Innowacyjne technologie przyspieszające i upraszczające przygotowanie bibliotek NGS oraz interpretację wyników UMI – Unique Molecular Indices - Znaczniki (barcodes) do identyfikacji unikalnych cząsteczek DNA/miRNA/mRNA. UMI to krótkie, dwunastonukleotydowe, przypadkowe sekwencje, które są dodawane na etapie przygotowywania biblioteki NGS przed wzbogacaniem za pomocą PCR. Ich zadaniem jest „wyznakować” każdą cząsteczkę DNA/miRNA/mRNA jaką mamy w próbce. Jest ponad 16 milionów kombinacji UMI, zatem zakłada się, iż każda cząsteczka otrzyma swój niepowtarzalny znacznik. Analiza danych oparta na chmurze w GeneGlobe Data Analysis Center dla każdego produktu wykorzystującego UMI jest darmowa.
Fałszywie pozytywne wyniki: błąd PCR lub samego sekwencjonowania Konwencjonalne ukierunkowane sekwencjonowanie DNA / RNA
Ekson 21
*
Mutacja jest widoczna w 1 na 5 odczytów. Nie można dokładnie określić, czy mutacja jest: 1. Błędem PCR lub sekwencjonowania (np. Artefakt lub fałszywy wynik pozytywny) 2. Prawdziwą mutacją o niskiej częstotliwości UMI przed jakąkolwiek amplifikacją
Cyfrowe sekwencjonowanie z UMI
UMI
*
Fałszywy wariant występuje w niektórych fragmentach niosących ten sam UMI
UMI
** *** Prawdziwy wariant występuje we wszystkich fragmentach niosących ten sam UMI
Błędy i niedokładności w oznaczaniu ilościowym Ekson 21
Konwencjonalne ukierunkowane sekwencjonowanie DNA / RNA
Pięć odczytów, które wyglądają dokładnie tak samo Nie można stwierdzić, czy reprezentują: 1. Pięć unikalnych cząsteczek DNA / RNA, lub 2. Pięciokrotne powielenie tej samej cząsteczki DNA / RNA (duplikaty PCR) UMI przed jakąkolwiek amplifikacją
Cyfrowe sekwencjonowanie z UMI
Pięć unikalnych cząsteczek DNA / RNA wykryte za pomocą 5 różnych UMI
UMI
UMI
Pięciokrotne powielenie tej samej cząsteczki DNA / RNA (duplikaty PCR) wykryte za pomocą 1 UMI
Single Primer Extension(SPE) Podejście do PCR z pojedynczym starterem bez uprzednio zdefiniowanego ograniczenia rozmiaru amplikonu: ^^
Ułatwia projektowanie Paneli Qiaseq z dużą ilością genów (bez potrzeby „poolowania” – jedna próbka jedna probówka)
^^
Podnosi znacznie specyficzność wzbogacania biblioteki Amplicion-based enrichment is performed in a single reaction regardless of the size of targeted regions
QIAseq FX technology Enzymatyczna metoda fragmentacji DNA i ligacji adapterów: ^^
Nie wymaga oczyszczania pomiędzy fragmentacją, a dołączaniem adapterów
^^
Adaptery dołączane na zasadzie ligacji, co zmniejsza ilość błędów w porównaniu z technikami opartymi o PCR.
^^
Wydajna fragmentacja odcinków z dużą ilością par G/C
^^
Długość fragmentów od 200 pz do 1000 pz zależna od czasu fragmentacji
^^
Szybki proces
Locked Nucleic Acid technology (LNA) „Zablokowane kwasy nukleinowe” to klasa analogów RNA, w których pierścień rybozy jest „zablokowany” w idealnej konformacji wiązania Watsona-Cricka. W wyniku tego, oligonukleotydy LNA wykazują: ^^
Niespotykaną stabilność termiczną po hybrydyzacji z komplementarną nicią DNA lub RNA
^^
Dla każdego wprowadzonego monomeru LNA, temperatura topnienia (Tm) dupleksu wzrasta o 2-8 ° C.
^^
Oligonukleotydy LNA mogą być krótsze niż tradycyjne oligonukleotydy DNA lub RNA i nadal zachowują wysoką Tm. Jest to ważne, gdy oligonukleotyd jest używany do wykrywania małych lub bardzo podobnych cząsteczek (np. miRNA, mRNA)
^^
Wbudowywanie LNA w oligonukleotydy poprawia czułość i specyficzność wielu technologii opartych na hybrydyzacji, w tym PCR, mikromacierzy, hybrydyzacji in situ (ISH)….
Multiple Displacement Amplification (REPLI-g) Technika amplifikacji DNA nie oparta o PCR: ^^
Reakcja rozpoczyna się od przyłączenia losowych starterów heksamerowych do matrycy
^^
syntezę DNA prowadzi się przy użyciu enzymu o wysokiej wierności: polimerazy DNA 29, w stałej temperaturze.
^^
W porównaniu z konwencjonalnymi technikami amplifikacji PCR, MDA generuje produkty dłuższe i robi mniej błędów.
^^
Pozwala szybko powielić niewielkie ilości DNA do rozsądnej ilości do analiz genomowych.
^^
Metoda ta została aktywnie wykorzystana w amplifikacji całego genomu (WGA) i jest między innymi wykorzystywana do sekwencjonowania genomu pojedynczych komórek
Przykłady zastosowań UMI, SPE, FX, LNA, REPLI-g: U M I FX SPE
Analiza wybranych wariantów DNA - QIAseq targeted DNA panels Jeden protokół: od 10 do 40ng DNA z krwi lub cfDNA, od 40 do 250ng FFPE DNA, długość procedury: 1 dzień. Pokrycie 100% wszystkich sekwencji eksonowych. Gotowe Panele, możliwość zaprojektowania własnych: Breast cancer panel - 93 geny, Colorectal cancer panel - 71 genów, Myeloid Neoplasms panel - 141 genów, Lung cancer panel - 72 geny, Actionable solid tumor panel - (mieszane pokrycie), BRCA1 and BRCA2 panel - 2 geny, BRCA1 and BRCA2 Plus panel - 6 genów, Pharmacogenomics panel - (mieszane pokrycie), Mitochondrial panel - (cały), Inherited diseases panel - 298 genów, Comprehensive cancer panel - 275 genów.
U M I
Badanie ekspresji wybranych genów - QIAseq targeted RNA panels Od 25 do 400ng totalnego RNA, długość procedury: 1 dzień. Gotowe Panele (człowiek i mysz), możliwość zaprojektowania własnych: Angiogenesis & Endothelial Cell Biology - 340 genów, Apoptosis & Cell Death - 264 genów, Cancer Transcriptome 395 genów, Extracellular Matrix & Cell Adhesion Molecules - 421 genów, Inflammation & Immunity Transcriptome - 475 genów, Molecular Toxicology Transcriptome - 370 genów, Signal Transduction PathwayFinder - 405 genów, Stem Cell & Differentiation Markers - 293 geny, Immuno-Oncology - 990 genów.
I
M
U E
SP
Wykrywanie i weryfikacja wybranych genów fuzyjnych - QIAseq RNAscan panels Nawet od 1ng RNA, rekomendacja od 50ng świeżego RNA lub 100ng RNA z FFPE, długość procedury: 1 dzień Gotowe Panele, możliwość zaprojektowania własnych: Leukemia panel, Solid Tumor panel, Lung cancer panel, Lung cancer panel.
I
M
U A
LN
Odkrywanie nowych i porównywanie poziomu ekspresji miRNA/piRNA - QIAseq miRNA library kit Od 1ng do 500 ng totalnego RNA, długość procedury: 7 h, Specjalnie zaprojektowane adaptery łączące się tylko z dojrzałym miRNA, kulki magnetyczne do selekcji fragmentów w zestawie (metoda bezżelowa).
I
M
U A
LN
Multipleksowe badanie pełnego transkryptomu lub wybranych transkryptów w pojedyńczych komórkach QIAseq™ UPX 3’ Transcriptome Kit i QIAseq UPX 3’ Targeted RNA Panels Od 1 do 100 komórek lub od 10 pg do 1 ng izolowanego RNA, system indeksowania umożliwiający jednoczesne sekwencjonowanie 18,432 próbek
I
M
U E
SP
Badania immunologiczne - QIAseq Immune Repertoire RNA Library Kit Od 10 do 1000 ng RNA, panel receptorów dla komórek T (człowiek i mysz) służący do sekwencjonowania regionu V (D) J genów alfa, beta, delta i gamma, w tym regionów CDR3.
FX
Sekwencjonowanie Całego Genomu, Eksomu*, Metagenomu metodą Shotgun – QIAseq FX DNA Library Kit Od 1 ng do 1µg, długość procedury: 1,5h, gotowe adaptery w wygodnym formacie rozłożone na płytce wielodołkowej, amplifikacja biblioteki jest zwykle wymagana, jeśli wejściowa ilość DNA jest mniejsza niż 100 ng.
FX LI-g P
Sekwencjonowanie Całego Transkryptomu z małej ilości komórek - QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit Od 1 do 1000 komórek, od 10 pg do 10 ng DNA, długość procedury: 5,5h, kilka wariantów w protokole: totalne RNA lub mRNA+LncRNA
RE
FX
I PL
Sekwencjonowanie Całego Genomu, Eksomu* z małej ilości komórek (np. trudnych lub niemożliwych do hodowli) – QIAseq FX Single Cell DNA Library Kit Od 1 do 1000 komórek, od 10 pg do 10 ng DNA, długość procedury: 3,5h, kompatybilny z komórkami eukariotycznymi i prokariotycznymi
-g RE
Produkt pomocniczy do kwantyfikacji bibliotek mRNA, DNA, miRNA – QIAseq LNA Library Quant Kit LNA
Inne zestawy o unikalnych właściwościach i technologiach: Sekwencjonowanie transkryptomu - QIAseq Stranded Total RNA Lib Kit oraz QIAseq Stranded mRNA Select Kit Od 100 do 5000 ng lub od 1 do 100 ng poly-A+ RNA, długość procedury: 5h Nowa, zastrzeżona metoda bez użycia dUTP lub aktynomycyny D. Cała enzymologia została przemodelowana i jest bardziej wydajna oraz jest mniej toskyczna. Oba zestawy zachowują informacje o tym, która nić DNA została przepisana na RNA. Sekwencjonowanie Ukierunkowane Metagenomu - QIAseq™ 16S/ITS Panel Od 1pg DNA Możliwość wyboru nawet wszystkich regionów zmiennych 16S rRNA i regiony ITS. „Stopniowane startery”, które zwiększają jakość odczytów, analizę wariantów i eliminują potrzebę stosowania kontroli PhiX spike-in. Sekwencjonowanie wolnokrążącego DNA - QIAseq cfDNA All-in-One Kit Totalne DNA z osocza: od 1 do 100 ng, długość procedury: do 3h Zoptymalizowany protokół, zawiera moduł do oczyszczania cfDNA i moduł do konstrukcji bibliotek, amplifikacja biblioteki jest zwykle wymagana, jeśli wejściowa ilość cfDNA jest mniejsza niż 10 ng. Sekwencjonowanie Metylomu - QIAseq Methyl Library Kit Od 100pg DNA po konwersji bisulfitowej, długość procedury: 2,5h Protokół składa się z dwuetapowej reakcji przeprowadzonej w pojedynczej probówce, bez pośrednich etapów oczyszczania, kompatybilny z cfDNA, RRBSseq, MeDIPseq Sekwencjonowanie Ukierunkowane i Sekwencjonowanie Amplikonów - QIAseq 1-Step Amplicon Library Kit Od 10 do 100ng produkty PCR, długość procedury: 0,5h Kompatybilny z dowolnym panelem genów lub produktem PCR. Sekwencjonowanie Całego Genomu, Eksomu*, Sekwencjonowanie Ukierunkowane z próbek o małej ilości i/lub złej jakości DNA - QIAseq Ultralow Input Library Kit Od 10 do 100 pg DNA, długość procedury: 2,5h Kompatybilny z szeroką gamą typów próbek, w tym FFPE, ChIP, starożytne i zdegradowane DNA, cfDNA… Produkty pomocnicze do deplecji (usuwania) rRNA - QIAseq FastSelect RNA Removal Kits Protokół 20 minut, jedno pipetowanie, kompatybilny z zestawami innych producentów.
Wybrane narzędzia Bioinformatyczne: QCI Interpret – Hereditary Disease Oprogramowanie zaprojektowane do klasyfikowania i interpretowania patogennych wariantów chorób dziedzicznych. QCI Interpret sięga do QIAGEN Knowledge Base, największej i najnowocześniejszej bazy danych klinicznych, zawierającej informacje o ponad 750 000 próbkach ludzkich. CLC Genomics Workbench Zaawansowane rozwiązanie opracowane przez naukowców dla naukowców do analizy i wizualizacji danych z sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Jego najnowocześniejsza technologia obejmuje unikalne funkcje i algorytmy, które są szeroko stosowane przez liderów naukowych w przemyśle i środowisku akademickim, aby przezwyciężyć wyzwania związane z analizą danych. *Platforma Qiaseq otwarta na wzbogacanie sondami od każdego dostawcy