Pregledni rad GENETIČKI DETERMINIZAM, TRANSGENA TEHNOLOGIJA I EKSTRANUKLEARNI GENI DIMITRIJEVIĆ, M i PETROVIĆ, Sofija Katedra za genetiku i oplemenjivanje biljaka, Departman za ratarstvo i povrtarstvo, Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Novom Sadu
Izvod Tehnologija manipulacije genima laboratorijskim metodima, koja je proizvela genetički modifikovane organizme se zasniva na rekombinacijama genskog materijala u jedru. Manipulacija jedarnom DNK ima prednosti, ali kako se pokazalo i nedostatke. Iskustva koja je donela primena tehnologije transgena u poslednjih desetak godina su iznela na videlo i druge stavove o mehanizmima nasleđivanja, ili bar dovela u pitanje neke paradigme zasnovane na genetičkom determinizmu. Jedna od posledica je i afirmacija vannuklearne DNK. Manipulacija genima u citoplazmatičnim organelama je postala predmet interesovanja tehnologa GM tehnologije. Ključne reči: Transgena tehnologija, GMO, DNK, citoplazmatični geni.
Transgena tehnologija, ili tehnologija direktnog transfera gena iz organizma u organizam se razvila iz akumulisanog saznanja o nosiocima i mehanizmima nasleđivanja. Ovo se posebno odnosi na poslednjih pedesetak godina prošlog veka. Ovaj period je obeležilo snažno okretanje sveta nauke, u svom biološkom delu, u pravcu mikrosvemira ćelija, hromozoma i gena. Posledica su genetički modifikovani organizmi (GMO), koji su izašli iz laboratorije i od polovine prošle decenije krupnim koracima zakoračili na svetsko tržište, posebno proizvodnju i tržište poljoprivrednih proizvoda. Mnoga dotadašnja pravila etike, poljoprivredne proizvodnje, tržišta prehrambenih i nekih drugih proizvoda, kao i globalnog odnosa snaga u proizvodnji hrane su nepovratno počela da se menjaju. Međutim, GMO su doneli i sumnju ne samo u dostatnost kvantiteta naučnog saznanja koje bi omogućilo slobodnu manipulaciju genetičkim materijalom, već i sumnju u samu suštinu, u kvalitet tog saznanja. U pitanje je došla osnova shvatanja poruka koje nam donose saznanja o tokovima nasleđivanja. Shvatanje poruka spoznavanja nasleđivanja bioloških informacija se direktno odražava na slobodu manipulacije genima, formiranje tehnika koje se koriste za kreiranje rekombinantne DNK, kao i projektovanje posledica korišćenja tehnologije transgenih organizama. Projektovanje ovih posledica je veoma važno, jer promene koje donose GMO su nepovratne.
Genetički determinizam i transgena tehnologija Mendelovski odnosi razdvajanja u monohibridnom nasleđivanju, kao i drugim tipovima nasleđivanja, su zasnovani na shvatanju gena kao pojedinačnih (autonomnih) kategorija koje međusobno stupaju u ograničen broj odnosa, odnosno različite tipove jednostavnih intraalelnih i interalelnih interakcija (dominantno-recesivno, kodominantno itd.). Ovo znači da će isti geni (dominantni, recesivni, ili parcijalno dominantni) imati isti efekat bez obzira na različitu genetičku osnovu u kojoj mogu da se nađu tokovima prenosa nasledne informaciju. Ovo učenje u dobrom delu razdvaja uticaj spoljne sredine od genske varijacije. Po tom učenju, akcija gena i efekat sredine se objedinjuju na nivou fenotipa, što se zasniva na stavu da geni i genomi ne mogu da se direktno menjaju, kao odgovor na efekte spoljne sredine. Da su se shvatanja u genetičkoj nauci menjala sporije od onoga što su rezultati eksperimenata nudili klasičan primer je otkriće transpozona, pokretnih genskih elemenata, čije je postojanje Barbara MekKlintok (Barbara McKlintock) utvrdila i iznela genetičkoj naučnoj javnosti krajem 40-tih godina prošlog veka, tačnije 1950. Ne samo da njeno otkriće tada nije uvaženo, već je i sama bila izložena nepoverenju najvećeg dela naučne javnosti. Decenijama kasnije postojanje transpozona je potvrđeno i MekKlintok je dobila Nobelovu nagradu. Bilo je to 1983. Simptomatično je da se radilo upravo o otkriću koje je nagovestilo da je genski mikrokosmos veoma složen, sofistikovan, dinamičan i interaktivan sistem. Ponašanje arhitekti i začetnika transgene tehnologije je najčešće direktna posledica genetičkog determinizma, koji određuje gene kao esenciju organizma. Podrazmevanje da je gen autonomna jedinica koja predominantno deluje samostalno i konstantno bez obzira ostalu genetičku osnovu, daje slobodu da se geni horizontalno prenose preko svih prirodnih barijera. Daje slobodu i da se transgeni insertuju u genom domaćina na mestima koja su sasvim van kontrole, odnosno slučajna. Štaviše, i da se sasvim neprecizno insertuju vektorskom bakterijskom DNK, ili čak „upucavaju“ biolostičkim metodom koji rasprskava gen po genomu često oštećujući i sam himerni gen koji se insertuje (Palevitz, 2000). Prihvatanje dogme o genskoj individualnosti je osnov kreiranja himernih gena, odnosno genskih konstrukcija u kojima su kombinovani strukturni i regulatorni geni, takođe, sasvim taksonomski udaljnih organizama (Dimitrijević i Petrović, 2004). Sve ovo se prihvata ako eksperimenti pokažu da transgen u GMO funkcioniše i da se negativne posledice ne vide (USFDA, 2000). Genomska DNK kao objekt genetičke manipulacije i eko-kontaminacija Genomska (jedarna) DNK je od početka bila predmet genetičkih istraživanja i interesovanja. Razlog je svakako to što se najveći deo genetičke informacije ćelije, odnosno DNK nalazi u jedru. Jedarna DNK je najuočljivija i najdostupnija. Radovi Mendela su zasnovani na fenotipskim promenama koje su pripisivane akciji jedarnih gena. U skladu sa genetičkim determinizmom, shvatanjima procesa nasledjivanja, istraživanja nDNK (nuklearne DNK) su daleko kvantitativno i kvalitativno nadmašila istraživanja ostalih faktora nasleđivanja. Posledično, transgena tehnologija se zasniva na trensformacijama u strukturi nDNK. Svi do sada kreirani GM organizmi se dobijeni insertovanjem himernih gena u jedro, odnosno u jedarnu DNK. Ovo se odnosi i na komercijalno korišćene GM poljoprivredne kulture. Jednom integrisane u genom
domaćina, transgene konstrukcije se nalaze u svim ćelijama GM organizma, dele sa domaćinovom nDNK u gametogenezi i vertikalno prenose sa roditelja na potomstvo. Ne ulazeći u detaljnija razmatranja svih pitanja koja su pokrenuta u globalnoj diskusiji o mestu i svrsishodnosti tehnologije rekombinantne DNK, osvrnućemo se samo na mogućnost eko-kontaminacije u domenu poljoprivredne proizvodnje. Polinacija daje šansu da se transgeni prenesu i na vrste koje nisu ciljne, odnosno da dođe do nekontrolisane genetičke modifikacije biljaka koje pripadaju istoj, ili srodnoj vrsti, one kulture koja je genetički modifikovana i gajena u polju. Ovaj rizik je posebno veliki u ishodnim centrima GM poljoprivrednih kultura koje obiluju lokalnim populacijama i spontanim srodnicima kultivisane vrste. Ireverzne promene koje bi se desile bi značajno uticale na biodiverzitet i na gubljenje važne konvencionalne genetičke varijabilnosti. Jednom oslobođene u prirodnu sredinu GM kulture postaju potencijalni ekokontaminanti. Stranooplodne GM kulture su svakako rizičnija kategorija od samooplodnih, ali treba imati u vidu da se po definiciji samooplodnim kulturama smatraju one koje imaju manje od 4% stranooplodnje (Borojević, 1981). I najmanji procenat stranooplodnje čini samooplodne GM kulture rizičnom kategorijom sa aspekta ugrožavanja eko-sredine. Čak i prostorna izolacija GM kulture u polju ne mora da bude garant pune bezbednosti, imajući u vidu sve načine kojima polen može da se širi. Pored ugrožavanja konvencionalnog biodiverziteta, nekontrolisano oslobađanje himernog gena u životni prostor bi dovelo do promena selekcionih pritisaka u prirodnoj sredini i kreiranja „super patogena“, ili „super korova“, koji bi ne samo promenili ravnotežu u prirodnoj sredini, već stavili poljoprivrednu proizvodnju u nova iskušenja. Kontaminacija lokalnih populacija kukuruza u udaljenim predelima Meksika, transgenim kukuruzom je utvrđena probama CaMV 35S promotera (Quist and Chapela, 2001). Ovaj viralni promoter je najčešće korišćen u himernim transgenim konstrukcijama kao pokretač strukturnog transgena. Vannuklearni nasledni elementi, novi cilj arhitekti GM organizama Vanjedarni geni, odnosno geni u citoplazmi spadaju u izuzetke, koji potvrđuju pravilo da se sve osobine ne nasleđuju jedarnim genima. Genetički determinzam ih je dugo držao van fokusa istraživanja naslednih procesa. Ovi izuzeci hromozomske teorije nasleđivanja ne podležu mendelovskim zakonima naslednosti. Kada se govori o ukupnom naslednom potencijalu ćelije, u ovom razmatranju pre svega biljne ćelije, onda se mora imati u vidu da je genetička informacija pored jedra organizovana i u organelama citoplazme – plastidima (hloroplastima) i mitohondrijama. Zajedničko za ove organele je da su odgovorne za konverziju energije u ćeliji pristupačne oblike i samostalno se umnožavaju. Zajedničko im je i pretpostavljeno poreklo od individualnih bakterija koje su se u simbiotskom odnosu inkorporisale u citoplazmu primitivnih ćelija i nastavile da žive kao deo njih. Svoj prvobitni genski fond su delimično integrisale u genom (nDNK) domaćina, a delom zadržale. Otuda pored autonomnog nasleđivanja, gde se ispoljava upadljiv materinski efekat, neki proteini se dobijaju zajedničkim delovanjem nuklearnih i vannuklearnih gena, dok je nasleđivanje pojedinih proteina citoplazmatičnih organela vezano isključivo za jedro. DNK mitohondrija (mtDNK) i hloroplasta (ctDNK) su u čistoj formi, odnosno ne pojavljuju se u asocijaciji sa proteinima kao nDNK, tako da nemaju nikakve sličnosti sa hromozomima. Količina ctDBK i mtDNK je znatno manja
nego nDNK, međutim imajući u vidu da se mitohondrije i hloroplasti pojavljuju u ćeliji u većem broju, broj kopija ovih DNK se znatno uvećava. U zrelom plastidu ćelije ctDNK se javlja u oko 300 kopija. U ćelijama mezofila zrelog lista pšenice se prosečno nalazi oko 160 hloroplasta. Ovoznači da može da bude oko 48000 „hromozoma“ hloroplasta po ćeliji mezofila. Primera radi, „hromozom hloroplasta“ biljne ćelije ima i do 155000bp (Jones and Karp, 1986). Mitohondrijalna DNK čoveka ima 5-10 DNK prstena, koji nose 16500bp sa 37 gena. Haploidna ćelija kvasca ima i do 50 malih kružnih „hromozoma“ u svakoj mitohondriji. U ćelijama eukariota, ribozomi hloroplasta i mitohondrija su manji od citoplazmatičnih ribozoma i više odgovaraju tipu ribozoma prokariota, odnosno bakterija. Po prirodi razmnožavanja plastidi i mitohondrije ctDNK i mtDNK se malo menjaju iz generacije u generaciju, za razliku od nDNK koja se 50% menja po ciklusu vertikalnog prenosa gena. Problemi koje nose tradicionalni metodi transformacije nDNK, kao i proširenje saznanja o naslednim procesima koje je donelo iskustvo istraživanja vezanih za transgenu tehnologiju u izvesnoj meri je promenilo mnoga načela genetičkog determinizma. Pre svega, shvatanje o složenosti puteva nasleđivanja i posledično povećano interesovanje za DNK citoplazme. Povećana ploidnost usled većeg broja hloroplasta u ćeliji, kao i otsustvo pozicionog efekta i mehanizama „utišavanja gena“, dovodi do neočekivaon visokog nivoa ekspresije transgena (Vantini et al., 2003). Transformacija ctDNK se smatra perspektivnim postupkom, posebno u kreiranju GM poljoprivrednih kultura, kao što su paradajz, krompir, duvan, kukuruz, pšenica, pirinač, Solanaceae itd. Ciljne osobine transgene transformacije i ovde su otpornost na insekte i totalne herbicide, koje su se pokazale komercijalno najisplativijim u dosadašnjem plasmanu tradicionalno dobijenih GMO. Postupak inženjerovanja ctDNK, prema preliminarnim rezultatima, pruža mogućnost i za dobijanja biljaka sa izuzetno velikim sadržajem rastvorljivih proteina (Askari, 2004). Ono na čemu, međutim, pobornici korišćenja plastida u transgenim insercijama najviše insistiraju je povećana ekološka bezbednost. Prilikom dvostruke oplodnje angiosperma, u embrionalnu kesu prodiru generativna jedra, tako da je, po oplodnji, citoplazma embriona isključivo majčina (jajne ćelije). Isto važi i za oplodnju sekundarnog jedra iz čega proizilazi endosperm. Tako su hloroplasti ćelija oca isključeni iz vertikalnog prenosa gena. Na ovaj način se onemogućava prenošenje transgena na kultivisane, ili spontane srodnike i u ovom delu se smanjuje opasnost ugrožavanja biodiverziteta nekontrolisanim širanjem transgena iz GM kulture. Pri ovome treba napomenuti i da humane ćelije nemaju plastide. Iz sličnih razloga se ispituju i mogućnosti genskih transformacija mtDNK. Smatra se da bi genske promene u mtDNA pomogle u dobijanju muški sterilnih linija i kod onih poljoprivrednih kultura gde muška sterilnost nije nađena u srodnim spontanim populacijama. Ovim bi se u mnogome olakšalo i pojeftinilo dobijanje hibrida kod stranooplodnih biljaka, gde ne postoji konvencionalan način dobijanja muški sterilnih linija. Iako se mogućnost transgenih transformacija mitohondrija razmatra u poslednjih nekoliko godina, do realizacije ovog koncepta kod biljaka postoji put koji treba da prevaziđe kompleksne procese transkripcije i translacije mitohondrijalnih gena, razvijanje laboratorijskih tehnika i dobijanje pogodnih obeleživača uspele transformacije (Araya et al., 1998; Farré and Araya, 2001).
Završna razmatranja Džejms Votson (James Watson) jedan od trojice dobitnika Nobelove nagrade za postavljanje strukture DNK (dezoksiribonukleinske kiseline) i prvi direktora Organizacije projekta mapiranja humanog genoma (Human Genome Organisation - HUGO), kaže: „Mislili smo da je naša sudbina u zvezdama. Sada znamo da je u najvećoj meri naša sudbina u našim genima“ (prema Ho, 1998). Ova misao može različito da se tumači. Autor prema kome je mišljenje navedeno, ovaj iskaz tumači kao paradigmu genetičkog determinizma. Ipak, šire gledano ova misao može da predstavlja proizvod svesti o beskrajnoj složenosti svemira nasleđivanja. U genetičkoj nauci, pa unekoliko i komercijalizaciji transgene tehnologije su se neki stavovi promenili i čini se da transgena tehnologija polako izlazi iz pionirskog perioda, bez obzira što je to u ovom momentu samo na nivou nagoveštaja. Pre svega:
javnost je mnogo bolje informisana o transgenoj tehnologiji i njenoj komercijalizaciji, što je rezultovalo u kontroli građanskih organizacija, ali i u zakonodavstvu koje su donele kako vlade pojedinih država, tako i međunarodna tela. Ovim su multinacionalne kompanije dovedene u situaciju da delaju u pravcu sofistikovanja transgene tehnologije, genetički determinizam, koji je uz neke druge vanbiološke faktore doveo do stvaranja i ubrzane komercijalizacije GMO, polako prelazi u shvatanje da proces nasleđivanja nije samo matematički zbir jedarnih gena u pojednostavljenom međusobnom odnosu. I ovo saznanje usmerava transgenu tehnologiju ka povećanoj sofistikovanosti, kao i pažljivijim pristupima u plasmanu.
Mnogi stavovi su se poslednjih decenija promenili. Neki od stavova su neki bili na nivou dogme, kao centralna dogma DNK RNK protein. Reverznom transkripcijom ovaj tok dobija i suprotan smer te genetička informacija može da putuje sa RNK na DNK. Sinteza pojedinih proteina, takođe, odstupa od ovako pojednostavljene dogme. Dovođenjem u pitanje genetičkog geterminizma na kome se zasniva komercijalna transgena tehnologija, menja se sam osnov moderne biotehnologije u svom vulgarizovanom obliku. Hiljadugodišnja bioinformacija povezuje organizam sa univerzumom i komplikovana je i dinamična kao i on sam. Hiljade gena se javljaju u sistemu, gde svaki gen može da ima veliki broj varijanti, koje mogu u sadejstvu sa genetičkom osnovom i interakcijom sa širom sredinom da daju iste, ili različite efekte. Isti gen može različito da se ponaša od individue do individue zavisno genetičke osnove i varijacije sredine. Epistaza, uticaj gena na druge nesrodne gene, ili pleiotropni efekat, gde proteinski produkt gena utiče na različite osobine, transpozoni koji menjaju poziciju, menjajući svoj efekt, kao i efekt okolnih gena upućuju da nijedan gen ne radi samostalno i u izolaciji. Hiljade enzima koje genski sistem produkuje učestvuje u hiljadama metaboličkih procesa koji podržavaju i čine život. Ovo su samo nagoveštaji komplikovanosti sistema u koji transgena tehnologija, za sada grubo, ulazi. Genetička istraživanja koja su prethodila, ili idu uz transgenu tehnologiju napreduju, pokušavajući da usavrše i sam proces manipulacije genima. Prekasno je i pitanje je da li je potrebno da se Pandorina kutija genske manipulacije tehnikama rekombinantne DNK zatvori. Ova
tehnologija je tu da ostane. Manipulacija ekstranuklearnom DNK je pokušaj da se tehnologija učini prihvatljivijom za tržište, ali i put saznanja o tokovima naslednosti, koji utire put Novoj genetici. Jer sada je jasno da mnogo toga nije jasno, ali je dobro da smo toga svesni mi, ali i multinacionalne korporacije.
Literatura
Araya, A., Zabaleta, E., Blanc, Valérie., Bégu, Dominique, Hernould, M., Mouras, A., Litvak, S. (1998): RNA editing in plant mitochondria, cytoplasmic male sterility and plant breeding. EJB Electronic Journal of Biotechnology. http://www.ejbiotechnology.info/content/vol1/issue1/full/4/bip/ Askari, F. (2004): Faith in chloroplast transformation. http://www.biospectrumindia.com/ Borojević, S (1981): Principi i metodi oplemenjivanja bilja. Izd. R.U. „Radivoj Ćirpanov“, Novi Sad. Dimitrijević, M., Petrović, Sofija (2004): Genetički modifikovani organizmi – Pitanja i dileme. Izd. Zelena mreža Vojvodine, Novi Sad. Farré, J-C., Araya, A. (2001): Gene expression in isolated plant mitochondria: high fidelity of transcription, splicing and editing of a transgene product in electroporated organelles. http://nar.oupjournals.org/cgi/content/full/29/ 12/ Ho, Mae-Wan (1998): Genetic Engineering Drean or Nightmare? The Brave New World of Bad Science and Big Business. Publ. Gateway Books,The Hollies, Wellow, Bath BA2 8QJ, UK. Jones, R. N., and Karp, A. (1986): Introducing Genetics. Pub. John Murray, 122-125. Palevitz, B. A. (2000): DNA Surprise: Monsanto discovers extra sequences in its Roundup Ready soybeans. The Scientist, Vol. 14[15]:20. Quist, D., and Chapela, I.H. (2001): Transgenic DNA introgressed into traditional maize landraces in Oaxaca, Mexico. Nature, 414, 541-3. USFDA (2000): Biotechnology Consultation Note to the File BNF No. 000071. October9, http://vm.cfsan.fda.gov/ Vantini, F., Govoni, C., Cattivelli, L., Gastaldelli, M., Tacconi, G., Bassi, R. (2003): Vector Family for Efficient Targeting of Foreign Genes to Tomato Chloroplasts DNA. Proceedings of the XLVII Italian Society of Agricultural Genetics - SIGA Annual Congress 24/27 September Verona, Italy.
GENETIC DETERMINISM, TRANSGENIC TECHNOLOGY AND EXTRANUCLEAR GENES DIMITRIJEVIĆ, M and PETROVIĆ, Sofija Chair of Genetics and Plant Breeding, Dept. for Field and Vegetable Crops, Faculty of Agriculture, University of Novi Sad, Serbia and Montenegro
A technology of gene manipulation using laboratory methods that led to genetically modified organisms is based on nuclear gene material recombination. The nuclear DNA manipulation has certain advantages, as well as, considerable handicaps. Accumulated experience brought by transgenic technology application during the past twelve years carried forward opinions about the inheritance mechanisms somewhat different from prevailing standpoints. Some paradigms rooted on genetic determinism have been questioned, at least. One of the consequences is a trying to find out more sophisticated and safer routines by cytoplasmic DNA manipulation. Key words: Transgenic technology, GMO, DNA, cytoplasmic genes.