่าน Protocal ได้ หลายแบบ เช่น ไม่ต้องเขียนโปรแกรมใน PLC เพิ่มเติม ยกเว้ น Analog TCP/IP, Modbus, Device Net เป็ นต้ น output ต้ องเขียน Function block เพื่อรับค่า แล้ วปรับ สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ Scale ส่ง Output ออกเป็ น 4-20 mA ค่า Analog input หรือค่าการวัดที่รับเข้ ามาสามารถนํามาคํานวณได้ ทดสอบการคํานวณประสิทธิภาพ โดยป้ อนค่าการวัด การนํา HMI มาคํานวณประสิทธิภาพของหม้ อไอนํา้ ที่ OPC Server สามารถทดสอบรับส่งค่าจาก PLC และ แสดงผลแบบ Online ทําให้ ทราบค่าประสิทธิภาพได้ Simulate ค่าการวัดได้ พร้ อมกัน และยังสามารถทดลอง อย่ างรวดเร็ว ค่ า Input ที่นํามาคํานวณเป็ นค่ าที่เวลา เปลี่ ยนค่ า Input ทําให้ ท ราบว่ าค่ า Input มีผ ลต่ อ เดียวกัน ช่วยลดความผิดพลาดจากการให้ ผ้ ูปฎิบัติงาน ประสิทธิภาพของหม้ อไอนํ้า อย่ างไร ตัวอย่ า งเช่ น เมื่อ เดินจดค่าจากเครื่องมือวัดซึ่งทําให้ เวลาไม่ตรงกัน และ อุณหภูมิ Feed water ลดลง โดยที่ค่า Input อื่นๆคงที่ ลดความผิ ด พลาดจากการคํา นวณด้ ว ยมือ จากเดิ ม ที่ ประสิทธิภาพจะเพิ่มขึ้น เมื่อค่า Feed water EC มากขึ้น คํานวณประสิทธิภาพวันละครั้ง หรือนานๆครั้ง งานวิจัยนี้ ประสิทธิภาพจะตํ่าลง เมื่อค่า Blowdown EC เพิ่มขึ้น ทํา ให้ ทราบค่ า ประสิ ท ธิ ภ าพได้ ตลอดเวลา สามารถ ประสิทธิภาพจะสูงขึ้น เมื่อปริมาณการใช้ เชื้อเพลิงสูงขึ้น วางแผนซ่อมบํารุงเมื่อประสิทธิภาพเริ่มตํ่าลง ซึ่งจะช่ วย ประสิ ท ธิ ภ าพจะตํ่ า ลง เมื่ ออั ต ราการไหลเพิ่ มขึ้ น ประหยัดค่าใช้ จ่ายทางด้ านเชื้อเพลิง HMI ที่เขียนด้ วย ประสิทธิภาพจะสูงขึ้น Visual C# สามารถนําข้ อมูลไปใช้ ในรูปแบบอื่นๆได้ อกี อภิปรายผลการศึกษา

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

166

เช่น เก็บค่าไว้ ใน Database เพื่อดูข้อมูลย้ อนหลัง หรือให้ แสดงผลผ่านทาง Website กิตติกรรมประกาศ

EDA International Ltd. (n.d.). COPC32: SCADA with Trend View created by Visual Studio Express 2015. Retrieved from http://www.eda. co.th/COPC.htm

บทความนี้สาํ เร็จได้ ขอบคุณกําลังใจจากคุณพ่ อคุณ Klein, S. A., & Alvarado, F. L. (1995). Property แม่ และครอบครัว อีกทั้ง รศ.ดร.วุฒิชัย อัศวินชัยโชติ table and charts (SI units). The International Association for the Properties of Water and Steam อาจารย์ท่ปี รึกษา ที่คอยชี้แนะให้ คาํ แนะนํา (IAPWS). Retrieved from http://www.kostic.niu. edu/350/_350-posted/350Chengel7th/Appendix1 เอกสารอ้างอิง Udated.pdf กรมโรงงานอุตสาหกรรม. (2549). กฎกระทรวง เรือ่ ง กําหนดมาตรการความปลอดภัยเกีย่ วกับหม้อนํา้ หม้อ ต้มทีใ่ ช้ของเหลวเป็ นสือ่ นําความร้อน และภาชนะรับ แรงดันในโรงงาน พ.ศ. 2549 (ค.ศ. 2006). ลงวันที่ 21 มิถุนายน 2549, หน้ าที่ 28-33, เล่มที่ 123 ตอนที่ 65 ก. [1]

Li, D., & Sun, R. (2011). Implement of Communication between Configuration Software and OPC Server Based on Modbus/TCP. In The Tenth International Conference on Electronic Measurement & Instruments, ICEMI’2011 (pp. 218-221). Chengdu, China: IEEE.

ส่ ว นเทคโนโลยี นํ้า อุต สาหกรรม. (2549). การหา Translated Thai Reference ประสิทธิภาพของหม้อไอนํา้ (Calculation of Boiler Efficiency) สํานักเทคโนโลยีนํา้ และการจัดการมลพิ ษ โรงงาน. สืบค้ นจาก http://www.gmeinspector.com/ Department of Industrial Works. (2006). Ministerial private_folder/Bolier/CalculationofBoilerEfficiency.pp regulation regarding the security measure on the Boiler using liquid as a heat conductor and pressure t [2] container in the plant B.E. 2549 (2006) dated June Erwin, N., Francis, H., & Ofosu, R. A. (2014). 21, 2006, on the pages of 28-33, book No. 123 Developing a Human Machine Interface (HMI) for section 65 a. [in Thai] [1] Industrial Automated Systems using Siemens Simatic WinCC Flexible Advanced Software. Journal of Industrial Water Technology Department. (2006). Emerging Treads in Computing and Information Calculation of Boiler Efficiency, Bureau of Industrial Water Technology and Pollution Management. Sciences, 5(2), 134-144. Retrieved from http://www.gmeinspector.com/ private_ folder/Bolier/CalculationofBoilerEfficiency. ppt [in Thai] [2]

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

167

การประเมินผลกระทบของแรงดันตกชัว่ ขณะโดยใช้หลักการระบุตาแหน่ง ความผิดพร่องในระบบจาหน่ายด้วยเส้นโค้ง ITIC ฤทธิพัฒน์ โพธิ์ศรี* และสมพร สิริสาราญนุกุล

Evaluation of Voltage Sag Impact by Method of Fault Position in Distribution System with ITIC curve Rittipad Posree* and Somporn Sirisumrannukul ภาควิชาวิศวกรรมไฟฟ้ าและคอมพิวเตอร์ คณะวิศวกรรมศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้ าพระนครเหนือ แขวงวงศ์สว่าง เขตบางซื่อ กรุงเทพมหานคร 10800 Electrical Engineering Faculty of Engineering King Mongkut’s University of Technology North Bangkok Bangkok 10800 * Corresponding author. E-mail address: texnaja@gmail.com บทคัดย่อ แรงดั น ตกชั่ ว ขณะ คื อ ปั ญ หาคุ ณ ภาพอย่ า งหนึ่ ง ส าหรั บ ระบบจ าหน่ า ยไฟฟ้ าแบบเหนื อ ดิ น ซึ่ ง มี โ อกาสเกิ ด ความผิ ด พร่ อ ง หรื อ การลัดวงจร ผลกระทบของแรงดั นตกชั่ ว ขณะเนื่อ งจากความผิด พร่ อ งหรื อ การลัด วงจรขึ้ นอยู่ กับ ขนาดกระแสและระยะเวลา ในการกาจัดความผิดพร่ องของอุปกรณ์ป้องกัน ปั จจัย ทั้งสองดังกล่ าวทาให้ ทราบถึงระดับความลึกและระยะเวลาของการเกิดแรงดั น ตกชั่วขณะ ด้ วยการอ้ างอิงกับกราฟ ITIC เราจะทราบว่าอุปกรณ์ท่มี ีความไวที่เชื่อมต่ ออยู่ ณ บัสที่สนใจ สามารถทางานได้ อย่ างเหมาะสม หรือ ไม่ บทความนี้นาเสนอวิธีก ารระบุ ตาแหน่ งของความผิดพร่ อ งเพื่ อให้ ได้ ข นาดและจ านวนครั้งของการเกิด เหตุ การณ์แรงดั นตก ซึ่งอ้ างอิงกับข้ อมูลที่ทราบค่าแน่ นอนและข้ อมูลเชิงสุ่มของระบบ วิธีท่พี ัฒนาขึ้นได้ ทาการทดสอบกับระบบจาหน่ าย Roy Billinton Test System (RTBS) ผลการจาลองเหตุการณ์ท่ไี ด้ รับเป็ นประโยชน์อย่ างมากและเป็ นแนวทางสาหรับผู้ใช้ ไฟฟ้ าในการตัดสินใจหาจุ ดสมดุล ระหว่างต้ นทุนในการป้ องกันเหตุการณ์แรงดันตกชั่วขณะและผลกระทบทางเศรษฐกิจเนื่องจากแรงดันตกชั่วขณะ คาสาคัญ: แรงดันตกชั่วขณะ การระบุตาแหน่งความผิดพร่อง เส้นโค้ ง ITIC Abstract Voltage sag is one of the main power quality problems in overhead distribution systems which are exposed to faults or short circuits. The effects of voltage sag from fault or short circuit generally depend on fault current magnitude and clearing time of protective device. These two factors determine the depth and duration of voltage sag. With reference to the ITIC curve, it can be determined whether sensitive equipment connected at the bus of interest can function properly This paper presents a method of fault position to obtain the magnitude of voltage and the number of voltage sag events based on deterministic data and statistical data of the system. The developed methodology was tested with the Roy Billinton Test System (RTBS). The simulation results obtained are very useful and can be served as a guideline for customers to justify the optimal balance between the cost of investment to guard against voltage sag events and the economic loss due to voltage sag events. Keywords: Voltage sag, Fault Position, ITIC curve

การใช้ งานอุปกรณ์อเิ ลคทรอนิกส์ต่างๆ ของทางด้ านผู้ใช้ ไฟฟ้ าเนื่องจากอุปกรณ์ไฟฟ้ าสมัยใหม่ อ่อนไหวต่อการ ในช่ วงระยะเวลาหลายปี ที่ผ่านมา ปั ญหาคุณภาพไฟฟ้ า เกิด ปั ญ หาทางด้ า นแรงดัน ไฟฟ้ า โดยเฉพาะอย่ า งยิ่ ง ได้ รับความสาคัญเป็ นอย่ างมากและต่ อเนื่องควบคู่ไปกับ แรงดัน ตกชั่ วขณะ ในระบบจาหน่ า ยไฟฟ้ า แรงดัน ตก บทนา

168

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ชั่ ว ขณะมี โ อกาสเกิ ด ขึ้ นมากกว่ า การที่ ไ ฟฟ้ าดั บ และ ผลกระทบกับความเสียหายต่อผู้ใช้ ไฟฟ้ าก็จะมีมากกว่ า ด้ วยเช่นกัน แรงดันตกชั่วขณะ หมายถึง การที่ขนาดของ แรงดันประสิทธิผลมีขนาดลดลงชั่วขณะ (โดยทั่วไปแล้ ว ขนาดของแรงดั น อยู่ ท่ีป ระมาณ 10%-90% และ ระยะเวลาประมาณ 0.5-30 ลูกคลื่น) (Jovica & Chandra, 2006) ซึ่งโดยปกติแล้ ว มักจะเกิดจากมี ความผิดพร่องเกิดขึ้นที่บางจุดในระบบไฟฟ้ า แรงดันตก ชั่วขณะนั้นเป็ นปั ญหาที่สาคัญที่สดุ ในเรื่องคุณภาพไฟฟ้ า

ต่ อ ลู ก ค้ าผู้ ใช้ ไฟที่ เ ป็ นโรงงานอุ ต สาหกรรม เพราะ อุปกรณ์ต่างๆ ที่ใช้ ในโรงงานอุตสาหกรรมสมัยใหม่น้ัน (อุปกรณ์ควบคุมการผลิต PLC ตัวปรับความเร็วมอเตอร์ คอมพิวเตอร์ เป็ นต้ น) ต่างก็มคี วามไวต่อการเกิดแรงดัน ตกชั่ ว ขณะ แม้ แ ต่ รี เ ลย์ แ ละคอนแทรกเตอร์ ส าหรั บ อุ ป กรณ์ ไ ฟฟ้ าก็ส ามารถที่ จ ะมี ค วามไวต่ อ แรงดั น ตก ชั่ ว ขณ ะเ ช่ น กั น ดั ง จะ เ ห็ น ได้ จา กกา รท าง าน ใ น กระบวนการผลิ ตหยุ ด ลงเมื่ออุป กรณ์เ หล่ านี้ ไม่ ทางาน เพราะเกิดแรงดันตกดังแสดงในรูปที่ 1

รูปที่ 1 รูปแบบคลื่นแรงดันตกชั่วขณะที่เกิดจากความผิดพร่องในบริเวณที่ห่างไกล (Mark, David, & Marek, 1993)

การมีเข้ าใจความแตกต่างระหว่ างไฟฟ้ าดับและการ เกิดแรงดันตกชั่วขณะมีความสาคัญมาก การที่ไฟฟ้ าดับ จะเกิด เมื่ออุป กรณ์ป้ องกัน ทางไฟฟ้ าได้ ตัดวงจรที่จ่ า ย ไฟฟ้ าให้ กบั ลูกค้ า ซึ่งเป็ นเหตุการณ์ปกติท่จี ะเกิดขึ้นเมื่อมี ความผิด พร่ องเกิด ขึ้น ในระบบ แต่ ส าหรั บแรงดัน ตก ชั่ ว ขณะจะเกิ ด ขึ้ นในช่ ว งเวลาขณะที่มี ค วามผิ ด พร่ อ ง เกิดขึ้นในระบบไฟฟ้ า การเกิดความผิดพร่ องบนวงจร สายป้ อนที่ขนานกัน หรือบนสายส่งของระบบไฟฟ้ าก็จะ ทาให้ เกิดแรงดันตกชั่วขณะได้ และส่งผลกระทบต่อผู้ใช้ ไฟฟ้ าเป็ นบริเวณกว้ างมากกว่ าการเกิดเหตุการณ์ไฟฟ้ า ดับ ดังนั้นการเกิดแรงดันตกชั่วขณะจะมีความถี่ในการ เกิด มากกว่ า การที่ไ ฟฟ้ าดับ และ ถ้ า หากว่ า อุ ป กรณ์ มี ความไวต่ อ แรงดัน ตกชั่ ว ครู่ค วามถี่ท่ีจ ะเกิด ปั ญ หากับ อุปกรณ์หรือการผลิตก็จะมากขึ้นไปด้ วย การหยุ ดชะงักของการผลิตในโรงงานอุตสาหกรรม เนื่องมาจากแรงดั นตกชั่วขณะและไฟดับ สามารถสร้ า ง ความเสีย หายอย่ า งมากต่ อกระบวนการผลิ ต ของผู้ ใ ช้ ไฟฟ้ า การหยุดการทางานเพียงแค่ข้นั ตอนเดียวก็อาจจะ ทาให้ เสียหายทั้งกระบวนการได้ และมูลค่าความเสียหาย

ของทางเศรษฐกิจก็จะขึ้นอยู่กบั ประเภทของการผลิต ทั้ง ในส่วนของ ค่าความเสียหายนี้รวมถึงการสูญเสียโอกาส ในการผลิตสินค้ า ค่ าแรงงานในการเริ่มต้ นทางานใหม่ ผลิตภัณฑ์ได้ รับความเสียหาย คุณภาพของสินค้ าลดลง การส่งสินค้ าล่ าช้ า สูญเสียความพึงพอใจของลูกค้ า และ อื่นๆ อีกมากมาย (Goswami, Gupta, & Singh, 2008; Jovica & Chandra, 2006) บทความนี้กล่าวถึง คุณลักษณะของแรงดันตกชั่วขณะ กราฟ ITIC (Information Technology Industry Council) และการหาจานวนครั้ง ขนาด และระยะเวลาของ การเกิดแรงดันตกโดยใช้ หลักการของตาแหน่ งความผิด พร่ อง ด้ วยข้ อมู ลขนาดและระยะเวลาการเกิด แรงตก ชั่วขณะทาให้ เราสามารถประเมินความเสี่ยงได้ ว่าอุปกรณ์ คาดว่ า จะได้ รั บผลกระทบเนื่ องจากแรงดัน ตกชั่ ว ขณะ หรื อ ไม่ โดยการน าความสั ม พั น ธ์ ร ะหว่ า งขนาดและ ระยะเวลาของการแรงดันตกมาเขียนลงในกราฟ ITIC 1. การเกิดแรงดันตกชั่วขณะ โดยปกติ แ ล้ ว แรงดั น ตกชั่ ว ขณะจะเกิ ด เมื่ อ มี ความผิดพร่ องเกิดขึ้นในระบบไฟฟ้ าจนกระทั่งความผิด

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

พร่องจะถูกกาจัดด้ วยอุปกรณ์ป้องกันต่างๆ ซึ่งถ้ าเป็ นใน โรงงานอุปกรณ์น้ ี การกาจัดความผิดพร่องก็จะทาหน้ าที่ โดยฟิ วส์ หรือเบรกเกอร์สายป้ อนของโรงงาน ถ้ าเป็ นใน ระบบจาหน่ายไฟฟ้ าความผิดพร่องก็จะถูกกาจัดด้ วยฟิ วส์ หรือไม่กเ็ ซอร์กติ เบรกเกอร์ (Circuit Breaker) ในสถานี ไฟฟ้ า ถ้ าหากว่ามีอุปกรณ์ปิดซา้ ติดตั้งอยู่การเกิดแรงดัน ตกชั่วขณะก็สามารถที่จะเกิดซา้ ได้ หลายครั้งตามจานวน ครั้งของการสับซา้ ของอุป กรณ์ป้องกัน การเกิดความผิด พร่ อ งในระบบไฟฟ้ าสามารถเกิด ขึ้ นได้ ท่ีส ถานี ไ ฟฟ้ า หรือไม่กท็ ่รี ะบบสายส่งกาลังไฟฟ้ า รูปที่ 2 แสดงระบบ สถานีไฟฟ้ าทั่วไปที่มสี ายป้ อนต่ออยู่ท่บี ัสเดียวกัน ซึ่งเมื่อ เกิด ความผิดพร่ องที่สายป้ อนที่ F1 ก็จ ะทาให้ เกิด การ ขั ด ข้ องในการจ่ า ยไฟฟ้ าให้ กั บ ลู ก ค้ าที่ ส ายป้ อนนั้ น

169

อย่างไรก็ตามผู้ใช้ ไฟทั้งหมดที่อยู่ในสายป้ อนที่ขนานกับ สายป้ อนที่เกิดความผิดพร่องจะเกิดแรงดันตกชั่วขณะใน ขณะที่ยังเกิดความผิดพร่องอยู่ ถ้ าหากมีอุปกรณ์ปิดซา้ ที่ สถานี ไ ฟฟ้ าแห่ ง นั้ น ผู้ ใ ช้ ไ ฟที่อ ยู่ ใ นสายป้ อนที่ไ ม่ เ กิด ความผิ ด พร่ อ งก็ส ามารถที่จ ะได้ รั บแรงดัน ตกชั่ ว ขณะ หลายๆ ครั้งได้ เช่นกัน (Mark, David, & Marek, 1993) ในตอนท้ า ยของช่ ว งเวลาที่เ กิด ซึ่ ง ประมาณ มากกว่า 10 ลูกคลื่น ซึ่งผู้ใช้ ไฟฟ้ าจะได้ รับแรงดันไฟฟ้ า ดังรูปที่ 3 ความผิดพร่องที่เกิดในระบบสายส่งสามารถมี ผลกระทบต่อผู้ใช้ ไฟจานวนมากและแม้ ว่าผู้ใช้ ไฟฟ้ าที่อยู่ ห่ า งออกไปไกลมากก็ต ามก็ยั ง สามารถได้ รั บ รู้ ได้ ถึ ง แรงดันตกชั่วครู่

รูปที่ 2 ระบบจาหน่ายทั่วไปที่มีความผิดพร่องเกิดที่สายป้ อน F1 (Mark, David, & Marek, 1993)

รูปที่ 3 ลาดับการทางานของอุปกรณ์ปิดซา้ ที่ทาให้ เกิดปัญหาแรงดันตกชั่วขณะในระบบ (Mark, David, & Marek, 1993)

2. ITIC Curve โดยปกติแล้ วการประเมินผลกระทบของแรงดัน ตกชั่ ว ขณะจะต้ องใช้ ค่ า 2 ตั ว คื อ ขนาดของแรงดั น (Magnitude) และระยะเวลาในการเกิด (Duration) ค่า ทั้งสองดัง กล่ าวนามาใช้ ร่ว มกับ เส้ น โค้ งของแรงดันต่ อ ความทนต่อการเกิดแรงดันไฟฟ้ าตกสาหรับอุปกรณ์ ซึ่ง เส้ น โค้ ง นี้ เป็ นการเปรี ย บเทีย บระหว่ า งการลดลงของ แรงดันซึ่งแทนอยู่ในแกน Y และระยะเวลาซึ่งแทนอยู่ใน

แกน X โดยกราฟนี้จะมีพ้ ืนที่ท่อี ุปกรณ์ยังสามารถทางาน ได้ และพื้นที่ท่อี ปุ กรณ์หยุดทางาน โดยกราฟเส้ นโค้ งนี้ถูก เรียกว่ าเส้ นโค้ ง ITIC ซึ่งสภาเทคโนโลยีอุตสาหกรรม ระดับนานาชาติได้ กาหนดไว้ สาหรับอุปกรณ์สารสนเทศ นอกจากนี้ยังมีอกี กราฟหนึ่งชื่อว่า SEMI F47 เป็ นกราฟ ที่ใช้ บอกความคงทนต่อการเกิดแรงดันตกชั่วขณะสาหรับ อุป กรณ์ ป ระเภทเซมิค อนดักเตอร์ รูป ที่ 4 แสดงการ เปรียบเทียบระหว่างเส้ นโค้ ง ITIC และ SEMI F47 ซึ่งมี

170

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ความแตกต่างกันเล็กน้ อยสาหรับพื้นที่ท่ไี ด้ รับผลกระทบ เนื่องจากแรงดันตกชั่วขณะในบทความนี้ การประเมินผล กระทบอ้ างอิงกับกราฟ ITIC เป็ นหลัก อย่ างไรก็ตาม

หลักการวิเคราะห์ยังคงเหมือนเดิมไม่ว่าจะใช้ กราฟการ ประเมินรูปแบบใด

รูปที่ 4 เส้นโค้ ง ITIC และ SEMI F47

ผลกระทบจากการเกิดแรงดันตกชั่วขณะนั้นขึ้นอยู่กบั ความลึ กของการตกของแรงดัน ซึ่ งขึ้นอยู่ กับขนาดของ กระแสลั ด วงจร และช่ ว งระยะเวลาที่เ กิด ซึ่ ง ขึ้น อยู่ กับ ระยะเวลาการทางานของอุปกรณ์ป้องกัน รูปที่ 5 แสดง กราฟ ITIC ซึ่งประกอบไปด้ วยพื้นที่ 2 ส่วน คือ พื้นที่ท่มี ี ภูมคิ ้ มุ กัน (Immunity Region) หรือพื้นที่ท่อี ปุ กรณ์สามารถ ท า ง า น ไ ด้ ต า ม ป ก ติ แ ล ะ พื้ น ที่ ที่ ไ ม่ มี ภู มิ คุ้ ม กั น

(Unimmunity Region) หรือ พื้นที่ท่อี ุปกรณ์อาจจะได้ รับ ความเสียหายจากการเกิดไฟฟ้ าดับ ตัวอย่ างของการใช้ กราฟ ITIC เช่ น อุ ป กรณ์ จ ะสามารถท างานได้ เ มื่ อ แรงดันไฟฟ้ ามีขนาดลดลง 0.8 เท่าของแรงดันปกติ และ เวลาน้ อยกว่า 10 วินาที ซึ่งเมื่อเทียบในแกน X และ Y จะเห็นว่าอยู่ในพื้นที่ท่มี ภี มู คิ ้ มุ กัน

รูปที่ 5 เส้นโค้ ง ITIC ของอุปกรณ์ตัวอย่าง

3. การระบุตาแหน่งของความผิดพร่อง (Method of Fault Position) (ธนิษฐ์ เมนะเนตร, 2552) วิ ธีการระบุ ต าแหน่ ง ความผิด พร่ องถู กน ามาใช้ เพื่ อหาค่ าการเกิดแรงดันตกชั่วขณะที่คาดว่ าจะเกิดขึ้น เนื่องจากการเกิดความผิดพร่ องในระบบจาหน่ ายนั้นมี

ลักษณะแบบสุ่ม (Random) การทานายถึงความถี่ท่จี ะ เกิด แรงดั น ตกชั่ ว ขณะ ดั ง นั้ น การประเมิ น แรงดั น ตก ชั่วขณะในระบบจาหน่ายไฟฟ้ าต้ องการข้ อมูล ข้ อมูลทั่วไป ของระบบ เช่ น พารามิเ ตอร์ ข องสายป้ อน เช่ น ความ ต้ า นทาน ค่ า รี แ อตแตนซ์ เป็ นต้ น และ ข้ อ มู ล ความ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

เชื่อถือได้ ของอุปกรณ์ไฟฟ้ า ในรูปของอัตราการล้ มเหลว ของอุปกรณ์ต่างๆ ในระบบ เช่ น สายป้ อน หม้ อแปลง จาหน่าย รวมทั้งสถิตกิ ารเกิดไฟฟ้ าดับของพื้นที่ในรูปของ ประเภทและจานวนครั้งของการเกิดการลัดวงจร เป็ นต้ น การระบุตาแหน่งความผิดพร่องจะมีข้นั ตอนดังต่อไปนี้ 3.1 กาหนดพื้นที่ท่ตี ้ องการจะทานายความถี่การ เกิดแรงดันตกชั่วขณะเนื่องจากเกิดการลัดวงจรในระบบ ไฟฟ้ า 3.2 แบ่ ง พื้ นที่ท่ีก าหนดไว้ อ อกเป็ นช่ ว งเล็ก ๆ โดยแต่ละส่วนเล็กๆ จะนาไปหาค่าความผิดพร่ องแบบ ต่างๆ 3.3 ตาแหน่งที่เกิดความผิดพร่องแต่ละตาแหน่ง จะมีก ารก าหนดค่ า ความถี่ในการเกิด การลั ด วงจร คือ จานวนครั้งในการเกิดการลัดวงจรต่อปี 3.4 แรงดันตกชั่วขณะจะถูกคานวณในแต่ละจุด ที่จะเกิดความผิดพร่องในระบบ 3.5 ค่าที่ได้ จากการคานวณในข้ อ 3.3 และ 3.4 (คุณสมบัตแิ ละจานวนครั้งของแรงดันตกชั่วขณะ) จะถูก

171

นามารวมกันเพื่อหาจานวนการเกิดแรงดันตกชั่วขณะใน ช่ วงเวลาที่กาหนด ณ จุ ดโหลดที่ต้องการประเมินผล กระทบ (ธนิษฐ์ เมนะเนตร, 2552) แนวคิดของวิธีน้ ีคือความผิดพร่ องสามารถเกิดขึ้นที่ จุ ด ใดก็ไ ด้ ในสายป้ อน ตั้ ง แต่ ต้ นสายถึ ง ปลายสาย โดยอาศัย หลักการการประยุ กต์การใช้ วิ ธีมอนติคาร์โ ล ร่ ว มกับวิ ธีร ะบุ ต าแหน่ ง ความผิด พร่ อง แต่ การใช้ วิ ธีน้ ี จะต้ องพิจารณาทุกจุ ดบนสายตามความยาวให้ มากที่สุด เพื่ อที่จะได้ คาตอบที่ถูกต้ องมากที่สุดซึ่งใช้ เวลานานใน กระบวนการสุ่มแต่ละครั้ง ดังนั้นจึงได้ ใช้ วิธกี ารแบ่งสาย ป้ อนออกเป็ นจานวนส่วนเท่าๆ กัน ตามรูปที่ 6 ซึ่งสร้ าง จุ ดระหว่ างต้ น สายกับปลายสายขึ้น ตัวอย่ า งในรูป ที่ 6 แบ่งสายป้ อนออกเป็ น 3 จุด (Dummy Node) ทาให้ มี 5 ต า แห น่ งที่ เป็ น ไป ได้ ใ นกา รเ กิ ด ควา มผิ ด พร่ อง ประกอบด้ วย บัสที่ 1 จุด Dummy Node ทั้งสามจุด และ บัสที่ 2 จากนั้น เราจึงหาค่าการเกิดจากจุดต่างๆ ที่แบ่งนี้

รูปที่ 6 วิธกี ารระบุตาแหน่งผิดพร่อง

วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ โปรแกรมการวิเคราะห์ทาโดยการจาลองระบบไฟฟ้ า โดยใช้ หลักการการระบุตาแหน่งของความผิดพร่องได้ ถูก พัฒนาขึ้น โดยสามารถจาลองระบบไฟฟ้ าเพื่อนามาหาค่า จานวนครั้ง ในการที่เกิดความผิดพร่ องและทดสอบกับ ระบบจาหน่ ายทดสอบมาตรฐาน Roy Billinton Test System (RTBS) บัสที่ 2 ระบบจาหน่ายไฟฟ้ า RBTS

บัสที่ 2 มีระดับแรงดันเท่ากับ 11 kV ดังรูปที่ 7 โดย ระบบจาหน่ายไฟฟ้ า RBTS บัสที 2 มีจุดโหลดทั้งหมด 22 จุดโหลด สวิตซ์ถ่ายโอนโหลดจานวน 2 ตัว และเซอร์ กิตเบรกเกอร์จานวน 4 ชุด ซึ่งข้ อมูลความเชื่อถือได้ ของ อุ ป กรณ์ โหลดและจ านวนผู้ ใ ช้ ไฟฟ้ า ความยาวของ สายไฟฟ้ า สถิ ต การเกิด ความผิ ด พร่ อ งภายในระบบ RBTS บัสที่ 2 แสดงได้ ดังตารางที่ 1 ถึงตารางที่ 4 ตามลาดับ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

172 LP4

LP7

LP6

10 LP3

15 LP9

4 LP2

LP5

33 kV

1 LP1

F1 F4

LP18

F2 F3

26 LP19

30 29

11 kV 16

LP16

LP17 35 36

LP22

19 20

LP12

21 LP10

32 LP20

13 LP8 LP11

LP21

LP15

22 23

LP13

LP14

รู ปที่ 7 ระบบจาลอง RBTS ตารางที่ 1 ความเชื่อถือได้ ของอุปกรณ์ ระบบ RBTS บัสที่ 2 อุปกรณ์  หม้ อแปลง 0.015 สายป้ อน 0.065

โดย

 r S

r 200 5

S 1.0

= อัตราการล้ มเหลว (ครั้ง/กิโลเมตร - ปี ) = ระยะเวลาในการซ่อมหรือระยะเวลาทดแทน (ชั่วโมง) = ระยะเวลาในการปลดสับสวิตซ์ (ชั่วโมง)

ตารางที่ 2 ข้ อมูลโหลดและจานวนผู้ใช้ ไฟฟ้ าในระบบ RBTS บัสที่ 2 จุดโหลด (LP) ประเภทผู้ใช้ ไฟฟ้ า กาลังไฟฟ้ าเฉลี่ย (MW) 1,2,3,10,11 ที่อยู่อาศัย 0.535 12,17,18,19 ที่อยู่อาศัย 0.450 6,7,15,16,22 ธุรกิจบริการ 0.454 8 อุตสาหกรรม 1.000 9 อุตสาหกรรม 1.150 4,5,13,14,20,21 หน่วยงานของรัฐ 0.566 ตารางที่ 3 ข้ อมูลความยาวของสายไฟฟ้ า ระบบบัสที่ 2 ประเภทสายป้ อน ความยาวสาย (km)

ผู้ใช้ ไฟฟ้ า/จุดโหลด 210 200 10 1 1 1

หมายเลขสายป้ อน

0.60

2,6,10,14,17,21,25,28,30,34

0.75

1,4,7,9,12,16,19,22,24,27,29,32,35

0.80

3,5,8,11,13,15,18,20,23,26,31,33,36

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

173

ตารางที่ 4 สถิติการเกิดความผิดพร่องในระบบจ่ายกาลังไฟฟ้ า ชนิดของความผิดพร่อง

ร้อยละการเกิดความผิดพร่อง

Single Line-to-Ground Fault Line-to-Line Fault Symmetrical Three-Phase Fault

58.14 30.23 11.63

ผลการศึกษา ผลการทาสอบการรั น โปรแกรมเพื่ อหาค่ า การเกิด แรงดัน ตกชั่ ว ขณะที่ป ลายสายป้ อนแสดงได้ ดัง รูป ที่ 8 ตาแหน่งปลายสายป้ อนเป็ นจุดโหลดที่เราสนใจเนื่องจาก มีอุปกรณ์ท่ีมีความอ่อนไหวต่อระดับแรงดันตกชั่วขณะ ติดตั้งอยู่ ในที่น้ ี เราสนใจระดับแรงดันตกที่ต่ากว่า 90%

ลงมา เราพบว่ า ที่แ รงดัน 11 kV จะมีอัต ราการเกิด แรงดันตกชั่วขณะที่ 80% มีค่าสูงสุด เท่ากับ 3.3 ครั้งต่อปี รองลงมา คือ ที่ระดับแรงดัน 85% จานวน 3.0 ครั้งต่อปี รวมจานวนครั้งของการเกิดแรงดันตกแล้ วเท่ากับ 17.2 ครั้งต่อปี ค่าของกราฟในรูปที่ 8 แสดงเป็ นจานวนได้ ใน ตารางที่ 5

รูปที่ 8 กราฟจานวนการเกิดแรงดันตกชั่วขณะที่แรงดันระดับต่างที่ปลายสาย ตารางที่ 5 ผลการหาค่าแรงดันตกชั่วขณะที่ปลายสาย Voltage 0.2 0.4 0.6 11kV 2.3 1 1.1

0.7 1.4

0.8 3.3

0.85 3

0.9 2.2

อภิปรายผลการศึกษา

รูปที่ 9 กราฟ ITIC เมื่อเกิดความผิดพร่องที่ปลายสายป้ อน

0.95 1.5

1 4.4

total 17.2

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

174

หากการเกิดความผิดพร่ องที่ปลายสายป้ อน เมื่อนา ขนาดของแรงตกชั่วขณะที่เหลืออยู่ 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% มาเขียนลงกราฟ ITIC โดยเวลาการท างานของอุป กรณ์ ป้ องกัน ในการก าจั ด ความผิดพร่องอยู่ท่ี 0.123 วินาทีทุกค่าซึ่งเป็ นระยะเวลา ที่ระบบป้ องกันทางาน เราจะเห็นได้ ว่า ที่แรงดันต่ากว่ า 70% ลงมาอุปกรณ์ คาดว่าอุปกรณ์จะไม่สามารถทางาน ได้ ดัง รูปที่ 9 ซึ่งเมื่อพิ จารณาจากตารางการเกิดแรงดัน ตกชั่ ว ขณะก็พ บว่ า ที่ แ รงดั น คงเหลื อ ต่ า กว่ า 70% มี จ านวนครั้ ง ของการเกิด เหตุ ก ารณ์ แ รงดั น ตกชั่ ว ขณะ รวมทั้งหมดเท่ากับ 5.8 ครั้งต่อปี ด้ วยหลักการดังกล่าว ทาให้ เราสามารถประเมินความเสี่ยงของการเกิดแรงดัน ตกและผลกระทบที่คาดว่ าจะเกิดขึ้นเพื่อนาไปประเมิน ความสัม พั น ธ์ร ะหว่ า งเงิ น ลงทุ น ของการติ ด ตั้ ง ระบบ ป้ องกัน และ ผลกระทบจากความเสียหายทางเศรษฐกิจ เนื่องจากแรงดันตกได้ อย่างมีประสิทธิภาพ สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ บทความนี้นาเสนอการประเมินผลกระทบเนื่องจาก แรงดัน ตกชั่ ว ขณะซึ่ ง มีส าเหตุมาจากการเกิด ความผิ ด พร่องในระบบจาหน่ายไฟฟ้ าโดยใช้ วิธกี ารหาตาแหน่งจุด ผิดพร่องที่อ้างอิงกับการคานวณการลัดวงจรและวิธีการ จาลองเหตุการณ์แบบมอนติคาร์โล เพื่อหาอัตราจานวน ครั้งในการเกิดแรงดันตกชั่วขณะที่แรงดันคงเหลือระดับ ต่ างๆ จากนั้ นจึง นาค่ าแรงดันที่ไ ด้ มาเขีย นลงในกราฟ ITIC เพื่ อหาว่ าอุปกรณ์จะไม่ สามารถทางานได้ ท่ีช่วง ระดับแรงดันเท่าไร โดยนามาเขียนลงในกราฟ ITIC ผล ที่ได้ คือเราสามารถประเมินความเสี่ยงที่จะเกิดการหยุด ท างานของอุป กรณ์ ท่ีมี ค วามไวต่ อ การเกิด แรงดั น ตก ชั่วขณะได้ อย่างมีประสิทธิภาพ ทาให้ เรามีข้อมูลเบื้องต้ น ในการตั ด สิ น ใจประเมิ น การลงทุ น ในการปรั บ ปรุ ง คุ ณ ภาพไฟฟ้ าได้ ใ นอนาคต งานวิ จั ย ที่จ ะท าต่ อ ไปใน อนาคต คือ การนาเสนอการประยุกต์ใช้ ความน่ าจะเป็ น ร่วมกับโครงสร้ างประเภทของระบบการทางานของผู้ใช้ ไฟฟ้ าที่มกี ารติดตั้งอุปกรณ์ท่มี ีความอ่อนไหวสาหรับการ นาประเมินความเสียหายเนื่องจากเหตุการณ์แรงดันตก ชั่วขณะต่อไป

เอกสารอ้างอิง ธนิษฐ์ เมนะเนตร. (2552). การประเมินแรงดันตกช่วง สัน้ ในระบบจาหน่ายโดยใช้วธิ ีการจาลองเหตุการณ์มอนติ คาร์ โ ลร่ ว มกับ โปรแกรมศึ ก ษาพฤติ ก รรมชั่ว ครู่ ท าง แม่เหล็กไฟฟ้ า. กรุงเทพฯ: บัณทิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัย เทคโนโลยีพระจอมเกล้ าพระนครเหนือ. [1] Goswami, A. K., Gupta, C. P., & Singh, G. K. (2008). Assessment of Financial Losses due to Voltage Sags in and Indian Distribution system. In IEEE Region 10 Colloquium and the Third International Conference on Industrial and Information Systems (pp.1-6). India: Kharagpur. Jovica, V. M., & Chandra, P. G. (2006). Probabilistic Assessment of Financial Losses due to Interuption and Voltage Sags Part I: The Methodology. IEEE transaction on power delivery, 21, 0885-8977. Mark, F. M., David, R. M., & Marek, J. S. (1993). Voltage Sags in Industrial Systems. IEEE transactions on industry applications, 29, 397-403. Translated Thai References Tanit Meananeatra. (2552). Evaluation of Voltage Sag in Distribution System by Mote Carlo Simulation and Electromagnetic Transein Program. Bangkok: Graduate College King Mongkut’s University of Technology North Bangkok. [in Thai] [1]

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

175

ความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างจุลภาคและสมบัติทางกลของเหล็กกล้า Fe-Cr-Mo ทีผ่ ่านการซินเตอริง่ วณานุรัตน์ ศรีจาพันธุ1์ , เรืองเดช ธงศรี2, ธัญพร ยอดแก้ ว2, นาตยา ต่อแสงธรรม2, มนภาส มรกฎจินดา2, รุ่งทิพย์ กระต่ายทอง2 และอัมพร เวียงมูล1*

Relationship between Microstructure and Mechanical Property of Sintered Fe-Cr-Mo Steels Wananurat Srijampan1, Ruangdaj Tongsri2, Thanyaporn Yotkaew2,Nattaya Torsangthum2, Monnapas Morakotjinda2, Rungtip Krataitong2 and Amporn Wiengmoon1* 1

ภาควิชาฟิ สิกส์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยนเรศวร พิษณุโลก 65000 หน่วยวิจัยและพัฒนาโลหะวิทยาผง ศูนย์เทคโนโลยีโลหะและวัสดุแห่งชาติ ปทุมธานี10120 1 Department of Physics, Faculty of Science,Naresuan University, Phitsanulok 65000 2 Powder Metallurgy Research and Development Unit, National Metal and Materials Technology Center, PathumThani 12120 * Corresponding author. E-mail address: ampornw@nu.ac.th บทคัดย่อ งานวิ จั ย นี้ มี วั ต ถุ ป ระสงค์ เพื่ อ ศึก ษาผลของคาร์ บ อนและอัต ราการเย็น ตั ว ต่ อ โครงสร้ า งจุ ล ภาคและสมบั ติ ใ นเหล็ก กล้ า Fe3.0wt.%Cr-0.5wt.%Mo-0.01wt.%C ที่เติมคาร์บอนในปริมาณ 0.2 และ 0.3wt.%C โดยนาผงโลหะมาอัดขึ้นรูปที่อุณหภูมิห้องให้ มี ความหนาแน่น 6.5 g/cm3และซินเตอริ่งที่อุณหภูมิ 1280oC ในเตาสุญญากาศ ทาให้ เย็นตัวด้ วยก๊าซไนโตรเจนที่อัตรา0.1 และ 4.0oC/s ศึกษาโครงสร้ างจุลภาคด้ วยกล้ องจุลทรรศน์แสงและกล้ องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด ศึกษาชนิดเฟสด้ วยเทคนิคการเลี้ยวเบน ของรังสีเอ็กซ์ทดสอบความแข็งและทดสอบแรงดึง จากการศึกษาพบว่า เมื่อให้ อัตราการเย็นตัว 0.1oC/s ชิ้นงานที่เติมคาร์บอน 0.2% มีโครงสร้ างจุ ลภาคเป็ น polygonal ferrite (PF) ส่วนชิ้นงานที่เติมคาร์บอน 0.3wt.% ประกอบด้ วย PF และเบนไนต์เมื่ออัตรา การเย็นตัวเพิ่มขึ้นเป็ น 4.0oC/s มีโครงสร้ างเป็ นเบนไนต์ มาร์เทนไซนต์และออสเทนไนต์ บางส่วนความแข็งและความต้ านทานแรงดึง สูงสุดของชิ้นงานที่เติมคาร์บอน 0.2 และ 0.3% ที่อตั ราการเย็นตัว 0.1oC/s มีค่าเป็ น 106.7 HV0.1, 127.3 HV0.1 และ 205.3 MPa, 565.5 MPa ตามลาดับเมื่ออัตราการเย็นตัวเป็ น 4.0oC/s จะมีค่าเพิ่มขึ้นเป็ น 304.5 HV0.1, 436.1 HV0.1 และ 470.4 MPa, 700.2 MPa ตามลาดับ 2

คาสาคัญ: เหล็กกล้ า Fe-Cr-Mo โครงสร้ างจุลภาค สมบัติทางกล อัตราการเย็นตัว Abstract In this work, the effect of carbon content and cooling rate on microstructure and mechanical property of the Fe-3.0wt.%Cr0.5wt.%Mo-0.01wt.%C steel was investigated. The pre-alloyed powder was mixed with 0.2 and 0.3wt.%C. The powder mixtures were compacted with hydraulic compactor at room temperature to green density of 6.5 g/cm3. The green compact were sintered at 1280 ˚C in vacuum furnace and cooled by nitrogen gas with cooling rate of 0.1 and 4.0oC/s. It was found that the microstructure of 0.2wt.%C sintered steel at cooling rate of 0.1oC/sconsisted of polygonal ferrite (PF). The steelcontaining 0.3wt.%C, the microstructure consisted of PF and bainite. At higher cooling rate of 4.0oC/s, bainite, martensite and some retained austenite (γ) were found in both steels. The Vickers microhardness and ultimate tensile strength of the steels containing 0.2 and 0.3wt.%C with cooling rate of 0.1oC/s were 106.7 HV0.1, 127.3 HV0.1 and 205.3 MPa, 565.5 MPa, respectively. At cooling rate of 4.0oC/s, Vickers microhardness and ultimate tensile strength were increased up to 304.5 HV0.1, 436.1 HV0.1 and 470.4 MPa, 700.2 MPa, respectively. Keywords: Fe-Cr-Mo steel, Microstructure, Mechanical Property, Coolingrate

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

176

บทนา กรรมวิธโี ลหะผงเป็ นวิธกี ารผลิตวัสดุหรือชิ้นส่วนจากผง โลหะ โดยการน าผงโลหะไปอั ด ขึ้ นรู ป และน าไป ซินเตอริ่ง กรรมวิธีโลหะผงเข้ ามามีบทบาททดแทนการขึ้น รูปแบบดั้งเดิม เนื่ องด้ วยสามารถผลิ ตชิ้ นส่วนที่มีรูปร่ าง ซับซ้ อนได้ มีนา้ หนักเบา มีความแม่นยาของรูปร่ างและยัง ประหยัดวัตถุดบิ หรือผงตั้งต้ น (นภิสพร มีมงคล, 2548) Astaloy CrM มักใช้ เป็ นผงโลหะเริ่มต้ น (Pre-alloyed) ที่มีส่ วนผสมประกอบด้ วยธาตุเหล็ก โครเมีย ม 3wt.% โมลิบดินัม 0.5wt.% และคาร์บอน 0.01wt.% ผลิตด้ วย วิธกี ารอะตอมไมเซชันด้ วยนา้ ทาให้ ผงโลหะมีความเป็ น เนื้อเดียวกัน สามารถทาการอัด ขึ้น รูป และชุ บแข็ง ได้ ดี (Höganäs, 2015) จากการวิจัยที่ผ่านมาพบว่าโครงสร้ าง จุ ลภาคและสมบัติทางกลของเหล็กกล้ า Astaloy CrM ขึ้นกับการเติมธาตุ เช่น คาร์บอน อุณหภูมิซินเตอริ่งและ อัตราการเย็นตัว ในปี 2000 Yu พบว่าเหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่เติมคาร์บอน 0.3-0.5wt.% เมื่อปล่อยให้ เย็นตัว ปกติ ภ ายในเตาจะมี โ ครงสร้ างจุ ล ภาคประกอบด้ ว ย เบนไนต์และเฟอร์ไรท์ ซึ่งเบนไนต์จะเพิ่มขึ้นเมื่อปริมาณ คาร์บอนเพิ่ มขึ้น Lindberg, Johansson, and Maroli (2000) ได้ เติมคาร์บอน 0.4wt.% ใน Astaloy CrM อัด ขึ้นรูปร้ อนและซินเตอริ่งที่ 1120oC พบว่ ามีความแข็ง เพิ่มสูงถึง 450 HV10 มีความแข็งแรงสูงมากถึง 850 MPa นอกจากนี้ Lewenhagen (2000) (Dlapka, Danninger, Gierl, & Lindqvist, 2010; Sulowaski & Cias, 2011) พบว่าเหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่เติมคาร์บอน 0.3, 0.5, 0.7wt.% เมื่อนามาซินเตอริ่งอุณหภูมิ 1250oC จะส่งผล ให้ เหล็กกล้ ามีความแข็งและความต้ านทานแรงดึงสูงกว่า การซิ น เตอริ่ ง ที่อุ ณ หภูมิ 1120oC แต่ ค วามเหนี ย วจะ ลดลง นอกจากนี้ยังพบว่ าการปรับเปลี่ยนอัตราการเย็น

ตัวหลังการซินเตอริ่งจะส่งผลให้ เกิดโครงสร้ างจุ ลภาคที่ แตกต่างกันไป โดยที่อตั ราการเย็นตัวเร็วจะส่งผลให้ เกิด โครงสร้ างมาร์เทนไซต์ทาให้ ความแข็งและความต้ านทาน แรงดึงสูง เมื่ออัตราการเย็นตัวต่าส่งผลให้ เกิดโครงสร้ าง เบนไนต์ เพิร์ลไลท์และเฟอร์ไรท์ ซึ่งความแข็งและความ ต้ านทานแรงดึงจะลดลง (Dobrzañski & Musztyfaga, 2009; Moghaddam Farhangi, Ghambari, & Solimanjad, 2012; Moghaddam & Solimanjad, 2013) อย่างไรก็ ตามพบว่างานวิจัยที่ผ่านมักจะมุ่งเน้ นไปที่การเติมคาร์บอน ในปริมาณที่มากกว่ า 0.3wt% และอัตราเย็นตัว 1.07.0oC/s ดังนั้นในงานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อ ศึกษาผล ของคาร์บอนในปริมาณ 0.2 และ 0.3wt.% ที่มอี ตั ราการ เย็นตัวต่าและปานกลาง วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ 1. การเตรียมชิ้ นงาน ชิ้นงานในการทดลองเตรียมโดยการนาโลหะผง Astaloy CrM (3.0wt.%Cr-0.5wt.%Mo-0.01wt.%C) มา ผสมกับคาร์บอนในรูปของกราไฟต์ในปริมาณ 0.2 และ 0.3wt.% และสารหล่ อลื่น zinc stearate (ZnSt)ใน ปริมาณ 1wt.% ในเครื่องผสมสารเป็ นเวลา 45 นาที จากนั้นนาผงโลหะที่ผสมแล้ วไปอัดขึ้นรูปด้ วยเครื่องอัด ไฮโดรลิกด้ วยแรงอัด 400 MPa เป็ นชิ้นงานสาหรั บ ทดสอบแรงดึงตามมาตรฐาน MPIF Standard 10 ให้ มี ความหนาแน่น (green density) 6.5 g/cm3 จากนั้น นาไปซินเตอริ่งที่อณ ุ หภูมิ 1280oC เป็ นเวลา 45 นาที ใน สุญญากาศและปล่ อยให้ เย็นตัวถึงอุณหภูมิห้องภายใต้ อัตราการเย็นตัว 0.1 และ 4.0oC/s โดยการอัด ก๊า ซ ไนโตรเจนขั้น ตอนการเตรี ย มชิ้ นงานแสดงดัง รู ป ที่ 1 ตัวอย่างที่ผ่านการซินเตอริ่ง แสดงในรูปที่ 2

Temp. (oC)

1600

1280oC 45 min

1200 800 400

0.1oC/s 600oC 60 min

4.0oC/s

Time (min) รูปที่ 1แผนภาพแสดงขั้นตอนการซินเตอริ่งและการเย็นตัว

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

177

9 cm 0.8cm รูปที่ 2ตัวอย่างชิ้นงานหลังการซินเตอริ่ง

2. ศึกษาชนิดเฟสและโครงสร้างจุลภาค การเตรียมชิ้นงานเพื่อศึกษาชนิดเฟสด้ วยเครื่อง ทดสอบการเลี้ยวเบนของรังสีเอ็กซ์ (XRD) โดยนาชิ้นงานที่ ผ่านการซินเตอริ่งมาตัดและขัดหยาบด้ วยกระดาษทราย เบอร์ 180, 240, 320, 600 และ 1000 ตามลาดับและ ขัดละเอียดบนผ้ าสักหลาดด้ วยผงขัดเพชรขนาด 6, 3 และ 1 ไมครอน จากนั้นนาไปทดสอบด้ วยเทคนิคการ เลี้ยวเบนของรังสีเอ็กซ์ย่หี ้ อ Rigaku รุ่น TTRAX III การศึกษาโครงสร้ างจุ ลภาคด้ วยกล้ องจุ ลทรรศน์ แสงและกล้ องจุ ลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดโดย นาชิ้นงานที่ขัดละเอียดมากัดด้ วยกรด 2 ชนิด 1) Nital 5% เพื่อศึกษาโครงสร้ างโดยรวม 2) การย้ อมสีด้วยกรด Picric5 g + Ethanal 100 ml เป็ นเวลา 20 วินาที และ ตามด้ วย กรด Na2S2O5 10 g + นา้ กลั่น 100 ml เพื่อ แยกแยะระหว่างเบนไนต์ มาร์เทนไซต์และออสเทนไนต์ 3. การทดสอบสมบัติทางกล สมบั ติ ท างกลของเหล็ก กล้ า ได้ ท าการทดสอบ ความแข็งไมโครแบบวิกเกอร์ โดยใช้ นา้ หนัก 100 กรัม เป็ นเวลา 10 วินาที ชิ้น งานละ 10 จุ ด และหาค่ าเฉลี่ย และทาการทดสอบแรงดึง (Tensile test) ด้ วยเครื่อง Instron Universal Instrument ทดสอบตามมาตรฐาน MPIF Standard 42 ทดสอบตัวอย่างละ 3 ชิ้น และนามา หาค่าเฉลี่ย ผลการศึกษาและอภิปรายผลการศึกษา 1. โครงสร้างจุลภาค

จากการศึ ก ษาโครงสร้ างจุ ล ภาคด้ วยกล้ อง จุ ลทรรศน์แสงพบว่ าเมื่ออัตราการเย็นตัวเป็ น 0.1oC/s เหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่มีปริมาณคาร์บอน 0.2wt.% หลังการกัดกรดด้ วย Nital 5% ดังรูปที่ 3(ก-ข) พบว่ามี โครงสร้ างเป็ น polygonal ferrite (PF) ส่วนชิ้นงานที่มี คาร์บอน 0.3wt.% มีโครงสร้ างจุลภาคแบบ dual phase ที่ประกอบด้ วย PF และเบนไนต์ ซึ่งเป็ นโครงสร้ างของ เฟอร์ไรท์และซีเมนไตต์ (Fe3C) ดังรูปที่ 3(ค-ง) เมื่อ อัตราการเย็นตัว เพิ่ มขึ้นเป็ น 4.0°C/s ชิ้ นงานที่เติม คาร์บอน 0.2 และ 0.3wt.% มีโครงสร้ างประกอบด้ วย เบนไนต์มาร์เทนไซต์ และออสเทนไนต์ตกค้ าง เมื่อทา การกัด กรดย้ อมสีโครงสร้ าง (color etching) ทาให้ สามารถแยกเฟสเบนไนต์ แ ละมาร์ เ ทนไซต์ ไ ด้ ซึ่ ง จะ สามารถเห็นโครงสร้ างของเบนไนต์เป็ นสีฟ้า ส่วนมาร์เทน ไซต์เป็ นสีนา้ ตาล และออสเทนไนต์เป็ นสีขาว ดังรูปที่ 3 (จ-ช) ซึ่ ง จะเห็น ว่ า เมื่ อ ปริ ม าณคาร์ บ อนเพิ่ ม ขึ้ นเป็ น 0.3wt.% ปริมาณเฟสมาเทนไซต์ (สีนา้ ตาล) จะเพิ่มขึ้น เมื่อเทียบกับเหล็กกล้ าที่มีคาร์บอน 0.2wt.% รูปที่ 4 แสดงโครงสร้ างของเบนไนต์ ท่ี ก าลั ง ขยายสู ง จะเห็ น ลักษณะของเฟอร์ไรท์ท่มี รี ปู ร่างเป็ นแผ่นแหลมและโตเข้ า ไปในเกรนจากผลการทดลองสอดคล้ องกับงานวิจัยของ Yu ซึ่งได้ ศึกษา Astaloy CrM ที่เติมคาร์บอน 0.3 และ 0.4wt.% ที่อัตราการเย็นตัว 0.1-0.25°C/s พบว่ า โครงสร้ างจุ ล ภาคประกอบด้ ว ยเฟอร์ ไรท์แ ละเบนไนต์ และที่อัต ราการเย็น ตัว 2-5°C/s มี โ ครงสร้ า งเป็ น เบนไนต์และมาร์เทนไซต์

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

178

Cooling %C rate o ( C/s)

Nital 5%

Picral 5% และ Na2S2O510%

ข

ก PF

0.2

0.1

ค

ง PF

0.3

bainite

0.2

4.0

0.3

รูปที่ 3 ผลของคาร์บอนและอัตราการเย็นตัวต่อโครงสร้ างจุลภาคของ Astaloy CrM หลังการกัดด้ วยกรด 5% Nital และ Picral 5% และ Na2S2O510%

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ก

ข

ค

ง

179

รูปที่ 4 ภาพถ่ายด้ วยกล้ องจุลทรรศน์แสงและกล้ องจุลทรรศน์อเิ ล็กตรอนแบบส่องกราดของ Astaloy CrM ที่มีปริมาณคาร์บอน 0.3%C ที่อตั ราการเย็นตัวต่างกัน (ก-ข) 0.1°C/s (ค-ง) 4.0°C/s

2. การศึ ก ษาชนิ ดเฟสด้ว ยเทคนิ ค การเลี้ ยวเบน ของรังสีเอ็กซ์ จากผลการศึกษาด้ วย XRD พบว่าที่อตั ราการเย็น ตัว 0.1oC/s จะประกอบด้ วยพีคของเฟอร์ไรท์ท้งั หมด เมื่ออัตราการเย็นตัวเพิ่มขึ้นเป็ น 4.0oC/s จะพบเฟสของ เฟอร์ไรท์และออสเทนไนต์ตกค้ าง (รูปที่ 5) อย่ างไรก็ ตามไม่ พบพี คของซี เมนไตต์ และมาเทนไซท์ ทั้ง นี้อาจ

เนื่องมาจากเฟสทั้งสองมีปริมาณต่าจนไม่สามารถตรวจ พบด้ วยเทคนิคนี้ซ่งึ สอดคล้ องกับโครงสร้ างจุลภาคในรูป ที่ 3 ที่พบเฟสของเบนไนท์ (สีฟ้า) มากกว่ ามาเทนไซท์ (สีนา้ ตาล)การเกิดเฟสออสเทนไนต์ตกค้ างเมื่ออัตราการ เย็นตัวสูง เนื่องจากโครงสร้ างออสเทนไนต์ไม่ สามารถ เปลี่ยนเป็ นเฟอร์ไรท์เบนไนท์ หรือมาเทนไซท์ได้ ท้งั หมด ทาให้ ยังคงมีออสเทนไนต์ตกค้ าง

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

180

ก

ข

ค

ง

ออสเทนไนต์ เฟอร์ไรท์

รูปที่ 5รูปแบบการเลี้ยวเบนของรังสีเอ็กซ์ของAstaloyCrMที่ปริมาณคาร์บอนต่างกันและอัตราเย็นตัวต่างกัน (ก) 0.2wt.%C, 0.1oC/s (ข) 0.3wt.%C, 0.1oC/s (ค) 0.2wt.%C, 4.0oC/s (ง) 0.3wt.%C, 4.0oC/s

3. การทดสอบสมบัติทางกล รู ป ที่ 6 แสดงสมบั ติ ท างกลของเหล็ ก กล้ าที่ ปริ มาณคาร์ บอนและอัต ราการเย็น ตัว ต่ า งกัน จากการ ทดสอบความแข็งจุลภาคแบบวิกเกอร์และทดสอบแรงดึง พบว่ าที่อัตราการเย็นตัว 0.1OC/s เหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่เติมคาร์บอน 0.2% มีความแข็งความต้ านทาน แรงดึงสูงสุด (ultimate tensile strength) ความต้ านทาน แรงดึงจุดคราก (yield Strength) และเปอร์เซ็นต์การยืด ตัว (percent elongation) เป็ น 106.7 HV0.1, 205.3 MPa, 123.8 MPa และ 8.42% ตามลาดับ ส่วน เหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่เติมคาร์บอน 0.3wt.% มีค่า เป็ น 127.3 HV0.1, 565.5 MPa, 353.4 MPa และ 2.5% ตามล าดั บ เมื่ อ อั ต ราการเย็ น ตั ว เพิ่ ม ขึ้ นเป็ น 4.0OC/s เหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่เติมคาร์ บอน 0.2wt.% มีความแข็งความต้ านทานแรงดึงสูงสุด ความ ต้ านทานแรงดึงจุ ดคราก และเปอร์เซ็นต์การยืดตัว เป็ น 304.5 HV0.1, 470.4 MPa, 294.8 MPa , 2.4% ตามลาดับ ส่วนเหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่เติมคาร์บอน 0.3wt.% มีค่าเป็ น 436.1 HV0.1, 700.2 MPa,

374.5 MPa, 3.4% ตามลาดับ จากผลการทดลองจะ เห็ น ได้ ว่ า เมื่ อ ปริ ม าณคาร์ บ อนและอั ต ราการเย็น ตั ว เพิ่มขึ้นเหล็กกล้ าจะมีความแข็งและความต้ านทานแรงดึง เพิ่ มขึ้น ส่ว นเปอร์ เ ซ็น ต์การยื ด ตัว จะลดลง เนื่องจากมี โครงสร้ างเป็ นเบนไนต์ แ ละมาเทนไซท์ ท่ี แ ข็ ง ซึ่ ง สอดคล้ องกับงานวิจัยของ Sulowaski & Cias (2011; Moghaddamet al., 2012; Moghaddam & Solimanjad, 2013; Dobrzañski & Musztyfaga, 2009) จาก การศึกษาผิวรอยแตกหลังทดสอบแรงดึง พบว่าชิ้นงานมี ลั ก ษณะการแตกหั ก แบบเหนี ย วและแบบเปราะ โดย สังเกตจากลักษณะที่เป็ นหลุมหรือรอยบุ๋ม (dimple) ซึ่ง แสดงถึงพฤติกรรมการแตกแบบเหนียว ส่วนการแตก แบบเปราะจะมีลักษณะการแตกแบบผ่าเกรนที่มีผิวเรียบ เป็ นชั้นๆ (cleavage) แสดงดังรูปที่ 7 เมื่อปริมาณ คาร์บอนและอัตราการเย็นตัวเพิ่มขึ้นจะพบการแตกแบบ เปราะมากขึ้นเนื่องจากเหล็กกล้ ามีโครงสร้ างเป็ นเบนไนต์ และมาร์เทนไซต์ท่แี ข็งนอกจากนี้ยังพบรอยแตก (crack) ในชิ้นงานอีกด้ วย

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ก

ข

ค

ง

รูปที่ 6 ผลของคาร์บอนและอัตราการเย็นตัวต่อสมบัติทางกล (ก) ความแข็ง (ข) ความต้ านทานแรงดึงสูงสุด (ค) ความต้ านทานแรงดึงจุดคราก (ง) เปอร์เซ็นต์การยืดตัว

รูปที่ 7 ผิวรอยแตกหลังการทดสอบแรงดึง (ก) 0.2wt.%C, 0.1oC/s (ข) 0.3wt.%C, 0.1oC/s (ค) 0.2wt.%C, 4.0oC/s (ง) 0.3wt.%C, 4.0oC/s

181

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

182

สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ 1. เหล็กกล้ า Astaloy CrM ที่มีการเติมคาร์บอนใน ปริมาณ 0.2wt.% หลังการซินเตอริ่งและให้ อตั ราการเย็น ตัว 0.1oC/s มีโครงสร้ างจุลภาคเป็ น polygonal ferrite (PF) เมื่อเติมคาร์บอน 0.3wt.% จะมีโครงสร้ างเป็ น dual phase ซึ่งประกอบด้ วย PF และเบนไนต์ 2. เมื่ออัตราการเย็นตัวเพิ่ มขึ้นเป็ น 4.0oC/s จะมี โครงสร้ างเป็ นเบนไนต์มาร์เทนไซต์และออสเทนไนต์ตกค้ าง เหล็กกล้ าที่มีคาร์บอน 0.3wt.% จะมีปริมาณโครงสร้ างของ เบนไนต์ มาร์เทนไซต์และออสเทนไนต์ตกค้ างเพิ่มขึ้น 3. เมื่อปริมาณคาร์บอนและอัตราการเย็นตัวเพิ่มขึ้น ท าให้ ความแข็ ง และความต้ านทานแรงดึ ง เพิ่ ม ขึ้ น เนื่องจากการเกิดโครงสร้ างของเบนไนท์และมาเทนไซท์

Moghaddam, K. S., & Solimanjad, N.(2013). Effects of sinter hardening technology on homogeneous and heterogeneous microstructures. Powder Metallurgy, 56, 245-250. Dobrzañski, L. A. & Musztyfaga, M. (2009). Effect of cooling rates on sinter-hardened steels. Journal of Achievements in Materials and Manufacturing Engineering, 37/2, 630-638. Dobrzañski, L. A. & Musztyfaga, M. (2009). Influence of cooling rates on properties of prealloyed PM materials. Journal of Achievements in Materials and Manufacturing Engineering, 37/1, 28-35.

Dlapka, M., Danninger, H., Gierl, Ch., & Lindqvist, B. (2010). Sinter hardening Cr-Mo prealloyed steels with ผู้วิจัยขอขอบคุณโครงการทุนสถาบันบัณฑิตวิทยาศาสตร์ sufficient toughness. Powder Metallurgy Progress, 10, 20-31. และเทคโนโลยีไทย (TGIST) ศูนย์เทคโนโลยีโลหะและวัสดุ แห่ งชาติ (MTEC) และทุ นวิ จั ยจากงบประมาณรายได้ Sulowaski, M., & Cias, A. (2011). The effect of มหาวิทยาลัยนเรศวรประจาปี งบประมาณ 2559 ที่สนับสนุน sintering atmosphere on the structure and mechanical properties of sintered Fe-Mn-Cr-Mo-C structural ทุนวิจัยและเครื่องมือในการทาวิจัยในครั้งนี้ steels, Powder Metall. In Proceedings of an international conference held in Pune (pp. 123-131). India: Pune. เอกสารอ้างอิง กิตติกรรมประกาศ

Moghaddam, S., Farhangi, H., Ghambari, M., & Solimanjad, N. (2012). Effect of sinter hardening on mechanical properties of Astaloy CrM powder Lindberg, C., Johansson, B., & Maroli, B. (2000). metallurgy steel. Micro & Nano Letters, 7, 955–958. Mechanical properties of warm compacted Astaloy CrM, Euro PM. In Proceedings of an international conference Yu, Y. (2000). Thermodynamic and kinetic behaviours of Astaloy CrM. Powder Metallurgy held in Shrewsbury (pp. 1-8). UK: Shrewsbury. World Congress. In Proceedings of an international Höganäs, A. B. (2015). Handbook for Iron and conference held in Kyoto (pp. 9-11). Japan: Kyoto. Steel Powders: Hoganas Iron and Steel Powders for Translated Thai Reference Sintered Components. Sweden: Helsingborg. นภิสพร มีมงคล. (2548). โลหะกรรมวัสดุผง Powder Metallurgy. สงขลา: มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์. [1]

Lewenhagen, J. (2000). Chromium steel powders for components. Mater. Sci. Forum, 2000, 241-246.

Meemongkol, N. (2005). Powder Metallurgy. Songkhla: Songklanakarin University. [in Thai] [1]

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

183

การออกแบบตัวควบคุมพีไอดี+ฟัซซีสาหรับการหลบหลีกสิง่ กีดขวาง ของหุ่นยนต์เคลือ่ นที่ภายในอาคาร ไกรศักดิ์ โพธิ์ทองคา* และมนูศักดิ์ จานทอง

PID+Fuzzy Controller Design for Obstacle Avoidance of Indoor Mobile Robot Kraisak Phothongkum* and Manusak Janthong ภาควิชาวิศวกรรมเครื่องกล คณะวิศวกรรมศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี ธัญบุรี ปทุมธานี 12110 Department of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, Thanyaburi, Pathumthani 12110 * Corresponding author. E-mail address: kraisak_p@mail.rmutt.ac.th บทคัดย่อ บทความนี้นาเสนอการใช้ ตัวควบคุมฟัซซีลอจิกสาหรับควบคุมการเคลื่อนที่ของหุ่นยนต์ขับเคลื่อน 2 ล้ อ โดยเป็ นการนามาประยุกต์ใช้ งานร่วมกับการสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่ในระบบคาร์ทเี ชียนและตัวควบคุมพีไอดี เพื่อควบคุมให้ หุ่นยนต์เคลื่อนที่ตามเส้ นทางที่กาหนด ไว้ ไปยังตาแหน่งเป้ าหมายที่ต้องการพร้ อมทั้งสามารถหลบหลีกสิ่งกีดขวางได้ แบบอัตโนมัติ ซึ่งในงานนี้จะทาการทดสอบวิธีการควบคุมที่ จะนามาใช้ กับหุ่นยนต์เคลื่อนที่อัตโนมัติท่จี ะสามารถนามาใช้ ทดแทนการใช้ แรงงานมนุษย์ในการขนถ่ ายสิ่งของวัสดุภายในโรงงานหรือ คลังสินค้ าได้ โดยทาการจาลองการเคลื่อนที่ของหุ่นยนต์ด้วยโมเดลทางคณิตศาสตร์ของหุ่นยนต์เคลื่อนที่ท่มี ีรปู แบบการขับเคลื่อนแบบดิฟ เฟอเรนเชียลไดร์ฟด้ วยโปรแกรม MATLAB/Simulink ซึ่งจากผลการทดสอบจาลองการเคลื่อนที่ของหุ่นยนต์พบว่าตัวควบคุมฟั ซซี-พีไอ ดี สามารถควบคุมให้ หุ่นยนต์เคลื่อนที่ไปตามเส้ นทางที่กาหนดเพื่อไปยังตาแหน่งเป้ าหมายที่ต้องการได้ โดยตัวควบคุมฟัซซีลอจิกสามารถ สร้ างเส้นทางการเคลื่อนที่ใหม่เพื่อหลบหลีกสิ่งกีดขวางให้ กบั หุ่นยนต์ได้ ในกรณีท่หี ุ่นยนต์มีการตรวจพบสิ่งกีดขวางในเส้นทางการเคลื่อนที่ หลัก ซึ่งเมื่อหุ่นยนต์เคลื่อนที่ถึงตาแหน่งเป้ าหมายที่ต้องการแล้ วมีค่าความผิดพลาดของตาแหน่งระหว่างหุ่นยนต์กบั เป้ าหมายสูงสุดไม่เกิน 0.025 เมตร คาสาคัญ: หุ่นยนต์เคลื่อนที่ หลบหลีกสิ่งกีดขวาง ตัวควบคุมฟัซซีลอจิก Abstract This article presents the fuzzy logic controller used for motion control of 2-wheel mobile robot. The trajectory planning in cartesian space and PID controller is applied to track specified path toward a desired target point and to avoid the obstacle automatically. In this work, experimentations of the proposed algorithm for autonomous mobile robot can help to replace workers for material handling in factory or warehouse. Motion simulation using a mathematical model of differential drive mobile robot is performed by MATLAB/Simulink software. Simulation results show that the fuzzy-PID controller can control mobile robot to move along desired path toward the target, and then the fuzzy logic controller is able to generate a new path for mobile robot to avoid the obstacle when mobile robot detects the obstacle in original planned path and distance error when mobile robot reaches the target is less than 0.025 meters. Keywords: Mobile Robot, Obstacle Avoidance, Fuzzy Logic Controller

บทนา ในปั จ จุ บั น การขนย้ า ยสิ่ ง ของวั ส ดุ ภ ายในโรงงาน อุตสาหกรรมหรือภายในคลังสินค้ านั้น โดยส่วนมากแล้ ว

จะใช้ แรงงานมนุ ษย์ในการเข็นหรือลากเพื่อเคลื่อนย้ าย ซึ่งหากวัสดุน้นั มีนา้ หนักมากก็จาเป็ นต้ องใช้ แรงงานหลาย คน ทาให้ มีการสิ้นเปลืองแรงงานและค่าใช้ จ่ายที่สงู ขึ้น รวมทั้งอาจทาให้ พ้ ืนที่ปฏิบัติงานหรือการจราจรภายใน

184

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

โรงงานหรือคลังสินค้ านั้นติดขัดหรือเกิดความวุ่นวายได้ ซึ่งแนวทางหนึ่งในการแก้ ไขปั ญหาส่วนนี้กค็ ือการนาเอา หุ่ น ยนต์ เ คลื่ อ นที่ เ ข้ ามาช่ ว ยท างานแทนมนุ ษ ย์ เช่ น หุ่นยนต์เคลื่อนที่ติดตามเส้ นที่ได้ มีการกาหนดเส้ นทาง การเคลื่อ นที่ไว้ โดยการทาสีเ ส้ น ไว้ กับ พื้ นที่ต้ องการให้ หุ่ น ยนต์ เ คลื่ อ นที่ ไ ป ซึ่ ง หุ่ น ยนต์ ใ นลั ก ษณะนี้ อาจมี ข้ อจากัดในเรื่องของการตรวจรู้ส่งิ กีดขวางว่าเส้ นทางที่จะ เคลื่อนที่ไปนั้นมีส่งิ กีดขวางการเคลื่อนที่หรือไม่และอาจ ท าให้ เกิด อุ บั ติ เ หตุ ข้ ึ นได้ ด้ ว ยเหตุ น้ ี จึ ง มี แ นวคิ ด ที่จ ะ นาเอาหุ่นยนต์เคลื่อนที่แบบอัตโนมัติเข้ ามาทางานแทน รวมทั้งมีการควบคุมให้ สามารถหลบหลีกสิ่งกีดขวางได้ อัตโนมั ติ เพื่ อป้ องกันอุ บั ติ เหตุ ท่ีอาจเกิดขึ้ นจากสภาวะ แวดล้ อมที่ไม่ แน่ นอนภายในพื้ นที่ปฏิบติงานนั้นๆ ซึ่งใน พื้นที่ปฏิบัติงานนั้นต้ องมีการกาหนดพิกัดหรือตาแหน่ งที่ แน่นอนไว้ เพื่อใช้ ในการอ้ างอิงตาแหน่ งจากตัวของหุ่นยนต์ เพื่อไม่ให้ เกิดความผิดพลาดในการทางาน โดยมี ง านวิ จั ย จ านวนมากที่ เ กี่ย วข้ อ งกั บ หุ่ น ยนต์ เคลื่อนที่หลบหลีกสิ่งกีดขวาง ซึ่งส่วนใหญ่ แล้ วจะมีการ นาเอาแบบจาลองทางคณิตศาสตร์ของหุ่นยนต์ มาทาการ ทดสอบจ าลองการเคลื่ อ นที่ ด้ ว ยซอฟท์แ วร์ ก่ อ นเพื่ อ ทดสอบวิธกี ารหรืออัลกอริทมึ ที่จะนามาใช้ ในการควบคุม การเคลื่ อ นที่ ข องหุ่ น ยนต์ ในส่ ว นของแบบจ าลองที่ นามาใช้ ในการทดสอบจาลองการเคลื่อนที่ของหุ่นยนต์ นั้ น ป ร ะ ก อ บ ด้ ว ย แ บ บ จ า ล อ ง ท า ง จ ล น ศ า ส ต ร์ (Kinematics Model) (Lee, Lin, Lim, & Lee, 2009) และแบบจ าลองทางพลศาสตร์ (Dynamics Model) (Ali, Aldair, & Almousawi, 2014) ซึ่งจะมีความ แตกต่ างกัน โดยแบบจาลองทางพลศาสตร์น้ันจะมีการ นาเอาค่ามวล โมเมนต์และแรงต่างๆที่เกี่ยวข้ องกับตัว หุ่นยนต์เข้ ามาทาการคานวณด้ วย โดยจะทาให้ ผลลัพธ์ท่ี ได้ มีความไกล้ เคีย งกับการทางานจริงของหุ่ นยนต์มาก ยิ่งขึ้น เช่นวิธกี ารของลากรานจ์ (Lagrange’s approach) หรื อ วิ ธี ก ารของนิ ว ตั น -ออยเลอร์ (Newton-Euler’s approach) (Rached & Ahmad, 2013) ในส่วนของการ ควบคุมนั้นวิธกี ารหนึ่งที่นิยมนามาประยุกต์ใช้ กบั หุ่นยนต์ เคลื่อนที่คือตัวควบคุมฟั ซซีลอจิก ซึ่งจะมีหลักการคล้ าย กับวิธคี ดิ ของมนุษย์ ที่มคี วามซับซ้ อนหรือคลุมเครือ และ มีเสถียรภาพสูงอีกด้ วย (Xi & Byung-Jae, 2013) น าเสนอการประยุ กต์ใ ช้ ตัว ควบคุ มฟั ซ ซี ล อจิ กส าหรั บ

จาลองการเคลื่อนที่หลบหลีกสิ่งกีดขวางของหุ่นยนต์ โดย ใช้ แบบจาลองทางจลนศาสตร์ (Kinematics Model) โดย การสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่และควบคุมความเร็วล้ อ ขับเคลื่อนทั้ง 2 ข้ างเพื่อให้ หุ่นยนต์สามารถหลบหลีกสิ่ง กีดขวางไปยังต าแหน่ ง เป้ าหมาย (Faisal, Hedjar, Sulaiman & Mutib, 2013) นาเสนอการใช้ ฟัซซีลอจิก ส าหรั บ ควบคุ ม การเคลื่ อ นที่ ข องหุ่ น ยนต์ โ ดยท าการ ทดสอบกั บ หุ่ น ยนต์ จ ริ ง และมี ก ารติ ด ตั้ ง เซ็ น เซอร์ ตรวจจับสิ่งกีดขวางด้ วยอุลตร้ าโซนิค เพื่อตรวจรู้ระยะ ของสิ่งกีดขวางกับหุ่นยนต์และนาไปใช้ เป็ นอินพุตของตัว ควบคุมฟั ซซีลอจิกเพื่อควบคุมให้ หุ่นยนต์เคลื่อนที่หลบ หลีกสิ่งกีดขวางนั้นเพื่อไปยังตาแหน่งเป้ าหมายที่ต้องการได้ โดยบทความนี้ เป็ นการน าเสนอการประยุ กต์ใ ช้ ตัว ควบคุมฟั ซซีลอจิกร่วมกับการสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่ ในระบบคาร์ทเี ชียนเพื่อควบคุมให้ หุ่นยนต์คลื่อนที่ไปยัง ตาแหน่งเป้ าหมายที่ต้องการและสามารถหลบหลีกสิ่งกีด ขวางได้ แ บบอั ต โนมั ติ ซึ่ ง จะเป็ นทดสอบจ าลองการ เคลื่อนที่ของหุ่นยนต์จากแบบจาลองทางคณิตศาสตร์โดย ใช้ โปรแกรม MATLAB/Simulink วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์ 1. โ มเ ดล ทา ง คณิ ตศ า ส ต ร์ ข อง หุ่ น ย น ต์ คื อ แบบจาลองของตัวหุ่นยนต์ท่เี ขียนออกมาเป็ นสมการทาง คณิตศาสตร์ เพื่อใช้ ในการศึกษาพฤติกรรมหรือใช้ เพื่ อ การจาลองการทางานของหุ่นยนต์ก่อนที่จะทาการทดสอบ กับหุ่นยนต์จริง 1.1 Kinematics Model หรือแบบจาลองทาง จลนศาสตร์แสดงดังสมการที่ 1 โดยจากรูปที่ 1 แสดง ลักษณะของตัวหุ่นยนต์ขับเคลื่อนแบบดิฟเฟอเรนเชียล ไดร์ฟ (Differential Drive Mobile Robot) โดยประกอบ ไปด้ วยล้ อขับเคลื่อนด้ านหลัง 2 ล้ อ ที่เป็ นอิสระต่อกัน และล้ อตามด้ านหน้ า (Caster Wheel) เพื่อใช้ ในการ สมดุลตัวหุ่นยนต์ มีเฟรมที่สาคัญ 2 เฟรมคือ เฟรม อ้ างอิงหลักที่ไม่มกี ารเคลื่อนที่ (Initial Frame) ใช้ ในการ บอกต าแหน่ ง ของหุ่ น ยนต์ และเฟรมของตั ว หุ่ น ยนต์ (Robot Frame) ซึ่งจะมีการเคลื่อนที่หรือหมุนหันเหไป กับตัวหุ่นยนต์ด้วย มีจุดกาเนิดอยู่ระหว่ างล้ อ ขับเคลื่อน ทั้ง 2 ข้ าง โดยแกน x ชี้ไปทางด้ านหน้ าของตัวหุ่นยนต์

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

185

รูปที่ 1 ลักษณะแบบจาลองของหุ่นยนต์เคลื่อนที่แบบดิฟเฟอเรนเชียลไดร์ฟ x  v  cos( ) y  v  sin( )   

(1)

เมื่อ x คือตาแหน่งของหุ่นยนต์เมื่อเทียบกับแกน x ของเฟรมอ้ างอิง y คือตาแหน่งของหุ่นยนต์เมื่อเทียบกับแกน y ของเฟรมอ้ างอิง  คือมุมหันเหของหุ่นยนต์เมื่อวัดเทียบกับแกน x ของเฟรมอ้ างอิง ความเร็วเชิงเส้นของหุ่นยนต์ v คือ ความเร็วเชิงมุมของหุ่นยนต์  คือ จากสมการที่ 1 สามารถเขียนแบบจาลองทาง จลนศาสตร์ของหุ่นยนต์ท่เี ป็ นฟังก์ชันของความเร็วเชิงมุม

ล้ อขับเคลื่อนซ้ ายและขวาอยู่ในรูปแบบของเมทริกซ์ได้ เป็ น (Mishra, 2014)

 R  cos R  cos  x   R  sin  R  sin   y     1 R R   R          L L   L    2     2 0  R    L  0 2  

1.2 Dynamics Model หรือแบบจาลองทาง พลศาสตร์ ข องหุ่ น ยนต์ สามารถหาได้ จ ากสมการลาก รานจ์ (Lagrange’s Equation) ซึ่งจะทาการคานวณจาก

(2)

พลังงานจลน์ (Kinetic Energy) และพลังงานศักย์ (Potential Energy) ของระบบ โดยสมการลากรานจ์ แสดงดังสมการที่ 3 (Edouard, Toni, & Ivan, 2010)

d  L   L      Qi dt  qi   qi 

(3)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

186

L T V

โดยที่ เมื่อ L T V qi Qi

คือ คือ คือ คือ คือ

สมการลากรานจ์ (Lagrangian) พลังงานจลน์รวมของระบบ (Total Kinetic Energy) พลังงานศักย์รวมของระบบ (Total Potential Energy) ระบบพิกดั ที่สนใจ (Generalized Coordinate System) แรงในระบบพิกดั ที่สนใจ (Generalized Force)

โดยเมื่อทาการแทนค่าลงในสมการลากรานจ์แล้ ว จั ด รู ป ให้ อยู่ ใ นรู ป แบบของสมการแบบจ าลองทาง พลศาสตร์ของตัวหุ่นยนต์เคลื่อนที่ได้ ว่า M q     V q, q     B q   

โดยที่

(4)

  R2 R2 2 (mL2  I )   I w  2 (mL  I ) 2 4L 4L M (q)    2 R2  R (mL2  I ) I (mL2  I ) w  2 2 4L  4 L 

 0  V (q, q )   2  R m d c  2 L 1 0  B (q )    0 1 

 R2 mc d 2L   0 

,     ,

2. การสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่หลัก (Trajectory Planning in Cartesian Space) เป็ นส่วนที่ใช้ สร้ าง เส้ นทางการเคลื่อนที่หลักของหุ่นยนต์โดยจะเป็ นเส้ นทาง ระหว่ า งหุ่ น ยนต์ กับ เป้ าหมายในแนวตรง และไม่ ไ ด้

 L 

θ  η   R   θ L 

พิจารณาถึงสิ่งกีดขวางการเคลื่อนที่ โดยสมการที่นามา ประยุกต์ใช้ เป็ นของแขนกลหุ่นยนต์ใน 3 มิติ ซึ่งในกรณี ของหุ่นยนต์เคลื่อนที่จะพิจารณา 2 มิติคือบนระนาบ x, y เท่านั้น (Luca, 2008)

รูปที่ 2 การสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่หลัก (Trajectory Planning)

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

187

เริ่ ม จากท าการก าหนดต าแหน่ ง เริ่ ม ต้ นของ ตาแหน่ง (L) และคานวณหาระยะเวลาที่ใช้ ในการสร้ าง หุ่นยนต์ (Pi), ตาแหน่ งเป้ าหมายที่ต้องการ (Pf), เส้ นทางการเคลื่อนที่สาหรับช่วงการเร่ง (Ts) และเวลาที่ ความเร็วสูงสุด (Vmax) และความเร่ งสูงสุดที่ต้องการ ใช้ ท้งั หมด (T) (amax) จากนั้น ทาการคานวณหาระยะทางระหว่ าง 2 L  Pf  Pi

(5)

Vmax amax

(6)

Ts 

T

2 L  amax  Vmax amax  Vmax

(7)

จากนั้ น คานวณหาค่ า ระยะทางที่เพิ่ ม ขึ้น ซึ่ งเป็ น ฟังก์ชันของเวลา  โดยจะแบ่งออกเป็ น 3 ช่วงเวลาคือ ที่ t = 0 ถึง Ts , t = Ts ถึง T-Ts และ t = T-Ts ถึง T  t2  a max  2  2 Vmax  (t )   Vmax  t  2a max  2  V2  t T   Vmax  T  max   a max  2 a max 

สุ ด ท้ า ยหาค่ า สั ม ประสิ ท ธิ์ ข องอั ต ราการสร้ าง เส้ นทางการเคลื่อนที่ (S) และจะได้ สมการการสร้ าง S

; t  [Ts , T  Ts ]

(8)

; t  [T  Ts , T ]

เส้ นทางการเคลื่อนที่จากตาแหน่งเริ่มต้ นไปยังเป้ าหมาย เพื่อนาไปใช้ งานกับหุ่นยนต์แสดงดังสมการที่ 10  L

P( s)  Pi  S  ( Pf  Pi )

3. ตัวควบคุมฟัซซีลอจิก (Fuzzy Logic Controller) เป็ นศาสตร์ด้านการคานวณที่เข้ ามามีบทบาทสาคัญมาก ขึ้นในวงการวิจัย และได้ มกี ารนาไปประยุกต์ใช้ งานต่างๆ มากมาย ซึ่งฟั ซซีลอจิกนั้นเป็ นเครื่องมือที่เข้ ามาช่ วยใน การตัดสินใจภายใต้ ความไม่แน่ นอนของข้ อมูลโดยยอม ให้ มคี วามยืดหยุ่นได้ ซึ่งจะใช้ หลักการเหตุผลที่คล้ ายการ เลียนแบบวิธคี ดิ ของมนุษย์ (ประหยัด สุพะกา, 2553)

; t  [0, Ts ]

(9) (10)

3.1 Fuzzy Tracking (FT) ใช้ ในการควบคุมให้ หุ่ น ยนต์ เ คลื่ อ นที่ไ ปตามเส้ น ทางหลั ก ที่ก าหนดไว้ จ าก ตาแหน่งเริ่มต้ นไปยังเป้ าหมาย รับค่าอินพุต 2 ค่า คือ ความผิ ด พลาดของระยะทาง (Distance Error) ประกอบด้ วยตัวแปรทางภาษาคือ {Z, NZ, N, M, NF, F, VF} และความผิดพลาดของมุมหั นเห (Heading Error) ประกอบด้ วยตัวแปรทางภาษาคือ {N, SN,

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

188

NNZ, Z, NPZ, SP, P} โดยเมื่อประมวลผลแล้ วจะได้ เอ้ าท์พุตออกมาเป็ นความเร็วของล้ อขับเคลื่อนซ้ ายและ ตารางที่ 1 กฎในการควบคุมของ Fuzzy Tracking Angle Er. N SN Dis. Er. Z L=Z L=Z R=M R=NM NZ L=S L=S R=H R=NH N L=S L=S R=VH R=H M L=S L=S R=VH R=H NF L=S L=S R=VH R=H F L=S L=S R=VH R=H VF L=S L=S R=VH R=H

ขวา (VL, VR) ประกอบด้ วยตัวแปรทางภาษาคือ {Z, S, NM, M, NH, H, VH} แสดงดังรูปที่ 3

NNZ

NPZ

L=Z R=NM L=Z R=M L=S R=NH L=S R=H L=NM R=NH L=M R=NH L=NM R=NH

L=Z R=Z L=S R=S L=NM R=NM L=M R=M L=NH R=NH L=H R=H L=VH R=VH

L=NM R=Z L=M R=Z L=NH R=S L=H R=S L=NH R=NM L=NH R=M L=NH R=NM

L=NM R=Z L=NH R=S L=H R=S L=H R=S L=H R=S L=H R=S L=H R=S

L=M R=Z L=H R=S L=VH R=S L=VH R=S L=VH R=S L=VH R=S L=VH R=S

รูปที่ 3 ค่าฟังก์ชันความเป็ นสมาชิกของ Fuzzy Tracking (FT)

3.2 Fuzzy Avoidance (FA) ใช้ ในการควบคุม เพื่อสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่ใหม่ให้ กบั หุ่นยนต์ในการ หลบหลีกสิ่งกีดขวางเมื่อมีการตรวจพบสิ่งกีดขวางการ

เคลื่อนที่อยู่ รับค่าอินพุตระยะของสิ่งกีดขวางที่ตรวจพบ ได้ (Obstacle Distance) แบ่งออกเป็ น 3 ส่วนคือ ด้ า น ห น้ า , ด้ า น ซ้ า ย แ ล ะ ด้ า น ข ว า ข อ ง หุ่ น ย น ต์

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ประกอบด้ วยตัวแปรทางภาษาคือ {NEAR, MEDIUM, FAR} ซึ่งเมื่อประมวลผลแล้ วได้ เอ้ าท์พุตเป็ นความเร็ว ตารางที่ 2 กฎในการควบคุมของ Fuzzy Avoidance Obstacle Distance Front Right FAR FAR FAR FAR FAR NEAR fAR NEAR NEAR FAR NEAR FAR NEAR NEAR NEAR NEAR FAR FAR FAR MEDIUM FAR MEDIUM MEDIUM FAR MEDIUM FAR MEDIUM MEDIUM MEDIUM MEDIUM

189

ของล้ อขับเคลื่อนซ้ ายและขวา (VL, VR) แสดงดังรูป ที่ 4

Wheel Vel. Left FAR NEAR FAR NEAR FAR NEAR FAR NEAR MEDIUM FAR MEDIUM FAR MEDIUM FAR MEDIUM

Left Vel. P+ P+ SP+ NSP+ P+ SP+ NSP+ SP+ SP+ ZERO P+ SP+ ZERO

Right Vel. P+ SP+ P+ SP+ P+ SP+ P+ P+ SP+ SP+ SP+ SP+ SP+ P+ SP+

รูปที่ 4 ค่าฟังก์ชันความเป็ นสมาชิกของ Fuzzy Avoidance (FA)

3.3 Fuzzy-PID (FPID) ใช้ ใ นการเพิ่ ม ประสิทธิภาพตัวควบคุมพีไอดี (PID Controller) ในการ ควบคุมหุ่ นยนต์ให้ เคลื่อนที่ไปตามเส้ นทางที่กาหนดได้ อย่างถูกต้ องมากขึ้น โดยจะมีการนาเอาค่าความผิดพลาด (Error) ของระบบมาคานวณ ซึ่งหากระบบมีค่าความ ผิดพลาดที่เปลี่ยนไปจะมีการปรับค่าเกนให้ โดยอัตโนมัติ เพื่ อความเหมาะสมในการควบคุ มระบบในขณะนั้ น ๆ

โดยบล็อกไดอะแกรมการควบคุม แสดงดังรูปที่ 5 รับค่า อินพุต 2 ค่า คือ ความผิดพลาด (Error) ประกอบด้ วย ตัวแปรทางภาษา {NB, NM, NS, ZE PS, PM, PB} และอัต ราการเปลี่ ยนแปลงของความผิดพลาด (Delta Error) ประกอบด้ วยตัวแปรทางภาษา {NB, NM, NS, ZE PS, PM, PB} แสดงดังรูปที่ 6

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

190

รูปที่ 5 บล็อกไดอะแกรมตัวควบคุม Fuzzy-PID ตารางที่ 3 กฎในการควบคุมของ Fuzzy-PID Error Kp Delta-Error NB NM Ki Kd P Z NB N P P Z P P NM N Z P Z P P NS N N P P P P ZE N N P P P P PS N N P P P P PM N Z P Z P Z PB N P P Z

N P N Z P Z Z Z Z P N P Z Z Z Z P Z N P N

N N N N P N N P N Z Z Z N P N N P N N P N

N P N Z P Z Z Z Z P N P Z Z Z Z P Z P N P

Z P Z P Z Z P N P P N P P N P P Z Z Z P Z

P N P P N P P N P P N P P N P P N P P N P

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูปที่ 6 ค่าฟังก์ชันความเป็ นสมาชิกของ Fuzzy-PID (FPID)

4. การควบคุมการทางานของหุ่นยนต์

รูปที่ 7 ไดอะแกรมการควบคุมจาลองการทางานของหุ่นยนต์เคลื่อนที่หลบหลีกสิ่งกีดขวาง

รูปที่ 8 ซอฟท์แวร์ MATLAB/Simulink ที่ใช้ ในการควบคุมการทางาน

191

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

192

ผลการศึกษา ในส่วนของการทดสอบจาลองการเคลื่อนที่ของ หุ่นยนต์จะใช้ ซอฟท์แวร์ MATLAB/Simulink โดยได้ ทา การออกแบบโปรแกรมแสดงดังรูปที่ 8 ซึ่งการทดสอบ จาลองการเคลื่อนที่แบ่งออกเป็ น 2 การทดสอบคือ การ

จาลองเคลื่อนที่ไปยังเป้ าหมายโดยไม่ มีส่งิ กีดขวางการ เคลื่อนที่ เริ่มต้ นที่ตาแหน่ ง (0, 0) เคลื่อนที่ไปยัง เป้ าหมายที่ตาแหน่ง (8, 0) และกรณีท่มี ีส่งิ กีดขวางการ เคลื่อนที่รวมอยู่ด้วย เริ่มต้ นที่ตาแหน่ง (0, 0) เคลื่อนที่ ไปยังเป้ าหมายที่ตาแหน่ ง (8, 0) มีส่ิงกีดขวางการ เคลื่อนที่ 2 ชิ้นที่ตาแหน่ง (2, 1) และ (5, 0)

รูปที่ 9 ผลการทดสอบจาลองการเคลื่อนที่ของหุ่นยนต์กรณีไม่มีส่งิ กีดขวาง

รูปที่ 10 ตาแหน่งของหุ่นยนต์และค่าความผิดพลาดของหุ่นยนต์กบั เป้ าหมายเทียบกับเวลากรณีไม่มีส่งิ กีดขวาง

รูปที่ 11 ผลการทดสอบจาลองการเคลื่อนที่ของหุ่นยนต์กรณีมีส่งิ กีดขวาง 2 ชิ้น

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

193

รูปที่ 12 ตาแหน่งของหุ่นยนต์และค่าความผิดพลาดของหุ่นยนต์กบั เป้ าหมายเทียบกับเวลากรณีมีส่งิ กีดขวาง

(Distance Error) เทียบกับเวลา ซึ่งจะค่ อยๆลดลงเมื่อ เคลื่อนที่เข้ าใกล้ เป้ าหมายที่ต้องการซึ่งมีค่าไม่เกิน 0.025 จากรูปที่ 9 แสดงผลการทดสอบจาลองการเคลื่อนที่ เมตร ของหุ่ น ยนต์ แ บบไม่ มี ส่ิ ง กี ด ขวางการเคลื่ อ นที่ ไ ปยั ง สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ ตาแหน่ งเป้ าหมาย โดยแสดงเป็ นเส้ นทางการเคลื่อนที่ หลัก (Trajectory), เส้ นทางที่ได้ จาก Kinematics Model บทความนี้นาเสนอการประยุ กต์ใช้ ตัวควบคุ มฟั ซ ซี (Desired) และเส้ นทางการเคลื่อนที่จริงของหุ่ นยนต์ ลอจิกและการสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่ในระบบคาร์ที (Actual) โดยรูปที่ 10 แสดงตาแหน่ งของการสร้ าง เชียน กับหุ่นยนต์เคลื่อนที่ 2 ล้ อ โดยเป็ นการจาลองการ เส้ นทางการเคลื่อนที่จากตัวควบคุมและตาแหน่ งของตัว ทางานเสมือนหุ่นยนต์เคลื่อนที่ขนย้ ายวัสดุภายในโรงงาน หุ่นยนต์บนแกน x และ y เทียบกับเวลาที่เคลื่อนที่จาก หรื อคลั ง สิน ค้ า ต่ า งๆ แทนการใช้ ง านแรงงานคนหรื อ ตาแหน่ งเริ่มต้ นไปยังเป้ าหมายที่ต้องการ และค่าความ หุ่ น ยนต์เ คลื่อ นที่แ บบติด ตามเส้ นที่พ้ ื น ซึ่ ง ไม่ ส ามารถ ผิดพลาดตาแหน่ งของหุ่ นยนต์กับเส้ นทางการเคลื่อนที่ ตรวจรู้ หรื อ หลบหลี ก สิ่ ง กี ด ขวางได้ โดยจะเป็ นการ (Distance Error) เทียบกับเวลา ซึ่งจะค่อยๆลดลงเมื่อ ควบคุ มให้ หุ่ นยนต์ เ คลื่ อ นที่ไปยั งต าแหน่ ง เป้ าหมายที่ เคลื่อนที่เข้ าใกล้ เป้ าหมายที่ต้องการซึ่งมีค่าไม่เกิน 0.025 ต้ องการพร้ อมทั้งสามารถหลบหลีกสิ่ง กีดขวางได้ แบบ เมตร อัตโนมัติ และทาการจาลองการเคลื่อนที่ของหุ่นยนต์ด้วย จากรู ป ที่ 11 แสดงผลการทดสอบจ าลองการ โปรแกรม MATLAB/Simulink ในสภาวะที่มีและไม่มี เคลื่ อ นที่ข องหุ่ น ยนต์ แ บบมี ส่ิง กีด ขวางการเคลื่ อ นที่ สิ่งกีดขวางการเคลื่อนที่ ซึ่งจากผลการทดสอบจาลองการ รวมอยู่ด้วยเพื่อไปยังตาแหน่ งเป้ าหมาย โดยแสดงเป็ น เคลื่อนที่พบว่ า ตัวสร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่และตัว เส้ นทางการเคลื่อนที่หลัก (Trajectory), เส้ นทางที่ได้ จาก ควบคุ ม ฟั ซ ซี ล อจิ ก ที่ ไ ด้ ท าการออกแบบไว้ สามารถ Kinematics Model (Desired) และเส้ นทางการเคลื่อนที่ ควบคุมให้ หุ่นยนต์เคลื่อนที่ไปตามเส้ นทางที่สร้ างขึ้นเพื่อ จริงของหุ่นยนต์ (Actual) ซึ่งเมื่อมีการตรวจพบสิ่งกีด ไปยังตาแหน่งเป้ าหมายที่ต้องการได้ และกรณีท่มี ีการตรวจ ขวางจะมีการสร้ างเส้ นทางใหม่เพื่อให้ หุ่นยนต์เคลื่อนที่ พบสิ่งกีดขวางหุ่นยนต์กส็ ามารถหลบหลีกและเคลื่อนที่ผ่าน ตามเพื่อหลบหลีก โดยรูปที่ 12 แสดงตาแหน่งของการ ไปยังเป้ าหมายที่ต้องการได้ เช่นกัน โดยมีค่าความผิดพลาด สร้ างเส้ นทางการเคลื่อนที่จากตัวควบคุมและตาแหน่งของ ของตาแหน่ งระหว่ างหุ่ นยนต์กับเป้ าหมายไม่ เกิน 0.025 ตัวหุ่นยนต์บนแกน x และ y เทียบกับเวลาที่เคลื่อนที่จาก เมตร ต าแหน่ งเริ่ มต้ นไปยั งเป้ าหมายที่ต้ องการ และค่ าความ สาหรับการพัฒนาต่อไปควรมีการทดสอบจาลองกับ ผิดพลาดต าแหน่ งของหุ่ นยนต์ กับเส้ นทางการเคลื่ อนที่ กลุ่มของหุ่นยนต์เคลื่อนที่หลายๆตัว ทางานพร้ อมกันใน อภิปรายผลการศึกษา

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

194

สภาวะแวดล้ อ มเดีย วกัน เพื่ อ ให้ เหมื อนกับ สภาพการ Faisal, M., Hedjar, R., Al Sulaiman, M., & Alทางานจริง และควรมีการทดสอบหลบหลีก สิ่งกีดขวางที่ Mutib, K. (2013). Fuzzy Logic Navigation and กาลังมีการเคลื่อนที่ด้วย Obstacle voidance by a Mobile Robot in an Unknown Dynamic Environment. Advanced Robotics Systems, 10, 1-7. กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณมหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุ รี ที่ได้ สนับสนุนทุนในการดาเนินการวิจัยในครั้งนี้ เอกสารอ้างอิง

Lee, J. H., Lin, C., Lim, H., & Lee, J. M. (2009). Sliding Mode Control for Trajectory Tracking of Mobile Robot in the RFID Sensor Space. Control, Automation and Systems, 7, 429-435. DOI 10.1007/s12555-009-0312-7.

ประหยัด สุพะกา. (2553). Fuzzy Logic. สืบค้ นจาก Mishra, E. A. (2014). Trajectory Tracking of http://alaska.reru.ac.th/text/fuzzylogic.pdf [1] Differential Drive Wheeled Mobile Robot. Luca, A. D. (2008). Trajectory Planning in Mechanical Engineering and Robotics (IJMER), 2, Cartesian space. Retrieved from http://www.diag. 28-31. uniroma1.it/~deluca/rob1_en/14_TrajectoryPlanning Rached, D., & Ahmad A. H. (2013). Dynamic Cartesian.pdf Modelling of Differential-Drive Mobile Robots using Ali, R. S., Aldair, A. A., & Almousawi, A. K. Lagrange and Newton-Euler Methodologies: A (2014). Design an Optimal PID Controller using Unified Framework. Advances in Robotics & Artificial Bee Colony and Genetic Algorithm for Automation, 2, 2-7. DOI.org/10.4172/2168Autonomous Mobile Robot. Computer Applications, 9695.1000107 100(16), 8-16. Xi, L., & Byung-Jae, C. (2013). Design of Obstacle Avoidance System for Mobile Robot using Edouard, I., Toni, P., & Ivan, P. (2010). Fuzzy Logic Systems. Smart Home, 7(3), 321MODELLING OF MOBILE ROBOT DYNAMICS. In 328. Proceeding of the 7th EUROSIM Congress on Modelling and Simulation in Czech (6-10 Translated Thai Reference September 2010). N.P.: n.p. Supakum, P. (2010). Fuzzy Logic. Retrieved from http://alaska.reru.ac.th/text/fuzzyl ogic.pdf [in Thai] [1]

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

195

คุณสมบัติทางเคมีและชีวภาพของสารสกัด lignin และประสิทธิภาพทางพลังงานของ กากอ้อยทีเ่ หลือหลังจากการสกัดแยก lignin ด้วยกรดและด่าง ชุติมา บุญเรืองรอด1, ศิริลักษณ์ เลี้ยงประยูร2* และสุมัลลิกา โมรากุล1

Chemical and Biological Characteristics of Lignin and Energy Efficiency of Acid and Alkali Delignified Bagasse Chutima Boonruangrod1, Siriluck Liengprayoon2* and Sumallika Morakul1 1

ภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพ คณะอุตสาหกรรมเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ กรุงเทพมหานคร 10900 สถาบันค้ นคว้ าและพัฒนาผลิตผลทางการเกษตรและอุตสาหกรรมเกษตร อุตสาหกรรมเกษตรอาคาร 3 ชั้น 7 มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ เขตจตุจกั ร กรุงเทพฯ 10900 1 Department of Biotechnology, Faculty of Agro-Industry, Kasetsart University, Chatuchak, Bangkok, Thailand 10900 2 Kasetsart Agricultural and Agro-Industrial Product Improvement Institute (KAPI), Kasetsart University, Chatuchak, Bangkok, Thailand 10900 * Corresponding author. E-mail address: aapsrl@ku.ac.th บทคัดย่อ ผลผลิตพลอยได้ หลักจากอุตสาหกรรมนา้ ตาลได้ แก่ กากอ้ อย ซึ่งมีปริมาณมหาศาลในแต่ละปี และถูกนามาใช้ ประโยชน์หลักในการ ผลิตเชื้อเพลิงหมุนเวียนในกระบวนการผลิตนา้ ตาล งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสกัด lignin จากกากอ้ อยด้ วยกรดและด่าง จากนั้นศึกษา คุณสมบัติของสารสกัดที่ได้ และประสิทธิภาพทางพลังงานของกากอ้ อยที่เหลือเพื่อเป็ นแนวทางในการนาไปใช้ ประโยชน์และเพิ่มมูลค่ า ให้ กบั ผลผลิตพลอยได้ จากอุตสาหกรรมนา้ ตาล เนื่องจาก lignin นับเป็ น polymer ที่มีปริมาณมากเป็ นอันดับสองรองจาก cellulose และ มีโครงสร้ างทางเคมีท่มี ีศกั ยภาพในการนามาใช้ ประโยชน์ท่หี ลากหลาย จากการศึกษาผลได้ การสกัดรวมถึงคุณสมบัติของ lignin จากกาก อ้ อยที่อายุต่างกัน โครงสร้ างทางเคมี (FTIR) และคุณสมบัติทางชีวภาพ (antioxidant activity, antimicrobial activity) พบว่าผลได้ การ สกัดแตกต่างกันไปตามสภาวะการสกัด (1%NaOH และ formic acid: acetic acid: H2O, 30:55:15, v/v/v) สัดส่วนของ solid: liquid ratio (1:6 และ 1:12) อายุของกากอ้ อย (หลังหีบ 1 วัน, 10-12 เดือน) รวมถึงการ pretreatment (±steam explosion) โดยกากอ้ อยเก่า สามารถสกัด lignin ได้ โดยไม่ผ่านการระเบิดด้ วยไอนา้ และให้ ผลได้ สงู สุดเท่ากับ 26% ในขณะที่กากอ้ อยใหม่ จาเป็ นต้ องนามาผ่านการ ระเบิดด้ วยไอนา้ โดยได้ ผลได้ สงู สุด 22% ตัวทาละลายที่ให้ ผลดีท่สี ดุ คือ 1%NaOH อัตราส่วน 1:12 อย่างไรก็ตาม lignin จากกากอ้ อยเก่า มีคุณสมบัติในการต้ านอนุมูลอิสระต่ากว่าในกากอ้ อยใหม่เล็กน้ อยซึ่งอาจเนื่องมาจากการเกิด oxidation ของ lignin บางส่วนในสภาวะการ เก็บรักษากากอ้ อยภายนอกอาคารของโรงงาน นอกจากนี้ยังพบว่าสารสกัด lignin ที่ความเข้ มข้ นต่ าสุดที่ 1250 µg/ml (MIC) สามารถ ยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรียแกรมลบ (E. coli, S. typhimurium & V. cholera) ได้ ดีกว่าแกรมบวก (S. aureus) นอกจากนี้กากอ้ อย ที่ผ่านการสกัดแล้ วสามารถนากลับมาใช้ ผลิตไฟฟ้ าต่อได้ โดยให้ ค่าพลังงานความร้ อนลดลงประมาณ 5-19% เมื่อเทียบกับกากอ้ อยที่ยัง ไม่ผ่านการสกัด 2

คาสาคัญ: lignin อุตสาหกรรมนา้ ตาล สารต้ านอนุมูลอิสระ การสกัด lignin ด้ วยกรด การสกัด lignin ด้ วยด่าง Abstract Large amount of sugar industrial by products mainly bagasse is generated annually and mostly used to produce energy for sugar industry itself. The present work aims at extracting lignin from bagasse using acid and alkali delignification methods. The obtained lignin was characterized for its chemical and biological characteristics including the energy efficiency of delignified bagasse. Indeed, lignin becomes more attractive due to its second largest amount compared to cellulose. Moreover, its chemical structures indicate high potential to be developed for various applications. From extraction process, yield of extracted lignin was varied according to extracting media (1%NaOH and formic acid: acetic acid: H2O, 30:55:15, v/v/v), solid: liquid ratio (1:6 and 1:12), state of obtained bagasse (1 day and 12 day after juice extraction) and pretreatment process (steam explosion).

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

196

Extraction of twelve month stored bagasse under alkali condition without pretreatment provided the highest yield of 22%. Meanwhile, pretreatment for new bagasse seems necessary in order to improve extraction efficiency when using 1%NaOH at 1:12 ratio. In addition, lignin obtained from twelve month bagasse provided poorer antioxidant activity assessed by DPPH compared to that from new bagasse. This could be due to partial oxidation of lignin under outdoor storage condition of bagasse. Concerning antimicrobial activity, all lignin obtained from all extraction conditions at the concentration of 1,250 µg/ml (Minimum Inhibitory Concentration; MIC) could inhibit microbial growth. The better inhibition was observed in gram negative bacteria (E. coli, S. typhimurium and V. cholera) than gram positive bacteria (S. aureus). In addition, delignified bagasse could be reutilized as an energy source with slight reduction of heat building capacity around 5 - 19% compared to normal bagasse. Keywords: Lignin, Sugar Industry, Antioxidant, Acid delignification, Alkali delignification

หมุน เวี ยนได้ (renewable feedstock) โดยชีว มวล (biomass) จัดเป็ นวัสดุหมุนเวียนชนิดหนึ่งที่มีศักยภาพ ในแต่ ล ะปี อุ ต สาหกรรมน้า ตาลในประเทศไทยมี เพียงพอต่อความต้ องการทางด้ านวัสดุและพลังงานของ ปริมาณอ้ อยเข้ าหีบจานวนมาก ซึ่ง จากข้ อมูลรายงานการ มนุ ษ ย์ ใ นอนาคต ซึ่ ง ชี ว มวลจากพื ช จะประกอบด้ ว ย ผลิตนา้ ตาลทรายของโรงงานทั่วประเทศประจาปี การผลิต โครงสร้ างต่างๆ เช่น เซลลูโลส (cellulose) เฮมิเซลลูโลส 2557/58 (ฉบับปิ ดหีบอ้ อย) พบว่ามีปริมาณอ้ อยเข้ า (hemicellulose) ลิกนิน (lignin) และสารเมตาบอไลต์ หีบทั้งหมดประมาณ 105.96 ล้ านตัน (รายงานการผลิต ต่างๆ มากมาย โดย lignin เป็ น aromatic polymer ที่พบ นา้ ตาลทรายของโรงงานนา้ ตาลทั่วประเทศประจาปี การ มากที่สดุ ในโลก มีโครงสร้ างพื้นฐานเป็ น phenylpropane ผลิต 2557/58 (ฉบับปิ ดหีบอ้ อย), 2015) ส่งผลให้ มี และมีโมเลกุลที่ซับซ้ อนมากทาหน้ าที่ยึดเกาะเส้ นใยเข้ า ปริ มาณผลผลิ ต พลอยได้ จ านวนมหาศาลจากโรงงาน ด้ วยกัน อีกทั้งยังเป็ นเสมือนเกราะป้ องกันการทาลายจาก นา้ ตาลเกิดขึ้นซึ่งถูกนามาใช้ ประโยชน์หลากหลายรูปแบบ จุลินทรีย์ ส่งผลทาให้ แยก lignin ออกได้ ยาก ในการผลิต โดยเฉพาะกากอ้ อยซึ่งมีประมาณ 18 ล้ านตัน ซึ่งส่วน เยื่อกระดาษโดยส่ว นใหญ่ จึง ใช้ Sodium Hydroxide ใหญ่ มีการนากลับมาใช้ เป็ นพลั งงานหมุ นเวี ยนภายใน (NaOH) หรือโซดาไฟในการต้ มภายใต้ ความดันและ โรงงาน (del Rí o et al., 2015) และ/หรือใช้ ใน อุณหภูมิสงู เพื่อให้ สามารถแยก lignin ได้ และนาเส้ นใย อุตสาหกรรมเยื่อกระดาษ (Sena-Martins, Almeida- ไปใช้ ป ระโยชน์ จากนั้ น lignin จะถู กแยกออกจาก Vara, & Duarte, 2008) กากหม้ อกรองถูกนาไปใช้ เป็ น โซดาไฟเพื่อนาโซดาไฟกลับไปใช้ ใหม่ โดย lignin จะถูก ปุ๋ ย (Meunchang, Panichsakpatana, & Weaver, 2005) นาไปใช้ ประโยชน์ในรูปแบบที่ไม่ซับซ้ อนและมีมูลค่าต่า รวมไปถึงการนากากน้าตาลไปใช้ ในการผลิตเอทานอล เช่น ใช้ เป็ นเชื้อเพลิงในการเผาไหม้ (Arshad & Ahmed, ปั จจุ บันมีงานวิจัยจานวนมากพยายามเพิ่มประสิทธิภาพ 2016) สารเชื่อมเนื้อไม้ (Ghaffar & Fan, 2014) และ และมู ล ค่ า จากการน าผลผลิ ต พลอยได้ ดั ง กล่ า วไปใช้ ยางมะตอยธรรมชาติ เป็ นต้ น อย่างไรก็ตามหากพิจารณา ประโยชน์ในด้ านอื่นๆ นอกเหนือจากการใช้ ประโยชน์ใน การนา lignin มาใช้ ประโยชน์กระบวนการดังกล่าวซึ่งเป็ น ปั จจุบัน การสารวจหาสารที่มีมูลค่าสูงที่สามารถนาไปใช้ สภาวะที่รุนแรงทาให้ lignin ถูกดัดแปลงโครงสร้ างมาก เป็ นสารตั้ ง ต้ น ในอุ ต สาหกรรมชนิ ด อื่น ๆ นั บ เป็ นอี ก ขึ้น รวมถึงแนวโน้ มงานวิจัยในปั จจุ บันที่พบว่า lignin มี แนวทางที่ส ามารถช่ ว ยเพิ่ ม มู ล ค่ า ให้ กั บ ผลพลอยได้ ศักยภาพในการนามาพั ฒนาเพื่อใช้ ประโยชน์ได้ อีก ใน เหล่ านั้น รวมไปถึงเป็ นการช่ วยเพิ่ มมูลค่าโดยรวมของ งานวิจัยนี้จึงได้ ทาการทดลองสกัด lignin จากกากอ้ อย ด้ วยสภาวะที่ ไ ม่ รุ น แรงเนื่ องจากต้ องการลดการ อุตสาหกรรมนา้ ตาลอีกด้ วย จากแนวคิดของระบบโรงกลั่นชีวภาพ (biorefinery) เปลี่ยนแปลงโครงสร้ างที่อาจเกิดขึ้นของ lignin รวมถึง ที่ต้องการลดสภาวะการขาดแคลนวัสดุเชื้อเพลิงในระบบ เพื่อช่วยลดปั ญหาสิ่งแวดล้ อม โดยเปรียบเทียบระหว่ าง โรงกลั่นปิ โตรเคมี โดยเฉพาะนา้ มันดิบและฟอสซิลต่างๆ การใช้ กรด (formic acid: acetic acid: H2O, 30: 55: จึ ง ได้ หั น มาใช้ วั ส ดุ ท างเลื อ กที่ ส ามารถใช้ ประโยชน์ 15 (v/v/v)) และด่าง (1% NaOH) ตามงานวิจัยของ บทนา

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

197

Delmas (2011) และ Zabaleta (2012) ตามลาดับ ของกากอ้ อยที่เหลือจากการสกัด เพื่อนากลับมาเผาเป็ น จากนั้นศึกษาคุณสมบัตทิ างเคมีและชีวภาพของ lignin ที่ พลังงานหมุนเวียนต่อไป สกัดได้ จากกากอ้ อย และตรวจสอบค่าพลังงานความร้ อน วิธีการศึกษาและวัสดุอุปกรณ์

Bagasse

Pretreatment (steam explosion)

Acid/Alkali Delignification

Lignin precipitation

Lignin

รูปที่ 1 ขั้นตอนโดยรวมของการศึกษาคุณสมบัติต่างๆ ของสารสกัด lignin จากกากอ้อย

1. ตัวอย่างกากอ้ อย ตัวอย่ างกากอ้ อยแบ่ง เป็ นสองกลุ่ม คือ ตัวอย่ าง กากอ้ อยใหม่ท่เี ก็บหลังการหีบ 1 วันและกากอ้ อยเก่าอายุ 12 เดือน กากอ้ อยทั้งสองชนิดได้ รับความอนุเคราะห์จาก โรงงานรวมเกษตรกรอุตสาหกรรม (99 หมู่ 10 ต.โคก สะอาด อ.ภูเขียว จ.ชัยภูมิ 36110) หลังการเก็บตัวอย่าง กากอ้ อยจะถูกนามาอบแห้ งโดยใช้ ต้ อู บลมร้ อน (RF115 (230V), Art. No. 9090-0009, Redline, Germany)

ที่อุณหภูมิ 40°C ใช้ เวลาประมาณ 4 วัน จนกระทั่งกาก อ้ อยมีความชื้น (moisture) ประมาณ 20% หาความชื้น โดยนาถ้ วยไปอบที่ 105°C เป็ นเวลา 30 นาที ชั่งนา้ หนัก แล้ วใส่ตัวอย่ างประมาณ 5 กรัม จากนั้นนาไปอบที่ 105°C นาน 2 ชั่วโมง ชั่งน้าหนักแล้ วนาไปอบต่ อจน น้ า หนั ก ของตั ว อย่ า งคงที่ (ตามมาตรฐาน ASTM D3173) คานวณผลตามสมการ (1)

M = (W1 - W2) / W × 100

(1)

M = ร้ อยละของปริมาณความชื้น (%moisture) W1 = นา้ หนักถ้ วยและตัวอย่างก่อนอบ (กรัม) W2 = นา้ หนักถ้ วยและตัวอย่างหลังอบ (กรัม) W = นา้ หนักตัวอย่าง (กรัม) 1. การระเบิดด้ วยไอนา้ (Steam explosion) นากากอ้ อย 100 กรัม มาผ่ านกระบวนการ ระเบิดด้ วยไอนา้ ตามวิธกี ารของ (Cara et al., 2008) ด้ วยเครื่องระเบิดเยื่อ (Nitto Koatsu, Japan) ที่อุณหภูมิ 210°C ความดัน 1.3 MPa เป็ นเวลา 4 นาที จากนั้นล้ าง ด้ วยนา้ จนสะอาด ก่อนนาไปสกัด lignin 2. การสกัด lignin (Delignification) ทาการสกัดกากอ้ อยในสภาวะที่เป็ นกรดและ ด่างดังนี้ สภาวะกรดใช้ สารผสม formic acid: acetic

acid: H2O (30:55:15 v/v/v) ที่ solid-liquid ratio เท่ากับ 1:6 และ 1:12 (w/v) (Delmas, 2011) หลังจาก autoclave ที่อุณหภูมิ 110°C เป็ นเวลา 3 ชั่วโมง (Tomy SX-700 Vertical Autoclave, TOMY Digital Biology, Japan) กรองกากอ้ อยออกก่อน ตกตะกอน lignin ด้ วยนา้ กลั่น จากนั้นกรอง lignin ผ่าน กระดาษกรอง Whatman No.1 ก่อนนาไปอบที่อุณหภูมิ 50°C เป็ นเวลา 6 ชั่วโมง

198

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

การสกั ด ในสภาวะด่ า งใช้ สารละลาย 1% NaOH ที่ solid-liquid ratio เท่ากับ 1:6 และ 1:12 (w/v) (Zabaleta, 2012) หลังจาก autoclave ที่ อุณหภูมิ 110°C เป็ นเวลา 1 ชั่วโมง (Tomy SX-700 Vertical Autoclave, TOMY Digital Biology, Japan) กรองกากอ้ อยออกก่อนตกตะกอน lignin โดยการปรับ pH ของสารสกัด ให้ เท่ากับ 2 ด้ วยสารละลาย 50% H2SO4 จากนั้ น กรอง lignin ผ่ า นกระดาษกรอง Whatman No.1 ก่อนนาไปอบที่อณ ุ หภูมิ 50°C เป็ นเวลา 6 ชั่วโมง เปรียบเทียบผลได้ การสกัดของกากอ้ อยที่ผ่าน และไม่ผ่านการระเบิดด้ วยไอนา้ 3. การวิเคราะห์ค่าพลังงานความร้ อน น ากากอ้ อ ยที่ผ่ า นและไม่ ผ่ า นกระบวนการ สกัดมาวิเคราะห์ค่าพลังงานความร้ อน (Gross Calorific Valve) ด้ วยเครื่อง Bomb Calorimeter (IKA C-5000 Automated Bomb Calorimeter, IKA Laboratory Equipment, Germany) ตามวิ ธีก ารทดสอบของ มาตรฐาน ASTM D5865 4. การวิเคราะห์ ปริมาณฟี นอลิกทั้งหมด (total phenolic content) ทาการวิเคราะห์ TPC ด้ วย Folin-Ciocalteu colorimetric method ตามวิธกี ารของ (Wolfe, Wu, & Liu, 2003) โดยใช้ gallic acid ความเข้ มข้ น 0-200 µg/ml ในนา้ กลั่น และ kraft lignin ความเข้ มข้ น 0%DPPHremaining = (Af / A0) × 100

800 µg/ml ใน DMSO เป็ นสารละลายมาตรฐาน วัดค่า การดูดกลืนแสง (UV-1800, Shimadzu Scientific Instruments, Japan) ที่ความยาวคลื่น 760 nm 5. วิเคราะห์โครงสร้ างทางเคมีด้วยเทคนิค FTIR นาตัวอย่าง lignin นา้ หนัก 10 mg มาบดเป็ น ผง ศึกษาโครงสร้ างโมเลกุลด้ วย ATR-FTIR (Nicolet IR200, Thermo Fisher Scientific, USA) ในช่วงคลื่น 4000-400 cm-1, Resolution 4 cm-1, 128 scan วิเคราะห์โครงสร้ างด้ วย OMNIC8 software 6. วิ เ คราะห์ คุ ณ สมบั ติ ก ารต้ านอนุ มู ล อิ ส ระ (antioxidant activity) ด้ วยเทคนิค DPPH ท าการวิ เ คราะห์ คุ ณ สมบั ติ ก ารต้ า นอนุ มู ล อิสระด้ วยเทคนิค DPPH ดัดแปลงวิธกี ารจาก Fagali and Catalá (2008) โดยนาสารละลาย DPPH ความเข้ มข้ น 0.25 mM ใน DMSO จานวน 1 ml มาผสมกับ สารละลายตัวอย่ าง lignin 0.1 mg/ml ใน DMSO จ านวน 1 ml วั ด ค่ า การดู ด กลื น แสง (UV-1800, Shimadzu Scientific Instruments, Japan) ที่ความยาว คลื่น 517 nm ที่ 0-60 นาที แล้ วรายงานผลในรูป %DPPHremaining เทียบกับสารมาตรฐาน gallic acid ความเข้ มข้ น 0, 0.001, 0.01 mg/ml ใน DMSO และ kraft lignin ที่ 0, 0.05 และ 0.1 mg/ml ใน DMSO ดัง สมการ (2)

(2)

Af = ค่าการดูดกลืนแสงในแต่ละช่วงเวลา A0 = ค่าการดูดกลืนแสงที่จุดเริ่มต้ น 2. ทดสอบการยั บ ยั้ งและท าลายเชื้ อจุ ลิ น ทรี ย์ (antimicrobial activity) ท าการทดสอบการยั บ ยั้ ง (MIC, minimal inhibitory concentration) และการทาลาย (MBC, minimal bactericidal concentration) เชื้อจุ ลินทรีย์ ดัดแปลงวิธกี ารจาก (Basri & Fan, 2005) โดยนาสาร สกัด lignin ละลายใน DMSO ที่ความเข้ มข้ น 1250 และ 2500 µg/ml มาทดสอบกับเชื้อจุลินทรีย์ก่อโรค 4 สาย พันธุ์ ได้ แก่ Staphylococcus aureus (DMST 8840), Escherichia coli (DMST 4212), Salmonella

typhimurium (DMST 562), Vibrio cholera (DMST 15778) ผลการศึกษาและอภิปรายผลการศึกษา 1. ผลของการสกัด lignin จากกากอ้ อย เบื้องต้ นได้ ทาการสกัด lignin จากกากอ้ อยอายุ 12 เดือน เนื่องจากสามารถนามาใช้ ประโยชน์ได้ ตลอดปี โดยไม่ข้ ึนกับฤดูกาลหีบอ้ อย และเปรียบเทียบผลได้ ใน สภาวะการสกัดต่างๆ ดังนี้

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

- SA 1:6 : Pretreatment (steam explosion) + acid hydrolysis + solid: liquid ratio (1:6) - SA 1:12 : Pretreatment (steam explosion) + acid hydrolysis + solid: liquid ratio (1:12) - NSA 1:6 : No-pretreatment + acid hydrolysis + solid: liquid ratio (1:6) - NSA 1:12 : No-pretreatment + acid hydrolysis + solid: liquid ratio (1:12)

199

- SB 1:6 : Pretreatment (steam explosion) + alkali hydrolysis + solid: liquid ratio (1:6) - SB 1:12 : Pretreatment (steam explosion) + alkali hydrolysis + solid: liquid ratio (1:12) - NSB 1:6 : No-pretreatment + alkali hydrolysis + solid: liquid ratio (1:6) - NSB 1:12 : No-pretreatment + alkali hydrolysis + solid: liquid ratio (1:12)

หมายเหตุ อักษรภาษาอังกฤษที่แตกต่างกัน (A, B, C, D) แสดงความแตกต่างกันอย่างมีนยั สาคัญทางสถิติ (P≤0.05) รูปที่ 2 ผลได้ การสกัด lignin จากกากอ้ อยเก่า (%yield, w/w กากอ้อย) ที่ได้ จากสภาวะการสกัดด้ วยกรด (ภาพที่ 2ก.) และด่าง (ภาพที่ 2ข.)

200

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

จากสภาวะการสกัดด้ วยกรดดังแสดงในภาพที่ 2 ก. พบว่ าผล ได้ กา รสกั ด อยู่ ในช่ วง 4 .8 -9. 8%z (โดยน้า หนั ก แห้ ง กากอ้ อย) โดยการใช้ อัต ราส่ ว นของ solid : liquid ที่ 1:6 และ 1:12 ในกากอ้ อยที่ไม่ผ่านการ ระเบิดด้ วยไอน้า ไม่ มีผลต่ อการเพิ่ มประสิทธิภาพการ สกัด lignin (NSA1:6 : NSA1:12 เท่ากับ 9.4% : 9.8%) ในขณะที่ก ากอ้ อ ยที่ผ่ า นการระเบิ ด ด้ ว ยไอน้า ได้ ผลการสกัดเพิ่มขึ้น (SA1:6 : SA1:12 เท่ากับ 4.8% : 6.6%) อย่างไรก็ตามตัวอย่ างกากอ้ อยที่ไม่ผ่านการ ระเบิดด้ วยไอนา้ ให้ ผลได้ ของ lignin มากกว่าการนากาก อ้ อยมาผ่านการระเบิดด้ วยไอนา้ ก่อนการสกัด ในการสกัดในสภาวะด่าง (ภาพที่ 2ข.) พบว่าให้ ผลได้ การสกัดสูงกว่ าการใช้ กรดประมาณ 1-3.6 เท่า (SB1:6 : SB1:12 เท่ากับ 17.4% : 22.1% และ NSB1:6 : NSB1:12 เท่ากับ 10.9% : 26.1%) โดย การเพิ่มอัตราส่วนของด่างทาให้ ผลได้ การสกัดเพิ่มขึ้น ทั้ง ในตัวอย่ างที่ผ่านและไม่ ผ่านการระเบิดด้ วยไอน้า โดย

การนากากอ้ อยเก่ามาสกัด lignin เพื่อใช้ ประโยชน์ กล่าว ได้ ว่าการระเบิดโครงสร้ างของกากอ้ อยด้ วยไอนา้ อาจไม่ จาเป็ น หากพิจารณาผลได้ กบั ขั้นตอนการสกัดที่เพิ่มขึ้น จากขั้นตอนนี้พบว่าสภาวะที่เหมาะสมต่อการสกัด lignin ด้ วยกรดคือ NSA1:6 และในสภาวะด่างคือ NSB1:12 โดยจะได้ ท าการเปรี ย บเทีย บโครงสร้ างทางเคมี ข อง lignin ที่สกัดได้ จากทั้งสองสภาวะต่อไป 2. ผลของอายุกากอ้ อยต่อผลได้ การสกัด lignin เนื่องจากกากอ้ อยที่ได้ จากโรงงานมีอายุการเก็บ รักษาที่แตกต่างกันตามสภาพการจัดการของโรงงานและ การนาไปใช้ ประโยชน์ ในขั้นตอนนี้จะเปรียบเทียบผลได้ การสกัดของกากอ้ อยใหม่ ท่ีเก็บหลัง จากการหี บ 1 วั น (ภาพที่ 3) เมื่อใช้ อตั ราส่วนของ solid : liquid ratio ที่ เหมาะสมส าหรั บ กรดและด่ า งจากขั้ น ตอนที่ 1 และ เปรีย บเทียบผลของการระเบิดด้ วยไอน้า ต่ อผลได้ การ สกัด

หมายเหตุ อักษรภาษาอังกฤษที่แตกต่างกัน (A, B, C) แสดงความแตกต่างกันอย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ (P≤0.05) รูปที่ 3 ผลได้ การสกัด lignin จากกากอ้ อยใหม่ (%yield, w/w กากอ้อย) ที่จากสภาวะการสกัดต่างๆ

จากการใช้ อั ต ราส่ ว นของ solid: liquid ที่ เหมาะสมด้ วยกรด (1:6) และ ด่าง (1:12) ในการสกัด lignin จากกากอ้ อยใหม่ พบว่ าการใช้ กรดให้ ผลได้ ไม่ แตกต่างกันทั้งในตัวอย่างที่ผ่าน (SA1:6(new)) และไม่ ผ่ า นการระเบิ ด ด้ วยไอน้ า (NSA1:6(new)) เท่ า กั บ 6.99 และ 7.77% ตามลาดับ ในขณะที่การสกัดกากอ้ อย

ใหม่ด้วยด่างนั้นการระเบิดด้ วยไอนา้ สามารถเพิ่มผลได้ การสกัดได้ อย่างมีนัยสาคัญคือจาก 13.8% เป็ น 17.6% ผลได้ ของ lignin ที่ต่างกันเมื่อผ่านการระเบิดด้ วย ไอนา้ ระหว่างกากอ้ อยเก่า (ภาพที่ 2) กับกากอ้ อยใหม่ (ภาพที่ 3) นั้นอาจเกิดจากความแข็งแรงของโครงสร้ าง lignocellulose ในกากอ้ อยใหม่ท่มี ากกว่ากากอ้ อยเก่าทา

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ให้ การสกั ด ด้ ว ยด่ า งเพี ย งอย่ า งเดี ย วไม่ ส ามารถแยก lignin ออกได้ จึ ง จ าเป็ นต้ อ งน ากากอ้ อ ยมาผ่ า น กระบวนการ pretreatment ในกรณีของกรดซึ่งผลได้ ไม่ แ ต ก ต่ า ง กั น อ า จ เ นื่ อ ง ม า จ า ก ก า ร ส ล า ย พั น ธ ะ (hydrolysis) ester และ ether ระหว่ าง lignin และ polysaccharides มีประสิทธิภาพต่ากว่าการใช้ ด่าง 3. ค่าพลังงานความร้ อน

เพื่ อ ตรวจสอบว่ า กากอ้ อ ยที่เ หลื อ จากการสกัด lignin สามารถนาคืนเข้ าสู่กระบวนการผลิตเชื้อเพลิง ตามปกติของโรงงานได้ หรือไม่ จึงทาการเปรียบเทียบค่า พลังงานความร้ อนที่ได้ จากกากอ้ อยเก่าและใหม่ ท่ีผ่าน และไม่ผ่านกระบวนการสกัด โดยก่อนการวิเคราะห์ค่า พลังงานได้ ทาการอบตัวอย่างกากอ้ อยเพื่อให้ มีความชื้น ไม่เกิน 10% ผลค่าพลังงานความร้ อนดังแสดงในตาราง ที่ 1

ตารางที่ 1 ค่าพลังงานความร้ อนของกากอ้ อยที่ผ่านและไม่ผ่านการสกัดจากสภาวะต่างๆ energy power Energy power Samples % moisture (cal/g) (watt-hour) Bagasse 4.7 4129 4.80 NSA 1:6 6.5 3744 4.35 NSB 1:12 10.6 3350 3.90 Bagasse (new) 4.1 4268 4.96 SA 1:6 (new) 5.5 4180 4.86 NSA 1:6 (new) 5.7 4145 4.70 SB 1:12 (new) 8.4 3693 4.29 NSB 1:12 (new) 9.9 3663 4.26

ผลพบว่าค่าพลังงานแบบ Gross Calorific Value ซึ่ง แสดงผลค่ าความร้ อนจากการเผาไหม้ ของเชื้อเพลิง จากกากอ้ อยเก่าและใหม่ท่ไี ม่ผ่านกระบวนการสกัดจะให้ ใกล้ เคียงกันคือ 4129-4268 cal/g หรือคิดเป็ นกาลัง ไฟประมาณ 5 watt/hour ซึ่ ง หลั ง จากการผ่ า น กระบวนการสกัดพบว่ า ในกากอ้ อยที่เหลือจากการสกัด ด้ วยกรดให้ ค่าพลังงานความร้ อนลดลงเพียงเล็กน้ อย คือ ในกากอ้ อยเก่าลดลง 9.38% และ ในกากอ้ อยใหม่ลดลง 2.02-5.24% ในขณะที่กากอ้ อยที่เหลือจากการสกัด lignin ออกด้ วยด่างค่าพลังงานความร้ อนลดลงสูงกว่ า คือ ในกากอ้ อยเก่าลดลง 18.8% และในกากอ้ อยใหม่ ลดลง 13.5-14.1% โดยค่าความร้ อนที่ลดลงของกาก อ้ อยก่อนและหลังการสกัดสอดคล้ องกับผลได้ การสกัด lignin ในกากอ้ อยแต่ละประเภท กล่าวคือพลังงานความ ร้ อนที่ลดลงเนื่องมาจาก lignin ที่ถูกสกัดออกไปนั้นเป็ น สารไฮโครคาร์บอนที่ให้ พลังงานเช่นกัน และเป็ นที่ทราบ ดีว่าโรงงานเยื่อส่วนใหญ่มกี ารนา black liquor ซึ่งเป็ นผล พลอยได้ จากกระบวนการ delignification และมี lignin

201

% ค่าพลังงานความร้อนที่ลดลง (ต่อความร้อนของกากอ้อยก่อนสกัด) 9.38 18.8 2.02 5.24 13.5 14.1

เป็ นองค์ประกอบหลักไปใช้ ในการเผาเพื่อเป็ นพลังงาน หมุนเวียนด้ วยเช่นกัน 4. ปริมาณ total phenolic content (TPC) lignin ปริมาณ total phenolic content (TPC) ของสาร สกัด lignin เทียบกับสารละลายมาตรฐาน gallic acid และ kraft lignin แสดงในตารางที่ 2 เมื่อพิจารณาค่า TPC จากการใช้ กรดและด่ างโดยเปรียบเทียบกับสาร มาตรฐานในรูป kraft lignin และ gallic acid พบว่ า โครงสร้ างของสารสกัดที่ได้ ส่วนใหญ่เป็ น lignin ในขณะที่ โครงสร้ างบางส่วนเทียบได้ กบั gallic acid ซึ่งอาจเป็ นสาร polyphenols ที่มีน้า หนั ก โมเลกุ ล เล็ก กว่ า ที่ถู ก สกัด ออกมาพร้ อมกันหรือเกิดจากการ depolymerization อัน เนื่องมาจากสภาวะในการสกัด ในกากอ้ อยใหม่ ท่ีผ่านการระเบิดด้ วยไอน้าและ สกัดด้ วยด่างสารสกัดที่ได้ จะมีค่า TPC (w/w lignin) ใน รูป kraft lignin และ gallic acid สูงสุด คือ 76.6 และ 22.7% ตามลาดับ ในขณะที่กากอ้ อยที่ไม่ผ่านการระเบิด ด้ วยไอนา้ ทั้งเก่าและใหม่ (NSB1:12, NSB1:12(new))

202

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ให้ ค่า TPC ในรูป kraft lignin และ gallic acid ไม่ แตกต่างกันอย่างมีนัยสาคัญ (48.2 และ 50.1% (kraft lignin) และ 14.1% และ 14.6% (gallic acid) ตามลาดับ) ในการสกัดด้ วยกรด %TPC สูงที่สุดได้ จากกาก อ้ อ ยใหม่ ท่ีผ่ า นการระเบิ ด ด้ ว ยไอน้า (SA1:6(new))

เท่ ากับ 64.8% (kraft lignin) จากการวิเ คราะห์ เ ชิ ง คุณภาพกล่ าวได้ ว่ากากอ้ อยใหม่มีค่า %TPC มากกว่ า กากอ้ อยเก่า เนื่องจากสภาวะการเก็บรักษากากอ้ อยเก่า ภายนอกอาคารเป็ นเวลานานอาจท าให้ เกิด การ oxidation ของ phenolic compounds ได้ ง่าย

ตารางที่ 2 Total phenolic content (TPC) ในรูปของ gallic acid และ kraft lignin %TPCkraft %TPCgallic อายุกากอ้อยหลังหีบ ชื่อตัวอย่าง (w/w lignin) (w/w lignin) d NSA 1:6 43.0 ± 1.15 12.7d ± 0.32 12 เดือน NSB 1:12 48.2c ± 0.30 14.1c ± 0.08 SA 1:6 (new) 64.8b ± 1.01 18.8b ± 0.34 NSA 1:6 (new) 37.0e ± 1.22 10.9e ± 0.11 1 วัน SB 1:12 (new) 76.6a ± 1.50 22.7a ± 0.28 c NSB 1:12 (new) 50.1 ± 0.41 14.6c ± 0.42 หมายเหตุ อักษรภาษาอังกฤษที่แตกต่างกัน (a, b, c, d, e) แสดงความแตกต่างกันอย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ (P≤0.05) ของ %TPC ในรูป gallic acid และ kraft lignin

5. การวิเคราะห์โครงสร้ างทางเคมีด้วยเทคนิค FTIR ภาพที่ 4 และสัญญาณที่ wave number ต่างๆ ดังแสดง ทาการวิเคราะห์โครงสร้ างทางเคมีของสารสกัด ในตารางที่ 3 (Zabaleta, 2012) lignin จากแต่ละสภาวะด้ วยเทคนิค FTIR ดังแสดงใน

รูปที่ 4 ATR-FTIR spectrum จากตัวอย่างสารสกัด lignin ที่ได้ จากสภาวะการสกัดต่างๆ

จากการวิเคราะห์ โครงสร้ างของสารสกัด lignin ทั้ง 6 สภาวะ ด้ วย FTIR พบสัญญาณที่ wave number 3690-3030 cm-1 ซึ่งตรงกับการสั่นสะเทือนของ O-H stretching ของโครงสร้ า ง aromatic และ aliphatic

สัญญาณที่ 2930-2845 cm-1 ตรงกับ C-H stretching ของ aromatic methoxy, methyl และ methylene group ใน side chains นอกจากนี้ยังพบสัญญาณส่วนใหญ่ ท่ี wave number 1710-835 cm-1 ซึ่งประกอบไปด้ วยที่

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

1710 cm-1 ตรงกับ C=O bond stretching ของ unconjugated ketone, carboxyl, ester group ที่ 1595, 1515, 1514, 1502, 1465 cm-1 ซึ่งตรงกับ aromatic structure และ lignin (Bui et al., 2015; Cé lino, Gonç alves, Jacquemin, & Fré our, 2014) ที่ 1418 cm-1 ตรงกับ C-H ใน lignin ที่ 1218 cm-1 ตรงกับ

203

ring breathing กับ C-O stretching ของ syringyl และ guaiacyl structure ที่ 1121 cm-1 ตรงกับ aromatic CH in plain deformation ของ syringyl unit และที่ 835 cm-1 ตรงกับ C-H ของ syringyl substructure (Zhou, Jiang, Via, Fasina, & Han, 2015) ซึ่งโดยรวมสารสกัด จากทั้ง 6 สภาวะมีโครงสร้ างที่คล้ ายคลึงกัน

ตารางที่ 3 Functional group จาก wave number ต่างๆ ของตัวอย่างสารสกัด lignin ที่ได้ จากสภาวะการสกัดต่างๆ Wave number (cm-1) Functional groups 3690-3030 OH stretching vibrations and hydrogen bonding in phenolic and aliphatic structure 2930-2845 C-H stretching in aromatic methoxyl group and in methyl or methylene group of side chain 1710 C=O bond stretching Unconjugated ketone, carboxyl, ester group 1695 Unconjugated ketone or carboxyl group stretching 1595, 1515, 1514, 1502, 1465 Aromatic structure in lignin 1418 C-H deformation in lignin 1326 Syringyl ring breathing with C-O stretching 1261 Guaiacyl ring breathing with C=O stretching 1218 Ring breathing with C-O stretching of both the syringyl and guaiacyl structure Syringyl substructure 1161 Ester bond associated with p-hydroxypheny propane 1121 Aromatic C-H in plain deformation of syringyl unit Syringyl structure 1030 Deformation of the aromatic C-H linkages in guaiacyl substructure Deformation of the bond C-O in primary alcohols 835 C-H in positions 2 and 6 in syringyl substructure

5. คุณสมบัตกิ ารต้ านอนุมูลอิสระ (antioxidant activity) การทดสอบคุณสมบัตใิ นการต้ านอนุมูลอิสระด้ วย วิธี DPPH ของสารสกัด lignin ที่ความเข้ มข้ น 0.1 mg/ml เทียบกับสารมาตรฐาน gallic acid ที่ 0, 0.01 และ 0.001 mg/ml และ kraft lignin ที่ 0, 0.1 และ

0.05 mg/ml แสดงผลด้ วยค่า %DPPHremaining โดย ค่ า %DPPHremaining ที่ล ดลงแสดงสมบัติข องสารใน การยั บ ยั้ ง อนุ มู ล อิส ระได้ ม ากขึ้ น ผลการทดสอบนี้ ดั ง แสดงในภาพที่ 5

รูปที่ 5 %DPPHremaining ของสารสกัด lignin ความเข้ มข้ น 0.1 mg/ml จากสภาวะการสกัดต่างๆ เปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน gallic acid ที่ความเข้ มข้ น 0, 0.01 และ 0.001 mg/ml และ kraft lignin ที่ 0, 0.1 และ 0.05 mg/ml

204

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

เมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพของ lignin จาก สภาวะการใช้ กรดและด่ างจากตัวอย่ างกากอ้ อยทั้งสอง กลุ่ม (1 วัน และ 12 เดือน) พบว่า lignin ที่ได้ จากการ ส กั ด ก า ก อ้ อ ย ใ ห ม่ ด้ ว ย ก ร ด มี แ น ว โ น้ ม ใ ห้ ค่ า %DPPHremaining ที่ต่ า กว่ า การสกัด กากอ้ อ ยใหม่ ด้ ว ย ด่ าง ทั้ งใน กา กอ้ อยที่ ผ่ าน กา รระ เบิ ด ด้ ว ยไ อน้ า (SA1:6(new) เท่ากับ 50.6% และ SB1:12(new) เท่ากับ 61.9%) และกากอ้ อยที่ไม่ผ่านการระเบิดด้ วย ไอน้า (NSA1:6(new) เท่ า กับ 68.9% และ NSB1:12(new) เท่ากับ 78.3%) ซึ่งแสดงถึงสมบัติใน การต้ านอนุ มูลอิสระที่มากกว่ า ในส่วนของกากอ้ อยเก่า พบว่ า lignin ที่ ไ ด้ จากการสกั ด ด้ วยกรดมี ค่ า %DPPHremaining ที่ต่ากว่าการสกัดด้ วยด่าง (NSA1:6 เท่ากับ 68.4% และ NSB1:12 เท่ากับ 80.8%) 6. การยับยั้งและทาลายเชื้อจุลินทรีย์ (antimicrobial activity)

ผลการทดสอบคุ ณ สมบัติแ ละความสามารถใน การยั บยั้ ง และทาลายเชื้ อจุ ลิ น ทรีย์ ข องสารสกัด lignin แสดงในตารางที่ 5 จากผลการทดสอบพบว่ าสารสกัด lignin จากกากอ้ อ ยทุก สภาวะที่ค วามเข้ มข้ น 1250 µg/ml ให้ ผลการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียแกรมลบ (E. coli, S. typhimurium และ V. cholera) ได้ แต่ในการยับยั้ง แบคทีเรียแกรมบวก (S. aureus) ต้ องใช้ ความเข้ มข้ นที่ มากกว่ าคือ 2500 µg/ml ในขณะที่การทาลาย เชื้ อจุ ลิ น ทรี ย์ ไ ม่ ส ามารถท าได้ แ ม้ ว่ า จะใช้ ร ะดั บ ความ เข้ มข้ นสูงสุดของสารสกัดที่เตรียมได้ คือ 2500 µg/ml เนื่องจากข้ อจากัดในเรื่องความสามารถในการละลายของ สารสกัด lignin ใน DMSO ทาให้ สามารถเตรียมได้ สงู สุด ที่ความเข้ มข้ น 2500 µg/ml จึงไม่ทราบความเข้ มข้ น สุดท้ ายของ MBC

ตารางที่ 5 ผลการทดสอบหาความเข้ มข้ นต่าสุด (µg/ml) ของสารสกัด lignin จากกากอ้อยในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ (Minimum Inhibitory Concentration) และทาลายเชื้อจุลินทรีย์ (Minimum Bactericidal Concentration) S. aureus E. coli S. typhimurium V. cholera Samples MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC NSA 1:6 2500 >2500 1250 >2500 1250 >2500 1250 2500 NSB 1:12 2500 >2500 1250 >2500 1250 >2500 1250 2500 SA 1:6 (new) 2500 >2500 1250 >2500 1250 >2500 1250 2500 NSA 1:6 (new) 2500 >2500 1250 >2500 1250 >2500 1250 >2500 SB 1:12 (new) 2500 >2500 1250 >2500 1250 >2500 1250 2500 NSB 1:12 (new) 2500 >2500 1250 >2500 1250 >2500 1250 2500

อย่างไรก็ตามเมื่อเปรียบเทียบกับสารสกัด lignin จากวัสดุการเกษตรอื่นของงานวิจัยที่ผ่านมาเช่น เศษตอ ซังข้ าวโพด ที่เตรียมได้ จากสภาวะการสกัดใกล้ เคียงกัน (4%NaOH, 95°C, 120 นาที) พบว่า lignin จากเศษ ตอซังข้ าวโพดสามารถยับยั้งและทาลายแบคทีเรียแกรม บวก (S. aureus) ได้ ท่คี วามเข้ มข้ น 1250 µg/ml และ 3125 µg/ml (Dong et al., 2011) ตามลาดับ ซึ่ง เป็ นไปในแนวโน้ มเดียวกับผลการทดลองที่ได้ ในงานวิจัยนี้

วิจารณ์และสรุปผลการศึกษา จากผลการทดลองสกัด lignin จากกากอ้ อยพบว่ า ผลได้ ของการสกัดขึ้นอยู่กบั ชนิดของตัวทาละลายโดยการ ใช้ ด่าง (1%NaOH) จะให้ ผลได้ จากการสกัดมากกว่าการ ใช้ กรด (formic acid: acetic acid: H2O, 30:55:15, v/v/v) ประมาณ 3 เท่า และอัตราส่วนของ solid : liquid ไม่มีผลต่อผลได้ การสกัดในสภาวะกรด แต่ใน

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

สภาวะด่างที่เพิ่มอัตราส่วนตัวทาละลายจาก 1:6 เป็ น 1:12 สามารถเพิ่มผลได้ การสกัดขึ้น 5-10% อายุของ กากอ้ อยนับเป็ นอีกปั จจั ยหนึ่งเนื่องจากพบว่ า การสกัด กากอ้ อยที่หี บ ใหม่ จ าเป็ นต้ อ งท าการ pretreatment (steam explosion) เพราะมีโครงสร้ างที่แข็งแรงมากกว่า กากอ้ อยเก่าและในเชิงคุณภาพมีค่า %TPC สูงกว่ากาก อ้ อยเก่ า ซึ่ง อาจส่ง ผลต่ อคุณ สมบัติการต้ านสารอนุ มูล อิสระที่ดีกว่า อย่ างไรก็ตามเมื่อตรวจสอบโครงสร้ างทาง เคมีด้วยเทคนิค FTIR แล้ วพบว่าโครงสร้ างทางเคมีของ สารสกัด lignin จากกากอ้ อยทุกสภาวะมีความใกล้ เคียง กันและสอดคล้ องกับงานวิจัยอื่นที่ใช้ สภาวะในการสกัด คล้ ายกัน (Bui et al., 2015; Cé lino et al., 2014; Zabaleta, 2012; Zhou et al., 2015) ทั้งนี้การเลือกใช้ วิธกี ารสกัดจะขึ้นอยู่กบั ความต้ องการ ในการนา lignin ไปใช้ ประโยชน์และการจัดการกากอ้ อย ของโรงงาน เพราะพบว่ากากอ้ อยที่ผ่านการสกัดสามารถ นากลับมาหมุนเวียนใช้ ผลิตไฟฟ้ าได้ หลังจากผึ่งทิ้งไว้ เพื่ อให้ กลิ่น ของกรดและด่ า งระเหยไปโดยค่ า พลั งงาน ความร้ อนจะลดลงประมาณ 5-19% เมื่อเทียบกับกาก อ้ อ ยที่ไ ม่ ผ่ า นกระบวนการสกัด และขึ้น อยู่ กับปริ มาณ lignin ที่ถูกสกัดออกไป เนื่องจากโครงสร้ าง lignin เป็ น hydrocarbon polymer ซึ่งเป็ นส่วนที่ให้ พลังงานได้ จากงานวิ จัยชิ้นนี้กล่ าวได้ ว่า สารสกัด lignin จากกาก อ้ อยเมื่อพิจารณาทั้งในเชิงปริมาณที่มีมากเมื่อเทียบกับสาร กลุ่ม bioactive compound จากพืชหลายชนิดและในเชิง คุ ณภาพที่มีท้ังสมบั ติในการต้ านอนุ มู ลอิสระและยั บ ยั้ ง เชื้อจุ ลินทรีย์ก่อโรค จึงเป็ นกลุ่มของสารสกัดที่มีศักยภาพ ในการนาไปพัฒนาเพื่อการใช้ ประโยชน์ในหลายด้ าน แม้ ว่า จะยังมีข้ อด้ อยในเรื่ องของความไวต่ อการเกิด oxidation และข้ อมู ล ทางด้ า นโครงสร้ างที่ ยั ง ต้ องการการศึ ก ษา เพิ่มเติมก็ตาม

205

จากอุต สาหกรรมน้า ตาล” และ LipPolGreen-Asia Platform ที่ใ ห้ ค วามอนุ เ คราะห์ ใ นการใช้ เ ครื่ องมื อ วิเคราะห์ เอกสารอ้างอิง รายงานการผลิ ต น้า ตาลทรายของโรงงานน้า ตาลทั่ ว ประเทศประจาปี การผลิต 2557/58 (ฉบับปิ ดหีบอ้ อย). (2015). กรุงเทพฯ: สานักบริหารอ้ อยและนา้ ตาลทราย. [1] Arshad, M., & Ahmed, S. (2016). Cogeneration through bagasse: A renewable strategy to meet the future energy needs. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 54, 732-737. Basri , D. F., & Fan, S. H. (2005). The potential of aqueous and acetone extracts of galls of Quercus infectoria as antibacterial agents. Indian Journal of Pharmacology, 37(1), 26-29. Bui, N. Q., Fongarland, P., Rataboul, F., Dartiguelongue, C., Charon, N., Vallé e, C., & Essayem, N. (2015). FTIR as a simple tool to quantify unconverted lignin from chars in biomass liquefaction process: Application to SC ethanol liquefaction of pine wood. Fuel Processing Technology, 134, 378-386.

กิตติกรรมประกาศ

Cara, C., Ruiz, E., Ballesteros, M., Manzanares, P., Negro, M. J., & Castro, E. (2008). Production of fuel ethanol from steam-explosion pretreated olive tree pruning. Fuel, 87(6), 692-700.

นักวิ จั ย ขอขอบคุ ณ ส านั กงานกองทุ น สนุ บสนุ น การ วิจัย (สกว.) สาหรับทุนวิจัยโครงการ “การสารวจหา สารประกอบ polyphenols เพื่อเพิ่มมูลค่าผลผลิตพลอย ได้ จากอุตสาหกรรมนา้ ตาล (RDG5750030)” ภายใต้ แผนงานวิจัย “การสร้ างมูลค่าเพิ่มของผลผลิตพลอยได้

Cé lino, A., Gonç alves, O., Jacquemin, F., & Fré our, S. (2014). Qualitative and quantitative assessment of water sorption in natural fibres using ATR-FTIR spectroscopy. Carbohydrate Polymers, 101, 163170.

206

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

del Rí o, J. C., Lino, A. G., Colodette, J. L., Lima, C. F., Gutié rrez, A., Martí nez, Á. T., . . . Rencoret, J. (2015). Differences in the chemical structure of the lignins from sugarcane bagasse and straw. Biomass and Bioenergy, 81, 322-338. Delmas, G.-H. (2011). La BiolignineTM: Structure st application a l’elaboration de resines Delmas. Université de Toulouse: Mecanique, Energetique, Genie civil et Procedes (MEGeP). Dong, X., Dong, M., Lu, Y., Turley, A., Jin, T., & Wu, C. (2011). Antimicrobial and antioxidant activities of lignin from residue of corn stover to ethanol production. Industrial Crops and Products, 34(3), 1629-1634. Fagali, N., & Catalá, A. (2008). Antioxidant activity of conjugated linoleic acid isomers, linoleic acid and its methyl ester determined by photoemission and DPPH techniques. Biophysical Chemistry, 137(1), 56-62. Ghaffar, S. H., & Fan, M. (2014). Lignin in straw and its applications as an adhesive. International Journal of Adhesion and Adhesives, 48, 92-101. Meunchang, S., Panichsakpatana, S., & Weaver, R. W. (2005). Co-composting of filter cake and

bagasse; by-products from a sugar mill. Bioresource Technology, 96(4), 437-442. Sena-Martins, G., Almeida-Vara, E., & Duarte, J. C. (2008). Eco-friendly new products from enzymatically modified industrial lignins. Industrial Crops and Products, 27(2), 189-195. Wolfe, K., Wu, X., & Liu, R. H. (2003). Antioxidant activity of apple peels. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(3), 609-614. Zabaleta, A. T. (2012). Lignin Extraction, Purification and Depolymerization Study. Universidad del Paí s Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea, Argitalpen Zerbitzua: Spain. Zhou, C., Jiang, W., Via, B. K., Fasina, O., & Han, G. (2015). Prediction of mixed hardwood lignin and carbohydrate content using ATR-FTIR and FT-NIR. Carbohydrate Polymers, 121, 336-341.

Translated Thai References Sugar production report of the production year 2014/2015 (end of production season). (2015). Bangkok: Office of the cane and sugar board. [in Thai] [1]

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

207

การศึกษาฤทธิ์การต้านอนุ มูลอิสระและการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์พอลิฟีนอล ออกซิเดสของสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดชนิดต่างๆ และการประยุกต์ใช้ ในกุง้ ขาว (Litopenaeus vannamei) เพือ่ ยับยั้งการเกิดเมลาโนซิส ประภัสสร แสนธิ, จีรวรรณ มณีโรจน์ และเปรมวดี เทพวงศ์*

A study of the antioxidant activities and polyphenoloxidase inhibitory effects of several commercial mushroom trimming extracts and its application on inhibiting melanosis in white shrimp (Litopenaeus vannamei) Praphatsorn Santhi, Jirawan Maneerote and Pramvadee Tepwong* ภาควิชาผลิตภัณฑ์ประมง คณะประมง มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ กรุงเทพฯ 10900 Department of Fishery Products, Faculty of Fisheries, Kasetsart University, Bangkok, 10900 * Corresponding author. E-mail address: ffispdt@ku.ac.th บทคัดย่อ ส่วนเหลือจากการตัดแต่งเห็ดเป็ นส่วนที่เกิดขึ้นจากการตัดแต่งและการล้ างทาความสะอาดในขั้นตอนก่อนการจาหน่ายหรือการบริโภค รวมทั้งเห็ดที่ไม่ได้ ขนาดตามที่ตลาดต้ องการ ซึ่งส่วนเหลือดังกล่าวมักจะถูกทิ้งและไม่มีการนาไปใช้ ให้ เกิดประโยชน์อย่ างเต็มที่ ส่วนเหลือ จากการตัดแต่งเห็ดคาดว่าจะเป็ นแหล่งของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ดังนั้น งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสมบัติในการเป็ นสารต้ าน อนุมูลอิสระและสารยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดสของสารสกัดจากการตัดแต่ งเห็ดที่สกัดด้ วยสารละลายเอทานอลความ เข้ มข้ นร้ อยละ 70 จานวน 5 ชนิด ได้ แก่ เห็ดหอม (Lentinus edodes) เห็ดนางฟ้ า (Pleurotus sajor-caju) เห็ดออรินจิ (Pleurotus eryngii) เห็ดชิเมจิดา (Hypsizygus tessellatus) และเห็ดชิเมจิขาว (Hypsizygus marmoreus) โดยวิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟี นอลิก ทั้งหมด การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ DPPH และค่าการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดส ผลการศึกษาพบว่า สารสกัดจาก การตัดแต่ งเห็ดทั้ง 5 ชนิด มีปริมาณสารประกอบฟี นอลิกทั้งหมด ค่าการต้ านอนุมูลอิสระ DPPH และค่าการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ พอลิฟีนอลออกซิเดส แตกต่ างกันอย่ างมีนัยสาคัญ (p≤0.05) โดยสารสกัดจากการตัดแต่ ง เห็ดหอมมีปริมาณสารประกอบฟี นอลิก ทั้งหมด (6.57g GAE/100 g dry basis) ค่าการต้ านอนุมูลอิสระ DPPH (EC50 = 1.93) และค่ าการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ พอลิฟีนอลออกซิเดส (% PPO inhibition = 20.3-43.7%) ดีท่สี ดุ จึงเลือกมาศึกษาประสิทธิภาพในการชะลอการเกิดเมลาโนซิสใน กุ้งขาว (Litopenaeus vannamei) โดยทาการแช่ ก้ ุงขาวในสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดหอมที่ระดับความเข้ มข้ นต่ างๆ (ร้ อยละ 0.5 1.0 1.5 และ 2 (นา้ หนัก/ปริมาตร)) เป็ นเวลา 60 นาที ผลการศึกษาพบว่ า กุ้งขาวที่แช่ ในสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดหอมที่ระดับความ เข้ มข้ นร้ อยละ 1.5 และ 2.0 (นา้ หนัก/ปริมาตร) มีค่าคะแนนการเกิดเมลาโนซิสอยู่ในช่ วงที่ผ้ ูทดสอบให้ การยอมรับและมีค่าสีเทาลดลง ช้ ากว่าเมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งขาวที่แช่ ในน้ากลั่นและแช่ ในสารสกัดจากการตัดแต่ งเห็ดหอมที่ระดับความเข้ มข้ นร้ อยละ 0.5 และ 1.0 (นา้ หนัก/ปริมาตร) (p≤0.05) ดังนั้น สารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด หอมมีแนวโน้ มเป็ นวัตถุเจือปนอาหารทางเลือกจากธรรมชาติเพื่อ ชะลอการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาวระหว่างการเก็บรักษา คาสาคัญ: ส่วนเหลือจากการตัดแต่งเห็ด สารต้ านอนุมูลอิสระ การยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดส เมลาโนซิส กุ้งขาว Abstract Mushroom trimming are inedible part and small size of whole mushroom, which is exhibited during sizing, trimming and cleaning process. They are agricultural waste and not being used to its advantage. Mushroom trimming may be enrich source of bioactive compounds. Thus, the objective of this study was to evaluate the antioxidative activities and polyphenoloxidase inhibitory effects of 70% ethanolic extracts from the trimming part of 5 mushroom species, namely black mushroom (Lentinus edodes), sarjor-caju mushroom (Pleurotus sajor-caju), king oyster mushroom (Pleurotus eryngii), brown beech mushroom

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

208

(Hypsizygus tessellatus) and white beech mushroom (Hypsizygus marmoreus). The content of total phenolic compound (TPC), DPPH radical scavenging activity and inhibition of polyphenoloxidase of 5 mushroom trimming extracts were determined. The result showed that TPC, DPPH radical scavenging activity and inhibition of polyphenoloxidase of 5 mushroom trimming extracts were significant (p≤0.05). The black mushroom trimming extract (BMTE) had highest TPC (6.57g GAE/100 g dry basis), DPPH radical scavenging activity (EC50 = 1.93) and inhibition of polyphenoloxidase (% PPO inhibition = 20.3-43.7%). Thus, BMTE was selected to study the effect of melanosis formation in white shrimp (Litopenaeus vannamei). The white shrimp were treated by immersed in BMTE solution at different concentrations (0.5, 1.0 1.5 and 2.0% (w/v)) for 60 min. It was found that shrimp treated with 1.5 and 2.0% (w/v) BMTE had the lower melanosis score and considered to be acceptable by the panelists. The decreased of mean gray values was more slowly in treated samples, compared with other treated samples (p≤0.05). This study indicated efficiency that BMTE was an alternative natural melanosis inhibitor for retardation of melanosis in shrimp during post-mortem storage. Keywords: mushroom trimming extract, antioxidant activity, inhibition of polyphenoloxidase, melanosis, white shrimp

บทนา ปัจจุบนั การเพาะปลูกและบริโภคเห็ดในประเทศไทย ได้ รับความนิยมมากขึ้น เนื่องจากเห็ดมีราคาถูก หาได้ ง่ า ยและมี คุ ณ ค่ า ทางโภชนาการสู ง ประกอบไปด้ ว ย สารอาหารหลายชนิ ด เช่ น วิ ต ามิ น B1 (thiamin) วิตามิน B2 (riboflavin) และวิตามิน B3 (niacin) รวมทั้ ง แร่ ธ าตุ ต่ า งๆ เช่ น โพแทสเซี ย ม ฟอสฟอรั ส แมกนี เ ซี ย ม และสัง กะสี เป็ นต้ น นอกจากนี้ เห็ด ยั ง มี สรรพคุณทางยา เช่ น ป้ องกันมะเร็งและเสริมสร้ างการ ทางานของระบบภูมิค้ ุมกัน (Ferreira, Vaz, Vasconcelos, & Martins, 2010) ลดคอเลสเตอรอลและน้าตาลใน เลือด (Jeong et al., 2010) รวมทั้งยังเป็ นแหล่งของสาร secondary metabolites หลายชนิดที่มีสมบัติในการเป็ น สารต้ านอนุ มูลอิสระ เช่ น สารประกอบฟี นอลิก , สาร ergothioneine และแซคคาไรด์ เป็ นต้ น (Dubost, Oua, & Beelmanb, 2007) จากการตรวจเอกสารเบื้องต้ น พบว่า สารสกัดจากส่วนที่บริโภคได้ ของเห็ดมีความสามารถ ในการยับยั้งการเกิดสีนา้ ตาลในผลไม้ และชะลอการเกิด ออกซิเดชันของไขมันในเนื้อสัตว์ได้ (Jang, Sanada, Ushio, Tanaka, & Ohshima, 2002; Bao, Shinomiya, Ikeda, & Ohshima, 2009) ในขั้นตอนก่อนการจาหน่าย หรือการบริโภคเห็ดจะมีการตัดแต่งก้ านดอกและบริเวณ โคน รวมทั้งเห็ดที่ไม่ได้ ขนาดทาให้ มสี ่วนเหลือเกิดขึ้น ซึ่ง ส่ ว นเหลื อดัง กล่ า วมักจะถู กทิ้ง และจะกลายเป็ นแหล่ ง สะสมของโรค แมลงและศัตรูเห็ด ถ้ ามีการจัดการหรือ กาจัด อย่ า งไม่ เ หมาะสม จากสาเหตุดัง กล่ าวนักวิ จัย จึ ง

พยายามศึกษาการใช้ ประโยชน์ของส่วนเหลือ ทิ้งจากการ ตัดแต่ งเห็ด เช่ น การประยุ กต์ใช้ เศษเหลือจากการตัด แต่ ง เห็ด นางฟ้ าผสมในอาหารปลาสลิ ด เพื่ อ ปรั บ ปรุ ง คุ ณ ภาพเนื้ อปลาสลิ ด (อรพิ น ท์ จิ น ตสถาพร และคน อื่นๆ, 2556) และการใช้ เศษก้ านเห็ดหอมในการเลี้ยง ไก่ (Buwjoom & Yamauchi, 2005) เป็ นต้ น กุ้งขาว หรือ กุ้งขาวแวนนาไม (Litopenaeus vannamei) เป็ นสัตว์นา้ เศรษฐกิจที่สาคัญของประเทศไทย ในปี พ.ศ. 2557 มีปริมาณการส่งออกสินค้ าจากกุ้งขาว 63,177 ตัน คิดเป็ นมูลค่า 23,456 ล้ านบาท (กระทรวงเกษตร และสหกรณ์, 2557) อย่างไรก็ตามเป็ นที่ทราบกันดีว่ากุ้ง ขาวมีระยะเวลาการเก็บรักษาอย่างจากัดแม้ จะเก็บรักษาที่ อุณหภูมิต่า เนื่องจากการเกิดจุดดา (black spots) หรือ บางครั้งเรียกว่า เมลาโนซิส (melanosis) จะเกิดขึ้นอย่ าง รวดเร็วบริเวณส่วนหัวและรยางค์ ซึ่งเกิดจากการทางาน ของเอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดส (PPO) ในกุ้งเกิดการ ออกซิไดส์สารประกอบฟี นอลเป็ นสารประกอบควิโนน และเกิดพอลิเมอร์ไรเซชันได้ สารประกอบสีนา้ ตาลที่เป็ น พอลิเมอร์ท่มี ีโครงสร้ างซับซ้ อน โดยทั่วไปอุตสาหกรรม การส่งออกหรือการแปรรูปกุ้งจะมีการใช้ สารสังเคราะห์ ได้ แก่ สาร 4-hexylresorcinol และสารกลุ่มซัลไฟต์ เช่น โซเดียมเมตาไบซั ลไฟต์ (SMS) เพื่ อยับยั้งการทางาน ของเอนไซม์ PPO อย่ างไรก็ตามมีร ายงานว่ า สารใน กลุ่มซัลไฟต์เป็ นสารก่อภูมิแพ้ โดยกระตุ้นอาการหอบใน ผู้ป่วยโรคหอบหืด (Martinez-Alvarez, Lopez-Caballero, Gomez-Guillen, & Montero, 2009) ทาให้ นักวิจัยเริ่ม หันมาให้ ความสนใจและทาการศึกษาการใช้ สารทดแทนที่

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

มีสมบัติหรือมีประสิทธิภาพเทียบเท่าสารทางการค้ ามาก ขึ้น สารสกัดจากธรรมชาติ ท่ีมีรายงานว่ าสามารถชะลอ หรือยับยั้งการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งได้ ได้ แก่ สารสกัดจาก ส่วนที่บริโภคได้ ของเห็ดเข็มทอง (Jang, Sanada, Ushio, Tanaka, & Ohshima, 2003) สารสกัดจากเมล็ดกระถิน (Nirmal & Benjakul, 2011) รวมทั้งสารสกัดจาก เปลือกทับทิม (Fang, Sun, Huang, & Yuan, 2013) เป็ นต้ น จากสมบัติด้านต่างๆ ของสารสกัดจากส่วนที่บริโภค ได้ ของเห็ด และความต้ อ งการสารสกัดจากธรรมชาติท่ี สามารถชะลอการทางานของเอนไซม์ PPO ได้ ดังนั้น งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสมบัติในการเป็ นสาร ต้ า นอนุ มู ล อิ ส ระและสมบั ติ ใ นการยั บ ยั้ ง ค่ า กิ จ กรรม เอนไซม์ PPO ของสารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ดชนิด ต่างๆ ที่นิยมบริโภคและหาได้ ง่ายในประเทศไทย โดยทา การวิเคราะห์ ปริมาณฟี นอลิกทั้งหมด การทดสอบฤทธิ์ ต้ า นอนุ มูล อิส ระ DPPH และค่ า การยั บยั้ ง กิจ กรรม เอนไซม์ PPO รวมทั้งทาการศึกษาระดับความเข้ มข้ นที่ เหมาะสมของสารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ดในการยับยั้ง การเกิดเมลาโนซิสของกุ้ ุงขาวที่เก็บรักษาในนา้ แข็ง โดย ผลการศึกษาที่ได้ นอกจากจะทาให้ ทราบถึงสมบัติในการ เป็ นสารต้ านอนุมูลอิสระและสมบัติในการยับยั้งกิจกรรม เอนไซม์ PPO ของสารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ดชนิด ต่ างๆ และระดับความเข้ ม ข้ นที่เหมาะสมต่ อการชะลอ การเกิด เมลาโนซิ ส ในกุ้ ง ขาวแล้ ว ยั ง เป็ นการช่ ว ยลด ปริมาณเศษเหลือทางการเกษตรอีกทางหนึ่งด้ วย

209

2. การเตรียมสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด นาตัวอย่างส่วนเหลือจากการตัดแต่งเห็ดแห้ งมา สกัดด้ วยสารละลายเอทานอลเข้ มข้ นร้ อยละ 70 โดย ดัดแปลงวิธกี ารจาก Tepwong, Giri, Sasaki, Fukui, and Ohshima (2012) หลังจากนั้นนาสารสกัดที่ได้ ไปทา แห้ งแบบเยือกแข็งและเก็บรักษาที่อุณหภูมิ - 20 องศา เซลเซียส เมื่อต้ องการใช้ นาสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดที่ ได้ มาละลายด้ ว ยน้า กลั่ นให้ มีร ะดับความเข้ มข้ น ตามที่ ต้ องการ 3. การศึกษาฤทธิ์การต้ านอนุมูลอิสระและการยับยั้ง กิจกรรมเอนไซม์ PPO ของสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด 3.1 การวิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟี นอลิก ทั้งหมด (Total phenolic content) โดยใช้ Folin– Ciocalteu reagent ดัดแปลงวิธีการจาก Slinkkard & Singleton (1997) และทาการคานวณปริมาณฟี นอลิก ทั้งหมด โดยเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานของ Gallic acid 3.2 การวิ เ คราะห์ ค่ า 2, 2-diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity โดยดัดแปลงวิธกี ารจาก Mau, Lin, and Chen (2002) และรายงานผลในรู ป แบบของค่ า 50% effective concentration (EC50) ซึ่งหมายถึงปริมาณสารต้ าน ออกซิเ ดชันที่ทาให้ ความเข้ มข้ น ของสารละลาย DPPH ลดลง 50% ซึ่งสามารถคานวณได้ จากการสร้ างกราฟ ระหว่ างความเข้ มข้ นของสารตัวอย่ างกับ % radical scavenging activity 3.3 การวิเคราะห์ค่ากิจกรรมการยับยั้งเอนไซม์ PPO ตามวิธีของ Nirmal and Benjakul (2009) มี วิธีการศึกษา วิธกี ารพอสังเขปคือ 3.3.1 การสกัด crude PPO จากส่วนหัวที่ 1. การเตรียมตัวอย่างส่วนเหลือจากการตัดแต่งเห็ด นาส่ ว นเหลือ จากการตัด แต่ ง ดอกและก้ า นเห็ด เชื่อมกับอกของกุ้ง (cephalothoraxes) 3.3.2 การวิเคราะห์ค่ากิจกรรมเอนไซม์ รวมทั้ง เห็ด ที่ไ ม่ ไ ด้ ข นาดตามที่ต ลาดต้ อ งการจ านวน 5 ชนิด ได้ แก่ เห็ดหอม เห็ดออรินจิ เห็ดนางฟ้ า เห็ด PPO มีวิธกี ารทดลอง คือ นา crude PPO ผสมให้ เข้ ากัน ชิเมจิดาและเห็ดชิเมจิขาว มาหั่นเป็ นชิ้นเล็กๆ แล้ วนาไป กับสารละลาย L-DOPA โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ และ อบแห้ งในตู้อบ ลมร้ อนที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นา้ ปราศจากไอออน จากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความ จนมีความชื้นสุดท้ ายร้ อยละ 10 จากนั้นบดให้ เป็ นผง ยาวคลื่น 475 นาโนเมตร ทุกๆ 30 วินาที เป็ นเวลา ละเอียด บรรจุใส่ถุงพอลิเอทีลีนและเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 3 นาที และนาไปคานวณค่ากิจกรรมเอนไซม์ โดยหนึ่ง หน่วยกิจกรรมเอนไซม์ คือ ค่าการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น – 20 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนามาใช้ 0.001 ที่ 475 นาโนเมตร/ นาที/ มิลลิลิตร

210

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

ทิลีนและเก็บรักษาในกล่องพอลิสไตรีนที่บรรจุนา้ แข็งใน อัตราส่วนของกุ้งขาวต่อนา้ แข็งเท่ากับ 1:2 (นา้ หนัก/ นา้ หนัก) นาไปเก็บรักษาในห้ องเย็นอุณหภูมิ 4 องศา เซลเซียสเป็ นเวลา 7 วันและเปลี่ยนนา้ แข็งทุกวัน จากนั้น ทาการวิเคราะห์การเกิดเมลาโนซิสและค่าสีเทา 4.1 การวิเคราะห์ค่าคะแนนการเกิด เมลาโนซิส ในกุ้งขาว (Melanosis score) ทาการประเมินและให้ คะแนนค่าการเกิดเม ลาโนซิสในกุ้งขาวชุดควบคุมและกุ้งขาวที่แช่ ในสารสกัด จากการตัดแต่งเห็ด โดยใช้ ผ้ ูทดสอบจานวน 8 คนที่ผ่าน PPO inhibition (%) = (A-B/A)*100 การฝึ กฝนให้ ค้ ุนเคยกับการเปลี่ยนแปลงการเกิดเมลาโน ซิ ส ในกุ้ ง ขาว ตั้ ง แต่ ไ ม่ พ บเมลาโนซิ ส ในกุ้ ง ขาวจนถึ ง เมื่อ A คือ ค่ากิจกรรมของเอนไซม์ PPO ที่สกัดได้ จาก ยอมรับไม่ได้ โดยมีเกณฑ์การให้ คะแนนตาม 10-point ส่วนหัวที่เชื่อมกับอกของกุ้ง (cephalothoraxes) scoring ซึ่งดัดแปลงจาก Otwell and Marshall (1986) B คือ ค่ากิจกรรมของเอนไซม์ PPO ของสารสกัด 4.2 การบันทึกภาพกุ้ งขาวและการวิเคราะห์ จากการตัดแต่งเห็ด ค่าสีเทา (mean gray value) PPO inhibition เพิ่มขึ้นแสดงว่าสารสกัดจากการ ทาการบันทึกภาพกุ้งขาวชุดควบคุมและกุ้ง ตัดแต่งเห็ดมีค่าความสามารถในการยับยั้งกิจกรรม ขาวที่แช่ในสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดด้ วยกล้ องดิจิตอล เอนไซม์ PPO ในกุ้งขาว ทุกวัน เพื่อติดตามการเกิด เมลาโนซิส จากนั้นนาภาพที่ ได้ ไปวิ เ คราะห์ ค่ า สี เ ทาของตั ว อย่ า งกุ้ ง ขาว โดยใช้ 4. การประยุ กต์ใ ช้ สารสกัดจากการตัดแต่ ง เห็ดใน โปรแกรมสาเร็จรูป Image J โดยค่าสีเทาจะแปรผกผัน กุ้งขาว (Litopenaeus vannamei) กับการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาว เมื่อค่าสีเทาลดลงแสดง น ากุ้ ง ขาวขนาด 70-80 ตัว /กิโ ลกรั ม ที่จั บ ขึ้ น ว่าเมลาโนซิสในกุ้งขาวเพิ่มมากขึ้น จากบ่ อ เลี้ ยงของเกษตรกรที่ ผ่ า นมาตรฐาน Good 5. การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ Aquaculture Practice (GAP) ในอ าเภอบ้ า นแพ้ ว วางแผนการทดลองแบบสุ่ ม สมบู ร ณ์ ต ลอด จังหวัดสมุทรสาคร บรรจุ ล งในกล่ องพอลิส ไตรีน โดย (Complete Randomized Design: CBD) วิเคราะห์ความ เรียงกุ้งขาวสลับชั้นกับนา้ แข็งในอัตราส่วนกุ้งต่อนา้ แข็ง แปรปรวนและเปรียบเทียบความแตกต่างของค่าเฉลี่ยตาม เท่ากับ 1:2 (นา้ หนัก/นา้ หนัก) และขนส่งมายังภาควิชา วิธี Duncan’s New Multiple Range Test ที่ระดับความ ผลิตภัณฑ์ประมง คณะประมงมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ เชื่อมั่นร้ อยละ 95 ภายในระยะเวลา 3 ชั่วโมง หลังจากนั้นนากุ้งขาวมาล้ าง ด้ วยนา้ เย็นและสะเด็ดนา้ และนากุ้งขาวมาแช่ ในสารสกัด ผลการศึกษาและอภิปรายผลการศึกษา จากการตัดแต่งเห็ดที่ระดับความเข้ มข้ น 4 ระดับ ได้ แก่ ความเข้ มข้ นร้ อยละ 0.5 1.0 1.5 และ 2 (นา้ หนัก/ 1. ฤทธิ์การต้ านอนุ มูลอิสระและการยับยั้งกิจกรรม ปริมาตร) เป็ นเวลา 60 นาที โดยมีชุดควบคุม คือนา้ เอนไซม์ PPO ของสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด กลั่นและสารละลาย SMS ที่ระดับความเข้ มข้ นร้ อยละ 1.1 ปริ ม าณสารประกอบฟี นอลิ ก ทั้ ง หมด 1.25 (นา้ หนัก/ปริมาตร) กาหนดให้ อัตราส่วนกุ้ง ต่ อ (Total phenolic content) สารละลายเท่ากับ 1:2 และควบคุมอุณหภูมิระหว่ าง ผลการวิเคราะห์ปริมาณฟี นอลิกทั้งหมดของสารสกัด การศึกษาไม่ให้ เกิน 4 ± 1 องศาเซลเซียส เมื่อครบเวลา จากการตัดแต่งเห็ดจานวน 5 ชนิด พบว่า สารสกัดจาก ที่กาหนดทาการสะเด็ดนา้ และบรรจุ ก้ ุงขาวในถุงพอลิเอ การตั ด แต่ ง เห็ ด แต่ ล ะชนิ ด มี ป ริ ม าณฟี นอลิ ก ทั้ ง หมด 3.3.3 การวิเคราะห์ ค่าการยับยั้งกิจกรรม เอนไซม์ PPO มีวิธกี ารทดลองพอสังเขปคือ นาสารสกัด จากการตัดแต่งเห็ดที่ระดับความเข้ มข้ น 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 และ 2.5 กรัม/ลิตร ผสมให้ เข้ ากันกับ crude PPO แล้ วบ่มทิ้งไว้ ท่อี ุณหภูมิห้องเป็ นเวลา 30 นาที จากนั้น เติมสารละลาย L-DOPA และโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ผสมให้ เ ข้ า กัน แล้ ววั ดค่ าการดู ดกลื นแสงที่ 475 นาโน เมตร ทุกๆ 30 วินาที เป็ นเวลา 3 นาที และคานวณค่า การยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ PPO ดังสมการ

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

แตกต่ างกัน (p≤0.05) โดยเห็ดออริ นจิมีปริมาณฟี นอลิกสูงสุด (6.93 g GAE/100 g dry basis) รองลงมาคือ เห็ดหอม (6.57g GAE/100 g dry basis)

211

เห็ดชิเมจิขาว (6.40 g GAE/100 g dry basis) เห็ดชิเม จิดา (6.21 g GAE/100 g dry basis) และเห็ดนางฟ้ า (5.96 g GAE/100 g dry basis) ตามลาดับ (ตารางที่ 1)

ตารางที่ 1 ปริมาณสารประกอบฟี นอลิกทั้งหมดของสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด สารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด

ปริมาณฟี นอลิกทั้งหมด (g GAE/100g dry basis) เห็ดหอม (Lentinus edodes) 6.57 ± 0.008b เห็ดนางฟ้ า (Pleurotus sajor-caju) 5.96 ± 0.010e เห็ดออรินจิ (Pleurotus eryngii) 6.93 ± 0.001a เห็ดชิเมจิขาว (Hypsizygus marmoreus) 6.40 ± 0.013c เห็ดชิเมจิดา (Hypsizygus tessellatus) 6.21 ± 0.007d หมายเหตุ อักษรภาษาอังกฤษพิมพ์เล็กที่แตกต่าง แสดงความแตกต่างกันอย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ (p≤0.05)

สาเหตุท่ปี ริมาณสารประกอบฟี นอลิกทั้งหมดในสาร สกัด จากการตั ด แต่ ง เห็ด มีค่ า แตกต่ า งกัน อาจเป็ นผล เนื่องมาจากกระบวนการสร้ างและการย่อยสลายของเห็ด ชนิดนั้นๆ (Arbaayah & Umi, 2013) Bao, Osako, and Ohshima (2010) ได้ ทาการศึกษาปริมาณฟี นอลิก ทั้งหมดจากส่วนที่บริโภคได้ ของเห็ดจานวน 10 ชนิด ที่ สกัดด้ วยนา้ ร้ อนและสกัดครั้งที่สองด้ วยสารละลายเอทา นอลเข้ มข้ นร้ อยละ 70 ผลการศึกษาพบว่า เห็ดหอมและ เห็ดชิ เ มจิ ดามีปริ มาณฟี นอลิ กทั้ง หมดใกล้ เ คียงกัน กับ การศึกษาครั้งนี้ของคณะผู้วิจัย มีเพียงเห็ดออรินจิเท่านั้น ที่มีป ริมาณฟี นอลิ กทั้งหมดต่ ากว่ า ซึ่ งอาจเนื่องมาจาก ส่วนของเห็ดที่ใช้ ในการสกัด ขั้นตอนการสกัดและตัวทา ละลายที่ใช้ ในการสกัดแตกต่างกัน รวมทั้งสถานที่ในการ เพาะปลูกและระยะเวลาการเก็บเกี่ยวที่แตกต่ างกัน จึง ส่งผลให้ ปริมาณฟี นอลิกทั้งหมดมีค่าแตกต่างกัน 1.2 ค่า 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity ผลการศึกษาค่าการต้ านอนุมูลอิสระ DPPH ของ สารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดที่ระดับความเข้ มข้ นช่วง 0.1 ถึง 5 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร พบว่า สารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ดทั้ง 5 ชนิด มีค่าการต้ านอนุมูลอิสระ DPPH แตกต่าง กันแต่มีแนวโน้ มไปในทิศทางเดียวกัน คือ เมื่อความ เข้ ม ข้ น ของสารสกั ด เพิ่ ม ขึ้ น ค่ า การต้ า นอนุ มู ล อิ ส ระ DPPH เพิ่ มขึ้น โดยสารสกัดจากส่วนเหลือการตัดแต่ ง เห็ดหอมมีความสามารถในการเป็ นสารต้ านอนุมูลอิสระดี

ที่สดุ (รูปที่ 1A) และเมื่อคานวณหาค่า EC50 ของสาร สกัดจากการตัดแต่ ง เห็ด พบว่ า เห็ด หอม เห็ดนางฟ้ า เห็ดออรินจิ เห็ดชิเมจิขาว และเห็ดชิเมจิดา มีค่า EC50 เท่ากับ 1.93 4.58 2.83 1.96 และ 2.28 มิลลิกรัม/ มิลลิลิตร ตามลาดับ (รูปที่ 1B) โดยสารสกัดจากการตัด แต่งเห็ดหอมมีค่า EC50 น้ อยที่สดุ ซึ่งแสดงว่าสารสกัด จากการตัดแต่ง เห็ดหอมมีความสามารถในการเป็ นสาร ต้ า นอนุ มู ล อิส ระดี ท่ีสุด เนื่ อ งจากใช้ ป ริ ม าณสารสกัด ปริม าณน้ อยที่สุดเพื่ อท าให้ ความเข้ มข้ น ของ DPPH ลดลง 50 เปอร์เซ็นต์ รองลงมาคือเห็ดชิเมจิขาว เห็ดชิเม จิ ด า เห็ด ออริ น จิ และเห็ด นางฟ้ า ตามล าดั บ Sudha, Vadivukkarasi, Shree, and Lakshmanan (2012) รายงานว่ า สารสกัดจากการตัดแต่ ง เห็ดอาจมีสารกลุ่ ม active substances เช่ น สารประกอบฟี นอลิ ก ที่ มี ความสามารถในการให้ อนุ มู ล ไฮโดรเจนในการท า ปฏิกิริย ากับ DPPH ซึ่ งเป็ นกลไกของการเป็ นสารต้ า น อนุมูลอิสระ นอกจากนี้ Akanmu, Cecchini, Aruoma, and Halliwell (1991) ยังรายงานว่า สาร ergothioneine ซึ่งเป็ น secondary metabolite product สามารถกาจัด อนุมูลอิสระของไฮดรอกซิล (hydroxyl radical) (·OH) ซึ่ ง มี ค วามว่ อ งไวต่ อ การเกิ ด ปฏิ กิ ริ ย ามาก และยั ง มี ความสามารถในการจับกับ divalent metal ion ของ Cu2+, Cd2+ และ Hg2+ (Motohashi, Mori, & Sugiura, 1976)

212

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูปที่ 1 ค่า DPPH radical scavenging activity (%) (A) และค่า EC50 (B) ของสารสกัดจากการ ตัดแต่งเห็ดชนิดต่างๆ

1.3 ค่าการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ PPO (% PPO inhibition) ผลการศึกษาพบว่า สารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด ทั้ง 5 ชนิด มีความสามารถในการยับยั้งเอนไซม์ PPO ที่ แตกต่างกัน คือ เมื่อระดับความเข้ มข้ นของสารสกัดจาก การตัดแต่งเห็ดเพิ่มขึ้น % PPO inhibition จะเพิ่มขึ้น (p≤0.05) (รูปที่ 2) โดยสารสกัดจากการตัดแต่ ง เห็ดหอมมี % PPO inhibition สูงสุด (20.3-43.7%) รองลงมาคือ เห็ดนางฟ้ า (18.7-34.5%) เห็ดออรินจิ (12.5-37.5%) เห็ดชิเมจิขาว (0.5-34.5%) และเห็ดชิ เมจิ ดา (10.3-34.5%) ตามล าดับ สาเหตุท่ี % PPO inhibition แตกต่างกันนั้นอาจเป็ นผลเนื่องจากสารสกัด จากการตั ด แต่ ง เห็ ด แต่ ล ะชนิ ด ประกอบไปด้ วย สารประกอบบางอย่าง เช่น สารประกอบฟี นอลิกหรือสาร

ergothioneine ที่สามารถยับยั้งหรือชะลอการทางานของ เอนไซม์ได้ โดยสารประกอบฟี นอลิกจะเข้ าทาปฏิกริ ิยาที่ บริเวณ active site ของเอนไซม์ หรือทาปฏิกิริยากับ โปรตีนหรือเอนไซม์ผ่านพันธะไฮโดรเจนหรืออันตรกิริยา ไฮโดรโฟบิก ส่งผลให้ เอนไซม์ PPO ในกุ้งอาจจะเกิดการ รวมตัวหรือสูญเสียประสิทธิภาพในการทางาน (Nirmal & Benjaku, 2009) นอกจากนี้ สาร ergothioneine ซึ่ง จั ด เป็ นตั ว ยั บ ยั้ งแบบไม่ แ ข่ ง ขั น ( non-competitive inhibitor) อาจเข้ าจับกับเอนไซม์ PPO บริเวณอื่นที่ไม่ใช่ บริเวณ active site หรือทาหน้ าที่กาจัด Cu2+ บริเวณ binding site ส่งผลให้ เอนไซม์ PPO ทาปฏิกริ ิยากับสาร ตั้งต้ นได้ น้อยลง (Park et al., 2006; Encarnacion, et al., 2012) ดังนั้น เมื่อเอนไซม์ PPO ทาปฏิกริ ิยากับ สารตั้งต้ นได้ น้อยลง % PPO inhibition จึงเพิ่มขึ้น

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

213

รูปที่ 2 ค่าการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดสของสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดชนิดต่างๆ

2. การประยุกต์ใช้ สารสกัดจากการตัดแต่งเห็ด จากการศึกษาสมบัติการเป็ นสารต้ านอนุมูลอิสระ และสารยับยั้งการเกิดเมลาโนซิสของสารสกัดจากการตัด แต่ ง เห็ ด พบว่ า สารสกั ด จากการตั ด แต่ ง เห็ ด หอมมี แนวโน้ มในการเป็ นสารต้ านอนุ มูลอิสระและสารยับยั้ง การเกิดเมลาโนซิสสูงที่สุด โดยพิ จารณาจากปริมาณฟี นอลิกทั้งหมด, ค่าการต้ านอนุมูลอิสระ DPPH และค่า การยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ PPO ดังนั้น คณะผู้วิจัยจึง คัด เลื อกสารสกัด จากการตัด แต่ ง เห็ด หอม เพื่ อศึ กษา ระดับความเข้ มข้ นที่เหมาะสมต่อการชะลอการเกิดเมลา โนซิสในกุ้งขาว 2.1 ค่าคะแนนการเกิดเมลาโนซิส จากการวิเคราะห์ค่าคะแนนการเกิดเมลาโน ซิ ส โดยใช้ ผ้ ู ท ดสอบที่ผ่ า นการฝึ กฝน (รูป ที่ 3) พบว่ า ค่าคะแนนการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาวมีแนวโน้ มไปใน ทิศทางเดียวกัน คือเมื่อระยะเวลาการเก็บรักษาเพิ่มขึ้น การเกิดเมลาโนซิสจะเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วและต่อเนื่องไป เรื่อยๆ โดยกุ้งขาวที่แช่ในนา้ กลั่นมีระดับการเกิดเมลาโน ซิสเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว ส่งผลให้ ค่าคะแนนการเกิดเมลา โนซิสสูงกว่ ากุ้งขาวในชุดการทดลองอื่นๆ โดยจะสังเกตุ เห็นเมลาโนซิสได้ ในวันที่ 2 ของการเก็บรักษาและใน วันที่ 4 ของการเก็บรักษาพบว่า ค่าคะแนนการเกิดเมลา โนซิสมากกว่า 5 ซึ่งแสดงว่าผู้ทดสอบไม่ยอมรับตัวอย่าง ส่ว นกุ้ ง ขาวที่แ ช่ ใ นสารสกัดจากการตัด แต่ ง เห็ด หอมที่ ระดั บ ความเข้ ม ข้ น ต่ า งๆ พบว่ า ระดับ ความเข้ ม ข้ น ที่

เพิ่ มขึ้นจะแปรผกผันกับค่ า คะแนนการเกิด เมลาโนซิ ส กล่าวคือ เมื่อระดับความเข้ มข้ นของสารสกัดจากการตัด แต่งเห็ดหอมเพิ่มขึ้น ค่าคะแนนการเกิดเมลาโนซิสในกุ้ง จะต่ า ลง โดยกุ้ ง ขาวที่ แ ช่ ใ นสารสกัด จากการตั ด แต่ ง เห็ด หอมที่ร ะดับ ความเข้ ม ข้ น ร้ อยละ 0.5 และ 1.0 (น้าหนัก/ปริ มาตร) จะเกิดเมลาโนซิสค่ อนข้ างไวและ เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง ส่งผลให้ ค่าคะแนนจากผู้ประเมินมี ค่าเพิ่มขึ้นตามระยะเวลาการเก็บรักษา โดยจะสังเกตุเห็น เมลาโนซิสได้ ในวันที่ 2 และ 3 ของการเก็บรักษา ตามลาดับ และผู้ทดสอบยอมรับตัวอย่ างจนถึงวันที่ 4 ของการเก็บรักษา ในขณะกุ้งขาวที่แช่ในสารสกัดจากการ ตัดแต่ ง เห็ดหอมที่ระดับ ความเข้ ม ข้ น ร้ อยละ 1.5 และ 2.0 (นา้ หนัก/ปริมาตร) จะสังเกตุเห็นเมลาโนซิสได้ ใน วันที่ 4 ของการเก็บรักษา ส่งผลให้ มีค่าคะแนนการเกิด เมลาโนซิสต่ากว่ ากุ้งขาวที่แช่ ในสารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ ด หอมที่ ร ะดั บ ความเข้ ม ข้ นร้ อยละ 1.0 และ 0.5 (น้ า หนั ก /ปริ ม าตร) และกุ้ งขาวที่ แช่ ในน้ า กลั่ น ตามลาดับ (p<0.05) และยังมีความสามารถในการชะลอ การเกิดเมลาโนซิสได้ ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสาคัญกับ กับ กุ้งขาวที่แช่ในสารละลาย SMS ที่ระดับความเข้ มข้ นร้ อย ละ 1.25 (นา้ หนัก/ปริมาตร) (p≥0.05) นอกจากนี้ ผู้ทดสอบยังยอมรับตัวอย่างตลอดระยะเวลาเก็บรักษาใน นา้ แข็งเป็ นระยะเวลา 7 วัน

214

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

รูปที่ 3 คะแนนการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาวที่แช่ ในสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดหอมที่ระดับความเข้ มข้ นที่แตกต่ างกัน เมื่อ 0.5 %, 1.0 %, 1.5 % และ 2.0 % BMTE : สารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดหอมที่ระดับความเข้ มข้ นร้ อยละ 0.5, 1.0, 1.5 และ 2.0 (นา้ หนัก/ปริมาตร); control: นา้ กลั่น; 1.25 % SMS : สารละลายโซเดียมเมตาไบซัลไฟต์ท่รี ะดับความเข้ มข้ นร้ อยละ 1.25 (นา้ หนัก/ปริมาตร)

2.2 ค่าสีเทา ค่ า สีเ ทาเป็ นค่ า ที่ใ ช้ ส าหรั บ วิ เ คราะห์ ก าร เปลี่ยนแปลงการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาวที่แช่ในสารสกัด จากการตัดแต่งเห็ดหอมที่ระดับความเข้ มข้ นต่างๆ ที่ได้ จากการบันทึกภาพในแต่ ละวันและนาไปวิเคราะห์ด้วย โปรแกรมสาเร็จรูป (รูปที่ 4) ผลการศึกษาพบว่า ในวัน แรกของการเก็บรักษาค่าสีเทาจะมีค่าสูงที่สดุ เนื่องจากยัง ไม่พบการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาว แต่เมื่อระยะเวลาการ เก็บรักษาเพิ่มขึ้นค่าสีเทาในกุ้งขาวชุดควบคุมและกุ้งขาว ที่ แ ช่ ใ นสารสกั ด จากการตั ด แต่ ง เห็ ด หอมจะลดลง เนื่องจากระดับการเกิดเมลาโนซิสเพิ่มขึ้น โดยกุ้งขาวที่แช่ ในน้า กลั่น และกุ้ง ขาวที่แช่ ในสารสกัดจากการตัดแต่ ง เห็ด หอมที่ร ะดับ ความเข้ มข้ น ร้ อยละ 0.5 และ 1.0 (น้ า หนั ก /ปริ ม าตร) มี ค่ า สี เ ทาลดลงอย่ า งต่ อ เนื่ อ ง ในขณะที่ก้ ุงขาวที่แช่ ในสารละลาย SMS ที่ระดับความ

เข้ มข้ นร้ อยละ 1.25 (นา้ หนัก/ปริมาตร) และกุ้งขาวที่แช่ ในสารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ดหอมที่ระดับความเข้ มข้ น ร้ อยละ 1.5 และ 2.0 (นา้ หนัก/ปริมาตร) มีค่าสีเทา ลดลงอย่ างช้ าๆ ซึ่งผลที่ได้ สอดคล้ องกับค่าคะแนนการ เกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาวที่ได้ จากผู้ประเมิน คือ เมื่อค่ า คะแนนการเกิดเมลาโนซิสเพิ่มขึ้น ค่าสีเทาจะลงลด Bao (2014) ศึกษาการประยุกต์ใช้ สารสกัดจากเห็ดฟางต่อ การชะลอการเกิด เมลาโนซิ สในกุ้งขาว โดยพบว่ า สาร สกั ด จากเห็ ด ฟางที่ ระดั บ ความเข้ มข้ นร้ อยละ 1 (น้าหนัก/ปริมาตร) สามารถชะลอการเกิดเมลาโนซิ ส และมีการลดลงของค่าสีเทาช้ ากว่า เมื่อเทียบกับกุ้งขาวที่ แช่ ในสารสกัดจากเห็ดฟางที่ระดับความเข้ มข้ นร้ อยละ 0.75, 0.5 (นา้ หนัก/ปริมาตร) และนา้ กลั่น ตามลาดับ ตลอดระยะเวลาการเก็บรักษาในนา้ แข็งเป็ นเวลา 10 วัน

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

215

รูปที่ 4 ค่าสีเทา (mean gray value) ของกุ้งขาวที่แช่ในสารสกัดจากการตัดแต่งเห็ดหอม (คาบรรยายตามรูปที่ 3)

วิจารณ์และสรุปผลการศึกษา เอกสารอ้างอิง จากการศึกษาสมบัติในการเป็ นสารต้ านอนุ มูลอิสระ และการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ PPO โดยศึกษาปริมาณ สารประกอบฟี นอลิ กทั้ง หมด ค่ า การต้ า นอนุ มูล อิส ระ DPPH และค่าการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ PPO ในสาร สกัดจากการตัดแต่งเห็ดชนิดต่างๆ พบว่า สารสกัดจาก การตัดแต่ ง เห็ด แต่ ละชนิด มีสมบัติในการเป็ นสารต้ า น อนุ มู ล อิส ระและสมบัติ ใ นการยั บยั้ ง กิจ กรรมเอนไซม์ PPO แตกต่างอย่างมีนัยสาคัญ (p≤0.05) โดยสารสกัด จากการตั ด แต่ ง เห็ด หอมมีส มบั ติ ใ นการเป็ นสารต้ า น อนุมูลอิสระและการยับยั้งกิจกรรมเอนไซม์ PPO ดีท่สี ดุ และที่ระดับความเข้ มข้ นร้ อยละ 1.5 (นา้ หนัก/ปริมาตร) ของสารสกัดจากการตัดแต่ง เห็ดหอมมีประสิทธิภาพใน การชะลอการเกิดเมลาโนซิสในกุ้งขาวตลอดระยะเวลา การเก็บรักษาในน้าแข็งเป็ นเวลา 7 วัน ได้ ดีกว่ าเมื่อ เปรียบเทียบกับกุ้งขาวที่แช่ในนา้ กลั่นซึ่งเกิดเมลาโนซิสใน วันที่ 4 ของการเก็บรักษา (p≤0.05) กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณสถาบันวิจัยและพัฒนาแห่ ง มหาวิทยาลัย เกษตรศาสตร์ ที่สนับสนุนทุนในการวิจัย

กระทรวงเกษตรและสหกรณ์. (2557). สถิตกิ ารส่งออก (Export) กุ้ งขาว: ปริมาณและมูลค่ าการส่ง ออกราย เดือน. สืบค้ นจาก http://www.oae.go.th/oae_ report/ export_import/export.php [1] อรพิ นท์ จิ นตสถาพร, จุ ฑามาศ ทะแกล้ วพั น ธุ์, อรทัย จินตสถาพร, ศรีน้อย ชุ่ มคา, ฉั ตรชัย ไทยทุ่งฉิ น, และ สาธิต บุญน้ อม. (2556). การปรับปรุงคุณภาพเนื้อ ปลาสลิ ด ด้ ว ยของเหลื อจากการตัด แต่ ง เห็ด นางฟ้ าใน อาหารปลา. วารสารการพัฒนาชุมชนและคุณภาพชีวิต , 1(1), 125-133. [2] Akanmu, D., Cecchini, R., Aruoma, O. I., & Halliwell, B. (1991). The antioxidant action of ergothioneine. Arch Biochem Biophys, 288, 10–16. Arbaayah, H. H., & Umi, K. Y. (2013). Antioxidant properties in the oyster mushrooms (Pleurotus spp.) and split gill mushroom

216

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

(Schizophyllum commune) ethanolic extracts. Mycosphere, 4(4), 661–673. Bao, H. N. D. (2014). Antioxidant activity of hydrophylic extract from straw mushroom and its effect on shrimp melanosis. Khon Kean Agr. J., 42(4), 79-83.

Fang, X. B., Sun, H. Y., Huang, B. Y., & Yuan, G. F. (2013). Effect of pomegranate peel extract on the melanosis of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during iced storage. J. Food Agric. Environ., 11, 105-109. Ferreira, I. C. F. R., Vaz, J. A., Vasconcelos, M. A., & Martins, A. (2010). Compounds from wild mushrooms with antitumor potential. Anti-Cancer Agent. Me., 10, 424–436.

Bao, H. N. D., Osako, K., & Ohshima, T. (2010). Value-added use of mushroom ergothioneine as a colour stabilizer in processed fish meats. Sci. Food Agric., 90, 1634–1641. Jang, M. S., Sanada, A., Ushio, H., Tanaka, M., & Ohshima, T. (2003). Inhibitory effect of enokitake Bao, H. N. D., Shinomiya, Y., Ikeda, H., & extract on melanosis of shrimp. Fisheries Sci., 69, Ohshima, T. (2009). Preventing discoloration and 379–384. lipid oxidation in dark muscle of yellowtail by feeding an extract prepared from mushroom Jang, M. S., Sanada, A., Ushio, H., Tanaka, M., & (Flammulina velutipes) cultured medium. Ohshima, T. (2002). Inhibitory effect of ‘enokitake’ Aquaculture, 295, 243–249. mushroom extracts on polyphenol oxidase and prevention of apple browning. Lebnsm. Wiss. Buwjoom, T., & Yamauchi, K. (2005). Effects of Technol., 35, 697–702. shitake mushroom stalk meal on growth performance, carcass yield and blood composition in broilers. J. Jeong, S. C., Jeong, Y. T., Yang, B. K., Islam, R., Poult Sci., 42, 283-290. Koyyalamudi, S. R., & Pang, G., … Song, C. H. (2010). White button mushroom (Agaricus Dubost, N. J., Oua, B., & Beelmanb, R. B. (2007). bisporus) lowers blood glucose and cholesterol levels Quantification of polyphenols andergothioneine in in diabetic and hypercholesterolemic rats. Nutr. Res., cultivated mushrooms and correlation to total 30, 49–56. antioxidantcapacity. Food Chem., 105, 727–735. Martinez-Alvarez, O., Lopez-Caballero, M. E., Encarnacion, A. B., Fagutao, F., Jintasataporn, O., Gomez-Guillen, M. C., & Montero, P. (2009). The Worawattanamateekul, W., Hirono, I., & Ohshima, effect of several cooking treatments on subsequent T. (2012). Application of ergothioneine-rich extract chilled storage of thawed deepwater oink shrimp from an edible mushroom Flammulina velutipes for (Parapenaeus longirostris) treated with different melanosis prevention in shrimp, Penaeus monodon melanosis inhibiting formulars. LWT-Food Sci. and Litopenaeus vannamei. Food Res. Int., 45, Technol., 42, 1335-1344. 232–237.

Naresuan University Journal: Science and Technology 2016; 24(2)

217

Mau, J. L., Lin, H. C., & Chen, C. C. (2002). Antioxidant properties of several medicinal mushrooms. J. Agr. Food Chem., 50, 6072–6077.

Slinkkard, K., & Singleton, V. L. (1997). Total phenol analyses: automation and comparison with manual methods. Am. J. Enol. Viticult., 28, 49-55.

Motohashi, N., Mori, I., & Sugiura, Y. (1976). Complexing of copper ion by ergothioneine. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 24, 2364– 2368.

Sudha, G., Vadivukkarasi, S., Shree, R. B. I., & Lakshmanan, P. (2012). Antioxidant Activity of Various Extracts from an Edible Mushroom Pleurotus eous. Food Sci. Biotechnol., 21(3), 661-668.

Nirmal, N. P., & Benjakul, S. (2009). Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during iced storage. Food Chem., 116, 323-331.

Tepwong, P., Giri, A., Sasaki, F., Fukui, R., & Ohshima, T. (2012). Mycobial enhancement of ergothioneine by submerged cultivation of edible mushroom mycelia and its application as an antioxidative compound. Food Chem., 131, 247258.

Nirmal, N. P., & Benjakul, S. (2011). Inhibition of Translated Thai Reference melanosis formation in Pacific white shrimp by the extract of lead (Leucaena leucocephala) seed. Food Jintasataporn, O., Thaklaewphan, C., Jintasataporn, Chem., 128, 427–432. O., Chumkam, S., Thaituchin, C. & Boonnom, S. Otwell, W. S., & Marshall, M. R. (1986). (2013). Improving fillet quality of snakeskin Screening alternatives to sulfiting agents to control Gourami (Trichogaster pectoralis) by supplemental shrimp melanosis (blackspot). Retrieved from sarjor-caju mushroom (Pleurotus sajor-caju) byhttp://fshn.ifas.ufl.edu/seafood/sst/ AnnPdf/11th_ product in fish diets. J. Commun. Dev. Life Qual., 1(1), 125-133. [in Thai] [2] 035.pdf Park, Y., Lyou, Y., Hahn, H., Hahn, M., & Yang, J. (2006). Complex inhibition of tyrosinase by thiolcomposed Cu2+ chelators: A clue for designing whitening agents. J. Biomol. Struct. Dyn., 24, 131– 137.

Ministry of Agriculture and Cooperatives. (2014). Statistics on white shrimp export: the quantity and value of export by monthly Retrieved from http://www.oae.go.th/oae_report/export_import/ex port.php [in Thai] [1]

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

ระเบียบการตีพมิ พ์วารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี Naresuan University Journal: Science and Technology วารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี เป็ นวารสารที่เผยแพร่ผลงานวิจัย และบทความ ปริทศั น์ (วิชาการ) ในด้ านวิทยาศาสตร์เทคโนโลยี และด้ านวิทยาศาสตร์สขุ ภาพ ดังนั้น เพื่อให้ นักวิจัยและเจ้ าของ ผลงานนิพนธ์ส ามารถเตรียมต้ น ฉบับ ได้ ถูก ต้ องและได้ มาตรฐานตามระเบียบของวารสารมหาวิทยาลั ยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี จึงขอชี้แจงดังนี้ 1. วารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ถือเป็ นสื่อกลางการเผยแพร่บทความงานวิจัยและผลงาน ทางวิชาการในสาขาต่างๆ ในด้ านวิทยาศาสตร์เทคโนโลยี และด้ านวิทยาศาสตร์สุขภาพ มีกาํ หนดออก เผยแพร่ปีละ 3 ฉบับ คือ เดือนมกราคม - เมษายน เดือนพฤษภาคม - สิงหาคม และเดือนกันยายน ธันวาคม 2. ผลงานที่ส่งมาจะต้ องไม่เคยเสนอ หรือกําลังเสนอตีพิมพ์ในวารสารวิชาการใดมาก่อน 3. วารสารฯ รับตีพิมพ์บทความงานวิจัย หรือบทความทางวิชาการ ทั้งภาษาไทยและภาษาอังกฤษ 4. บทความงานวิจัย หรือบทความทางวิชาการที่เป็ นฉบับภาษาอังกฤษจะได้ รับการพิจารณาเป็ นอันดับแรก 5. บทความงานวิ จั ย หรื อ บทความทางวิ ช าการที่เ ป็ นฉบับ ภาษาไทยต้ องดํา เนิ น การแปลเอกสารอ้ า งอิง (References) เป็ นภาษาอังกฤษก่อนเสนอตีพมิ พ์ สําหรับการวิจัยที่เกี่ยวข้ องกับมนุษย์หรือสัตว์ทดลอง วารสารฯ จะรับพิจารณาเฉพาะบทความที่มีหลักฐาน ยืนยันว่า โครงการวิจัย ได้ ผ่านการรับรองเชิงจริยธรรมจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในมนุษย์หรือสัตว์ทดลอง แล้ วเท่านั้น นอกจากนี้ สําหรับการวิจัยที่เกี่ยวข้ องกับมนุษย์ เจ้ าของผลงานนิพนธ์ต้องแสดงให้ เห็นว่า ผู้เข้ าร่วมการ ทดลองได้ รับทราบข้ อมูลและตัดสินใจเข้ าร่วมโดยความสมัครใจ ทั้งนี้ การอนุ มตั ิให้ลงตีพมิ พ์ได้หรือไม่น้ นั ผลการ พิจารณาจากกองบรรณาธิการวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ถือเป็ นที่สิ้นสุด ข้อแนะนําสําหรับการส่งต้นฉบับครั้งแรก ประกอบด้ วย ขั้นตอนที่ 1 บั น ทึ ก ข้ อมู ล ส่ ว นตั ว ของท่ า นในระบบการรั บ สมั ค รบทความออนไลน์ โดยเข้ าไป ที่ http://www.journal.nu.ac.th และ Upload บทความต้ นฉบับ ทั้งนี้ ท่านสามารถใช้ Username และ Password ในการติดตามผลงานของท่าน และสามารถใช้ ในการจัดส่งบทความครั้งต่อไป ขั้นตอนที่ 2 กรุณาติดตามการตอบรับบทความทางอีเมล์ ซึ่งท่านจะได้ รับเอกสารดังนี้ 1. บันทึกข้ อความ 2. หนังสือนําส่งต้ นฉบับบทความ ซึ่งผู้นิพนธ์ทุกท่านต้ องลงนามยืนยัน ขั้นตอนที่ 3 จัดส่งบันทึกข้ อความ และหนังสือนําส่งพร้ อมต้ นฉบับบทความ จํานวน 1 ชุด ทางไปรษณีย์ หรือ E-mail: naresuanjournal@gmail.com กรณีประสงค์สมัครสมาชิกวารสารฯ ให้ นาํ ส่งพร้ อมค่าสมัครตามอัตราค่าสมัครใน เว็บไซต์ของวารสาร ทั้งนี้ สําหรับท่านที่ยงั ไม่เคยสมัครเป็ นสมาชิก หรือหมดอายุการเป็ นสมาชิก ทางวารสารได้ยกเว้น ค่าสมัครสมาชิก ท่านสามารถส่งบทความลงตีพมิ พ์ได้โดยไม่มีค่าใช้จ่ายใดๆ ทั้งสิ้ น 39

จัดส่งมายัง

บรรณาธิการวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี งานวิจัยและวิเทศสัมพันธ์ มหาวิทยาลัยนเรศวร บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยนเรศวร อาคารมหาธรรมราชา ชั้น 1 ตําบลท่าโพธิ์ อําเภอเมือง จังหวัดพิษณุโลก 65000 โทรศัพท์ 0-5596-8835 โทรสาร 0-5596-8844

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

ขั้นตอนการดําเนินงานภายหลังรับต้นฉบับ ขั้นตอนที่ 1 ออกหนังสือยืนยันการได้ รบั สิ่งตีพิมพ์หรือผลงานนิพนธ์ (ต้ นฉบับ) เพื่อเข้ าสู่กระบวนการพิจารณาของ ผู้ทรงคุณวุฒิ จากบรรณาธิการ ขั้นตอนที่ 2 กองบรรณาธิการตรวจสอบผลงานนิพนธ์เบื้องต้ น หากพบว่าเนื้อหายังไม่สมบูรณ์ และไม่เป็ นไป ตามเกณฑ์ท่กี าํ หนดไว้ ทางวารสารฯ จะจัดส่งต้ นฉบับคืนให้ ผ้ นู ิพนธ์พร้ อมออกหนังสือเป็ นลายลักษณ์อกั ษร ขั้นตอนที่ 3 จัดส่งผลงานนิพนธ์ให้ ผ้ ูทรงคุณวุฒิอย่ างน้ อย 2 ท่านต่ อ 1 ผลงาน ตรวจสอบผลงานนิพนธ์ ภายในระยะเวลา 14 วัน กรณี ไม่ผ่าน วารสารฯ จะส่งคืนต้ นฉบับให้ ผ้ นู ิพนธ์พร้ อมออกหนังสือเป็ นลายลักษณ์อกั ษร กรณี ผ่าน วารสารฯ จะดําเนินการแจ้ งสิ่งที่ต้องแก้ ไขตามข้ อเสนอแนะของผู้ทรงคุณวุฒิให้ ผ้ ูนิพนธ์ทราบ และดําเนินการแก้ ไขภายในระยะเวลา 7 วัน (ผลงานของท่านจะถูกแก้ ไขจนกว่าจะมีความสมบูรณ์ได้ มาตรฐานและ ได้ รับการยืนยันให้ ลงตีพิมพ์จากผู้ทรงคุณวุฒิ) ขั้นตอนที่ 4 ผลงานนิพนธ์ท่ีผ้ ูทรงคุณวุฒิยืนยันให้ ตีพิมพ์ วารสารฯ จะนําเข้ าสู่การพิจารณาโดยกองบรรณาธิการ วารสาร มหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี เป็ นขั้นตอนสุดท้ าย ผลงานนิพนธ์บางเรื่องอาจไม่ได้ รับการ พิจารณาซึ่งผลการพิจารณาของกองบรรณาธิการวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวรถือเป็ นที่ส้ นิ สุด ขั้นตอนที่ 5 วารสารฯ ออกหนังสือแจ้ งกําหนดการลงตีพิมพ์ให้ ผ้ ูนิพนธ์ทราบเป็ นลายลักษณ์อักษร พร้ อมระบุ ปี ที่(ฉบับที่) ลงตีพิมพ์ องค์ประกอบของบทความงานวิจยั (Research article) ส่วนแรก ควรประกอบด้ วย ชื่อเรื่อง (ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ) ชื่อผู้นิพนธ์ (ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ) ที่อยู่ผ้ นู ิพนธ์สงั กัดภาควิชา คณะ มหาวิทยาลัย เมือง จังหวัด รหัสไปรษณีย์ (ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ) และอีเมล์ของ ผู้นิพนธ์หลัก 1 ท่าน (กรณีบทความเป็ นภาษาอังกฤษไม่ตอ้ งมีภาษาไทยกํากับ) บทคัดย่อ (Abstract) บทความงานวิจัยต้ องประกอบด้ วยบทคัดย่อที่ระบุถงึ ความสําคัญของเรื่อง วัตถุประสงค์ วิธีการศึกษา ผลการศึกษา และบทสรุป ก่อนแล้ วตามด้ วยบทคัดย่ อภาษาอังกฤษที่มีเนื้อหาตรงกันโดยในส่วน บทคัดย่อนี้ เนื้อหารวมกันแล้ วไม่เกิน 600 คํา ต้ องระบุคาํ สําคัญ (Keywords) จํานวนไม่เกิน 5 คํา (บทความ ภาษาไทยต้องมีบทคัดย่อภาษาอังกฤษ แต่กรณีบทความภาษาอังกฤษไม่ตอ้ งมีบทคัดย่อภาษาไทย) เนื้ อหาของบทความ การเขียนเนื้อหาบทความวิจัย ควรมีข้อมูลตามลําดับดังนี้ 1) บทนํา 2) วัสดุอุปกรณ์และ วิธกี ารศึกษา 3) ผลการศึกษา 4) อภิปรายผลการศึกษา 5) สรุปผลและข้ อเสนอแนะ (ถ้ ามี) 6) กิตติกรรมประกาศ (ถ้ ามี) และ 7) เอกสารอ้ างอิง กรณีเอกสารอ้ างอิงเป็ นภาษาไทยจะต้ องแปลเป็ นภาษาอังกฤษตามรูปแบบที่กาํ หนดให้ ดูตัวอย่างได้ จาก เว็บไซต์ http://www.journal.nu.ac.th ความสําคัญของที่มาและปั ญหาของงานวิจัย ภูมิหลังของงานวิจัยที่เกี่ยวข้ องสมมุติฐาน และวัตถุประสงค์ของการวิจัยให้ เขียนไว้ ในส่วนบทนํา เทคนิคและวิธกี ารทั่วไปให้ อธิบายไว้ ในส่วนวัสดุอปุ กรณ์และวิธกี ารศึกษา ผลการทดลองต่าง ๆ ให้ อธิบายไว้ ในส่วนผลการศึกษา การวิเคราะห์เปรียบเทียบผลการทดลองกับงานของผู้อ่นื ให้ เขียนไว้ ใน ส่วนวิจารณ์ผลการศึกษา และการสรุปผลการศึกษาที่สามารถตอบวัตถุประสงค์ได้ ให้ เขียนไว้ ในส่วนสรุปผลการศึกษา ผู้นิพนธ์ อาจมีหัวข้ อย่อยในส่วนวัสดุอปุ กรณ์และวิธกี าร และ/หรือ ในส่วนผลการศึกษาได้ แต่ไม่ควรมีจาํ นวนหัวข้ อย่อยมากเกินไป 30

องค์ประกอบของบทความปริทศั น์ (Review article) บทความปริทศั น์เป็ นการนําเสนอภาพรวมของเรื่องที่น่าสนใจ ส่วนแรก ควรประกอบด้ วยชื่อเรื่อง (ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ) ชื่อผู้นิพนธ์ (ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ) ที่ อยู่ผ้ นู ิพนธ์ หรือสังกัดภาควิชา คณะ มหาวิทยาลัย เมือง จังหวัด รหัสไปรษณีย์ (ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ) และอีเมล์ ของผู้นิพนธ์หลัก 1 ท่าน (กรณีบทความเป็ นภาษาอังกฤษไม่ตอ้ งมีภาษาไทยกํากับ)

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

บทคัดย่อ (Abstract) เนื้อหารวมกันแล้ วไม่เกิน 600 คํา โดยเป็ นการย่อเรื่องให้ เข้ าใจว่าเรื่องที่นาํ เสนอมีความ น่าสนใจและความเป็ นมาอย่างไร (บทความภาษาไทยต้องมีบทคัดย่อภาษาอังกฤษ แต่กรณีบทความภาษาอังกฤษ ไม่ตอ้ งมีบทคัดย่อภาษาไทย) เนื้ อหาของบทความ ควรประกอบด้ วย บทนํา (Introduction) เพื่อกล่าวถึงความน่าสนใจของเรื่องที่นาํ เสนอ ก่อนเข้ าสู่เนื้อหาในแต่ละประเด็น และต้ องมีบทสรุป (Conclusion) เพื่อขมวดปมเรื่องที่นาํ เสนอ พร้ อมข้ อเสนอแนะ จากผู้นิพนธ์เกี่ยวกับเรื่องดังกล่ าวเพื่อให้ ผ้ ูอ่านได้ พิจารณาประเด็นที่น่าสนใจต่อไป สําหรับรูปแบบของการเขียน เหมือนกับบทความงานวิจัย ผู้นิพนธ์ควรตรวจสอบเนื้อหาที่เกี่ยวข้ องกับบทความที่นาํ เสนออย่างละเอียด โดยเฉพาะอย่างยิ่งเนื้อหาที่ใหม่ ที่สดุ เป็ นปัจจุบนั กาล เรื่องกําลังเป็ นที่น่าสนใจของสังคม จะได้ รับการพิจารณาเป็ นอันดับแรก บทความปริทศั น์ต้อง นําเสนอพัฒนาการของเรื่องที่น่าสนใจ ข้ อมูลที่นาํ เสนอจะต้ องไม่จาํ เพาะเจาะจงเฉพาะผู้อ่านที่อยู่ในสาขาของบทความ เท่านั้นแต่ต้องนําเสนอข้ อมูลซึ่งผู้อ่านในสาขาอื่นหรือนิสติ นักศึกษาในระดับสูงสามารถเข้ าใจได้ การจัดเตรียมต้นฉบับบทความ 1. การจัดรูปแบบบทความด้วยโปรแกรม Microsoft Word (Template ได้ที่ http://www.journal.nu.ac.th) 1.1 จัดหน้ ากระดาษ A4 โดยตั้งค่าหน้ ากระดาษดังนี้ ขอบบน 2.5 เซนติเมตร ขอบล่าง 2.5 เซนติเมตร ขอบซ้ าย 3 เซนติเมตร และขอบขวา 2.5 เซนติเมตร 1.2 จัดบทความให้ อยู่ในลักษณะเว้ นบรรทัด (1.5 lines) และมีเลขบรรทัดกํากับตลอดบทความ รวมทั้งตารางและ รูปภาพ 1.3 ใส่เลขหน้ ากํากับด้ านล่างขวาของกระดาษทุกหน้ า 1.4 จํานวนหน้ าผลงาน มีกาํ หนดไม่เกิน 12 หน้ า 2. ผลงานนิพนธ์ (ใช้ตวั อักษร Eucrosia UPC ตลอดทั้งบทความ) ชื่อเรื่อง ไม่ควรเกิน 100 ตัวอักษรรวมเว้ นวรรค ไม่ใช้ ช่ อื สามัญและชื่อวิทยาศาสตร์ของสิ่งมีชีวิตพร้ อมกัน ใช้ ตวั อักษรขนาด 18 พ้ อยท์ตวั หนา ชื่อผูน้ ิพนธ์ อยู่ถดั ลงมาจากชื่อเรื่อง ให้ ใช้ ตวั อักษรขนาด 16 พ้ อยท์ตัวธรรมดา หากมีผ้ ูนิพนธ์หลายคนที่ สังกัดต่างหน่วยงานกันให้ ใช้ ตวั อักษรภาษาอังกฤษ ตัวเล็กกํากับเหนือตัวอักษรสุดท้ ายของนามสกุลแต่ละคน ตามด้ วย เครื่องหมายดอกจัน (asterisk) สําหรับติดต่อผู้นิพนธ์ (Corresponding author) ที่อยู่ผูน้ ิพนธ์ อยู่ถัดลงมาจากชื่อผู้นิพนธ์ ให้ เขียนเรียงลําดับตามตัวอักษรภาษาอังกฤษที่กาํ กับไว้ ในส่วน ของชื่อผู้นิพนธ์ ใช้ ตวั อักษรขนาด 12 พ้ อยท์ตวั ธรรมดา ผูน้ ิพนธ์สําหรับติดต่อ อยู่ถดั จากที่อยู่ผ้ ูนิพนธ์ ให้ ใส่อเี มล์ของผู้นิพนธ์หลักที่สามารถติดต่อได้ ในระหว่าง ดําเนินการ ใช้ ตวั อักษรขนาด 12 พ้ อยท์ตวั ธรรมดา บทคัดย่อ ให้ จัดหัวเรื่องบทคัดย่อไว้ กลางหน้ ากระดาษ โดยใช้ ตัวอักษร Eucrosia UPC ขนาด 12 พ้ อยท์ ตัวหนา เนื้อความในบทคัดย่อขนาด 12 พ้ อยท์ ตัวธรรมดา ท้ ายบทคัดย่อให้ ระบุ คําสําคัญ (Keywords) จัดชิดขอบ ซ้ ายของกระดาษ ใช้ ตวั อักษรขนาด 12 พ้ อยท์ ตัวหนา และใช้ ตัวอักษรขนาด 12 พ้ อยท์ ตัวธรรมดา สําหรับคําสําคัญ แต่ละคํา กรณีภาษาไทยให้ เว้ นวรรค 2 เคาะ กรณีภาษาอังกฤษให้ ค่นั ด้ วยเครื่องหมายจุลภาค (,) เนื้ อหาในบทความ หัวเรื่อง Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion and Conclusions, Acknowledgements และ References ให้ ใช้ ตัวอักษรขนาด 14 พ้ อยท์ตัวหนา สําหรับเนื้อหาให้ ใช้ ตัวอักษรขนาด 14 พ้ อยท์ตวั ธรรมดา

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

ตารางและรูปภาพ คําอธิบายตารางให้ ใช้ คาํ ว่า ตารางที่ หรือ Table สําหรับรูปภาพให้ ใช้ คาํ ว่า รูปที่ หรือ Figure กํากับด้ วยตัวเลข 1, 2, 3,... ตามลําดับ โดยใช้ อกั ษรขนาด 12 พ้ อยท์ตัวหนา ส่วนชื่อตารางและชื่อรูป ให้ ใช้ อักษรขนาด 12 พ้ อยท์ตวั ธรรมดา ตารางต้ องไม่มเี ส้ นสดมภ์ ตัวอักษรหรือตัวเลขที่นาํ เสนอในรูปกราฟหรือตารางต้ อง เป็ นตัวอักษรขนาด 12 พ้ อยท์ตวั ธรรมดา สําหรับคําอธิบายเชิงอรรถให้ ใช้ ตวั อักษรขนาด 10 พ้ อยท์ การนําเสนอตาราง หัวข้ อตารางให้ เริ่มที่มุมซ้ ายด้ านบนของเส้ นตาราง ตามลําดับเลขที่ปรากฏในต้ นฉบับ ตารางที่นาํ เสนอจะต้ องแสดง รายละเอียดที่ครอบคลุมเนื้อหาทั้งหมด โดยไม่จาํ เป็ นต้ องกลับไปอ่านในเนื้อความหรือตารางอื่นประกอบ เมื่อผู้นิพนธ์ได้ นําเสนอข้ อมูลไว้ ในตารางหรือภาพแล้ ว ควรหลีกเลี่ยงการนําเสนอข้ อมูลอีกครั้งในเนื้อความ ควรเขียนชื่อตารางในลักษณะ ย่อใจความข้ อมูลที่นาํ เสนอโดยไม่กล่าวซํา้ ในหัวข้ อย่อยของตารางอีก หัวข้ อย่อยของตารางควรสั้นกะทัดรัด ตารางที่นาํ เสนอมักเป็ นข้ อมูลตัวเลขที่แสดงการเปรียบเทียบหรือความสัมพันธ์ระหว่างข้ อมูล ข้ อมูลที่นาํ เสนอ ในตารางควรมีความสอดคล้ องกับข้ อมูลในส่วนของเนื้อความ หลีกเลี่ยงการใช้ ข้อมูลที่ไม่จาํ เป็ น สามารถใช้ คาํ ย่อใน ตารางได้ แต่ควรอธิบายคําย่ อที่ไม่ใช่ คาํ มาตรฐานในเชิงอรรถ (footnote) ให้ เขียนเชิงอรรถโดยระบุตัวอักษร ภาษาอังกฤษไว้ ด้านบนและเรียงลงมาตามลําดับ ตารางที่สร้ างขึ้นมาไม่ต้องมีเส้ นสดมภ์ มีแต่เส้ นแนวนอน ตารางที่ นําเสนอจะต้ องเป็ นตารางที่พอเหมาะกับกระดาษขนาด A4 ดังตัวอย่าง ตารางที่ 1 แสดงผลทดสอบสมมติฐานที่มี ความสัมพั นธ์ระหว่ างปั จจัยส่ วนบุคคลและพฤติก รรมการซื้ อสินค้ าสุขภาพและความงาม ทางออนไลน์สาํ หรับตลาดกลางพาณิชย์อเิ ล็กทรอนิกส์ Chi-Square Test ปัจจัยส่วนบุคคล พฤติกรรมการซื้อ Sig (2-sided) เพศ การหาข้ อมูลก่อนการตัดสินใจซื้อ .013 อายุ ความถี่ในการซื้อ .000 รายได้ การหาข้ อมูลก่อนการตัดสินใจซื้อ .006 Table 2 Frequency of detected retromolar canals (n) according to gender or side (n total=99) Study parameter subgroups n/n total Male 28/39 Gender Female 36/60 Right 33/51 Side Left 31/48

Percentage (%) 71.79 60 64.70 64.58

การนําเสนอรูปภาพ (ภาพถ่าย กราฟ ชาร์ตหรือไดอะแกรม) ผู้นิพนธ์ต้องนําเสนอรูปภาพที่มีความคมชัดพร้ อมระบุหมายเลขกํากับรูปภาพ ต้ องมีรายละเอียดของข้ อมูล ครบถ้ วนและเข้ าใจได้ โดยไม่จาํ เป็ นต้ อง กลับไปอ่านที่เนื้อความอีก ระบุลาํ ดับของรูปภาพทุกรูปให้ สอดคล้ องกับ เนื้อหาที่อยู่ในต้ นฉบับ และมีขนาดที่เท่ากัน ชื่อของรูปภาพให้ เริ่มที่มุมซ้ ายล่าง ในกรณีนาํ เสนอรูปภาพที่มเี ส้ นกราฟ ผู้นิพนธ์ต้องนําเสนอเส้ นกราฟแต่ละเส้ นที่สามารถแยกความแตกต่างกัน ได้ และมีคุณภาพดี ใช้ สญ ั ลักษณ์มาตรฐาน (เช่น สี่เหลี่ยม สามเหลี่ยม วงกลม) หรือสัญลักษณ์อ่นื เป็ นตัวแทนนําเสนอ ได้ หากมีสญ ั ลักษณ์กาํ กับเส้ นกราฟ เช่ น ดอกจันทร์เพื่อแสดงความมีนัยสําคัญทางสถิติจะต้ องอธิบายสัญลักษณ์ ดังกล่ าวอย่ างชัดเจนบริเวณเชิงอรรถใต้ กราฟ และใช้ ตัวอักษร Eucrosia UPC (ทั้งบทความภาษาอังกฤษและ ภาษาไทย) กํากับแกน x แกน y และแกน z (หากมี) รวมทั้งอธิบายค่าต่างๆ ในกราฟทั้งหมด

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

รูปที่ 1 …………………………………………………......

หากนําเสนอเป็ นแท่งกราฟ ควรใช้ แท่งกราฟขาวดํา อาจมีลวดลายระบุแสดงความแตกต่างของแต่ละแท่งกราฟ อย่างชัดเจนดังรูปที่ 2 หลีกเลี่ยงการใช้ แท่งกราฟที่มีลักษณะแรงเงา (shading) หากมีสญ ั ลักษณ์กาํ กับแท่งกราฟ เช่น ดอกจันเพื่อแสดงความมีนัยสําคัญทางสถิติ จะต้ องอธิบายสัญลักษณ์ดังกล่ าวอย่างชัดเจนบริเวณเชิงอรรถใต้ กราฟ และใช้ ตวั อักษร Eucrosia UPC (ทั้งบทความภาษาอังกฤษและภาษาไทย) กํากับแกน x แกน y และ แกน z (หากมี) รวมทั้งอธิบายค่าต่างๆ ในกราฟทั้งหมด

Figure 2 …………………………………………………..

ภาพถ่ายจากฟิ ล์มเนกาติฟ (negative) ในกรณีท่ผี ลการศึกษามีภาพถ่ายจากฟิ ล์มเนกาติฟ ผู้นิพนธ์ต้องส่งภาพจริงมาพร้ อมต้ นฉบับระบุรายละเอียด ของข้ อมูลด้ านหลังภาพเพื่อป้ องกันความสับสน หากมีหลายภาพ ควรใช้ ภาพที่มีขนาดเท่ากันทั้งนี้วารสารฯ จะ พิจารณาเฉพาะภาพที่มคี วามคมชัดดีมากเท่านั้น ในกรณีท่เี ป็ นภาพถ่ายจากกล้ องจุลทรรศน์ ต้ องใส่แท่งสเกลบนภาพเพื่อระบุขนาดกําลังขยายของภาพถ่าย ภาพจํ าลองจากระบบดิจิตอล วารสารฯ อนุโลมให้ ใช้ ภาพจําลองซึ่งถ่ายจากกล้ องระบบดิจิตอลหรือเครื่องสแกนภาพสําหรับนําเสนอผลการศึกษา ได้ แต่จะต้ องเป็ นภาพที่มี ความคมชัดของรายละเอียดดีมากเท่านั้น โดยควรมีความละเอียดของภาพอย่างน้ อยที่สดุ 360 ppi (หากเป็ นภาพที่เป็ นลายเส้ นจะต้ องมีความ ละเอียดอย่างน้ อยที่สดุ 600 ppi) จัดเก็บภาพไว้ ในแฟ้ มเอกสาร (file) สกุล jpg หรือ tif ที่มขี นาดไม่เกิน 1 เมกะไบท์ต่อภาพ ผู้นิพนธ์ควร จัดเก็บแฟ้ มเอกสารของภาพแยกจากแฟ้ ม เอกสารเนื้อเรื่อง เนื่องจากความหลากหลายของโปรแกรม เครื่องสแกนภาพ หรือจอภาพคอมพิวเตอร์ ผู้นิพนธ์จะต้ อง รับผิดชอบในการจัดเตรียมภาพถ่ายที่สามารถนํามาเปิ ดใช้ งานได้ หากไม่สามารถเปิ ดภาพจําลองที่เตรียมมาได้ อาจส่งผลให้ การดําเนินการเกิดความล่าช้ า หรือไม่ได้ รับการพิจารณา วารสารฯ ไม่อนุญาตให้ ใช้ ภาพจําลองที่สร้ างมาจากโปรแกรมไมโครซอฟท์ออฟฟิ ศ (Microsoft Office) เช่น พาวเวอร์พอยท์ (Power Point) เอกเซล (Excel) หรืออื่นๆ

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

การอ้างอิงเอกสาร เอกสารที่นาํ มาอ้ างอิงควรได้ มาจากแหล่งที่มกี ารตีพิมพ์ชัดเจน อาจเป็ นวารสาร หนังสือ หรืออินเตอร์เน็ตก็ได้ ทั้งนี้ผ้ นู พิ นธ์เป็ นผู้รับผิดชอบต่อความถูกต้ องของเอกสารอ้ างอิงทั้งหมด การอ้างอิงในเนื้ อความ กรณีผ้ แู ต่งหนึ่งราย เอกสารอ้ างอิงภาษาไทย ตัวอย่าง สรุปความ ชื่อชื่อสกุล,ปี ที่พิมพ์ (สุขใจ อิ่มเอม, 2548) หรือ สุขใจ อิ่มเอม (2548) คัดลอก ชื่อชื่อสกุล,ปี ที่พิมพ์, น.เลขหน้ า (สุขใจ อิ่มเอม, 2548, น. 1) หรือ สุขใจ อิ่มเอม, (2548, น. 1) เอกสารอ้ างอิงภาษาอังกฤษ ตัวอย่าง สรุปความ ชื่อสกุล,ปี ที่พิมพ์ (Smith, 2005) or Smith (2005) คัดลอก ชื่อสกุล,ปี ที่พิมพ์,น.เลขหน้ า (Smith, 2005, p. 1) or Smith (2005, p. 1) กรณีผ้ ูแต่งสองราย เอกสารอ้ างอิงภาษาไทย ตัวอย่าง สรุปความ ชื่อชื่อสกุลคนแรกและชื่อชื่อสกุล (สุขใจ อิ่มเอม และพอดี พอใช้ , 2548) หรือ คนที่สอง,ปี ที่พิมพ์ สุขใจ อิ่มเอม และพอดี พอใช้ (2548) คัดลอก ชื่อชื่อสกุลคนแรกและชื่อชื่อสกุล (สุขใจ อิ่มเอม และพอดี พอใช้ , 2548, น. 5-8) คนที่สองปี ที่พิมพ์, น.เลขหน้ า หรือ สุขใจ อิ่มเอม และพอดี พอใช้ (2548, น. 5-8) เอกสารอ้ างอิงภาษาอังกฤษ ตัวอย่าง สรุปความ ชื่อชื่อสกุลคนแรก& ชื่อชื่อสกุลคน (Smith and Xu, 2005) or Smith and Xu (2005) ที่สอง,ปี ที่พิมพ์ คัดลอก ชื่อชื่อสกุลคนแรก& ชื่อชื่อสกุลคน (Smith & Xu, 2005, pp. 5-8) or Smith & Xu ที่สองปี ที่พิมพ์, หน้ า.เลขหน้ า (2005, pp. 5-8) กรณีผ้ ูแต่ง 3-8 หรือมากกว่า เอกสารอ้ างอิงภาษาไทย ตัวอย่าง สรุปความ ชื่อชื่อสกุลคนแรก และคนอื่นๆ,ปี ที่ (สุขใจ อิ่มเอม และคนอื่นๆ, 2548) หรือ พิมพ์ สุขใจ อิ่มเอม และคนอื่นๆ (2548) คัดลอก ชื่อชื่อสกุลคนแรก และคนอื่นๆ,ปี ที่ (สุขใจ อิ่มเอม และคนอื่นๆ, 2548, น. 5-8) หรือ พิมพ์, น.เลขหน้ า สุขใจ อิ่มเอม และคนอื่นๆ (2548, น. 10) เอกสารอ้ างอิงภาษาอังกฤษ ตัวอย่าง สรุปความ ชื่อชื่อสกุลคนแรกet al.,ปี ที่พิมพ์ (Smith et al., 2005) or Smith et al. (2005) คัดลอก ชื่อชื่อสกุลคนแรกet al.ปี ที่พิมพ์, (Smith et al., 2005, p. 10) or หน้ า.เลขหน้ า Smith et al. (2005, p. 10) การอ้างอิงท้ายบทความ ให้ ผ้ ูนิพนธ์เขียนเอกสารอ้ างอิงตามรูปแบบของ The American Psychological Association (APA style) 6th Edition สามารถดาวน์โหลดได้ ท่ี http://www.journal.nu.ac.th

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

ใบสมัครสมาชิกวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี วันที่ …….. เดือน ……………. พ.ศ. .............. เรียน กองบรรณาธิการวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ขาพเจา (นาย,นาง,นางสาว/ตําแหนงทางวิชาการ)............................…………………………………..…………………. สังกัด-สถานที่อยู ……………………………………………………………………………………………………….………………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… โทรศัพท..................................................................E-mail…………………………………………………………………… มีความประสงคจะขอสมัครสมาชิกวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ( ) สมาชิกประเภทบุคคลรายป 100 บาท ( ) สมาชิกประเภทบุคคลราย 3 ป 250 บาท ( ) สมาชิกประเภทองคกร/หนวยงาน รายป 100 บาท ( ) สมาชิกประเภทองคกร/หนวยงาน ราย 3 ป 250 บาท พรอมนี้ ขาพเจาไดสง ( ) เงินสด ( ) ธนาณัติ (สั่งจาย ปณ.เคานเตอรมหาวิทยาลัยนเรศวร 00036) ( ) ตั๋วแลกเงินไปรษณีย ในนาม ผูชวยบรรณาธิการวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี โปรดสงวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ตามที่อยูดังนี้ ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ลงชื่อ……………………..……………………. (.............…………………………………..) หมายเหตุ

1. การสงบทความลงตีพิมพไมจําเปนตองสมัครสมาชิก 2. บุคคล/หนวยงาน/องคกร ที่ตองการสมัครสมาชิกวารสารเพื่อประโยชนในการศึกษาคนควา กรุณากรอกขอมูลตามแบบฟอรมขางตน และจัดสงใหวารสารดําเนินการตอไป

ISSN 0858 – 7418 Naresuan University Journal: Science and Technology

แบบเพื่อขอลงตีพิมพในวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ชื่อเรื่อง ภาษาไทย ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................................. Title English ................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................. ชื่อ-สกุล ผูแตงหลัก ภาษาไทย ............................................................................................................................................ English ............................................................................................................................................... ที่อยู ภาษาไทย ..................................................................................................................................................................... Address English .............................................................................................................................................................. รหัสไปรษณีย................................โทรศัพท...................................................โทรสาร.............................................................. E-mail..................................................................................................................................................................................... ชื่อ-สกุล ผูแตงรวม 1......................................................................................................................... 2......................................................................................................................... 3......................................................................................................................... 4......................................................................................................................... 5......................................................................................................................... ประเภท

 บทความงานวิจัย (Research Articles) สาขา  วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี  วิทยาศาสตรสุขภาพ  บทความวิชาการ (Review Articles)

คํายืนยันของผูแตงทุกทาน ข า พเจ า ขอยื น ยั น ว า บทความนี้ ไ ม เ คยเสนอหรื อ กํ า ลั ง เสนอตี พิ ม พ ใ นวารสารใดมาก อ น และยิ น ดี ใ ห กองบรรณาธิการวารสารมหาวิทยาลัยนเรศวร: วิทยาศาสตรและเทคโนโลยี เลือกสรรหาผูทรงคุณ วุฒิ เพื่อพิจารณา ตนฉบับของขาพเจาโดยอิสระ และยินยอมใหกองบรรณาธิการฯ สามารถตรวจแกไขตนฉบับดังกลาวไดตามสมควร และ ยิน ยอมใหบ ทความที่ ล งตี พิ มพ ใ นวารสารมหาวิ ท ยาลั ยนเรศวร: วิท ยาศาสตร และเทคโนโลยี นี้ ถื อ เป น ลิข สิ ทธิ์ ข อง มหาวิทยาลัยนเรศวร ลงชื่อ.................................................. ลงชื่อ.................................................. ลงชื่อ.................................................. ลงชื่อ.................................................. ลงชื่อ.................................................. วันที่.........../......................./..............