Livro Doença dos Eritrócitos by Real Web Solution

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP

Autor: Prof. Dr. Paulo Cesar Naoum 1

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Doença dos Eritrócitos Doenças Autor: Prof. Dr. Paulo Cesar Naoum

Sumário O Eritrócito Normal ................................................................................................ ................................ .................................................... 10 Introdução ............................................................................................................................... ................................ ............................... 10 Hematopoiese com Ênfase Eritrocitária ................................................................ ...................................................... 16 Fase intra-uterina ................................................................................................ ................................ ..................................................... 16 Fase pós-nascimento ................................................................................................ ................................ ............................................... 17 Eritropoiese ............................................................................................................................. ................................ ............................. 18 Pró-eritroblasto ................................................................................................ ................................ ....................................................... 20 Eritroblasto basófilo ................................................................................................ ................................ ................................................ 21 Eritroblastos policromatófilo e ortocromático ................................................................ ....................................... 21 Reticulócito ............................................................................................................................. ................................ ............................. 23 Eritrócito................................................................................................................................ ................................ .................................. 24 Principais Componentes dos Eritrócitos ................................................................ ..................................................... 27 Os Fatores Mais Importantes da Eritropoiese ................................................................ ........................................ 27 Eritropoietina ................................................................................................ ................................ ...................................................... 27 O Ferro e seu Metabolismo ................................................................................................ ................................. 28 Ácido Fólico e Vitamina B12 ................................................................................................ ................................ 30 Mecanismos Envolvidos na Regulação da Absorção do Ferro ............................................ ................................ 31 A Hemoglobina ................................................................................................ ................................ ........................................................ 35 Estrutura Molecular e Função ............................................................................................. ............................. 35 A Síntese das Globinas ................................................................................................ ................................ ........................................ 37 A Síntese do Grupo Heme ................................................................................................ ................................... 41 Ontogenia das Hemoglobinas ............................................................................................. ............................. 45 Hemoglobinas obinas Variantes ................................................................................................ ..................................... 45 Talassemias ......................................................................................................................... ................................ ......................... 47 A Membrana................................ ............................................................................................................................ ............................ 49 Estrutura Química da Membrana................................................................ ........................................................ 49 Deformabilidade da Membrana .......................................................................................... .......................... 52 As Principais Enzimas Eritrocitárias ......................................................................................... ......................... 55 Os Reticulócitos ........................................................................................................................... ................................ ........................... 58 Introdução ............................................................................................................................... ................................ ............................... 58 2

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Avaliação de Anemia com Presença e Ausência de Reticulocitose......................................... ................................ 61 Fisiologia da Destruição dos Eritrócitos ................................................................ ...................................................... 63 Introdução ............................................................................................................................... ................................ ............................... 63 Destruição extravascular dos eritrócitos................................................................ eritrócitos ................................................. 65 Destruição Intravascular dos Eritrócitos ................................................................ ................................................. 67 Avaliação da Destruição Eritrocitária ................................................................ ...................................................... 69 Avaliação Laboratorial dos Eritrócitos ................................................................ ........................................................ 70 Introdução ............................................................................................................................... ................................ ............................... 70 Coleta de amostra de Sangue ................................................................................................ ................................. 72 A Avaliação aliação do Eritrograma ................................................................................................ ..................................... 73 O Esfregaço do Sangue Periférico ........................................................................................... ........................... 74 Principais Alterações Morfológias dos Eritrócitos ................................................................ ...................................... 75 Introdução ............................................................................................................................... ................................ ............................... 75 Alterações Patológicas dos Eritrócitos ................................................................ .................................................... 77 Alterações do tamanho dos eritrócitos ................................................................ ............................................... 77 Eritrócitos normocíticos – normocitose ................................................................ .............................................. 77 Anisocitose .......................................................................................................................... ................................ .......................... 78 Eritrócitos microcíticos – microcitose ................................................................ ................................................. 79 Eritrócitos macrocíticos – macrocitose ................................................................ ............................................... 79 Alterações da forma dos eritrócitos ................................................................ .................................................... 81 Poiquilocitose ................................................................................................ ................................ ...................................................... 81 Os esferócitos ................................................................................................ ................................ ...................................................... 82 Os eliptócitos e ovalócitos ................................................................................................ .................................. 83 Os estomatócitos................................ ................................................................................................ ................................................. 85 Os equinócitos ................................................................................................ ................................ ..................................................... 87 Os acantócitos ................................................................................................ ................................ ..................................................... 89 Os codócitos ou células em alvo ......................................................................................... ......................... 90 Os esquisócitos, células fragmentadas e queratócitos ....................................................... ................................ 91 Os dacriócitos ................................................................................................ ................................ ...................................................... 94 Microesferócitos e piropoiquilócitos ................................................................ .................................................. 96 Os leptócitos................................................................................................ ................................ ........................................................ 98 Outras alterações de forma de eritrócitos ................................................................ .......................................... 99 Megalócitos e macro-ovalócitos ovalócitos ....................................................................................... ....................... 100 Cristais de Hb CC e Hb SC ................................................................................................ .................................. 101 3

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Eritrócitos citos em "roleaux" e aglutinados ................................................................ ............................................. 103 Alterações do Conteúdo da Hemoglobina ................................................................ ........................................ 104 Inclusões Eritrocitárias ................................................................................................ ................................ ...................................... 107 Corpos de Howell-Jolly ................................................................................................ ................................ ...................................... 107 Anel de Cabot ................................................................................................ ................................ .................................................... 108 Pontilhados basófilos ................................................................................................ ................................ ........................................ 109 Corpos de Pappenheimer ................................................................................................ .................................. 110 Siderócitos e sideroblastos................................................................................................ sideroblastos ................................ 111 Hemoglobina H – Hb H ................................................................................................ ................................ ...................................... 112 Corpos de Heinz ................................................................................................ ................................ ................................................ 113 Inclusões de parasitas em eritrócitos................................................................ ................................................ 118 As Anemias ................................................................................................................................ ................................ ................................ 121 Introdução ............................................................................................................................. ................................ ............................. 121 Classificação Laboratorial das Anemias ................................................................ ................................................ 121 Classificação etiológica das Anemias ................................................................ .................................................... 125 Anemia Relativa................................ ................................................................................................ ................................................. 125 Anemia Associada com Deficiência na Síntese de Hemoglobina ...................................... ................................ 125 Anemia Associada com o Desequilíbrio Funcional da Medula Óssea ............................... 126 Anemia Associada com a Diminuição da Sobrevida dos Eritrócitos e Aumento da sua Destruição ......................................................................................................................... ................................ ......................... 127 Anemia ia Secundária à Perda de Sangue ................................................................ ............................................. 128 Alterações Eritrocitárias nos defeitos de Membrana ............................................................... ............................... 129 Introdução ............................................................................................................................. ................................ ............................. 129 Esferocitose Hereditária ................................................................................................ ................................ ........................................ 130 Heliptocitose Hereditária ................................................................................................ ................................ ...................................... 132 Piropoiquilocitose Hereditária .............................................................................................. .............................. 135 Estomacitose Hereditária ................................................................................................ ................................ ...................................... 136 Alterações Eritrocitárias nas Enzimopatias ................................................................ ............................................... 139 Introdução ............................................................................................................................. ................................ ............................. 139 Deficiência de Piruvato – Quinase ........................................................................................ ........................ 139 Deficiência de G-6-PD PD (Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase) (Glicose ................................ ................................................... 141 Alterações Eritrocitárias nas Talassemias ................................................................ ................................................. 144 Introdução ............................................................................................................................. ................................ ............................. 144 Talassemia Alfa................................................................................................ ................................ ...................................................... 145

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Genética e Fisiopatologia ................................................................................................ .................................. 145 Avaliação Laboratorial ................................................................................................ ................................ ....................................... 150 Talassemia Beta................................................................................................ ................................ ..................................................... 152 Genética e Fisiopatologia patologia ................................................................................................ .................................. 152 Avaliação Laboratorial ................................................................................................ ................................ ....................................... 158 Célula Falciforme ....................................................................................................................... ................................ ....................... 162 Palavras chaves das doenças causadas pelas Células Falciformes........................................ ................................ 162 Células Falciformes................................................................................................ ................................ ............................................ 162 Anemia Falciforme ................................................................................................ ................................ ............................................ 163 Doença Falciforme ................................................................................................ ................................ ............................................ 164 Hb S / Talassemia Beta ................................................................................................ ................................ ...................................... 167 Microdrepanocitose ................................................................................................ ................................ .......................................... 168 Hb SC - Doença ça da Hb SC ................................................................................................ ................................... 169 Hb SS / Persistência Hereditária de Hb Fetal (Hb SS / PHHF) ............................................ ................................ 169 Traço Falcêmico (O Portador Assintomático) ou Hb AS .................................................... ................................ 170 Histórico da Hb S ................................................................................................ ................................ ................................................... 171 Introdução ......................................................................................................................... ................................ ......................... 171 A Origem e Dispersão da Hb S ........................................................................................... ........................... 176 As Principais Descobertas Científicas ................................................................ ................................................ 179 Resistência das Células com Hb S ao Plasmodium faciparum........................................... ................................ 183 Genética, Química E Biologia Molecular Da Hb S................................................................ .................................. 184 Mutação e Consequências Estruturais na Globina Beta S ................................................ ................................ 184 O Fenótipo Falcêmico ................................................................................................ ................................ ........................................ 186 Os Genótipos Falcêmicos ................................................................................................ .................................. 187 Hb AS - Traço Falciforme ou Falcemia Heterozigota ......................................................... ......................... 187 Anemia Falciforme (Hb SS) ................................................................................................ ................................ 191 Hb SD - Doença da Hb SD ................................................................................................ .................................. 193 Hb SC - Doença da Hb SC ................................................................................................ ................................... 193 Hb S / Talassemia β0 ou Hb SF (Micro-Drepanocitose) (Micro ................................ ..................................................... 196 Hb S / Talassemia β+ ou Hb SFA......................................................................................... SFA ......................... 197 Hb SS / Talassemia Alfa ou Hb SH ................................................................ ..................................................... 198 Hb S/PHHF ou Hb SF ................................................................................................ ................................ .......................................... 201 Os Haplótipos da Hb SS ................................................................................................ ................................ ..................................... 202 Fisiopatogia da Hb S ................................................................................................ ................................ .............................................. 205 5

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os Efeitos na Molécula da Hb S, na Célula Falciforme e na Circulação Sangüínea do Doente Falcêmico................................. .......................................................................................................................... .......................... 205 A Polimerização da Hb S ................................................................................................ .................................... 209 A Degradação ação Oxidativa da Hb S ....................................................................................... ....................... 213 As Lesões da Membrana da Célula Falciforme................................................................ .................................. 216 A heterogeneidade das Células Falciformes ................................................................ ..................................... 219 A Anemia Hemolítica no Doente Falcêmico ................................................................ ...................................... 221 Os Processos VASO-OCLUSIVOS OCLUSIVOS ........................................................................................ ........................ 223 Alterações rações Laboratoriais nas Doenças Falciformes ............................................................... ............................... 224 Anemia Falciforme ................................................................................................ ................................ ............................................ 224 S/β Talassemia ou Micro Drepanocitose ................................................................ .......................................... 228 Hb S/talassemia α ................................................................................................ ................................ ............................................. 232 Hb SC ................................................................................................................................ ................................ ................................. 234 Hb SD ................................................................................................................................ ................................ ................................. 236 Hb S/Persistência Hereditária de Hb Fetal ................................................................ ........................................ 238 O Traço Falciforme (Hb AS) ............................................................................................... ............................... 240 Controle Clínico dos Doentes Falcêmicos ................................................................ ............................................. 242 Aspectos Gerais da Anemia ............................................................................................... ............................... 242 Dactilite (Síndrome Mão-Pé) Mão ............................................................................................. ............................. 242 Síndrome do Quadrante Superior Direito ................................................................ ......................................... 243 Síndrome Torácica Aguda (STA) ........................................................................................ ........................ 244 Priapismo........................................................................................................................... ................................ ........................... 245 Úlceras de Perna ................................................................................................ ................................ ............................................... 245 Necrose Avascular ................................................................................................ ................................ ............................................. 246 Acidente Vascular Cerebral (AVC) ................................................................ ..................................................... 246 Crises Dolorosas ................................................................................................ ................................ ................................................ 247 Tratamento das Crises Dolorosas ................................................................ ...................................................... 248 Interferentes que acentuam ou minimizam a Anemia Falciforme ....................................... ................................ 248 Principais consequências dos interferentes ambientais, sociais e econômicos na anemia falciforme .......................................................................................................................... ................................ .......................... 249 Interações da Hb SS com Deficiência de G-6PD G ................................................................ ................................ 250 Interações da Hb SS com Persistência Hereditária de Hb Fetal ........................................ ................................ 250 Interações da Hb SS com Esferocitoses e Eliptocitoses Eliptocitose .................................................... ................................ 253 Deficiência de Enzimas Eritrocitárias Anti-Oxidantes Anti (SOD, catalase, GPx) ...................... 254 Prevalência e Controle do Gene da Hb S................................................................ S ............................................... 254 6

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Distribuição Geográfica Mundial. ................................................................ ...................................................... 254 Distribuição Geográfica no Brasil ................................................................ ...................................................... 256 Relação entre Sobrenomes e Hb S no Brasil ................................................................ ..................................... 259 Interferentes Eritrocitários e ambientais na Anemia Falciforme ...................................... ................................ 260 Controle e Prevenção das Doenças Falciformes ............................................................... ............................... 261 Testes Laboratoriais Específicos para Hb S ................................................................ ....................................... 261 Radicais Livres .......................................................................................................................... ................................ .......................... 262 Introdução ............................................................................................................................. ................................ ............................. 262 Os Componentes Celulares ................................................................................................ ................................... 262 Elementos tos Químicos Importantes das Células ................................................................ ...................................... 263 O Radical Livre ....................................................................................................................... ................................ ....................... 263 O Oxigênio como Fonte de Radical Livre................................................................ ............................................... 263 Fontes de Elétrons na Célula ................................................................................................ ................................. 264 Fontes ntes de Hidrogênio na Célula ............................................................................................ ............................ 265 Ativação do Oxigênio em Presença de Elétrons e Hidrogênio .............................................. ................................ 266 Defesa Antioxidante Promovida pela Célula ................................................................ ......................................... 267 Lesões Causadas por Radicais Livres ................................................................ ..................................................... 268 Algumas Fontes de Origem de Radicais Livres ................................................................ ...................................... 268 Principais Grupos de Radicais Livres ................................................................ ..................................................... 269 Lesões dos Radicais Livres na Membrana ................................................................ ............................................. 270 Ação dos Radicais Livres na Membrana ................................................................ ................................................ 271 Oxidação das Metalo-Proteínas Proteínas ............................................................................................ ............................ 272 Ação de Radicais Livres nas Células Falciformes ................................................................ ................................... 275 Ação Protetiva Contra a Geração de Radicais Livres............................................................. ............................. 276 Avaliação Laboratorial dos Produtos Resultantes da Degradação Oxidativa da Hemoglobina ................................................................ ................................................................................................ ............................................... 277 Policetemia e Eritrocitose................................ ................................................................................................ .......................................... 279 Introdução ............................................................................................................................. ................................ ............................. 279 Policitemia Vera ou Verdadeira ............................................................................................ ............................ 280 Policitemia Secundária ................................................................................................ ................................ .......................................... 280 Aumento Compensatório da Eritropoietina................................................................ ...................................... 280 Elevação Anormal da Eritropoietina ................................................................ ................................................. 280 Situações Relativas ................................................................................................ ................................ ............................................ 281 Técnicas Laboratoriais Aplicadas aos Estudos dos Eritrócitos ................................................. ................................ 282

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Coloração de May-Grunwald Grunwald-Giemsa ................................................................ ................................................... 282 Reagentes .......................................................................................................................... ................................ .......................... 282 Pesquisa de Corpos de Heinz e Agregados de Hb H.............................................................. .............................. 283 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 283 Equipamentos ................................................................................................ ................................ ................................................... 283 Reagentes .......................................................................................................................... ................................ .......................... 283 Procedimento ................................................................................................ ................................ .................................................... 284 Precauções ........................................................................................................................ ................................ ........................ 284 Coloração intra-eritrocitária eritrocitária de Hb Fetal ................................................................ .............................................. 284 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 284 Equipamentos ................................................................................................ ................................ ................................................... 284 Reagentes .......................................................................................................................... ................................ .......................... 284 Procedimento ................................................................................................ ................................ .................................................... 285 Interpretação................................ ................................................................................................ ..................................................... 285 Teste de Falcização................................................................................................ ................................ ................................................ 285 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 285 Equipamentos ................................................................................................ ................................ ................................................... 285 Reagentes .......................................................................................................................... ................................ .......................... 285 Procedimento ................................................................................................ ................................ .................................................... 286 Interpretação................................ ................................................................................................ ..................................................... 286 Precauções ........................................................................................................................ ................................ ........................ 286 Dosagem de Hb Fetal ................................................................................................ ................................ ............................................ 286 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 286 Método de Singer ................................................................................................ ................................ .............................................. 287 Método de Betke................................................................................................ ................................ ............................................... 288 Teste de Precipitação para Hemoglobinas Instáveis............................................................. ............................. 289 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 289 Teste de Desnaturação ao Calor ....................................................................................... ....................... 290 Teste de Precipitação por Isopropanol ................................................................ ............................................. 291 Resistência osmótica em Solução de NaCl 0,36% ................................................................ ................................. 292 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 292 Equipamento ................................................................................................ ................................ ..................................................... 292 Reagentes .......................................................................................................................... ................................ .......................... 292 Procedimento ................................................................................................ ................................ .................................................... 292 8

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Interpretação................................ ................................................................................................ ..................................................... 293 Precaução .......................................................................................................................... ................................ .......................... 293 Curva de Fragilidade Osmótica ............................................................................................. ............................. 293 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 293 Equipamento ................................................................................................ ................................ ..................................................... 293 Reagentes .......................................................................................................................... ................................ .......................... 293 Procedimento ................................................................................................ ................................ .................................................... 294 Valores Referenciais ................................................................................................ ................................ .......................................... 295 Eletroforese Qualitativa de Hemoglobinas em Acetato de Celulose pH 8,0 e 9,0 ................ 295 Princípio............................................................................................................................. ................................ ............................. 295 Equipamento ................................................................................................ ................................ ..................................................... 295 Reagentes .......................................................................................................................... ................................ .......................... 296 Procedimento ................................................................................................ ................................ .................................................... 296 Controle ............................................................................................................................. ................................ ............................. 297 Precauções ........................................................................................................................ ................................ ........................ 297 Dosagem de Hb A2 por Eletroforese em Acetato de Celulose pH 8,0 e 9,0 ......................... 298 Procedimento Específico ................................................................................................ ................................... 298

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O ERITRÓCITO O Eritrócito Normal Introdução O eritrócito é uma célula altamente especializada e sua principal função é o transporte de oxigênio dos pulmões aos tecidos e de dióxido de carbono no sentido inverso. Esta função é facilitada pela forma discóide e bicôncava do eritrócito (figura ( 1.1), ), pelo fato de possuir ampla superfície para a troca de gás. O eritrócito tem um diâmetro médio de 8 mm, mas seu citoesqueleto e a estrutura da sua membrana é capaz de sofrer marcante deformação e passar através de capilares com 2-3 mm de diâmetro (figuras 1.2 e 1.3). ). Essa deformidade somente é possível pelas interações entre proteínas que estão inseridas na dupla camada lipoprotéica da membranaa eritrocitária (banda 3 e glicoforina) e as proteínas que estão na região interna da membrana e em contato com o citoplasma (espectrina, anquirina e proteína 4.1) conforme mostra afigura 1.4.. Defeitos nestas proteínas causam deformações na morfologia e funções fu dos eritrócitos, que são apresentadas resumidamente na tabela 1.1.

Figura 1.1. Microscopia eletrônica de eritrócitos normais, com formas discóides.

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Figura 1.2. Fluidez normal de eritrócitos em capilar de diâmetro vascular próximo de 8 mm.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Figura 1.3. Deformabilidade de eritrócito em capilar com diâmetro vascular de 3 mm (cisaliamento).

Figura 1.4. Estrutura da membrana do eritrócito; GPA: glicoforina A; GPC: glicoforina C.

Tabela 1.1.. Alterações das proteínas de membrana de eritrócitos, e as principais doenças específicas. Anormalidades Protéicas Espectrina e Anquirina Banda-3, 3, Proteína 4.1 Espectrina Proteína 4.1 Espectrina Defeito de permeabilidade de sódio

Forma de Herança

Doença Hereditária

Autossômica dominante

Esferocitose

Recessiva (raro)

Esferocitose

Autossômica dominante

Eliptocitose

Recessiva (raro)

Eliptocitose

Recessiva

Piropoiquilocitose

Autossômica dominante

Estomatocitose

O eritrócito maduro é desprovido de organelas e núcleo, e assim é incapaz de sintetizar proteínas, de realizar a fosforilação oxidativa e de obter energia pelo ciclo do ácido tricarboxílico. Dessa forma, a energia do eritrócito é obtida principalmente por meio da via aeróbica de Embden-Meyerhof Meyerhof e estocada sob forma de ATP (figura ( 1.5). ). Dependendo Depend do grau de oxidação do eritrócito, são liberadas quantidades variáveis de glicose através do desvio da hexose monofosfato para produzir componentes redutores como a glutationa (GPx) e

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH), conforme mostra no destaque a figura 1.5 referente à via de desvio pentose-fosfato. pentose

Figura 1.5. Vias metabólicas do eritrócito. NAD: nicotinamida adenina dinucleotídeo; NADH: forma reduzida da NAD; NADP: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato; NADPH: forma reduzida de NADP; 2,3 DPG: 2,3-difosfoglicerato; 2,3 difosfoglicerato; GSH: glutatião reduzido; GSSG: glutatião oxidado.

Aproximadamente 98% da proteína citoplasmática do eritrócito é composta por milhões de moléculas de hemoglobinas (Hb), que transportam o oxigênio. Cada molécula de hemoglobina h é formada por duas globinas do tipo alfa – representadas por a2, e duas globinas do tipo beta – representadas por b2, d2, g2. São as globinas do tipo beta que diferenciam os três tipos de hemoglobinas humanas: Hb A (a2b2), Hb A2(a2d2) e Hb Fetal (a2g2). Cada globina se liga a um grupo heme; portanto cada molécula de hemoglobina transporta quatro moléculas de oxigênio que se ligam aos quatro átomos de ferro (Fe++O2--), conforme mostra a figura 1.6. 1.6 Os tipos de hemoglobinas variam conforme o processo evolutivo do indivíduo, conforme mostra a tabela 1.2.

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Figura 1.6. (a) Representação esquemática de moléculas de hemoglobina oxigenada (oxihemoglobina) e hemoglobina desoxigenada (desoxihemoglobina). (b) Curva de dissociação de oxigênio.

Tabela 1.2. Tipos de hemoglobinas em diferentes fases. Tipo de Hb

Composição

Concentração/Fase

a 2b 2

96-98% - adulta (*)

a 2d 2

2-4% - adulta (*)

Fetal

a2g2

0-1% - adulta (*) 90-100% - feto Gower-1

z 2e 2

variável-embrião

Gower-2

a 2e 2

variável-embrião

Portland

z2g2

variável-embrião

(*) fase que representa a hemoglobina definitiva (ou adulta) após o sexto mês de vida A curva de dissociação de oxigênio descreve a porcentagem de saturação da hemoglobina com o oxigênio, em diferentes pressões do oxigênio (PO2). A curva com a forma signóide (figura ( 1.6) reflete a interação entre o oxigênio e a hemoglobina. Assim a hemoglobina se torna oxigenada (oxihemoglobina) à medida que a saturação supera 60%, fato que ocorre quando o 2,3 DPG desocupa a molécula de Hb. A desoxigenação da hemoglobina (deoxihemoglobina) ocorre com a saturação de 2,3 DPG na molécula, e efetivamente tem início quando o nível de saturação de oxigênio cai abaixo de 40%. Assim, o nível de liberação do oxigênio é por volta de 75% de saturação. Durante urante aproximadamente 120 dias de vida celular, o eritrócito desempenha sua função de transportador de oxigênio, percorrendo cerca de 450 quilômetros nos vasos sangüíneos, e 14

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP submetido a turbulências no coração e artérias (figura ( 1.7)) e ao cisaliamento nos capilares (figura 1.8). ). O envelhecimento dos eritrócitos é acompanhado pela perda de flexibilidade de sua membrana devido ao aumento do colesterol e da lipoperoxidação da dupla camada lipoprotéica (ver capítulo "Radicais Livres e Danos Eritrocitários"). A desestruturação protéica da membrana, em especial pelas agregações da banda-3 banda 3 e da 4.1, provavelmente se constituem num "sinal" para que os macrófagos reconheçam os eritrócitos envelhecidos e promovem a fagocitose (figura 1.9).

Figura 1.7. Fluxo turbulento normal em artéria.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Figura 1.8. Fluxo de eritrócitos em capilar, cuja deformidade natural é conhecida por cisaliamento (eritrócitos alongados em forma de capuz).

Figura 1.9. Fagocitose de eritrócito envelhecido por macrófago no sistema retículo endotelial (SRE).

Hematopoiese com Ênfase Eritrocitária Fase intra-uterina A produção das células do sangue inicia-se inicia se no saco vitelino após a segunda semana de fecundação e, conforme o embrião se desenvolve, várias estruturas orgânicas começam a se organizar e especializar. Nesse processo de desenvolvimento morfológico e fisiológico, o embrião se transforma em feto com o aparecimento dos primeiros órgãos. O fígado do feto se torna o principal local de hematopoiese no segundo trimestre de gestação, gestação, enquanto as medulas dos ossos vão se formando anatômica e funcionalmente. No terceiro trimestre do desenvolvimento fetal, as medulas ósseas são, enfim, o mais importante órgão hematopoiético. A maioria das células hematopoiéticas produzidas no saco vitelino vitelino e no fígado fetal é eritroblástica; enquanto, no período fetal, a síntese de eritrócitos e de granulócitos que envolve a produção de neutrófilos, eosinófilos e basófilos ocorre na medula óssea. Algumas características da eritropoiese intra-uterina intra estão resumidas na tabela 2.1. 2.1

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Tabela 2.1. Eritropoiese no período intra-uterino. intra Local da Eritropoiese

Tipo Celular Básico

Tipo Celular Maduro

Tipos de Hemoglobinas

Saco vitelínico

megaloblástico

megalócitos nucleados

Gower-1* 1* Gower-2* 2* Portland*

Fígado

normoblástico

macrócitos anucleados

Fetal

Medula óssea

normoblástico

macrócitos anucleados

Fetal

* conhecidas também como hemoglobinas embrionárias

Fase pós-nascimento Após o nascimento a medula óssea é o único local da eritropoiese em indivíduos saudáveis. Durante os primeiros quatro anos de vida, quase todas as cavidades medulares contêm tecido hematopoiético, configurando-lhe configurando lhe uma textura vermelha (a medula óssea vermelha), e poucas células adiposas. Com o passar do tempo, as células adiposas vão tomando o espaço das cavidades medulares na maior parte dos ossos, substituindo gradativamente o tecido hematopoiético por gordura. Por volta dos 25 anos de idade, as medulas ósseas que desenvolvem a medida que se tornam mais maduras, diminui progressivamente progressivamente seu potencial de diferenciação. Assim, as células-mãe mãe unipotentes direcionam-se direcionam se especificamente para a produção de eritrócitos, granulócitos-neutrófilos, neutrófilos, monócitos/macrófagos e megacariócitos, e são respectivamente identificadas por UFC-E, UFC-G, UFC-Me UFC-Mega.. Essas células se desenvolvem morfologicamente até serem reconhecidas pelos métodos citológicos comuns em suas linhagens correspondentes: pró-normoblastos, pró normoblastos, mieloblastos, monoblastos e megacarioblastos (figura 2.1). ).

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Figura 2.1. Representação do desenvolvimento das células do sistema hematopoiético. A linhagem de células progenitoras (CFC = colônia formadora de células ou C.F.U.: unidades formadoras de colônias) está definida pelos seguintes prefixos: Eo=eosinófilo; G=granulócito neutrófilo; M=macrófago; macrófago; Ba=basófilo; Meg=megacariócito; E=eritrócito; Mix CFC=célula com capacidade para formar três ou mais linhagens; BFU-E=unidade BFU E=unidade formadora de blastos eritróides; CFUCFU E=unidade formadora de colônias eritróides.

Diante dos conhecimentos aqui resumidos resumidos e devido à especificidade desse capítulo, será abordado apenas o desenvolvimento da linhagem eritrocitária.

Eritropoiese Nas pessoas adultas, os eritrócitos são normalmente formados na medula óssea. Esse processo, em situação patológica como nos casos de anemias hemolíticas crônicas, pode ocorrer no baço e em outros órgãos do sistema reticuloendotelial, por exemplo: o fígado. A eritropoiese depende da adequada obtenção de proteínas, carboidratos, gorduras, sais minerais e vitaminas. Os elementos mais importantes mportantes desses dois últimos grupos são ferro, ácido fólico e vitamina B12. A piridoxina e o ácido ascórbico também são considerados essenciais. A absorção de ferro é facilitada por ácido hipoclorídrico e ácido ascórbico, e depende de um componente protéico, proté a transferrina, para transportá-lo lo à medula óssea e aos órgãos de estocagem, dos quais o fígado é o principal. A absorção da vitamina B12 requer um componente protéico, conhecido por fator intrínseco, que é uma substância existente no suco gástrico e secretado pelas células parietais da mucosa gástrica. Assim, a vitamina B12 e o ácido fólico dependem do funcionamento normal da mucosa gástrica para serem absorvidos. O ácido ascórbico participa da transformação do ácido fólico para sua forma ativa, o ácido do folínico. Ferro, ácido fólico e vitamina B12 são estocados no fígado para serem utilizados em situação de deficiência desses elementos.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP O processo fisiológico responsável pela manutenção do equilíbrio entre a produção e a destruição dos eritrócitos inclui inclui um hormônio, a eritropoietina, produzido nos rins. A eritropoietina é uma alfaglobulina, cuja síntese está relacionada com a hipóxia celular. Especialmente a hipóxia renal reduz a produção e a liberação da eritropoietina e esta, por sua vez, acelera a diferenciação iferenciação da célula-tronco célula tronco mielóide multipotente para a linhagem específica da célula-mãe mãe eritróide blástica (UFB-E, (UFB E, ou unidade formadora de blastos eritróides). Nesse processo deve ser ressaltado que ao acelerar a diferenciação da célula-tronco célula mielóide multipotente, outra célula similar deve apenas de dividir para evitar o esgotamento do compartimento. A regulação da produção de eritrócitos pela eritropoietina depende do consumo de oxigênio tecidual e notadamente da queda da pO2 renal. Assim, quando ocorre a diminuição da massa eritrocitária circulante por uma alteração patológica, como são os casos das anemias, há um prejuízo na vascularização tecidual modificando o débito cardíaco, a função pulmonar e a liberação de 2,3-difosfoglicerato difosfoglicerato hematopoiese estão resumidas a ossos do crânio, costelas, vértebras, esterno, escápulas, clavículas, pelve, região média-superior média superior do sacro, cabeça do fêmur e úmero. Todas as cavidades medulares dos ossos restantes contêm gordura e, por isso, são denominadas de medulas amarelas. Algumas doenças específicas, por exemplo: anemias hemolíticas, anemias megaloblásticas e alguns tipos de leucemias, podem alterar o tecido hematopoiético e o seu local de síntese por: a. substituição parcial ou total das células adiposas por células hematopoiéticas nas cavidades medulares de ossos que normalmente têm atividades hematopoiéticas; b. extensão da medula hematopoiética para os ossos que contêm em suas cavidades a medula gordurosa (por exemplo, ossos longos); c. aparecimento de tecidos hematopoiéticos hematopoiéticos no fígado e baço, produzindo a hematopoiese extramedular. Os sistemas hematopoiéticos das pessoas adultas são exemplos de um constante estado de renovação das células em que o nível de perda de células maduras do sangue (eritrócitos, granulócitos, itos, monócitos, linfócitos e plaquetas) é equilibrado completamente, por meio da distribuição de novas células produzidas. As células maduras são retiradas da circulação sangüínea devido ao seu tempo de vida útil ou durante suas atividades funcionais. Assim, Ass a formação de células do sangue envolve dois processos: 1. desenvolvimento progressivo das características estruturais e funcionais específicas para um determinado tipo de célula (citodiferenciação ou maturação); 2. proliferação celular. A hematopoiese inicia-se se por meio de dois grandes grupos celulares conhecidos por célulascélulas tronco e células-mãe mãe que não são reconhecidas morfologicamente em esfregaços de sangue obtidos por punção da medula óssea, mas podem ser estudadas por testes funcionais. Essas células, denominadas enominadas de unidades formadoras de blastos (UFB) e unidades formadoras de colônias (UFC) têm sido identificadas e caracterizadas por sua capacidade de produzir pequenas colônias de um ou mais tipos de células em meios de cultura muito específicos (figura ( 2.1). A célula hematopoiética mais primitiva é a célula-tronco célula tronco pluripotente, que dá origem a dois tipos de células-tronco tronco específicas e conhecidas por células-tronco células mielóides multipotentese multipotentes células-tronco linfóides.. As células-tronco células mielóides multipotentes diferenciam-se diferenciam em vários tipos de células-mãe mãe mielóides que eventualmente geram os eritrócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastócitos, monócitos e plaquetas. As células-tronco células linfóides originam as célulascélulas 19

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP mãe específicas para produzirem linfócitos linf T, linfócitos B, linfócitos não-T T e linfócitos não-B. não Diferentemente das células-tronco, tronco, as células-mãe células mãe mielóides e linfóides têm limitada capacidade de regeneração. As células-mãe mãe mielóides mais imaturas são direcionadas para duas ou três vias de diferenciação. À (2,3-DPG). DPG). Toda essa situação promove o aumento da afinidade das células pelo oxigênio e causa a liberação da eritropoietina pelos rins para estimular as células formadoras de eritrócitos. Esse processo de regulação promovido pela adequada liberação de eritropoietina, estimula a eritropoiese, cujos componentes principais são os pró-eritroblastos pró (ou pró-normoblastos), normoblastos), os eritroblastos (ou normoblastos) basófilo, policromatófilo a acidófilo, os reticulócitos e os eritrócitos maduros. As células células blásticas sofrem contínuas reduções de tamanho, com mudanças profundas no seu conteúdo citoplasmático e na sua estrutura celular, ao mesmo tempo em que a síntese de hemoglobina se acumula gradativamente no espaço celular. A eritropoiese ocorre num período período normalmente entre oito e nove dias até a liberação do eritrócito adulto, conforme resume a tabela 2.2. Tabela 2.2. Duração aproximada dos diferentes tipos celulares e o crescimento da concentração de hemoglobina durante a gênese eritrocitária. Células

Tempo médio (h)

Concentração de Hbmm

Pró-eritroblasto

0-7

Eritroblasto basófilo

7-25

Eritroblastos policromatófilo e ortocromático

10-25

Eritroblasto acidófilo

13-25

Reticulócito

25-30

Eritrócito

120 dias

27-32

Pró-eritroblasto É uma célula oval ou circular com diâmetro variável entre 20 e 25 m. O núcleo ocupa 4/5 da célula, e é possível visualizar um ou dois nucléolos. É uma célula rica em ribossomos citoplasmáticos, além das organelas comuns que caracteriam áreas descoradas que correspondem aos locais em que se encontram os centrosomas, ou pequenas áreas claras onde se localizam as mitocôndrias (figura figura 2.2). 2 ). Ainda no citoplasma é possível observar apenas com recursos da microscopia eletrônica as moléculas de ferritina calculadas entre 500 a 1.000 por célula. Nenhuma ou pouca hemoglobina é sintetizada nesta fase (0 a 7 mmg). Cada pró-eritroblasto, eritroblasto, após 20 horas de vida, sofre o processo de mitose e origina dois eritroblastos basófilos. Eritroblasto basófilo – o processo de mitose da célula precedente resulta numa diminuição do tamanho celular do eritroblasto basófilo. Morfologicamente é uma célula circular, com o núcleo ocupando 2/3 do volume total, e o citoplasma é caracterizado por basofilia uniforme e menos intensa. O núcleo se torna bem característico através da cromatina distribuída homogeneamente em grupos (figura 2.2). ). O fenômeno da mitose é freqüentemente freqüentemente observado nessas células, quando por aspiração de sangue da medula óssea. Por microscopia eletrônica avalia-se avalia entre 20 20

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP e 30 mitocôndrias, centrosoma pequeno contendo dois centríolos envolvidos por um complexo de Golgi. Observa-se, se, também, a presença de conglomerados de ferritina que representam os siderócitos visualizados com corante específico em microscopia óptica. O eritroblasto basófilo tem vida média de 40 horas e se destaca por dar início à síntese de hemoglobina (7 a 25 mmg). Por mitose, origina origi o eritroblasto policromatófilo.

Figura 2.2. Microscopia óptica de esfregaço obtido de punção medular. PE=proeritroblasto; EB=eritroblasto basófilo; EP=eritroblasto policromático.

Eritroblasto basófilo O processo de mitose da célula precedente resulta numa diminuição do tamanho celular do eritroblasto basófilo. Morfologicamente é uma célula circular, com o núcleo ocupando 2/3 do volume total, e o citoplasma é caracterizado por basofilia uniforme e menos intensa. O núcleo se torna bem característico ico através da cromatina distribuída homogeneamente em grupos (figura ( 2.2). ). O fenômeno da mitose é freqüentemente observado nessas células, quando por aspiração de sangue da medula óssea. Por microscopia eletrônica avalia-se avalia se entre 20 e 30 mitocôndrias, centrosoma trosoma pequeno contendo dois centríolos envolvidos por um complexo de Golgi. ObservaObserva se, também, a presença de conglomerados de ferritina que representam os siderócitos visualizados com corante específico em microscopia óptica. O eritroblasto basófilo tem vida média de 40 horas e se destaca por dar início à síntese de hemoglobina (7 a 25 mmg). Por mitose, origina o eritroblasto policromatófilo.

Eritroblastos policromatófilo e ortocromático O eritroblasto policromatófilo é uma célula menor do que o basófilo basófilo e se destaca pela gradativa incorporação da acidofilia no citoplasma promovida pelo aumento da concentração de 21

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP hemoglobina (figuras 2.2 e 2.3). 2.3). O volume do núcleo dessa célula diminui proporcionalmente ao seu grau de envelhecimento, passando de ½ em relação relação ao volume da célula na fase inicial, para ¼ na fase final, caracterizando assim o eritroblasto ortocromático. O tempo de vida do eritroblasto policromatófilo é próximo de 24 horas e a célula sintetiza entre 10 e 25mmg de hemoglobina.

Figura 2.3. Microscopia óptica de esfregaço obtido de punção medular, mostrando no centro um eritroblasto policromático.

O eritroblasto ortocromático inicialmente tem o núcleo central que ocupa ¼ do volume celular e à medida que vai envelhecendo, esse núcleo se torna denso e desloca-se se para a periferia. Essa célula tem um tempo de vida médio de 30 horas e sintetiza entre 13 e 25 mmg de hemoglobina (figura 2.4). ). A perda do núcleo ocorre por um processo denominado extrusão (figura ( 2.5), que indica uma perda parcial do material, material, o restante é fagocitado por macrófagos, que se dispõem no centro de vários eritroblastos (ilhotas de eritroblastos) (figura ( 2.6). ). Ao fagocitar o núcleo, o macrófago introduz também alguma quantidade de hemoglobina, que é metabolizada e dá origem à formação de "picos" de bilirrubina. Após o desaparecimento do núcleo, a célula se transforma no reticulócito.

Figura 2.4. Microscopia óptica de esfregaço obtido de punção medular, mostrando um eritroblasto ortocromático (ou acidófilo).

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Figura 2.5. Figura representando a perda do núcleo (extrusão) durante passagem do espaço intracelular para o extracelular.

Figura 2.6. Fagocitose de núcleos de eritroblastos ortocromáticos (ou acidófilos) por macrófago (no centro da foto).

Reticulócito É uma célula caracterizada durante o período compreendido entre a perda do núcleo do eritroblasto ortocormático e a perda de organelas, em especial as mitocôndrias e os ribossomos. Tem uma duração de 72 horas e capacidade para sintetizar entre 25 e 30 mmg de hemoglobina. hem O reticulócito contém porções do complexo de Golgi, mitocôndria e um número variável de mono e polirribossomos. Moléculas de ferritina estão presentes nesta fase da série eritrocitária, e o desaparecimento das organelas é progressivo. O reticulócito reticulócito é uma célula que se caracteriza 23

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP pela resposta do sistema eritropoiético a um grave estresse. Assim, seu aumento no sangue se deve a uma resposta devido à anemia aguda (figura ( 2.7), ), ou às injeções de substâncias que ativam ou estimulam a eritropoiese, por por exemplo: vitamina B12, folatos, ferro, eritropoietina. A fase seguinte à do reticulócito é a do eritrócito.

Figura 2.7. Microscopia óptica de esfregaço de sangue periférico incubado com azul de crezil brilhante a 1%, onde aparecem elevado número de reticulócitos, reticulócitos, caracterizando a reticulocitose. Situações de reticulocitose semelhantes ao da foto são observadas nas anemias hemolíticas graves (anemia falciforme, hemoglobinas instáveis, esferocitose homozigota, etc.)

Eritrócito Esta célula tem a forma de disco bicôncavo, com 8 mm de diâmetro, espessura periférica de 2,5 mm e central de 1 mm. A superfície total é de 160 mm2 e o volume de 90 mm3. O peso é de 30 x 10-19g (figuras 2.8 e 2.9). 2.9). Esses valores variam entre 5 e 10% na normocitose e normocromia. Os eritrócitos têm cor amarela, se vistos a fresco por microscopia óptica. Alguns fenômenos naturais podem ser observados nos eritrócitos, entre os quais destacam-se: destacam • • •

formação de "roleaux", devido ao significativo aumento de fibrinogênio (infecções e mieloma); aglutinação, quando há altos títulos de anticorpos antieritrocitários; deformabilidade, situação normal observada in vivo no microscópio (figura figura 2.11). 2.11

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Figura 2.8. Microscopia eletrônica de varredura de eritrócito normal.

Figura 2.9. Microscopia óptica de sangue periférico mostrando eritrócitos normais.

Figura 2.11. Deformabilidade de eritrócitos na circulação vascular.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os eritrócitos são transportados no espaço intravascular pela força do coração e pelas "bombas" dos músculos somáticos. Quando a parede vascular sofre alguma lesão, os eritrócitos podem passar para o espaço extracelular das cavidades do corpo, ou ser levados ao meio exterior através da pele, ou dos sistemas gastrointestinal, respiratório e urinário. A função principal dos eritrócitos tos é o transporte de oxigênio dos pulmões para as células do organismo, e do dióxido de carbono no sentido inverso. Na circulação do sangue periférico atuam cerca de 25 bilhões de eritrócitos e, por dia, são retirados da circulação aproximadamente 1 bilhão bilhão dessas células. Os eritrócitos normais vivem em média 120 dias, e, à medida que envelhecem, as enzimas da glicólise diminuem suas atividades. O envelhecimento se manifesta pelo aumento da densidade, da fragilidade osmótica e da aglutinabilidade. É certo que uma pequena parte dos eritrócitos se decompõe por lise na circulação, entretanto a destruição efetiva ocorre no sistema reticuloendotelial, onde os macrófagos exercem a fagocitose (figura (figura 2.12). 2.12 Esse processo acontece essencialmente na medula óssea, enquanto enquanto em situações patológicas, por exemplo eritrócitos deformados pela presença de corpos de Heinz, ou globinas despareadas nas talassemias, a fagocitose ocorre no sistema reticuloendotelial do fígado e baço, e nas células macrofágicas da circulação sangüínea. sangüínea. Após a fagocitose, a globina se dissocia em aminoácidos, a protoporfirina, proveniente da degradação do grupo heme, se transforma em bilirrubina livre, e o ferro se combina com o apoferritina da célula reticular. Os aminoácidos e o ferro, provenients provenient da decomposição da hemoglobina, são novamente utilizados pelos eritroblastos para a síntese de novas moléculas.

Figura 2.12. Microscopia eletrônica mostrando macrófago do sistema retículo endotelial fagocitando eritrócito.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Principais Componentes dos Eritrócitos Os Fatores Mais Importantes da Eritropoiese Eritropoietina

A eritropoietina é um hormônio produzido nos rins. Estruturalmente é uma glicoproteína formada por uma simples cadeia polipeptídica constituída por 165 aminoácidos, dos quais três deles estão ligados a carboidratos cuja glicolização ocorre no nitrogênio do grupo amina, e um outro tem a glicolização no grupo carboxila. Dessa associação resulta que 60% da eritropoietina é composta por proteína e 40% por carboidrato, proporcionando proporcionando um peso molecular de 30.000 daltons. A síntese da eritropoietina ocorre no gene EPO localizado no braço longo do cromossomo 7, nas células peritubulares intersticiais dos rins. O estímulo para que o gene EPO inicie a produção de eritropoietina está relacionado relacionado com a pressão do oxigênio renal (pO2 renal). Quando a pO2 renal diminui, por ex.: devido à anemia, o gene EPO é estimulado a sintetizar a eritropoietina. Por outro lado, quando a pO2 renal se normaliza, a síntese desse hormônio diminui aos níveis aceitáveis. Normalmente, somente quantidades muito pequenas, ou picomolecular, estão presentes no sangue. Por avaliação de técnicas de radioimunoensaio, o nível basal de eritropoietina no plasma varia de 9 a 26 um/ml. A elevação da síntese de eritropoietina ocorre poucas horas após a queda do pO2 renal causada por anemia ou por hipoxia renal, observando que a elevação da síntese de EPO está diretamente relacionada com a queda da pO2 renal. A eritropoietina estimula concomitantemente as células tronco (Unidade Formadora de Blastos Eritróides, ou BFU-E, E, e Unidade Formadora de Colônias Eritróides, ou CFUCFU-E) para aumentar o número de células precursoras eritróides (proeritroblastos, eritroblastos e reticulócitos), e eventualmente, o número de eritrócitos circulantes. circulantes. O hormônio EPO se liga a receptores específicos de superfície das células tronco, que é rapidamente introduzido nas células e degradado, a seguir. Esse processo resulta na elevação do íon cálcio no interior dessas células que desencadeia o processo de transcrição do RNAm de várias proteínas eritróides, incluindo a globina. O aumento da síntese de DNA nas células tronco estimuladas pela eritropoietina ocorre entre 20 e 40 horas. Juntamente com esse processo de estimulação da eritropoietina outros fatores também são necessários, p.ex.: ferro, folatos e aminoácidos, para o completo desenvolvimento da eritropoiese (figura ( 3.1).

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Figura 3.1. Eritropoiese na medula óssea: 1. Proeritroblasto; 2. Eritroblasto basófilo; 3: Eritroblasto policromático; 4. Eritroblasto ortocromático.

O Ferro e seu Metabolismo

O metabolismo do ferro é caracterizado por uma obtenção externa de forma limitada e uma reutilização eficaz, proveniente de fontes internas que o armazenam. Normalmente cerca de 66% do ferro total do corpo (2.000 a 2.500 mg) está ligado à hemoglobina circulante; 30% (800 a 1.500 mg) em órgãos e células que estocam o ferro, e 3 a 5% na mioglobina. Traços de ferro são encontrados em determinadas enzimas. Somente perto de 3 mg estão ligados à transferrina na circulação, mas esta quantidade é substituída ou perdida várias vezes ao dia. O ferro é absorvido através da mucosa do jejuno em uma fase rápida, que se inicia segundos após ter alcançado as células mucosas das vilosidades intestinais, e atinge o pico entre 30 e 60 minutos. Esta fase rápida é seguida por uma outra lenta que demora 24 horas, em média. O ferro, após passar pelas células, é liberado para a circulação, onde se liga à transferrina. Em pessoas saudáveis, cerca de 1,0 mg de ferro é absorvido dos dos alimentos diariamente. No período menstrual esta quantidade é cerca de 2,0 mg, enquanto na deficiência de ferro, a requisição é de quatro a seis vezes maior. Quando há sobrecarga de ferro no organismo, ocorre a diminuição de sua absorção. O estoque de ferro erro no corpo está compreendido principalmente pela ferritina. A alimentação humana pode fornecer diariamente de 10 a 15 mg de ferro para o indivíduo adulto de países desenvolvidos. Entretanto, o conteúdo de ferro dos alimentos é muito variável, conforme mostra a tabela 3.1. 3.1 Tabela 3.1. Conteúdo de ferro em mg% nos principais alimentos consumidos. Tipo de Alimento Açúcar e doces

Ferro (mg%) 0

Leite, queijos, coalhadas

0,1 – 0,2

Frutas

0,1 – 0,5

Arroz, massas, pães

0,5 – 1,5

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Batatas

0,5 – 1,0

Legumes e verduras

0,5 – 1,5

Ovos

2,0 – 3,0

Carnes magras

1,5 – 3,0

Feijões, favas, lentilhas

4,0 – 8,0

O baixo conteúdo de ferro no açúcar e no leite explica a ocorrência freqüente de deficiência de ferro em lactantes, idosos e em algumas populações com alimentação desequilibrada. Por outra parte, as bebidas alcoólicas em geral contêm quantidades variáveis e elevadas de ferro, cuja média é da ordem de 10 mg por litro, fato que pode explicar, em parte, a freqüência de hemocromatose na cirrose alcoólica. A avaliação quantitativa de ferro pode ser obtida pela medida de ferro sérico saturado, da capacidade de ligação do ferro e da concentração de ferritina sérica. A tabela 3.2apresenta 3.2 os valores normais da quantidade de ferro sérico e capacidade de ligação, em e três unidades diferentes. Tabela 3.2. Valores de ferro sérico e capacidade de ligação em pessoas saudáveis, utilizando três unidades diferentes. mg/litro

mmol/litro

mg/dl

Ferro sérico

0,7 – 1,8

13 – 32

70 – 180

Capacidade de ligação

2,5 – 4,0

45 – 70

250 – 400

Os valores de ferro sérico estão diminuídos na anemia, por deficiência de ferro, nas infecções crônicas e nas hipoproteinemias; e estão elevados na hemocromatose, na anemia hemolítica, após múltiplas transfusões e, freqüentemente, na anemia perniciosa. A capacidade de ligação do ferro está aumentada na anemia por deficiência de ferro e na gravidez, diminuída das infecções crônicas e hipoproteinemias, e totalmente saturada com ferro na hemocromatose. O nível de ferritina sérica reflete o ferro ferro armazenado no organismo, indicando, em geral, que para cada micrograma de ferritina há 8 miligramas de ferro estocado. Os valores normais diferem entre populações, idade e sexo. No Brasil aceitam-se aceitam se os valores expostos na tabela 3.3. Tabela 3.3. Valores de ferritina em diferentes faixas etárias, em homens e mulheres, expressos em mg/ml. Recém-nascidos nascidos

25 – 200

Crianças de até 1 mês

200 – 600

Crianças de 2 a 5 anos

50 – 200

Crianças de 6 a 15 anos

7 – 140

Homens acima de 15 anos

15 – 200

Mulheres acima de 15 anos

12 – 150 29

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP O nível de ferritina está diminuído na deficiência de ferro e elevado em pacientes com sobrecarga de ferro causada por hemocromatose primária e secundária, esta última devido principalmente aos processos hipertransfusionais como ocorre na talassemia beta maior. O aumento da ferritina sérica pode ocorrer também nas doenças hepáticas, nas doenças malignas e nas infecções.

Ácido Fólico e Vitamina B12

Duas vitaminas, o ácido fólico e a vitamina B12 são necessários para dar suporte ao processo de proliferação e maturação das células eritroblásticas. Ambas devem estar presentes em quantidades adequadas para as sínteses normais de metionina e timidalatos, elementos necessários para a replicação normal de DNA e da divisão seqüencial das células. A forma natural de folatos – metiltetrahidrofolato – encontra-se se na maioria dos alimentos, e atua como doador de metil para a formação de metil B12. O grupo metil é então transferido para homocisteína para formar metionina, um aminoácido essencial para o metabolismo protéico. Uma suplementação inadequada de metiltetrahidrofolato desarranja tanto a formação de metil B12 quanto as etapas do metabolismo de folatos. Os níveis intracelulares de metil B12 e uma coenzima ativa – a deoxiadenosil B12 B – podem diminuir quando há deficiência de vitamina B12. O impacto principal das deficiências de vitamina B12 e folatos é a insuficiência dos grupos metil em atuar na transformação de metiltetrahidrofolato para tetrahidrofolato, e conseqüentemente diminuii a síntese de DNA e a reprodução celular. Assim, as deficiências de folatos e vitamina B12 afetam profundamente o processo de maturação dos precursores eritrocitários (figura 3.2). ). As células se tornam grandes, o núcleo, imaturo (figura ( 3.3), a mitose é interrompida, nterrompida, e os eritroblastos ortocromáticos sofrem destruições precoces. A morte dessas células eritroblásticas durante o desenvolvimento é denominada por eritropoiese inefetiva.

Figura 3.2. Deformações nos eritroblastos ortocromáticos na deficiência de vitamina B12 e folatos. Observar a desproporção entre citoplasma e núcleos, o tamanho da célula e a morfologia anormal.

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Figura 3.3. Deformação nuclear e maturação alterada na deficiência de vitamina B12 e folatos.

Mecanismos Envolvidos na Regulação da Absorção do Ferro Autor: Rodolfo Cançado

Figura 3.1.a.. Capacidade de ligação do ferro esquematizada em situações normal e patológica, relacionando a transferrina insaturada e transferrina ligada ao ferro.

No interior das células, a síntese da ferritina e do receptor da transferrina é regulada por proteínas citoplasmáticas ligadas ao ácido ribonucléico mensageiro (RNAm), atualmente identificadas como proteínas reguladoras de ferro (IRPs – iron regulatory proteins), proteins IRP1 e IRP2. Toas as células doo organismo contêm RNAm para ambas as proteínas reguladoras do ferro, embora a IRP1 seja mais abundante dessas duas proteínas.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP As IRPs regulam a entrada e o armazenamento do ferro no interior das células através do controle do processo de tradução da síntese síntese do receptor da transferrina e de ferritina. O controle da expressão dos genes envolvidos no metabolismo do ferro é realizado através da ligação das IRPs em estruturas específicas do RNAm, denominadas elementos responsivos ao ferro (IREs – iron-responsive responsive elements). elements). Cinco IREs estão presentes na posição 3’ da região não-traduzida traduzida do RNAm do receptor da transferrina, enquanto que uma única IRE está presente na posição 5’ do RNAm da ferritina. A síntese dos receptores da transferrina é regulada regulada através do controle da estabilidade do RNAm do receptor da transferrina citoplasmática. Quando diminui a concentração do ferro intracelular, as IRPs ligam-se se às IREs na posição 3’ do RNAm dos receptores da transferrina. Essas ligações aumentam a estabilidade dade do RNAm e, por sua vez, diminuem sua degradação citoplasmática. Por conseguinte, o nível de RNAm do receptor da transferrina citoplasmática aumenta, a taxa da síntese do receptor da transferrina eleva-se eleva se e o número de receptores da transferrina na superfície erfície celular aumenta, proporcionando maior absorção do ferro. A síntese de ferritina é regulada através do controle da tradução do RNAm de ferritina sem alterar a quantidade citoplasmática de RNAm da ferritina. Quando uma IRP liga-se liga à única IRE na posição ção 5’ do RNAm da ferritina, há diminuição do processo de tradução do RNAm e, conseqüentemente, também diminuem a síntese de ferritina e o armazenamento do ferro intracelular, aumentando a disponibilidade de ferro na célula. Cinética Interna do Ferro O complexo ferro-transferrina, transferrina, ligado ao receptor, entra na célula por endocitose. O influxo de íons hidrogênio ao endossomo, através da bomba de próton, diminui o pH ácido da vesícula endocitótica. O ferro é liberado, continuando, porém, a apotransferrina ligada ligada ao receptor. O complexo transferrina-receptor, receptor, livre do ferro, retorna à superfície celular, onde, na presença de pH neutro, a transferrina separa-se separa se do receptor e retorna ao plasma para novo ciclo. A mobilização do ferro da ferritina requer a ação de agentes quelantes e redutores como ácido ascórbico, glutation e cisteína, que penetram no interior da molécula através dos canais da ferritina, atingindo o seu núcleo onde reduzem o ferro para sua forma ferrosa. O ferro liberado ou assume suas funções metabólicas, meta ou agrega-se se em grumos. Esses grumos coalescem num aglomerado dentro dos lisossomos, recebendo a denominação de homossiderina. O estudo da ferrocinética, utilizando o ferro marcado com substância radioativa (Fe59) e ligado à transferrina, permite avaliar o ferro de transporte (plasmático), o ferro de armazenamento e o ferro que é incorporado no interior dos eritrócitos. Além disso, permite determinar a vida média dos eritrócitos, o local de produção e de destruição dos mesmos. A maior parte do ferroo plasmático destina-se destina se à medula óssea, sendo que 80% do ferro liga-se liga ao heme e passa a fazer parte da hemoglobina como ferro funcional, e os 20% ligado à transferrina é captado pelas células do sistema mononuclear fagocitário, principalmente do fígado e do baço, onde permanece como ferro de depósito sob a forma de ferritina e/ou hemossiderina. Armazenamento do Ferro O ferro pode armazenar-se, se, no organismo, sob a forma de ferritina ou de hemossiderina nas células do sistema mononuclear fagocitário (da medula medula óssea, do baço e do fígado), no parênquima hepático e no músculo esquelético. 32

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A capacidade do organismo de armazenar o ferro serve a duas finalidades: prover uma reserva interna, que possa ser mobilizada quando a necessidade de ferro exceder a oferecida pela dieta; e proteger o organismo dos efeitos tóxicos do ferro livre quando a quantidade de ferro absorvida exceder as quantidades perdidas e as necessárias para a síntese de compostos funcionais de ferro. Fisiologicamente, o organismo humano é capaz de aumentar muito pouco a eliminação de ferro e, portanto, o aumento progressivo do aporte de ferro seja por via gastrointestinal, seja por via parenteral, através de transfusões sangüíneas, leva impreterivelmente a uma condição anormal de sobrecarga de ferro. Aproximadamente 25% do ferro do organismo de um adulto normal está presente sob a forma de armazenamento. Cerca de dois terços sob a forma de ferritina e o restante sob a forma de hemossiderina. Porém, em condições anormais de acúmulo de ferro no organismo, organis o armazenamento do ferro se dá principalmente sob a forma de hemossiderina. O ferro armazenado nas células do sistema mononuclear fagocitário tem uma capacidade de troca mais dinâmica que em outros sítios. Esse fato determina que o sistema mononuclear fagocitário desempenhe, além de importante local de depósito, papel fundamental na cinética interna do ferro. Fatores Relacionados à Deficiência de Ferro A dependência crítica do organismo humano pelo ferro fez com que os organismos superiores desenvolvessem, em, durante o processo de evolução natural, mecanismos elaborados que permitissem absorção eficiente, transporte, distribuição, armazenamento e conservação do ferro no organismo. Distúrbios em quaisquer desses mecanismos podem resultar em deficiência ou acúmulo úmulo de ferro no organismo. A causa básica da diminuição dos estoques de ferro é o desequilíbrio entre quantidade absorvida e consumo e/ou perdas, que ocorrem por diversas vias, resultando no esgotamento das reservas de ferro do organismo. Isso pode ocorrer er devido a diversos fatores, tais como: necessidade aumentada de ferro (fatores fisiológicos: crescimento, menstruação, gestação); diminuição da oferta ou da absorção do ferro (fatores nutricionais: baixa quantidade e/ou biodisponibilidade do ferro da dieta, die doenças inflamatórias crônicas intestinais, gastrectomia); ou perdas de ferro (fatores patológicos; perda de sangue, principalmente pelo trato gastrointestinal e genital, verminoses, doação de sangue). Na prática, a deficiência de ferro, geralmente resulta resulta da combinação de dois ou mais fatores que levam à diminuição gradual do estoque de ferro do organismo. Crianças e mulheres em idade fértil constituem os principais grupos de risco para o desenvolvimento da deficiência de ferro. Na infância, o estoque de ferro é precário devido ao crescimento rápido com grande expansão da massa celular e à pouca quantidade de ferro no leite natural. Após a adolescência, as mulheres podem apresentar uma diminuição gradual do estoque de ferro e evoluir com diferentes graus graus da deficiência de ferro devido às perdas sangüíneas menstruais e ao consumo de ferro na gravidez. Nas mulheres em idade fértil, a necessidade diária de ferro é de 2 a 3 mg/dia, ou mais, devido à perda menstrual. Durante a gestação, apesar de normalmente cessarem as perdas sangüíneas 33

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP referentes à menstruação, a necessidade diária de ferro aumenta para cerca de 5 mg durante o segundo e o terceiro trimestre devido à expansão do volume materno e fetal. Entretanto, estima-se se que pelo menos 10% das mulheres apresentam apresentam perdas sangüíneas menstruais mais intensas (mais de 80 ml por ciclo menstrual) e a necessidade diária de ferro é significativamente maior, variando entre 2 e 4 mg. A perda menstrual associada ao número de gestações, à amamentação e ao método de anticoncepção iconcepção utilizado, são fatores importantes relacionados à maior incidência de deficiência de ferro e de anemia ferropriva entre as mulheres quando comparado às incidências nos homens. O organismo humano normalmente não é capaz de aumentar a excreção de ferro, mesmo em condições de sobrecarga de ferro. Portanto, somente quando se perde sangue é que quantidades significativas deste metal são eliminadas pelo organismo. Cada grama de hemoglobina contém cerca de 3,4 mg de ferro e, na prática, pode-se pode estimar que 2 ml de sangue contém cerca de 1 mg de ferro. Como a necessidade diária de um indivíduo adulto normal é muito pequena, levariam vários anos para que um adulto do sexo masculino ou mulheres na pós-menopausa pós menopausa com reservas normais de ferro desenvolvessem anemia anemia ferropriva por ingestão insuficiente de ferro. Portanto, o achado da deficiência de ferro nesses indivíduos não deve ser atribuído apenas à dieta inadequada, requerendo, portanto, uma avaliação criteriosa do paciente no sentido de investigar possíveiss perdas anormais de sangue particularmente pelo trato gastrointestinal. Sobrecarga de Ferro Uma pessoa adulta normal para conteúdo de ferro tem armazenado cerca de 3 g de ferro no organismo, distribuídos nos eritrócitos (2 g) e sob forma de moléculas de ferritina ferritina (1 g). DefineDefine se como sobrecarga de ferro quando a ferritina acumulada ultrapassa 1 g. Os valores elevados de ferritina são muito variáveis, podendo chegar até 5 g em casos específicos, por exemplo, talassemia beta maior, devido à excessiva reposição reposição transfusional de eritrócitos. Quando ocorre sobrecarga de ferro, é importante a intervenção médica dirigida ao uso de quelantes – drogas que se ligam ao ferro, cujo complexo é expelido pela urina. As principais conseqüências da sobrecarga de ferro são duas: hemocromatose e hemossiderose. hemossiderose. Na hemocromatose, o excesso de ferro impregna-se impregna nos tecidos, causando lesões teciduais, e se armazenam em grande quantidade nos macrófagos alterando-lhes lhes suas funções. Na hemossiderose ocorre a deposição de ferro nos tecidos t sem causar lesões, nos precursores eritrocitários (eritroblastos), nos eritrócitos, bem como também se armazenam nos macrófagos. As causas mais comuns de sobrecarga de ferro são de origem genética ou adquirida. adquirida As de origem genética são subdivididas em dois grupos: a. hemocromatose hereditária, autossômica e recessiva; b. anemias refratárias causadas por: b1. talassemia beta maior; b2. anemia sideroblástica; b3. anemia hemolítica congênita (ex.: esferocitose). 34

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP As de origem adquiridas são também anemias refratárias ref devido a: a. aplasia medular, com transfusões sangüíneas; b. ingestão cr6onica de ferro, principalmente complexos vitamínicos contendo ferro; c. transfusão excessiva de eritrócitos. As conseqüências mais freqüentes de hemocromatose são diabete, artrite, insuficiência cardíaca congestiva, impotência sexual, cirrose hepática e hepatoma. A avaliação laboratorial da sobrecarga de ferro mostra o seguinte: a. ferritina sérica:: elevada; b. saturação da transferrina > 62%: indica homozigose na hemocromatose hereditária (valor normal: 20 a 35%).

A Hemoglobina Estrutura Molecular e Função

A hemoglobina (Hb) é uma proteína globular e sua principal função é o transporte de oxigênio. Quimicamente é composta pela combinação de uma proteína, a globina, globina e um grupo tetrapirrólico, o heme (figura figura 3.4). 3.4). A globina consiste na combinação de dois pares diferentes de cadeias polipeptídicas (a2b2, a2d2 e a2g2) que caracterizam as três hemoglobinas normais, as HbA, HbA2 e Hb Fetal, respectivamente. As cadeias polipeptídicas alfa, ou globina alfa, são formadas por 141 aminoácidos cada, enquanto as globinas beta, delta e gama têm 146 aminoácidos cada uma. Desta forma, os tetrâmeros a2b2, a2d2 e a2g2 têm 574 aminoácidos cada (figura 3.5). ). O heme, por sua vez, é um complexo formado formado por um átomo de ferro situado no interior da estrutura porfirínica. Esta estrutura é protegida por aminoácidos circundantes que envolvem o grupo heme, protegendo-o protegendo o da água. Esta proteção garante a estabilidade do ferro no estado ferroso (Fe++), permitindo-o permitin que se ligue com o átomo de oxigênio.

Figura 3.4. Modelo espacial da globina beta ligada com o grupo heme (estrutura vermelha no centro da globina). Observar os aminoácidos periféricos que fazem parte da superfície externa da globina, e estabelecem contato com o meio aquoso circundante.

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Figura 3.5. Esquema da estrutura tetramerizada (duas globinas alfa identificadas por (a1 e a2 e duas globinas beta: b1 e b2) da molélula da HbA (a2b2). A identificação das globinas alfa e beta em a1, a2, b1 e b2 é importante mportante para o entendimento dos contatos de estabilização (a1b1 e a2b2) e de oxigenação(a1ab2 e a2b1).

A estabilidade da molécula de Hb é dependente do arranjo estrutural do tetrâmero das duas globinas alfa (a2) e das duas globinas beta (b2), ou delta (d2), ou gama (g2). Em resumo, o tetrâmero que compõe a molécula da Hb A é representado como a2b2, da HbA2 (a2d2), e da Hb Fetal (a2g2). Cerca de 75% de cada um dos tetrâmeros tem estrutura química em forma helicoidal e com várias dobraduras (figura ( 3.6). Os 25% da molécula tetramérica das hemoglobinas apresenta-se se como estruturas peptídicas não dobradas e seus aminoácidos, por estarem na parte externa da molécula, estabelecem contato com o meio aquoso circundante. Com o auxílio de técnicas de cristalografia cristalografia molecular em raio X, foi possível conhecer a estrutura espacial da HbA e sua disposição intermolecular efetuada por contatos entre as globinas a e b (figura 3.5). ). Assim, a função da hemoglobina como receptora e transportadora de oxigênio está associada aos os movimentos de suas subunidades. Os contatos entre as globinas a1b1 (ou a2b2) dispostos espacialmente na vertical (figura 3.5)) são muitos extensos e envolvem 34 aminoácidos, e dão estabilidade à molécula. Por outro lado, os contatos a1b2 (ou a2b1) dispostos espacialmente na horizontal (figura 3.5)) são menos extensos e envolvem 19 aminoácidos, e por isso permitem a mobilidade das globinas b e o deslocamento da molécula de 2,3 DPG (2,3 difosfoglicerato) e a oxigenação da molécula. Os contatos a1a2 ocorrem rrem somente na forma desoxigenada (desoxi-Hb) (desoxi Hb) e tem importância na interação entre os 4 grupos heme, no efeito Bohr, e no transporte de CO2. Os contatos b1b2 ocorrem nas formas oxi-Hb oxi e desoxi-Hb, Hb, e quando estão na fase desoxi-Hb desoxi participam da fixação da molécula de 2,3 DPG no tetrâmero (figura ( 3.5).

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Figura 3.6. A globina, com suas dobraduras, e a inserção do grupo heme.

O transporte de oxigênio pela hemoglobina está baseado na capacidade de seus átomos de ferro combinarem reversivelmente com o oxigênio molecular, bem como pela eficiência do seu carreamento pelos eritrócitos aos tecidos e órgãos. A liberação de oxigênio ocorre nos pequenos vasos arteriais, com distribuição a diferentes células e tecidos (figura ( 3.7).

Figura 3.7. Esquema da distribuição do oxigênio pelo eritrócito nos pequenos vasos arteriais. (1) eritrócitos, (2) nervo periférico com bainha de mielina, (3) macrófago, (4) músculo estriado.

A Síntese das Globinas

As globinas podem ser identificadas em tipo-alfa e tipo-beta.. As globinas tipo-alfa são sintetizadas por um grupo de genes interligados (genes ( tipo-alfa)) localizados no braço curto do cromossomo 16. As globinas tipo-beta tipo beta são sintetizadas por um grupo de genes interligados (genes tipo-beta)) localizados no braço curto do cromossomo cromossom 11. 37

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os genes tipo-alfa incluem dois genes alfa, separados um do outro por 3.000 pares de bases nitrogenadas, e denominados a1 e a2, que permanecem em atividade durante toda a vida do indivíduo. Os outros genes desse agrupamento são os genes zeta (z2) que atua somente na fase embrionária, três pseudo-genes genes (yz2, ya2, ya1) (figura 3.8)) e um gene com função não muito bem definida, o gene teta (q1), Esse agrupamento de genes engloba uma extensão de aproximadamente 30.000 pares de bases nitrogenadas. Os pseudo-genes pseudo genes (y) são genes que têm seqüência homóloga aos genes estruturais ativos, porém contêm mutações que inibem sua expressão.

Figura 3.8. Agrupamento de genes tipo alfa.

Os genes do tipo-beta são mais abrangentes e heterogêneos do que os do tipo alfa, pois envolve a síntese das globinas beta, delta, gama e epsilon. Esse grupo de genes está localizado no braço curto do cromossomo 11 (figura figura 3.9), 3.9), e é composto no total por mais de 60 mil pares de bases nitrogenadas. O gene epsilon (e) é expresso na fase embrionária, embrionária, enquanto que os genes gamagama A G alanina(g ) e gama-glicina (g ) são característicos da fase fetal. Os genes delta (d) e beta (b) são atuantes a partir de uma fase do período fetal e se expressam por toda a vida após o nascimento.

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Figura 3.9. Agrupamento de genes tipo beta.

A molécula de hemoglobina é formada por notável sintonia entre as sínteses de globinas alfa, beta e gama, juntamente com o grupo heme, a partir do eritroblasto basófilo. A concentração da hemoglobina aumenta proporcionalmente à medida que os eritroblastos se desenvolvem e amadurecem, e continua até a fase de reticulócitos. A síntese das milhões de moléculas de hemoglobinas que se formam em cada uma dessas células se caracterizam pelo equilíbrio entre as globinas alfa e não-alfa (beta, beta, delta e gama), cuja estabilização ocorre após o sexto mês de vida (figura 3.10). ). As concentrações dessas hemoglobinas podem ser avaliadas eletroforeticamente (figura figura 3.11). 3.11

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Figura 3.10. Esquema da síntese equilibrada das globinas alfa e não-alfa não (beta, gama e delta) após o sexto mês de vida.

Figura 3.11. Eletroforese de hemoglobinas normais.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A Síntese do Grupo Heme

O heme é formado por quatro núcleos pirrólicos, que estão unidos entre si por radicais metanílicos ·CH. Um átomo de ferro está unido por quatro valências aos quatro átomos de nitrogênio da protoporfirina (figura figura 3.12). 3.12

Figura 3.12. Grupo heme. O ferro na molécula porfirínica.

A biossíntese do heme tem como início um metabolismo do ciclo de Krebs, a succinil coenzima A, e um aminoácido (glicina). Esses dois substratos se combinam por uma reação catalisada através da enzima mitocondrial, a delta-amino delta amino levulinato sintetase, ou ALA sintetase, e cuja coenzima é o fosfato de piridoxal, derivado da vitamina B6. Nesse processo forma-se forma um composto instável, o ácido alfa-amino-beta-adípico, alfa adípico, que se descarboxila espontaneamente em ácido-delta-aminolevulínico-ALA ALA (figura ( 3.13). ). A seguir, duas moléculas de ALA se condensam, com a perda de duas moléculas de água, formando o porfobilinogênio (PBG). Quatro moléculas de PBG se juntam sob a ação da PBG desaminase, resultando na perda de aminas das cadeias laterais formando o uroporfirinogênio-I. uroporfirinogênio I. Sob ação da enzima uroporfirinogênio-III-cosintetase, cosintetase, forma-se forma o uroporfirinogênio-III (URO-III). III). Os URO-I e III sofrem descarboxilações transformando os quatro grupos acetilas e metilas, dando origem aos coproporfirinogênios I e III, sob ação da enzima URO descarboxilase. As coproporfirinas se descarboxilam e se oxidam, mediadas pela enzima COPRO oxidase, oxidase, e sintetizam o protoprofirinogênio (PROTO-GENE). (PROTO GENE). A ação da enzima PROTO gene oxidase promove a oxidação do PROTO-GENE, GENE, resultando as protoporfirinas (PROTO), que fixam o ferro catalisado pela ferroquelatase, e resultam o grupo HEME. A origem do ferro é proveniente p do seu transporte pela transferrina e dos depósitos de ferritina.

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Figura 3.13. Síntese do grupo heme. Relação entre os defeitos enzimáticos e as doenças porfirínicas.

As alterações do grupo heme são decorrentes de dois processos: defeitos enzimáticos hereditários e deficiência de ferro. Os defeitos enzimáticos hereditários causam as doenças conhecidas por porfirias. As porfirias constituem um grupo de doenças geralmente hereditárias, devido às alterações durante o processo de formação das porfirinas. porfirinas. As três porfirinas de importância clínica são: protoporfirina, uroporfirina e coproporfirina. A protoporfirina está amplamente distribuída pelo corpo e desempenha a função de precursor do grupo heme na composição da hemoglobina e mioglobina, bem como da catalase e dos citocromos. A uroporfirina e a coproporfirina, que são precursoras da protoporfirina, são normalmente excretadas em pequenas quantidades pelas fezes e urina. Os eritrócitos contêm pequena concentração de protoporfirina e coproporfirina. coproporfir Os portadores de porfirina se caracterizam pela fotossensibilidade, dores abdominais agudas, neuropatias, excreção aumentada de porfirinas e seus precursores. As porfirinas participam do armazenamento e utilização de energia. As principais síndromes das as porfirias são: • • • • • • •

porfiria eritropoiética – hereditária protoporfiria eritrocitária – hereditária porfiria (hepática) intermitente aguda – hereditária porfiria (hepática) variegata – hereditária coproporfiria (hepática) – hereditária porfiria (hepática) cutânea tânea tardia – adquirida porfirinúria: doenças malignas, infecções, poliomielite.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP As porfirias podem ser agrupadas em eritropoiéticas e hepáticas. Os tipos, as características e a idade de manifestações das porfirias eritropoiéticas estão resumidos na tabela 3.1. As fisiopatologias da porfiria eritropoiética congênita (ou doença de Gunther) e da protoporfiria eritropoiética estão resumidas nas tabelas 3.2 e 3.3,, respectivamente. As porfirias hepáticas estão representadas na tabela 3.4. 3.4 Tabela 3.1. As porfirias eritropoiéticas. Tipo

Característica

Porfiria eritropoiética congênita rara;

Idade 0 a 5 anos

intensa fotossensibilidade; anemia hemolítica; Prognóstico: esplenomegalia ruim Protoporfiria eritropoiética

comum;

0 a 5 anos

fotossensibilidade discreta Prognóstico: bom Coproporfiria eritropoiética

muito rara;

variável

fotossensibilidade discreta Prognóstico: bom Tabela 3.2. Fisiopatologia da porfiria eritropoiética. •

Herança

autossômica recessiva

•

Causa

deficiência de co-sintetase sintetase de uroporfirinogênio III

•

Efeitos

produção excessiva de uroporfirinogênio, pigmentos de uroporfirina e coproporfirina na urina

•

Conseqüências

alta fotossensibilidade, lesões vesiculares e ulcerativas na pele, anemia hemolítica com esplenomegalia

•

Prognóstico

ruim

•

Laboratório

urina vermelha ou rosada, fluorescente, ossos e dentes fluorescentes, eritroblastos fluorescentes, uroporfirina e 43

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP coproporfirina na urina, anemia Tabela 3.3. Fisiopatologia da proporfiria eritropoiética. •

Herança

autossômica dominante

•

Causa

deficiência de ferro quelatase

•

Efeitos

produção excessiva de protoporfirina com acúmulo nos eritrócitos e fígado

•

Conseqüências

fotossensibilidade leve, prurido, edema dermatose, colestase, hepatite, cirrose

•

Prognóstico

bom

•

Laboratório

urina normal ou com pigmentos, anemia ausente ou discreta, protoporfirina elevada nos eritrócitos, normoblastos fluorescentes Tabela 3.4. Porfirias hepáticas.

Tipo Porfiria intermitente aguda (PIA)

Característica • •

• • •

Porfiria variegata

• • • •

Comum – autossômica dominante Ausência de fotossensibilidade, dor abdominal aguda, neuropatia, indução por medicamentos, infecções, não há lesões cutâneas Prognóstico bom após 30 anos Urina vermelha ou escura sob luz solar Contém porfobilinogênio Rara – autossômica dominante Sintomas variáveis, em geral similares anos da PIA, lesões cutâneas Prognóstico bom Urina: aumento de coproporfirina, uroporfirina e protobilinogênio

Idade

15 a 40 anos

10 a 30 anos

Coproporfirina hereditária

• •

Rara – autossômica dominante Sintomas similares aos da PIA

variável

Porifiria cutânea tardia

• •

Rara – adquirida Intensa fotossensibilidade, lesões cutâneas, hepatopatias

variável

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Ontogenia das Hemoglobinas

A síntese dos diferentes tipos de hemoglobinas nos períodos do desenvolvimento humano, e caracterizados por fases embrionária, fetal e pós-nascimento, pós nascimento, obedece ao rígido controle genético das regiões controladoras de genes dos respectivos agrupamentos de genes tipo alfa (no cromossomo 16) e tipo beta (no cromossomo cromossomo 11). Essas regiões controladoras de genes ativam os genes embrionários zeta e epsilon durante a fase em que o embrião se forma e se desenvolve. O tetrâmero x2e2 forma a Hb Gower-1. Gower 1. Outras duas hemoglobinas embrionárias, presentes até a 12ª semana do desenvolvimento embrionário são as Hb Portland (x2g2) e Hb Gower-2 Gower (a2e2). Todas as três hemoglobinas embrionárias são específicas sob o ponto de vista funcional para o embrião. De tal forma que ao passar para a fase fetal, uma outra hemoglobina é sintetizada sinte –a Hb Fetal (a2g2) – e as hemoglobinas embrionárias têm suas sínteses diminuídas gradativamente, até o total desaparecimento. A síntese da Hb Fetal inicia-se, inicia se, portanto, a partir da quarta semana da vida fetal, com elevação progressiva de sua concentração concentração até o nascimento, chegando próximo a 100%. Fisiologicamente a hemoglobina do feto é muito importante para esta fase, pois apresenta alta afinidade por oxigênio. A partir da 10ª semana de vida fetal inicia-se inicia a síntese da HbA (a2b2), que chega à concentração concentração máxima de 10% no nascimento. A Hb A2 (a2d2) , por sua vez, começa a ser sintetizada na 25ª semana em concentrações reduzidas (<1%) até o nascimento, aumentando até se estabilizar no sexto mês de vida, conforme mostra a tabela 3.5. Tabela 3.5. Concentrações das hemoglobinas embrionárias, Fetal, A e A2, nos períodos embrionário fetal e seis meses após o nascimento. Período

Hemoglobina

Concentração

Gower-1

20 – 40%

Portland

5 – 20%

Gower-2

10 – 20%

Fetal

90 – 100%

5 – 10%

< 1%

Pós-nascimento

96 – 98%

(acima de 6 meses de idade)

2 – 4%

Fetal

0 – 1%

Embrionário

Fetal

Hemoglobinas Variantes

A maioria das variantes estruturais é originada por simples substituições de aminoácidos, resultantes de mudanças nas seqüências de nucleotídeos. As alterações estruturais, com conseqüências nas atividades físico-químicas físico químicas da molécula, estão na dependência da extensão do processo mutacional e dos locais em que esses ocorrem. Dessa forma, as hemoglobinas variantes podem originar-se se por: 45

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP a. Substituições de um aminoácido por outro, de características diferentes, na superfície externa da molécula. Pode ocorrer também a substituição de dois aminoácidos por outros dois, em uma mesma cadeia, sendo, entretanto, condição muito rara. As substituições de aminoácidos aminoácidos na superfície externa, com exceção feita à Hb S (ver capítulo "Célula Célula Falciforme"), Falciforme"), não produzem alterações significantes no funcionamento da molécula. As principais hemoglobinas variantes desse grupo são: Hb C, Hb G, Hb J, etc. b. Substituições de aminoácidos na superfície interna da molécula envolvendo resíduos polares e não polares. Essa substituição tem ocorrido preferencialmente nos locais invariantes daa molécula, incluindo aqueles que fazem parte do "pacote" do grupo heme, cuja principal função é protegê-lo protegê lo da entrada de água, bem como dos aminoácidos que participam dos contatosa1b1. Qualquer substituição na superfície interna causa instabilidade molecular, lar, geralmente iniciando-se iniciando se pela oxidação do grupo heme com formação excessiva de metahemoglobina e precipitação da globina instável. Citologicamente é possível observar a precipitação intra-eritrocitária intra eritrocitária da globina instável por meio da presença de corpos de Heinz (ver capítulo sobre "Corpos Corpos de Heinz"). Heinz c. Substituições de aminoácidos que participam dos contatos a1b2 das ligações químicas com o 2,3-DPG DPG e do resíduo histidina C-terminal C terminal da cadeia beta promovem a formação de hemoglobinas variantes com alterações na sua afinidade pelo oxigênio, geralmente causando eritrocitoses com alterações da curva de dissociação de oxigênio. d. Substituições dos resíduos resíduos de histidina distal ou proximal, que estão ligados ao grupo heme, causam anormalidades que se caracterizam pela oxidação espontânea e contínua do ferro, com formação excessiva de metahemoglobina proveniente das hemoglobinas variantes do tipo M (Hb M). A formação de metahemoglobina desencadeia a degradação oxidativa da hemoglobina, com formação de corpos de Heinz. e. Adição de um ou mais aminoácidos ao último aminoácido (C-terminal) (C terminal) das globinas alfa e beta, tornando-as tornando longas e manifestando-se como fenótipos talassêmicos alfa e beta. f. Fusão entre duas cadeias de globinas diferentes, em especial das cadeias delta-beta delta que resultam na formação de hemoglobina variante conhecida por Hb Lepore. A fusão inversa, ou seja, beta-delta, beta é conhecida por Hb anti-Lepore. Lepore. Outras fusões têm sido descritas na literatura e todas essas ocorrências se devem ao "crossing"crossing-over" desigual no pareamento dos cromossomos 11. Assim, somam-se se atualmente perto de 500 variantes estruturais, poucas delas associadas com manifestações clínicas e alterações hematológicas, que podem ser agrupadas em: • • • • •

hemoglobinas de agregação; hemoglobinas sem alterações fisiológicas; hemoglobinas instáveis; hemoglobinas com alterações funcionais; hemoglobinas com fenótipos talassêmicos (adição de aminoácidos, aminoácidos, e fusão entre cadeias de globinas diferentes).

As hemoglobinas de agregação formam tactóides e cristais, com repercussões clínicas e laboratoriais variáveis. As hemoglobinas S e C participam desse grupo (ver capítulo "Célula " Falciforme"). As hemoglobinas variantes que não causam alterações funcionais são a maioria, perto de 350 tipos diferentes, e embora apresentem importância bioquímica, genética e antropológica, a não produzem efeitos clínicos e laboratoriais significantes.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP As hemoglobinas instáveis (cerca de 130 tipos diferentes) apresentam graus variáveis de manifestações clínicas e hematológicas, expressando-se expressando se laboratorialmente de forma diversificada da entre os diferentes tipos descritos na literatura. As hemoglobinas com alterações funcionais (cerca de 20 tipos diferentes) causam metahemoglobina por Hb M, cianose e alteração de afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. As hemoglobinas com fenótipos talassêmicos talassêmicos são as variantes provocadas por falhas no processo de regulação da síntese de globina pela adição de aminoácidos ao C-terminal C das globinas alfa e beta e pelo pareamento desigual do cromossomo 11 no processo da mitose celular. Com exceção das Hb variantes sem alterações fisiológicas, as demais causam anormalidades morfológicas nos eritrócitos: falcização (Hb S), células em alvo (Hb C), corpos de Heinz (Hb instáveis e metahemoglobinemias), células "mordidas" (Hb instáveis), microcitoses e hipocromias as (Hb Lepore e anti-Lepore). anti

Talassemias

As globinas alfa e beta constituem, em conjunto, perto de 98% do conteúdo de hemoglobinização eritrocitária. A principal hemoglobina humana, a Hb A, é formada por dímeros de globinas alfa (a2) e beta (b2), sintetizadas sincronizada e equilibradamente. Alterações genéticas são as principais origens de desequilíbrios que podem ocorrer na síntese dessas globinas e, conseqüentemente, causam doença de intensidades variáveis conhecidas por talassemia. Denomina-se talassemia alfa quando há diminuição na síntese de globina alfa, e talassemia beta se a diminuição for da globina beta. Quanto maior for o grau de diminuição de uma das globinas, as conseqüências patológicas e fisiopatológicas também serão maiores, pois esse se processo produz deficiência na hemoglobinização dos eritrócitos, que se manifesta por hipocromia de intensidades variáveis (figura ( 3.14). ). Por outro lado, a globina que teve sua síntese normal não se une integralmente a outra globina correspondente, pois esta foi diminuída em sua síntese. Diante disso, a globina despareada precipita-se precipita se nos eritroblastos e eritrócitos circulantes, causando-lhes lhes lesões que alteram a morfologia celular e abreviam o período de vida. As lesões eritrocitárias atraem a ação fagocitária fagocitária dos macrófagos que atuam tirando as partes lesadas. Esse processo de "saneamento" celular modifica a configuração dos eritrócitos, tornando-os os menores (microcitose) e disformes (dacriócitos e leptócitos) (figura (figura 3.15). 3.15 Essas alterações modificam os índices hematimétricos, notadamente a HCM e VCM, diminuindo-os. diminuindo Informações adicionais poderão ser obtidas no capítulo sobre "Alterações " ções Eritrocitárias nas Talassemias".

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Figura 3.14. Hipocromia acentuada na talassemia beta maior (ou homozigota). Na talassemia beta maior a síntese de globina beta pode estar totalmente ou parcialmente ausente. No presente caso, a figura representa uma situação em que o paciente com talassemia beta maior não tinha Hb A, somente Hb Fetal e Hb A2.

Figura 3.15. Hipocromia acentuada na talassemia beta maior onde se observa eritrócitos microcíticos, esquisócitos, dacriócitos, leptócitos, entre outras deformações. Na ausência ou diminuição da síntese de globina beta "sobra" a globina alfa, pois não há beta para se combinar (consultar figura 3.10 deste capítulo). Como conseqüência, as globinas alfa despareadas se precipitam nos eritrócitos, causam lesões oxidativas na membrana, e atraem a ação dos macrófagos do S.R.E. que, ao retirarem partes lesadas dos eritrócitos, deformam essas células em esquisócitos.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A Membrana Estrutura Química da Membrana

A membrana do eritrócito é composta de uma dupla camada camada lipídica, com a qual várias proteínas estão associadas. Essa estrutura permite que a célula mantenha separado o fluído intracelular no líquido extracelular, além de selecionar nutrientes, gases e íons, bem como permitir a excepcional deformabilidade do eritrócito e quando necessário. A composição química da membrana lipídica se resume principalmente ao colesterol livre e fosfolipídeos. Os fosfolipídeos, por sua vez, são constituídos pelos seguintes elementos: • • • • • •

Fosfatidilcolina (FC): 28% Fosfatidiletanolamina (FE): 27% Esfingomielina (EM): 26% Fosfatidilserina (FS): 13% Fosfatidilinositol (FI): 4% Pequenos fosfolipídeos: 2%

Estruturalmente, o colesterol livre, a fosfatidilcolina e esfingomielina estão localizados principalmente na camada externa da dupla membrana, enquanto que a fosfatidilserina e a fosfatidiletanolamina estão presentes na camada interna, do lado citoplasmático. A disposição em dupla camada da membrana, com participação aproximadamente igual de componentes lipídicos e protéicos, produz uma característica de bipolarização frente à presença da água. Assim, em direção ao meio aquoso interno (citoplasma celular) e externo (líquido plasmático do sangue), se forma a camada de fosfolipídeos hidrofílicos, enquanto que orientados para a região interna interna da dupla camada (onde não há água) estão os ácidos graxos hidrofóbicos (figura 3.18). ). Como ilustra a figura 3.19,, cerca da metade da massa estrutural da membrana é composta por três classes de proteínas, diferenciada em integrantes ou estruturais periféricas ou citoesqueléticas, e as proteínas âncoras (tabela 3.6). ). As proteínas integrantes mais importantes são a glicoforina A e a Banda-3.. A glicoforina A se projeta para a parte externa da célula, apresenta-se apresenta se com maior concentração, é composta em grande parte por carboidratos, e é responsável pela determinação do grupo sangüíneo ABO. Três outras glicoforinas identificadas por B, C e D também fazem parte da membrana, porém em baixíssimas concentrações. As glicoforinas se apresentam, também, como elementos receptores utilizados pelos protozoários (P. ( falciparum)) da malária para se fixarem e penetrarem no eritrócito (figura 3.20). ). Dessa forma, admite-se admite se que as pessoas que apresentam carência de glicoforinas na composição da membrana eritrocitária são resistentes às infecções de plasmódios da malária. A proteína Banda 3 é a mais volumosa das proteínas integrantes na membrana do eritrócito (figura figura 3.21), 3.21), e serve como um "canal" para a troca passiva de ânions através da membrana.

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Figura 3.18. Esquema da distribuição dos principais fosfolipídeos na membrana celular de eritrócito normal, com destaque para as regiões hidrofílicas e hidrofóbicas.

Figura 3.19. Esquema da composição estrutural da membrana eritrocitária.

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Figura 3.20. Microscopia eletrônica de ovos de plasmódios no interior de eritrócitos.

Figura 3.21. Fracionamento das proteínas de membrana de eritrócitos normais, por eletroforese em gel de poliacrilamida. As proteínas com maiores concentrações são: Espectrina, Banda-3, Banda Glicoforina A, G3PD e Actina; e as com concentrações menores são: Banda 4.1, Banda 4.2, Actina e Banda 7.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP As proteínas periféricas e âncoras estão localizadas em direção ao interior da célula e constitui o esqueleto fibrilar da membrana eritrocitária, fato que permite a manutenção da forma do eritrócito e restringe o movimento das proteínas integrantes. O maior componente do esqueleto da membrana eritrocitária é uma proteína flexível e fibrosa, denominada por espectrina.. A espectrina está ligada à superfície interna da membrana membrana por meio de ligações não covalentes a uma outra proteína, a anquirina,, que por sua vez se liga à proteína Banda-3 Banda (figura 3.19). ). A porção terminal da espectrina se liga a duas outras proteínas: actina e tropomiosina, tropomiosina ambas envolvidas na contratilidade de do eritrócito. As proteínas periféricas, por sua disposição espacial na membrana, facilitam o movimento de substratos e co-fatores fatores de dentro para fora da célula e vice-versa. vice versa. Dois desses importantes sistemas enzimáticos são o Na+, K+-ATPase e Ca++, Mg++-ATPase. ATPase. O primeiro sistema, conhecido por bomba de sódio-potássio sódio regula a quantidade desses íons no eritrócito, ou seja, o aumento de sódio sem a perda de potássio causa um ganho de água na célula, fazendo-a fazendo aumentar de volume, e conseqüente hemólise; enquanto enquanto que o aumento de potássio produz a sua retração ou encolhimento. O segundo sistema, conhecido por bomba de cálcio, cálcio expulsa o cálcio para fora da célula, evitando o aumento da sua concentração intracelular. O cálcio está envolvido na regulação e estabilização estabilização da estrutura fosfolipídica da membrana. Concentrações elevadas de cálcio no interior da célula torna-a torna a menos deformável, e produzem alterações da sua forma. A característica da superfície externa da membrana eritrocitária pode ser definida de acordo aco com sua estrutura antigênica, antigênica, que tem resultado em um complexo processo de diferenciação de tipagem sangüínea. Calcula-se Calcula se em mais de 300 antígenos eritrocitários já identificados; muitos desses antígenos constituem os quinze sistemas de grupos sangüíneos. sangüíneos. Em alguns desses sistemas (ex.: A, B, O e P) os determinantes antigênicos são ricamente constituídos por grupos prostéticos de oligossacarídeos das proteínas integrantes da membrana. Quase todos os antígenos são componentes intrínsecos da membrana, aparecendo aparecendo durante o início da eritropoiese. O sistema Lewis é uma exceção, porque seus antígenos estão nos glicolipídeos presentes nos fluidos teciduais, e são absorvidos pelos eritrócitos. Outros antígenos "passageiros" que podem aparecer na superfície dos eritrócitos sob condições patológicas incluem polissacarídeos bacterianos e certas drogas (ex.: penicilinas).

Deformabilidade da Membrana

A deformabilidade celular é dependente das proteínas de membrana da rede citoesquelética ou proteínas periféricas, e também da fluidez da membrana, que é inteiramente dependente da natureza e composição dos lipídeos de membrana (fator enrijecedor). Alterações envolvendo as proteínas de membrana podem alterar a sua composição estrutural e, conseqüentemente deformar a célula. célula. Alguns estados patológicos tais como a completa deficiência da proteína banda 4.2 devido a uma mutação da Alanina ® Treonina na posição 142 do polipeptídeo dessa proteína, podem causar instabilidades das propriedades biofísicas da membrana, com formação ão microagregados de proteínas citoesqueléticas e enrijecimento da sua estrutura. Da mesma forma, na deficiência da proteína espectrina ocorre o desarranjo do citoesqueleto celular, com desorganização da sua disposição estrutural. Esses exemplos induzem a deformabilidade do eritrócito, associado à incapacidade da sua recuperação morfológica (tabela 3.7). Alterações que reduzem a fluidez da membrana, tornando-a tornando a rígida, também se devem às anormalidades dos componentes lipídicos, abaixo destacados:

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conteúdo aumentado de colesterol livre conteúdo diminuído de fosfatidilcolina conteúdo aumentado de ácidos graxos com muitas moléculas de carbono conteúdo aumentado de cadeias acil.

Em contraste à exposição acima, os fatores que aumentam a fluidez da membrana também també induzem à deformação eritrocitária, com destaque para os seguintes: • • • •

conteúdo diminuído de colesterol livre (figura ( 3.22) conteúdo aumentado de fosfaticilcolina (figura ( 3.23) conteúdo aumentado de ácidos graxos com poucas moléculas de carbono conteúdo aumentado entado de cadeias acil insaturadas.

Figura 3.22. Microscopia eletrônica de varredura mostrando eritrócitos acantócitos (acantocitose) em sangue de pessoa com deficiência de colesterol livre na membrana da célula.

Figura 3.23. Microscopia eletrônica de varredura mostrando eritrócitos deformados, geralmente grandes, com VCM elevado, e presença de codócitos (células em alvo), em pessoa com conteúdo aumentado de fosfatidilcolina na membrana da célula.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os defeitos de outros componentes da membrana eritrocitária, eritrocitária, notadamente aqueles que fazem parte da estrutura antigênica, podem estar associados a deformações dos eritrócitos. Um exemplo desse tipo de defeito é a perda de qualquer antígeno que compõe o sistema Rh, fato que caracteriza as "células nulas Rh". Este Este tipo de alteração causa deformação eritrocitária e diminui o seu tempo de vida. Além disso, a presença de anticorpos contra antígenos específicos de superfície de membrana pode elevar o grau de destruição celular (auto-hemólise), (auto hemólise), com ou sem deformação celular. Tabela 3.6. Principais proteínas da membrana dos eritrócitos, dispostas em subgrupos. Subgrupos

Tipos de Proteínas

Integrantes ou Estruturais

Banda-3 Glicoforina A, B, C e D GFI (*)

Periféricas ou Citoesqueléticas

Espectrinas Banda 4.1 Actina Tropomiosina

Âncoras

Anquirina Banda 4.2

(*) GFI: proteínas ligadas ao glicosilfosfatidilnositol

Tabela 3.7. Anormalidades hereditárias da membrana do eritrócito. Patologia Esferocitose

Proteínas Anormais

Forma de Herança

Espectrina, Anquirina

Autossômico dominante

Banda 3, Proteína 4.2

Recessivo (rara)

Espectrina

Autossômico dominante

Proteína 4.1

Recessivo (rara)

Piropoiquilocitose

Espectrina

Recessivo

Estomatocitose

Defeito na permeabilidade do Na+

Autossômico dominante

Eliptocitose

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP As Principais Enzimas nzimas Eritrocitárias O eritrócito, por ser uma célula anucleada e desprovida de organelas, apresenta o seu metabolismo suportado especialmente na degradação da glicose, fato que permite a contínua geração de energia durante todo o perído de vida da célula. Esta atividade metabólica pode ser subdividida em uma via anaeróbica principal, conhecida por via de Embden--Meyerhoff, que é do tipo não-oxidativa, oxidativa, e três vias menores conhecidas por via Fosfogluconato (ou via das pentoses) do tipo oxidativa, via de Metahemoglobina redutase, redutase, e finalmente a via RapoportLuebering.. Todas essas vias são interligadas e interdependentes, qualificando o eritrócito a desenvolver sua função de transporte de oxigênio durante o seu período vital. VIA EMBDEN-MEYERHOF: MEYERHOF: esse processo envolve 90% da degradação da glicose em lactato (figura 3.24). ). Para cada molécula de glicose usada, são geradas duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) e duas ligações de fosfatos (Glicose-6-Fosfato (Glicose Fosfato e Frutose-6-Fosfato). Frutose As moléculas de ATP emite energia para a manutenção do volume do eritrócito, da sua forma discóide e da sua flexibilidade. O eritrócito tem uma pressão osmótica cinco vezes maior que o plasma e a integridade da membrana é mantida por intensa troca de sódio e potássio, realizada rea pela bomba de sódio-potássio potássio-ATPase, ATPase, com rígido controle desses íons (ver item 3.3.1 desse capítulo – "Estrutura Estrutura Química da Membrana"). Membrana A via de Embden-Meyerhof erhof também gera NADH, que é necessária para a enzima metahemoglobina redutase evitar o aumento da oxidação do ferro da hemoglobina – normalmente cerca de 3% da oxihemoglobina se transforma em metahemoglobina. Nesse processo o gliceraldeído, pela redução de NAD ® NADH, gera a molécula de 1.3 difosfoglicerato (1.3 DPG) que é metabolizada por um sistema que a transforma em 2,3 DPG e, logo a seguir, pela ação da enzima fosfatase, modificamodifica a em 3-Fosfoglicerato (figura figura 3.22). 3.22 Esse processo de transformação que caracteriza a via Luebering-Rapoport, Rapoport, com geração de 2,3 DPG e tem importância fundamental na fixação do oxigênio pela hemoglobina. Como se sabe, a molécula de 2,3 DPG fica instalada dentro da molécula de hemoglobina, especificamente entre as duas globinas globinas beta (consultar a figura 3.5 desse capítulo). Quando o 2,3 DPG está dentro da hemoglobina não há fixação do oxigênio pelo ferro do grupo heme. A "expulsão" do 2,3 DPG num complexo sistema químico da hemoglobina, permite que o oxigênio seja fixado e transportado transportado pela hemoglobina. Quando a hemoglobina libera o oxigênio para as células e tecidos, o 2,3 DPG volta a ocupar o seu espaço no interior da molécula de hemoglobina.

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Figura 3.24. Via glicolítica de Embden-Meyerhof.

Figura 3.25. Via Rapoport-Luebering.

VIA FOSFOFLUCONATO (OXIDATIVA): é também conhecida por desvio (ou "shunt") das pentoses. Cerca de 5% da degradação da glicose ocorre por esta via oxidativa (figura ( 3.26). A NADPH (nicotinamida-adenina adenina-dinucleotídeo-fosfato reduzido) é gerado erado como processo final da transformação do glutatião peroxidase (GPx) em glutatião reduzido (GSH). Esse processo mantém a integridade da célula contra processos oxidativos (consultar capítulo sobre "Corpo " de Heinz"). "). Dessa via faz parte uma importante enzima, a glicose-6-fosfato fosfato desidrogenase (G-6PD). A G-6-PD PD converte a glicose-6-fosfato glicose (glicose 6-P) para 6-fosfogluconato fosfogluconato (6-PG), (6 permitindo a produção de NADPH e glutatião reduzido (GSH). A G-6-PD G PD é necessária para proteger a hemoglobina contra a oxidação. 56

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Figura 3.26. Via fosfoglucanato ou desvio ("shunt") das pentoses.

As principais alterações das enzimas eritrocitárias se devem às suas deficiências deficiências com destaque para: • • • •

deficiência de G-6-PD PD deficiência de piruvato-quinase piruvato deficiência de metahemoglobina-redutase metahemoglobina deficiência de enzimas antioxidantes

Com exceção à deficiência de piruvato-quinase, piruvato as deficiências de G-6-PD, PD, meta Hb-redutase Hb e de enzimas antioxidantes (SOD, GPx e catalase), produzem a formação e precipitação intraintra eritrocitária de corpos de Heinz. Assim, outros detalhes sobre as deficiências dessas enzimas poderão ser encontradas no capítulo sobre "Radicais "Radicais Livres e danos eritrocitários". eritrocitários

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OS RETICULÓCITOS Os Reticulócitos

Introdução As anemias podem ser resultantes de falhas na produção de eritrócitos, perda aguda de sangue, ou destruição excessiva de eritrócitos. Uma das formas mais sensíveis de distinguir a causa da anemia entre as etiologias acima é avaliar a resposta da eritropoiese por meio da contagem de reticulócitos. Sob condições normais, cerca de 1% dos eritrócitos são são substituídos diariamente por células jovens – os reticulócitos. Essas células contêm RNA polirribossômicos que se coram com corantes vitais: azul de crezil brilhante e novo azul de metileno. Sob circunstâncias patológicas que serão apresentadas, os corantes corantes usuais da rotina hematológica: Leishman, Wright, May-Grunwal, Grunwal, ou Giemsa, podem mostrar os reticulócitos discretamente maiores que os eritrócitos e com cor cinza pálido, caracterizando a policromasia (figuras figuras 1 e 2).

Figura 1. Eritrócito com policromasia em esfregaço de sangue periférico corado com coloração rotineira (base de azul de metileno e eosina). A policromasia geralmente indica reticulocitose. No presente caso observa-se se que a célula com policromasia é maior que os eritrócitos, tratando-se tratan portanto de um reticulócito. A policromasia, cuja cor é diferente daquele do eritrócito maduro, se deve à presença de RNA ribossômico nos reticulócitos.

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Figura 2. Sangue incubado com azul de crezil brilhante a 1% e disposto diretamente em esfregaço. esfregaço Observa-se se que há reticulocitose acentuada com anisocitose de reticulócitos e de eritrócitos maduros. O presente caso é de anemia falciforme.

A coloração de reticulócitos se faz misturando 100 ml de sangue com 50 ml de azul de crezil brilhante a 1% (ver item "Contagem de Reticulócitos" – capítulo "Técnicas Laboratoriais), incubando a 37oC por 15 a 30 minutos. Após o período de incubação se faz o esfregaço e procede a análise microscópica com objetiva de aumento 100x (imersão), inicialmente observando-os qualitativamente ualitativamente (figura ( 3)) e posteriormente quantitativamente. A avaliação qualitativa permite que se tenha noção da presença normal, elevada ou diminuída dessas células, bem como de sua morfologia: micro, macro, megalo ou normal.

Figura 3. Sangue incubado com azul de crezil brilhante a 1% e disposto em esfregaço "contra-corado" "contra com Giemsa-May May Grunwald. Trata-se Trata se de reticulocitose de anemia hemolítica na deficiência de G-6PD. G Há alguns eritrócitos com corpos de Heinz (setas).

A contagem de reticulócitos geralmente é avaliada porcentualmente em relação aos eritrócitos, ou seja, contam-se se os reticulócitos em dez campos microscópicos (aumento 100x), contrapondo ao número de eritrócitos em cada campo; somam-se somam se o número de reticulócitos contados nos 10 campos e o número de eritrócitos também contados nesses campos, e dessa relação se extrai a porcentagem (ex.: 100 reticulócitos/2000 eritrócitos = 5% de reticulócitos). Em geral, admite-se se que o número normal de reticulócitos é de 0,5 a 2,0%. Entretanto, Entret quando o paciente a ser analisado padece de anemia, é importante que seja realizada a correção da contagem de reticulócitos usando a seguinte fórmula:

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Contagem corrigida de reticulócitos = O hematócrito normal é 40% para mulher e 45% para homem.

A interpretação da contagem percentual de reticulócitos estabelece que contagens elevadas indicam que a medula óssea está sob estímulo da eritropoiese. Entretanto, o estímulo é dependente do grau de anemia, ou seja, numa pessoa com hematócrito de 45%, o reticulócito reti demora 1 dia no sangue periférico para se transformar em eritrócito. Em pessoas com hematócritos de 35%, 25% ou 15%, o reticulócito demora 1,5 dia, 2 dias e 2,5 dias, respectivamente, para se transformar em eritrócitos no sangue periférico (figura (figura 4). Há assim uma avaliação que se denomina por índice de produção de reticulócitos (IPR), cuja fórmula é a seguinte:

IPR =

Figura 4. Índice de produção de reticulócitos (IPR). Aplica-se Aplica se o IPR para paciente sob controle terapêutico. Interpretação do gráfico: pessoa normal com hematócrito de 45% tem maturação média de reticulócitos de 3,5 dias na medula óssea, e 1 dia no sangue periférico. À medida que aumenta o grau de anemia, o número de dias de maturação dos reticulócitos na medula óssea diminui, enquanto enquanto que aumenta no sangue periférico, causando a reticulocitose. A interpretação desse teste é importante para o acompanhamento de um paciente sob controle terapêutico, sendo, portanto, específico para cada pessoa. Como se pode observar na figura 4, uma pessoa sem anemia tem a maturação média de reticulócitos por volta de 3,5 dias na medula óssea e um dia no sangue periférico. Quando há aumento da eritropoiese como resposta a um processo anêmico ou terapêutico, o tempo de vida dessas células no sangue periférico pe aumenta, fato que caracteriza a reticulocitose. Nesses casos, há liberação de grande número de 60

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP reticulócitos da medula para o sangue periférico, e essas células são macrocíticas (figuras ( 1 e 2). Outra forma de estimar a produção de eritrócitos é calcular calcular a contagem absoluta de reticulócitos, em que a porcentagem de reticulócitos é multiplicada pela contagem de eritrócitos. Normalmente esta contagem se situa entre 50.000 e 60.000/ml e se constitui em excelente parâmetro para avaliar a resposta positiva positiva da eritropoiese. Por exemplo, numa anemia por perda de sangue ou por excessiva destruição de eritrócitos (anemia hemolítica), a síntese da eritropoiese é estimulada e se reflete na contagem de reticulócitos, elevando-o elevando o 1% acima do seu valor basal, e conseqüentemente, nseqüentemente, aumentando o valor absoluto de reticulócitos para níveis superiores a 100.000/ml.

Avaliação de Anemia com Presença e Ausência de Reticulocitose O grupo de anemias que apresenta elevada produção de reticulócitos é denominado por anemia hemolítica (tabela 1). ). A hemólise se deve à destruição prematura dos eritrócitos nos casos sangüíneos (intravascular) ou nos espaços entre os vasos do sistema retículo endotelial (extravascular). A principal característica da hemólise é a contagem aumentada aumentad de reticulócitos. Apenas uma outra situação causa a reticulocitose, além da anemia hemolítica, é a perda de sangue (anemia hemorrágica aguda). A avaliação do paciente com suspeita de hemólise inclui a obtenção de informações pertinentes ao extrair a sua história clínica: infecções recentes; todos os medicamentos e drogas usados; exposição a toxinas, fumaça, compostos químicos e altas temperaturas; tipos de trabalho e história familiar, especialmente nas suspeitas de hemoglobinopatias, talassemias, enzimopatias enzimopatias e esferocitose. Informações sobre transfusões de sangue (concentrado de células ou produtos derivados de sangue) também são importantes na vigência de reticulocitoses. A avaliação física de pacientes com reticulocitose inclui: palidez, icterícia e esplenomegalia. es Pacientes com hemólise intravascular aguda, tal como acontece em reações transfusionais e na hemoglobinúria paroxística noturna apresentam dores (geralmente nas costas, próximas aos rins) e urina escura. Por outro lado, pacientes com hemólises hemólises crônicas (ex. talassemias beta maior, tal. beta associada à Hb S, anemia falciforme e esferocitose) podem desenvolver alterações esqueléticas e nos ossos faciais devido à hiperplasia do tecido hematopoiético da medula óssea. As principais alterações laboratoriais laboratoriais observadas nas reticulocitoses incluem: anemia macrocítica – devido à presença de reticulócitos que são maiores que os eritrócitos, e policromasia devido à presença de material ribossômico dos reticulócitos. A ausência de reticulocitose apropriada na vigência de anemia é indicativo de interferência na produção de eritrócitos (eritropoiese), tal como ocorre na deficiência nutricional de ferro e folatos, ou na aplasia e fibrose do tecido hematopoiético da medula óssea, ou por invasão de células ulas tumorais na medula óssea (leucemias, metástases). Tabela 1. Principais tipos de anemias hemolíticas associadas a reticulocitoses. •

Enzimopatias

•

Hemoglobinopatias

Alterações

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Talassemias

•

Alterações de membrana

•

Hemoglobinúria paroxística noturna

•

Acantocitose hereditária

•

Esplenomegalia

•

Anemia hemolítica autoimune

•

Anemia hemolítica microangiopática

•

Toxinas e infecções

•

Queimaduras

intracorpusculares

Alterações

extracorpusculares

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FISIOLOGIA DA DESTRUIÇÃO DOS ERITRÓCITOS Fisiologia da Destruição dos Eritrócitos

Introdução O eritrócito normal tem um período de vida estimado em 120±20 dias. Durante este período está sujeito a grandes variações metabólicas e fisiológicas, choques mecânicos e deformações. As turbulências do fluxo luxo sangüíneo ou lesões do tecido endotelial das paredes dos vasos arteriais com deposição de fibrina podem produzir fragmentações dos eritrócitos e hemólises intravasculares. Quando uma forte força física, semelhante à que ocorre nas plantas dos pés durante nte uma corrida ou em exercícios físicos, se aplica à determinada área vascularizada, os eritrócitos se rompem na circulação. Por outro lado, os eritrócitos ao se tornarem velhos, sofrem mudanças catabólicas que têm influências na diminuição da flexibilidade flexibilidade da célula. Esta diminuição dificulta a circulação dos eritrócitos na microvasculatura (figuras (figuras 1 e 2) e, em algum local da circulação ocorrerá a lise da célula por meio da fagocitose dos macrófagos do sistema reticuloendotelial (figura figura 3). 3

Figura 1. Eritrócitos normais em circulação na microvasculatura. Os estreitos vasos permitem a passagem dos eritrócitos com certa folga. Entretanto, há locais na microvasculatura em que ocorrem deformações das células e que posteriormente retornam à morfologia discóide discó normal (foto superior). Quando há pré-estase pré estase venosa, com diminuição do fluxo sangüíneo, os eritrócitos

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP normais continuam na forma discóide bicôncava, porém agregados um a outro com a característica de empilhamento ou formação em "roleaux" (foto inferior). inferio

Figura 2. Eritrócito velho, com perda da capacidade de deformação, fato que dificulta a sua circulação na microvasculatura. A rigidez do eritrócito muitas vezes bloqueia a luz do vaso, prejudicando a fluidez da circulação, bem como se torna "alvo" fácil da fagocitose dos macrófagos do sistema retículo endotelial.

Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura mostrando o macrófago (M) fagocitando o eritrócito (E) no sistema retículo endotelial.

Embora todas as células do sistema retículo endotelial participam da destruição dos eritrócitos velhos, aquelas do baço são anatomicamente mais sensíveis em detectar as anormalidades dos eritrócitos. 64

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP O sistema retículo endotelial – SRE – é a designação que se dá aos fagócitos ou macrófagos que tem mecanismos ecanismos de defesa imunológica, bem como de destruição de eritrócitos normais envelhecidos e de eritrócitos patológicos (ex.: células falciformes, esferócitos, inclusões de Hb H e corpos de Heinz). Esses macrófagos estão distribuídos principalmente no baço, baç fígado, linfonodos e medula óssea, e em menor quantidade nos pulmões e outros tecidos. O processo da fagocitose envolve uma série de informações imunológicas que se inicia devido às alterações na composição da membrana eritrocitária. Como já foi visto no no capítulo anterior (item 3.3. A Membrana)) a membrana é composta por lipídeos, proteínas e antígenos de superfície. Ao envelhecer, a membrana do eritrócito se modifica e ativa seus antígenos de superfície que, por sua vez, atraem anticorpos plasmáticos caracterizados caracterizados pelas imunoglobulinas G e M (IgG e IgM). A reação entre os antígenos de membrana com IgG e IgM desencadeiam ativação de proteínas específicas conhecidas por complementos e que atraem os macrófagos em direção a esses eritrócitos. Os macrófagos têm têm receptores para essas imunoglobulinas que envolvem o eritrócito, fato que promove o processo da fagocitose. Além disso, os macrófagos do SRE do fígado e baço reconhecem o complemento do tipo 3, ou C3, na superfície do eritrócito envelhecido, e que devido devido à dificuldade dessa célula em transitar pela microvasculatura (figura 2), ), fagocita-a fagocita (figura 3), ), causando a hemólise extravascular. O complemento tipo 3 ou C3 – os complementos são proteínas presentes no plasma que se diferenciam quimicamente, e por isso foram diferenciadas em 9 tipos diferentes, e denominadas por C1, C2 ... C9. Atuam como mediadores de resposta imunológica, envolvendo células estranhas ou anormais, bem como microorganismos estranhos (vírus, fungos, bactérias) e facilitando a fagocitose. No processo de envelhecimento do eritrócito, os anticorpos IgG e IgM aderidos aos antígenos de membrana do eritrócito desencadeiam uma reação em cascata que ativa a ação de todos os nove complementos. Especificamente o C3 ao ser ativado envolve o eritrócitoo e facilita sua destruição pelos macrófagos.

Destruição extravascular dos eritrócitos Cerca de 90% dos eritrócitos que se tornam velhos são retirados no sistema retículo endotelial pelos macrófagos. Esse tipo de saneamento fisiológico normal é conhecido por destruição extravascular dos eritrócitos, e se caracteriza como a forma mais eficiente para "reciclar" os componentes da célula destruída, em especial os aminoácidos e ferro. Dentro do macrófago, o eritrócito é atacado pelas enzimas lisosomiais; a membrana membrana é rompida e as moléculas de hemoglobinas são desagregadas pelas enzimas hemo-oxigenases. hemo oxigenases. O ferro livre do grupo heme se liga à transferrina plasmática e é transportado para a medula óssea para ser reutilizado, ou é estocado dentro dos macrófagos como ferritina e hemossiderina. Os aminoácidos são também reutilizados para comporem outras proteínas. O anel de protoporfirina que era parte integrante do grupo heme é rompido em a-meteno e seu a-carbono carbono exalado como monóxido de carbono. O tetrapirrol aberto (bilirrubina) é transportado pela albumina do plasma ao fígado, onde é ligado com outros componentes químicos para formar glicuronídeos de bilirrubina e, a seguir, excretado na bile. Os glicuronídeos de bilirrubina ao passarem pelo intestino sofrem ação de bactérias intestinais e são convertidos em urobilinogênio. A maior parte desse urobilirogênio é excretado pelas fezes como urobilina, um componente de cor laranja-amarelo laranja amarelo que dá cor às fezes. Aproximadamente 10 a 20% do urobilinogênio é reabsorvido e excretado excretado pela urina, ou retorna para o intestino por meio do ciclo entero-hepático. entero hepático. Em situações de doenças hepáticas (ex.: hepatite), o ciclo entero--hepático hepático fica desequilibrado e uma grande parte do urobilinogênio é excretado pela urina.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A destruição extravascular ascular dos eritrócitos patológicos, como são os casos das células falciformes, dos esferócitos, dos eritrócitos com precipitados de globina alfa (talassemia beta), de Hb H (talassemia alfa), de corpos de Heinz (Hb instáveis, deficiência de G-6PD G e outras situações oxidativas das hemoglobinas), se deve basicamente à estimulação imunológica dos macrófagos (figura 4). ). Em todas as anormalidades citadas, a composição protéico-lipídica protéico da membrana eritrocitária é afetada, desencadeando a ativação dos antígenos de d superfície e, conseqüentemente, a ação de anticorpos (IgG e IgM) e complemento C3, já descritos anteriormente. Quando a destruição extravascular envolve eritrócitos patológicos, o faz de forma excessiva com acentuada destruição de eritrócitos. Assim, os subprodutos da hemoglobina: ferro e bilirrubina não conseguem ser absorvidos na sua totalidade, resultando em excesso de ferro que é transformado em níveis elevados de ferritina sérica, e de bilirrubina livre no plasma, causando a bilirrubinemia (figura ( 5).

Figura 4. Microscopia eletrônica da "roseta", onde o macrófago (centro) lança pseudópodos (em branco) e inicia o processo de múltipla fagocitose de vários esferócitos, na anemia esferocítica.

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Figura 5. Destruição extravascular excessiva de eritrócitos patológicos, com elevação de bilirrubina livre (ou indireta).

Destruição Intravascular dos Eritrócitos O restante da retirada dos eritrócitos da circulação, cerca de 10% ocorre por destruição intravascular.. Normalmente, essa forma de destruição se deve às lesões e fragmentações que os eritrócitos sofrem ao longo de suas atividades funcionais. Dessa forma, a lise eritrocitária libera a hemoglobina no plasma, que se dissocia em dímeros de globinas a e b, se ligando rapidamente a uma proteína eína plasmática, a haptoglobina. A formação do complexo haptoglobina-hemoglobina hemoglobina impede a excreção renal da hemoglobina plasmática. O complexo pode ser removido da circulação pelos hepatócitos, onde sofre degradação similar à que ocorre 67

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP nos macrófagos (poiss no fígado há o sistema retículo endotelial). Há situações em que a hemólise intravascular se torna acentuada, como são os casos de intoxicações por venenos de cobra e produtos químicos, infecções pelo plasmódio da malária, entre outros. Nessas ocasiões, a destruição excessiva dos eritrócitos dentro dos vasos sangüíneos supera a capacidade de remoção da hemoglobina liberada no plasma pela haptoglobina e, conseqüentemente, a elevada concentração de hemoglobina livre plasmática que se oxida e se transforma em e hematina (figura 6). ). A hemoglobina livre plasmática que não se oxida é filtrada pelos glomérulos renais e uma parte é excretada pela urina (hemoglobinúria), e outra parte é depositada nas células tubulares renais sob forma de hemossiderina (figura ( 6).

Figura 6. Destruição intravascular excessiva e suas principais consequências.

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Avaliação da Destruição Eritrocitária As avaliações quantitativas de bilirrubina sérica e LDH (desidrogenase láctica) se caracterizam como métodos laboratoriais capazes de mostrar a intensidade da destruição eritrocitária. A concentração de bilirrubina no sangue, particularmente a fração indireta (bilirrubina livre, ou indireta, ou não-conjugada), conjugada), está correlacionada com o grau de destruição dos eritrócitos. O nível normal dee bilirrubina total varia entre 0.4 e 1 mg/dl, do qual 70% a 80% é bilirrubina indireta ou não-conjugada, conjugada, e o restante é bilirrubina direta ou conjugada. Valores diminuídos de bilirrubina são encontrados em pacientes com anemias hipoproliferativas, notadamente notadam por deficiência de ferro ou inflamação. Valores normais ou discretamente elevados de bilirrubina, entre 0.8 a 2.0 mg/dl são comuns em pacientes com eritropoiese inefetiva (incapacidade da eritropoiese corrigir a anemia) causada por anemia hemolítica; nesses casos a bilirrubina indireta ou não-conjugada conjugada está elevada. Por outro lado, quando a elevação da bilirrubina se deve à bilirrubina direta ou conjugada, indica anormalidade na função do fígado. O nível sérico de LDH é menos específico, aumentando com lesões de vários tecidos, incluindo fígado e coração. Entretanto, aumentos de níveis séricos são vistos em pacientes com anemia hemolítica, especialmente aquelas de causa intravascular. A concentração normal de LDH sérica é de 300 a 600 IU/l, e aumentos entre entre 800 e 2000 IU/l são comuns nas anemias hemolíticas compensadas. Elevações excessivas de LDH são observadas na eritropoiese inefetiva, como nos casos de anemias megaloblásticas.

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AVALIAÇÃO VALIAÇÃO LABORATORIAL DOS ERITRÓCITOS Avaliação Laboratorial dos Eritrócitos

Introdução Os testes laboratoriais básicos para avaliar qualitativamente e quantitativamente os eritrócitos incluem a dosagem de hemoglobina (Hb), o hematócrito (Ht), a contagem de eritrócitos, os índices hematimétrico VCM = volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração da hemoglobina corpuscular média; RDW: amplitude dos eritrócitos e a contagem de reticulócitos. A concentração de hemoglobina fornece uma estimativa da capacidade de transporte de oxigênio do sangue. O método padrão para quantificação manual ou automatizada da hemoglobina é baseado na reação da cianometahemoglobina. Quando quantificada manualmente, a concentração de hemoglobina pode ser determinada por meio da curva padrão pa obtida conforme orientação técnica do kit laboratorial que fornece o padrão de reagentes de cianometahemoglobina. O uso do fator de correção também é comum e substitui o uso da curva. Erros na determinação da hemoglobina podem ser causados pela imperícia imperí técnica, mal funcionamento do espectrofotômetro, deterioração de reagentes, ou amostras alteradas (coleta com hemólise, demora entre coleta e análise, calor, congelamento, lipemia e leucemias com elevado número de leucócitos). A avaliação do hematócritoo é feita pelo empacotamento dos eritrócitos em relação ao volume total do sangue. Vários fatores podem interferir na técnica de hematócrito ou de micromicro hematócrito, com destaque para a rotação usada (rpm), o funcionamento do timer e a padronização do tempo, o, da qualidade dos tubos usados, do tipo de vedação do microhematócrito, do sangue coletado sem anticoagulante, entre outros. Assim, é importante que se realizem checagens periódicas do microhematócrito. A interpretação da coluna dos eritrócitos sedimentados dos pode sofrer interferência das contagens de leucócitos e plaquetas nas leucemias e trombocitemias, respectivamente. A contagem de eritrócitos deve ser realizada por contadores automáticos, e excepcionalmente para casos específicos usa-se se a câmara de contagem contagem de células. Atualmente o uso da câmara tem se restringido à checagem do contador automático. Assim, é imprudente que os laboratórios realizem contagens de células do sangue (eritrócitos, leucócitos e plaquetas) por câmaras, uma vez que as chances de erros aumentam significativamente e, também, pelo fato de haver contadores de células de boa qualidade para atender a demanda de pequenos, médios e grandes laboratórios. Os cálculos dos índices hematimétricos são fundamentais para estabelecer a classificação classificaç laboratorial das anemias em: microcítica/hipocrômica (VCM e HCM diminuídos), normocítica/normocrômica (VCM e HCM normais), e macrocítica/normocrômica (VCM 70

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP aumentado e HCM normal). Independentemente dessa classificação, que tem apenas a função de orientarr o médico a respeito do tipo de anemia, a avaliação qualitativa da morfologia eritrocitária por meio da análise microscópica fornece informações sobre os tipos e intensidades das alterações eritrocitárias. A contagem de reticulócitos avalia a atividade da eritropoiese, e pode ser realizada de forma direta (%), por cálculo absoluto, contagem corrigida, ou pelo índice de produção. Por outro lado, muitas vezes os testes básicos apresentados são insuficientes para identificar a causa de uma anemia, bem como de esclarecer adequadamente o seu tipo. Ao longo da evolução tecnológica associada ao progresso científico da hematologia laboratorial, desenvolveu-se desenvolveu gradualmente o estabelecimento de testes específicos para identificação das alterações dos eritrócitos (tabela 1). ). Atualmente alguns desses testes estão sendo substituídos por marcadores imunológicos e que permitem avaliações pela citometria de fluxo. Tabela 1. Alguns testes específicos em Hematologia direcionados à identificação da alteração dos eritrócitos e de seus componentes. Teste

Principal Aplicação

Dosagem de ferro sérico

anemia ferropriva

Dosagem de ferritina

anemia ferropriva e controle da sobrecarga de ferro

Teste de fragilidade osmótica

anemia esferocítica

Eletroforese de hemoglobinas

hemoglobinopatias, talassemias, doença falciforme

Dosagem de Hb A2

talassemia beta menor

Pesquisa de Hb H

talassemia alfa

Pesquisa de corpos de Heinz

Hb instáveis, estresse oxidativo

Teste de instabilidade da Hb

Hb instáveis

Dosagem de Hb Fetal

talassemias beta maior e menor, doença falciforme.

Dosagem de G-6PD

deficiência de G-6PD

Dosagem de piruvato-quinase quinase

deficiência de piruvato-quinase

Dosagem de metahemoglobina

metahemoglobinemias, estresse oxidativo, Hb Instáveis

Coloração de Perl’s

anemia sideroblástica

Coloração intraeritrocitária de Hb Fetal

persistência hereditária de Hb Fetal e tal. beta maior

Dosagem de haptoglobina

anemia hemolítica

Dosagem de metalbumina

anemia hemolítica

Urobilinogênio na urina

anemia hemolítica

Teste de Coombs dreito

anemia hemolítica causada por anticorpo ligado ao eritrócito

Dosagem de bilirrubina indireta (não conjugada)

anemia hemolítica

Teste de Ham

HPN (hemoglobina paroxística noturna)

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Dosagem de vit. B12

deficiência de vit. B12

Coleta de amostra de Sangue A coleta de amostra de sangue para análise do hemograma é um procedimento que associa informações do paciente e técnicas bem estabelecidas. As informações do paciente incluem: • • • • • •

identificação completa: nome, sexo, idade, origem racial (branco, negro, asiático), endereço, telefone; identificação do médico solicitante: nome, CRM e telefone; medicamentos usados na semana precedente à coleta; informações sobre o estado físico: cansaço, indisposição, febre, sangramento, etc.; informações sobre re doença(s) já diagnósticada(s); estado paciente: calmo, agitado, sudorese, etc.

A coleta da amostra de sangue como procedimento técnico considera os seguintes itens: • • •

•

• •

•

forma de coleta: sentado ou deitado, ambulatório ou enfermaria; sangue venoso ou capilar (punção digital ou de áreas de pé) ou cordão umbilical, ou de outros locais do corpo (veia femural, veias de tornozelo, jugulares externas); tipo de anticoagulante: EDTA-K EDTA 2, EDTA-K3, heparina e citrato tri-sódico. sódico. O EDTAEDTA K3 é o preferencial para hemograma, hemograma, a heparina é o melhor anticoagulante para o teste de fragilidade osmótica, e o citrato tri-sódico tri sódico é o mais usado para estudos de coagulação. Para o restante das várias técnicas laboratoriais, especialmente aquelas para estudos dos eritrócitos, deve-se deve usar o EDTA-K3. O esfregaço pode ser feito imediatamente após a retirada da agulha da seringa ou vacuntainer, com o sangue sem anticoagulante, ou após o sangue ter sido misturado com o anticoagulante. Preferencialmente o esfregaço deve ser feito no momento da d coleta. Foi demonstrado que até uma hora após a coleta do sangue (desde que mantida a temperatura entre 18 a 25oC), não há alterações de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. Após uma hora iniciam-se iniciam se alterações morfológicas, que se tornam evidentes depois de 3 horas da coleta principalmente dos leucócitos. Os eritrócitos são mais resistentes, porém após 6 horas da coleta de sangue, podem sofrer crenações e tornarem-se tornarem se esferocíticos. As lâminas usadas para a distensão do esfregaço devem estar limpas, sem gordura go e sem riscos (comuns em lâminas reutilizadas). A coloração dos esfregaços sangüíneos tem por base a mistura de azul de metileno com eosina. Assim ocorreram modificações técnicas de concentrações e tipos de azul de metileno. Os três métodos mais usados usados na rotina hematológica são: MayMay Grunwald/Giemsa; Wright e Romanowsky. Os esfregaços com coloração automatizada, ou distensões feitas por distensores mecânicos, dependem da orientação técnica de cada máquina.

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A Avaliação do Eritrograma O eritrograma é o conjunto das análises que incluem contagem de eritrócitos, dosagem da hemoglobina, e determinação do hematócrito (ou micro-hematócrito). micro hematócrito). Dessas análises obtêm-se obtêm os índices hematimétricos que são importantes na classificação laboratorial das anemias (consultar o capítulo "As As Anemias"). Anemias"). Os índices hematimétricos são três: VCM (ou volume corpuscular médio), HCM (hemoglobina corpuscular média) e o CHCM (concentração da hemoglobina lobina corpuscular média). As fórmulas para obter esses índices são apresentadas a seguir.

CHCM(g/dL ou %) Ht: hematócrito; CE: contagem de eritrócitos; Hb: dosagem de hemoglobina Com o emprego de contadores automáticos avançados, surgiram outros índices, dos quais o RDW (amplitude dos eritrócitos) tem sido útil para indicar alterações morfológicas dos eritrócitos, relacionados ao tamanho. Na maioria desses aparelhos, o RDW representa o desvio padrão das medidas do tamanho do eritrócito, e em outros outros é obtido pelo coeficiente de variação (CV) do tamanho dessas células. O contínuo avanço em tecnologia e computação tem aumentado a precisão e a velocidade com que se faz as análises das células do sangue, ao mesmo tempo em que se reduz a quantidade de sangue ngue necessária para os testes. Esse progresso que emprega a informatização dos diversos meios que envolvem as contagens das células (impedância, dispersão de luz, ou ambos associados) provêm informações adicionais de até 30 parâmetros. Com o desenvolvimento desenvolvimen da tecnologia dos raios laser e dos avanços dos processos de fluidez como a focalização hidrodinâmica e o fluxo laminar, poderá fornecer mais informações não só quantitativas, mas também qualitativa (morfológica) dos eritrócitos. Apesar de todo esse processo, cesso, as doenças dos eritrócitos são muitas vezes determinadas pela cuidadosa investigação da bancada, de técnicas específicas, e notadamente através da criteriosa avaliação citológica.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP O Esfregaço do Sangue Periférico A avaliação da morfologia dos eritrócitos eritrócitos é a parte mais importante na identificação e na busca da causa da anemia. Como se verá nos próximos capítulos, grande parte das anemias apresentam características peculiares nos eritrócitos. Entre os diversos tipos de anemia, as hemolíticas representam ntam excelente exemplo de alterações morfológicas. As anemias hemolíticas, quer sejam de origem microangiopática ou por hemólise traumática (ex.: queimaduras graves), causam fragmentações nos eritrócitos; os esferócitos são identificados nas anemias por hemólise he autoimune e na esferocitose hereditária; as células em alvo (ou codócitos) são observadas nas doenças hepáticas em geral, talassemias e doença de Hb C (Hb CC-homozigota); CC homozigota); eritroblastos no sangue periférico e dacriócitos em profusão são vistos na mielofibrose mielofibrose e nos processos mielotísicos (invasão da medula óssea por células cancerosas, linfomas, fibrose ou granulomatose); parasitas intracorpusculares são vistos na malária e babesiose; células afoiçadas nas mais diversas formas são comuns na anemia falciforme falciforme e na doenças falciformes (Hb SC, Hb S/talassemia beta, Hb SS/talassemia alfa, Hb SD); eritrócitos mordidos ocorrem em sangue de portadores de Hb instáveis e deficiência de G-6PD. G 6PD. Como se pode concluir por essa breve apresentação correlacionando algumas algumas alterações eritrocitárias com doenças, a análise microscópica da morfologia eritrocitária é fundamental na avaliação hematológica (figura ( 1). Porém, deve-se se destacar também que as observações das morfologias dos leucócitos e das plaquetas muitas vezes são decisivas para auxiliar o diagnóstico citológico de determinados tipos de anemias, como os exemplos que se seguem: • •

a hipersegmentação dos neutrófilos é comum nas anemias megaloblásticas; a trombocitopenia e a leucopenia, com alterações morfológicas morfológicas das plaquetas é indicativo de processo patológico na medula óssea com envolvimento das três séries celulares do sangue: eritrócitos, leucócitos e plaquetas.

Figura 1. Alguns tipos específicos de alterações da morfologia dos eritrócitos. 74

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PRINCIPAIS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS ERITRÓCITOS Principais Alterações Morfológias dos Eritrócitos

Introdução As alterações morfológicas dos eritrócitos decorrem de três situações distintas: envelhecimento da célula, artefato técnico, patologias intra ou extra eritrocitárias. O envelhecimento dos eritrócitos está relacionado com suas atividades ao longo do seu período médio de vida (± 120 dias), onde os impactos físicos das células e os compostos químicos consumidos gradativamente durante o seu ciclo vital, provocam provocam deformações na sua estrutura e, consequentemente, alterações morfológicas (figuras ( 1 e 2). ). Assim, numa análise de sangue normal é possível observar a presença de eritrócitos discretamente alterados em seu contorno, ou em sua forma. Geralmente a presença presença dessas células envelhecidas não excedem 4%.

Figura 1. Microscopia eletrônica (ME) de varredura de eritrócitos normais.

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Figura 2. ME de varredura de um eritrócito na fase inicial de envelhecimento, mostrando-se mostrando discretamente "inchado", perda da capacidade de se manter na forma discóide e bicôncava, e discretas lesões na sua membrana.

O artefato técnico se deve a vários fatores, com destaques para: qualidade do esfregaço, qualidade da coloração, e sangue estocado, principalmente. A qualidade do esfregaço es inclui a sua espessura, a homogenização do sangue coletado com anticoagulante, o volume da gota de sangue extraído diretamente da seringa ou do tubo coletor. A qualidade da coloração se deve ao perfeito equilíbrio do uso dos corantes básico e ácido e da água tamponada. Entretanto, há situações patológicas como são os casos do mieloma múltiplo onde há alta concentração de imunoglobulina que promove a captação do componente básico do corante, tornando o esfregaço com coloração azul-escura azul e a formação do "roleaux". Outra situação, também patológica, e que influi na qualidade do esfregaço se deve ao alto nível de crioglobulinas que causam aglutinações dos eritrócitos e do esfregaço, à temperatura ambiente. Nesses casos, o sangue deve ser aquecido a 37ºC para realizar não só o esfregaço como as outras avaliações: contagens de células, dosagem de hemoglobina e hematócrito. O sangue estocado produz artefatos caracterizados por crenações em toda a extensão do esfregaço, bem como eritrócitos picnóticos, ou seja, seja, muito corados e pequenos. Uma outra causa de crenação dos eritrócitos se deve ao excesso de anticoagulante, notadamente quando se usa o EDTA. Entretanto, em sangue estocado, com a morte natural dos eritrócitos ao longo dos dias, o EDTA é o principal fator tor das alterações artefatuais dos eritrócitos. A figura 3 mostra o artefato caracterizado por eritrócitos alongados, simulando células falcizadas ou eliptóides, observadas nas margens de um esfregaço normal. Os artefatos devem ser muito bem distinguidos das d células normais, e para isto é fundamental a experiência do profissional. As patologias intra ou extra-eritrocitárias eritrocitárias que deformam os eritrócitos serão descritas detalhadamente no próximo item deste capítulo, porém as causas das alterações morfológicas dos eritrócitos doentes de devem a: a. eritropoiese anormal: deficiências de ferro, vit. B12 e folatos, hemólises, aplasias; b. formação inadequada de hemoglobina: deficiência de ferro e talassemias; c. lesões dos eritrócitos ao deixarem a medula óssea: oxidações por deficiência de G-6PD, G drogas e metahemoglobinemias, esferocitoses, eliptocitoses, estomatocitoses, fragmentações, hemoglobinopatias (Hb S, Hb C, Hb instáveis); d. eritropoiese aumentada: anemias hemolíticas, hemorragias, etc.

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Figura 3. Esfregaço de sangue periférico mostrando eritrócitos deformados por artefato técnico. As células alongadas não sãoanormais, anormais, pois foram observadas apenas na extremidade do esfregaço, provavelmente devido à lâmina que fez o deslizamento do sangue.

Alterações Patológicas dos Eritrócitos Os principais processos patológicos dos eritrócitos, quer sejam provenientes da sua estrutura (membrana, enzimas ou hemoglobina) ou adquiridas (malária, oxigenações, queimaduras) resultam em anormalidades do tamanho, forma, conteúdo de hemoglobina e inclusões,que serão apresentadas nos ítens 2.1, 2.1 2.2, 2.3 e 2.4

Alterações do tamanho dos eritrócitos

Eritrócitos normocíticos – normocitose

A normocitose é um termo que se usa quando o Valor Corpuscular Médio (VCM) se apresenta dentro dos padrões de normalidade. É portanto de se esperar que a análise morfológica do esfregaço sangüíneo se apresente com eritrócitos com tamanhos normais entre 6,0 e 8,5 mm. Entretanto, há casos em que os valores de VCM estão normais em pessoas com anemia normocítica,, e nesses casos é comum encontrar eritrócitos com tamanhos tamanhos diferentes um dos outros, caracterizando a anisocitose. anisocitose

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Anisocitose

A palavra aniso é de origem grega e significa desigual.. Assim, o uso do termo anisocitose se aplica quando na análise do esfregaço se observam eritrócitos com tamanhos diferentes (figura ( 4). ). A anisocitose pode ser devido à presença de eritrócitos normais com microcíticos, de normais com macrocíticos, de microcíticos com macrocíticos, ou de normais, microcíticos e macrocíticos. Desta forma, a anisocitose expressa alterações que podem ser estimadas em: discreta, moderada ou acentuada. acentuada. Se a variação é causada principalmente por micrócitos ou macrócitos, ou ambos, estes fatos devem ser relatados. Alguns contadores automáticos de células do sangue identificam a anisocitose através da avaliação avaliação computadorizada das superfícies dos eritrócitos contados. Essa avaliação é conhecida por RDW (red (red cell distribution width ou distribuição das superfícies dos eritrócitos). Os índices RDW e VCM atualmente são utilizados para a classificação das alterações alterações do tamanho dos eritrócitos, conforme mostra a tabela 1.

Figura 4. Anisocitose eritrocitária em sangue de paciente que tinha ferropenia, mas que há um mês estava sob tratamento. Observa-se Observa se eritrócitos microcíticos e hipocrômicos oriundos da fase anêmica, anêm de eritrócitos normais devido ao tratamento, e de alguns macrócitos que provavelmente sejam reticulócitos lançados ao sangue periférico também devido ao tratamento.

Tabela 1. Classificação dos eritrócitos por uso de RDW e VCM. VCM Baixo

VCM Normal

VCM Alto

RDW normal

microcitose homogênea

normocitose homogênea

macrocitose homogênea

RDW alto

microcitose heterogênea

normocitose heterogênea

macrocitose heterogênea

Apesar da facilidade da classificação dos eritrócitos fornecida por contadores de células avançados tecnologicamente, não há dúvida que a avaliação microscópica ainda é fundamental, mesmo contando com esses recursos. 78

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Eritrócitos microcíticos – microcitose

Os eritrócitos com diâmetro diminuído (< 6 mm) são caracterizados como micrócitos. Quando o número de micrócitos é representativo no sangue periférico, ocorre a diminuição do VCM e conseqüentemente a microcitose (figura 5). ). Os micrócitos geralmente têm reduzido conteúdo de hemoglobina (hipocromia), mas há casos de micrócitos normocrômicos. Os micrócitos podem ser discóides ou fragmentados. Em geral, na deficiência de ferro há alterações no processo de maturação da eritropoiese, e nesses casos os micrócitos geralmente são discóides. Nas talassemias alfa e beta, o desequilíbrio entre as sínteses de globinas produz a precipitação da globina sintetizada (precipitam globinas beta na talassemia alfa, e globinas alfa na talassemia beta), e por essa razão há deformações nos eritrócitos que são parcialmente fagocitados por macrófagos do SRE, produzindo micrócitos fragmentados (ver capítulo "Fisiologia " da Destruição dos Eritrócitos"). "). Nas anemias hemolíticas, a microcitose microcitose resulta da presença de micro-esferócitos esferócitos ou de fragmentações (ver capítulo sobre "Anemias "Anemias" e "Alterações Eritrocitárias nas Talassemias"). Talassemias

Figura 5.. Microcitose na talassemia beta menor. A foto mostra a presença predominante de micrócitos hipocrômicos, ao lado de poucos eritrócitos normais. Há também eritrócitos com formas alteradas: dacriócitos, esquisócitos e leptócitos.

Eritrócitos macrocíticos – macrocitose

Os eritrócitos cujos diâmetros excedem 9,0 mm são denominados por macrocíticos. Quando há muitos macrócitos no sangue capazes de elevar elevar o valor de VCM acima de 100 fl, caracteriza-se caracteriza a macrocitose (figura 6). ). As causas mais comuns da macrocitose se devem aos níveis diminuídos de vitamina B12 e ácido fólico (figura ( 7). ). Outras patologias como o alcoolismo, anemia hemolítica crônica com reticulocitose, reticulocitose, mieloma, leucemia, carcinoma metastático, hipotiroidismo e doença hemolítica do recém-nascido recém nascido também causam a macrocitose. Eritrócitos muito grandes podem ser visualizados ocasionalmente em doenças que atingem as

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP células tronco: anemia aplástica, aplástica, aplasia pura da série vermelha, mielofibrose e anemia sideroblástica.

Figura 6.. Macrocitose em sangue de recém-nascido recém nascido com anemia hemolítica (anemia hemolítica do RN). Juntamente com esferócitos observam-se observam se grandes eritrócitos que certamente se devem à reticulocitose. A presença desses macrócitos eleva o VCM, caracterizando a macrocitose (consultar tabela 1).

Figura 7.. Macrocitose na deficiência de folatos em gestante. Na gestação há deficiência também de ferro, fato que causa um dimorfismo eritrocitário eritrocitário com micrócitos e macrócitos conjuntamente. No presente caso, embora haja o dimorfismo, o número de macrócitos é maior, além da hipersegmentação do neutrófilo, também conseqüência da deficiência de folatos.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A presença de macrócitos ovais (figura ( 8) sugere ugere defeito de maturação nuclear por deficiência de vitamina B12 ou ácido fólico, caracterizando a anemia megaloblástica (ver (ver capítulo sobre "As Anemias").

Figura 8. Megalócitos em sangue periférico de paciente com anemia megaloblástica.

Alterações da forma dos eritrócitos

Poiquilocitose

O termo usado para variações nas formas dos eritrócitos é poiquilocitose.. O reconhecimento de várias formas ou poiquilócitos no esfregaço é util na diferenciação das anemias. Os principais exemplos de poiquilócitos que caracterizam certas anemias são os seguintes: eliptócitos, falciforme, fragmentados, esferócitos, dacriócitos e codócitos. Os poiquilócitos podem originar por alterações bioquímicas nas membranas dos eritrócitos, alterações metabólicas das enzimas, anormalidades da molécula de hemoglobina, envelhecimento do eritrócito, anormalidades no micro-ambiente micro ambiente das células, etc. A tabela 2resume resume as principais origens da poiquilocitose poiquilocitose relacionadas às alterações da forma. Tabela 2. Origens dos eritrócitos com alterações de forma. Anormalidades da Membrana

Secundário a Traumas*

Secundário à Mcrocitose

Secundário à Hb Normal

esferócitos

fragmentados

macroovalócitos

célula falciforme

eliptócitos

esquisócitos

megalócitos cristais de Hb

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP CC estomatócitos

queratócitos

equinócitos

dacriócitos

acantócitos

microesferócitos

cristais de Hb SC

piropoiquilócitos codócitos

semilunar

leptócitos

célula em bolha** célula mordida

* queimaduras, válvulas cardíacas, microangiopatias hemolíticas, hemoglobinúria da marcha, malária ** Blister cell

Os esferócitos

Os esferócitos são células redondas visíveis em microscopia eletrônica de varredura (figura ( 9), e quando observadas por microscopia óptica, apresentam-se apresentam se circulares e intensamente coradas (figura 10). ). O diâmetro do esferócito é de aproximadamente 6,2 a 7,0 mm, e sua espessura varia entre 2,2 a 3,4 mm.

Figura 9. Microscopia eletrônica de varredura de um esferócito. A célula perde a sua biconcavidade e se torna esférica.

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Figura 10. Esferocitose hereditária em aumento 1000x. Há anisocitose entre os esferócitos, onde os maiores (macro-esferócitos) esferócitos) são devido à presença de reticulócitos. Coloração de May-GrunwaldMay Giemsa (corante de rotina hematológica).

Os esferócitos podem ser causados por condições hereditárias ou adquiridas. Vários defeitos moleculares nas proteínas de membrana podem ser identificados naesferocitose na hereditária (ver capítulo sobre "Alterações "Alterações Eritrocitárias nos Defeitos de Membrana"). Os esferócitos não são facilmente deformáveis e perdem parte de constituintes da membrana por fragmentação durante suas passagens pela microcirculação no SRE, fato que abrevia seu ciclo de vida e causa hemólise. ise. Essas células tornam-se tornam se densas e pequenas com aumento do conteúdo de hemoglobina, caracterizando a hipercromia (figura 10)) e geralmente com elevação da concentração da hemoglobina corpuscular média (CHCM). Os esferócitos mostram aumento da fragilidade celular frente a soluções salina hipotônicas – teste da fragilidade (ou resistência) osmótica (ver capítulo "Técnicas Laboratoriais"). Uma das formas terapêuticas de diminuir a anemia hemolítica na esferocitose hereditária é a retirada do baço (esplenectomia); mia); a hemólise diminui, mas os esferócitos persistem indicando que a anormalidade se deve mais ao defeito da membrana celular do que das lesões causadas pelos macrófagos do SRE do baço. As causas mais freqüentes de esferocitose adquirida se devem a anemia anemia imuno-hemolítica imuno por anticorpos autoimune ou insoimune, por anemia hemolítica com corpos de Heinz (ver item "Corpos de Heinz" neste capítulo), anemia hemolítica micro-angiopática micro angiopática e hemólise por diluição aquosa. Eritrócitos transfundidos também são freqüentemente freqüentemente esféricos (microesferócitos).

Os eliptócitos e ovalócitos

Os eliptócitos são eritrócitos alongados e delgados, com concentração elevada de hemoglobina produzindo discreta hipercromia em várias células. Também são denominados 83

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP por ovalócitos quando o eixo longitudinal do eritrócito é menos delgado. Os eliptócitos podem ter origem hereditária ou adquirida. Por meio da microscopia eletrônica de varredura observa-se observa discreta concavidade no centro de algumas células eliptóides (figura ( 11), ), fato que qu justifica por vezes a região central menos condensada de hemoglobina.

Figura 11. Microscopia eletrônica de varredura na esferocitose hereditária. Há eliptócitos com concavidade central e outros quase sem a concavidade. Essa disposição anormal da estrutura estrut da membrana celular, reflete na distribuição do conteúdo de hemoglobina entre os eliptócitos, cracterizado anisocromia.

Considera-se se eliptose hereditária quando 25 a 90% dos eritrócitos são elípticos (figura ( 12), e o principal defeito ocorre no citoesqueleto citoesqueleto da célula, com diminuição do conteúdo da proteína banda 4.1 (ver capítulo sobre "Alterações Eritrocitárias nos Defeitos de Membrana"). Nos casos de eliptocitose hereditária, os eritroblastos precursores dos eliptócitos geralmente têm a morfologia normal, ormal, excetuando alguns casos raros da doença. O período de vida média dos eliptócitos é diminuído, porém sua atividade funcional não é afetada. O teste de fragilidade osmótica é variável conforme o tipo de eliptócitos (ver capítulo "Alterações Eritrocitárias Eritrocitá nos Defeitos de Membrana").

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Figura 12. Sangue periférico de portador da eliptocitose hereditária, em aumento 400x. Observar acentuada poiquilocitose (>70%) caracterizada pela presença predominante de eliptócitos.

A eliptocitose adquirida ocorre na deficiência de ferro, anemia megaloblástica, e na anemia mielotísica, onde menos de 10% das células são elípticas ou ovais. Eliptócitos também podem ser vistos nas talassemias e anemia falciforme.

Os estomatócitos

Os estomatócitos se caracterizam no sangue sangue periférico como células com áreas estreitas e alongadas na região central dos eritrócitos (figura ( 13). O termo stomasignifica significa boca.

Figura 13. Sangue periférico de estomatocitose hereditária em aumento 1000x. Observa-se Observa que quase todas as células são estomatócitos.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Em geral, em esfregaços de sangue normal é muito difícil a presença de estomatócitos, porém sua presença é comum no alcoolismo, cirrose, doença hepática obstrutiva e doença de Rh nulo. Em situações artefatuais, também pode ocorrer a presença de estomatócito. A estomatocitose hereditária se deve basicamente à hidratação aumentada com influxo de sódio para o interior da célula (figura figura 14), 14), e à deficiência de acetiltransferase lecitina (ATLC) conforme mostra a figura 15. 15 A estomatocitose é comum entre australianos de origem mediterrânea. O quadro clínico dos portadores da estomatocitose hereditária é heterogêneo, e se deve ao grau de anormalidade no transporte de sódio-potássio sódio potássio de célula. Devido ao grau de deformidade do estomatócito, admite-se admite que ue o mesmo seja retirado precocemente da circulação (ver capítulo "Alterações Alterações Eritrocitárias nos Defeitos de Membrana"). Membrana

Figura 14. Microscopia de varredura de estomatócitos, em que há hidratação aumentada pelo acentuado influxo de sódio para o interior da célula, provocando a mudança de discóide para discodisco estomatócito.

Figura 15. Microscopia eletrônica de varredura mostrando que a deficiência de acetil transferase de lecitina provoca dobradura na membrana do eritrócito, e sua transformação em estomatócito.

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Os equinócitos

Equinócito é um nome de origem grega referente ao ouriço do mar. Os eritrócitos com espículas uniformemente distribuídas têm esta denominação. Termos antigos como células crenadas ou células de Burr (Burr cells)) não são mais utilizados, pois as células crenadas é uma situação quase sempre relacionada a artefatos técnicos, enquanto que as células de Burr apresentam espículas heterogêneas e são freqüentes em pacientes com uremia. A presença de equinócitos se deve também a situações artefatuais que interferem mudanças do pH do corante, como em sangue estocado que promove a perda de ATP, bem como alterações alterações bioquímicas do plasma. Três situações patológicas dos eritrócitos são responsáveis pela formação dos equinócitos: a deficiência da enzima eritrocitária piruvato-quinase piruvato (figura 17), ), diminuição do potássio intramembrana (figura 18)) e aumento da concentração concentração de fosfatidil colina na membrana (figura ( 19), ), todos bem demonstrados por microscopia eletrônica de varredura. Os equinócitos também estão presentes em pacientes com carcinoma de estômago e em hemorragias causadas por úlceras peptídicas.

Figura 17. ME de varredura do equinócito de sangue de paciente com deficiência de piruvato-quinase. piruvato

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Figura 18. ME de varredura de equinócitos com alterações de potássio intra-eritrocitário. intra eritrocitário.

Figura 19. ME de varredura de equinócitos com aumento da concentração de fosfatidilcolina na membrana.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os acantócitos

Os acantócitos são eritrócitos com espículas desproporcionais e heterogêneas, facilmente identificáveis na rotina hematológica (figura ( 20), ), e na microscopia eletrônica de varredura (figura 21). As projeções ou espículas, ou crenações são irregulares no tamanho e no espaçamento. A acantocitose pode ser herdada ou adquirida, e as células acantocíticas geralmente são menores que os eritrócitos normais. A situação herdada mais comum da acantocitose decorre rre da alteração na composição da membrana motivada pela deficiência de colesterol entre a dupla camada lipoprotéica ou abeta lipo-proteinemia. lipo proteinemia. Outras patologias que podem produzir acantocitose são alcoolismo crônico com comprometimento do fígado, nas póspós esplenectomia e nas síndromes de mal absorção.

Figura 20. Acantócitos no sangue periférico de paciente com beta lipoproteinemia.

Figura 21. ME de varredura de acantócito de sangue de paciente com abeta lipoproteinemia.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os codócitos ou células em alvo

Codócitos ou células em alvo são eritrócitos com a área central corada intensamente pela condensação de hemoglobina, circundada por um anel claro e um anel periférico também corado, caracterizando a célula em alvo (figura ( 22). ). Por microscopia eletrônica, o codócito, ou célula em alvo, tem a forma de um capuz, ou de um chapéu (figura ( 23). ). Essa alteração na forma do eritrócito é sempre adquirida pelo aumento da superfície da membrana, resultante do acúmulo de colesterol e fosfolipídeos. O aumento da superfície superfície da membrana torna-a torna mais resistente quando submetida ao teste de fragilidade (ou resistência osmótica) (ver capítulo "Técnicas Laboratoriais"). Os codócitos ou células em alvo são característicos nas talassemias, notadamente na beta menor, nas hemoglobinopatias nopatias SS, CC, DD, EE e na doença falciforme do genótipo S/tal. beta. Também podem ser observadas na anemia por deficiência de ferro, doenças obstrutivas do fígado e pós-esplenectomia.

Figura 22. Sangue periférico de paciente com Hb CC (doença da Hb C), C), com acentuada presença de células em alvo

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Figura 23. ME de varredura de codócito ou célula em alvo. Observar a condensação de hemoglobina no centro do eritrócito, bem como o aumento da superfície do eritrócito causado pelo acúmulo de colesterol e fosfolipídeos na membrana.

Os esquisócitos, células fragmentadas e queratócitos

O surgimento de eritrócitos deformados e que adquirem morfologias fora dos padrões de classificação deve-se se à tentativa dessas células em passar pelos filamentos de fibrina, vasos alterados, por impacto físico em próteses (válvulas cardíacas), ou pela retirada de "pedaços" dos eritrócitos pelos macrófagos do SRE. Assim, o termo esquisócito tem origem grega e que significa fragmento. As formas dos esquisócitos são muito variadass como, por exemplo, nas talassemias (figura 24), ), ou de fragmentação ou pedaços de eritrócitos (figura figura 25) 25 causados em conseqüência de diversas patologias: válvulas cardíacas artificiais, coagulação intravascular disseminada (C.I.V.D.) na púrpura trombocitopênica trombocitopênica trombótica (P.T.T.), na anemia hemolítica urêmica, queimaduras graves e no câncer metastático que atinge a medula óssea, ou o queratócito,, que tem a forma de capacete (figura ( 26)) e ocorre principalmente em pacientes com anemia hemolítica microangiopática, microangiopática, e outras anemias hemolíticas adquiridas.

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Figura 24. Esquisócitos em sangue de portador de talassemia beta menor. A precipitação de globina alfa (na talassemia beta) ou de globina beta (na talassemia alfa) deforma o eritrócito, que ao passar pelo SRE sofre ação dos macrófagos. Os macrófagos retiram partes dos eritrócitos deformados pela precipitação da globina, descaracterizando a forma discóide, e produzindo células "mordidas".

Figura 25. Eritrócitos fragmentados em sangue de paciente com prótese prótese cardíaca, e que desenvolveu anemia hemolítica. Observam-se Observam se vários eritrócitos fragmentados e também micromicro esferócitos.

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Figura 26. Queratócitos (setas) em sangue de paciente com anemia hemolítica por transfusão de sangue incompatível. Há outras células deformadas: esquisócitos e ovalócitos.

A formação do queratócito é muito interessante pois passa por uma fase intermediária conhecida por célula em bolha (figura figura 27), 27), e se deve à fase inicial da sua deformação. A célula em bolha pode ser observada na circulação periférica, e ao romper a fina estrutura de membrana que caracteriza a bolha, se forma o queratócito.

Figura 27. Eritrócito em bolha, obtido de sangue de paciente com anemia hemolítica microangiopática.

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Os dacriócitos

Os dacriócitos são células ulas com forma de lágrima ou gôta, e o nome também tem origem grega (dacry significa lágrima), conforme mostram as figuras 28 e 29.. O tamanho dos dacriócitos é variável, e pode ser normocrômico ou hipocrômico. Os dacriócitos são observados na mielofibrose com metaplasia mielóide, devido à atividade fagocitária dos macrófagos do SRE do baço, que nesta doença apresenta-se apresenta se aumentado. Em outras doenças, como são os casos de anemia mielotísica, anemia perniciosa, talassemia beta (figura ( 5), ), em oxidações da hemoglobina lobina com formação de corpos de Heinz (figura ( 30), ), e tumor metastático na medula óssea.

Figura 28. Dacriócitos em sangue periférico de paciente com mielofibrose (mielodisplasia). Mielodisplasia é o nome que se dá a um grupo de doenças que afeta a hematopoiese medular, ex.: doenças pós-leucêmicas, leucêmicas, mielofibrose, aplasias de um tipo celular, etc. No presente caso há vários dacriócitos, além de outras alterações de forma (poiquilocitose). Ver outros dacriócitos na figura 5.

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Figura 29. Microscopia eletrônica trônica de varredura de um dacriócito de paciente com talassemia beta menor. A forma é tipicamente de gota de lágrima e há concavidade celular.

Figura 30. Microscopia óptica, aumento 1600x de dacriócito com corpos de Heinz após coloração com azul de crezil il brilhante a 1%, obtido de paciente com hemoglobina instável.

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Figura 5. Microcitose na talassemia beta menor. A foto mostra a presença predominante de micrócitos hipocrômicos, ao lado de poucos eritrócitos normais. Há também eritrócitos com formas alteradas: eradas: dacriócitos, esquisócitos e leptócitos.

Microesferócitos e piropoiquilócitos

Os microesferócitos são resultantes de lesões térmicas que afetam a membrana dos eritrócitos, tal como ocorre em queimaduras graves. Essas células são pequenas, às vezes do tamanho de plaquetas, e hipercrômicas (figura figura 31). 31). Esses pedaços de eritrócitos deformados têm formas esféricas de diferentes tamanhos e são retirados da circulação do SRE do baço, fígado e medula óssea (figura 32).

Figura 31. Sangue periférico de paciente paciente que sofreu queimaduras graves. Os eritrócitos apresentam aniso-poiquilocitose poiquilocitose acentuada, com presença de microesferócitos de diferentes tamanhos, além de células fragmentadas.

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Figura 32. Microscopia eletrônica de varredura de microesferócitos com dificuldades de se locomoverem nos sinusóides do baço. Essas células são facilmente fagocitadas pelos macrófagos, e têm seu tempo de vida reduzido.

Os piropoiquilócitos são eritrócitos extremamente deformados que incluem num mesmo campo visual do microscópio pio óptico grande diversidade de células, a maioria microcítica, com destaque para microesferócitos, microeliptócitos, fragmentos de eritrócitos, dacriócitos, etc. (figura ( 32a). Se deve a uma rara doença hemolítica hereditária, e a anormalidade se deve provavelmente pro à alteração da espectrina da membrana do eritrócito. A fragmentação dos eritrócitos nesta doença pode ser induzida "in vitro", incubando o sangue a 45oC por alguns minutos (ver capítulo "Alterações eritrocitárias nos defeitos de membrana").

Figura 32a. Sangue periférico de paciente com piropoiquilocitose hereditária. O destaque morfológico dos eritrócitos é suas múltiplas formas de deformações, com esquisócitos, micrócitos, leptócitos, células bizarras, etc. A hipercromia é comum entre os eritrócitos eritrócitos alterados.

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Os leptócitos Os leptócitos são células alongadas e delgadas (figuras ( 33 e 34)) que aparecem em deficiência grave de ferro e nas talassemias. Morfologicamente se parecem com os eliptócitos, porém se diferenciam desses devido à hipocromia associada. Tem-se se relacionado à anormalidade morfológica do eritrócito leptócito devido ao excesso de colesterol na membrana da célula. Essas células também são comuns nas doenças crônicas do fígado.

Figura 33. Leptócitos em sangue periférico de paciente com anemia por deficiência de ferro. No mesmo esfregaço é possível destacar os eritrócitos em alvo ou codócitos, micrócitos, esquisócitos e hipocromia.

Figura 34. Microscopia eletrônica de varredura de eritrócitos de paciente com anemia hemolítica. Observar micro-esferócitos, micro esferócitos, eritrócitos hipocrômicos e um leptócito.

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Outras alterações de forma de eritrócitos

Célula semilunar: também conhecida por célula em meia-lua meia lua ou célula crescente. São eritrócitos que possuem uma palidez rosada numa extremidade, e uma região circular vazia (figura 35). ). As células semilunares ocorrem em situações patológicas adquiridas, principalmente nas pessoas com malária.

Figura 35. Células semilunar, em sangue de paciente com malária. São pouco coradas e possuem um grande círculo vazio tomando 2/3 da estrutura celular do eritrócito.

Célula mordida: ocorre nos eritrócitos que têm corpos de Heinz induzidos por oxidações medicamentosas (ex.: sulfas e derivados), oxidações por poluentes, Hb instáveis, metahemoglobinemias, mias, anemia falciforme e na deficiência de G-6-PD. G PD. Os eritrócitos com corpos de Heinz, ao passarem pelo SRE, são "atacados" por macrófagos que retiram parte do eritrócito em que estavam os corpos de Heinz. Esses eritrócitos, ao voltarem para a circulação do sangue periférico, apresentam-se apresentam como se fossem "mordidos" (figura 36).

Figura 36. Célula mordida em sangue periférico de paciente com corpos de Heinz causado pela deficiência de G-6-PD.

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Células em roseta: é uma situação muito rara, decorrente de anemia hemolítica adquirida em que os eritrócitos aderem a fagócitos, especialmente em neutrófilos, conforme mostra a figura 37.

Figura 37. Eritrócitos em forma de roseta, em sangue periférico de anemia hemolítica por transfusão de sangue de subgrupo incompatível. inc

Megalócitos e macro-ovalócitos ovalócitos

Essas células são facilmente diferenciadas os eritrócitos macrocíticos pelas suas formas enormes e ovaladas, e geralmente com policromatofilia (figuras ( 8 e 38). ). A patologia mais comum que induz a presença de megalócitos ou de macro-ovalócitos macro ovalócitos é a anemia megaloblástica. Anemia megaloblástica é uma situação patológica provocada por deficiência de vitamina B12 ou folatos, fato que altera o processo de maturação dos eritroblastos (figura ( 39). ). É comum, portanto, que qu na ocorrência dessas células, causada pela anemia megaloblástica, observar pontilhados basófilos, corpos de Howell-Jolly, Howell Jolly, eritroblastos, plaquetas grandes (macroplaquetas) e hipersegmentação dos neutrófilos.

Figura 8. Megalócitos em sangue periférico de paciente com anemia megaloblástica

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Figura 38. Esfregaço de sangue periférico em paciente com anemia megaloblástica. Observar anisoaniso poiquicitose, com macrócitos e megalócitos, além de um neutrófilo hipersegmentado.

Figura 39. Esfregaço de sangue de medula óssea de um paciente com anemia megaloblástica. A célula central é um megaloblasto policromático com dois núcleos.

Cristais de Hb CC e Hb SC

As hemoglobinas S e C tendem a se cristalizarem devido às suas mutações ocorridas por substituições do mesmo aminoácido da globina beta, o ácido glutâmico (Glu) na posição nº 6 (Hb S: Glu à Valina e Hb C= Glu à Lisina). Os cristais da Hb CC se condensam numa determinada região do eritrócito, deixando o restante da célula totalmente desglobinizada. 101

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Entretanto, o, a forma mais comum de identificar a cristalização da Hb CC é por meio da análise do esfregaço onde a condensação da Hb C deforma o eritrócito e se concentra gradativamente numa parte da cédula (figura figura 40). 40

Figura 40. Sangue periférico de paciente com hemoglobina CC. Dois eritrócitos iniciam o processo de cristalização da Hb C, com deformações alongadas e condensação de Hb C para uma área da célula.

A cristalizações da Hb CC e da Hb SC não são observadas em todos os pacientes com esses genótipos, e em alguns após exaustiva pesquisa citológica. Os heterozigotos AC e AS não têm cristalizações de hemoglobinas. Na anemia falciforme (Hb SS), os cristais de Hb S são visíveis por microscopia de interferência de fase (figura ( 41).

Figura 41. Cristais de Hb S, na anemia falciforme por microscopia de interferência de fase.

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Eritrócitos em "roleaux" e aglutinados

Geralmente ocorrem dúvidas relacionadas à distinção entre eritrócitos em "roleaux" (figura ( 42) e aglutinados (figura 43).

Figura 42. Sangue periférico de paciente com a doença mieloma múltiplo, destacando no centro da foto um plasmócito, e a disposição dos eritrócitos em "roleaux".

Figura 43. Sangue periférico de paciente com anemia hemolítica auto-imune, auto imune, provocando maciça aglutinações eritrocitárias.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Para considerar ambos os casos, as anormalidades devem estar presentes em toda a extensão do esfregaço, pois se estiver em apenas uma parte dele é indicativo de artefato técnico. Os eritrócitos em "roleaux", quando distribuídos uniformemente ao longo da lâmina l indicam a presença de uma paraproteína com concentração elevada, como são freqüentes nos casos de mieloma múltiplo e macroglobulinemia. Denomina-se Denomina se por paraproteínas uma proteína plasmática (beta ou gama globulina anormal) produzida por um clone neoplásico neop de células plasmáticas. Na aglutinação dos eritrócitos ocorre a agregação de grupos de células ao acaso, na presença de vários anticorpos eritrocitários. A auto-aglutinação auto aglutinação ocorre quando os eritrócitos de uma pessoa aglutina na presença de seu próprio plasma ou soro que contém aglutininas específicas não conhecidas pelos receptores eritrocitários. Algumas vezes a auto-aglutinação auto aglutinação é vista em sangue de pessoas aparentemente normais, porém sua presença é mais freqüente na vigência de certas anemias hemolíticas, pneumonias atípicas, infecções por estafilococos e tripanosomas. Outra situação que pode ocorrer a autoaglutinação é na presença de aglutininas estimuladas a frio (10 a 20oC), fato que induz a atividade dos anticorpos.

Alterações do Conteúdo o da Hemoglobina

Eritrócitos com conteúdo normal de hemoglobina têm um centro claro que ocupa 1/3 do diâmetro da célula. Essas células são denominadas por normocrômicas, observando que há discreta variação na intensidade no seu halo claro central, que variam entre as diferentes partes de um esfregaço. Quando há diminuição da concentração de hemoglobina, o halo claro central aumenta de intensidade e de tamanho, caracterizando ahipocromia a (figura 44). ). A hipocromia é causada por diminuição da síntese da hemoglobina devido a duas principais situações patológicas: deficiência de ferro grave, anemia sideroblástica e talassemias (ver capítulos "Anemias" e "Talassemias"). A hipocromia freqüentemente está associada à microcitose,, porém há casos em que está associada à normocitose como ocorrem na artrite reumatóide, infecções crônicas e processo inflamatório.

Figura 44. Sangue periférico de paciente com anemia ferropriva grave (Hb: 5,8 g/dl). Nota-se Nota anisopoiquilocitose acentuadas, com micrócitos, dacriócitos e esquisócitos, associadas a intenso grau de hipocromia.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A anisocromia é a designação que se dá para descrever a variação do conteúdo de hemoglobina quando eritrócitos normocrômicos e hipocrômicos estão presentes conjuntamente. Exemplo de anisocromia é a anemia nemia sideroblástica, onde células hipocrômicas e normocrômicas são vistas, indicando que a medula óssea está produzindo duas populações de células. Outras situações em que ocorre a anisocromia são os casos em que pacientes com anemia hipocrômica recebem transfusões ransfusões de eritrócitos normais (figura ( 45).

Figura 45. Sangue periférico de paciente com Hb C/associada a talassemia beta, após receber transfusão de eritrócitos. Presença de aniso-poiquilocitose aniso poiquilocitose com eritrócitos normais, esquisócitos, codócitos e células mordidas, associadas à anisocromia.

A hipercromia ocorre quando a concentração da hemoglobina corpuscular médica (CHCM) está acima da normalidade. Assim, é possível visualizar os eritrócitos bem corados, sem o halo claro no centro da célula. A hipercromia hipercromia está quase sempre relacionada à esferocitose, quer seja hereditária ou adquirida (anemias hemolíticas causadas por queimaduras graves (figuras ( 31 e 46).

Figura 31. Sangue periférico de paciente que sofreu queimaduras graves. Os eritrócitos apresentam aniso-poiquilocitose poiquilocitose acentuada, com presença de microesferócitos de diferentes tamanhos, além de células fragmentadas.

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Figura 46. Sangue periférico de paciente com anemia esferocítica hereditária (esferocitose), com anisocitose pela presença dee normocitose e micro-esferócitos, micro associada a hipercromia (CHCM: 36 g/dl).

A policromasia ocorre quando os eritrócitos são maiores e há excesso de coloração, com tendência à cor cinza (nos corantes de rotina hematológica), conforme mostra a figura 47. Se deve a remanescentes de material ribossômico devido à reticulocitose e atividade eritropoiética elevada.

Figura 47. Sangue periférico de paciente com anemia hemolítica, com presença de policromasia (células centrais). A contagem de reticulócitos na ocasião da análise era de 17%.

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Inclusões Eritrocitárias

Normalmente os eritrócitos não contêm inclusões, entretanto muitas inclusões diferentes podem ser vistas em várias doenças hematológicas. Inclusões que se desenvolvem nos eritrócitos, devido a certos rtos tipos de anemias, podem ser visíveis por corantes da rotina hematológica como são os casos de corpos de Howel-Jolly, Howel Jolly, anel de Cabot, pontilhado basófilo. Corpos de Pappenheimer, siderócitos, sideroblastos, inclusões de Hb H e corpos de Heinz são visualizados visual com corantes específicos. Por outro lado, há as inclusões adquiridas como o Plasmodium e Bartonella.

Corpos de Howell-Jolly

Os corpos de Howell-Jolly Jolly são fragmentos nucleares arredondados, de tamanho pequeno ou médio, com tamanho próximo de 1 mm, resultantes da desintegração do núcleo dos eritrblastos ortocromáticos (figura 48). ). Coram-se Coram se pelos corantes da rotina hematológica em cor púrpurapúrpura escura. Pelo fato de reagirem positivamente à reação de Feulgen (teste usado para DNA em cromatina nuclear), presume-se se que os corpos de Howell-Jolly Howell Jolly contenham DNA.

Figura 48. Sangue periférico de paciente com esteatorréia e atrofia do baço. No centro da foto há um eritroblasto ortocromático, e diagonalmente a esta célula há dois eritrócitos com corpos de Howell-Jolly Jolly bem visíveis. Os acantócitos se devem à esteatorréia.

A presença de corpos de Howell-Jolly Howell Jolly é comum em pacientes esplenectomizados com anemia hemolítica, isto porque essas inclusões são retiradas dos eritrócitos ao passarem pelo SRE do baço. Na anemia ia falciforme, podem ser vistos após a ocorrência de fibrose esplênica (ver capítulo "Células Falciformes"). Outras anemias podem apresentar corpos de Howell-Jolly: Howell anemias hemolíticas em geral, anemia megaloblástica, em numerosos casos de estearrotéia com atrofia esplênica. 107

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Anel de Cabot O anel de Cabot aparece no eritrócito como estrutura anelada, ou dobrada em forma de oito (figura 49). ). Sua origem se deve a material remanescente dos microtúbulos do citoplasma dos eritroblastos, especialmente de RNA ribossômico. Os anéis de Cabot podem aparecer em eritrócitos de pacientes com anemia megaloblástica, outras anemias graves (falciforme, talassemia maior), intoxicação por chumbo, e na disseritropoiese em que os eritrócitos são destruídos antes de serem liberados erados da medula óssea. Por vezes, um mesmo eritrócito com anel de Cabot pode incluir também pontilhados basófilos ou corpos de Howell-Jolly. Howell Jolly.

Figura 49. Sangue de paciente com anemia megaloblástica tratada mostrando um eritrócito com anel de Cabot dobrado na forma de oito.

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Pontilhados basófilos São grânulos pequenos e irregulares, ou esféricos, de cor azul, às vezes muito escuros. Podem ser finos e amplamente distribuídos nos eritrócitos, ou grosseiros e em menor número próximo à membrana dos eritrócitos (figuras figuras 50 e 51).

Figura 50. Sangue periférico de portador de talassemia beta heterozigota, com dois eritrócitos com pontilhados basófilos grosseiros.

Figura 51. Sangue periférico de paciente com anemia megaloblástica. Observa-se Observa se a presença de dois megaloblastos anormais, com núcleo em forma de roseta e com pontilhados basófilos no citoplasma.

A presença de pontilhados basófilos é indicativa de eritropoiese acentuada, sem tempo adequado para maturação dos eritrócitos. A ocorrência está está associada notadamente às anemias causadas por defeitos na síntese de hemoglobina, talassemias, intoxicações por chumbo, alcoolismo e drogas citotóxicas. 109

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Corpos de Pappenheimer São pequenos corpúsculos arredondados, compostos por grânulos sideróticos, irregulares e escuros, identificados por corantes da rotina hematológica (figuras ( 52 e 53). 53 Com coloração específica de azul da Prússia, esses corpúsculos se coram positivamente, fato que indica presença de ferro. Normalmente o número de inclusões por eritrócitos eritrócitos não supera a três. O SRE do baço geralmente removem os corpos de Pappenheimer, por isso é mais fácil visualizá-los visualizá em pacientes esplectomizados, ou com baixa ação esplênica (hipoesplenismo). A ocorrência desses corpúsculos é freqüente na anemia sideroblástica, sideroblástica, ocorre também na talassemia beta maior, anemias refratárias e nas anemias diseritropoiéticas.

Figura 52. Sangue periférico de paciente esplenectomizado, com anemia sideroblástica adquirida. O esfregaço apresenta anisopoiquilocitose, presença de micrócitos, dacriócitos, esquisócitos, hipocromia acentuada, e um eritrócito com corpos de Pappenheimer.

Figura 53. Sangue periférico de paciente esplenectomizado, com deficiência de piruvato quinase. Há presença de corpos de Pappenheimer em todos os eritrócitos, com grande diversidade de formas de inclusões.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Siderócitos e sideroblastos Siderócitos são eritrócitos contendo grânulos de ferro não-heme não (figura 54), ), formados por um complexo de ferro-férrico férrico (Fe+++), lipídeos, proteínas e carboidratos, insolúvel em água. Em pessoas saudáveis é possível visualizar grânulos sideróticos em preparação com corantes azul da Prússia (corante de Perl) dentro de alguns poucos eritroblastos obtidos por punção medular, na proporção 1 ou 2 grânulos por célula. Entretanto, Entretanto, nas anemias sideroblásticas há muitos eritroblastos com vários grânulos caracterizando os sideroblastos (figura figura 55). 55 A presença de siderócitos nos eritrócitos de sangue periférico ocorre nos vários tipos de anemias sideroblásticas (hereditária e adquirida), adquirida), porém nas análises de sangue medular a identificação dos sideroblastos e mais sensível.

Figura 54. Sangue periférico de paciente com anemia sideroblástica adquirida por alcoolismo. Há vários eritrócitos com siderócitos corados com azul de Prússia. É possível observar um macrócito típico de alcoolismo.

Figura 55. Sangue de medula óssea corado com azul de Prússia, mostrando dois seroblastos com vários grânulos, num caso de anemia sideroblástica hereditária.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Hemoglobina H – Hb H

A precipitação intra-eritrocitária eritrocitária de corpúsculos de Hb H se deve ao desequilíbrio da síntese de globinas alfa (que estão diminuídas) e de globinas beta (que estão normais). As globinas beta se tetramerizam em complexos de globina b4, formando moléculas instáveis áveis de hemoglobinas conhecidas por Hb H. Assim, a presença de Hb H é indicativo de talassemia alfa (ver capítulo "Alterações Eritrocitárias nas Talassemias"). A forma de precipitação de Hb H se caracteriza por múltiplos corpúsculos homogeneamente distribuídos nos eritrócitos (figura ( 56), ), mas que por microscopia eletrônica de varredura é possível avaliar a deformação do eritrócito com Hb H (figura ( 57).

Figura 56. Sangue periférico de paciente com talassemia alfa (doença de Hb H, com três genes alfa alf afetados). Nesta patologia há profusão de eritrócitos com precipitados de Hb H, que se parecem com bolas de golfe.

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Figura 57. Microscopia eletrônica de varredura de eritrócito com precipitado de Hb H. A deformação do eritrócito é muito intensa, provocando sua retirada precoce pelos macrófagos do SRE.

A ocorrência de precipitados de Hb H está associada a talassemias alfa hereditária e adquirida. Na forma hereditária, há grande diversidade de alterações clínicas e hematológicas, pois está na dependência dência do número de genes alfa afetados no processo de síntese da globina alfa. Para entender melhor esta diversidade, sugiro a leitura do capítulo "Alterações Eritrocitárias nas Talassemias". Na forma adquirida, a presença de Hb H está relacionada às drogas drog quimioterápicas usada no tratamento de cânceres, linfomas e leucemias. A coloração específica para identificar a Hb H intra-eritrocitária intra eritrocitária é o azul de crezil brilhante a 1% (ver capítulo "Técnicas Laboratoriais).

Corpos de Heinz

Os corpos de Heinz se caracterizam aracterizam por precipitados de um ou mais corpúsculos esféricos e escuros, de tamanhos variados, geralmente agregados à membrana (figuras (figuras 58 e 59). Em pacientes esplenectomizados, os corpos de Heinz são grandes e visíveis. A identificação dos corpos de Heinz inz somente é possível com coloração supravital de azul de crezil brilhante a 1% e violeta de metil a 1% (ver capítulo "Técnicas Laboratoriais").

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Figura 58. Sangue periférico de paciente com Hb instável (Hb Koln), corado com azul de crezil brilhante a 1% por 40 minutos, a 37oC. Todos os eritrócitos têm precipitados da Hb Koln que é instável aos corantes redox

Figura 59. Microscopia eletrônica de um eritrócito com vários corpos de Heinz agregados à membrana. A agregação desses precipitados causa a oxidação oxidação das lipoproteínas, alterando-lhe alterando a forma e facilitando a fagocitose por macrófagos do SRE.

A precipitação de corpos de Heinz é decorrente de processos oxidativos induzidos ou espontâneos que afetam a molécula de hemoglobina oxigenada (oxi-Hb). (oxi Hb). A oxidação oxidaç da oxi-Hb transforma-aa em metahemoglobina que se degrada em subcompostos – os hemicromos (sulfa(sulfa hemoglobina), culminando com a desagregação das globinas alfa e beta, que se precipitam e deformam o eritrócito (figura figura 60). 60 Informações detalhadas sobre essee processo pode ser encontrada nos capítulos "Radicais Livres e Danos Eritrocitários" e "Células Falciformes".

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Figura 60. Microscopia eletrônica de varredura de um eritrócito com corpos de Heinz se projetando e deformando o eritrócito.

As principais formas da indução de corpos de Heinz se devem a: a) causas adquiridas por medicações oxidantes (ex.: sulfas, hidrazinas), ou por contaminação ambiental (poluentes oxidantes); b) causas hereditárias por Hb instáveis, metahemoglobinemias hereditárias, deficiências ências de enzimas (G6PD, SOD, catalase, GPx). Destaque especial deve ser dada à formação de corpos de Heinz nas Hb instáveis. instáveis As hemoglobinas instáveis foram descritas pela primeira vez por Dacie em 1960, e a partir desta data mais de 300 tipos diferentes foram descritos em todo o mundo. São hemoglobinas variantes, causadas geralmente por mutações recentes que atingem determinado membro de uma família e sem que um dos pais apresentassem a alteração. Por essa razão são conhecidos por "fresh mutation". Os portadores tadores de Hb instáveis apresentam as manifestações clínicas da doença, bem como as alterações laboratoriais, após processos indutores que facilitam a oxidação da hemoglobina variante, tais como: febre alta, medicações oxidantes, infecções por vírus (provavelmente velmente relacionadas com febres altas). A partir do processo que desencadeia a oxidação da Hb instável, o portador padece de anemia hemolítica crônica de graus variáveis entre discreto (Hb 10,0 g/dl) a grave (Hb: 4 g/dl), esplenomegalia em 80% dos casos, icterícia, cianose (devido à elevação da metahemoglobina), hepatomegalia em crianças, e necessidade de reposição de sangue. O desencadeamento fisiopatológico da doença se deve à oxidação da Hb instável, que pode ser originada por uma ou mais mutações na globina globina alfa ou beta. As mutações que ocorrem na globina beta causam lesões oxidativas mais intensas, com maior grau de anemia. As mutações das hemoglobinas instáveis acontecem na região ou superfície interna da molécula de hemoglobina, envolvendo quase sempre sempre aminoácidos hidrofóbicos e com ponto isoelétrico neutro. A mudança de um aminoácido por outro diferente afrouxa a proteção que realiza ao grupo heme, fato que permite a entrada da água e a oxidação do ferro e, conseqüentemente da hemoglobina. Essa oxidação ção causa excessiva formação de metahemoglobina da Hb instável que se instabiliza, desagregando o tetrâmero a2b2 com precipitação da globina que contém a mutação. A globina precipitada é que forma os corpos de Heinz visíveis nas microscopias ópticas (figura 58)) e eletrônica (figuras ( 59 e 60). ). A deformação dos eritrócitos com corpos de Heinz inicia-se se com a alteração da proteína banda 3 da membrana eritrocitária, que induz a reação com o complemento e, conseqüentemente, ao passar pelo SRE do baço se tornam alvos a preferenciais dos macrófagos (figura ( 61). ). A macrofagocitose retira partes dos eritrócitos, deixando-os os deformados em esquisócitos e células mordidas (figura ( 36), ), e com a sobrevida diminuída – principal causa da hemólise e anemia. 115

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Figura 36. Célula mordida em sangue periférico de paciente com corpos de Heinz causado pela deficiência de G-6-PD.

Figura 61. Microscopia eletrônica de varredura mostrando a fagocitose de eritrócitos com corpos de Heinz no SRE do baço, em sangue de pessoa com Hb instável (Hb Koln).

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Laboratorialmente as hemoglobinas instáveis apresentam-se apresentam se com reticulocitose aumentada (alguns casos chegam a 70%), precipitação da Hb instável ao calor (37oC a 50oC), além da anemia que pode ser geralmente normocítica (VCM normal) e hipocrômica. hipocrômic As alterações morfológicas se caracterizam por aniso-poiquilocitose, aniso poiquilocitose, policromasia e hipocromia de intensidades variáveis. A pesquisa de corpos de Heinz com azul de crezil brilhante é sempre positiva. Eletroforeticamente a Hb instável geralmente apresenta apresenta a mesma mobilidade da Hb A (devido à mutação entre os aminoácidos não envolver diferença de carga elétrica). Porém, é possível observar nos casos de mutações de globina beta a presença de globinas alfa livres (figura 62).

Figura 62. Eletroforese de hemoglobina em acetato de celulose mostrando a Hb Koln como um rastro entre a Hb S e Hb A2 (asterisco), além da disposição difusa da globina alfa livre (seta).

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Inclusões de parasitas em eritrócitos Três importantes inclusões de parasitas em eritrócitos são causas de anemias hemolíticas, tratam-se da malária, babesiose e bartolenose. Malária: é uma protozoose com ampla distribuição mundial, notadamente nas regiões tropicais e temperadas. A infecção é transmitida pelo mosquito que serve como vetor de quatro espécies do gênero Plasmodium: P. vivax, P. falciparum, P. malariae e P. ovale.. As infecções devido ao P. falciparum (figura 63)) e P. vivax (figura 64) são as mais comuns. O P. falciparum é o responsável pela maior parte dos indivíduos afetados por malária em todo o mundo, incluindo o Brasil. O P. vivax causa infecções capazes de causarem a morte do portador. O ciclo vital da malária tem início na fêmea do mosquito, após obter sangue humano por meio da picada, oportunidade em que as formas sexuadas (gametócitos) (gametócitos) evolui para as formas infecciosas (esporozoitos). São as formas infecciosas que são injetadas em outros indivíduos através da picada do inseto. Os esporozoitos passam para as células do parênquima hepático onde se multiplicam e dividem, produzindo produz merozoitos nessa fase pré-eritrocítica. eritrocítica. Quando a célula hepática se rompe, os parasitas penetram nos eritrócitos, e suas presenças são possíveis de serem identificadas pela forma anelada (figuras ( 63 e 64). ). A evolução do ciclo vital do plasmódio no eritrócito trócito produz transformações (merozoito) até se tornar maduro (esquizonte). As figuras 65 e 66 mostram essa fase madura do plasmódio. Na análise laboratorial, o P. falciparum se caracteriza por parasitemia maciça com pequenas formas aneladas com duplos grânulos gr de cromatina; os gametócitos têm a forma de banana ou elíptica. Nas infecções por P. vivax, os eritrócitos são grandes (reticulócitos), com grânulos de Schuffner oriundos de microtúbulos degradados.

Figura 63. Sangue periférico de paciente com malária causada por P. falciparum. falciparum A foto mostra a forma anelada com duplo grânulo de cromatina.

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Figura 64. Sangue periférico de paciente com malária causada por P. vivax. Devido à anemia hemolítica grave, os reticulócitos estão em quantidade elevada no sangue periférico e são alvos preferenciais da parasitose. A figura mostra um grande eritrócito (reticulócito) com forma anelada, com grânulos de Schuffner.

Figura 65. Sangue periférico de paciente com malária causada por P. falciparum. O eritrócito parasitado sitado mostra a fase madura do plasmódio (esquisonte) com distribuição de merozoitos.

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Figura 66. Microscopia eletrônica de varredura de sangue infectado por P. falciparum. A foto mostra a fase madura (esquisonte) com vários merozoitos no interior, em dois dois eritrócitos que estão se rompendo (hemólise).

Babesiose: doença transmitida por carrapatos e causada por parasitas do gênero Babesia. É comum em numerosas espécies animais, e ocasionalmente é transmitida ao homem. Os pacientes são afetados por febre, mal-estar, mialgia, hepato-esplenomegalia, esplenomegalia, e discreto grau de anemia hemolítica. Pessoas esplenectomizadas podem padecer de infecção grave da babesiose, muitas vezes letal. O diagnóstico laboratorial é feito no sangue periférico, da mesma forma como se procede cede na malária, pela presença de formas aneladas semelhantes a halteres nos eritrócitos. Esta infecção é freqüente no continente africano, e raríssima no Brasil. Bartonelose: é uma doença caracterizada por anemia hemolítica febril de grau acentuado, e ocorre rre com maior freqüência entre os habitantes da cordilheira dos Antes: Peru, Colômbia e Equador. A Bartonella bacilliformis é uma bactéria cocobacilar encontrada no interior dos eritrócitos de pessoas infectadas. A doença é conhecida como febre de Oroya ou doença de Carrión, e é transmitida pelo mosquito Phlebotomus.

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AS ANEMIAS As Anemias

Introdução Anemia é um nome de origem grega, em que aima significa sangue e an indica falta de. Assim, anaima é a raiz do nome anemia, que no idioma grego significa falta de sangue. É um termo milenar, muito usado na medicina grega desde Hipócrates.. Atualmente, anemia é usado para pessoas que apresentam a concentração da hemoglobina diminuída: abaixo de 12,5 g/dl no homem, abaixo de 11,5 g/dl na mulher, e abaixo de 11,0 11,0 g/dl em crianças. É importante destacar que os valores acima apresentados podem diferir discretamente entre autores de livros, bem como entre diferentes países, e entre regiões de um mesmo país. A manifestação clínica da anemia também é variável. Em pessoas com valores de hemoglobina entre 9 e 10 g/dl , ela pode estar associada a uma discreta falta de ar, palpitações (taquicardia), e sudoração após exercícios. Quando a anemia se torna mais grave (Hb < 9 g/dl), esses sintomas são mais intensos, e a capacidade acidade de trabalho diminui. Nesses casos, a falta de ar é acentuada, bem como a taquicardia, além da dor de cabeça aos menores esforços. A palidez é visível quanto maior o grau da anemia. Outros sintomas e sinais que aparecem têm uma base fisiológica e inclui: a. b. c. d. e. f. g.

retenção de sódio suficiente para causar edema; perda de apetite; indigestão, devido à limitação do fornecimento de oxigênio às células intestinais; fraqueza e mal estar geral; tontura; síncopes ocasionais por comprometimento da regulação vasomotora; sintomas e hipóxia do sistema nervoso central que incluem: insônia e incapacidade de raciocínio; h. em idosos pode causar angina ou insuficiência cardíaca, disfunção gastrointestinal e muita fraqueza.

Classificação Laboratorial das Anemias Laboratorialmentee as anemias são classificadas pelos valores quantitativos dos índices eritrocitários: contagem de eritrócitos ou glóbulos vermelhos (GV), hematócrito (Ht), hemoglobina (Hb), volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), e concentração ão da hemoglobina corpuscular média (CHCM). Esses valores indicam três grupos de anemias: normocítica/normocrômica; microcítica/hipocrômica; macrocítica/normocrômica. Na realidade, os índices que indicam esses valores são o VCM e HCM, conforme os exemplos que se seguem:

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Exemplo 1:: homem sem anemia GV: 5.000.000/mm3 (ou 5,0 x 106/mm3) Ht: 45% Hb: 15 g/dl VCM: 90 fL HCM: 30 pg CHCM: 33 g/dl Exemplo 2:: Homem com anemia microcítica/hipocrômica GV: 5,0 x 106/mm3 (normal) Ht: 38% (diminuído) Hb: 12 g/dl (diminuído) VCM: 76 fL (diminuído) HCM: 24 pg (diminuído) CHCM: 31,5 g/dl (normal) Exemplo 3:: Homem com anemia microcítica/hipocrômica GV: 3,9 x 106/mm3 (diminuído) Ht: 28% (diminuído) Hb: 7,3 g/dl (diminuído) VCM: 71 fL (diminuído) HCM: 18 pg (diminuído) CHCM: 26 g/dl (diminuído) Exemplo 4:: Homem com anemia macrocítica/normocrômica GV: 3,9 x 106/mm3 (diminuído) Ht: 39% (diminuído) Hb: 10,6 g/dl (diminuído) VCM: 100 fL (aumentado)

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP HCM: 27 pg (normal) CHCM: 27 g/dl (normal) Exemplo 5:: Homem com anemia normocítica/normocrômica normoc GV: 3,5 x 106/mm3 (diminuído) Ht: 27% (diminuído) Hb: 9,5 g/dl (diminuído) VCM: 77 fL (normal HCM: 29 pg (normal) CHCM: 36 g/dl (normal) Diante dos cinco exemplos apresentados, é possível concluir que a classificação laboratorial das anemiasse se faz por meio dos índices VCM e HCM, conforme mostra a tabela 1. 1 Entretanto, é importante destacar que embora essa classificação tenha como base os valores quantitativos, é fundamental que se descreva pela análise do esfregaço a morfologia dos eritrócitos. Tomaremos o exemplo 5 (anemia normocítica/normocrômica). A análise da morfologia eritrocitária deste caso mostrou que os eritrócitos apresentavam-se apresentavam com anisocitose dimórfica,, caracterizada pela concomitância de eritrócitos microcíticos e macrocíticos, macr e por anisocromia (figura 1). A tabela 2 relaciona as principais doenças que causam as anemias microcíticas e hipocrômicas, macrocíticas e normocrômicas e normocíticas e normocrômicas. Tabela 1. Classificação laboratorial das anemias. Microcítica Hipocrômica

Macrocítica Normocítica Normocrômica Normocrômica

VCM*

< 77 fL

> 92 fL

77-92 fL

HCM**

< 27 pg

27-32 pg

* Os valores de VCM variam entre os laboratórios, há quem os consideram 80 fL como valor mínimo e 95 fL como valor máximo. ** Os valores de HCM também variam entre laboratórios, há quem os consideram 28 pg como valor mínimo.

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Figura 1. Esfregaço de sangue periférico de paciente com anemia hemolítica autoimune, reticulocitose (macrócitos com policromasia) e micro-esferócitos. micro A avaliação dos valores numéricos (GV, Ht e Hb) resultaram em índices VCM e HCM normais, caracterizando anemia normocítica e normocrômica,, com evidente alterações morfológicas de tamanho, forma e coloração eritrocitária.

Tabela 2. Principais causas de anemias anemias microcítica/hipocrômica, macrocítica/normocrômica e normocítica/normocrômica. TIPO DE ANEMIA

CAUSAS a) deficiência de ferro a) talassemias

Microcítica/Hipocrômica

a) anemia sideroblástica hereditária b) anemia de doença crônica b) hemoglobinopatias (Hb SS, /tal.α, etc.) a) deficiência de ácido fólico a) deficiência de vitamina B12

Macrocítica/Normocrômica

b) anemia hipoproliferativa b) anemia refratária b) doenças hepáticas b) anemia hemolítica b) hemorragias

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP a) anemia hipoproliferativa a) anemia mielotísica a) anemia hemolítica a) hemoglobinopatias (Hb SS, Hb SC, Hb instáveis, etc.) Normocítica/Normocrômica a) hemorragias a) anemia de doenças crônicas a) anemia sideroblástica adquirida b) início da deficiência de ferro b) anemia refratária (a) situações comuns; (b) situações ocasionais.

Classificação etiológica das Anemias A classificação etiológica das anemias considera os principais mecanismos fisiopatológicos envolvidos como causas de anemias. Entretanto, há evidentes dificuldades para agrupar as anemias sob o ponto de vista etiológico, pois se devem a múltiplos fatores. Por exemplo, a deficiência de ferro numa pessoa pode estar também associada à deficiência de folatos. Dessa forma, a classificação etiológica gica classifica as diferentes causas de anemias em cinco grupos:

Anemia Relativa Se deve basicamente ao aumento do volume do líquido plasmático no sangue, e as principais origens relacionadas são: gestação, hiperproteinemia e fluidos intravenosos.

Anemia a Associada com Deficiência na Síntese de Hemoglobina

Deficiência de ferro: se deve à perda excessiva (ex.: hemorragias), ao aumento de sua utilização (ex.: maioria dos processos anêmicos); carência alimentar; absorção defeituosa. Anemia sideroblástica hereditária: a principal causa é o defeito enzimático na síntese de ALA sintetase, cujo gene está ligado ao cromossomo X. 125

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Anemia das doenças crônicas: se deve principalmente à deficiência na utilização de ferro, como ocorre nas infecções, inflamações e neoplasias. neo Talassemias: é um conjunto de situações clínicas e hematológicas que se caracterizam pelo desequilíbrio na síntese das globinas alfa e beta. A diminuição da síntese de globina alfa origina a talassemia alfa, enquanto que a diminuição da síntese de globina beta causa a talassemia beta.

Anemia Associada com o Desequilíbrio Funcional da Medula Óssea

Lesão no tecido hematopoiético: pode ser de origem desconhecida, causando a anemia aplástica pura da série vermelha; vermelha ou por indução efetuadas por drogas, s, radiações, compostos químicos e agentes infecciosos, dando origem à anemia aplástica secundária ou pancitopênica. Substituição do tecido medular: se deve a infiltrações por células leucêmicas, linfomas, mieloma, câncer metastático e mielofibrose. Hematopoiese poiese inefetiva (insuficiente): a principal causa ocorre por defeitos de proliferação e maturação da célula pluripotencial primitiva, ou célula tronco hematopoiética. Como resultado surgem as anemias mielodisplásicas, mielodisplásicas das quais fazem parte as seguintes patologias: tologias: • • • •

anemia refratária anemia refratária com sideroblastos em anel anemia refratária com excesso de blastos anemia refratária com excesso de blastos em transformação

Diminuição do estímulo eritropoiético: se deve especificamente à deficiência de eritropoietina, tal como na anemia por insuficiência renal, anemia por doenças endócrinas, e nas anemias por doenças crônicas. Anemia aplástica constitucional: neste grupo inclui anemias herdadas, do tipo autossômico recessivo, que predispõe à insuficiência insuficiência do tecido hematopoiético. As principais formas de anemias deste grupo são: anemia de Fanconi (aplasia pacitopênica), anemia de DiamondDiamond Blackfan (aplasia pura da série vermelha), e anemia aplástica familiar. Anemia aplástica adquirida: afeta somente os eritrócitos itrócitos (anemia pura da série vermelha), causada por agentes virais, e supressão imunológica (como a que ocorre no timoma). Hemoglobinúria paroxística noturna: é uma doença adquirida que afeta a célula pluripotencial primitiva, produzindo eritrócitos, leucócitos leucócitos e plaquetas anormais. A principal anormalidade desta doença se deve à dificuldade da célula em produzir a síntese de uma proteína de membrana: glicosilfosfatidilinositol (GPI), causando hemólise induzida pela queda do pH sangüíneo.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Anemia Associada iada com a Diminuição da Sobrevida dos Eritrócitos e Aumento da sua Destruição

Há dois grandes grupos de causadores de anemias, um associado à diminuição da sobrevida média dos eritrócitos e outro com o aumento da sua destruição. No primeiro grupo estão relacionadas as anemias hereditárias por defeito de membrana, enzimopatias eritrocitárias, eritrocitárias ehemoglobinopatias hemoglobinopatias & talassemias. talassemias No segundo grupo incluem as anemias hemolíticas adquiridas do tipo imune e não imune. Anemia por defeitos na membrana TIPO

CAUSA

Esferocitose

Defeito estrutural

Eliptocitose

Defeito estrutural

Estomatocitose

Defeito estrutural

Piropoiquilocitose

Defeito estrutural

Acantocitose

Abetalipoproteinemia

Defeito lecitina – colesterol transf.

Defeito do colesterol

Hbnúria paroxística noturna

Sensibilidade a complemento

Enzimpatias hereditárias TIPO

CAUSA

Deficiência de G6PD

Lesões oxidativas

Deficiência de piruvato quinase

Alterações na geração de ATP

Deficiência de anti-oxidantes anti (*)

Lesões oxidativas

* (SOD, GPPx, Catalase, MetaHb-redutase) Hemoglobinopatias & Talassemias TIPO

CAUSA

Hb S – Doenças falciformes

Mutação de aminoácido da globina beta

Hb C

Idem

Hb instáveis

Idem: globinas alfa ou beta

Hb M

Idem: globinas alfa ou beta

Talassemia beta

Deficiência de globina beta

Talassemia alfa

Deficiência de globina alfa

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Hb S/talassemia beta

interação das causas acima

Hb SS/talassemia alfa

Idem

Hb C/talassemia beta

Idem

Anemias Hemolíticas Adquiridas -Tipo Imune Todas as anemias abaixo listadas se devem a destruição eritrocitárias por reações imunológicas. TIPO

CAUSA

Doença hemolítica do RN

Isoimune

Reações transfusionais

Isoimune

Anticorpos quente

Auto imune

Anticorpos frio

Auto imune

Reações a drogas

Indução imunológica

Anemias Hemolíticas Adquiridas -Tipo Não-Imune As anemias hemolíticas adquiridas do tipo não-imune não imune são causadas por vários fatores, tal como se segue: TIPO

CAUSA

Coagulação intravascular disseminada (a)

Destruição por deposição de fibrina

Púrpura trombocitopênica

Idem

Trombótica (a)

Idem

Síndrome hemolítica urêmica (a)

Idem

Hemólise por infecções

Bacterianas e virais

Hemólise da malária

Protozoários (plasmódios)

Hemólise tóxica

Drogas, agentes químicos

Hemólise física

Próteses vasculares, queimaduras

Hemólise física

Hbnúria da marcha

Hiperesplenismo

Destruição prematura dos eritrócitos no baço

Estão stão incluídas no grupo das anemias hemolíticas microangiopáticas Anemia Secundária à Perda de Sangue Se deve às hemorragias crônicas a agudas, cujo volume de sangue perdido induzirá o processo anêmico.

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ALTERAÇÕES ERITROCITÁRIAS NOS DEFEITOS DE MEMBRANA Alterações Eritrocitárias nos defeitos de Membrana

Introdução O esqueleto da membrana dos eritrocitários é responsável pela preservação da forma e da integridade celular. A membrana normal normal é composta por igual quantidade de lipídeos e proteínas (ver capítulo "Principais Principais Componentes dos Eritrócitos"). Eritrócitos"). As anormalidades de membrana que resultam em anemia hemolítica são devido a alterações de uma ou mais proteínas estruturais. Os lipídeos da membrana, bem como o sistema de transporte de cátions, podem estar alterados e, conseqüentemente, produzir defeitos no funcionamento da membrana. Todas essas três anormalidades (proteínas, lipídeos e sistema de transporte de cátions) alteram a superfície de área da membrana, aumento de sua rigidez, fragmentação ou deformação. Os eritrócitos anormais apresentam dificuldades no trânsito vascular vas do baço (figura 1). ). As doenças causadas por anormalidades de membrana incluem: esferocitose hereditária, eliptocitose hereditária, piropoiquilocitose hereditária e estomatocitose hereditária.

Figura 1. Corte histológico do baço de paciente com esferocitose, esferocitose, examinado em microscopia eletrônica de varredura. Os eritrócitos esferocíticos perdem a deformabilidade e apresentam dificuldade em transitar pelos sinusóides vasculares. Os macrófagos do SRE atuam, fagocitando-os fagocitando e retirando-os retirando precocemente da circulação sangüínea.

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Esferocitose Hereditária A esferocitose hereditária (EH) é uma doença hereditária, distinguida pela presença de numerosos microesferócitos no esfregaço de sangue periférico (ver capítulo "Principais Alterações Morfológicas dos Eritrócitos"). A herança genética da EH é geralmente autossômica dominante, e a forma mais comum é a heterozigose. O estado de homozigose parece ser incompatível com a vida. Vários casos são freqüentemente encontrados em uma mesma família. Em 25% dos casos da EH, ambos os pais não estão afetados: afetados: isto pode ser resultante de uma mutação espontânea, ou da forma recessiva da doença, ou de reduzida penetrância do gene dominante. A prevalência da EH é muito variável entre as populações 1:500 a 1:1000 no Brasil, a 1:5000 no norte da Europa. A anormalidade básica da EH se deve a defeitos heterogêneos na composição protéica da membrana, que pode envolver deficiência ou disfunção de espectrina, anquirina, banda 3 e proteína 4.2 (figura 2).

Figura 2. Interações horizontal zontal (azul) e vertical (cinza) dos defeitos de membrana. Defeitos das proteínas do sentido vertical são vistos na esferocitose hereditária. Defeitos no sentido horizontal ocorre mais freqüentemente na eliptocitose e piropoiquilocitose hereditária.

130

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Fisiologicamente, as alterações que causam a esferocitose diminuem a camada fosfolipídica e altera a área superficial da membrana. Esse processo patológico facilita a entrada de sódio para dentro do eritrócito, exigindo excesso de energia para expulsá-lo expulsá e manter o equilíbrio. Como conseqüência, o esferócito além de perder sua capacidade de deformabilidade, sofre as lesões de membrana (figura 3).

Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura de microesferócitos, mostrando várias células esferocíticas com lesões na membrana, ao lado de um eritrócito discóide normal.

As três principais evidências clínicas na EH são: anemia, icterícia e esplenomegalia. A gravidade do curso clínico da doença é variável, sendo tipicamente mais intensa nas crianças e jovens, na forma recessiva e autossômica. Geralmente a EH se manifesta antes dos 10 anos de idade, mas em muitos casos pode não se manifestar até a fase adulta. O aumento do metabolismo dos pigmentos biliares (ex.: bilirrubina) devido ao alto grau de hemólise, pode causar "pedras" na vesícula, ou colelitíase. Embora seja rara complicações mais graves, pode ocorrer especialmente em crianças, a crise aplástica com pancitopenia (diminuição das séries vermelhas, brancas e plaquetas) no sangue periférico, devido a um desgaste aste hematopoiético da medula óssea. Diante dessa situação pode ocorrer anemia grave, infecções virais e úlceras nas pernas. A eritropoiese constantemente elevada promove aumento da área medular nos ossos produtores de sangue, causando alterações esqueléticas. esqueléti Laboratorialmente, a concentração de hemoglobina situa-se situa se entre 8 e 11 g/dl, com VCM normal, e CHCM elevado em 60% dos pacientes com EH. A reticulocitose varia entre 5 e 20%. A avaliação do esfregaço de sangue periférico evidencia numerosos microesferócitos microesfer (figura 4), muitas vezes com anisocitose devido à presença de reticulócitos (que são células maiores) ou por deficiência de vit. B12 e ácido fólico pela eritropoiese aumentada. O teste específico para a esferocitose hereditária é a curva de fragilidade fragilid osmótica (figura 5),, cujos dados técnicos poderão ser obtidos no capítulo sobre "Técnicas " Laboratoriais".

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Figura 4. Esfregaço de sangue periférico de paciente com esferocitose hereditária. Além de microesferócitos há também macroesferócitos pela presença de reticulocitose, ou devido à deficiência de vitamina B12 e folatos – fatos comuns nas anemias hemolíticas crônicas.

Figura 5. Teste de fragilidade osmótica. À esquerda o gráfico mostra a posição da curva obtida pela análise de sangue com esferocitose, a temperatura ambiente. À direita o mesmo sangue incubado a 37ºC por 24 horas.

Heliptocitose Hereditária A eliptocitose hereditária ária é um grupo heterogêneo de anemia em que predominam eritrócitos com forma elíptica no sangue periférico (figura ( 6). ). A forma de herança genética é autossômica dominante, envolvendo defeitos na disposição estrutural da membrana das proteínas espectrina e a interação entre espectrina – actina – proteína 4.1. A anormalidade da espectrina é a forma mais comum da eliptocitose, alterando sua interação horizontal (figura ( 2). ). Os fatores que determinam 132

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP a forma elíptica dos eritrócitos defeituosos começam a ser descobertos. descobertos. Na evolução desses eritrócitos durante a eritropoiese, observa-se observa se que os eritroblastos até a fase de reticulócitos tem a forma normal, admitindo que a transformação em eliptócito ocorre quando atingem a circulação periférica. Assim, acredita-se se que durante o fluxo através da microcirculação o eritrócito com o defeito de proteínas horizontais da membrana se deforma e não consegue retornar à forma normal, permanecendo com a morfologia elíptica (figuras ( 7 e 8).

Figura 6. Sangue periférico de paciente com eliptocitose hereditária. No presente caso, o predomínio de eliptócitos ultrapassa 75% dos eritrócitos.

Figura 7. Representação do eritrócito na microcirculação, com a forma muito alterada e achatada. Caso esse eritrócito tenha alteração de proteína na estrutura horizontal do eritrócito, ao retornar para um vaso maior, sua forma continua achatada ou elíptica (figura (figura 8). 8

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Figura 8. Microscopia eletrônica de varredura mostrando eliptócito (centro) ao lado de eritrócitos normais.

As manifestações ões clínicas da esferocitose hereditária são variáveis, desde portadores assintomáticos até situações raras de pacientes com anemia hemolítica grave. A hemólise moderada ocorre entre 10 e 15% das pessoas afetadas, e nesses casos ocorre a anemia, icterícia e esplenomegalia. Laboratorialmente, os portadores assintomáticos de eliptocitose se mostram com valores normocíticos e normocrômicos, hemoglobina acima de 12 g/dl e reticulócitos abaixo de 4%. Na análise do sangue periférico observa-se observa que os eliptócitos estão presentes, geralmente acima de 25% do total dos eritrócitos. Pelo menos três tipos de eliptócitos podem ser identificados, baseando-se se na morfologia eritrocitária e na manifestação clínica, como se segue: a. Eliptocitose típica (figura 6): 6) é a forma mais prevalente, com graus de hemólise que variam desde a ausência até moderada. b. Eliptocitose esferocítica: esferocítica: ocorre em 10 a 26% dos casos, e a análise dos eritrócitos mostra significativo número de eliptócitos menos alongados juntamente com microesferócitos. c. Eliptocitose estomatocítica (figura 9): 9): é caracterizada pela presença de ovalócitos, alguns com fendas longitudinais (estomatócitos). Esta forma de eliptocitose estomatocítica é prevalente no sudeste asiático, provavelmente por oferecer proteção contra a invasão de parasitas da malária.

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Figura 9. Sangue periférico de paciente com eliptocitose estomatocítica. Os eritrócitos são do tipo ovalócitos, alguns com fenda na sua porção média (estomatócitos).

Os testes para confirmação são a fragilidade osmótica (ver capítulo "Técnicas Técnicas laboratoriais") laboratoriais que se mostra alterado na eliptocitose esferocítica, e normal nas eliptocitoses típica e estomatocítica. A bilirrubina indireta e o urobilinogênio fecal mostrammostram se elevados, e a haptoglobina sérica está diminuída nos episódios de hemólises.

Piropoiquilocitose Hereditária A piropoiquilocitose hereditária é uma anemia hemolítica extremamente rara, caracterizada por acentuada anisocitose, micropoiquilócitos e esquisócitos. Sua presença é autossômica recessiva, e ocorre com maior freqüência nos negros. A principal causa é um defeito de membrana da proteína espectrina, com formação de heterodímeros entre as espectrina a e b (figura 2), ), provocando evidente alterações da membrana, fato que resulta em anemia hemolítica importante. Essas alterações conduzem a instabilidade térmica da membrana, deformando-a deformando a mais quando o sangue é incubado entre en 40ºC e 45ºC por alguns minutos. A piropoiquilocitose se manifesta com hemólise grave desde a infância, tornando-se tornando necessário a transfusão de concentrado de eritrócitos. Clinicamente observa-se observa se icterícia, esplenomegalia e colelitíase. Laboratorialmente,, há acentuada microcitose pela presença de micro-esquisócitos micro esquisócitos (ver figura 32a do capítulo "Principais Alterações Morfológicas dos Eritrócitos") com VCM abaixo de 25 fL. A concentração de hemoglobina está diminuída em relação ao grau de hemólise e os reticulócitos apresentam-se se aumentados.

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Estomacitose Hereditária A estomatocitose hereditária, também conhecida por hidrocitose, e xerocitose hereditária é um grupo heterogêneo de doenças de membrana do eritrócito. Caracterizam-se Caracterizam por causarem discreto a moderado graus de anemia hemolítica, alteração na permeabilidade da membrana a cátions, e sua herança é do tipo autossômica dominante. O conteúdo de água do eritrócito é dependente da concentração de cátions sódio e potássio. Os eritrócitos na estomatocitose itose hereditária são afetados por aumento da permeabilidade e do fluxo de sódio e potássio, resultando no aumento do conteúdo de água e inchaço do eritrócito (figura ( 10). ). Diante desse processo ocorre aumento do sódio e diminuição do potássio no eritrócito, pois o defeito na permeabilidade do sódio é maior que a do potássio. No sangue periférico, os eritrócitos inchados se apresentam com uma fenda na região central, semelhante a uma "boca", que em grego significa "stomatos", daí o nome estomatocitose estomatocit (figura 11).

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Figura 10. Microscopia eletrônica de varredura de estomatócito, na estomatocitose hereditária.

Figura 11. Sangue periférico de pessoa com estomatocitose hereditária, onde cerca de 75% dos eritrócitos são do tipo estomatócitos.

Clinicamente ente a estomatocitose hereditária é similar às outras anemias hemolíticas crônicas, cuja intensidade é discreta e variável entre os seus portadores. Laboratorialmente, a anemia cursa com valores de hemoglobina entre 8 e 10 g/dl, com reticulocitose moderada (10 a 20%), e discreta macrocitose com VCM elevado. Na análise do sangue periférico, os estomatócitos prevalecem entre 10 e 50%. A fragilidade osmótica está aumentada quando morfologicamente a estomatocitose é predominante, e se deve à relação entre volumee celular e superfície. Nos casos em que além dos estomatócitos coexistem células em alvo – fato que caracteriza a xerocitose – a fragilidade osmótica está normal ou diminuída. 137

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A figura 12 mostra por microscopia eletrônica a estomatocitose por xerocitose, com o aparecimento no sangue periférico de células em alvo.

Figura 12. Microscopia eletrônica da estomatocitose do tipo xerocitose. Nesse caso os estomatócitos têm a função celular alterada na regulação da água celular; há perda de água (desidrocitose), com acentuado efluxo de sódio.

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ALTERAÇÕES ERITROCITÁRIAS NAS ENZIMOPATIAS Alterações Eritrocitárias nas Enzimopatias Introdução O metabolismo normal da via de Embden-Meyerhof Embden Meyerhof e da via das pentoses já foi apresentado no capítulo "Principais Componentes dos Eritrocitários". Entretanto, há algumas alterações enzimáticas que causam patologias de variáveis graus nos eritrócitos – são as enzimopatias. Cerca de 90% da energia para o metabolismo dos eritrócitos é produzida pela glicose anaeróbica da via de Embden-Meyerhof, Meyerhof, que produz adenosina trifosfato (ATP) em concentrações necessárias para o seu funcionamento normal e da sua sobrevida. Há várias enzimopatias que alteram o funcionamento normal dessa via metabólica, causando anemias hemolíticas de intensidades diversas, e são denominadas em conjunto por anemias hemolíticas não esferocíticas. A forma mais comum de anormalidade enzimática da via de Embden-Meyerhof Embden é a deficiência de piruvato quinase. A via das pentoses é responsável pela glicólise aeróbica, aeróbica, que gera cerca de 10% de energia dos eritrócitos. Essa via produz a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) que é necessário para a redução da glutationa oxidada (GSSG) em glutationa reduzida (GSH). A GSH protege as outras enzimas enzimas eritrocitárias e as moléculas de hemoglobinas das oxidações. As deficiências de enzimas nesta via desencadeia a peroxidação do hidrogênio, a desnaturação oxidativa da hemoglobina, e hemólise (ver capítulo "Radicais "Radicais Livres e Danos Eritrocitários"). Eritrocitários A indução desse processo hemolítico é quase sempre resultante do estresse oxidativo por ingestão de drogas oxidantes (ex.: sulfas) bem como de determinados alimentos potencialmente oxidantes (ex.: fava). A enzimopatia mais comum da via das pentoses é a deficiência de glicoseglicose 6-fosfato desidrogenase ou G--6-PD.

Deficiência de Piruvato – Quinase A deficiência de piruvato quinase altera o processo metabólico da via de Embden-Meyerhof, Embden causando anemia hemolítica de grau discreto a moderado. A maioria dos casos descritos na literatura mostra maior prevalência nos povos do nordeste da Europa, apesar disso é amplamente distribuída em todas as regiões do mundo. A forma de herança herança genética é do tipo autossômica recessiva,, com várias formas de mutantes caracterizadas por diferentes genótipos diferenciados eletroforeticamente. A maioria das pessoas com anemia hemolítica por deficiência de piruvato quinase é homozigota ou tem dupla la heterozigose para dois genes mutantes. Aqueles que são heterozigotos geralmente têm atividade de piruvato quinase reduzida à metade e não manifestam anemia ou outras alterações hematológicas. Por outro lado, a forma 139

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP adquirida da deficiência de piruvato quinase ocorre em alguns casos de malignidades hematológicas (ex.: doenças linfo e mieloproliferativas) e síndromes diseritropoiéticas. Fisiologicamente, a piruvato quinase cataliza a formação do piruvato a partir do fosfoenolfosfoenol piruvato (PEP) e é acompanhada acompanhad pela transformação de ADP em ATP (energia):

Fosfoenol-piruvato Piruvato Assim, a deficiência de piruvato quinase reduz a produção de ATP, que é necessária para manter o funcionamento normal da bomba de sódio-potássio sódio potássio da membrana do eritrócito. Nesta situação, tuação, potássio e água são perdidos pela célula, resultando na distorção da sua forma, com espículas (figura 1). ). Essas células lesadas perdem a capacidade de deformabilidade e são destruídas prematuramente no baço causando anemia.

Figura 1. Esfregaço de sangue periférico de paciente com deficiência de piruvato quinase. A presença de eritrócitos com espículas (equinócitos) se deve à falha na bomba de sódio-potássio, sódio que desidrata a célula e induz sua destruição precoce.

Clinicamente, a deficiência de piruvato piruvato quinase é muito variável. Algumas crianças recémrecém nascidas necessitam de exo-sangüíneo exo sangüíneo transfusão; outras pessoas têm anemia hemolítica compensada e sem sintomas. A doença é geralmente identificada na infância, porém ocorrem casos cujas manifestações acontecem na fase adulta. Os sinais e sintomas são aqueles associados à hemólise crônica: icterícia, anemia, esplenomegalia e coletitíase. Laboratorialmente, a anemia se manifesta com valores de hemoglobina entre 6 e 12 g/dl. Os eritrócitos são geralmente normocíticos e normocrômicos, apesar do VCM se elevar devido à reticulocitose, que chega a 60% em alguns casos. Porém, os valores de reticulócitos na maioria dos casos se situam entre 2,5 a 15%. Leucócitos e plaquetas estão normais na maioria dos casos. Morfologicamente, rfologicamente, os eritrócitos não apresentam grandes alterações, a não ser as formas espiculadas do tipo esquinócitos (figura ( 1). ). Podem ser visualizadas alterações como 140

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP policromasia, poiquilocitose e, eventualmente, eritroblastos e micro-esferócitos. micro esferócitos. A avaliação av da bilirrubina indireta está elevada moderadamente. O teste especial para identificar a deficiência de piruvato quinase é a fragilidade osmótica induzida ao calor de 37oC por 24 horas (ver figura 5do capítulo "Alterações Alterações Eritrocitárias nos Defeitos de Membrana"), Membrana"), cujo teste poderá ser visto no capítulo "Técnicas Técnicas Laboratoriais". Laboratoriais". Os corpos de Heinz estão ausentes nesta enzimopatia.

Deficiência de G-6-PD PD (Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase) (Glicose

A deficiência de G-6-PD PD é a forma mais comum de enzimopatia associada com hemólise. A doença se origina devido à herança de um dos genes que codifica a enzima GG-6-PD. O curso da doença varia desde episódios de hemólises induzidos por drogas ou estresse oxidativo oxidat até formas graves de anemia hemolítica. A deficiência de G-6-PD G PD foi descoberta na década dos anos 50 em alguns soldados negros que receberam droga anti-malária anti malária (primaquina) e desenvolveram anemia hemolítica. A deficiência de G-6-PD PD é ligado ao cromossomo cromossomo X, e por isso o homem a expressa com maior intensidade por serem sempre homozigotos. Na mulher, a expressão da doença também pode ocorrer desde que os dois cromossomos estejam com genes afetados. A prevalência da deficiência de G-6-PD G é maior em regiões ocidental da África, Mediterrâneo, Oriente Médio e Sudeste Asiático. No Brasil, estudos realizados em diferentes Estados revelaram que a sua prevalência é de cerca de 3 a 4% entre pessoas de cor negra. Os estudos de genótipos da doença mostraram que há mais mais de 400 variantes genéticas classificadas em cinco grupos (tabela 1), ), cujas intensidades são muito heterogêneas. Fisiologicamente, a desnaturação oxidativa da hemoglobina é o fator que mais tem influência no processo hemolítico nas pessoas com deficiência deficiênci de G-6-PD. A enzima G-66-PD é necessária para converter a glicose-6-fosfato fosfato em 6-fosfogluconato 6 fosfogluconato e subseqüentemente na produção de NADPH e de glutatião reduzido (GSH). A GSH protege enzimas e hemoglobina contra oxidação pela detoxificação do peróxido de hidrogênio hidrogênio e da ação dos radicais livres (ver capítulo "Principais Componentes dos Eritrócitos" e "Radicais Livres e Danos Eritrocitários"). Os eritrócitos normais têm atividade suficiente de G-6-PD G PD para manter níveis adequados de GSH. Quando há deficiência da G-6-PD, PD, os eritrócitos não podem gerar GSH suficiente para detoxificar o peróxido de hidrogênio. A hemoglobina é então oxidada a metahemoglobina, processo inicial da sua degradação que resultará em globinas desnaturadas e formação de corpos de Heinz (ver capítulo "Principais Principais Alterações Morfológicas dos Eritrócitos" Eritrócitos – ítens "Corpos de Heinz"" e "Células Mordidas"). Os corpos de Heinz se ligam aos grupos sulfidril da membrana, causando rigidez dos eritrócitos. Esses eritrócitos deformados têm dificuldades de fluir na microcirculação do baço, aço, e por isso são fagocitados parcial ou integralmente pelos macrófagos, que resulta em anemia hemolítica. Numerosas drogas induzem à hemólise na deficiência de GG 6-PD: PD: primaquina, fenilhidrazina, nitrofrerantoina, ácido nalidixico (anti-microbiano (anti para organismos gram-negativo), negativo), sulfonamidas, azul de metileno e naftaleno. Clinicamente, a deficiência de G-6-PD G é muito variável (tabela 1), ), e é dependente do grau do estresse oxidante, origem racial, e variante genética. Na maioria dos casos, a anemia ocorre somente após os episódios hemolíticos desencadeados pelo estresse oxidativo. Na hemólise aguda, a hemoglobina cai rapidamente para 3 a 4 g/dl. A anemia é do tipo normocítica e normocrômica, com reticulocitose elevada após 4 a 5 dias do início do episódio hemolítico. Logo após o episódio hemolítico, a morfologia eritrocitária se mostra alterada pela presença de 141

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP aniso-poiquilocitose, poiquilocitose, eritrócitos contraídos (figura ( 2), ), policromasia, células mordidas e alguns esferócitos. Os testes laboratoriais de "screening" na suspeita clínica de deficiência de G-6-PD G são: pesquisa de corpos de Heinz, dosagem de metahemoglobina e teste da redução de metahemoglobina (ver capítulo "Técnicas " Laboratoriais"). "). O teste específico é a avaliação da atividade enzimática de G-66-PD PD por fluorescência ou pela avaliação da metahemoglobina redutase. Tabela 1. Classificação dos cinco grupos de deficiência de glicose-6-fosfato fosfato desidrogenase. CLASSE variantes deficientes associadas à anemia 1 hemolítica crônica. Ex.: variante New York CLASSE variantes com deficiência acentuada da atividade da 2 enzima G-6-PD (menos de 10% da atividade normal). Ex.: variante mediterrânea CLASSE variantes com deficiência moderada da atividade da 3 enzima G-6-PD (10 a 60% da atividade normal). Ex.: variante africana ou G-6PDA CLASSE variantes com deficiência discreta da atividade da 4 enzima G-6-PD (60 a 100% da atividade normal) CLASSE variantes com atividade da enzimática aumentada da 5 enzima G-6-PD INFORMAÇÕES IMPORTANTES • • •

A classe 1 é muito rara. As classes 2 e 3 são as mais importantes sob o ponto de vista clínico, pois causam crises de hemólises quando o portador é exposto a drogas oxidantes. No Brasil, a deficiência de G-6-PD G mais comum é a de classe 3 – africana(87% (87% dos casos), seguida da classe 2 – mediterrânea (com 12% dos casos).

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Figura 2. Sangue periférico de paciente com deficiência de G-6-PD, G PD, um dia após o episódio hemolítico. Observar eritrócitos contraídos (condensação de hemoglobina para uma parte da célula), equinócito e anisocitose. Além disso, é comum as "células mordidas" e policromasia.

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ALTERAÇÕES ERITROCITÁRIAS NAS TALASSEMIAS Alterações Eritrocitárias nas Talassemias

Introdução As talassemias representam um conjunto de sintomas caracterizados por anemia, fraqueza, cansaço, dores nas pernas, palidez, icterícia, e que dependendo da gravidade da doença, ocorrem alterações esqueléticas, ticas, hepatomegalia, esplenomegalia, cálculos biliares, infecções, insuficiência cardíaca e disfunções hormonais. Cientificamente, as talassemias foram descritas pela primeira vez por Thomas B. Cooley em 1925, que relatou a doença em quatro crianças que tinham tinham anemia e esplenomegalia, aumento do fígado, palidez, todos com aspectos faciais mongolóides, e alterações ósseas do crânio e dos ossos faciais. No exame de esfregaço sangüíneo, Cooley descreveu acentuado grau de anemia com presença de muitos eritroblastos. eritroblastos. Devido à excelência do artigo e da clareza com que foi descrito, por muitos anos essa forma de talassemia grave foi reconhecida e citada como anemia de Cooley,, e que hoje corresponde à talassemia beta maior. Historicamente, é possível que a talassemia talassemia tenha se originado há mais de 4 mil anos, pois há referência da doença feita por Hipócrates, bem como achados em múmias de crianças dos períodos pré-histórico histórico e histórico, com alterações ósseas no crânio, muito parecidos com os da talassemia beta maior. Os gregos certamente já conheciam a talassemia como uma entidade mórbida, distinguida em certas regiões e ilhas devido aos casamentos consangüíneos. Por essa razão, é provável que daí tenha se originado o nome talassemia, onde thalassa significa mar; e anaima an que sugere "pessoas com falta de sangue (anêmicas) que vivem a beira-mar beira mar (ilhas)", surgindo daí o termo talassemia. Atualmente, a talassemia é uma das doenças mais estudada e mais conhecida no sentido científico, médico, social e demográfico. Sob o ponto nto de vista clínico, as talassemias são classificadas em maior, intermediária, menor e mínima, conforme mostra a tabela 1.. Por outro lado, as talassemias também têm sua classificação laboratorial conforme o tipo de globina que foi afetada, fato que as diferenciam dif em: a. talassemia alfa: quando a síntese da globina alfa está deficiente, enquanto a de globina beta está normal; b. talassemia beta: quando a síntese da globina beta está deficiente, enquanto a de globina alfa está normal. Tabela 1. Classificação clínicas das talassemias. 144

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Talassemia Maior

Intermédia Menor Mínima

Hemoglobina

7-10

10-13

>13

Reticulócito (%)

2-15

2-10

2-5

0,5-2

Eritroblasto

+++

++/+

---

Eritrócitos alterados

+++

+/-

Icterícia

+/-

---

Esplenomegalia

+++

-/+

---

+++/++

++/+

---

+++

+/-

---

Alterações esqueléticas Necessidade de transfusões

O desequilíbrio entre as globinas alfa e beta causa a precipitação dentro do eritrócito da globina que foi sintetizada normalmente, normalmente pois esta não encontrou a sua correspondente para se juntar e formar a molécula da hemoglobina. Desta forma, conclui que quanto maior for o bloqueio da síntese de uma das globinas, maior será o desequilíbrio, mais intenso serão as globinas precipitadas, e mais extensas serão as lesões le nos eritrócitos – que serão retirados precocemente da circulação causando anemias hemolíticas de graus variados. Além das talassemias alfa e beta, há vários tipos de lesões moleculares que ocorrem nos cromossomos 16 (onde estão agrupados os genes da globina globina alfa) e 11 (onde estão agrupados os genes das globinas beta, delta e gama). Assim, é possível ter situações de talassemias em que as globinas alfa e beta estão deficientes numa mesma pessoa: talassemia alfa/beta; situações em que as globinas beta e delta estão deficientes: beta/delta talassemia,, etc. E também ocorrem as interações entre talassemias e hemoglobinas variantes, como são os casos da Hb S/tal. beta, Hb SS/tal. alfa, Hb C/tal. beta, beta, etc. Informações adicionais sobre interação da Hb S com talassemias lassemias podem ser obtidas no capítulo "Células " Falciforme".

Talassemia Alfa Genética e Fisiopatologia

Os distúrbios genéticos que causam a talassemia alfa se devem às lesões nos agrupamentos de genes para síntese de globinas alfa que estão localizados no braço curto do cromossomo 16 (ver capítulo "Principais Componentes dos Eritrócitos"). Uma pessoa que não temtalassemia tem alfa apresenta dois genes alfa íntegros em cada um dos dois cromossomos 16 (um herdado do pai e outro da mãe), assim, há quatro genes alfa atuantes (figura ( 1).

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Figura 1. Localização dos genes que controlam a produção de globinas alfa no cromossomo 16.

A talassemia alfa ocorre quando um, ou dois, ou três, ou os quatro genes alfa estão alterados nos seus processos biológicos de síntese de globinas alfa, conforme mostra a figura 1. Ainda, tomando-se se por base esta figura, é possível relacionar que os tipos de talassemias alfa se devem ao número de genes afetados. Fisiopatologicamente, as conseqüências clínicas e hematológicas de quem padece de talassemia alfa se devem em à quantidade intra-eritrocitária intra de globina beta "livre" (figura figura 2). 2 Quanto maior a extensão da lesão de um gene alfa, ou de dois, três ou dos quatro genes alfa, o desequilíbrio em relação à globina beta será maior, fato que permite diferenciar as talassemias talassemias alfa em três grupos básicos: portador assintomático (talassemias alfa mínima e menor), doença de Hb H e hidropsia fetal.. Os resultados fisiopatológicos mais expressivos oriundos desse desequilíbrio podem ser avaliados pelo esquema apresentado na figura 3.

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Figura 2. O desequilíbrio entre globinas alfa e beta causado pela talassemia alfa.

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Figura 3. Talassemia alfa e suas conseqüências.

Interpretação da Figura 3: a. Quadro azul: a diminuição da síntese da globina alfa tem início na fase fetal, assim o desequilíbrio ocorre na combinação entre globinas alfa e gama. Na fase fetal, as globinas gama "sobram" e precipitam nos eritrócitos em forma de tetrâmeros de globinas gama (g4) e compõe moléculas instáveis de hemoglobinas – a Hb Bart’s (figura 4). Essas hemoglobinas têm afinidade aumentada pelo oxigênio, não tem efeito Bohr, e não desempenham a interação entre grupos heme no processo de oxigenação molecular – ou seja, são hemoglobinas sem desempenho funcional. Ao nascer, esta mesma pessoa continua a sofrer sofrer as conseqüências do desequilíbrio causado pela deficiência da síntese de globina alfa, pois nesta fase a globina beta que substitui a globina gama, sofre a mesma conseqüência, uma vez que o tetrâmero formado somente de globinas beta (b4) constituem moléculas moléculas de hemoglobinas anormais, a Hb H (figura ( 4), ), que se precipitam nos eritrócitos e são identificadas pela coloração citológica com azul de crezil brilhante (figura ( 5).

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Figura 4. Eletroforese em agarose alcalina de hemoglobinas. Da esquerda para direita: Hb AA (normal), Hb AH, Hb AH (ambas da mesma pessoa) e Hb AF + Bart’s (de recém-nascido). recém

Figura 5. Precipitação intra-eritrocitária intra eritrocitária de Hb H em paciente com doença de Hb H. O sangue foi incubado com o corante por 4 horas a 37oC, mostrando que todos os eritrócitos são afetados pelas conseqüências do desequilíbrio alfa/beta causado pela deficiência de globina alfa. 149

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP b. Quadro rosa: as conseqüências das alterações funcionais das hemoglobinas Bart’s e H como transportadores ineficientes de oxigênio, se destacam pela hipóxia tecidual, estímulo acentuado à síntese de eritropoietina, expansão medular e deformidades ósseas. c. Quadro amarelo: as precipitações intraeritrocitárias de Hb H e Bart’s promovem contínuas oxidações do ferro, que liberam espécies ativadas de oxigênio (radicais livres: O· 2, HO· , H2O2). Os radicais livres oxidam as proteínas da membrana eritrocitária (Banda 3), alterando-lhe alterando lhe sua estrutura e, por isso, atraindo os macrófagos do SRE (principalmente do baço), que reconhecem imunologicamente imunologicamente essa alteração como "situação anormal". A ação dos macrófagos se realiza por retirada de partes da membrana oxidada dos eritrócitos, deformando-os deformando os em micrócitos e esquisócitos (figura ( 6). ). As lesões causadas pelas ações dos macrófagos culminam com a anemia, anemia enquanto que no SRE do baço, as atividades macrofágicas exacerbadas causam o hiperesplenismo (inclusive com destruição precoce de leucócitos e plaquetas) e esplenomegalia.

Figura 6. Esfregaço de sangue periférico de pessoa com doença de Hb H. Anisocitose com presença de micrócitos; poiquilocitose com destaque a esquisócitos e dacriócitos;hipocromia acentuada.

Avaliação Laboratorial

Os principais testes para a avaliação laboratorial dos diferentes tipos de talassemias alfa estão resumidos na tabela 2,, e as técnicas necessárias estão descritas no capítulo "Técnicas Laboratoriais". De uma forma geral, a eletroforese de hemoglobina com hemolisado obtido pela mistura de sangue total (100 ml) com saponina a 1% (100 ml), é eficiente na identificação da fração de Hb H com baixíssimas concentrações. É importante observar que a Hb H é instável e, portanto, o uso de clorofórmio ou tolueno na preparação do hemolisado pode destruí-la destruí la completamente. Na eletroforese de hemoglobina, a Hb H se instabiliza com o calor do processo termodinâmico da eletroforese, por isso é importante "procurá-la" "procurá la" nos primeiros 5 minutos após ter iniciada a 150

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP eletroforese. À medida que a eletroforese se desenvolve, a Hb H, quando presente, vai se dissipando até desaparecer. A pesquisa intraeritrocitária da Hb H também é fundamental e necessária para a comprovação da talassemia alfa. Apesar da técnica estar descrita no capítulo "Técnicas "Técnicas Laboratoriais", Laboratoriais é importante enfatizar que o corante azul de crezil brilhante é quimicamente capaz de reagir com compostos oxidativos, portanto é um corante do tipo redox. Este corante induz a reação intracelular de compostos oxidados, como são os casos de Hb H e corpos de Heinz. Quando o eritrócito tem Hb H, sua precipitação está relacionada ao tempo de incubação ou à concentração de azul de crezil brilhante a 1% misturado aos eritrócitos. Nossos melhores resultados são obtidos quando see misturam 100 ml de sangue total com 200 ml de azul de crezil brilhante a 1% e, após bem homogenizado, a mistura é incubada a 37oC por 40 a 60 minutos. Por este processo técnico, os eritrócitos com Hb H ficam descorados e geralmente com precipitados (figura 5), em relação aos eritrócitos normais que ficam homogeneamente corados.

Figura 5.. Precipitação intra-eritrocitária intra eritrocitária de Hb H em paciente com doença de Hb H. O sangue foi incubado com o corante por 4 horas a 37oC, mostrando que todos os eritrócitos são afetados pelas conseqüências do desequilíbrio alfa/beta causado pela deficiência de globina alfa. É muito comum em nossa população a talassemia alfa de um gene afetado, sendo prevalente em 15 a 25% da nossa população. O portador desta forma de talassemia se se enquadra no grupo da talassemia mínima, pois sua hemoglobina total geralmente está dentro dos parâmetros de normalidade. Apesar disso não é raro a manifestação de dores nas pernas e cansaços periódicos. Por outro lado, quando são dois genes alterados, é muito possível observar discreto grau de anemia, com hemoglobina total entre 10 e 13 g/dl, além de alterações morfológicas dos eritrócitos. Neste caso, o paciente, embora "assintomático", manifesta os sintomas acima com maior freqüência. A prevalência deste deste tipo de talassemia alfa em nossa população é de 3 a 4%. A doença da Hb H, causada por lesões em três genes alfa, com evidente quadro clínico de anemia moderada a grave, inclui os portadores com talassemia menor ou intermediária – pois depende da extensão do grau de lesão nos três genes alfa. A presença de Hb H na eletroforese é muito marcante, com concentração entre 5 e 20%, e sua prevalência na população brasileira é de 1 caso para 5000 estudados. Por fim, a síndrome hidrópica é extremamente rara entre nós, n embora comum nas populações do sudeste asiático. Por ser mortal, a criança, ao nascer, não 151

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP vive além de algumas horas ou, às vezes, por ser incompatível com a vida, ocorrem abortos espontâneos nesta doença. As análises somente são realizadas em sangue de recém-nascido recém ou do cordão umbilical, mostrando quase 100% de Hb Bart’s e eritroblastose fetal (figura ( 7).

Figura 7.. Sangue periférico de criança recém-nascida recém nascida com hidropsia fetal. A presença de eritroblastose fetal é marcante, chegando entre 30 e 40% do total da série vermelha.

Talassemia Beta Genética e Fisiopatologia

A talassemia beta é uma das doenças mais bem estudada e conhecida entre as de origem hereditária. A causa genética se deve a lesões provocadas por mutações de bases nitrogenadas nas regiões que controlam os genes do tipo beta, delta, gama e epsilon – este último com atividade somente no período embrionário. Esse Esse agrupamento de genes, também conhecido genericamente como genes do tipo beta, estão localizados no braço curto do cromossomo 11. As lesões genéticas que ocorrem nos genes tipo beta podem afetá-los afetá los parcial ou integralmente, e podem também ser cumulativos, ou seja, pode alterar a expressão só do gene beta, bem como dos genes beta e delta; beta, delta e gama; beta, delta, gama e epsilon, conforme mostra a figura 8.. Quando o bloqueio do gene é total, denomina-se denomina por bo-talassemia, e quando o bloqueio é + parcial, porb talassemia.

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Figura 8. Bloqueio dos genes tipo beta (β, (β, δ, γ e ε) na região de agrupamentos de gene para globina beta, delta, gama e epsilon, no braço curto do cromossomo 11.

A forma de transmissão da talassemia beta é variável, e depende do tipo de lesão: total ou parcial. No exemplo que mostraremos a seguir, caracterizam os genótipos mais comuns de talassemia beta (figura 9). ). Por meio desta figura observa-se observa se que uma pessoa sem talassemia beta tem dois genes beta (b/b), um dos genes beta proveniente proveniente do cromossomo 11 do pai e o outro da mãe. Além dos genes beta, há os genes delta, gama e epsilon, porém por praticidade o exemplo se concentrará apenas nas lesões dos genes que sintetizam a globina beta. Como se pode constatar pela figura 9,, quando o bloqueio do gene beta é total e afeta apenas um dos dois genes da pessoa (b/-), ), o portador é caracterizado geneticamente como talassemia beta heterozigoto,, ou clinicamente como talassemia beta menor (consultar a tabela 1). 1 Por outro lado, a lesão total de ambos genes beta causa a talassemia beta homozigota ou talassemia beta maior (tabela 1). ). Nestas duas citações de bloqueio total do gene beta, pode-se pode deduzir que o primeiro caso é bo talassemia heterozigota, e o segundo se trata de botalassemia homozigota. homozigo O mesmo procedimento de interpretação pode ser feito no bloqueio parcial da globina beta. Há situações de dupla heterozigose que causa clinicamente a talassemia beta maior, é o que ocorre quando há a herança por parte do pai de um cromossomo 11 com o gene gene beta bloqueado totalmente (bo) e do outro cromossomo 11 por parte da mãe com o gene beta bloqueado

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP parcialmente (b+). Neste caso, a duplicidade de genes alterados bo/b+ talassemia causa a talassemia maior.

Figura 9. Localização dos genes que controlam a síntese de globinas do tipo beta, relacionando lesões com tipos de talassemias. A biologia molecular desvendou que há mais de 100 mutações no agrupamento de genes de globina beta capazes de causarem talassemia beta. A figura 10 apresenta algumas alguma dessas mutações e, como se pode deduzir da interpretação da figura, todas estão relacionadas com origens raciais.

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Figura 10. Mutações que ocorrem no agrupamento de genes da globina beta, com suas respectivas localizações, tipo de talassemia e origem racial.

Fisiopatologicamente o desequilíbrio entre as globinas alfa e beta, devido à diminuição da síntese de globina beta provoca lesões eritrocitárias desencadeadas pelas globinas alfa despareadas (figura 11). ). Quanto maior o grau de bloqueio na síntese de globina beta, maiores serão também a desmoglobinização, bem como as lesões eritrocitárias, e os reflexos clínicos e de alterações laboratoriais. Os resultados que refletem as conseqüências do desequilíbrio entre globina alfa e beta (na talassemia beta) pode ser avaliado pela análise da figura 12. 12

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Figura 11. Desequilíbrio entre as globinas alfa e beta, causado pela talassemia beta.

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Figura 12. Talassemia beta e suas consequências.

Interpretação da Figura 12: a. Quadro azul: a deficiência da síntese de globina beta desencadeia a precipitação de dímeros de globina alfa (a2). b. Quadro rosa: quando a lesão do agrupamento de genes tipo beta não atinge a síntese de globina gama, esta é sintetizada normalmente e se combina com a globina alfa. Como se sabe, a Hb Fetal é ineficiente na função de transportadora de oxigênio, pois tem afinidade aumentada por este gás. c. Quadro amarelo: a falta de hemoglobinização é a principal causa de anemia. Porém, a intensidade do quadro anêmico decorre da precipitação de globinas alfa alfa nos precursores eritróides da medula e nos eritrócitos do sangue periférico. A precipitação de globinas alfa provoca a oxidação da proteína, Banda 3 da membrana e, cuja alteração em sua composição determina a macrofagocitose dos eritrócitos, fato que os leva a deformações: microcitose, células bizarras, etc. (figura ( 13). ). A anemia induz à hipóxia tecidual, bem como à síntese de eritropoietina pelas células glomerulares renais; a eritropoiese medular se intensifica desde os primeiros meses de vida e, por isso, i leva à expansão do tecido hematopoiético e às deformidades ósseas e outras alterações metabólicas. A necessidade de transfusões de sangue (eritrócitos) produz elevação dos níveis de ferro e ferritina provenientes dos eritrócitos transfundidos, causando causand siderose tecidual e deposição de ferro em outros tecidos, glândulas e órgãos. A necessidade de cuidados médicos especializados é fundamental para a manutenção da vida nos casos de talassemia beta maior.

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Figura 13. Sangue periférico de paciente com talassemia beta maior. Aniso-poiquilocitose Aniso acentuada, com eritrócitos hipocrômicos.

Avaliação Laboratorial

Os testes laboratoriais incluem hemograma completo, análise da morfologia eritrocitária e testes específicos: eletroforese de hemoglobinas, dosagens dosage de Hb A2 e Hb Fetal, contagem de reticulócitos, dosagens de ferro e ferritina. A tabela 3 resume as características gerais do paciente com talassemia beta menor, menor bem como exemplos de resultados laboratoriais. A tabela 4 resume também as características gerais do paciente com talassemia beta maior, maior e a tabela 5complementa complementa as principais alterações laboratoriais desta doença grave. Tabela 1. Classificação clínicas das talassemias. Talassemia Maior

Intermédia

Menor

Mínima

7-10

10-13

>11,5

Reticulócito (%)

2-15

2-10

2-5

0,5-2

Eritroblasto

+++

++/+

---

Eritrócitos alterados

+++

+/-

Icterícia

+/-

---

Esplenomegalia

+++

-/+

---

+++/++

++/+

---

Hemoglobina

Alterações

158

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP esqueléticas Necessidade de transfusões

+++

+/-

---

Tabela 2. Relação entre talassemia alfa mínima, menor e doença de Hb H com valores hematológicos específicos. • • Talassemia Alfa Mínima

•

• Talassemia Alfa Menor

•

• Doença de Hb H

•

Paciente: assintomático Eritrograma: valores normais, com discretas alterações morfológicas Testes Específicos: eletroforese de Hb com presença de traços (0,5 a 1%) de Hb H. Hb H intraeritrocitária: + ou Paciente: relata fraqueza e cansaço periódicos. Anemia não responde ao tratamento com ferro Eritrograma: discreto grau de anemia microcítica e hipocrômica. Valores situados próximo a faixa menor da normalidade (Hb 10-13 g/dl) Testes Específicos: eletroforese de Hb: 2 a 5% de Hb H. Hb H intraeritrocitária + (1/1000 a 5000 eritrócitos) Paciente: relata anemia, fraqueza, za, dores nas pernas, pode ter esplenomegalia Eritrograma: anemia microcítica e hipocrômica de grau moderado (Hb: 7 a 10 g/dl). Moderadas alterações morfológicas dos eritrócitos. Testes Específicos: eletroforese de Hb: 5 a 20% de Hb H. Hb H intraeritrocitária +++ (1/50 a 100 eritrócitos)

Tabela 3. Principais características do portador de talassemia beta menor e testes laboratoriais com exemplos numéricos. Paciente

• •

Relata fraqueza, cansaço, dores nas perdas. Anemia não responde a tratamento comferro

Eritrograma

• •

Anemia microcítica e hipocrômica. Ex.: GV: 5,5 mi – Hb: 11,5 g/dl – Ht: 38% - HCM: 21 – VCM: 69 Morfologia: micrócitos, dacriócitos, pontilhados basófilos, hipocromia.

•

159

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Testes Específicos

• •

Outros testes

• • • •

Hb A2 aumentada (4 a 7%) em 95% dos casos Hb Fetal: normal (a maioria dos casos) ou discretamente elevada (concentração até 5%) Resistência osmótica (NaCl 0,36%) – positivo (resistente) em 90% dos casos. Ferritina: normal ou discretamente elevada Ferro sérico: normal Reticulócitos: normal ou discretamente elevado

Tabela 4. Principais características do portador de talassemia beta maior e testes laboratoriais com exemplos numéricos. Paciente

Anemia grave desde o nascimento. Hepatomegalia. Esplenomegalia. Atraso de crescimento. Febre. Vômitos. Anorexia. urina escura.

Aniso Eritrograma Anemia hipocrômica de grau acentuado. Anisopoiquilocitose (+++), esquisócitos, formas bizarras, eritroblastos (+/+++). Ex.: GV: 1,8 mi – Hb: 4,5 g/dl – Ht: 16% Testes Específicos

Hb Fetal aumentada em todos os casos (conc.: 20 a 95%). Eletroforese de Hb: Hb AF ou Hb F

Outros testes

Resistência osmótica (NaCl 0,36%) – positivo (resistente) Ferritina: muito aumentada (até 3.000) Ferro sérico: aumentado Reticulócitos: aumentado (10 a 20%) Bilirrubina indireta: aumentada (1 a 3 mg/dl) Medula óssea: hiperplasia eritrocitária

• • • • • •

Tabela 5. Principais alterações laboratoriais na talassemia beta maior.

• • •

Hb fetal: 10 a 90% Anemia hemolítica microcítica e hipocrômica: Hb < 7 g/dl Morfologia eritrocitária: anisocitose, poiquilocitose, células em alvo, esferócitos,

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Características Laboratoriais

• • • • • • • • • • • • •

formas bizarras, hipocromia, células fragmentadas, siderócitos, eritroblastos, pont. basófilo, anel de Cabot Reticulócitos: aumentados Leucócitos: freqüentemente elevados com desvio à esquerda Plaquetas: normais Ferro sérico e capacidade de transporte: elevada Ferritina: elevada LDH sérico: elevado Bilirrubina indireta: elevada (1 a 3 mg/dl) Urobilinogênio na urina: elevado Urobilinogênio fecal: elevado Sobrevida dos eritrócitos: diminuída Fragilidade osmótica: diminuída Fragilidade mecânica: aumentada Medula óssea: hiperplasia das células eritróides

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CÉLULA FALCIFORME Célula Falciforme

Palavras chaves das doenças causadas pelas Células Falciformes Células Falciformes As células falciformes são eritrócitos com morfologias drasticamente alteradas pela presença de moléculas de hemoglobinas S (ou Hb S). Quando as moléculas de Hb S estão oxigenadas (oxi( Hb S), suas estruturas são globulares e, por isso, mantém os eritrócitos com formas discóides. Quando as moléculas de Hb S liberam oxigênio se tornam desoxigenadas (deoxi-Hb ( S). As moléculas de Hb S deoxigenadas alteram suas configurações estruturais devido a formações de polímeros deixando de ser globulares. A polimerização das moléculas de deoxi-Hb deoxi S causa a formação de estruturas moleculares alongadas como se fossem feixes, e assim os eritrócitos com deoxi-Hb Hb deixam de ser discóides e apresentam diferentes formas das quais as mais comuns tem a forma de foice. O predomínio de eritrócitos com a forma afoiçada resulta na denominação de células falciformes.Por Por outro lado, a denominação da hemoglobina que causa as células falciformes foi extraída do termo inglês Sickle cell. Em 1945, com m a utilização da técnica de eletroforese para o fracionamento de proteínas, observou-se observou se que os eritrócitos normais tinham hemoglobina diferente daqueles com as formas afoiçadas (obtidos de pacientes com anemia falciforme). Para designar a diferença entre essas hemoglobinas, denominou-se denominou por HbA as hemoglobinas consideradas normais e de Hb S (a letra foi extraída do Sickle cell) cell para as hemoglobinas extraídas das células falciformes.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Células Falciformes - Eritrócitos falcizados em sangue periférico de doente com anemia falciforme. A forma delgada dessas células é indicativo de falcização irreversível. Essas células quando analisadas por microscopia eletrônica mostram lesões de membrana.

Célula Falciforme em microscopia eletrônica - Observar duas lesões es na membrana eritrocitária de um eritrócito falcizado. As lesões de membrana ocorrem após uma série de eventos provocados pela polimerização da deoxi-Hb Hb S, geração de espécies ativadas de oxigênio, e por ação macrofágica durante a passagem desses eritrócitos eritrócitos danificados pelo sistema retículo endotelial.

Anemia Falciforme

É uma designação clínica usada para doentes homozigotos com Hb S (ou Hb SS). SS Há uma certa variabilidade clínica e laboratorial entre os doentes com anemia falciforme que pode ser explicada por meio de interferentes biológicos (doenças nças crônicas ou agudas associadas), eritrocitários (associação com talassemia alfa, enzimopatias, enzimopatias doenças de membrana e persistência hereditária de Hb Fetal) Fetal) e sociais (pobreza, cultura, atendimento de saúde). Além desses interferentes, ocorre também a diversificação diversificação dos componentes unitários as bases nitrogenadas - do agrupamento dos genes tipo beta (epsilon, gama-A, A, gama-G, gama delta e beta S) que não expressam proteínas, mas diferenciam etnicamente alguns grupos populacionais. A composição diferenciada dessas dessas bases nitrogenadas é denominada haplótipos. Assim, um mesmo genótipo de Hb SS pode ser qualificado por meio de técnicas de biologia molecular em pelo menos cinco haplótipos: Hb SS-Benin, Hb SS-Bantú, SS Hb SSCamarões, Hb SS-Senegal e Hb SS-Árabe/Indiano.. Alguns desses haplótipos caracterizam-se caracterizam por maior gravidade da anemia falciforme (ex.: Hb SS-Benin SS e Hb SS-Bantú) Bantú) ou por menor gravidade (Hb SS-Árabe/Indiano). Árabe/Indiano). A forma mais comum de herança genética da anemia falciforme se deve a ambos genitores serem portadores de Hb AS ou traço falciforme.

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Eritrócitos na Anemia Falciforme - Esfregaço de sangue periférico de paciente, cujo sangue foi coletado durante episódio de crise dolorosa. A figura mostra vários eritrócitos falcizados (do tipo irreversível) com a morfologia muito delgada e eritrócitos do tipo equinócitos.

Doença Falciforme É uma denominação clinicamente ampla utilizada quando se desconhece o genótipo da doença falcêmica. Inclui, portanto, todos os genótipos que causam ofenótipo da doença: anemia, icterícia, bilirrubinemia, dores, etc. Fazem parte desse grupo a anemia falciforme caracterizada pelo genótipo SS (Hb SS), ), a interação da Hb S com talassemia beta (Hb (Hb S/talassemia beta) beta também conhecida por microdrepanocitose, microdrepanocitose, a interação da anemia falciforme com talassemia alfa (Hb SS/talassemia alfa), ), a interação da anemia falciforme com a persistência hereditária de Hb Fetal (Hb S/PHHF), ), e de Hb S com hemoglobinas variantes, especialmente com a Hb D (Hb SD) e Hb C (Hb SC).

Eritrócito no Traço falciforme ou Hb AS

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Hb S/ Talassemia beta ou micro-drepanocitose. micro

Eritrócitos na Hb SC

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Eritrócitos na Hb SD

Eritrócitos da Hb SS / persistência hereditária de Hb Fetal ou Hb SS / PHHF

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Hb S/talassemia beta ou micromicro drepanocitose

Hb S / Talassemia Beta

Esfregaço de sangue periférico de paciente com interação Hb S/talassemia beta ou Hb S./tal. B+. Observar a presença de células falcizadas, eritrócitos em alvo (ou codócitos), eritrócitos microcíticos e hipocrômicos.

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Esfregaço de sangue periférico de paciente com interação Hb S/talassemia beta ou Hb S./tal. Bº. A presença de aniso-poiquilocitose poiquilocitose é marcante pelos eritrócitos falcizados ou em fase de falcização, dacriócitos, em alvo, microcíticos, hipocrômicos, e um eritroblasto ortocromático.

Microdrepanocitose

É uma designação antiga da Hb S / Talassemia beta, que foi descrita em 1950 por Enzo Silvestrano e Ida Bianco, na Itália. Há basicamente dois tipos dessa interação e diferenciados pelo grau de lesão da talassemia beta. Quando a lesão genética que causa a talassemia beta suprime totalmente a expressão de síntese do gene da globina beta, denomina-se denomina por talassemia beta-zero (ou tal. b0). Se a lesão do gene da globina beta for parcial, a talassemia é classificada por talassemia beta-mais mais (ou tal. b+). Assim, a microdrepanocitose ou a Hb S/talassemia beta pode ser de dois tipos: Hb S/tal. b0 ou Hb S/tal. b+. Na Hb S/tal. b0 não há síntese de Hb A, portanto na eletroforesee a Hb S predomina com concentrações variáveis entre 70 a 90%, seguida da Hb Fetal (5 a 20%) e Hb A2 com valores normais ou elevados. Na Hb S/tal. b+ ocorre a síntese de Hb A com concentração abaixo da Hb S; Hb S (50 a 80%); Hb A (10 a 40%), Hb Fetal (5 a 10%) e Hb A2 normal ou elevada. O grau de anemia no genótipo Hb S/b0 tal. é maior que na Hb S/tal. b+. Os doentes com microdrepanocitose ou Hb S/talassemia beta apresentam crises intermitentes de dores, infartos ósseos e nas articulações. Hematologicamente, Hematologicamente, o sangue periférico mostra eritrócitos microcíticos e hipocrômicos juntamente com células falcizadas, eritrócitos em alvo e policromáticos. Finalmente, a forma mais comum de herança genética desses dois tipos de doença se caracteriza por um dos genitores ser portador assintomático de Hb AS e o outro também portador assintomático de talassemia beta menor (Hb Ab menor).

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Hb SC - Doença da Hb SC

Essa doença é comum no oeste da África. No Brasil sua prevalência é baixa em relação à anemia falciforme (consultar o item Prevalência e distribuição geográfica da Hb S). S É caracterizada por anemia de grau moderado (Hb: 9-13 9 13 g/dl) e muitas vezes são identificadas na idade adulta quando pode apresentar complicações. Geralmente as complicações de devem a lesões da microvasculatura, provavelmente devido aos efeitos causados pela falcização da Hb S e da rigidez celular provocada pela Hb C (processos de cristalização da Hb C). Entre as complicações mais comuns da doença da Hb SC destacam necroses assépticas da cabeça cabe do fêmur e do úmero, bem como manifestações da hematúria. Pode ocorrer também episódios trombóticos abrangentes envolvendo particularmente os pulmões especialmente durante infecções intercorrentes, na gestação e puerpério. Outra complicação grave se deve dev a lesões causadas por repetidas oclusões vasculares da retina. Geralmente a doença da Hb SC é diagnosticada pela presença de anemia moderada, esplenomegalia, e alterações morfológicas dos eritrócitos incluindo células em alvo, alvo cristais de hemoglobina C e células falciformes. falciformes A forma mais comum de herança se deve a um dos genitores ser portador de traço falciforme (Hb AS) e outro portador de Hb AC. AC

Esfregaço de sangue periférico de paciente com doença falciforme SC, ou Hb SC. É comum a presença de eritrócitos citos falcizados juntamente com eritrócitos em alvo ou com cristais de Hb C (apontados por setas).

Hb SS / Persistência Hereditária de Hb Fetal (Hb SS / PHHF)

A persistência hereditária de Hb Fetal (PHHF) é um termo que abrange uma variedade de condições, todas associadas com a produção persistente de Hb Fetal após o período neonatal e, geralmente, com ausência de anormalidades hematológicas importantes. A associação entre anemia falciforme e persistência hereditária de Hb Fetal, ou Hb SS/PHHF, tem em sido encontrada em todas as regiões do Brasil. Na Hb SS/PHHF a falcização não ocorre facilmente pois a Hb 169

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Fetal está elevada com níveis entre 15 e 30% e se distribui homogeneamente entre todos eritrócitos. Como se sabe a Hb Fetal não se co-polimeriza com aHb S e devido a isso o desencadeamento do processo da falcização é mínimo. Clinicamente os portadores dessa interação possuem eritrócitos com características falcizantes diferentes entre si - fato inverso ao que ocorre na anemia falciforme - e desta forma ma não padecem das seqüelas da doença. Muitas vezes o diagnóstico desses portadores ocorre na fase adulta devido à ausência de anemia e sintomatologia. Geralmente o portador de Hb SS/PHHF tem a herança de genitores com os seguintes fenótipos: AS/PHHF e AS, ou AS/PHHF e AS/PHHF.

Esfregaço de sangue periférico de pessoa adulta (32 anos de idade), diagnosticada como portadora de Hb SS/PHHF. A concentração de hemoglobina era de 11,8 b/dl. Observar anisocromia e um eritrócito em vias de se tornar falcizado. As alterações morfológicas nessa interação são muito discretas.

Traço Falcêmico (O Portador Assintomático) ou Hb AS

O portador do traço falcêmico tem o genótipo de Hb AS com concentração da Hb A sempre maior que a Hb S.. Em geral, a contração daHb da A oscila entre 60 e 80% e a Hb S entre 20 e 40%. A Hb A2 apresenta-se apresenta se com valores dentro da normalidade, e da mesma forma a Hb Fetal tem concentração normal após o sexto mês de vida. Como a Hb A inibe a polimerização da Hb S dentro dos eritrócitos, resulta que a morbidade morbidade clínica é nula. Não é incomum a associação da Hb AS com talassemia alfa - detectável pela presença de Hb H na eletroforese alcalina - e nesses casos pode ocorrer discreta anemia microcítica e hipocrômica.. Da mesma forma há muitos casos descritos da associação entre Hb AS edeficiência de glicose-6-fosfato fosfato desidrogenase (G-6-PD), (G , uma vez que ambas situações têm elevada prevalência entre negros. É possível que nesta associação possa ocorrer hematúria e embolia pulmonar. São bem documentados episódios de de infarto esplênico em altitudes acima de 2.000 metros, em pessoas com traço falciforme. Cuidados referentes ao controle de oxigenação em pacientes anestesiados para cirurgias são sempre necessários. 170

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Por fim, o trabalho de conscientização do portador do traço traço falcêmico em relação à sua prole é muito importante, uma vez que instruído a respeito poderá contribuir para o controle de nascimento de doentes falcêmicos, ou então ter conhecimentos adequados das conseqüências da doença e de seus cuidados básicos. O traço falciforme é uma situação cuja herança se deve principalmente a um dos genitores ter Hb AS e outro Hb AA. Porém, em famílias de doentes falcêmicos, o portador de traço pode ter pais com os seguintes genótipo: AS e AS; Ab menor e AS; AS e AC; AS e AD; SS e AA; S/b tal. e AA, entre outros.

Esfregaço de sangue periférico de pessoa com traço falciforme. Os eritrócitos são normocíticos e normocrômicos.

Histórico da Hb S Introdução

Anteriormente à primeira descrição formal, as doenças falciformes certamente já eram conhecidas, mas não eram diagnosticadas pois suas principais manifestações eram comuns a outras doenças. Episódios de dor articular se assemelham ao reumatismo agudo. A icterícia e a hemólise são manifestações da malária e úlceras de perna perna são comuns em países de regiões tropicais. Segundo Konotey-Ahulu, Ahulu, esta doença já era do conhecimento de algumas tribos da África Ocidental, onde a denominação "reumatismo do frio" recebeu várias denominações relacionadas com uma condição crônica e recorrente. recor A tribo Ga se referia a essa condição como "Chwecheechwe", " os Twi, como "Ahututuo Ahututuo", os Ewe como "Nuidudui"" e os Fante como "Nwiiwii". " Konotey-Ahulu, Ahulu, neste mesmo trabalho, relata informações de anciões destas tribos relatando vários casos de morte de indivíduos jovens da tribo, como óbitos devidos provavelmente à anemia falciforme. 171

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Entretanto, acredita-se se que a primeira descrição da doença na África tenha sido feita por Africanus Horton (1874), que observou febre, crises de dor generalizadas e dores articulares a que se exacerbavam nas estações de chuva, manifestações essas associadas a anormalidades no sangue periférico. Parece que vários grupos étnicos em Gana, incluindo os Twi, Ewe e Ga, identificaram a Anemia Falciforme como uma entidade que era caracterizada caracterizada por alguns sintomas gerais, tais como: crises agudas de dor nos ossos e nas articulações, gravidade variável, tendência familiar e até que os pais de crianças afetadas pareciam normais. Estas descrições são particularmente precisas em uma determinada nada família da tribo Krobo onde o Dr. Konotey-Ahulu, Konotey Ahulu, em 1974, foi capaz de resgatar os dados referentes à existência da anemia falciforme em nove gerações sucessivas desde 1670, com retrospecto genotípico de todos os membros da família incluindo a idade doo óbito de cada um. Não existe no entanto, qualquer evidência de que estes grupos étnicos relacionassem os vários sintomas a alguma doença do sangue. Outras comunidades da África negra não caracterizaram com esta fidelidade a anemia falciforme. Na Nigéria, a maior nação negra africana, a anemia falciforme aparentemente permaneceu desconhecida como uma entidade distinta até recentemente. Embora os vários dialetos nigerianos sejam ricos em palavras e expressões que descrevem vários dos sintomas comumente encontrados ntrados na anemia falciforme, estes termos não são, entretanto, específicos desta patologia. Assim, não existem evidências de que a anemia falciforme tenha sido identificada como uma entidade distinta nas sociedades tradicionais da Nigéria antes da sua descrição descrição pela Medicina. Entretanto, as descrições mais modernas na imprensa médica estão inevitavelmente baseadas em características da patologia da mesma forma que as observadas pelos povos africanos há algumas centenas de anos. Duas observações, ainda anteriores anteriores ao relato de Herrick, apresentavam características muito sugestivas de doença falciforme. A primeira descrevia achados clínicos e de necrópsia de um escravo, nos Estados Unidos, que apresentava quadro de febre. A segunda referia-se referia ao caso de um homem, em, negro, que apresentava episódios de dor generalizadas, sintomas pleuríticos, icterícia e escaras nas regiões anteriores de ambas as pernas. Após sua morte, a necrópsia não localizou baço, mesmo após cuidadoso exame. Em 1910, o Dr. James B. Herrick descreve descreve então, pela primeira vez, a presença de poiquilócitos observados numa preparação corada do sangue de um estudante de Odontologia. Este estudante também apresentava episódios de dor, que Herrick sugeriu, estivessem associados à presença dos eritrócitos anormais. Após a descrição original de Herrick, uma segunda observação foi feita no Hospital da Universidade de Virgínia. Uma mulher negra de 25 anos de idade apresentava a sintomatologia descrita por Herrick, além de cálculos biliares e bilirrubinúria. O terceiro caso, descrito no Hospital da Universidade de Washington, foi o de uma mulher de 21 anos. O quarto caso era semelhante aos descritos anteriormente quanto à apresentação clínica e laboratorial, ratificando a descoberta de uma nova entidade patológica. patológica. Nesse trabalho foi, pela primeira vez, utilizada a denominação anemia falciforme (Mason, 1922). A demonstração do fenômeno de falcização in vitro foi feita por Emmel em 1917 usando preparações de sangue seladas entre lâmina e lamínula. A partir destes dados, foi estabelecida a

172

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP natureza familiar da doença e sugerida a relação entre o processo de afoiçamento e a baixa tensão de oxigênio. Huck, em 1923, observou que o processo de afoiçamento era reversível. Mais tarde, Sydenstricker relatou a contagem elevada de reticulócitos e a notável hiperplasia eritróide na medula óssea, características nas doenças falciformes. O mesmo autor, posteriormente estudando vários casos, relatou a variabilidade no curso da doença associando à anemia e à icterícia. Estabeleceu Estabeleceu o conceito de crise hemolítica, associada a um conjunto de achados clínicos, como a dor em articulações que, via de regra, não vinha vinculada a exacerbação da hemólise. As várias manifestações clínicas da anemia falciforme bem como a descrição dos diversos di comprometimentos a nível sistêmico foram descritos nos anos subseqüentes. Os trabalhos de Han e Gillespie, em 1927, mostraram a dependência do oxigênio nas mudanças de forma dos eritrócitos. Estes dois pesquisadores atribuíram corretamente o defeito causador do fenômeno falcizante à hemoglobina e não ao eritrócito. Mais tarde, outros pesquisadores, demonstraram que as células com a forma de foice apareciam em suspensão de eritrócitos em tensões de oxigênio menores que 45 mm Hg e que, o fenômeno de falcização lcização era inibido em soluções de pH superiores a 7,4. Por volta de 1940, foi demonstrado que o afoiçamento de eritrócitos, in vitro, ocorria em 7 a 10% dos afro-americanos afro e que este fenômeno ocorreria também in vivo. Ainda em 1930, são descritos "trombos "trombos frescos e organizados em vasos sangüíneos de pequeno e médio calibre e conseqüente infarto" (Steinberg, 1930). A presença de múltiplos infartos em rim e pulmões foi relatada. (Yater & Mollari, 1931). Em seu trabalho de 1934 Diggs, relata, pela primeira vez, estudos minuciosos, post mortem, de pacientes com anemia falciforme nos Estados Unidos e demonstra que repetidos infartos esplênicos levavam à progressiva fibrose desse órgão. O próprio Diggs, alguns anos mais tarde, estuda alguns parâmetros hematológicos hematológ em pacientes com anemia falciforme (HCM, fragilidade celular e morfologia minuciosa dos eritrócitos. Foi notada, pela primeira vez, a presença de eritrócitos que estavam irreversivelmente afoiçados mesmo após adequada reoxigenação. As décadas de 30 e 40 presenciaram uma grande variedade de registros dos aspectos clínicos associados à hemólise e vaso-oclusão. vaso oclusão. As úlceras de perna foram relacionadas à anemia falciforme, nesse período. O priapismo foi pela primeira vez reconhecido como uma complicação na anemia anemia falciforme em 1934, assim como lesões do sistema nervoso central (Diggs, 1934). Rápidos avanços no entendimento das várias facetas da doença ocorreram no período entre 1940 e 1960. Ham e Castle em 1940 estabeleceram o círculo vicioso da patogenia do afoiçamento in vivo, isto é, resultados de afoiçamento em viscosidade sangüínea aumentada, que acarreta uma circulação mais lenta e menor oxigenação, que por sua vez causa mais afoiçamento.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP O estudos de Sherman em 1946 levaram à constatação de que o afoiçamento afoiça era mais eficientemente induzido em células obtidas de pacientes anêmicos do que naqueles sem anemia e também que os eritrócitos em foice desoxigenados exibiam birrefringência ótica, um fenômeno que não era observado em células normais. Isto, provavelmente, provavelmente, foi a primeira evidência de que a forma desoxigenada da hemoglobina falcizante possuía uma estrutura organizada. Na metade da década de 40 estava claro que existiam duas classes distintas de indivíduos que apresentavam eritrócitos que se afoiçavam: a) os indivíduos assintomáticos com o traço falcêmico e b) os pacientes com sintomas e anemia falciforme. Neel, no ano de 1947, sugeriu que a diferença entre estas duas classes de indivíduos poderia ser explicada da mesma forma que a diferença entre talassemia semia maior e menor, ou seja, o traço falcêmico e a anemia falciforme eram, respectivamente, manifestações heterozigota e homozigota do mesmo gene e não o resultado da expressão de um gene cujo efeito era de variável intensidade. Dois anos mais tarde, Beet demonstrou a natureza hereditária da anemia falciforme e do traço falcêmico trabalhando em Zâmbia. No mesmo ano, Neel apresenta evidências similares em pacientes norte-americanos. Uma pediatra de Nova York, Janet Watson, e colaboradores sugeriram em 1948 que a pequena quantidade de células afoiçadas em recém nascidos afro-americanos afro americanos seria explicada por uma anormalidade da hemoglobina de adultos com anemia falciforme e que esta anomalia não estaria presente na hemoglobina de neonatos. Após este longo períodoo de aquisição de conhecimentos, dois grandes avanços ocorreram ao final dos anos 40. Primeiramente em 1949, Linus Pauling demonstra que a hemoglobina obtida de pacientes com anemia falciforme difere eletroforeticamente da hemoglobina de indivíduos normais;; e que os indivíduos portadores do traço falcêmico apresentam uma mistura das hemoglobinas normal (hemoglobina A) e anormal (hemoglobina S). O segundo avanço veio através da análise genética formal de famílias realizada por vários pesquisadores com especial al referência ao trabalho de Neel que demonstrou que ambos os pais de crianças com anemia falciforme apresentavam traço falcêmico. Em 1950 Harris descreve a forma de agulhas para os cristais de hemoglobina S com tamanho de 1 a 15 micra de comprimento. Nos anos que se passaram, algumas outras hemoglobinas com mobilidade eletroforética anormal foram descritas, sem, no entanto, serem capazes de causar o fenômeno de afoiçamento. A primeira delas foi a hemoglobina C, que foi observada associada à hemoglobina S em m um paciente que apresentava uma forma mais branda de anemia falciforme. Por volta de 1953 Singer & Singer demonstraram que a polimerização ou gelificação da deoxideoxi hemoglobina seria inibida pela presença de hemoglobina fetal e favorecida na presença de hemoglobina C. Usando a técnica de "fingerprinting", Ingram em 1956 identificou a anormalidade molecular da hemoglobina "S", confirmando o conceito original de Pauling de que a anemia falciforme era uma doença molecular. Após a descoberta de que a hemoglobina hemoglobina S apresentava padrão eletroforético distinto da hemoglobina A, muitas outras variantes foram encontradas. Inicialmente, as letras do alfabeto foram utilizadas para designá-las; designá las; posteriormente, outras designações foram atribuídas às hemoglobinas anormais, como por exemplo, os nomes dos locais geográficos onde foram encontradas.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Considerando a distribuição geográfica e a incidência mundial dos diferentes tipos de hemoglobinopatias, várias interações entre elas são encontradas. Entre estas interações, as de maior importância, por causa das conseqüências clínicas, são aquelas relacionadas à hemoglobina S, que recebem a denominação genérica de doença falciforme. As doenças falciformes foram então caracterizadas como aquelas nas quais a falcização produz significantes cantes manifestações clínicas. Entre estas figuram as hemoglobinopatias SC, a hemoglobinopatia SD, as S-talassemias talassemias e a anemia falciforme, sendo esta última designação reservada ao estado homozigoto para o gene. Assim sendo, o termo doença falciforme refere-se se aos casos em que a hemoglobina S se polimeriza, tornando-se se falcizada quando desoxigenada. Entre as hemoglobinopatias, as doenças falciformes são as mais freqüentes patologias chegando a atingir 1 em cada 500 indivíduos da raça negra (WHO, 1983). Estas Estas doenças são associadas a manifestações clínicas de gravidade variável e a alta incidência de morbidade e mortalidade. Como exemplo, podemos citar que, sem medidas preventivas para infecções, a taxa de mortalidade em crianças com anemia falciforme atinge 25% até os cinco anos de idade (Leiken et al., 1989). Observa-se se nestes pacientes uma maior susceptibilidade às infecções provocadas por germes encapsulados como Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae.. O risco de sepsis pelo Streptococcus pneumoniae é 600 vezes maior quando comparado a crianças normais, causado pela diminuição da capacidade de opsonização e pela hipofuncionalidade esplênica (Leiken et al., 1989). Uma outra infecção relacionada com grave manifestação clínica da anemia falciforme é a parvovirose, causada pelo parvovírus B19, que é associada a pelo menos 90% dos casos de anemia aplástica entre estes pacientes (Mallouh & Qudah, 1995). Causa freqüente de mortalidade precoce em crianças é o seqüestro esplênico agudo, circunstância tância em que, com o rápido aumento do baço a maior parte do sangue fica retida em seu interior, provocando choque hipovolêmico. Ainda entre os fatores que impedem crianças em idade escolar e adultos jovens de terem uma qualidade de vida satisfatória, são as freqüentes crises vaso-oclusivas oclusivas que, provocando danos teciduais e disfunções orgânicas importantes, também aumentam a mortalidade (Leiken et al., 1989). Embora não haja cura para as doenças falciformes algumas medidas de caráter clínico são indispensáveis eis para o conhecimento da patologia em questão, bem como para a diminuição da morbidade e mortalidade. Entre estas, as mais freqüentemente observadas na literatura são: 1. A orientação aos familiares, fornecendo-se fornecendo se explicações minuciosas sobre a doença, para o reconhecimento precoce das eventuais complicações, bem como sobre a necessidade de acompanhamento médico sistemático. 2. Uso profilático de antibióticos a partir do 3º mês de vida na prevenção das infecções. 3. Uso adicional, ao esquema de imunização tradicional, tradicional, de vacinações específicas para Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e hepatite. É preconizado também, na doença falciforme, a criação de programas voltados para o diagnóstico laboratorial precoce, o conhecimento das manifestações clínicas e programas de tratamento e profilaxia das complicações.

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A Origem e Dispersão da Hb S

Estudos antropológicos associados às análises biomoleculares, sugerem que o gene anormal para a síntese da Hb S pode ter ocorrido entre os períodos Paleolíticos e Mesolítico, Meso aproximadamente há 50 e 100 mil anos, nas regiões centro-oeste centro oeste da África, Índia e leste da Ásia. A causa que motivou a mutação do gene da hemoglobina normal (Hb A) para o gene da Hb S ainda permanece desconhecida. Admite-se, Admite se, porém, que a origem da Hb S foi multiregional, atingindo populações com diferentes características genéticas. Estudos realizados em populações africanas mostram que a expansão do gene da Hb S se deu efetivamente no período pré-Neolítico Neolítico entre 10 mil e 2 mil anos antes de Cristo, Cristo, e foi marcada pela miscigenação entre os povos da região do Saara. Nesse período o Saara era composto por terras férteis, com agricultura desenvolvida para o abastecimento de suas populações. No período Neolítico (3.000(3.000 5000 anos a.C.) ocorreu a transmissão transmissão da malária causada pelo Plasmodium falciparum proveniente da região que hoje corresponde à Etiópia. Destaca-se Destaca durante esse período o aumento do processo migratório, o assentamento de grupos populacionais e o estabelecimento de grandes centros de civilização civilização no vale do rio Nilo, bem como na Mesopotâmia, Índia e sul da China. No continente africano, a malária se propagou da costa oriental para a costa ocidental formando uma faixa coincidente com a alta prevalência de Hb AS. Esse fato levou Allison, em 1954, 1954, a estabelecer uma relação entre o efeito protetivo da Hb S em portadores heterozigotos (Hb AS) frente ao desenvolvimento da malária causada pelo Plasmodium falciparum.. Com a desertificação do Saara ocorrida no período Neolítico posterior (2.000 a 500 anos a a.C.), suas populações migraram para outras regiões da África, atingindo aquelas banhadas pelo mar Mediterrâneo, fato que facilitou sua introdução no continente europeu notadamente no sul da Itália e Grécia. No período Medieval, entre os séculos 1 e 15, 15, o gene da Hb S se expandiu para o leste e sudeste europeu. A introdução da Hb S nas Américas e no Brasil se deu com maior intensidade entre os séculos 16 e 19, motivado pelo tráfico de escravos africanos. A tabela 2.2.1 resume a evolução cronológica da mutação m do gene para Hb S. A trajetória dos negros africanos para o Brasil foi heterogênea, uma vez que o tráfico de escravos se desenvolveu ao longo de 300 anos, carreando escravos de quase toda a costa ocidental da África. Acredita-se Acredita que nesse período entraram traram pelos portos da Bahia e Rio de Janeiro, pelo menos 3,6 milhões de negros africanos, conforme pode ser verificado na tabela 2.2.2. Por outro lado, a migração européia e asiática para o Brasil também foi diversificada destacando principalmente os imigrantes imigrantes portugueses, italianos e espanhóis, além de várias outras raças de origens européia e asiática, conforme mostram as tabelas 2.2.3 e 2.2.4. AdmiteAdmite se, portanto, que esses contingentes populacionais também portadores de alterações genéticas, contribuíram ram para a introdução de vários tipos de hemoglobinas variantes, talassemias, enzimopatias e doenças de membrana eritrocitária, entre outras. Os processos miscigenatórios entre os diferentes povos que constituem a atual população brasileira ocorreram de forma fo gradual ao longo dos séculos, tornando-se tornando se abrangentes a partir do século 20. Este fato pode ser avaliado na literatura disponível, bem como em censos demográficos, de tal forma que até os anos 80 nossa população era composta por 54,2% de brancos, 39,2% de mistos (pardos e mulatos), 5,8% de negros, 0,6% de asiáticos e 0,2% de índios (tabela 2.2.5). Por essas razões, o gene da Hb S dispersou-se se amplamente na população brasileira, interagindo geneticamente com outras hemoglobinas variantes, talassemias, enzimopatias en e esferocitose.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Tabela 2.2.1: Evolução Cronológica da Mutação do Gene para Hb S Ano

Período

Evento

Paleolítico/Mesolítico 50.000-100.000

Ocorrência da mutação do gene betaApara betaS na região centro-oeste oeste da África

Pré-Neolítico

10.000-2.000 anos A.C.

Crescimento populacional no Saara com marcante miscigenação entre povos diferentes

Neolítico

3.000-500 anos A.C.

O aumento da transmissão da malária acompanha a revolução agrícola, e exerce pressão seletiva para o gene betaS

Neolítico Posterior

2.000-500 anos A.C.

Desertificação do Saara promove intensa migração populacional para todas direções, e conseqüente dispersão do gene betaS

Medieval

700 anos D.C. século 15

Dispersão do gene betaS para o sudeste e leste europeu

Moderno

Séculos 15-18

Dispersão do gene betaS pelo tráfico de escravos africanos para Américas (Brasil)

Contemporâneo

Século 19

Fase final do tráfico de escravos africanos (1880) e início da imigração européia para o Brasil

Tabela 2.2.2: Migrações para o Brasil em diferentes períodos, com enfoque para indígenas e africanos.

ANCESTRAIS DOS INDÍGENAS Período

8500 a.C. - 1500 a.C.

Nº de indivíduos

Origem

Mongólia, passando pelo estreito de Bering Migrações através do Oceano Pacífico e da América do Sul, no entanto, não devem ser totalmente afastadas AFRICANOS

Período

1551 - 1701

Nº de indivíduos

580.000

Origem

Século XVI: principalmente da área entre a ilha São Tomé e Angola Século XVII: principalmente de Angola, pelos portos de Luanda e Benguela. Outros da Costa da Mina 177

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Período

1701 - 1810

Nº de indivíduos

1.891.000

Origem

Aproximadamente 2/3 vieram de Angola, pelos portos de Luanda e Benguela, de uma região situada entre os cabos Lopez e Negro. Os restantes vieram da Costa da Mina e da região limitada pelos cabos Monte e Lopez, com Ajudá como porto principal

Período

1810 - 1857

Nº de indivíduos

1.145.000

Origem

Principalmente de Angola, em grande parte saindo pelo porto de Benguela

fonte: Salzano F. M. Em busca das raízes. Ciência Hoje 1986; 5;48-53. 53.

Tabela 2.2.3: Migrações para o Brasil em valores quantitativos de portugueses, europeus, japoneses e chineses para o Brasil. EUROPEUS Período

1500 - 1640

Nº de indivíduos

65.000

Origem

Portugal

Período

1640 - 1808

Nº de indivíduos

400.000

Origem

Portugal

Período

1808 - 1970

Nº de indivíduos

5.100.000

Origem

Europa em geral ASIÁTICOS RECENTES

Período

1900 - 1970

Nº de indivíduos

248.000

Origem

Japão

Período

1900 - 1970

Nº de indivíduos

10.500

Origem

China

fonte: Salzano F. M. Em busca das raízes. raízes Ciência Hoje 1986; 5;48-53. 53. 178

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Tabela 2.2.4: Valores estimativos da composição básica racial brasileira, dispostos cronologicamente desde 1500. ANO

ORIGEM ÉTNICA OU RACIAL

POPULAÇÃO

1500

indígenas

2.0 milhões

1551 - 1857

africanos

3.6 milhões

1500 - 1944(*)

portugueses

2.6 milhões

1884 - 1944(*)

italianos

1.2 milhão

1844 - 1944(*)

espanhóis

600 mil

1884 - 1944(*)

europeus e asiáticos

1.0 milhão

(*) 1944 foi o último censo realizado pelo IBGE, com procedência de estrangeiros para o Brasil

Tabela 2.2.5: Variação estimada da composição étnica brasileira em 480 anos. GRUPO ÉTNICA OU GEOGRÁFICO

1500

1890

1980

Indígena

2.000.000

440.000

200.000

Brancos

6.302.000

65.000.000

Mistos

6.000.000

46.000.000

Negros

2.000.000

7.000.000

Asiáticos recentes

733.000

fonte: Censos demográficos Salzano F. M. Em busca das raízes. raízes Ciência Hoje 1986; 5;48-53.

As Principais Descobertas Científicas

A anemia falciforme é conhecida há séculos por povos de diferentes regiões da África. Exames radiológicos de ossos de pessoas que viveram na África há mais de 7.000 anos mostraram lesões características dessa condição mórbida. É interessante destacar que os doentes eram identificados por tatuagem incisional para facilitar o diagnóstico e proibir o casamento com membros sadios do grupo.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Observações científicas da doença das células falciformes datam de um século e meio. Os trabalhos de Cruz Jobim, no Rio de Janeiro, em 1835; de Accioli, na Bahia, em 1908; de Lebby, em 1846; e de Hodenpyl, em 1896, nos Estados Unidos podem ser considerados como os pioneiros a respeito dessa doença. Entretanto, foi Herrick, em 1910, quem observou a forma anormal dos eritrócitos do sangue periférico de um estudante negro, procedente procede da Jamaica, portador de um grave quadro anêmico acompanhado de icterícia, complicações pulmonares e úlceras de membros inferiores. Quando o terceiro caso, semelhante ao descrito por Herrick, foi relatado, em 1917, cogitou-se se a possibilidade de essa doença doença ser de origem hereditária pelo fato de se encontrar eritrócitos com idênticas deformações no sangue dos pais do paciente. O termo doença falciforme - "sickle cell disease" - foi empregado pela primeira vez, em 1922, por Mason. Este autor relacionou, inclusive, inclusive, algumas características comuns entre os portadores dessa doença: todos eram negróides, apresentavam icterícia, anemia intensa, reticulocitose e eritrócitos falcizados no sangue periférico. Em 1927, Hahn e Gillespie demonstraram a dependência do fenômeno nômeno da falcização com a tensão de oxigênio, atribuindo o defeito à hemoglobina, e não somente ao glóbulo vermelho. Três anos depois, esses resultados foram confirmados in vivo,, quando se observou a formação de células falcizadas, especialmente quando a tensão de oxigênio caía abaixo de 40 a 45 mmHg. Em 1935, Diggs e Bill notaram que algumas dessas células se mantinham na forma falcizada, mesmo após a reoxigenação. Um ano depois, Ham e Castle propuseram uma explanação da fisiopatologia do processo de falcização. falc Essa teoria sustentava a hipótese de que ocorria um "ciclo vicioso de estase eritrocitária" nas células falcizadas do sangue periférico, causando um aumento de viscosidade sangüínea com demora do fluxo sangüíneo através dos capilares e diminuição da da tensão de oxigênio, provocando mais falcização. Qualquer fato que aumentasse a viscosidade do sangue exacerbaria a falcização dos eritrócitos. Em 1946, Sherman demonstrou que as células falciformes, ao serem desoxigenadas, exibiam birrefringência óptica. Esse fato consistiu na primeira evidência de que a hemoglobina S, na ausência de oxigênio, apresentava uma estrutura ordenada no interior dos eritrócitos, e sugeriu a Linus Pauling que a Hb S era diferente da hemoglobina normal. Em 1949, Pauling e seus colaboradores laboradores mostraram essa diferença por meio da mobilidade eletroforética e atribuíram esse fenômeno à mudança de carga da globina (fig ( 2.3.1). ). Em 1956, Ingram, utilizando a técnica de "fingerprint" (eletroforese bidimensional, associada com cromatografia), cromatografia), demonstrou que a anormalidade química da Hb S era devida à substituição do ácido glutâmico pela valina, na posição número 6 da cadeia beta (b 6 Glu ® Val), produzindo a perda de duas cargas negativas por molécula da hemoglobina (fig. ( 2.3.2).

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Figura 2.3.1 - Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, tampão alcalino, mostrando a separação dos genótipos AA, AS e SS.

Figura 2.3.2 - Fingerprinting das hemoglobinas AA e SS, acima a seta 1 mostra a posição normal do péptido que contém o aminoácido aminoácido glutâmico na posição 6 da globina beta (Hb AA). Abaixo a seta 2 mostra a mudança do péptido, devido a troca do aminoácido glutâmico pela valina na posição 6 da globina beta (Hb SS).

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A partir de 1978, com as observações iniciais de Kan e Dozy, novo impulso impulso foi dado ao estudo da Hb S, pela introdução de técnicas de biologia molecular. Por meio de enzimas obtidas de bacteriófagos específicos, foi possível admitir que a Hb S teve múltiplas origens. Esses estudos foram realizados em populações da raça negra negr da África, Jamaica e em afro-americanos, americanos, e pela análise do agrupamento dos genes tipo beta do cromossomo 11 concluíram que há, pelo menos, cinco tipos de Hb S: SS-Benin, Benin, SS-Bantu, SS SS-Senegal, SS-Camarões, SS-Árabe Árabe-indiano, todas com resultado final da troca oca de ácido glutâmico por valina, na posição 6 da globina beta, porém, com diferentes extensões de lesões moleculares ocorridas ao longo do agrupamento dos genes beta, delta, gama-alanina, alanina, gama-glicina, gama glicina, pseudogene beta e épsilon. Essas descobertas esclareceram ceram a diversidade clínica que se observa em diferentes doentes com anemia falciforme, alguns com evolução clínica benigna, e outros com constantes complicações. Os estudos que sucederam as descobertas de Kan e Dozy evoluíram para outros objetivos, entre os quais se destacam aqueles que visam ao uso da quimioterapia para estimulação específica da síntese de Hb Fetal pelos genes gama. Esses estudos se basearam no fato de que, quando um indivíduo com anemia falciforme (Hb SS) tem, associada a esta condição, um outro defeito genético caracterizado pela persistência hereditária de Hb Fetal (PHHF), com razoável elevação do nível de Hb Fetal, suas condições fisiopatológicas são muito melhores do que as daquele que é apenas homozigoto SS. Assim, a busca de drogas que pudessem estimular os genes gama "adormecidos" após o nascimento, fez com que De Simone e seus colaboradores, em 1982, utilizassem a droga antileucêmica 5-azacitidina 5 azacitidina que produzia sensível aumento da síntese de Hb Fetal nos doentes leucêmicos. Essa droga, droga, utilizada em doente com anemia falciforme, também causava a elevação da Hb Fetal, cuja presença nos eritrócitos com Hb S "inibe" o processo de falcização. Pelo fato de 5-azacitidina azacitidina ser tóxica e potencialmente carcinogênica, seu uso foi desestimulado, mas a busca de outras drogas estimulantes dos genes gama continuou com a hidroxiuréia e, atualmente, com os butiratos. Finalmente, destaca-se se que com a evolução tecnológica oferecida pela biologia molecular, especialmente as técnicas de isolamento e clonagem clonagem de genes de globina, tem estimulado estudos no sentido da realização da terapia gênica. A terapia gênica se resume na correção das alterações ou substituições das bases nitrogenadas no DNA ou no RNA mensageiro, revertendo 182

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP o defeito desde as células hematopoiéticas hematopoiéticas mais primitivas. Além disso, essa tecnologia tem permitido também a realização de análises de DNA da globina beta, visando à prevenção pré prénatal de recém-nascidos nascidos com doença falciforme.

Resistência das Células com Hb S ao Plasmodium faciparum

Há ampla aceitação científica de que a alta freqüência da anemia falciforme, talassemias e deficiência de glicose-6-fosfato fosfato desidrogenase (G6PD) observada em algumas áreas tropical e subtropical da África e Ásia se devem à resistência contra os efeitos deletérios deletérios da malária (Plasmodium falciparum)) conferidos aos portadores heterozigotos dos traços falcêmicos (Hb AS) e talassêmico, bem como aos deficientes de G-6PD G (fig. 2.4.1).

Figura 2.4.1. Acima: distribuição da malária causada por P. falciparum na África e Ásia e Oceania. Abaixo: distribuição da anemia falciforme, talassemia e outras hemoglobinopatias em áreas coincidentes à da malária.

Especialmente com referência à possível proteção dos heterozigotos falcêmicos contra o P. falciparum, Allison, 1954, 954, obteve três diferentes formas de evidências dessa relação. Primeiro, ele demonstrou que crianças com traço falciforme tinham baixa parasitemia; segundo, ele observou que adultos com traço falcêmico inoculados com P. falciparum não tinham infecções 183

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP tão freqüentes quanto àqueles com hemoglobinas normais (Hb AA); e terceiro, ele mostrou que a freqüência do gene betaS (bS) na África oriental está relacionada com a endemicidade da malária. Outras evidências deram suporte à teoria de Allison, e uma em particular partic se refere ao fato de que os óbitos ocorridos por malária cerebral na infância era muito menos comuns em crianças com traço falcêmico quando comparado com crianças portadoras de hemoglobinas normais. Qual ou quais as bases científicas que dão consistência consistência à hipótese malária? Luzzato e colaboradores, em 1970, sugeriram que quando o parasita entra em eritrócitos contendo Hb S, utilizam o oxigênio celular e desencadeiam a polimerização da deoxi-Hb deoxi S e, conseqüentemente, a falcização do eritrócito. O eritrócito eritrócito falcizado é seqüestrado no sistema retículo endotelial (SRE) do baço ou de outros órgãos, impedindo que o P. falciparum complete seu ciclo vital. Pesquisas realizadas por Friedman, 1978, demonstraram que eritrócitos com Hb S cultivados "in vivo" e sob baixa tensão de oxigênio similar ao do sangue venoso, impediam o desenvolvimento do P. falciparum. falciparum. Por outro lado, pesquisas realizadas em eritrócitos de pessoas com deficiência de G-6PD G 6PD concluíram que a oxidação que se processa no interior da célula é um outro fator que impede o desenvolvimento do ciclo do P. falciparum. falciparum Recentes pesquisas realizadas em nosso laboratório mostraram que o nível de oxidação da Hb S no traço falcêmico é 2,5 vezes superior ao dos eritrócitos com hemoglobinas normais, e certamente a contínua oxidação causada pela metahemoglobina S (meta Hb S) deve ser deletéria ao P. falciparum.. O processo da oxidação da Hb S está exposto com detalhes no item 4.3 (os efeitos oxidativos da deoxi-Hb Hb S).

Genética, Química E Biologia Molecular Molecul Da Hb S Mutação e Consequências Estruturais na Globina Beta S

A Hb S é causada por uma mutação do gene beta da globina, produzindo uma alteração estrutural na molécula. Por ser uma anomalia da globina beta, as características clínicas do estado homozigoto só serão percebidas após a estabilização da produção das globinas que ocorre por volta do sexto mês de vida. No gene da globina beta S, há a substituição de uma base nitrogenada do códon GAG para a GTG, resultando na substituição do ácido glutâmico glutâm (Glu) pela valina (Val) na posição número 6 da globina beta (figura ( 3.1.1). ). A valina é um aminoácido neutro (pI ~ 6) e o ácido glutâmico é carregado negativamente (pI=2,8). Essa troca altera o pI da Hb S, tornando-aa carregada menos negativamente (pI da Hb A= 6,8; pI da Hb S > 6,8) fato que resulta em uma mobilidade mais lenta da Hb S, quando comparada com a Hb A em eletroforese alcalina (pH 8 a 9), conforme mostra a figura 3.1.2. A troca de aminoácidos que resulta na Hb S abala estruturalmente a molécula, molécula, pois se na Hb A o ácido glutâmico da posição 6 da globina beta auxilia no afastamento das moléculas desoxigenadas de hemoglobinas, a entrada da valina nesta posição favorece a polimerização sob condições de baixo teor de oxigênio, resultando na deformação ão do eritrócito com a forma afoiçada (figura ( 3.1.3).

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Figura. 3.1.1.. Modelo da estrutura terciária da globina beta com a seta indicando a posição do sexto aminoácido, em que o ácido glutâmico é substituído pela valina.

Figura 3.1.2.. Eletroforese de hemoglobinas em acetado de celulose, tampão alcalino (pH 8.5). A mobilidade das hemoglobinas se desenvolve do pólo negativo para o positivo. A análise eletroforética de três amostras de sangue de pessoas com o traço falciforme (Hb S) mostra most que a Hb A se move com maior velocidade em direção ao pólo negativo quando comparada com a Hb S. A Hb A tem o ácido glutâmico na posição 6 da globina beta, fato que a deixa com maior número de

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP cargas negativas. A Hb S é produto da substituição do ácido glutâmico pela valina - um aminoácido neutro, assim a Hb S é menos carregada negativamente, fato que influi no seu deslocamento mais lento em direção ao pólo positivo.

Figura 3.1.3.. Deformação do eritrócito com Hb S, geralmente caracterizado pela forma afoiçada. a

As consequências provenientes da desoxigenação da Hb S resulta na agregação de moléculas ....2ß2S que se juntam e se cristalizam facilitando contatos entre aminoácidos distantes entre si. Esses contatos, realizados pela valina na posição 6 da globina beta com fenilalanina da posição 85 e leucina da posição 88 da mesma globina, promovem a formação de longos polímeros em forma de feixes de moléculas de Hb S agregados. A desestruturação da molécula da Hb S desoxigenada é, portanto, o principal desencadeamento desencadeamento do processo da falcização dos eritrócitos com Hb S. Informações detalhadas desse processo estão apresentadas no item 4 desse capítulo (Fisiopatologia da Hb S).

O Fenótipo Falcêmico

A doença falciforme agrupa vários tipos de associações entre a Hb S e outras hemoglobinas variantes, com talassemias alfa e beta, além do estado de homozigose (Hb SS). O uso da designação doença falciforme sintetiza situações clínicas e patológicas comuns, com variável gravidade, cujo conjunto caracteriza o fenótipo da doença. Assim, o fenótipo falcêmico se destaca principalmente por anemia hemolítica crônica, crises de dores, icterícia, infecções constantes, e graus diversificados de morbidade e mortalidade. Desde o início da descoberta científica da anemia falciforme rme tem sido observado ampla diversidade clínica entre os doentes, fato que atrai o interesse de pesquisadores na busca de explicações para os diversos fenômenos decorrentes da falcização. Com o avanço da tecnologia laboratorial foi possível caracterizar diferentesgenótipos que explicam em parte a diversidade genotípica da doença. Entretanto, o fenótipo tem um valor histórico, enriquecido por detalhes que foram obtidos dos muitos casos descritos na literatura científica.

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Os Genótipos Falcêmicos

Com a aplicação da técnica de eletroforese no estudo das hemoglobinas humanas foi possível identificar várias combinações entre diferentes diferentes hemoglobinas variantes com hemoglobina normal, com talassemias alfa e beta, e dessa forma estabelecer os genótipos das hemoglobinas. Os genótipos falcêmicos incluem todas associações em que faz parte a Hb S. Entre os principais genótipos falcêmicos destacam stacam-se os seguintes: Hb AS (a2Ab2A / a2Ab2S) - traço falciforme ou falcemia heterozigota Hb SS (a2Ab2S) - anemia falciforme Hb SD (a2Ab2S / a2Ab2D) - doença da Hb SD Hb SC (a2Ab2S / a2Ab2C) - doença da Hb SC Hb S / talassemia b0 ou Hb SF (a2Ab2S / a2A g2) - microdrepanocitose ou S/Beta zero talassemia 6. Hb S / talassemia b+ ou Hb SFA (a2 Ab2S / a2Ab2A / a2g2) - microdrepanocitose ou S/Beta mais talassemia 7. Hb SS / talassemia alfa (a2Ab2S / b4S) ou Hb SH 8. Hb S / P.H.H.F. ou Hb SF (a2Ab2S / a2A g2) - Hb S associada à persistência hereditária da Hb Fetal 1. 2. 3. 4. 5.

Além desses genótipos descritos na população brasileira e em várias regiões do mundo, há outros genótipos mais raros, restritos a alguns povos e regiões, como são os casos dos genótipos Hb SE (sudeste asiático), Hb SO Arábia (Arábia Saudita e Emiratos Árabes), Hb S/Menphis (USA). A tabela 3.3.1 resume as principais características clínicas e laboratoriais dos genótipos de Hb S. Detalhes sobre as alterações laboratoriais poderão ser obtidos no item 5 (Alterações ( Laboratoriais nas Doenças das Células Falciformes). Falciformes A seguir, apresentamos breve resumo sobre os principais genótipos descritos na população brasileira. Hb AS - Traço aço Falciforme ou Falcemia Heterozigota O traço falciforme caracteriza o portador assintomático, pois é o heterozigoto falcêmico representado por Hb AS. Assim, o portador de Hb AS não padece de doença e não apresenta alterações hematológicas (tabela tabela 3.3.1). 3.3.1 Os processos vaso-oclusivos oclusivos sob condições fisiológicas normais inexistem, e portanto não há mortalidade e nem morbidade seletivas. Geralmente detecta-se se o portador de Hb AS em estudos populacionais, ou análise devido à presença do gene da hemoglobina S em m algum membro da família.

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Figura 3.3.1. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, pH 8,5, de três amostras de hemolisado de eritrócitos. (1) Hb A + Lepore; (2) Hb AA; (3) Hb AS. A Hb S e Hb Lepore apresentam a mesma mobilidade eletroforética em pH alcalino (pH 8 a 9). A Hb Lepore geralmente tem concentração baixa (10 a 15%) em relação à Hb S do traço falcêmico (20 a 45%). Na Hb A + Lepore é comum a Hb A2 estar diminuída e o portador apresentar anemia microcitica e hipocrômica, similar à da talassemia tal beta menor.

Figura 3.3.2. Eletroforese de hemoglobinas em agarose ácida, pH 6.0, de três amostras de solução de hemoglobina. (1) Hb AS; (2) Hb AA; (3) Hb AC. Neste tipo de eletroforese o sentido se faz do pólo positivo para o pólo negativo, devido ao tampão ácido. A eletroforese em agarose ácida é aplicada para diferenciar a Hb S da Hb D, e a Hb S da Hb Lepore, todas com igual posição na eletroforese alcalina. Na eletroforese ácida, as hemoglobinas D e Lepore migram na mesma posição da Hb A, enquanto a Hb S se separa da Hb A. Outra característica da eletroforese ácida é a separação da Hb Fetal, que migra com maior mobilidade em relação à Hb A.

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Figura 3.3.3. Teste de solubilidade para diferenciar Hb S de outras hemoglobinas. A Hb S (AS, SS, SC, S/tal. b, etc.) é insolúvel em soluções hipertônicas quando submetida à redução com ditionito de sódio. É um método qualitativo para indicar, ou não, presença de Hb S sem qualificar o genótipo. O tubo da esquerda (transparente) é de Hb AA, e o da direita direita é de Hb AS.

Geneticamente a condição heterozigota se deve à herança do gene da globina bS por parte de um dos pais, juntamente com o gene da globina bAproveniente do outro. Nessa condição, a concentração da Hb A é sempre mais elevada do que a Hb S (figuras ( 3.1.2 e 3.3.1). 3.3.1 O diagnóstico laboratorial é feito por técnicas eletroforéticas em pH alcalino (8 a 9) ou pH ácido (5 a 6,5), conforme mostram as figuras 3.3.1 e 3.3.2.. Outros testes que apenas acusam a presença de Hb S, sem identificar o seu genótipo genótipo (AS, SS, SC, etc.), são os testes de falcização e solubilidade (figura 3.3.3). O traço falciforme pode estar associado ocasionalmente a condições clínicas graves, que incluem: hipotermia, hematúria, aumento do risco às infecções do trato urinário durante duran a gravidez e retardo constitucional da puberdade. Os portadores de Hb AS, quando iniciam quadro de hipóxia, raramente desenvolvem sintomas relacionados à vaso-oclusão. vaso oclusão. No entanto, existem relatos de morte súbita e complicações clínicas em portadores de traço falciforme expostos a condições de baixa tensão de oxigênio, como ocorre em anestesias sem eficiente suplementação de oxigênio durante e após os processos cirúrgicos, em esforços físicos extenuantes associados à desidratação e em condições adversas de de trabalho, por exemplo, locais com baixa tensão de oxigênio.

189

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Tabela 3.3.1. Aspectos laboratoriais e clínicos de hemoglobinopatias S. Genóti Anemia Esplenomeg Outras po alia Característi cas Clínicas

Sangue Periférico

Falcizaç Clínica ão

Observaç ões

Nenhu ma

Não

Geralmente nenhuma

Normal

Positivo

Nenhu ma

Pode ocorrer hematúria

Grave

Sim. Raro após a infância

Crises de dores irregulares. Infartos ósseos. Aumento de infecções bacterianas

Formas Positivo falcizadas. Células em alvo. Hipocromia . Policromasi a

Grave

Incapacida de progressiv a. Diminuiçã o do período de vida

Discreta Comum a modera da

Crises de dores irregulares. Infartos ósseos. Retinopatia nos adultos

AnisoPositivo poiquilocito se, células em alvo. Hipocromia . Policromasi a

Discreta ou modera da

Gravidade clínica durante a gestação. Cristais intracelula res

S/b-tal

Modera Ocasional da ou grave

Crises de dores irregulares. Infartos ósseos

AnisoPositivo poiquilocito se, células em alvo. Hipocromia . Policromasi a

Modera Ausência da a de Hb A grave na S/b0-tal.

Discreta Comum a modera da

Pode haver artralgias. Dores abdominais

Formas Positivo falcizadas. Células em alvo. Policromasi a

Discreta a modera da

SO Grave ARÁBI A

Sim. Raro após a infância

Discreta Não

Similar à Hb Similar à SS Hb SS

Geralmente nenhuma

Distinguese Hb SS da Hb SD por eletrofores e em ágarácido

Positivo

Modera Pode ser da a confundid grave a com Hb SC. Distinguese por eletrofores e em ágarácido

Hipocromia Positivo .

Discreta Distinguese da Hb 190

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Microcitose

SC por eletrofores e em ágarácido

S/a-tal.

Nenhu Não ma a discreta

Geralmente nenhuma

Hipocromia Positivo . Microcitose

Nenhu Presença de Hb H ma a discreta na eletrofores e

S/PHH F

Nenhu Não ma a discreta

Não há infartos recorrentes

Normal. A Positivo Hb F apresentase distribuída homogenea -mente por eluição ácida

Nenhu Por ma a eletrofores discreta e confundese com S/b0-tal.

Anemia Falciforme (Hb SS)

Em contradição com os portadores de traço falciforme, a história de pacientes com anemia falciforme revela, quase invariavelmente, uma doença continuamente agressiva, caracterizada por repetidos episódios agudos, geralmente do tipo vasculoclusivo, com ou sem efeitos mielodepressivos (deficiência temporária da medula óssea em produzir eritrócitos). Os sinais e sintomas ntomas são especialmente causados por: anemia crônica, episódios de agravamento de anemia, dores nas juntas e nas extremidades de mãos e pés, dores abdominais, necrose asséptica da medula óssea, acidentes cerebrovasculares, infartos pulmonares, etc. Os recém-nascidos, nascidos, portadores de anemia falciforme, geralmente não apresentam os problemas causados por essa hemoglobinopatia devido à alta concentração de Hb Fetal presente nos eritrócitos, durante as primeiras semanas de vida. Entretanto, os sintomas e os efeitos efei dessa anemia podem ocorrer quando a mãe - portadora de Hb SS - apresenta anemia e complicações durante a gravidez. A doença é detectada durante os primeiros anos de vida, com manifestação de anemia grave, hepatomegalia, esplenomegalia, ou por crises dolorosas dolorosas manifestadas por inchaço e calor nas mãos ou pés e que são conhecidas por síndromes de mãos e pés. Essa doença apresenta um curso constante, em que se combinam os sinais, sintomas e limitações da anemia persistente com a ocorrência freqüente de vários vários tipos de crises. Os exames laboratoriais indicam a presença de anemia grave (tabela (tabela 3.3.2). 3.3.2 Os valores de hemoglobina variam de 5 a 9 g/dl, que associados a uma acentuada queda de hematócrito e contagem de eritrócitos resultam em índices normocíticos e normocrômicos. No esfregaço de sangue periférico observa-se se variações nos tamanhos e nas formas dos eritrócitos. De 0,5 a 20% dos eritrócitos estão falcizados; formas de células em alvo, microcitos e alguns esferócitos também podem ser observados no sangue sangue periférico. Os reticulócitos estão geralmente elevados acima de 10%. Os normoblastos são freqüentemente identificados no sangue periférico, bem como pontilhados basófilos e corpos de Howell-Jolly. Howell Jolly. A leucocitose é moderada (12.000 a

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP 17.000/mm3), contendo alguns granulócitos (neutrófilos) imaturos na circulação periférica. As plaquetas podem estar discretamente elevadas. O exame da medula óssea apresenta hiperplasia normoblástica e áreas de medula vermelha ativa podem ser encontradas em regiões geralmente ocupadas por medulas amarelas. A coloração de ferro na medula revela sobrecarga desse mineral nos eritrócitos e eritroblastos. Haptoglobinas livres (proteínas encontradas no plasma normal que especificamente se liga e transporta hemoglobina extracelular) estão e geralmente ausentes. A clínica dos pacientes portadores de anemia falciforme é descrita no capítulo 6 (Controle ( Clínico das Doenças Falciformes) Falciformes Tabela 3.3.2. Alterações laboratoriais específicas na anemia falciforme. Concentração da Hb S 90 a 100% Dosagem de Hb Fetal

2 a 10%

Tipo de anemia

Normocítica e normocrômica

Dosagem de Hb g/dl

5-9

Reticulócitos

5 a 30%

Leucócitos

acima de 10 mil durante as crises. Pode ocorrer desvio à esquerda.

Plaquetas

plaquetose, com formas anormais

Fragilidade osmótica

diminuída

Fragilidade térmica e mecânica

aumentada

Bilirrubina indireta

elevada, acima de 5 mg/dl

Urobilinogênio urinário

elevado

Urobilinogênio fecal

elevado

Hematúria

freqüente

Ácido úrico sérico

pode estar elevado

Fosfatase alcalina sérica

elevada nas crises

Medula óssea

hiperplasia das células eritróides

Ferro sérico

normal ou amentado

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Hb SD - Doença da Hb SD

A Hb D é uma hemoglobina variante com a mesma mobilidade eletroforética da Hb S, porém sem causar danos fisiológicos ou morfológicos ao eritrócito. Há vários tipos diferentes de Hb D descritos em diversas regiões: Hb D Punjab ou Los Angeles (b 121 glutâmico ® glutamina), Hb D Ibadan (b 87 treonina ® lisina), Hb D Bushman (b 16 glicina ® arginina) e Hb D Iran (b 22 glutâmico ® glutamina). Desses tipos a Hb D Punjab ou Los Angeles é a mais comum de ser identificada em várias regiões do mundo. No Brasil a Hb AD Punjab é prevalente na proporção de 1 caso para cada 5.000 analisados, em média. Assim, é possível a associação da Hb S com Hb D Punjab em nossa população, e essa dupla heterozigose é conhecida por Hb SD ou doença da Hb SD. A anemia é similar a Hb S/talassemia beta, com graus variáveis variáveis entre discreta a moderada, concentração de hemoglobina total entre 9 a 13 g/dl, VCM normal e ausência de Hb Fetal. Ocasionalmente o doente SD pode apresentar esplenomegalia, e da mesma forma pode ocorrer artralgias e dores abdominais. No esfregaço sangüíneo a morfologia eritrocitária mostra células em falcização, células em alvo e policromasia (figura ( 3.3.4). Pelo fato da Hb SD ter a mesma mobilidade eletroforética que a Hb SS em tampão alcalino, a melhor forma de diferenciá-las las é por meio de eletroforese eletroforese de hemoglobina em gel de agarose com tampão ácido. Neste tipo de eletroforese ácida a Hb D separa-se separa se da Hb S, posicionando-se posicionando na mesma região da Hb A.

Figura 3.3.4. Esfregaço de sangue periférico de paciente com Hb SD - Doença da Hb SD. Observar células em alvo, eritrócito em falcização, esferócitos, etc. A presença de esferócitos se deve à hemólise.

Hb SC - Doença da Hb SC

A Hb C é uma hemoglobina variante comum na costa ocidental da África, especificamente na região noroeste daquele continente. continente. No Brasil, a prevalência do genótipo Hb AC é em média 0,5%, e entre pessoas negras chega a 3%. Há dois tipos de Hb C descritas na literatura, a Hb C 193

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP (b6 glutâmico ® lisina) e Hb C Harlem (b73 aspártico ® asparagina + b6 glutâmico ® valina). A Hb C Harlem é muito rara e por ter dupla mutação, uma das quais similar à da Hb S, pode causar discreta falcização eritrocitária. Assim, a Hb C é a forma mais freqüente de associação com a Hb S, causando a doença da Hb SC. A anemia é variável de discreta a moderada, com a hemoglobina total situando-se se entre 9 e 13 g/dl. O VCM é normal, apesar da moderada alteração morfológica dos eritrócitos no esfregaço sangüíneo. É comum a presença de células em falcização, eritrócitos em alvo (codócitos), hipocromia, policromasia e cristais de Hb C (figura ( 3.3.5). ). Os doentes com Hb SC apresentam crises de dores intermitentes, infartos ósseos, e retinopatia nos adultos. Gestantes portadoras de Hb SC devem ter acompanhamento especial durante a gestação. A análise laboratorial específica específica é realizada por meio de eletroforese de hemoglobina em tampão alcalino, com a Hb C separando-se separando se da Hb S e posicionando-se posicionando junto com a Hb A2 (figura 3.3.6). ). Em eletroforese de hemoglobina em gel de agarose com tampão ácido a Hb C é mais lenta que a Hb S e posiciona-se se junto ao local de aplicação da amostra (figura 3.3.2).

Figura 3.3.2. Eletroforese de hemoglobinas em agarose ácida, pH 6.0, de três amostras de solução de hemoglobina. (1) Hb AS; (2) Hb AA; (3) Hb AC. Neste tipo de eletroforese o sentido se s faz do pólo positivo para o pólo negativo, devido ao tampão ácido. A eletroforese em agarose ácida é aplicada para diferenciar a Hb S da Hb D, e a Hb S da Hb Lepore, todas com igual posição na eletroforese alcalina. Na eletroforese ácida, as hemoglobinas D e Lepore migram na mesma posição da Hb A, enquanto a Hb S se separa da Hb A. Outra característica da eletroforese ácida é a separação da Hb Fetal, que migra com maior mobilidade em relação à Hb A.

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Figura 3.3.5. Esfregaço de sangue periférico de paciente com Hb SC - Doença de Hb SC. O destaque desta foto é a presença de cristais de Hb C acumulados na periferia de um eritrócito (seta).

Figura 3.3.6. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, pH 8.5. Da esquerda para direita (1) AF; (2) AF; (3) SC; (4) AA; (5) AA; (6) SC. As duas primeiras amostras, com Hb Fetal elevada, são de pacientes com talassemia beta maior que receberam transfusão de sangue com hemoglobinas normais. Outra observação mais detalhada mostra que adiante da Hb A nas aplicações aplicações 1, 2, 4 e 5 há em todas elas uma fração rápida e difusa, com baixa concentração, onde estão concentradas as hemoglobinas. A1a, A1b e A1c, sem que seja possível distinguí-las. distinguí las. Na Hb SC as concentrações de Hb S e Hb C são equilibradas.

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Hb S / Talassemia β 0 ou Hb SF (Micro-Drepanocitose) (Micro

A ocorrência da interação entre Hb S e talassemia b no Brasil se deve ao alto grau de miscigenação entre as etnias que participaram da formação do brasileiro. Embora a Hb S seja muito prevalente por meio de genótipo genótipo AS entre africanos, outros povos também apresentam prevalências elevadas, por exemplo: sul da Itália, Arábia Saudita e Emiratos Árabes. Por outro lado, a talassemia beta que apresenta alta prevalência do seu estado heterozigoto (Hb A/btal) entre povoss dos países banhados pelo mar Mediterrâneo, teve ao longo dos anos a sua disseminação entre povos da península ibérica (Portugal e Espanha) e África. Por essas razões, o genótipo S/talassemia beta pode ser encontrado entre pessoas de cor branca e de cor negra. n A Organização Mundial da Saúde estima que nascem anualmente no Brasil perto de 600 crianças com o genótipo S/talassemia beta. A Hb S/talassemia beta pode ser identificada laboratorialmente em dois genótipos distintos, a Hb S/talassemia b0 e Hb S/talassemia S/tala b+. A talassemia b0 é indicativo que o gene da globina beta está totalmente inativo para sintetizar a Hb A, assim os portadores do genótipo Hb S/tal b0 apresentam apenas as hemoglobinas S (com concentrações variáveis entre 70 e 90%), Fetal (5 a 20%) e Hb A2 (entre 4 e 7%). Essas hemoglobinas podem ser facilmente fracionadas por eletroforese de tampão alcalino em acetato de celulose ou em gel de agarose. A anemia nos pacientes com o genótipo S/b0 talassemia é geralmente grave, com a concentração de hemoglobina moglobina total oscilando entre 7 e 10 g/dl. O VCM e HCM estão diminuídos e a análise da morfologia eritrocitária mostra acentuada aniso-poiquilocitose, aniso poiquilocitose, com microcitose, esquisócitos, eritroblastos, policromasia e células em alvo, além de células em fase de de falcização (figura ( 3.3.7).

Figura 3.3.7. Esfregaço de sangue periférico de paciente com Hb S/talassemia b0, ou Hb SF. Por meio desse esfregaço observa--se se presença de células microcíticas, hipocrômicas e falcizadas, daí a denominação de micro-drepanocitose.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Hb S / Talassemia β + ou Hb SFA

A introdução do genótipo Hb S/talassemia b+ é a mesma descrita no item 3.3.5 (Hb ( S/tal. b0). O genótipo específico de Hb S/tal. b+ se deve quando o gene herdado da globina beta sintetiza apenas parte da Hb A e, por isso, a concentração da Hb A é menor que da Hb S (figuras ( 3.3.8 e 3.3.9). A Hb A2 geralmente está discretamente elevada. Por vezes é possível identificar na eletroforese de hemoglobina em tampão alcalino a presença de Hb Fetal entre 5 a 10%.

Figura 3.3.8. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, pH 8.5. Da esquerda para a direita: (1) Hb AA; (2) Hb AA; (3) Hb AS. Observar que a Hb AS apresenta maior concentração da Hb S em relação à Hb A. Esse fato se deve ao gene da globina beta A estar parcialmente "bloqueado" para sintetizar Hb A, caracterizando a talassemia b+. Se o gene da globina beta A estivesse íntegro, a concentração da Hb A seria maior que a da Hb S. Na maioria dos casos de Hb S/tal.b+ a Hb A2 está elevada, como mostra a figura.

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Figura 3.3.9. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, pH 8.5. Da esquerda para a direita: (1) A + A2 aumentada; (2) Hb AJ; (3) Hb AJ; (4) Hb S/tal.b+. Observar a Hb A2 aumentada na Hb S/tal.b+. A primeira amostra aplicada é de um portador de talassemia beta menor. A segunda e terceira amostras pertencem a dois portadores de Hb J Oxford em heterozigose (AJ).

A ocorrência da anemia nos portadores desta dupla heterozigose é de grau moderado, com a hemoglobina total variando entre 9 e 11 g/dl. Na análise da morfologia eritrocitária é possível observar moderada aniso-poiquilocitose, poiquilocitose, com micrócitos, dacriócitos, codócitos, policromasia, e algumas células em falcização. O VCM e HCM estão diminuídos. O genótipo Hb S/tal. b+ é pouco freqüente üente em nossa população quando comparado com o genótipo Hb S/tal. b0. É importante destacar que ocorre certa confusão na análise laboratorial por eletroforese de hemoglobina quando se examina amostra de sangue de paciente com anemia falciforme (Hb SS) que recebeu sangue normal (Hb A) por transfusão. Nestes casos, o valor quantitativo de Hb S em relação à da Hb A transfundida se parece com o resultado eletroforético do genótipo b S/tal. b+. Portanto, é fundamental ser informado se o sangue do paciente a ser analisado foi ou não transfundido.

Hb SS / Talassemia Alfa ou Hb SH

A talassemia alfa é uma alteração que pode ter origem genética ou adquirida. A origem genética está bem definida e se deve à falha na síntese de globinas alfa, devido à lesão molecular de um ou mais genes alfa dos quatro normalmente dispostos nos dois cromossomos 16 (aa/aa) de cada pessoa. A causa adquirida da talassemia alfa tem sido relatada em pacientes com doenças linfo ou mieloproliferativas, cuja prevalência chega a 60% de talassemia talassemia alfa entre eles. Entretanto, pouco se sabe de que forma a talassemia alfa foi adquirida. Em ambos os casos, a talassemia alfa se deve à lesão de apenas um gene alfa (-a/aa), ( ou lesões de dois (-a/-a;--/aa) /aa) e de três (--/-a) ( genes alfa. A lesão de quatro genes alfa (--/--) ( é restrita à causa genética. 198

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Especialmente nos negros, a talassemia alfa resulta geralmente na deleção de um gene ou de dois genes alfa. Estudos realizados nos Estados Unidos da América indicam que cerca de 30% dos negros tem talassemia alfa. No Brasil, Sonati, em 1992, descreveu a prevalência de 21,3% de talassemia alfa heterozigota (-a/aa) ( entre os negros. A interação de anemia falciforme com talassemia alfa representa um fator modulador dos parâmetros hematológicos, com elevação da contagem contagem de eritrócitos e redução dos índices hematimétricos VCM (volume corpuscular médio), HCM (hemoglobina corpuscular média) e CHCM (concentração da hemoglobina corpuscular média), em relação ao doente com anemia falciforme. Fisiologicamente, a redução da da concentração da hemoglobina (Hb S) corpuscular média diminui a formação de polímeros de Hb S nos eritrócitos, e conseqüentemente do número de células densas - fato que favoreceria à indução dos eritrócitos falciformes irreversíveis. Dessa forma, a diminuição ição do grau de anemia na interação Hb SS / talassemia alfa ocorre na deleção de um, dois ou três genes alfa. Entretanto, é na deleção de dois genes alfa: HbSS (-a/-a) ( que o grau de anemia é menos acentuado (tabela ( 3.3.3). Outro importante efeito da talassemia talassemia alfa na interação com anemia falciforme se deve à elevação da Hb Fetal e da Hb A2 (tabela 3.3.3). ). Estas influências assumiram importância quando se pensou que as elevações das hemoglobinas A2 e Fetal promoveriam a "diluição" da Hb S e, conseqüentemente, e, a diminuição do processo da polimerização da deoxi-Hb deoxi S. Entretanto, está bem estabelecido que a Hb Fetal - e somente ela - exerce potente efeito inibidor da polimerização da Hb S, reduzindo o número de células falcizadas irreversivelmente. Apesar dos conhecimentos onhecimentos adquiridos até o presente, os relatos da literatura científica mostram que os efeitos "benéficos" da influência da talassemia alfa na anemia falciforme ainda são inconclusivos, conforme mostra a avaliação abaixo extraída de várias publicações: a. os eventos vaso-oclusivos oclusivos não diminuem; b. a freqüência e a gravidade das crises vaso-oclusivas vaso oclusivas são maiores em pacientes com maior deformidade dos eritrócitos e níveis de hemoglobina mais altos, independente do número de genes alfa presentes; c. maior ocorrência de osteonecrose; d. diminuem as úlceras dos membros inferiores; e. diminuem as doenças vasculares de retina. A identificação laboratorial da interação Hb SS/talassemia alfa pode ser feita por um simples processo eletroforético em tampão alcalino, desde que se aplique amostra de sangue hemolisado com saponina a 1%. Quando o paciente é portador da interação é possível observar a Hb H (agregados de bS4) de forma difusa, bem à frente da Hb S (figura ( 3.3.10).

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Figura 3.3.10. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose pH 8.5. As amostras de hemoglobinas foram obtidas por hemólise dos eritrócitos com saponina a 1%. Da esquerda para a direita: Hb SS/tal. alfa ou Hb SH, dois casos de traço falcêmico (Hb AS), e o padrão normal (Hb AA).

Tabela 3.3.3. Valores hematológicos na anemia falciforme homozigota (Hb SS aa/aa) e nas interações com talassemia alfa (Hb SS - a/aa ou Hb SS -a/-a). Genótipo

Hb (g/dl)

VCM (fl)

Retic. (%)

Hb A2 (%)

SS (aa/aa)

8,0 ± 1,1

92 ± 7

11 ± 6

2,8 ± 0,4

SS (-a/aa)

8,6 ± 1,1

83 ± 7

9±6

3,3 ± 0,6

SS (-a/-a)

9,2 ± 1,3

72 ± 4

7±5

3,8 ± 0,4

fonte: Steinberg & Embury, 1986 200

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Hb S/PHHF ou Hb SF

A associação entre anemia falciforme e persistência hereditária de Hb Fetal resulta na identificação do genótipo de Hb SF, com valores de Hb Fetal oscilando entre 15 e 30%. Dois fatores contribuem para a diminuição da gravidade do quadro clínico e hematológico dessa associação. O primeiro é a exclusão da Hb Fetal no processo da polimerização da deoxi-Hb deoxi S, fato que diminui significativamente nificativamente a cinética da falcização. O segundo fator se deve a diminuição da concentração da Hb S intra-eritrocitária intra eritrocitária devido à presença da Hb Fetal; quando o nível de Hb S está abaixo de 75% o processo da falcização é drasticamente inibido. Há evidências ias de que o nível elevado de Hb Fetal modifica a expressão clínica da anemia falciforme e outras formas sintomáticas da doença. Em geral, na anemia falciforme, há discreta elevação da Hb Fetal (2 a 10% de concentração) sem que se caracterize a PHHF. Neste caso há eritrócitos com Hb Fetal e outros sem Hb Fetal, caracterizando a distribuição heterogênea de Hb Fetal quando submetida à eluição ácida e corada com eritrosina (coloração de Kleihauer) conforme mostra a figura 3.3.11. 3.3.11 Na associação Hb S/PHHF a Hb Fetal etal está presente em todos os eritrócitos caracterizando a distribuição homogênea e inibindo a polimerização da Hb S.

Figura 3.3.11. Esfregaço de sangue periférico de paciente com Hb S/PHHF, submetido a coloração específica para Hb Fetal. Observar a distribuição heterogênea, com eritrócitos corados (Hb Fetal) e eritrócitos sem coloração (sem Hb Fetal).

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Os Haplótipos da Hb SS

As observações clínicas realizadas por grande número de médicos em seus pacientes com anemia falciforme, sempre deram destaques destaques a variabilidade clínica e evolução da doença. Essa variabilidade era coincidente com a diversidade étnica entre grupos de doentes falcêmicos da África. Inicialmente relacionou-se relacionou se a menor gravidade da anemia falciforme com níveis elevados de Hb Fetal e, posteriormente com a interação entre HbSS/talassemia alfa. Com o desenvolvimento da biologia molecular e técnicas que caracterizam sequências de DNA foi possível esclarecer que entre indivíduos com o mesmo genótipo da anemia falciforme - a Hb SS - haviam am diferenças entre as bases nitrogenadas que compunham o agrupamento de genes de globina beta, delta, gama e epsilon dispostos numa região do cromossomo 11. Todos os indivíduos são geneticamente diferentes e essas características são transmitidas de geração ão a geração. Entretanto, destaca-se destaca se que grande parte das diferenças individuais representam variações patológicas do DNA, enquanto outras tantas são variações silenciosas. As variações silenciosas são designadas polimorfismos e podem ser detectadas por duas vias: 1. Diferenças na sequência de DNA que podem ser identificadas pela análise sequencial de fragmentos de DNA clonados. Com as atuais técnicas de biologia molecular é possível isolar determinado gene do restante do genoma humano. 2. Muitas vezes as substituições de nucleotídeos neutros podem introduzir ou remover regiões dos genes sem que o produto final seja alterado, como é o caso da Hb S. Entretanto, com o uso de enzimas de restrição, tem sido possível caracterizar esses defeitos. A presença de numerosas numerosas regiões polimórficas, ao longo do complexo gênico beta, permite clivagens realizadas por diferentes enzimas de restrição, entre as quais destacam-se: se: Hinc II, Xmnl, Hind III, Pvu II, Hinf I, Hgi II, Ava II, Hpa I, Bam HI entre outras; conforme mostra mostra a figura 3.4.1 no cromossomo 11, e a ação de clivagem (ou quebra de pedaços dessas regiões do complexo gênico) pela ação das enzimas acima citadas. Logo abaixo da representação esquemática do complexo gênico beta, a figura 3.4.1 mostra também, quatro diferentes diferentes tipos de homozigoses de Hb S, denominados por haplótipos de Hb S, e caracterizadas pela ação dessas enzimas de restrição. Para entender a ação das enzimas de restrição usaremos o exemplo clássico da enzima Mst II, que tem a capacidade de fragmentar fragmentar o DNA ao detectar a sequência de bases nitrogenadas representada por citosina-citosina-timina citosina qualquer base-adenina-guanina guanina-guanina, ou simplesmente CCTNAGG (onde N pode ser qualquer uma das quatro bases: A, T, G, C). A região de ataque da Mst II é uma sequência sequência de sete bases, que no DNA da globina beta normal (Hb A) é CCTGAGG. Entretanto, na mutação que resulta a Hb S esta sequência passa a ser CCTGTGG. Dessa forma, a Mst II não reconhece a sequência de bases desse pedaço do gene da globina beta S e, por isso, não o fragmenta, conforme representa a figura 3.4.2. Os fragmentos do DNA-b A, com um tamanho correspondente a 1.150 bases nitrogenadas (ou 1,15Kb), são menores do que os DNA-bb S, com 1.350 bases nitrogenadas (ou 1,35Kb), e ambos são diferenciados por or meio de eletroforese de DNA em gel de agarose. Esse é um dos processos utilizados no diagnóstico pré-natal pré natal de casais de risco para gerarem filhos com doenças falciformes. Por outro lado, as características clínicas de anemia falciforme são marcadas pela diversidade de manifestação entre os portadores da doença, devido a fatores conhecidos e já relatados como, por exemplo, concentração da Hb Fetal e talassemia alfa. Além desses, concorrem para essa variabilidade os fatores ecológicos (clima, por exemplo), sócio-econômico, econômico, atenção médica. Entretanto, a grande maioria das diferenças clínicas e hematológicas deve-se deve se a fatores genéticos 202

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP relacionados a outros genes que podem estar ligados ou não ao gene da globina b S , que são capazes de modificar a expressão da doença. Portanto, o curso clínico e a gravidade da anemia falciforme (Hb SS) estao relacionados ao haplótipo herdado e caraterizados pela ação de enzimas de restrição. Até o presente, foram identificados cinco tipos diferentes de mutações para o gene da globina b S, e certamente todos se originaram separadamente. Os tipos (ou haplótipos) diferenciados pela ação de diferentes enzimas de restrição foram identificados por SS-Árabe-Indiano, SS-Senegal, Senegal, SS-Benin, SS SS-Bantu Bantu ou República Centro Africana (RAC) e SS-Camarões, Camarões, conforme mostra a tabela 3.4.1. Os haplótipos Benin e Bantu (RAC) estão associados ao aumento da gravidade clínica da doença e são também os mais frequentes na população mundial. Já os portadores dos haplótipos Senegal e Árabe-Indiano Árabe Indiano apresentam apresent níveis de Hb Fetal significativamente elevados, favorecendo o desenvolvimento clínico benigno. Na África os indivíduos com anemia falciforme são haplotipicamente homozigotos. Nas Américas, devido ao alto grau de miscigenação, os portadores de anemia falciforme falciforme são haplotipicamente heterozigotos. No Brasil, estudos realizados em diferentes regiões mostraram que a maior frequência do gene da Hb S é proveniente do haplótipo SS-Bantu. SS Steinberg e cols., publicaram em 1998 uma relação entre gravidade clínica, concentração de hemoglobina total e níveis porcentuais de Hb Fetal, com os cinco haplótipos de Hb S em pacientes com anemia falciforme. Dessa relação obteve-se obteve se que os diferentes haplótipos apresentam relação com a clínica dos doentes falcêmicos, entretanto, entretanto, a menor gravidade da doença se deve ao haplótipo que apresenta nível elevado de Hb Fetal, conforme mostra a tabela 3.4.2. Tabela 3.4.1.. Haplótipos de Hb SS caracterizados por nove enzimas de restrição diferentes. Estas enzimas tem a capacidade de fragmentar fragmentar o complexo gênico da globina beta S em diferentes posições, conforme o haplótipo do portador da Hb SS. Sítio

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hc Xm Hd Hd Hc Hc Hf Hp Ba

SS- Árabe-indiano

SS-Senegal

SS-Benin

SS-Bantu (RAC)

SS-Camarões

Tabela 3.4.2. Haplótipos da anemia falciforme e seus efeitos na gravidade clínica e hematológica, associados ao nível de Hb Fetal. Haplótipos

Gravidade

Hb (g/dl)

Hb Fetal (%)

Benin

Grave

8.0 - 8.5

6-7

Bantu

Mais grave

7.0 - 8.5

6-7

Senegal

Moderada

8.5 - 9.0

8-9

Mod. / grave

~ 8.0

5-6

Discreta

~10.0

15 - 20

Camarões Árabe-Indiano

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Figura 3.4.1. Complexo gênico beta no cromossomo 11. Enzimas de restrições e locais de clivagem ou fragmentação. Relação entre enzimas de restrição e quatro tipos de Hb SS, caracterizados pela análise de biologia molecular.

Figura 3.4.2.. Ação da enzima Mst II no DNA das globinas BA e BS, com produção de fragmentos de DNA com diferentes tamanhos; BA: 1,15kb; bS:1,35Kb.

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Fisiopatogia da Hb S Os Efeitos na Molécula da Hb S, na Célula Falciforme e na Circulação Sangüínea do Doente Falcêmico.

O processo mutacional que deu origem à Hb S é a causa das profundas alterações fisiopatológicas que afetam a molécula no seu estado desoxigenado, e que são desencadeadas por meio da forma de polímeros de Hb S, degradação oxidativa da Hb S com precipitação de corpos de Heinz, e geração de radicais livres oxidantes. Todas essas três formas de agressões intra-eritrocitárias eritrocitárias atuam contra a estrutura e o desempenho fisiológico da membrana do eritrócito falcêmico, provocando lesões e perda da sua maleabilidade. A polimerização da Hb S ocorre preferencialmente em três níveis: molecular, celular e circulatório. Noo nível molecular o desenvolvimento do processo da falcização se dá a partir do momento em que a oxi-Hb Hb S perde o oxigênio e se torna deoxi-Hb deoxi Hb S. A deoxi-Hb deoxi S promove a formação de pontes de hidrogênio entre os aminoácidos valina da posição número 1 da globina glo betaS, que é normalmente sintetizada para esta posição, e a valina mutante que substituiu o ácido glutâmico na posição 6 da mesma globina. A formação dessas pontes de hidrogênio modifica a estrutura espacial da molécula de Hb S e promove contatos intermoleculares intermoleculares com outros aminoácidos da globina beta S que participam da formação do tetrâmero aA2bS2. Os principais aminoácidos envolvidos são a fenilalanina da posição 85 e a leucina da posição 88. Como conseqüência, formam-se se agregados desses filamentos que se polimerizam e alteram a estrutura globular das moléculas de Hb S, modificando também a morfologia discóide do eritrócito para formas bizarras das quais a mais conhecida é o afoiçamento (figura ( 4.1.1). ). As variáveis que interferem na formação e na cinética cinética da polimerização da Hb S são o oxigênio, a concentração da hemoglobina (Hb S) corpuscular média – ou C[Hb S]CM, a temperatura e outras hemoglobinas normais e variantes. O oxigênio é o elemento mais importante, pois somente a deoxi-Hb S se polimeriza, e qualquer fator que o estabilize (ex.: a queda o pH sangüíneo e o aumento da concentração do 2,3 di-fosfoglicerato) di fosfoglicerato) reduzirá a afinidade pelo oxigênio, perpetuando o estado desoxigenado da Hb S e a sua polimerização. A C[Hb S]CM é normalmente superior ao limite da solubilidade da Hb S em condições experimentais, fato que pode explicar sua facilidade em cristalizar-se cristalizar se e formar polímeros. A redução da temperatura desfaz a polimerização em condições experimentais. As hemoglobinas normais, principalmente a Hb A, seguida da Hb Fetal, tem um maior efeito inibidor da polimerização que outras hemoglobinas variantes. As Hb variantes que melhor se co-polimerizam co polimerizam com a Hb S são as seguintes, em ordem decrescente: C, D, O Arábia e J. No nível celular, os homozigotos para p Hb S (ou Hb SS) conservam seus eritrócitos com a forma bicôncova se o nível da saturação de oxigênio da Hb S estiver acima de 65% ca. e retornam à forma discóide quando oxigenadas, porém acumulam-se se gradativamente produtos de degradação celular provenientes proveni da falência parcial das bombas de sódio, potássio, cálcio e ATPase. Com a perda de potássio e da água, a C[Hb S]CM se eleva e favorece a polimerização, que se intensifica com a falência da bomba de cálcio/ATPase, alterando a permeabilidade da membrana membran eritrocitária (figura figura 4.1.2). 4.1.2 Esse processo deletério é a principal causa dos eritrócitos que se tornam irreversivelmente falcizados. A membrana eritrocitária é muito afetada durante a falcização, caracterizada por desarranjos das proteínas espectrina-actina, tina, diminuição das glicoproteínas, geração de radicais livres oxidantes e orientação anormal dos fosfolipídeos, apresentando deformações sob forma de escavações na membrana dos eritrócitos (figura figura 4.1.3). 4.1.3). No nível circulatório, a alteração da plasticidade plasticidad normal dos eritrócitos desencadeada pelos efeitos polimerizantes da Hb S tornam os eritrócitos 205

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP falcêmicos com maior possibilidade de aderirem ao endotélio vascular. Esta aderência decorre de interações entre as células endoteliais e os eritrócitos falcêmicos, falcêmicos, com a participação de antígenos de superfície celular (CD36 e CD44) e integrinas – proteínas de membranas que juntamente com fibronectina e laminina se ligam às células falcêmicas. As proteínas plasmáticas também participam da ligação dos eritrócitos falcêmicos com as células endoteliais, com destaques para o fator de Willebrand, trombospondina, fibrinogênio e fibronectina. As células endoteliais interagem com CD36, lamininas, glicoproteína 1B, molécula de adesão vascular e receptor Fe, conforme resume resum a figura 4.1.4.. Como conseqüência da elevada adesividade do eritrócito falcêmico ao endotélio vascular dos capilares, ocorre a estase venosa que desencadeia a hipoxia tecidual, fato que leva mais moléculas de Hb S ao estado de deoxi-Hb deoxi Hb S, exarcebando uma situação circulatória já desfavorável e lesando os tecidos perfundidos por esses capilares. Eventualmente pode ocorrer oclusão total dos capilares (vaso-oclusão) (vaso oclusão) com trombose, e desencadeamento de mecanismos da coagulação. Os tecidos malperfundidos sofrem infartos com necrose e formação de fibrose, principalmente no baço, medula óssea e placenta. Todos esses eventos provocam lesões teciduais agudas, com crises de dores e lesões crônicas de órgãos, conforme mostra as seqüências de eventos desencadeados a partir partir da desoxigenação de Hb S esquematizados na figura 4.1.2

Figura 4.1.1. Microscopia eletrônica da célula falciforme. Observar as projeções arredondadas que indicam as regiões do eritrócito falcêmico em que estão acomodados os corpos de Heinz.

Figura 4.1.3. Eritrócitos com Hb S na forma oxigenada (oxi-Hb (oxi Hb S). Das cinco células incluídas na foto, apenas uma ainda conserva a forma normal. As restantes apresentam lesões de membrana causadas durante as contínuas degradações da deoxi-Hb deoxi S, meta-Hb Hb S e geração geraç de radicais

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP oxidantes. Essas lesões prejudicam a deformabilidade natural dos eritrócitos, favorecendo a formação dos eritrócitos falciformes irreversíveis.

Figura 4.1.4. Possíveis interações (-) ( ) entre o eritrócito falcêmico, célula endotelial e matriz subendotelial. GPIb = glicoproteína 1b; CD 36 e CD 44 = antígenos de superfície celular; FcR = receptor Fc; VCAM = molécula de adesão vascular; TSP = trombospondina; LM = laminina; vWF = fator de von Willebrand; Ig = imunoglobulina; GLS = glicolipídeo glicolipídeo sulfatado.

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Figura 4.1.2. Processo interativo de oxigenação, polimerização e degradação da hemoglobina S, que ocorrem respectivamente na oxi-Hb oxi S, deoxi-Hb S e meta-Hb Hb S.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A Polimerização da Hb S

A polimerização é o fenômeno determinante das alterações alterações morfológicas dos eritrócitos SS. A hemoglobina S, em condições de baixa tensão de oxigênio, é transformada de oxihemoglobina para desoxihemoglobina, sendo sua configuração alterada, de modo que as subunidades b se afastam. A porção hidrofóbica b6 valina de um dos tetrâmeros reposiciona-se se mostrando uma projeção que se liga com a porção b 85 fenilalanina ou b 88 leucina de um outro tetrâmero. Apenas uma subunidade de cada tetrâmero faz o contato; assim são formados ninhos de polimerização. Quando 30 tetrâmeros estão agregados, é formado um núcleo crítico, que constitui a primeira fase da nucleação. Sobre este núcleo crítico, outros tetrâmeros podem aderir e formar então um polímero. Um polímero é uma fita de 220 hm, de diâmetro helicoidal, constituídaa de 14 fibras, 10 na superfície e 4 no interior. Os polímeros estáveis fornecem uma área necessária para iniciação de uma segunda fase de nucleação, na qual fibras adicionais podem ser agregadas, formando feixes paralelos, chamados tactóides. A dupla nucleação nucl é responsável pelo crescimento exponencial dos polímeros (figuras (figuras 4.2.1, 4.2.2, 4.2.3, 4.2.4 e 4.2.5).

Figura 4.2.1. Esquema representativo de eritrócitos normais oxigenados, oxi-Hb oxi Hb A (círculos claros), e na forma desoxigenada ou desoxi-Hb desoxi A (círculos escuros). A oxi-Hb e a desoxi-Hb Hb A são solúveis e não apresentam disposição diferenciada num meio líquido.

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Figura 4.2.2. Esquema representativo de eritrócitos falcêmicos oxigenados oxi-Hb oxi S (círculos claros), e na forma desoxigenada ou desoxi-Hb desoxi S (círculos escuros). A oxi-Hb Hb S é solúvel, enquanto o tetrâmero de desoxi-Hb Hb S se agrega a outro tetrâmero similar devido a contatos intermoleculares com a fenilalanina da posição 85 e a leucina da posição 88, e se torna insolúvel.

Figura 4.2.3. Microscopia Microscopia eletrônica da formação de fibras em célula falcizada.

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Figura 4.2.4. Microscopia eletrônica da célula falciforme com grande número de fibras se dispondo no sentido longitudinal da célula.

Figura 4.2.5. Microscopia eletrônica de um eritrócito falcizado falcizado com disposição assimétrica das fibras.

A taxa e extensão da polimerização intracelular da desoxihemoglobina são complexas e dependem de vários fatores, como: concentração intracelular de hemoglobina S, proporção intracelular das diferentes hemoglobinas, porcentagem da saturação de oxigênio, temperatura, pH e 2,3-DPG. DPG. Quanto maior a concentração intracelular da hemoglobina S, menor o tempo necessário para formação do polímero; assim células SS, que contém altos níveis de hemoglobina S, necessitam de menor tempo para formar polímeros e conseqüentemente alterar sua forma; já as células SC possuem menor concentração intracelular de hemoglobina S, necessitando assim de um maior tempo para alcançar a formação de um núcleo crítico de polimerização e formação do tetrâmero. tetrâmero. A hemoglobina fetal, além de influenciar a 211

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP concentração intracelular de hemoglobina S, também inibe a polimerização devido a um resíduo glutamínico g 87 que impede um contato lateral da dupla fita da fibra de hemoglobina. Quando ocorre uma desoxigenação rápida, são formados vários ninhos de polimerização e conseqüentemente vários polímeros de tamanho pequeno, resultando em muitas projeções na membrana celular, dando à célula o aspecto de uma clava, porém sem a perda da forma discóide dos eritrócitos. trócitos. Quando a desoxigenação é lenta, permite a formação de longos polímeros, e estes provocam a alteração para a forma clássica em foice dos eritrócitos da anemia falciforme. Estas projeções são críticas para perturbar a estrutura e função das células SS. O tempo em que a célula SS é mantida em baixas taxas de oxigenação também é importante na formação do polímero. O tempo necessário para formação do polímero é maior que o tempo gasto pelo eritrócito falciforme na passagem pela microcirculação. Devido a esta relação de tempo, os polímeros são formados em apenas 20% das células SS, durante o fluxo entre arteríolas e capilares. Se os polímeros ocorressem apenas na dependência da tensão de oxigênio da microcirculação, sem a influência do fator tempo, todas as células SS formariam polímeros, resultando acentuado decréscimo na deformabilidade, vaso-oclusão vaso oclusão generalizada e óbito.

Conseqüências da Polimerização Os eritrócitos medem 8 mm e os capilares 5 mm, portanto a célula precisa de uma grande deformabilidade de para passar na microcirculação; outros obstáculos dificultam a passagem pela microcirculação. Células com hemoglobina S sofrem de anormalidades que fazem esta passagem pela microcirculação ser ainda mais desafiante. Estas anormalidades podem ser divididas as em alterações que diminuem a deformabilidade e alterações que aumentam a aderência das células falciformes ao endotélio. As alterações que diminuem a deformabilidade das células falciformes são: 1) a formação de rígidos polímeros de hemoglobina S nas células cé desoxigenadas; 2) a desidratação celular devido às alterações no transporte de íons da membrana e conseqüente formação de células densas. Entre as alterações que aumentam a aderência das células falciformes estão: 1) a destruição de células levando à produção de uma população de células jovens que têm um potencial de aderência aumentado, como demonstrado por alguns estudos, nos quais os reticulócitos dos pacientes com anemia falciforme apresentam maior aderência ao endotélio vascular; 2) a exposição de de fosfatidilserina na superfície dos eritrócitos falciformes, que facilita a aderência e a hemólise. Diminuição da Deformabilidade das Células Falciformes São várias as alterações observadas nas células falciformes. A redução da deformabilidade das células SS é uma delas e é multifatorial, sendo conseqüência principalmente da formação dos polímeros de hemoglobina S, mas também tendo como fatores contribuintes, e importantes, as alterações da membrana celular e do seu citoesqueleto, as quais também podem ser secundárias às lesões provocadas pelos polímeros. A desidratação celular é uma das conseqüências das lesões à membrana e ao citoesqueleto celular. A membrana celular falciforme apresenta alteração da permeabilidade aos cátions e à água. A perda de cátions,, levando à saída de água da célula, provoca a desidratação celular, com aumento da concentração intracelular de hemoglobina, determinando aumento do CHCM. A perda de potássio é a principal causa da desidratação dos eritrócitos falciformes. Os fatores que mais contribuem para a perda de potássio são o co-transporte co de K+Cl- e a formação dos canais +2 + de Gardos (Ca atividade dependente de K ). O co-transporte de K+Cl- é ativado pelo edema celular e por acidose. Esta pode ocorrer, in vivo, particularmente em condições ondições de circulação

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP estagnante. As alterações do co-transporte co de K+Cl- ocorrem também nas células CC e SC, resultando na característica morfológica comum que é a célula em alvo. As células SS têm maior conteúdo de Ca+2, e este é compartimentalizado em vesículas intracelulares, mantendo a concentração de Ca+2, no citosol, normal. Quando há distorção da membrana, como no processo de falcização, ocorre aumento da permeabilidade da membrana celular ao cálcio, aumentando a concentração de cálcio citoplasmático. citoplasmático. Como os eritrócitos têm uma pequena capacidade de tampão para o cálcio, a mínima entrada de cálcio leva a um aumento significativo na sua concentração citoplasmática. Assim, para manter o gradiente de equilíbrio no citosol da célula, os canais de Gardos Gardos são ativados. Estes são canais de Ca+2, cuja + ativação é dependente de K . A ativação dos canais de Gardos leva à entrada de potássio na célula. Quando potássio entra na célula, decorrente da ativação dos canais de Gardos, a membrana celular torna-se se eletricamente eletricamente mais negativa, fazendo com que o Cl- saia da célula, + levando consigo o K . A perda de KCl é acompanhada da perda de água. Outro mecanismo envolvido na perda de potássio são alterações na bomba de Na+/K-. Clark et al. demonstraram que alterações na bomba de Na+/K- são responsáveis pela desidratação celular, porém, de uma forma lenta.

A Degradação Oxidativa da Hb S

O processo de desoxigenação da Hb S favorece a metahemoglobinização da Hb S, aumentando sua concentração e superando a ação da enzima meta Hb-redutase, redutase, fato que causa a formação de hemicromos e precipitação de globina S sob forma de corpos de Heinz (figura ( 4.3.1) promovendo o desalinhamento da proteína banda-3 banda 3 da membrana do eritrócito. Os eritrócitos falcizados e com alterações na estrutura estrutura da membrana alteram a distribuição das moléculas de imunoglobinas G (IgG) em suas superfícies, cujas concentrações elevadas em determinadas regiões dos eritrócitos facilitam as ligações com os receptores Fc das células endoteliais e, dessa forma, induzem uzem a ação fagocitária dos macrófagos no sistema retículo endotelial (SRE), causando hemólise e anemia (figura ( 4.1.2). ). Em recente pesquisa realizada no Centro de Referência de Hemoglobinas da UNESP de São José do Rio Preto, evidenciou-se evidenciou que a simples presença sença de Hb S, independente do genótipo e de sua concentração, é suficiente para produzir a metahemoglobinização desta hemoglobina. Nesse estudo, o genótipo SS apresentou maior concentração média de meta--Hb Hb (3,97%), seguido da interação Hb S / Tal. Beta (2,67%) (2 e da Hb AS (1,07%). A mesma pesquisa revelou que a intensidade da presença de corpos de Heinz apresenta relação direta com o aumento da concentração da Hb S nos eritrócitos, assim no genótipo SS o índice médio de presença de eritrócitos com corpos de Heinz foi de 22 células positivas para cada mil analisadas, enquanto que para Hb S / Tal. Beta foi de 14 por mil, na Hb AS 4 por mil, e no grupo controle Hb AA 1 por mil.

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Figura 4.3.1. Esfregaço de sangue de paciente com anemia falciforme, previamente incubado com azul de crezil brilhante a 1% por 60 minutos a 37ºC. Observar a reticulocitose acentuada e várias células com corpos de Heinz que são estruturas esféricas e escuras agregadas à membrana do eritrócito.

A geração de radicais livres nos eritrócitos eritrócit com Hb S ocorre quando a oxi-Hb Hb S se muda para a forma deoxi-Hb Hb S. A liberação do oxigênio o torna suscetível ao ataque de elétrons que se encontram no interior da célula. Para evitar que o oxigênio fique eletrizado e se transforme em íon superóxido (O.2), a enzima anti-oxidante anti oxidante eritrocitária conhecida por superóxido dismutase (SOD) atua no sentido de mudar o radical superóxido para peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio, que também é um radical livre, sofre a ação anti-oxidante anti oxidante de outras outra duas enzimas eritrocitárias: a glutationa peroxidase (GSH-Px) (GSH Px) e a catalase, transformando-o transformando em moléculas de água (figura figura 4.1.2). 4.1.2 A deficiência hereditária de enzimas anti-oxidantes oxidantes tem sido relatada em diversas populações, e quando associada à anemia falciforme falciforme contribui ainda mais na oxidação da Hb S, elevando a formação de produtos de degradação desta hemoglobina, fatos que causam a redução da vida média do eritrócito falcêmico, aumento do grau de hemólise e intensificação da anemia.

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Figura 4.3.2. Microscopia eletrônica de varredura de eritrócitos falcizados irreversivelmente, com múltiplas deformações estruturais que comprometem a membrana do eritrócito.

Figura 4.3.3. Lesões da membrana do eritrócito causada pela fagocitose do corpo de Heinz por macrófago do sistema retículo endotelial (SRE). Microscopia eletrônica de varredura.

De uma forma geral, as proteínas da membrana celular podem ser alvos dos ataques de radicais livres quando estes estão dentro ou fora das células em altas concentrações, desnaturando-as. d O acúmulo de proteínas desnaturadas interfere nas funções celulares. Vários aminoácidos de importância para a função protéica são suscetíveis às lesões causadas pelos radicais livres: metionina, triptofano, histidina, cisteína e tirosina. As As proteínas lesadas por radicais livres podem dar origem a outros radicais, por exemplo: radicais hidroxila (HO) gerados do acúmulo de H2O2 na presença de ferro proveniente da degradação da hemoglobina S; entre os radicais livres intermediários destacamos hidroperóxidos lipídicos que ao reagirem com ferro geram os radicais alcoxil (RO.) e peroxil (ROO.). A geração desses radicais amplificam as lesões celulares devido aos contínuos processos de novos ciclos de peroxidação lipídica, resultando na liberação de alcanos (malonaldeídos) e alquenos (4-hidroxinonenal), (4 hidroxinonenal), causando lesões irreversíveis nos eritrócitos falcizados e tendência a deformações, conforme mostram as figuras 4.3.2 e 4.3.3. 215

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Como se pode observar, todos os efeitos deletérios aos eritrócitos com Hb S ocorre no momento em que a oxi-Hb Hb S se transforma em deoxi-Hb deoxi Hb S, desencadeando três processos fisiopatológicos caracterizados pela formação de polímeros de Hb S, metahemoglobinização da Hb S, e liberação de radicais livres de oxigênio (figura ( 4.1.2). Os produtos e subprodutos provenientes desses processos fisiopatológicos atacam a membrana do eritrócito com Hb S lesando-a lesando biologicamente, fato que propicia além da redução da vida da célula, outros eventos fisiopatológicos que caracterizam a doença falciforme. falciforme. No caso da anemia falciforme, o genótipo SS é suscetível à maior intensidade de degradação oxidativa, que laboratorialmente podem ser demonstradas pela alta concentração de metahemoglobina e precipitação intraintra eritrocitária de corpos de Heinz.

As Lesões da Membrana da Célula Falciforme

Autora: Adelina Elisabeth Lehmkuhl A assimetria da membrana plasmática foi inicialmente descrita em eritrócitos e plaquetas, há mais de 20 anos e após foi observado que também ocorria em todas as células nucleadas. A perda da assimetria da membrana dos eritrócitos falciformes foi demonstrada pela primeira vez por CHIU et al.,, em 1981 (CHIU, 1981; HERBELL, 1991). A membrana celular é uma bicamada de fosfolipídios medindo cerca de 10 hm de espessura. Os principais componentes onentes são lipídios e proteínas. Os três principais lipídios são: os fosfolipídios, colesterol e glicolipídios. Os fosfolipídios são anfipáticos, isto é, possuem uma cabeça polar hidrofílica que interage fortemente com a água e uma cauda hidrofóbica que interage, i por sua vez, fortemente com a outra porção hidrofóbica (cauda de outro fosfolipídio) da bicamada. Com esta propriedade anfipática, os fosfolipídios em meio aquoso formam espontaneamente uma bicamada planar, pois esta é a configuração de menor gasto gast de energia. A membrana celular dos eritrócitos e também de outras células, como postulado por Brestscher há mais de 20 anos, apresenta uma distribuição assimétrica dos fosfolipídios. Na camada externa da membrana celular está 75% a 80% do total de fosfolipídios; fosfolipídios; estes contêm colina e são: fosfatidilcolina e esfingomielina; o restante, 20% a 25% dos fosfolipídios está na superfície interna da membrana celular, e são os aminofosfolipídios: fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina (figura figura 4.4.1). 4.4.1

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Figura 4.4.1. Distribuição dos principais fosfolipídios na membrana celular.

Uma molécula lipídica polar, na superfície de uma membrana, é livre para se mover no seu próprio lado da bicamada, mas é impedida de deslocar-se deslocar se para superfície do outro lado. A resistência da bicamada à transferência de lipídios de uma face da membrana para outra mantém e preserva a assimetria da bicamada. Esta resistência é causada pela grande quantidade de energia necessária para empurrar as cabeças carregadas polares dos fosfolipídios fosfolipídios ao longo da base hidrocarbonada da membrana. Outros mecanismos envolvidos na estabilidade dos fosfolipídios são: a interação da fosfatidilserina com proteínas do citoesqueleto celular, como a espectrina e banda 4.1, e a ativa manutenção da orientação orientação por uma proteína de translocação de fosfolipídios ATP dependente, a aminofosfolipídios transferase. A relação entre os lipídios da camada interna e externa é o maior determinante da forma discóide dos eritrócitos. Um transporte ativo é necessário para manter um espontâneo equilíbrio de lipídios nas monocamadas, e para recuperar sua forma normal após a deformação. Alterações na forma dos eritrócitos são acompanhadas de uma troca na relação de área da camada externa com a camada interna. A reversibilidade da deformação que um eritrócito sofre, após passar pela microcirculação, depende de um rápido fluxo de lipídios de um lado para outro, implicando que a deformabilidade da célula é influenciada pela taxa de difusão transversal de lipídios. A assimetria dos fosfolipídios é essencialmente conservada por toda a vida da célula, sendo os fosfolipídios mantidos na membrana em um equilíbrio dinâmico. Todos os fosfolipídios se difundem passivamente através da bicamada, em uma taxa lenta. Os aminofosfolipídios são transportados ransportados ativamente pela aminofosfolipídio transferase, sendo esta responsável pelo rápido transporte da fosfatidilserina para a monocamada interna. Poderia se esperar que as alterações 217

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP na aminofosfolipídio transferase levassem à perda da assimetria por por difusão por meio de um gradiente de concentração, mas esse é um processo muito lento. Em condições em que a atividade de aminofosfolipídio transferase é prejudicada, como acontece no estoque de sangue, não se observa a perda da assimetria, pois o movimento movimento da fosfatidilserina para cada externa é extremamente lento. Essa é observada quando, além da alteração na atividade da aminofosfolipídio transferase, existe lesão da membrana que pode ser provocada in vitro por cálcio e ionofore e, in vivo,, pela formação formaçã dos polímeros de hemoglobina S. A exposição da fosfatidilserina na superfície externa da bicamada pode contribuir com os processos de vaso-oclusão, oclusão, aumentando a aderência das células falciformes ao endotélio vascular e levando a um estado de hipercoagulabilidade. hipercoagulabilidade. A fosfatidilserina é um sinalizador para a fagocitose pelos monócitos: este reconhecimento poderia ser uma das causas da vida curta das células falciformes e conseqüente anemia (figura ( 4.4.2).

Figura 4.4.2. Fosfolipídios da membrana celular – eritrócito ritrócito falciforme e normal.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A heterogeneidade das Células Falciformes

Este ítem contou com a colaboração de Adelina Elisabeth Lehmkulil HEBBEL et al. foram os primeiros a demonstrar que as células falciformes têm aderência anormal ao endotélio. Contribuem, para este fato, a densidade celular, presença de receptores nas células falciformes para substâncias mediadoras da aderência ao endotélio vascular, como o Fator de von Willebrand, e exposição de fosfatidilserina na superfície da membrana celular. celula Como conseqüência da desidratação celular, existe uma heterogeneidade das células falciformes, que pode ser demonstrada pela separação, por meio de centrifugação de vários grupos de células SS com gradiente de densidade diferentes. A densidade das células falciformes é determinada pela concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM): quanto maior a concentração de hemoglobina S, dentro da célula, maior é o CHCM, e maior é a densidade da célula. As células com densidade alta são referidas como células células densas. Podem ser definidas quatro categorias de células baseadas no gradiente densidade por centrifugação. As quatro categorias de células SS são: 1. células SS1, reticulócitos (fig. ( 4.5.1);

Fig. 4.5.1. Microscopia eletrônica de varredura (M.E.V.) de reticulócito obtido de sangue de doente com anemia falciforme. Nesta fase ocorrem as primeiras lesões visíveis, representadas por pequenas depressões na membrana da célula.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP 2. células SS2, células discóides (fig. ( 4.5.2);

Fig. 4.5.2. M.E.V. de um eritrócito falcêmico discóide (SS2) e de outro eritrócito falcêmico com lesões de membrana. Essas lesões induzem a transformação dos eritrócitos falcêmicos a se tornarem células falciformes densas (SS3). 3. células SS3, células discóides densas (fig. ( 4.5.3);

Fig. 4.5.3. M.E.V. de células falciformes densas (SS3), com notável alteração morfológica.

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4. células SS4, células falciformes irreversíveis (fig. ( 4.5.4).

Fig. 4.5.4. M.E.V. de célula falciforme irreversível, com a forma achatada e alongada, em fase de aderência ao endotélio vascular. Cada uma dessas categorias de células tem características morfológicas e propriedades distintas, contribuindo de forma diferente com a vaso-oclusão vaso e hemólise. KAUL et al. mostraram que as células falciformes aderem exclusivamente ao endotélio venular e a aderência é inversamente relacionada ao diâmetro da vênula. Estudos com cultura de células endoteliais mostraram que, quanto maior a densidade da hemácia falciforme, maior o poder de aderência. Porém, estudos com as células durante o fluxo sangüíneo, mostraram que a aderência ao endotélio está inversamente relacionada ao CHCM; assim KAUL et al. propuseram um modelo de vasovaso oclusão. Neste modelo, o processo de vaso-oclusão vaso oclusão é iniciado com a aderência de células de baixa densidade ao sistema venular pós-capilar, pós capilar, diminuindo o fluxo sangüíneo local, e facilitando a aderência de células falciformes irreversíveis e vaso-oclusão. vaso

A Anemia Hemolítica no Doente Falcêmico

A anemia que ocorre nos doentes com anemia falciforme (Hb (Hb SS) é caracterizada por uma anemia hemolítica parcialmente compensatória, com valores de hemoglobina se situando entre 6 e 9 g/dl. A anemia hemolítica compensatória se deve a um aumento da eritropoiese, verificado no sangue periférico por reticulocitose acentuada. Em vista disso, ocorre constante utilização de vitamina B12 e folatos, necessitando reposição adequada para evitar o agravamento da anemia. A anemia entre as doenças falciformes é mais expressiva na anemia falciforme, pois o grau de lesão da membrana brana do eritrócito falcêmico é muito intenso (fig. ( 4.1.2). ). Conforme ilustra a figura, a membrana do eritrócito falcêmico sofre pelo menos quatro tipos de agressões: a) ação de radicais superóxidos (O2.); b) alteração da permeabilidade devido às falhas das bombas de sódio, potássio, cálcio e ATPase; c) a oxidação da membrana causada pelo ferro no estado férrico (Fe+++) liberado da degradação da metahemoglobina; d) alteração da conformação espacial da proteína banda-33 da membrana eritrocitária devido à impregnação impregnação dos corpos de Heinz junto a sua estrutura. Todos esses processos que ocorrem cumulativamente, deformam os

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP eritrócitos falcêmicos, tornando-os tornando os irreversíveis e susceptíveis às ações macrofágicas das células do sistema retículo endotelial (SRE).

É importante portante considerar que o grau de variabilidade da anemia hemolítica que ocorre na anemia falciforme depende de vários fatores ou interferentes, que podem ser desde os de causas ambientais, sociais e econômicas, como biológicos (ex.: doenças crônicas associadas), assoc ou eritrocitárias (ex.: interações com deficiência de G-6PD, G 6PD, esferocitose, etc.), entre outros. Detalhes sobre interferentes que influenciam o grau de anemia na doença falciforme podem ser verificados no item 7 desse capítulo.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os Processos VASO-OCLUSIVOS OCLUSIVOS

A circulação sangüínea no ser humano desenvolve quase exclusivamente na microvasculatura composta por arteríolas, capilares, sinusóides e vênulas. No indivíduo adulto há cerca de 1,2 x 109 de vasos sangüíneos dos quais 99% estão na microvasculatura. É justamente nessa ampla área vascularizada que ocorrem as trocas de substâncias orgânicas e inorgânicas essenciais ess para as atividades das células. A maioria dos capilares são inelásticos, com diâmetros variáveis entre 3 a 16m, enquanto que os eritrócitos apresentam-se apresentam se com diâmetro médio de 8m (fig. 4.7.1). Dessa forma, a flexibilidade do eritrócito é fundamental fundamental para executar a função de transporte de oxigênio (fig. 4.7.2). ). As trocas de gases, líquidos, proteínas, sais minerais, principalmente, ocorrem de forma transvascular na imensa rede da microvasculatura. O conteúdo de oxigênio nesses vasos diminui à medida que o sangue flui em direção aos vasos de menor calibre, como as vênulas. Para se ter noção da perda de oxigênio durante o fluxo sangüíneo, é necessário comparar que a PO2 no sangue arteriolar é de aproximadamente 100 mmHg, e que decresce pela necessidade de distribuir o oxigênio pelos órgãos em que passa, até cair para níveis variáveis entre 12 e 17 mmHg ao chegar às vênulas. Algumas áreas da microvasculatura, caracterizadas pelas dobraduras dos vasos, prejudicam o fluxo sangüíneo e conseqüentemente a desoxigenação. oxigenação. Nessa situação, os eritrócitos com Hb SS podem sofrer deformações e iniciar os processo vaso-oclusivos. oclusivos. A obstrução das arteríolas impede a circulação para os capilares, entretanto os canais adjacentes geralmente impede o colapso, drenando o fluxo fluxo sangüíneo em vias de estagnação e permitindo a irrigação de tecidos e órgãos. Quando a desoxigenação da Hb S na microvasculatura é rápida, os processos vaso-oclusivos vaso oclusivos podem ser evitados. Porém, quando a falcização intravascular progride, inclusive com a participação de eritrócitos falciformes irreversíveis, essas células tendem a aderir ao endotélio vascular. Várias situações contribuem para o desencadeamento da oclusão vascular, com particular destaque à alta viscosidade do sangue e pela elevação dos níveis níveis de fibrinogênio. A alta viscosidade do sangue ocorre não somente pelos processos vaso-oclusivos, vaso oclusivos, mas também pela desidratação; os níveis elevados de fibrinogênio decorrem como resposta natural às infecções contraídas pelo doente falcêmico.

Fig. 4.7.1. Microscopia eletrônica de varredura de arteríola com diâmetro suficiente para passagem de apenas um eritrócito por vez.

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Fig. 4.7.2. Figura representando a microscopia eletrônica de um vaso estreito, obrigando os eritrócitos a se deformarem para poderem poderem acompanhar o fluxo sangüíneo.

Como conseqüência da estase venosa causada pela oclusão vascular, outros setores da microvasculatura desencadeiam processos de oclusão, levando mais moléculas de Hb S ao estado desoxigenado, piorando a situação circulatória circulatória já desfavorável e lesando os tecidos perfundidos por esses vasos. Eventualmente pode ocorrer oclusão total dos capilares, causando tromboses, formação de fibrina e, também, ativação do mecanismo de coagulação. Os tecidos mal perfundidos podem sofrer infartos infartos com necrose e formação de fibrose, principalmente do baço, medula óssea e placenta. Todos esses eventos podem causar lesões tissulares agudas, com crises dolorosas, cronificação e lesões orgânicas permanentes (capítulo 6 – Controle Clínico das Doenças Falciformes).

Alterações Laboratoriais nas Doenças Falciformes Anemia Falciforme

a.) Análise de Sangue Periférico O genótipo falcêmico mais importante sob o ponto de vista médico é a anemia falciforme, uma vez que os outros genótipos que causam a doença falciforme podem ser melhor controlados. A anemia falciforme cursa com graus de anemias que variam entre grave (Hb:5 g/dl) a moderado (Hb:9 g/dl), com o eritrograma mostrando valores de VCM e HCM normais, embora haja evidente anisocitose, poiquilocitose poiquilocitose e anisocromia. Assim, embora a classificação do tipo de anemia é em geral normocítica e normocrômica, as alterações morfológicas são bastante abrangentes pela presença de células falciformes, esquisócitos, células em alvo, etc., conforme mostra a tabela 5.1.. A distribuição da amplitude dos eritrócitos (RDW) está sempre elevada. Os eritrócitos que se transformam várias vezes na forma falciforme durante a desoxigenação, e retornam à forma discóide na oxigenação, se tornam irreversivelmente falcizados após apó as lesões constantes das suas membranas (figura ( 4.2.2), ), e podem ser identificados como eritrócitos afoiçados de forma muito delgada (figura ( 5.1). ). É também muito freqüente a policromasia (devido à reticulocitose) e eritroblastos ortocromáticos (figura ( 5.2), ), além de pontilhados basófilos. As presenças de corpos de Howell-Jolly Howell Jolly e de Pappenheimer são indicativas do não funcionamento do baço devido à auto-esplenectomia. auto

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Figura 5.1. Eritrócitos irreversivelmente falcizados em esfregaço de sangue periférico de paciente com anemia falciforme.

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Figura 5.2. Eritroblasto ortocromático em esfregaço de sangue periférico de paciente com anemia falciforme.

A leucocitose (12 a 30x109/L) e neutrofilia são ocorrências comuns nas análises dos leucogramas. Na vigência de processos infecciosos, pode ocorrer o desvio à esquerda por aumento do número de neutrófilos bastonetes e o aparecimento de formas mais jovens de neutrófilos (metamielócitos e mielócitos). A trombocitose é comum, com contagens de plaquetas ultrapassando 450x10 50x109/L , e este fato se deve ao fibrosamento do baço que não pode seqüestrar as plaquetas do sangue periférico – como faria o baço normal. É possível encontrar plaquetas gigantes quando ocorre infartos medulares. Entretanto, durante as crises vasovaso oclusivas, vas, o número de plaquetas pode diminuir acentuadamente.

b) Testes Específicos O principal teste de identificação do genótipo SS que caracteriza a anemia falciforme é a eletroforese de hemoglobina em tampão alcalino (agarose alcalina ou acetato de celulose) pH 8 a 9. Por meio desse teste identifica-se identifica se a Hb S, cuja mobilidade se dispõe entre a Hb A e Hb A2 (figura 5.3). ). Geralmente a anemia falciforme é acompanhada de discreta a moderada elevação da Hb Fetal (2 a 10%) e Hb A2 normal. Há entretanto que considerar que outro genótipo da doença falciforme, a Hb SD, se comporta eletroforeticamente como a Hb SS, uma vez que a Hb D tem a mesma mobilidade da Hb S, conforme mostra o mapa de eletroforese exposto na figura 5.4.. Análises mais cuidadosas podem diferenciá-las, dife las, inicialmente com relação à maior gravidade clínica da Hb SS em relação a Hb SD, bem como das alterações dos resultados do eritrograma (tabelas tabelas 5.1 e 5.2). ). É importante destacar que no genótipo Hb SS ocorre a presença da Hb Fetal (figura ( 5.4), enquanto nquanto que na Hb SD a concentração de Hb Fetal é normal. Porém, como melhor teste específico para diferenciar os genótipos SS e SD é a eletroforese em agarose ácida (tampão fosfato ou citrato pH 6,2). Na eletroforese em agarose ácida a Hb S se separa da Hbb A, enquanto que a Hb D se posiciona na mesma linha da Hb A (figura 5.4). Afigura 5.5 mostra a separação das frações de hemoglobinias Fetal, A, S e C por meio da eletroforese em agarose ácida. Outros testes como o de falcização e solubilidade não conseguem m diferenciar a Hb SS da Hb SD, pois ambos positivam a reação.

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Figura 5.5. Eletroforese de hemoglobinas em agarose ácida (pH 6.2). (1) Hb AS; (2) controle: Hb ASC; (3) controle normal: Hb AA. Observar traços de Hb Fetal nas três amostras analisadas.

Tabela 5.1. Alterações da morfologia eritrocitária nos diferentes genótipos das síndromes talassêmicas. Genótipo

Alterações da Morfologia Eritrocitária

Normocitose, normocromia

Células falcizadas e em alvo. Hipocromia e policromasia. Eritroblastos, corpos de Howell-Joly.

S/tal. beta

Anisocitose, microcitose, poiquilocitose, células falcizadas, dacriócitos, células em alvo. Hipocromia e policromasia.

S/tal. alfa

Anisocitose, microcitose, células falcizadas. Hipocromia e policromasia.

Aniso-poiquilocitose. poiquilocitose. Hipocromia.

Células falcizadas e em alvo. Policromasia.

S/PHHF

Discreta anisocitose, ou normocitose e normocromia.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Tabela 5.2. Principais alterações laboratoriais nas doenças falciformes. Doença Falciforme

Porcentagens de Hb S

Hb F

Hb A

VCM

HCM

Hbg/dl

Hb SS

90-100

2-10

5-9

Hb S/b0tal.

70-90

5-20

5-10

Hb S/b+tal.

50-80

5-10

10-40

7-10

Hb SS/atal.*

80-90

10-20

9-11

Hb SC

40-50

9-13

Hb SD

40-50

9-13

Hb S/PHHF

60-80

15-30

12-14

Hb AS

30-40

60-70

12-16

* pode ser detectada a Hb H (conc.: 2 a 5%), ou agregados, intraeritrocitários de Hb H 0=ausência, N=normal, =aumentado, ¯ =diminuído

S/β β Talassemia ou Micro Drepanocitose

a) Análise do Sangue Periférico A condição de dupla heterozigose Hb S/tal. b está associada com aspectos clínicos similares, embora não tão grave, ao da anemia falciforme. O genótipo S/tal. b0 – que não há síntese de Hb A – é clinicamente mais grave que o S/tal. b+, e é similar em gravidade à anemia falciforme. É importante destacar que clinicamente o genótipo S/tal. b+ é classificado em tipo 1 (clinicamente grave e hematologicamente anormal, embora menos grave que a Hb S/tal. b0), e o tipo 2 (causa apenas anemia moderadaa e os pacientes são assintomáticos). O eritograma dos pacientes com Hb S/tal. b0 mostram valores de hemoglobina variáveis entre 5 e 10 g/dl, contagem de reticulócitos entre 10 e 20%. Os eritrócitos são microcíticos e hipocrômicos, com marcante aniso-poiquilocitose (figura 5.6, tabelas 5.1 e 5.2), além de elevação do RDW, presença de pontilhados basófilos e células em alvo. Na Hb S/tal. b+ - tipo 1,, a concentração da hemoglobina varia entre 7 e 10 g/dl, os valores de VCM e HCM estão diminuídos, podem ser encontradas células falciformes, e os reticulócitos podem estar normais ou discretamente elevados. Na Hb S/tal. b+ – tipo 2,, há discreto grau de anemia, com diminuição do VCM e HCM, e poucas alterações morfológicas dos eritrócitos.

228

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP b) Testes Específicos A eletroforese de hemoglobina em tampão alcalino é o melhor teste específico para caracterizar os genótipos Hb S/tal. b0 e Hb S/tal. b+, conforme mostra a figura 5.4.. Na Hb S/tal. b0 há o fracionamento da Hb S e Hb Fetal com a concentração elevada, além da Hb A2 (figura 5.7), enquanto que o genótipo Hb S/tal. b+ se destaca pela presença da Hb S com concentração superior à da Hb A (figura figura 5.8); 5.8); é comum a Hb Fetal estar discretamente elevada neste genótipo. Outro teste importante para compor os resultados da Hb S/tal. b é a dosagem da Hb Fetal al por meio da avaliação da resistência alcalina desta hemoglobina.

229

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Figura 5.6. Esfregaço de sangue periférico de paciente com Hb S/talassemia b. Aniso-poiquilocitose Aniso pela presença de eritrócitos microcíticos, normocíticos, hipocrômicos, em alvo e células falcizadas.

Figura 5.7. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, tampão alcalino (pH: 8.5). (1) Hb AS; (2) Hb SF: resultado típico da Hb S/tal. β0.

230

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Figura 5.8. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, tampão acalino (pH 8.5). (1) Hb AA; (2) Hb AA; (3) Hb S com maior concentração que a Hb A + A2aumentado: resultado típico de Hb S/tal. β+.

Tabela 5.1. Alterações da morfologia eritrocitária nos diferentes genótipos das síndromes talassêmicas. Genótipo

Alterações da Morfologia Eritrocitária

Normocitose, normocromia

Células falcizadas e em alvo. Hipocromia e policromasia. Eritroblastos, corpos de Howell-Joly. Howell

S/tal. beta

Anisocitose, microcitose, poiquilocitose, células falcizadas, dacriócitos, células em alvo. Hipocromia e policromasia.

S/tal. alfa

Anisocitose, microcitose, células falcizadas. Hipocromia e policromasia.

Aniso-poiquilocitose. poiquilocitose. Hipocromia.

Células falcizadas e em alvo. Policromasia.

S/PHHF

Discreta anisocitose, ou normocitose e normocromia.

231

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Tabela 5.2. Principais alterações laboratoriais nas doenças falciformes. Doença Falciforme

Porcentagens de Hb S

Hb F

Hb A

VCM

HCM

Hbg/dl

Hb SS

90-100

2-10

5-9

Hb S/b0tal.

70-90

5-20

5-10

Hb S/b+tal.

50-80

5-10

10-40

7-10

Hb SS/atal.*

80-90

10-20

9-11

Hb SC

40-50

9-13

Hb SD

40-50

9-13

Hb S/PHHF

60-80

15-30

12-14

Hb AS

30-40

60-70

12-16

* pode ser detectada a Hb H (conc.: 2 a 5%), ou agregados, intraeritrocitários de Hb H 0=ausência, N=normal, =aumentado, ¯ =diminuído

Hb S/talassemia α

A associação entre a anemia falciforme (Hb SS) e talassemia alfa de um, dois ou três genes alfa deficientes, faz surgir a Hb S/tal. a. Geralmente os pacientes com essa doença são filhos de pais com traço falciforme (Hb AS), em que um ou ambos tem a talassemia alfa associada (Hb AS/tal. a). A análise do sangue periférico mostra anemia microcítica e hopocrômica, com hemoglobina entre 9 e 11 g/dl, alterações morfológicas morfol evidentes (tabela 5.1). Os testes específicos são eletroforese de hemoglobina em tampão alcalino – que permite visualizar a Hb H formada por tetrâmeros de BS4 (figura 5.9), ), e a pesquisa de Hb H intraintra eritrocitária que permite ver a precipitação da Hb Hb H nos eritrócitos desses pacientes (figura ( 5.10).

232

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Figura 5.9. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, tampão alcalino (pH 8.5). Observar a primeira aplicação à esquerda: Hb SS (anemia falciforme) associada à Hb H (talassemia alfa). A seta indica a posição da Hb H, constituída por tetrâmero de globinas bS ou bS4.

Figura 5.10. Sangue de paciente com anemia falciforme associada a talassemia alfa (Hb S/tal. a), incubado a 37ºC com azul de crezil brilhante a 1%. O esfregaço obtido mostra a presença, por contraste de fase, de eritrócitos com precipitados de Hb H.

233

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Tabela 5.1. Alterações da morfologia eritrocitária nos diferentes genótipos das síndromes talassêmicas. Genótipo

Alterações da Morfologia Eritrocitária

Normocitose, normocromia

Células falcizadas e em alvo. Hipocromia e policromasia. Eritroblastos, corpos de Howell-Joly. Howell

S/tal. beta

Anisocitose, microcitose, poiquilocitose, células falcizadas, dacriócitos, células em alvo. Hipocromia e policromasia.

S/tal. alfa

Anisocitose, microcitose, células falcizadas. Hipocromia e policromasia.

Aniso Aniso-poiquilocitose. Hipocromia.

Células falcizadas e em alvo. Policromasia.

S/PHHF

Discreta anisocitose, ou normocitose e normocromia.

Hb SC

A Hb SC é uma condição de dupla heterozigose, onde as concentrações de Hb S e Hb C se equilibram. Em comparação com a anemia falciforme, a doença da Hb SC apresenta-se apresenta com moderados sintomas clínicos e poucas complicações. Os primeiros sintomas mais significativos ocorrem na adolescência, cência, e incluem anemia, dores nas articulações, abdominais e esqueléticas, causadas pelas oclusões vasculares. A anemia do sangue periférico mostra anemia normocítica e normocrômica (VCM e HCM normais) de grau moderado, com a concentração de hemoglobina entre 9 e 13 g/dl, e anisoaniso poiquilocitose com células em alvo (tabelas ( 5.1, 5.2 e 5.11). O teste específico mais eficiente é a eletroforese de hemoglobina em pH alcalino (figura ( 5.4), onde é possível fracionar com muita clareza as hemoglobinas S e C (figura ( 5.12). A eletroforese em agarose ácida também pode ser usada com sucesso (figura (figura 5.5). 5.5

Figura 5.5. Eletroforese de hemoglobinas em agarose ácida (pH 6.2). (1) Hb S; (2) controle: Hb ASC; (3) controle normal: Hb AA. Observar traços de Hb Fetal nas três amostras analisadas.

234

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Figura 5.12. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, tampão alcalino (pH 8.5). (1) Hb AS; (2) controle: Hb ASC; (3) Hb SC; (4) controle normal: Hb AA2.

Tabela 5.1. Alterações da morfologia eritrocitária nos diferentes genótipos das síndromes talassêmicas. Genótipo

Alterações da Morfologia Eritrocitária

Normocitose, normocromia

Células falcizadas e em alvo. Hipocromia e policromasia. Eritroblastos, corpos de Howell-Joly. Howell

S/tal. beta

Anisocitose, microcitose, poiquilocitose, células falcizadas, dacriócitos, células em alvo. Hipocromia e policromasia.

S/tal. alfa

Anisocitose, microcitose, células falcizadas. Hipocromia e policromasia.

Aniso-poiquilocitose. poiquilocitose. Hipocromia.

Células falcizadas e em alvo. Policromasia.

S/PHHF

Discreta anisocitose, ou normocitose e normocromia.

Tabela 5.2. Principais alterações laboratoriais nas doenças falciformes. Doença Falciforme

Porcentagens de Hb S

Hb F

Hb A2 VCM HCM A

Hb SS

90100

2-10

Hb S/b0 tal.

7090

5-20

Hb S/b+ tal.

50-

5-10

Hbg/dl

5--9

5-10 10

10-

7-10 10 235

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP 80

Hb SS/atal.*

8090

10-20

9-11 11

Hb SC

4050

9-13 13

Hb SD

4050

9-13 13

Hb S/PHHF

6080

15-30

12--14

Hb AS

3040

6070

12--16

* pode ser detectada a Hb H (conc.: 2 a 5%), ou agregados, intraeritrocitários de Hb H

Hb SD

É uma condição de dupla heterozigose observada entre Hb S e variantes anormais que migram na mesma posição eletroforética da Hb S (figura ( 5.4)) mas não falcizam, pois foram originadas por mutações de aminoácidos diferentes à da Hb S. Essas hemoglobinas variantes foram denominadas por tipo D. Entre os 16 tipos diferentes de Hb D, as associações da Hb S foram descritas com 9 tipos diferentes de Hb D, porém quando a associação ocorre ocorre entre a Hb S com a Hb D Punjab ou Los Angeles (Sd-Punjab (Sd Punjab ou Los Angeles) produz sintomas clínicos e alterações hematológicas moderados, conforme mostram as tabelas 5.1 e 5.2.. Os testes específicos são eletroforeses em pH alcalino e agarose em pH ácido ácid (figura 5.4). ). Maiores detalhes da diferenciação laboratorial entre Hb SS e Hb SD foram apresentados no item 5.1. 5.1

236

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Figura 5.4. Posições eletroforéticas padrões em tampão alcalino (pH 8.5) e em agarose-ácida agarose (pH 6.2)

Tabela 5.1. Alterações da morfologia eritrocitária nos diferentes genótipos das síndromes talassêmicas. Genótipo

Alterações da Morfologia Eritrocitária

Normocitose, normocromia

Células falcizadas e em alvo. Hipocromia e policromasia. Eritroblastos, corpos de Howell-Joly. Howell

S/tal. beta

Anisocitose, microcitose, poiquilocitose, células falcizadas, dacriócitos, células em alvo. Hipocromia e policromasia.

S/tal. alfa

Anisocitose, microcitose, células falcizadas. Hipocromia e policromasia.

Aniso-poiquilocitose. poiquilocitose. Hipocromia.

237

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP SD

Células falcizadas e em alvo. Policromasia.

S/PHHF

Discreta anisocitose, ou normocitose e normocromia.

Tabela 5.2. Principais alterações laboratoriais nas doenças falciformes. Doença Falciforme

Porcentagens de Hb S

Hb F Hb A

VCM

HCM

Hbg/dl

5-9

Hb SS

90-100 100

2-10

Hb S/b0tal.

70-90 90

5-20

5-10

Hb S/b+tal.

50-80 80

5-10

10-40

7-10

Hb SS/atal.*

80-90 90

1020

9-11

Hb SC

40-50 50

9-13

Hb SD

40-50 50

9-13

Hb S/PHHF

60-80 80

1530

12-14

Hb AS

30-40 40

60-70

12-16

* pode ser detectada a Hb H (conc.: 2 a 5%), ou agregados, intraeritrocitários de Hb H

Hb S/Persistência Hereditária de Hb Fetal

A interação entre anemia falciforme (Hb SS) e persistência hereditária de Hb Fetal (PHHF), ou Hb S/PHHF, produz um quadro hematológico com discretas alterações morfológicas, concentração de hemoglobina geralmente dentro dos limites de normalidade (tabelas (tabelas 5.1 e 5.2). Os testes específicos mais eficientes são a eletroforese de hemoglobina em pH alcalino, dosagem de Hb Fetal etal e coloração intra-eritrocitária intra de Hb Fetal (figura figura 5.13). 5.13 A concentração de Hb Fetal varia entre 15 e 30%, e pelo fato de não se co-polimerizar co polimerizar com a Hb S, a ocorrência do desencadeamento do processo da falcização é mínimo (consultar os ítens 1.9, 1.9 3.3 e 7.4).

238

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Figura 5.13. Esfregaço preparado para coloração citoquímica de Hb Fetal intra-eritrocitária. intra Somente os eritrócitos corados em vermelho contêm Hb Fetal. Neste esfregaço a distribuição é heterogênea, característica de tal. beta. Quando há persistência hereditária de Hb Fetal (PHHF) todos os eritrócitos trócitos ficam homogeneamente corados pela presença de Hb Fetal.

Tabela 5.1. Alterações da morfologia eritrocitária nos diferentes genótipos das síndromes talassêmicas. Genótipo

Alterações da Morfologia Eritrocitária

Normocitose, normocromia

Células falcizadas e em alvo. Hipocromia e policromasia. Eritroblastos, corpos de Howell-Joly. Howell

S/tal. beta

Anisocitose, microcitose, poiquilocitose, células falcizadas, dacriócitos, células em alvo. Hipocromia e policromasia.

S/tal. alfa

Anisocitose, microcitose, microcitose, células falcizadas. Hipocromia e policromasia.

Aniso-poiquilocitose. poiquilocitose. Hipocromia.

Células falcizadas e em alvo. Policromasia.

S/PHHF

Discreta anisocitose, ou normocitose e normocromia.

Tabela 5.2. Principais alterações laboratoriais nas doenças falciformes. Doença Falciforme

Porcentagens de Hb S

Hb F

Hb A

VCM

HCM

Hbg/dl

90-100

2-10

5-9

Hb S/b tal.

70-90

5-20

5-10

Hb S/b+tal.

50-80

5-10

10-40

7-10

Hb SS 0

239

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Hb SS/atal.*

80-90

10-20

9-11

Hb SC

40-50

9-13

Hb SD

40-50

9-13

Hb S/PHHF

60-80

15-30

12-14

Hb AS

30-40

60-70

12-16

* pode ser detectada a Hb H (conc.: 2 a 5%), ou agregados, intraeritrocitários de Hb H

O Traço Falciforme (Hb AS)

O traço falciforme é o estado de heterozigose das doenças falciformes (Hb AS). A Hb A sempre está com concentração superior à da Hb S, e por isso os portadores são assintomáticos, com eritrograma normal. Em situações especiais de extrema hipoxia tecidual, o portador de Hb AS pode ter crises de dores, sem alterações hematimétricas importantes. Em ocasiões raras, podem ocorrer hematúria, assim como hipostenúria – por falha dos rins em concentrar a urina. Os testes específicos mais comuns são: teste de falcização (atualmente em desuso pela ineficácia), o teste de solubilidade (também em desuso pelas mesmas razões), as eletroforeses de hemoglobinas em pH alcalino (figura ( 5.14), em agarose-ácida (figura 5.5)) e eletroforese de focalização isoelétrica (figura figura 5.15). 5.15 Pela eletroforese de focalização isoelétrica, é possível diferenciar a Hb D que tem a mesma posição eletroforética da Hb S em eletroforese de pH alcalino em acetato de celulose e agarose alcalina. Da mesma forma a eletroforese em agaroseagarose ácida é eficiente na diferenciação entre as hemoglobinas S e D, conforme mostra a figura 5.4.

Figura 5.5. Eletroforese de hemoglobinas em agarose ácida (pH 6.2). (1) Hb S; (2) controle: Hb ASC; (3) controle normal: Hb AA. Observar traços de Hb Fetal nas três amostras analisadas.

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Figura 5.14. Eletroforese de hemoglobinas em acetato de celulose, tampão alcalino (pH 8.5). (1) Controle: Hb ASC; (2) Hb A + Lepore – A Hb Lepore migra na mesma posição da Hb S, porém sua concentração é abaixo de 15% e o portador tem anemia microcítica e hipocrômica; hipocrômica; (3) Hb AS; (4) Hb AC; (5) Hb AS.

241

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Controle Clínico dos Doentes Falcêmicos Aspectos Gerais da Anemia

As manifestações clínicas na anemia falciforme (HbSS) geralmente não são notadas até a segunda metade do primeiro ano de vida, quando os níveis de HbF que até então eram suficientes para limitar uma falcização clinicamente importante, caem em relação aos níveis crescentes de HbS presentes nos eritrócitos produzidos na medula óssea. O quadro clínico da doença falciforme apresenta grande variabilidade entre os pacientes, assim como no mesmo indivíduo ao longo de sua evolução. Dentre as síndromes falciformes, a anemia falciforme cursa com maior gravidade clínica, seguido pela S 0-talassemia, talassemia, doença da HbSC e S +-talassemia. Recentemente Platt e cols. estudaram estudaram um grupo de 3764 pacientes onde mais de 50% dos pacientes acompanhados sobreviveram além da quinta década, sendo a maior sobrevida detectada no sexo feminino e nos pacientes com HbSC (em relação à HbSS). Os pacientes mais sintomáticos apresentaram maior risco de morte precoce; leucocitose e baixo nível de HbF foram os fatores (laboratoriais) de risco mais importantes. As principais complicações clínicas que acometem os portadores de doença falciforme na sua forma homozigota ou em combinação de heterozigose heter são:

Dactilite (Síndrome Mão-Pé) Pé)

Acomete crianças na primeira infância, principalmente entre 6 meses a 2 anos de idade. Os episódios são tipicamente caracterizados por dor intensa e edema (sem eritema) no dorso das mãos e dos pés (fig. 6.2.1). ). Pelo menos duas e geralmente as quatro extremidades estão envolvidas, carretando um crescimento desproporcional entre os dedos (fig. (fig. 6.2.2). 6.2.2 São comuns a febre e a leucocitose; as alterações radiográficas com afinamento cortical e destruição dos metacarpos,, metatarsos e falanges, aparecem 2 a 3 semanas após o início dos sintomas. Os episódios são autolimitados e se resolvem dentro de 1 a 2 semanas, sendo a recorrência comum. Tratamento com sintomáticos.

242

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Figura 6.2.1 – Síndrome mão-pé. mão Mão de uma criança com anemia falciforme, com edema e dor.

Figura 6.2.2 – Dactilite (Síndrome mão-pé). mão pé). Mão de uma jovem de 16 anos, com marcante encurtamento do dedo médio da mão direita, por alteração no crescimento da epífise.

Síndrome do Quadrante Superior Direito

Na anemia falciforme, a análise histológica do fígado revela distensão dos sinusóides com células falciformes, eritrofagocitose das células de Kupffer, graus variados de fibrose periportal e pigmento de hemossiderina. Pode haver distúrbios da função hepática, e a dilatação aguda do fígado (por seqüestro de células falciformes, infarto subcapsular ou trombose de veia hepática) está associada a sensibilidade ou dor do quadrante superior direito.

243

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A síndrome é caracterizada por dor abdominal, febre e icterícia. A diferenciação entre colecistite e a crise hepática pode ser difícil, sendo que o quadro clínico, os níveis de bilirrubina direta e indireta, e a ultrassonografia abdominal são dados úteis para elucidar o diagnóstico. A colelitíase acomete 75% dos pacientes com HbSS, e 90% destes realizam colescistectomia (profilática ou terapêutica); os cálculos biliares foram documentados em crianças com menos de 5 anos de idade, e sua incidência aumenta com a faixa etária. O seqüestro agudo de eritrócitos falcizados nos sinusóides inusóides hepáticos é caracterizado por hepatomegalia associada a uma queda da hemoglobina, mas sem alterações significativas na função hepática. A crise hepática (também chamada de colestase intra-hepática intra hepática falciforme) é caracterizada por episódio súbito dee dor no hipocôndrio direito, hepatomegalia progressiva, aumento importante do nível de bilirrubinas (principalmente indireta) e alteração do coagulograma. O nível das enzimas hepáticas também encontram-se encontram se aumentados mas não como nas hepatites virais. A gravidade avidade dos episódios variam de leve à grave (com risco de vida). O diagnóstico diferencial dessas condições devem ser feitos com hepatite viral, doença hepática auto-imune, imune, colangite esclerosante, coledocolitíase e colecistite, todos os quais podem ser encontrados contrados nos pacientes com doença falciforme. Nesses casos, a biópsia hepática é importante para elucidação do diagnóstico. O tratamento para a hepatopatia falciforme inclui ex-sangüíneo ex sangüíneo transfusão e infusão de plasma fresco para corrigir a coagulopatia e reverter a colestase intra-hepática.

Síndrome Torácica Aguda (STA)

Caracterizada por dor torácica, febre, dispnéia, infiltrados pulmonares e declínio do nível basal de hemoglobina. Consiste na maior causa de morte e hospitalização entre os pacientes com doença falciforme. É três vezes mais freqüente em crianças do que em adultos e é mais comum na HbSS, seguido pela Sb0-talassemia, talassemia, doença da HbSC e Sb+-talassemia. A incidência da STA é inversamente proporcional ao nível de HbF e ao grau de anemia, mas diretamente etamente proporcional ao nível basal de leucócitos, além disso, está intimamente associada às crises dolorosas principalmente em adultos (30 a 50% dos episódios de STA são precedidos ou acompanhados por crises dolorosas). Para avançar no conhecimento da causa causa e evolução da síndrome, um recente estudo prospectivo e multicêntrico envolvendo 538 pacientes com STA foi desenvolvido. O tempo médio de hospitalização destes pacientes foi >10 dias, sendo associado à idade avançada, dor nos membros à apresentação, febre, febre, diminuição do nível de plaquetas, alterações radiológicas extensas, terapia transfusional e insuficiência respiratória (principalmente em pacientes cardiopatas, com 4 ou mais lobos pulmonares afetados e com plaquetas <199.000). Cerca de 22% dos pacientes tes com STA desenvolveram complicações neurológicas, e metade destes evoluiu com insuficiência respiratória; o mecanismo provável seria uma queda súbita da oxigenação no leito vascular do sistema nervoso central. As causas da STA – até então raramente identificadas iden – puderam ser estabelecidas em 38% dos casos, e o infarto pulmonar presumido em 16% dos casos, onde a embolia gordurosa (liberação de gordura secundária a infarto da medula óssea) e a infecção (especialmente a pneumonia 244

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP adquirida na comunidade) foram foram causas comuns. Dentre os organismos identificados e associados à STA, aChlamydia Chlamydia pneumoniae foi o mais freqüente, seguida por Mycoplasma pneumoniae e o vírus (vírus sincicial respiratório e parvovírus). O tratamento da STA consiste em antibioticoterapia antibioticoterapia de amplo espectro, associada a um macrolídeo; broncodilatadores devido à hiperreatividade das vias aéreas; transfusão precoce e de rotina para os pacientes de alto risco, incluindo adultos com história de cardiopatia e dor intensa nos membros à apresentação; apresentação; na maioria dos pacientes com anemia, a transfusão simples cruzada e pobre em leucócitos é segura e eficaz.

Priapismo Ocorre pela diminuição da drenagem sangüínea do pênis decorrente da congestão dos corpos cavernosos e esponjosos pelas células falcizadas. A apresentação aguda é caracterizada por ereção dolorosa e persistente, que ocorre geralmente após uma relação sexual ou acorda o paciente pela manhã, sendo freqüente a necessidade de intervenção cirúrgica - uma vez que respondem mal à eritrocitoaférese. toaférese. O priapismo crônico é caracterizado por semi-ereção semi nãodolorosa do pênis; os pacientes podem ficar impotentes, sendo beneficiados neste caso com aconselhamento psicológico e uso de próteses.

Úlceras de Perna A ruptura da pele sobre o maléolo e porções distais das pernas é um problema recorrente durante a vida adulta (fig. 6.6.1). Ocorre em cerca de 5 a 10% dos pacientes adultos com HbSS, sendo mais comum no sexo masculino e em pacientes adultos. É menos comum nos pacientes com deleção do gene a, com alto nível de Hb total, e naqueles com aumento de HbF. A etiologia é provavelmente multifocal e associada à hipóxia local e deficiência do fluxo sangüíneo na microvasculatura do músculo gastrocnêmio. São características a infecção secundária da úlcera úlce com destruição das bordas e a extensão progressiva. Osteomielite pode complicar úlceras crônicas, principalmente aquelas com feridas profundas.

245

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Figura 6.6.1 – Necroses e ulterações no tornozelo de um paciente com anemia falciforme devido a estase vascular ascular e isquemia nas regiões inferiores das pernas.

O tratamento é feito principalmente com cuidados locais, mas pode requerer terapia transfusional, enxerto de pele, e uso de sulfato de zinco e oxigênio hiperbárico.

Necrose Avascular No fêmur, ela ocorre rre em cerca de 10% dos pacientes com doença falciforme. Acomete principalmente as cabeças do fêmur e úmero, assim como corpos vertebrais, devido ao suprimento sangüíneo terminal limitado e à pouca circulação colateral dessas áreas – tornandoas mais vulneráveis ráveis à falcização e lesão óssea. Os pacientes com doença falciforme e deleção do gene a(talassemia alfa) têm maior incidência de necrose avascular. A efusão das articulações, dor, febre e leucocitose que acompanham tais infartos tornam difícil a diferenciação iação de atrite séptica. O tratamento é sintomático, mas nas formas avançadas pode ser preciso a substituição total do osso; artroplastia e colocação de próteses podem ser feitas, mas são dotadas de muitas complicações.

Acidente Vascular Cerebral (AVC) O AVC é uma complicação catastrófica da doença falciforme, e uma das maiores causas de morte em crianças e adultos. Frempong e cols. encontraram uma prevalência de 3,7% desta complicação na doença falciforme, sendo maior nos pacientes com HbSS (4,0%), seguido seguid pela Sb-talassemia talassemia (2,4%), Sb+talassemia (1,3%) e HbSC (0,8%). A incidência é igual em ambos os sexos, sendo mais freqüente nos pacientes com 1 a 9 anos de idade. Mais da metade dos AVCs são isquêmicos (54%), seguido pelos hemorrágicos (cerca de 34%) e pelos elos acidentes vasculares transitórios (AIT - 10%). O AVC isquêmico é mais freqüente em pacientes com menos de 20 anos de idade, e o hemorrágico - responsável por alta taxa de mortalidade (24% nas duas primeiras semanas após o evento) - tem sua maior incidência incid dos 20 aos 29 anos de idade. 246

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP A recorrência após um episódio de AVC é alta, cerca de dois terços das crianças não transfundidas apresentarão um novo episódio em 3 anos. O principal fator de risco é o AIT prévio, seguido por baixo nível de Hb, antecedentes antecedentes de STA e pressão arterial sistólica elevada. O quadro clínico inicial é caracterizado por hemiparesia aguda e convulsões, tendo pior prognóstico nas crianças mais jovens. Hemiparesia residual crônica, retardo mental e episódios convulsivos de difícil controle constituem a evolução habitual. A ocorrência desta complicação é provavelmente multifatorial e sua fisiopatologia pouco conhecida. O local da oclusão ocorre mais ao nível dos vasos cerebrais maiores do que na microvasculatura (principalmente artéria artéria cerebral média e carótida interna). Além disso, outros fatores têm sido implicados, como a presença de um estado hipercoagulável demonstrado pelos baixos níveis de proteína C e hiperhomocisteinemia nos pacientes com doença falciforme que desenvolveram AVC. VC. Além da adesão aumentada dos eritrócitos falcizados ao endotélio vascular, a regulação anormal dos tônus vascular também contribui para a vaso-oclusão, vaso e têmse demonstrado que os níveis de óxido nítrico – um importante regulador do tônus vascular normal, al, adesão celular e trombose – podem estar diminuídos na doença falciforme. O ultrassom-doppler-transcraniano transcraniano pode detectar lesões obstrutivas nas artérias cerebrais e, deste modo, identificar os pacientes falcêmicos com alto risco de desenvolver AVC. O tratamento consiste em ex--sangüíneo sangüíneo transfusão ou hipertransfusão. Na terapia transfusional crônica, o objetivo é manter a HbS < 30%, o que reduz o risco de recorrência para menos de 10%. Em geral, as transfusões são realizadas por um mínimo de 5 anos, após apó os quais a continuação da terapia transfusional é individualizada. Dados crescentes vêm defendendo a necessidade de terapia prolongada, possivelmente por toda vida em alguns pacientes. O AVC agudo ou iminente é indicação absoluta de ex-sangüíneo ex transfusão, ão, cujo objetivo é manter a Hb em torno de 10 g/dl e a HbS abaixo de 30%, além de evitar a hiperviscosidade e as alterações de volume. A principal conseqüência do regime transfusional crônico é a sobrecarga de ferro e a necessidade de quelação com a deferoxamina, deferoxamina, sendo reportada a eritrocitaférese como modalidade terapêutica para esta complicação.

Crises Dolorosas É a complicação mais comum dos pacientes com anemia falciforme, cuja freqüência e gravidade variam consideravelmente de paciente para paciente, e no mesmo paciente. Estima-se Estima que anualmente, cerca de 60% dos pacientes terão um episódio grave de dor. Estresse de qualquer tipo (infecção, temperaturas extremas, estresse físico ou emocional) pode precipitar o episódio doloroso, que geralmente afeta os os ossos longos e articulações, sendo a região lombar o local mais freqüentemente referido. A freqüência das crises dolorosas variam diretamente com o hematócrito e inversamente com o nível de hemoglobina Fetal. Pacientes com HbSS e Sb0-talassemia talassemia têm duas vezes mais crises por ano que aqueles com HbSC e Sb+-talassemia. A oclusão microvascular, em maior parte na medula óssea, inicia o episódio agudo de dor. Acredita-se se que a isquemia tecidual decorrente da oclusão microvascular pela falcização "in situ", causa sa lesões e infarto do tecido que por sua vez deflagra uma resposta inflamatória secundária, e esta, leva ao aumento da atividade do sistema simpático com conseqüente aumento da isquemia tecidual, criando um ciclo vicioso.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Uma crise dolorosa grave tem sido definida como aquela que requer tratamento com opióide parenteral por 4 horas ou mais, tal evento é geralmente tratado no hospital com uma média de permanência em torno de 10 dias para o adulto. A ocorrência de três ou mais crises por ano no mesmo pacientee indica doença falciforme grave. As crises dolorosas são mais comuns durante a terceira e quarta décadas de vida, e a mortalidade aumenta nos adultos com maior número de episódios dolorosos.

Tratamento das Crises Dolorosas • • • •

•

Tratar a causa da crise (caso possa ser identificada). Iniciar analgesia prontamente. Hidratação vigorosa com 3 a 4 litros/dia em pacientes adultos (via oral se possível, intravenoso se necessário). Tratar crises dolorosas agudas e graves da seguinte forma: 1. administrar morfina, meperidina meperidina ou hidromorfone parenteral, em doses cheias, com intervalo de 2 a 4 horas. Checar a dor freqüentemente. 2. Não especificar tratamento "se necessário". 3. Considerar a associação de drogas como hidroxizine, difenidramina, prometazina ou um anti-inflamatório anti não esteroidal. 4. Considerar analgesia paciente-controlada, paciente controlada, caso sejam necessárias doses mais freqüentes. Usar escalas de dor (escala análoga, 0 [ausente] até 10 [insuportável] para guiar a eficácia do tratamento e determinar as doses. Tratar dor crônica ou dor leve a moderada como se segue: 1. usar adesivos de fentanil para dor moderada a grave prolongada. 2. Usar acetaminofen com codeína para dor leve a moderada, sem necessidade de atendimento médico. 3. Administrar anti-inflamatório anti não esteroidal para a dor de osteonecrose, eonecrose, quando não houver contra-indicação contra indicação de seu uso por insuficiência renal ou hepática.

Interferentes que acentuam ou minimizam a Anemia Falciforme A anemia falciforme tem um desenvolvimento clínico extremamente variável que se caracteriza principalmente lmente por diferentes graus de intensidade da anemia hemolítica. As razões dessa variabilidade são parcialmente conhecidas na expressão fenotípica da doença. Apesar de ter um mesmo defeito genético, a anemia falciforme pode estar associada com níveis diferentes difer de Hb Fetal e interações com talassemia alfa que atuam como moduladores genéticos da doença. Entretanto, outros defeitos genéticos dos eritrócitos, com destaques para a deficiência de GG 6PD, a esferocitose e as deficiências de enzimas anti-oxidantes anti (SOD, GPx e catalase) certamente interferem no curso clínico da doença. Os diferentes haplóticos de Hb S denominados por Banto, Benin, Senegal, Camarões e Asiático, tem sido apontados também como possíveis causas da heterogeneidade fenotípica da anemia falciforme. falciforme. Toda essa diversidade que caracteriza a anemia falciforme está, em parte, relacionada à sua origem multicêntrica (consultar item 2.2) e que envolvem populações com diferentes anormalidades genéticas de proteínas e enzimas eritrocitárias. Por outro lado, além desses fatores caracterizados como interferentes eritrocitários, há os interferentes do meio ambiente em que 248

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP está inserido o doente falciforme. Entre os interferentes ambientais destacam-se destacam as situações sociais, econômicas e culturais do doente, doente, e que tem influencia no curso de sua doença.

Principais consequências dos interferentes ambientais, sociais e econômicos na anemia falciforme

Os principais interferentes ambientais que certamente tem influência nas consequências fisiofisio patológicas da anemia falciforme podem ser agrupados em três classes distintas, muitas vezes indissociáveis, e aqui identificados por: (a) meio ambiente, (b) deficiência cia alimentar e qualidade nutricional inadequada e (c) deficiência nas assistências médica, social e psicológica. Como se sabe, a grande maioria dos doentes falcêmicos e, notadamente aqueles com anemia falciforme, no Brasil, tem sua origem proveniente dos negros africanos. Historicamente os negros foram introduzidos como escravos nesse país e, mesmo com a libertação desse regime, seus descendentes tiveram poucas oportunidades de se desenvolverem social e economicamente como seria de se desejar. Nesse contexto, contexto, a maioria da população negra brasileira e, consequentemente os doentes falcêmicos, habitam as regiões mais pobres e carentes das nossas cidades. Os aspectos ambientais desses locais de moradias se caracterizam, em geral, pelas deficiências de saneamentoo básico, poluição ambiental, violência, qualidades inadequadas do ar, da água, de transportes e de higiêne, entre outros. A pobreza a que estão subjugados a maioria da população negra em nosso país, determina uma situação nutricional deficiente e desbalanceada, desbalanceada, notadamente de proteínas e vitaminas. As águas contaminadas por nitritos e microorganismos provenientes de dejetos humanos e animais são fatores que concorrem para acentuar a mortalidade dos pacientes falcêmicos. As deficiências nos atendimentos médico médico e social, por sua vez, são determinantes para a queda da expectativa de vida e falta de auto-estima auto estima do doente falcêmico. O atendimento médico especializado para o falcêmico está restrito a pouquíssimos centros, fato que o torna inexpressivo em nosso país. ís. Somam-se Somam se a esta situação o desconhecimento médico e paramédico no que se refere à clínica, ao tratamento, ao diagnóstico clínico e laboratorial, e ao acompanhamento adequado e seguro do doente. Por outro lado, os atendimentos social e psicológico sofrem m idênticas insuficiências acima expostas. Todos esses fatores listados como interferentes ambientais contribuem com as diversidades clínicas e hematológicas da anemia falciforme. Um exemplo específico dos interferentes decorre da oxidação da Hb S por gases gase poluentes (Nox e Sox), bem como dos alimentos e água contaminados por nitritos. A susceptibilidade à oxidação da hemoglobina é muito maior em pessoas com deficiências de enzimas anti-oxidantes, anti oxidantes, como são os casos de superóxido dismutase (SOD) glutatião peroxidase peroxidase (GPx) e catalase. Assim, é de se esperar que na Hb SS a deficiência de uma dessas enzimas anti-oxidantes anti oxidantes tenha influência na destruição precoce do eritrócito, e essa destruição poderá ser muito maior se o ambiente em que vive o paciente falcêmico contém gases poluentes oxidantes. Dessa forma, é importante para os profissionais médicos e paramédicos que se dispõe a prestar assistência médica, social, psicológica e laboratorial, tenham também amplo conhecimento da história relatada de cada um dos pacientes pac falcêmicos, com referências ao seu modo de vida, dos ambientes em que vivem e trabalham, bem como das suas dificuldades diárias (transportes, alimentação, desemprego, violência, etc.).

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Interações da Hb SS com Deficiência de G-6PD G

A deficiência de G-6PD é uma alteração genética recessiva ligada ao cromossomo X, cujo grau de heterogeneidade clínica e hematológica está na dependência de um dos cinco tipos em que é classificada (tabela 7.3.1).. A deficiência de G-6PD G tem elevada prevalência na África, alcançando valores de 30% em determinadas regiões, se distribui coincidentemente no continente africano na mesma faixa da Hb S e, da mesma forma que no traço falcêmico, há evidências de que o portador desta enzimopatia seja também resistente ao desenvolvimento do ciclo da parasitose do Plasmodium. Plasmodium. No Brasil a prevalência da deficiência de G-6PD G é variável entre 1 e 4% nas pessoas brancas e entre 9 e 15% entre as pessoas negras. Por essas razões não é rara a observação da associação entre anemia falciforme e deficiência de G-6PD G 6PD numa mesma pessoa. As vantagens ou desvantagens seletivas nessas associações ainda são discutíveis, mas por outro lado há evidências ias comprovadas de que sob circunstâncias que desencadeiam a oxidação da hemoglobina, como são os casos do uso de drogas oxidantes, ocorrem graves crises hemolíticas quando há associação entre anemia falciforme e deficiência de G-6PD. G Entretanto, há de se considerar a heterogeneidade da hemólise e anemia causadas pela deficiência dessa enzima devido aos diferentes tipos (tabela 7.3.1), fato que certamente interfere em graus diversos quando associados à anemia falciforme. Tabela 7.3.1. - Relação entre as cinco cin classes de G-6PD e Anemia Hemolítica.

• • •

Classe 1

Variantes deficientes associadas à anemia hemolítica crônica. Exemplo: variante New York

Classe 2

Variantes com deficiência acentuada da atividade da enzima G-6-PD G (menos de 10% da atividade normal). Exemplo: mplo: Variante Mediterrânea.

Classe 3

Variantes com deficiência moderada da atividade da enzima G-6-PD G (10 a 60% da atividade normal). Exemplo: Variante Africana ou 6-GPD 6 A.

Classe 4

Variantes com deficiência discreta da atividade da enzima G-6-PD G (60 a 100% da atividade normal).

Classe 5

Variantes com atividade da enzimática aumentada da enzima G-6-PD. G

A Classe 1 é muito rara As Classes 2 e 3 são as mais importantes sob o ponto de vista clínico, pois causam crises de hemólises quando o portador é exposto exp à drogas oxidantes. No Brasil, a deficiência de G-6-PD G mais comum é a de classe 3 - Africana (87% dos casos), seguida de classe 2 - Mediterrânea (com 12% dos casos).

Interações da Hb SS com Persistência Hereditária de Hb Fetal

A concentração máxima de Hb Fetal no sangue de uma pessoa com idade superior a seis meses é variável de 1 a 2%, dependendo do método usado para sua avaliação, e está restrita a poucos eritrócitos identificados por células-F. células Cerca de 3 a 7% dos eritrócitos contém Hb Fetal e cada um deles tem 4 a 8 picogramas (pg) de Hb Fetal juntamente com 22 a 26 pg de Hb A. O número 250

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP de células-F F de um indivíduo está sob controle genético, embora não se sabe se é do tipo monogênico ou poligênico. Tanto o número de células-F células F e a quantidade de Hb Fetal em cada célula-F F pode estar aumentado em várias condições genéticas ou adquiridas. Entretanto, as duas principais situações em que o nível de Hb Fetal está elevado são a persistência hereditária de Hb Fetal (PHHF) e nas diversas diversas formas de talassemias beta. Em ambos os casos as alteraçòes hematológicas avaliadas laboratorialmente são diferentes (tabela ( 7.4.1.). ). Por outro lado, o aumento de Hb Fetal causada por situação adquirida se deve especialmente ao uso de determinadas drogas, como se verá adiante. Na PHHF a síntese de Hb Fetal continua mesmo após o sexto mês de vida, com valores cujas elevações são variáveis entre 1 a 100%. As duas principais causas da PHHF se devem a diferentes deleções que atingem os dois genes gama (glicina e alanina) do cromossomo 11, e às mutações que não são por deleção (mutações de não-deleção). não deleção). Entre as pessoas de raça negra, a PHHF se deve às deleções nos genes gama, com concentrações de Hb Fetal variáveis de 5 a 30% entre os heterozigotos, e os portadores são clínica e hematologicamente normais (tabela ( 7.4.2.). ). Na PHHF homozigota os níveis de Hb Fetal podem chegar entre 90 e 100%, e apesar dos portadores serem saudáveis é comum a presença de eritrocitose e a hipocromia, com valores hematimétricos similares ao da talassemia beta menor. Os portadores de PHHF por mutações de não-deleção deleção tem eritrócitos normais e ausência de manifestações clínicas. A elevação de Hb Fetal nesses casos é muito variável e, da mesma forma, a distribuição intraeritrocitária pode ser pancelular ou heterocelular (tabela ( 7.4.3.). O significado clínico da associação da PHHF na anemia falciforme se mostra favorável hematologicamente conforme mostra a tabela 3.3.1, pois nesta interação Hb SS/PHHF as células-F F tem baixas concentrações de Hb S, fato que inibe a polimerização da Hb S bem como o desencadeamente te da falcização dos eritrócitos. Assim, admite-se admite se que a concentração intraintra eritrocitária da Hb Fetal seja particularmente útil na proteção contra o processo de falcização por não interagir com a Hb S quando esta se insolubiliza. Testes realizados "in vitro" vitr em soluções desoxigenadas contendo Hb Ae Hb S, mostraram que ocorre a insolubilização e precipitação somente da Hb S, e ao se redissolver o precipitado se detecta ambas hemoglobinas A e S. O mesmo experimento realizado em soluções contendo Hb Fetal e Hb S mostraram que a Hb Fetal não se precipita como a Hb S, e este fato sugere que as globinas gama exercem um efeito inibidor sobre a polimerização das globinas beta S, evitando a falcização. As evidências de que a elevação de Hb Fetal em pacientes com anemia anemia falciforme seja um fator moderador das consequências clínicas do processo da falcização, fizeram com que muitos pesquisadores se interessassem em conhecer as situações fisiológicas e terapêuticas capazes de elevarem a síntese de Hb Fetal. Assim, um dos primeiros trabalhos nesse sentido se deu pela observação de que gestantes a partir do segundo trimestre de gestação apresentavam níveis elevados de Hb Fetal. Com base nesses dados Beutler, em 1969, administrou gonadotrofina coriônica humana (hCG) em pacientes pacientes com anemia falciforme e obteve discretas elevações no nível de Hb Fetal. Da mesma forma, a progesterona foi administrada em pacientes com Hb SS, cujos resultados divulgados em 1969 por Beutler, e em 1982 por De Ceulaer e cols, mostraram outra vez que a Hb Fetal apresentava-se apresentava se com discretas elevações de seus níveis em relação ao nível basal de cada paciente. Os estudos na busca de medicamentos que elevassem os níveis de Hb Fetal continuaram com De Simone e cols em 1982 de forma experimental em babuinos anêmicos, nêmicos, que passaram a receber por via sub-cutânea sub a droga 5-azacitidina azacitidina (Aza-C) (Aza (16). Os animais que receberam a Aza-C Aza C tiveram elevações de síntese de Hb Fetal entre 70 e 80% do conteúdo total de hemoglobina e o aumento de células-F células F em 90% dos eritrócitos, eritrócito enquanto que s reciprocamente a síntese de globina-beta globina diminuía. Esses primeiros relatos promoveram buscas incessantes de medicamentos que pudessem ser aplicados de forma terapêutica em pacientes com doenças graves causadas por anormalidades de síntese de globina-beta. beta. A partir desses relatos vários pacientes com talassemia maior e anemia falciforme foram estudados por Ley e cols em 1982 e 1983, Charache e cols em 1983. Esses pacientes após terem recebido Aza-C Aza por 251

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP via intravenosa, apresentaram aumento na na concentração de Hb Fetal e no número de células F, geralmente nos primeiros 2 e 3 dias, e atingido níveis máximos de elevação entre quatro e sete vezes acima do valor da Hb Fetal dosada antes do tratamento. As avaliações das células falcêmicas desses pacientes ientes mostraram que o número de células densas diminuíram, bem como o grau de hemólise. Estudos realizados com outros agentes quimioterápicos como a citosina arabinosídeo (ARA-C) C) e efetuados por Papayannopoulo e cols em 1984, a vinblastina por Veith e colss em 1985, e Mileran por Liu e cols em 1990, também mostraram efetivo estímulo na síntese de Hb Fetal. Apesar da eficácia dessas drogas em elevar a síntese de Hb Fetal, os efeitos citotóxicos, e inclusive sua potencialidade carcinogênica, fizeram com que as as mesmas fossem abandonadas como uso terapêutico na anemia falciforme e talassemia beta. Paralelamente a esses estudos, as pesquisas desenvolvidas com hidroxiuréia (HU) - um agente quimioterápico usado desde os anos 60 passaram a ser mais promissores. Primeiramente Primeiramente porque esta droga não é incorporada ao DNA, como são os casos de Aza-C, Aza Ara-C C e Mileran, e sua ação decorre por inibir a ribonucleotíde-redutase, redutase, uma enzima que converte ribonucleotídeos em desoxiribonucletídeos para a síntese de DNA. Embora a HU tenha modestos efeitos em vários tipos de tumores, o seu uso clínico em oncologia está limitado ao controle das fases crônicas da leucemia mielóide crônica e na rápida redução do número de células blásticas em pacientes com leucemias agudas durante a fase inicial de tratamento, além do uso também no tratamento da policitemia primária ou policitemia vera. Os primeiros resultados dos efeitos positivos da HU, caracterizados pela elevação dos níveis de Hb Fetal em pacientes com anemia falciforme surgiu em 1984.. Embora a HU também tenha seus efeitos avaliados em 299 pacientes falcêmicos, americanos e canadenses, mostraram que os episódios de crises dolorosas diminuíram significativamente ao longo de um ano de rigorosa avaliação. Apesar disso, estudos multicêntricos cos estão levantando os resultados do uso da HU associados com várias características clínicas, genéticas e de efeitos terapêuticos. Finalmente, a busca de outras drogas que elevam os níveis de Hb Fetal, como são os casos da eritropoietina (Epo) e butiratos, butirato ainda apresentam grandes diversidades de resultados, fatos que tornam suas eficácias ainda inconclusivas. A tabela 7.4.4 apresenta as principais drogas capazes de elevarem os níveis de Hb Fetal em humanos. Tabela 7.4.1 - Fenótipos de persistência hereditária hereditária de Hb Fetal (PHHF) heterozigota e talassemia beta menor, relacionados com alterações hematológicas, concentração e distribuição celular de Hb Fetal. Aspectos laboratoriais

PHHF

Talassemia beta menor

Morfologia dos eritrócitos

Normal

Microcítica

Hemoglobina oglobina corpuscular média

Normal (*)

Diminuida

Hematócrito

Normal (*)

Diminuído

Hb Fetal (%)

1 - 100

0 - 10

Distribuição eritrocitária da Hb Fetal

Pancelular

Heterocelular

(*)Podem estar diminuidos na homozigose

252

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP

Tabela 7.4.2. - Persistência hereditária de Hb Fetal por deleções nos genes gama. Grupo Étnico

Tamanho da Deleção (Kb)

% de Hb Fetal (*)

Negro (USA)

>70,0

20 - 30

Negro (gana)

>70,0

20 - 30

Italiano

38,0

17 - 30

Italiano

44,0

21 - 23

Negro (Kenya)

22,8

5-8

(*) A distribuição intra-eritrocitária eritrocitária da Hb Fetal é pancelular (ou homogêneo) em todos estes grupos étnicos. Tabela 7.4.3. - Persistência hereditária de Hb Fetal por não deleção Grupo Étnico

Defeito Molecular

% de Hb Fetal

Distribuição de Hb Fetal

Negro

C à at 202

15 - 20

Pancelular

Italiano

C à at 196

10 - 20

Pancelular

Grego

G à A at 117

10 - 20

Pancelular

Chinês

C à T at 196

10 - 15

Heterocelular

Alemão

Não determinado

5-8

Heterocelular

Inglês

T à C at 198

4 - 12

Heterocelular

Suiço

Não determinado

1-3

Heterocelular

Tabela 7.4.4. - Drogas capazes de elevar o nível de Hb Fetal. Origem

Drogas

Hormonal

HCG - Progesterona

Agentes Citotóxicos

Aza-C, Ara-C, Metotrexato, HU

Fator eritropoiético

Eritropoietina

Ácidos graxos cadeia curta

de Butirato-arginina, arginina, Isobutiratos, Fenilacetato, Fenil-butirato, Ácido valpróico

Interações da Hb SS com Esferocitoses e Eliptocitoses A esferocitose hereditária é uma doença geneticamente heterogênea do tipo dominante, causada por alterações nas composições protéicas da membrana eritrocitária. A associação entre anemia 253

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP falciforme e esferocitose hereditária está, portanto, na dependência dos interferentes da própria anemia falciforme (exemplo: talassemia alfa, Hb Fetal, etc.) e o grau de lesão protéica causadora da esferocitose hereditária. Entretanto, de forma geral, a simples associação entre essas duas patologias causa anemia hemolítica com maior intensidade e esplenomegalia, do que usualmente se verificam na anemia falciforme. Presume-se, Presume se, assim, que a piora do quadro hematológico se deve à combinação dos efeitos hemolíticos das duas doenças. Por outro lado há relatos de pacientes com Hb SS e Hb Fetal elevada (entre 13 e 20%) que, apesar da associação com a esferocitose, apresentavam poucas crises de hemólises.

Deficiência de Enzimas Eritrocitárias Eritr Anti-Oxidantes Oxidantes (SOD, catalase, GPx)

Consultar o ítem 4.3 deste capítulo e o capítulo específico "Radicais Livres e danos eritrocitários".

Prevalência e Controle do Gene da Hb S Distribuição Geográfica Mundial.

Desde os anos 50 muitos estudos tem sido realizados em diferentes partes do mundo com o objetivo, inicialmente de se conhecer prevalência e medidas preventivas, e mais recentemente para ara o conhecimento dos haplótipos. As mais altas prevalências do gene ßs, caracterizado pela identificação do heterozigoto ou portador do traço falcêmico (Hb AS) superam 40% em alguns vilarejos do leste africano, e situa-se se acima de 20% nos países da África África equatorial: Camarões, Guiné, Zaire, Uganda e Kenia. Também, em países asiáticos como Arábia Saudita, Emirados Árabes e regiões da India, a prevalência da Hb AS atinge até 20% da população. Em regiões próximo ao extremo asiático como o Nepal, a freqüência do gene ßs (Hb AS) é de 5%. Na região que circunda o mar Mediterrâneo, incluindo a costa norte da África, Turquia, Líbano, Síria e Grécia, bem como em Portugal e Irã, as prevalências situam-se situam se entre 2 e 5%. Entretanto é importante destacar que dentro dessas as regiões (ou países) a prevalência varia consideravelmente entre vilarejos ou grupos raciais, como são os casos dos Eti-Turcos Eti Turcos na Turquia (14%), e entre os Khazramah na Síria (25%). Em todas as regiões descritas, pode-se pode se invocar a hipótese malária como fator f das altas freqüências do gene ßS. Porém, a presença da Hb S no "novo mundo", onde se incluem principalmente os Estados Unidos da América, Venezuela, Colombia, Jamaica, Cuba e Brasil, a presença de Hb S não pode ser explicada pela hipótese-malária, hipótese uma vez que foram introduzidos notadamente por escravos africanos. Outros países europeus como a Itália, principalmente na Sicília e Calábria – Holanda, Inglaterra e França, apresentam prevalências variáveis entre a 3% do gene ßS. Na Itália a indrodução do gene ßS certamente ocorreu a partir das conquistas efetuadas pelo Império Romano na África, enquanto que na Holanda, Inglaterra e França a imigração de africanos pertencentes a exex colonias tende a elevar prevalência de Hb S ao longo dos próximos anos.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP As hemoglobinopatias oglobinopatias se apresentam como doenças de importância na saúde pública de vários países latino-americanos. americanos. Particularmente nas ilhas do Caribe, onde a população é predominantemente de negros e a frequência de doenças faciformes é significativamente alta. alta Alguns desses países desenvolveram programas de controle de hemoglobinopatias com sucesso, como são os casos de Martinica, Guadalupe, Jamaica e Cuba. Por outro lado, dois dos países com altas prevalência de doenças falciformes: República Dominicana e Haiti, Hai caracterizados como os países mais pobres das Américas, carecem de qualquer tipo de programa preventino e de controle. Especialmente com relação a Cuba, cuja população é constituída por 65% de brancos de descendência espanhola e 35% de negros do oeste da África, e que apresenta atualmente uma população muito miscigenada, onde 10 milhões de pessoas são mulatas, desde o início dos anos 60, este país desenvolveu um sistema de saúde preventiva com ênfases aos cuidados primários, e o mesmo tempo investiu em tecnologia para os centros especializados em Medicina terciária. Além de ter desenvolvido programa de controle às infecções e à subnutrição, com resultados positivos que diminuíram os índices de mortalidade (em 1990: 10,8 por 1.000) e morbidade, desenvolveuu também controles preventivos para hemoglobinoptias. As frequências de Hb AS e Hb AC variam entre 3 a 7% e a expectativa de nascimento anual de crianças com doenças falciformes é cerca de 100 casos novos. Esse reduzido número de nascimento de crianças com doenças falciforme se deve aos programas de prevenção em gestantes, com aproximadamente 160 mil análises eletroforéticas de hemoglobinas por ano. Para as gestantes portadoras de Hb AS, os estudos se ampliam aos seus companheiros e familiares. Além da identificação identificação de casais de risco (ambos com Hb AS), o serviço de saúde oferece o diagnóstico prépré-natal por meio de análise do DNA, e na positividade do feto ser portador de anemia falciforme, sugere-se sugere o aborto. A Venezuela e a Colômbia apresentam populações com significativas freqüência de negros e mulatos e, consequentemente, as prevalências de Hb S nos dois países também são altas. Estudos realizados em indígenas venezuelanos e colombianos não revelaram a presença de hemoglobinopatias em suas populações nativas. nativas. As talassemia beta representam baixos índices de prevalência nos países, e ambos não têm nenhum programa de prevenção até o presente. A Argentina, composta predominantemente por populações nativas e de origens européias, estas provenientes da Itália e principalmente da Espanha, tem na talassemia beta o tipo mais comum de hemoglobinopatias e somente em Buenos Aires, em 1990, havia registrado cerca de 100 casos de talassemia maior. Também nesse país não há programas preventivos de hemoglobinopatias. Entre re os países da América Central que incluem Guatemala, Honduras, El Salvador, Nicarágua, Costa Rica e Panamá, com uma população total próxima de 30 milhões de habitantes a maioria das hemoglobinopatias foi encontrada entre os negros e mulatos. As prevalências prevalênc de Hb S e Hb C apresentam grande variabilidade, de um país para outro. Por exemplo, na Costa Rica, a freqüência média de Hb AS é de 11% na sua população negra, enquanto entre os negros da Guatemala é de 18% e do Panamá é de 20%. Na Costa Rica, por ter um Centro de Hemoglobinopatias mais avançado entre os países da América Central, detectou-se detectou 2,0% de talassemia alfa e 0,2% de talassemia beta heterozigota em estudos populacionais. Finalmente, o México, que tem a segunda maior população entre os países latino-americanos la (cerca de 90 milhões de habitantes), apresenta sua composição étnica predominantemente de origem indígena, além de mestiços provenientes do cruzamento com espanhóis. entre as hemoglobinopatias mais prevalentes destaca-se destaca a talassemia beta heterozigota eterozigota (0,1%), enquanto os casos de Hb S são esporádicos. Outros países latino-americanos, americanos, como o Uruguai, Bolívia, Equador, Paraguai, Peru e Chile, carecem de informações a respeito da prevalência de hemoglobinopatias em suas populações. 255

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Distribuição Geográfica no Brasil

As populações brasileiras caracterizam-se, caracterizam se, em geral, por apresentarem grande heterogeneidade genética, derivada da contribuição contribuição que lhes deram os seus grupos raciais formadores, de si também já muito diversificados, e dos diferentes graus com que eles se intercruzaram nas várias regiões do país. O processo de miscigenação pode ser analisado sob o ponto de vista de distribuição geográfica. Os estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro e a região litorânea do Nordeste apresentam, de forma mais intensa, a miscigenação branco-negra. branco negra. Já o interior do nordeste e o extremo norte (Amazonas, Pará e parte do Maranhão) serviram de palco principalmente cipalmente para o processo de mestiçagem branco-indígena, branco indígena, que também se pode observar nos estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Goiás. Na região sul, por sua vez há visível predominância do indivíduo branco, pois como já foi citado anteriormente sobre sob a heterogeneidade étnica, pode-se pode se constatar que enquanto nos estados do norte e nordeste a contribuição por portugueses predominou de forma quase absoluta, nos do sul as diferentes correntes imigratórias condicionaram maior variabilidade étnica. Assim, as prevalências das hemoglobinopatias e talassemias estão intimamente relacionadas com as etnias que compõe a nossa população. Nesse contexto se insere o estudo que realizamos sobre a prevalência do gene ßS na população brasileira. O estudo efetuado por meio meio de análises de 101 mil amostras de sangue provenientes de 65 cidades de dezesseis estados do Brasil (tabelas 8.2.1 e 8.2.2) revelaram que a prevalência do portador do traço falcêmico na população brasileira em geral é de 2,1%, entre pessoas de cor branca branca é de 1.18%, e entre pessoas de cor negra é de 4.87%, com ampla variação regional (figura 8.2.1). É notável a diminuição da prevalência de Hb AS na população total na direção norte-sul norte do Brasil (tabela 8.2.2), enquanto que a prevalência entre as pessoas de cor negra se mantém num nível quase homogêneo entre 4,03% e 5,54%. As prevalências de Hb AS por faixas etárias nas populações gerais (brancos e negros) das diferentes regiões do Brasil podem ser avaliadas na tabela 8.2.3. Os valores obtidos e analisados estatisticamente, mostram que não há alterações significantes entre as faixas etárias analisadas. Tabela 8.2.1. Distribuição porcentual da Hb AS em 101 mil amostras de sangue provenientes de quinze estados brasileiros e Distrito Estados

Brancos

Negros

Total

Alagoas

1,67

6,93

4,83

Bahia

3,68

6,21

5,48

Ceará

1,38

4,78

2,80

Distrito Federal

1,83

3,70

2,92

Goiás (*)

1,91

5,26

3,61

Maranhão

2,48

3,51

3,06

Grosso 1,89

3,85

3,05

6,14

3,72

Mato (*)

Minas Gerais

2,44

256

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Pará

2,80

5,02

4,40

Paraíba

1,19

3,29

2,19

Paraná

1,18

4,19

1,82

Pernambuco

0,88

1,80

1,33

Piauí

3,63

5,10

4,77

Rio de Janeiro

2,08

5,27

3,12

Rio Grande do 1,04 Norte

5,11

3,43

São Paulo

0,96

4,92

1,54

Total (média)

1,18

4,87

2,10

(*) Na época das análises não havia a subdivisão dos estados de Goiás e Mato Grosso em Tocantins e Mato Grosso do Sul, respectivamente. Tabela 8.2.2. Distribuição porcentual da Hb AS em 101 mil amostras de sangue provenientes das regiões norte, nordeste, centro-oeste, centro sudeste e leste. Região

Caucasóide

Negróide

Total

Norte

2,80

5,14

4,49

Nordeste

2,18

5,13

4,05

Centro-Oeste Oeste

1,85

4,03

3,11

Sudeste

1,12

5,54

1,87

Sul

1,18

4,53

1,87

Tabela 8.2.3. Distribuição percentual dos portadores de Hb AS por faixa etária na população geral analisada, obtida de 101 mil amostras de sangue, por região do Brasil. Região

Norte

Faixa Etária

% de Hb AS

00-10

5,93

11-20

5,45

21-30

3,56

31-40

5,33

41-50

3,36

51 ou +

00-10

6,13

Nordeste 257

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP

Centro-Oeste Oeste

Sudeste

Sul

11-20

5,25

21-30

3,92

31-40

5,00

41-50

2,81

51 ou +

2,21

00-10

5,08

11-20

3,26

21-30

3,04

31-40

3,27

41-50

2,78

51 ou +

2,04

00-10

2,12

11-20

1,66

21-30

2,03

31-40

2,35

41-50

2,18

51 ou +

1,34

00-10

2,71

11-20

1,88

21-30

1,54

31-40

1,65

41-50

1,47

51 ou +

1,88

258

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Figura 8.2.1 - Distribuição da frequência do gene beta S obtida durante a determinação da prevalência de Hb AS na análise de 101 mil pessoas de todas as regiões do Brasil.

Relação entre Sobrenomes e Hb S no Brasil

Na avaliação referente ao mapeamento da prevalência do gene ßS nas diferentes regiões do Brasil, analisamos 56.611 sobrenomes que foram agrupados pela suas semelhanças, resultando 297 sobrenomes no total. O estudo das raízes dos sobrenomes da população estudada indicaram que 69,3% são de origem ibérica, 11,7% religiosa, 10,4% itálica e 8,4% de outras origens. A relação entre os sobrenomes mais freqüentes e pertencentes a pessoas com gene ßS nas cinco regiões do Brasil (norte, nordeste, centro-oeste, centro oeste, sudeste e sul) mostraram que há determinados sobrenomes mais prevalentes em portadores de Hb S, conforme mostra a tabela 8.3.1. 8

259

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Tabela 8.3.1. Relação dos sobrenomes de portadores do gene ßS, com maior freqüência nas cinco regiões do Brasil. Sobrenome

Freqüência %

Regiões mais freqüentes

Anjos

7,8

ND, CO,SD

Galvão

7,4

ND, SD, S

Passos

6,1

N, ND, CO

Cruz

5,4

ND, CO, SD, S

Braga

5,4

N, ND, CO, SD, S

Bonfim

4,3

ND, SD, S

Gouveia

4,2

N, SD, S

Reis

4,0

N, ND, CO, SD, S

ND: Nordeste; CO: Centro-Oeste; Oeste; SD: Sudeste; N: Norte; S: Sul

Interferentes Eritrocitários e ambientais na Anemia Falciforme

Entre os vários genótipos falciformes identificados na população brasileira, a anemia falciforme falciform é o mais grave e também o que necessita de cuidados médicos com maior freqüência. A anemia falciforme tem um desenvolvimento clínico extremamente variável que se caracteriza principalmente por diferentes graus de intensidade da anemia hemolítica. As razões razõ dessa variabilidade são parcialmente conhecidas na expressão fenotípica da doença. Apesar de ter um mesmo defeito genético, a anemia falciforme pode estar associada com níveis diferentes de Hb Fetal e interações com talassemia alfa que atuam como modeladores modeladores genéticos da doença. Entretanto, outros defeitos genéticos dos eritrócitos com destaques para a deficiência de G-6PD, G a esferocitose e as deficiências de enzimas antioxidantes (SOD, GPx e catalase) certamente interferem no curso clínico da doença. Os diferentes haplótipos da Hb S denominados por Banto, Benin, Senegal, Camarões e Asiático, tem sido apontados também como possíveis causas da heterogeneidade fenotípica da anemia falciforme. Toda essa diversidade que caracteriza a anemia falciforme está, em em parte, relacionada à sua origem multicêntrica e que envolvem populações com diferentes anormalidades genética de proteínas e enzimas eritrocitárias (consultar os ítens 2.2 e 7.1 a 7.6). ). Por outro lado, além desses fatores caracterizados como interferentes eritrocitários, há os interferentes do meio ambiente em que está inserido o doente com anemia falciforme. Entre os interferentes interferentes ambientais destacam-se destacam as situações sociais, econômicas e culturais do doente, e que tem influência no curso de sua doença.

260

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Controle e Prevenção das Doenças Falciformes

A Organização Mundial da Saúde em sua publicação de 1985 estimou que anualmente nascem no Brasil cerca de 2.850 crianças com doenças falciformes, das quais 1.800 com a anemia falciforme, 700 com a dupla heterozigose SC (Hb SC), e 350 com com a interação Hb S/tal. ß. Nossos estudos estimam em aproximadamente 10 mil pessoas com doenças falciformes no Brasil. Diante dessas duas avaliações conclui-se conclui se que a maioria dos doentes falcêmicos não vivem além dos 4 anos de idade. Assim, o problema das doenças falciformes é muito mais grave do que se pensa, principalmente a vários fatores que incluem: a) o desconhecimento da doença, da clínica e da conduta, por grande maioria dos médicos; b) deficiências no sistema médico, de atendimento de urgências, e assistência social; c) desinformação do profissional de apoio médico: laboratoristas, enfermagem, psicólogos, etc. ; d) condições sócio-econômica sócio econômica-cultural dos doentes e familiares; e) impotência e/ou desinteresse dos governos (municipal, estadual e federal). ). Com relação ao governo federal o Ministério da Saúde constituiu em 1992 o Comitê de Hemoglobinopatias ligado à Coordenadoria do Sangue e de Hemoderivados (COSAH), que iniciou um trabalho elogiável ao longo de 7 anos e, inexplicavelmente, o comitê foi desfeito. de A despeito da falta da organização governamental há esforços mediados por competentes profissionais, em diferentes regiões do Brasil, que preocupados com o descaso, sensibilizaram setores governamentais regionais e conseguiram realizar testes de triagens triagens neonatal. Esses centros obtiveram excelentes resultados, como são os casos do NUPAD de Belo Horizonte, ligado à Universidade Federal de Minas Gerais, do Serviço de Hematologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Universidade Federal do Rio Grande Grande do Sul), e do Centro Infantil de Investigações Hematológicas Dr. Boldrini, de Campinas (UNICAMP). Além desses serviços, com grande expressão de resultados, vários outros estão sendo implantados, muitos dos quais pertencentes a universidades, hospitais e hemocentros. Durante trinta anos de atividades em hemoglobinopatias, tivemos a oportunidade de realizar programas preventivos não só de doenças falciformes, mas também de talassemias e outras hemoglobinopatias. Trabalhamos com recém-nascidos, recém primeira infância, ância, escolares de 2º grau e universitários, operários, gestantes e pacientes ambulatoriais. Os melhores resultados foram obtidos nos programas realizados com os escolares, pois o interesse em conhecer os problemas relacionados à doença começou a fazer parte parte da divulgação da disciplina de biologia. Penso, portanto, que este é o caminho ideal, pois está intimamente relacionado à educação. Testes Laboratoriais Específicos para Hb S

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Eletroforese Alcalina Eletroforese Ácida Dosagem de Hb Fetal Pesquisa de Talassemia Alfa Pesquisa de Corpos de Heinz Teste de Falcização Teste de Solubilidade Dosagem de Metahemoglobina Interpretação de Resultados

Os testes acima podem ser acionados no capítulo "Técnicas "Técnicas laboratoriais aplicadas aos eritrócitos".

261

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RADICAIS LIVRES Radicais Livres Introdução O organismo humano apresenta uma variedade de funções das quais participam diferentes órgãos e sistemas. As principais atividades orgânicas conhecidas por alimentação, metabolismo, respiração, excreção, circulação, movimentos, estrutura física, capacidade reativa, sensibilidade, coordenação, crescimento e reprodução, dependem da ação integrada das células que compões os diversos versos sistemas orgânicos. Uma pessoa tem cerca de 1 trilhão de células, das quais 20 a 25 bilhões estão na circulação sanguínea e representadas pelos glóbulos vermelhos ou eritrócitos, glóbulos brancos ou leucócitos, e trombócitos ou plaquetas. Nas células, células, o gradativo desgaste metabólico resulta na degradação de proteínas, gorduras e carboidratos, cujos sub-produtos sub produtos são compostos respectivamente por aminoácidos, ácidos graxos e monossacarídeos. Esses elementos, juntamente com enzimas e sais minerais participam participam de constantes trocas entre as células. Diante desse processo fisiológico, cada célula pode determinar suas próprias atividades bioquímicas, procurando sempre estabelecer um equilíbrio dinâmico, que na realidade depende também de influências internas e externas. Entre os fatores de equilíbrio bioquímico e fisiológico das células destacam-se se aqueles que promovem a manutenção das moléculas de proteínas e enzimas no estado reduzido.

Os Componentes Celulares A unidade celular é um complexo biológico de produção produção e degradação de substâncias, onde se destaca a síntese de proteínas e enzimas. Essa "usina" biológica necessita de estímulos externos e internos para efetuar seu trabalho, incluindo a manutenção da integridade de suas estruturas. Resultante dos processos cessos de transformação decorre a liberação de energia, íons e subprodutos, que são ativadores contínuos de reações celulares, especialmente as que promovem as oxioxi reduções. Entre os componentes celulares destacam-se: destacam se: núcleo, membranas nuclear e citoplasmática, tica, e organelas (mitocôndrias, retículos endoplasmáticos liso e rugoso, lisossomos, complexo de Golgi, centríolos e ribossomos). A maioria desses componentes celulares estão constantemente sob ação de produtos oxidantes, e para se manterem no estado reduzido redu produzem enzimas anti-oxidantes oxidantes que participam intensamente no equilíbrio das moléculas – são os processos ortomoleculares.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Elementos Químicos Importantes das Células Entre os 100 elementos químicos encontrados nas células, 65% é composto pelo oxigênio, 18% por carbono, 9% por hidrogênio e 3% por nitrogênio; os 5% restantes são completados por outros 95 elementos. O predomínio do oxigênio se torna fonte inesgotável de processos oxidativos que ocorrem na célula. Por outro lado, o carbono e hidrogênio hidrogênio que compõe significativamente a estrutura da membrana celular são suscetíveis às reações oxidativas provocadas pelo oxigênio. Diante desse breve resumo, conclui-se conclui se que a célula ao realizar seu trabalho biológico de produção e degradação, bem como de manutenção, manutenção, transporte e trocas de substâncias, se apresenta altamente sensível às oxidações celulares. Dessas oxidações resultam produtos instáveis quimicamente e que são conhecidos por radicais livres.. Para evitar a geração excessiva de radicais livres a célula se contrapõe aos processos oxidativos por meio de reações conhecidas por redução,, com a participação das enzimas anti-oxidantes.

O Radical Livre Radical livre é definido como ion, átomo, ou molécula com um elétron desemparelhado. Quando o radical livre envolve o oxigênio em sua estrutura, passa a ser denominado por espécie ativada de oxigênio. O radical livre tende a procurar o seu equilíbrio e, por isso, toma elétron de outra estrutura estabilizada, desestabilizando-a desestabilizando a e causando reações em cadeia. Por outro lado, quando um radical livre se encontra com outro radical livre ambos podem se completar e criar uma molécula, um ion ou um átomo estabilizado. Por essa razão a vida de um radical livre é extremamente curta, da ordem de 10-4 segundos, fato que torna impossível a sua avaliação. Entretanto, os efeitos deletérios causados pelos radicais livres podem ser avaliados e quantificados e, por essa razão, tornam-se tornam se indicadores biológicos do grau de geração de radicais livres.

O Oxigênio como Fonte de Radical Livre Como foi apresentado anteriormente, o oxigênio é o elemento químico mais abundante na natureza e nas células dos organismos vivos, especialmente nas dos animais. O oxigênio tem oito elétrons que se equilibram com os oito neutrons ou prótons do seu núcleo atômico. Entretanto, a disposição dos elétrons em sua órbita atômica está localizada em duas camadas: uma interna com dois elétrons e outra externa com seis elétrons (figura (figura 1). 1 Este átomo de oxigênio está constantemente à procura de outro átomo átomo de oxigênio para formar o oxigênio molecular, O2. O oxigênio molecular é um bi-radical bi radical estável, pois a disposição de dois dos seus elétrons da camada orbital externa permite que possam reagir com elétrons disponíveis nas células. Dessa forma, o oxigênio oxigênio molecular se torna um radical livre quando reage com um elétron, fato que desestabiliza-lo desestabiliza tornando-o o íon superóxido (O· 2), conforme mostra a figura 1.

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Figura 1. Equilíbrio atômico do oxigênio, a molécula de oxigênio como bi-radical bi radical estável (O2) e a formação do íon superóxido (O2· ).

Fontes de Elétrons na Célula A principal fonte de elétrons é proveniente do catabolismo celular de proteínas, lipídeos e carboidratos. Os produtos básicos da degradação desses elementos resultam em aminoácidos, ácidos graxos e glicose. A glicose sofre o processo de degradação (glicólise) e libera elétrons que atuam na transformação de aminoácidos e ácidos graxos em acetil coenzima-A. coenzima A. A glicose também se transforma em acetil-coenzima coenzima-A após ter-se derivado em Piruvato. A acetil--coenzima-A sofre oxidações transformando-se se em citrato e oxaloacetato com liberação de CO2 e elétrons. Esse processo de oxidação do acetil-Co-A acetil A é também conhecido como ciclo do ácido cítrico. Os elétrons resultantes do processo anterior participam dacadeia cadeia de transporte de elétrons e da cadeia de transferência de elétrons, elétrons, também conhecida como respiração celular. Nesse processo ocorre a produção de energia celular, com a transformação de ADP em ATP, bem como na liberação de água (2H+ + ½ O2 → H2O) (figura 2).

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Figura 2. Geração de elétrons por catabolismo de proteínas, lipídeos e carboidratos.

Fontes de Hidrogênio na Célula A cadeia de transporte de elétrons ocorre nos espaços intermembranas das mitocôndrias, com constantes transformações de NADH em NAD+ e liberação de H+, que também é utilizado na respiração celular e na produção de energia e H2O (figura 3).

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Figura 3. Produção de energia e H+ nos espaços intermembranas da mitocôndria.

Ativação do Oxigênio em Presença de Elétrons e Hidrogênio Quando ocorre presença excessiva de oxigênio molecular, ou diminuição da utilização de elétrons e íons hidrogênio durante a oxidação da acetil-Co-A acetil A e da transferência de elétrons, respectivamente, inicia-se se o processo de ativação do oxigênio:

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Defesa Antioxidante Promovida pela Célula A geração dos radicais livres é contínua no interior da célula, entretanto o seu bloqueio por enzimas e componentes anti-oxidantes anti oxidantes também é constante. Esse processo é específico conforme a estrutura celular: nas mitocôndrias mitocôndr ocorre a geração de H2O2 que é neutralizada pelas enzimas SOD e GPx; no citoplasma a geração de O°2 e HO° recebe a ação antioxidade de SOD, GPx e vitamina C; no peroxissomo a H2O2 é neutralizada pela catalase; no reticuloendoplasma a geração de O°2 sofre re a ação da SOD e GPx; na membrana citoplasmática os radicais ROO (peroxil), RO (alcoxil), e ROOH (hidroperóxido) são controlados pela vit. E, beta-caroteno caroteno e colesterol (tabela 1). A elevação dos radicais livres no interior das células surge quando há diminuição diminuição do estado reduzido, fato que promove gradualmente a oxidação dos produtos orgânicos, afetando as atividades das enzimas. Os radicais livres interferem em reações bioquímicas, produzindo danos efetivos nas estruturas biológicas, notadamente nos ácidos ácidos nucleicos e membranas celulares, resultando na formação de tumores e morte celular precoce, respectivamente. Tabela 1. Geração de radicais livres e de antioxidantes por estruturas celulares. SOD (superóxido dismutase), GPx (glutatião peroxidase). Estrutura

Radicais Livres

Antioxidantes

Mitocôndrias

H2O2

SOD GPx

Citoplasma

O.2

SOD

HO.

GPx Vit. C

Peroxissomo

H2O2

Reticuloendoplasma O.2

catalase SOD GPx

Núcleo

GPx

Membrana

ROO (peroxil)

Vit. E

RO (alcoxil)

Betacaroteno

ROOH (hidroperóxido)

Colesterol

267

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Lesões Causadas por Radicais Livres A ação dos radicais livres produzem quatro tipos de lesões celulares por ataque aos lipídeos insaturados, ácidos nucleicos, proteínas e enzimas e polissacarídeos. Essas lesões desencadeiam várias formas de alterações celulares, conforme mostra o esquema abaixo:

Algumas Fontes de Origem de Radicais Livres Entre os vários processos biológicos capazes de produzirem radicais livres, destacam-se: destacam 1 – CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL: cerca de 2 a 5% do oxigênio molecular se transforma em íon superóxido (O2 + e- → O· 2), iniciando a cadeia de formação de radicais livres. 2 – FAGOCITOSE: Quando ativos, os neutrófilos consomem grandes quantidades de oxigênio e formam radicais livres (O· 2, H2O2, HO· , O21, ClO· ) para metabolizar o material fagocitado. Esses radicais podem ser transferidos para outras células e causarem lesões em suas estruturas. 3 – REAÇÃO NA ISQUEMIA-REPERFUSÃO: ISQUEMIA No infarto do miocárdio há um aumento de xantina oxidase, que em contato com o oxigênio proveniente da reperfusão produz grande quantidade de ions superóxidos, desencadeando a formação de outros radicais livres. 4 – REAÇÕES DE DESINTOXICAÇÕES: Através das oxidases do citocromo P-450 450 (fumo, álcool, químicos, etc.). 5 – SÍNTESE DAS PROSTAGLANDINAS: PR O metabolismo do ácido aracdônico libera radicais hidroxila (HO· ).

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP 6 – REAÇÕES IONIZANTES: Por radiólise da água. 7 – FOTÓLISE: Luz UV e luz visível. 8–TERMÓLISE: TERMÓLISE: Temperaturas baixas ou elevadas que alteram o metabolismo celular. 9 – QUÍMICOS: QUÍMIC Reações de óxido-redução redução na presença de ferro: HOOH + Fe++ → HO· + H+O- + Fe+++

Principais Grupos de Radicais Livres Os principais grupos de radicais livres podem ser classificados conforme suas estruturas químicas que determinam a formação de: a. b. c. d.

Oxi-radicais radicais (O2· , RO· , HO2· , HO· , ROO· ) Peróxidos (H2O2, ROOH, ROOR) Espécies excitadas (O21, R2C= O3) Outros (NO· , ClO· , O3, SH)

A tabela 2 identifica os diferentes grupos de radicais livres classificados conforme suas estruturas químicas. Tabela 2. Grupos de radicais livres classificados conforme suas estruturas químicas.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Lesões dos Radicais Livres na Membrana As membranas atuam como delimitadoras do conteúdo celular, em reações químicas, na conservação de energia, na comunicação inter-celular, inter na seletividade iônica e na promoção e catálise de vários eventos moleculares. Sua massa é constituída quase exclusivamente por proteínas, lipídeos e pequena quantidade de carboidratos (glicoproteinas, glicolipídeos). Estruturalmente é, portanto, composta por ampla camada lipoproteica. Desse conjunto, destacadestaca se a composição do folheto bi-molecular bi molecular formado por dupla camada de fosfolipídeos (ácidos graxo e fosfato). Essa dupla camada tem áreas hidrofóbicas onde se situam apenas os ácidos graxos, e áreas hidrofilicas ofilicas nas regiões polares em que se localizam os fosfatos. Assim as áreas hidrolificas estão em contato com os meios interno e externo da célula. Quimicamente há dois tipos de ácidos graxos que compõe a membrana: os saturados e os insaturados. Os ácidos graxos saturados se caracterizam por terem ligações simples entre seus carbonos e pela resistência à oxidação. Os ácidos graxos insaturados tem duplas ligações entre seus carbonos e são sensíveis à oxidação. Um outro elemento químico importante na estrutura estrutu da membrana celular é o colesterol. O colesterol é o mais importante esterol, contendo uma cadeia alquila lateral (formada por carbonos e hidrogênios), núcleos esteróides, e a "cabeça polar" OH. Por ser uma substância anfótera (reage com ácido e base) tem tem grande facilidade em penetrar na área hidrofóbica e se ligar ao fosfolipideo, formando uma barreira que impede a ação dos radicais livres contra a região carbonada dos ácidos graxos. As figuras 3, 4 e 5 figuras mostram a composição química da membrana celular celular e sua suscetibilidade ao ataque de radicais livres.

Figura 4. Representação esquemática da estrutura da membrana celular e suas áreas hidrofóbica e hidrofílica, da química dos ácidos graxos, e da defesa da membrana contra os radicais livres.

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Figura 5. Ação do radical íon superóxido (O2· ) contra a região carbonada de ácido graxo insaturado.

Ação dos Radicais Livres na Membrana A área hidrofóbica da membrana é suscetível aos ataques dos radicais livres e, além disso, os ácidos graxos insaturados são espontaneamente oxidados em presença do oxigênio. Quando o nível de colesterol no interior da membrana está diminuindo, ou quando há presença de ferro ou cobre, ocorre a oxidação dos fosfolipídeos, desencadeando a formação do radical alquil lipidico, oxigênio centrado, radical peroxil e hidroperoxil:

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Os radicais livres provenientes da oxidação da membrana (radicais intermediários) reagem com o ferro (quando presente) e formam produtos finais estabilizados: o malonaldeido e o 44 hidroxinonenal:

As principais conseqüências da lipoperoxidação da membrana são as seguintes: • • • • •

alteração da permeabilidade alteração do transporte de substâncias orgânicas e inorgânicas alteração da bomba de Na+, K+, Ca++ e ATPase danos ao DNA morte celular precoce

Oxidação das Metalo-Proteínas Proteínas Entre as metalo-proteínas proteínas a hemoglobina é a mais complexa, e é a que representa maior interesse científico. A sua oxidação implica em vários processos de transformações químicas com destaque para a formação de subprodutos de degradação: degradação: metahemoglobina, hemicromos 1 e 2, e corpos de Heinz (fig. 6). Durante essas transformações há a geração de radicais O2, HO e H2O2 que atacam e deformam a membrana eritrocitária.

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Figura 6. Oxidação da hemoglobina, resultando em produtos de degradação (metahemoglobina, hemicromos e corpos de Heinz e geração de radicais livres (O2· , H2O2, HO e Fe+++).

Nas células precursoras dos eritrócitos (eritroblastos) a geração de radicais livres provoca danos ao DNA. O processo oxidativo da hemoglobina é dependente de três situações distintas, mas que podem estar presente conjuntamente: a. Deficiência de enzimas eritrocitárias: meta-Hb meta Hb redutase, SOD, GPx e catalase; b. Aumento do potencial oxidativo exógeno: poluentes (NOx, SOx), drogas oxidantes (sulfas), alimentos imentos com alto teor de nitritos; c. Defeito do grupo heme por mutação dos aminoácidos que o protegem, permitindo a contínua oxidação do ferro.

273

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Por outro lado, o fato dos eritrócitos representarem uma população celular significativa, com circulação constante por todo o organismo, é aceitável que as células afetadas por radicais livres, ou espécies ativadas de oxigênio, promovam a "introdução" desses elementos oxidantes para o interior dos eritrócitos. Qualquer uma das causas apresentadas desencadeiam a oxidação oxidação da hemoglobina, ao mesmo tempo em que são liberadas as espécies ativadas de oxigênio (O· 2, HO· , H2O2). A liberação de radicais de oxigênio exige rápida ação de enzimas antioxidantes (SOD, GPx e catalase), cujas dosagens se mostram elevadas quando estas estas não estão deficientes. Assim, na deficiência dessas enzimas antioxidantes, ou nas situações em que os produtos oxidantes se tornam excessivos no interior dos eritrócitos, a hemoglobina se oxida constantemente e sofre degradação. Sob a análise microscópicaa é possível visualizar os corpos de Heinz, que são produtos da degradação oxidativa da molécula de hemoglobina (fig. 7).

Figura 7. Corpos de Heinz agregados junto às membranas de eritrócitos, após a incubação com azul de crezil-brilhante a 1%.

Os corpos de Heinz estão geralmente impregnados junto à membrana eritrocitária, e a própria membrana sob ação do estresse oxidativo proveniente da reação do radical O2- com Fe+++ provoca rigidez e alteração da estrutura da membrana, com modificações da proteína proteí banda 3 (fig. 8).

Figura 8. Microscopia eletrônica de eritrócito em que os corpos de Heinz agregados à membrana eritrocitária foram removidos por fagocitose de macrófago, causando lesão à membrana do eritrócito.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Esse processo induz o reconhecimento imunológico que resultará na fagocitose dos corpos de Heinz pelos macrófagos durante a circulação no baço. Ao retirar os corpos de Heinz dos eritrócitos, estas células apresentam-se apresentam se como se tivessem sido mordidas, podendo ser identificadas em esfregaços de sangue periférico. Quando a extensão desse processo é abrangente, pode ocorrer hemólise e, consequentemente, a anemia. Dessa forma, conclui-se conclui que os eritrócitos podem ser sensíveis indicadores de estresses oxidativos que causam a geração de radicais livres.

Ação de Radicais Livres nas Células Falciformes

A geração de radicais livres em eritrócitos com Hb S está na dependência do processo de polimerização das moléculas desoxigenadas de Hb S. A instabilidade da Hb S causada pelo aumento da deoxi-HbS, juntamente tamente com as alterações da bomba de sódio, potássio e cálcio, desencadeia a formação de hemicromos e estresse oxidativo. Sob estresse oxidativo, as membranas eritrocitárias sofrem lesões causadas pela peroxidação lipídica (fig. 9), modificação da assimetria ria dos fosfolipídeos e das proteínas espectrina e actina. Assim, a célula falciforme se torna irreversível, fato que eleva ainda mais a liberação de produtos endógenos de peroxidação lipídica. Associam-se se a este fato as falhas dos mecanismos anti-oxidativos anti os devido à redução principalmente de GPx e catalase. Dessa forma, a célula falciforme irreversível se torna mais aderente ao endotélio e às conseqüências fisiopatológicas da facização: estase sangüínea, infarto tecidual, crises dolorosas e lesões crônicas dos órgãos.

Figura 9. O desencadeamento da geração de radicais livres é iniciado após o processo de polimerização da desoxi-HbS, HbS, causando lesões nas células falciformes e consequências patológicas.

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Ação Protetiva Contra a Geração de Radicais Livres A ação antioxidante se faz por meio de quatro mecanismos: 1. 2. 3. 4.

Controle enzimático Controle hidrofóbico Protetores hidrofílicos Protetores estruturais

O controle enzimático é realizado por três enzimas: SOD, catalase e GPx. A SOD atua no sentido de catalizar a transformação de O2· em H2O2, para isso acelera a introdução de 2H+ na molécula do ion superóxido: O2· + 2H+ + e- ® H2O2. A catalase e o GPx atuam no sentido de transformar a H2O2 em H2O, incluindo um processo intermediário com liberação do radical HO· e a adição de íon H+ e eletrons para resultar em H2O. O controle hidrofóbico é especifico para evitar a peroxidação da membrana celular. Este processo tem início quando o "excesso" de oxigênio molecular ataca os ácidos graxos insaturados, transformando-os os em radical r alquil lipídico pela retirada de H:

O controle hidrofóbico é efetuado por alfa-tocoferol alfa tocoferol e beta caroteno, que atuam na remoção de O2. Os protetores hidrofílicos são os antioxidantes caracterizados pelo ácido ascórbico, cisteína e glutatião reduzido. o. Esses antioxidantes atuam contra os produtos intermediários de radicais livres com características: H2O2, HO· , ROO e ROOR que se solubilizam na água celular. Os protetores estruturais são formados por moléculas de colesterol que penetram na área hidrofóbica da membrana plasmática e se envolve com os fosfolipídeos da região hidrofílica, formando uma barreira entre o radical livre e a cadeia carbonada do ácido graxo.

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Avaliação Laboratorial dos Produtos Resultantes da Degradação Oxidativa da Hemoglobina oglobina As atividades fisiológicas dos eritrócitos requerem processos contínuos de preservação da membrana celular e da manutenção do estado reduzido da hemoglobina. Naturalmente com o envelhecimento dessas células ocorrem desgastes de atividades funcionais funcionais das bombas de sódio, potássio e ATPase, bem como de enzimas eritrocitárias, especialmente as antianti-oxidantes. Assim, o eritrócito ao envelhecer desencadeia processos oxidativos da hemoglobina produzindo metahemoglobina e corpos de Heinz, fato que permite permite avaliar valores normais para metahemoglobinas até 2% do total da hemoglobina circulante. Da mesma forma, a presença de corpos de Heinz em eritrócitos pode ser identificado na proporção de 1 eritrócito com corpos de Heinz para cada 500 a 1000 eritrócitos normais. Quando ocorre oxidação excessiva da hemoglobina, motivada por processos exógenos (ex: medicamentos oxidantes, poluentes oxidantes, etc.) ou por deficiência hereditária de enzimas anti-oxidantes anti oxidantes (SOD, GPx, catalase, G6PD deficiente, e metaHb--redutase), se), ou por alteração estrutural da Hb (ex: Hb M e Hb instáveis), os valores de metahemoglobina e corpos de Heinz situam-se situam se acima da normalidade. A busca da causa do processo oxidativo poderá ser solucionada quando o paciente estiver fazendo uso de medicamentos entos oxidativos, ser portador de Hb M, de Hb instáveis, de deficiência de G6PD, ou de deficiência de meta Hb redutase. Particularmente a deficiência de G6PD tem elevada prevalência em nossa população, e dessa forma os portadores apresentam níveis elevados de metahemoglobina e corpos de Heinz, além da suscetibilidade a produtos oxidantes. Quando se afastam as causas adquiridas (drogas e poluentes oxidantes) e hereditárias (Hb M, Hb Instáveis, anemia falciforme, Hb S/Beta talassemia e talassemia beta maior) é necessário pesquisar as deficiências de enzimas anti-oxidantes, anti oxidantes, em especial a metaemoglobina redutase, superóxido dismutase, catalase e glutatião peroxidase. É importante destacar que os eritócitos falcêmicos, notadamente aqueles da anemia falciforme, apresentam resentam níveis elevados de metaemoglobina e corpos de Heinz. Quando os doentes falcêmicos padecem também de deficiências de enzimas anti-oxidantes anti oxidantes é comum que as conseqüências lesivas aos eritrócitos sejam mais intensas. Da mesma forma ocorre na talassemia talassemi beta, pois o desequilíbrio entre as globinas alfa e beta – devido ao bloqueio total (b0 talassemia maior) ou parcial (b+ talassemia maior) do gene da globina beta, induz o desequilíbrio e a precipitação da globina alfa livre". As globinas alfa "livres" precipitadas precipitadas se oxidam facilmente e induzem a lipoperoxidação das camadas lipoproteicas das membranas eritrocitárias, com formação de corpos de Heinz, e a conseqüente remoção desses corpúsculos pelos macrófagos do sistema retículo endotelial (SRE). A remoção remoção dos corpos de Heinz deformam os eritrócitos, encurtam a vida da célula e causa anemia. (Figura ( 10).

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Figura 10. Geração de radicais livres por meio de autoxidação da globina alfa despareada na talassemia beta. Os radicais livres, em especial Fe+++ e O2· causam lesões oxidativas na membrana do eritrócito beta talassêmico.

Diante do que foi apresentado, a avaliação dos produtos de degradação da hemoglobina (dosagem de metaemoglobina e pesquisa de corpos de Heinz) se torna importante para o conhecimento doss processos oxidativos que ocorrem notadamente na anemia falciforme e talassemia beta maior. O controle periódico dessa avaliação, associado com outras análises laboratoriais necessárias, certamente poderá permitir aos médicos desses pacientes o entendimento to mais eficiente da evolução clínica de ambas patologias.

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POLICETEMIA LICETEMIA E ERITROCITOSE Policetemia e Eritrocitose Introdução Os termos policitemia e eritrocitose são usados clinicamente para descreverem uma anormalidade caracterizada pela quantidade excessiva de eritrócitos, aumento do volume eritrocitário (hematócrito) e elevação da concentração da hemoglobina. Entretanto, há necessidade de diferenciar laboratorialmente a policitemia da eritrocitose. A policitemia laboratorialmente indica a elevação completa da massa eritrocitária, ou seja, da contagem de eritrócitos, hematócrito e hemoglobina. Assim, considera-se considera se a policitemia quando a concentração de hemoglobina é superior a 17,5 g/dl no homem e 16,0 g/dl na mulher. Associados à elevação da hemoglobina, hemoglobina, a contagem de eritrócitos supera 6,5 x 106 mm3 no 6 3 homem e 5,5 x 10 mm na mulher, bem como o hematócrito > 60% no homem e 50% na mulher. A eritrocitose é uma situação especial, cuja terminologia é específica, ou seja, ocorre a elevação do número de eritrócitos sem que seja acompanhada pelo hematócrito e hemoglobina. A eritrocitose é comum em certos casos de talassemia beta menor, conforme o exemplo abaixo: Eritrócitos: 6,2 x 106 mm3 Hemoglobina: 14 g/dl Hematócrito: 45%

Pelos resultados observa-se discrepâncias entre a contagem de eritrócitos e os valores de hemoglobina e hematócrito. No presente caso, os cálculos de VCM e HCM resultaram em: 72 fL e 22 pg ou seja, muito diminuídos, fato que se justificaria pela presença de microcitose e hipocromia, tal como ocorre na talassemia beta menor (ver capítulos "Principais "Principais Alterações Morfológicas dos Eritrócitos"" e "Alterações " Eritrocitárias nas Talassemias"). Com relação exclusivamente à policitemia, é possível classificá-la classificá la em Policitemia vera ou verdadeira e Policitemia secundária.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Policitemia Vera ou Verdadeira É uma doença mieloproliferativa, caracterizada pela proliferação clonal de um ou mais componentes hematopoiéticos na medula óssea. Devido a esse fato, pacientes com a doença policitemia vera apresentam resentam elevações dos componentes da série vermelha, série branca e plaquetas. A policitemia vera ocorre igualmente entre homens e mulheres, resultando em hiperviscosidade, hipervolemia e hipermetabolismo, situações que podem causar os sintomas típicos da doença: dores de cabeça, pruridos, dispnéia, aparência pletórica ou rubra, esplenomegalia em 2/3 dos doentes, hemorragias (gastrointestinal, uterina, cerebral), tromboses arteriais ou venosas, hipertensão e gota. As principais alterações laboratoriais são: • • • • • • •

Elevação de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito Leucocitose com neutrofilia absoluta em 50% dos casos Trombocitemia ou elevação de plaquetas em 50% dos casos Fosfatase alcalina dos neutrófilos acima do normal Elevação da vit. B12 sérica e da sua capacidade de ligação Viscosidade sangüínea elevada Medula óssea hipercelular com megacariócitos proeminentes

O curso e prognóstico dos doentes com policitemia vera inclui com certa freqüência a trombose, hemorragia e acidentes vasculares como causas constantes constantes de morte. O aumento da viscosidade, estase vascular e níveis elevados de plaquetas podem contribuir para a trombose. Por outro lado, a destruição vascular, infarto de pequenos vasos e defeitos funcionais de plaquetas causam as hemorragias. A sobrevidaa média de 10-16 10 16 anos após o início da doença pode sofrer interferências na sua evolução, uma vez que 10% dos casos de policitemia vera se transformam em leucemia mielóide aguda e 30% em mielofibrose.

Policitemia Secundária A policitemia secundária ocorre quando a massa eritrocitária está elevada uniformemente, quase sempre com valores de leucócitos e plaquetas normais. As causas da policitemia secundária podem ser agrupadas em: aumento compensatório da eritropoietina, elevação anormal da eritropoietina e situações relativas. Essas causas são listadas a seguir. Aumento Compensatório da Eritropoietina • • • • •

Altitudes elevadas (> 3.000 metros) Doenças cardiovasculares, especialmente com cianose Doenças pulmonares e hipoventilação alveolar Hemoglobinas anormais com afinidade elevada ao O2 Fumantes crônicos

Elevação Anormal da Eritropoietina • •

Doenças renais (hidronefrose, desequilíbrio vascular, cistos e câncer) Fibromioma maciço no útero 280

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP • •

Carcinoma hepatocelular Hemangioblastoma cerebelar

Situações Relativas • • • •

Estresse e pseudo-policitemia policitemia Fumantes Desidratação Perda plasmática: queimaduras, enteropatias

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TÉCNICAS LABORATORIAIS APLICADAS AOS ESTUDOS DOS ETRITRÓCITOS Técnicas Laboratoriais Aplicadas aos Estudos dos Eritrócitos Coloração de May-Grunwald Grunwald-Giemsa Reagentes 1.a – Solução de May-Grunwald: Grunwald: pesar 300 mg do corante (pó seco), dissolvê-lo dissolvê com 100 ml o de metanol, em banho-maria maria a 50-60 50 C. Agitar constantemente durante 1 a 2 horas. Deixar em repouso por 24 horas e, em seguida, filtrar. 1.b – Tampão fosfato pH 7.2 NaH2PO4.H2O → 2,7 g Na2HPO4 →11,3 g H2O q.s.p. → 1000 ml 1.c – Solução de Giemsa: pesar 1,0 g do corante e dissolvê-lo dissolvê lo em 100 ml de metanol em banho-maria a 50-60oC. Agitar constantemente durante 1 a 2 horas. Deixar em repouso por 24 horas, e em seguida filtrar. Tomar 50 ml de filtrado e misturar com 200 ml do tampão fosfato. Esta é a solução trabalho de Giemsa. Procedimento a. Fazer o esfregaço sangüíneo em lâmina limpa e seca, e deixá-lo deixá lo secar bem. b. Colocá-lo lo no suporte de lâmina e cobrí-lo cobrí lo com 3 ml da solução de May-Grunwald May por 3 minutos. c. Após os 3 minutos, gotejar sobre o corante May-Granwald Granwald 5 gotas (200 ml) de tampão fosfato pH 7.2 ao longo do esfregaço, e aguardar por 1 minuto. Após completar o tempo, entornar a lâmina e desprezar o corante. Lavar rapidamente o esfregaço com 1 a 3 ml de água destilada. d. Colocar de volta o esfregaço no suporte e cobrí-lo cobrí lo com 3 ml de solução de trabalho de Giemsa por 7 minutos. Ao terminar o tempo de coloração, desprezar o corante e lavar cuidadosamente a lâmina com água destilada. Deixe secá-la. secá e. Analisar o esfregaço inicialmente com a objetiva 10x e depois, detalhadamente com a objetiva 100x (imersão).

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Pesquisa de Corpos de Heinz e Agregados de Hb H Princípio Os corpos de Heinz são precipitados de polipeptídeos oriundos da desnaturação de hemoglobinas, e que see fixam junto à membrana dos eritrócitos. São encontrados em pacientes com hemoglobinas instáveis, e após ingestão, inalação, ou absorção dérmica de produtos químicos, por exemplo: cloratos, fenilhidrazinas e drogas oxidantes. Em pacientes portadores de hemoglobinas moglobinas instáveis, e esplenectomizados, os corpos de Heinz apresentam-se apresentam grandes e grosseiros, enquanto naqueles não esplenectomizados essas precipitações mostram-se mostram menores. Os corpos de inclusões de Hb H (agregados de Hb H) são formados por cadeias polipeptídicas po beta, oriundas da formação do tetrâmero b4. Após coloração vital, esses corpúsculos apresentam-se se dispostos homogeneamente no interior dos eritrócitos, como pequenos pontos azulados. Essas inclusões são facilmente diferenciadas dos reticulócitos. Os corpos de Heinz e de Hb H somente são observáveis após coloração vital (aquosa). Entretanto, quando submetidos a corantes que usam álcool (Ramanowsky, Giemsa, Wright, etc.) esses corpúsculos desaparecem por dissolução. Equipamentos • • • • •

Microscópio com lentes de imersão Tubos de vidro 12 x 75 mm Lâminas Banho-maria a 37oC Pipetas Pasteur ou micropipetas de 20 ml

Reagentes a. Solução azul crezil brilhante a 1% azul crezil brilhante 1,0 g citrato de sódio 0,4 g cloreto de sódio 0,8 g água destilada ilada q.s.p. 100 ml b. Solução violeta de metila (optativo) violeta de metila 0,5 g NaCl 0,9% q.s.p. 100 ml

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Procedimento a. Colocar 100 ml de sangue em um tubo e adicionar 100 ml de azul crezil brilhante (ou violeta de metila). b. Incubar o material contido no tubo a 37oC por 30 minutos. c. Fazer esfregaços finos e examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Precauções a. Utilizar um controle normal. b. Usar sangue fresco, com anticoagulante (EDTA, ACD e heparina são recomendados). O excesso de EDTA causa dificuldade dificuldad na coloração. c. Checar a temperatura de 37oC do banho-maria. d. Confirmar o diagnóstico de uma hemoglobina instável, realizando os seguintes testes adicionais: desnaturação ao calor e ao isopropanol, eletroforese de hemoglobina, eritrograma e análise da morfologia morfo eritrocitária. e. Confirmar a presença de Hb H, geralmente sugestivo de talassemia alfa, realizando eletroforese de hemoglobina com tampão TEB pH 8,0-9,0; 8,0 9,0; o hemolizado deve ter feito preferencialmente com saponina a 1%. Realizar também o eritrograma e análise a da morfologia eritrocitária.

Coloração intra-eritrocitária eritrocitária de Hb Fetal Princípio Esse método é baseado na diferença que existe na capacidade de dissociação das subunidades entre Hb A e Hb Fetal, em pH abaixo de 4,0. A Hb Fetal é ácido-resistente ácido resistente e por isso não é eluída das células, corando-se se facilmente com eritrosina ou similar, enquanto que outros tipos de hemoglobinas emoglobinas por serem eluídas não fixam o corante. Equipamentos • • • • •

microscópio pHmetro vasilha-suporte suporte de lâmina lâminas banho-maria a 37oC

Reagentes a. Tampão citrato-fosfato fosfato pH 3,3 ácido cítrico 0,1M 100 ml fosfato di-sódico sódico hidratado 0,1M 30 ml b. Solução aquosa de eritrosina a 0,1% c. Solução de etanol a 80%

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Procedimento Fazer esfregaços finos, obtidos de sangue sem anticoagulante, e fixá-los fixá los com etanol a 80% por 5 minutos. Lavar, a seguir, com água corrente e secar ao ar. Introduzir os esfregaços em vasilha-suporte vasilha suporte de lâminas contendo tampão citrato-fosfato citrato pH 3,3 o previamente aquecido a 37 C por 5 minutos. Lavar com água corrente e secar ao ar. Corar com eritrosina por 2 minutos. Lavar com água e examinar em microscópio com aumento de 400x. Interpretação Os eritrócitos contendo Hb Fetal aparecem corados internamente enquanto que os outros que não a contêm permanecem sem coloração interna. A coloração é homogênea quando todos os eritrócitos aparecem uniformemente corados e podem ser encontrados em sangue sangu de cordão umbilical de recém-nascidos, nascidos, e de portadores de persistência hereditária de Hb Fetal. A coloração é heterogênea quando existem duas populações eritrocitárias distintas, ou seja, uma corada e outra sem coloração, e esses são os casos principalmente principalmente das diferentes formas de beta talassemias maior – com exceção dos portadores de genótipo talassêmico βoδ/β δ oδ.

Teste de Falcização Princípio Sob baixa tensão de oxigênio, os eritrócitos contendo hemoglobina S tomam a forma característica de foice, ou de meia-lua. meia lua. O metabisulfito de sódio reduz a tensão de oxigênio. Assim, quando uma solução de metabisulfito é adicionada adicionada ao sangue total, e esta mistura é vedada entre lâmina e lamínula por meio de esmalte, os eritrócitos contendo Hb S se deformam, após algumas horas de repouso. Equipamentos • • • • •

microscópio lâminas de microscopia e lamínulas pipetas Pasteur placas de Petri esmalte para colorir unhas

Reagentes a. Solução de metabisulfito de sódio a 2% Na2S2O5 200 mg

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP água destilada q.s.p. 10 mg b. Esmalte Procedimento a. Diluir em um tubo de hemólise 100 ml do sangue em estudo com 200 ml de solução fisiológica (NaCl 0,8%). b. Misturar na lâmina de microscopia 10 ml do sangue diluído e 10 ml de metabisulfito de sódio a 2%. c. Cobrir a preparação com lamínula e vedar os quatro lados com esmalte. Conservar a preparação em câmara úmida (placas de Petri com algodão embebido com água). d. Examinar em microscópio com objetiva 40x após 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas. Interpretação O fenômeno da falcização (teste positivo) ocorre em portadores de Hb S, com variação de tempo entre os diferentes tipos: Hb SS (1 a 3 horas); Hb SC e Hb SD (6 a 12 horas); Hb S/talassemia beta (12 a 24 horas); Hb AS (12 a 24 horas). Entretanto, essa relação falcização/genótipo/tempo não é constante, e também não serve para caracterizar o genótipo. Após 24 horas, na ausência de eritrócitos falcizados, o resultado resultado será dado como negativo. Precauções a. O metabisulfito deve estar dentro do prazo de validade e preparados momentos antes de ser utilizado. b. A câmara úmida deve ser colocada em lugar fresco, à temperatura ambiente. c. A vedação lâmina-lamínula lamínula com esmalte é fundamental. fun d. A concentração do metabisulfito, bem como sua preparação no momento de uso são pontos críticos. e. Hb Fetal aumentada, em associação com Hb S, prejudica a falcização.

Dosagem de Hb Fetal Princípio A Hb Fetal é mais resistente à desnaturação por soluções fortemente alcalinas que outros outro tipos de hemoglobinas. O teste é realizado adicionando uma determinada quantidade de solução alcalina em uma concentração conhecida de hemolisado. Após um tempo específico, a desnaturação é bloqueada por adição de sulfato de amônio saturado, ou parcialmente parcialme saturado. O sulfato de amônio diminui o pH e precipita a hemoglobina desnaturada. Após a filtração, a quantidade de hemoglobina alterada é avaliada e expressa como hemoglobina alcali-resistente alcali (ou Hb Fetal) em valores percentuais. Apresentaremos duas técnicas de quantificação de Hb Fetal: a. método de Singer, usado para altas concentrações de Hb Fetal; b. método de Betke, usado para baixas concentrações de Hb Fetal. c.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Método de Singer Equipamentos • • • • • • • •

espectrofotômetro pipetas de 5 ml micro-pipetas pipetas de 20 a 100 ml, ou equivalente cronômetro papel de filtro (Whatman nº 44, S&S ou equivalente) tubos de vidro 13 x 100 mm funis pequenos (3 a 4 cm de diâmetro) banho-maria a ± 20oC

Reagentes a. Solução de NaOH N/12 (3,3 g/l litro de água destilada) b. Solução saturada de sulfato de amônio (NH4)2SO4 500 g água destilada 500 ml Preparação do sulfato de amônio parcialmente saturado: remover 400 ml do sobrenadante da solução acima, colocando-oo em um becker, e adicionar 400 ml de água destilada e 2 ml de HCl 10 N (80,6 ml de HCl + 19,4 ml de água destilada). Procedimento a. Pipetar 1,6 ml de NaOH N/12 em um tubo de 13 x 100 mm, identificando-o identificando como "Hb Fetal". b. Tomar outro tubo 13 x 100 mm, identificando-o identificando o como "Hb Total", e pipetar inicialmente 5 ml de água destilada e depois 20 ml de solução de hemoglobina. Homogeneizar a solução por inversão. c. No tubo rotulado "Hb Fetal", adicionar 100 ml da solução de hemoglobina, e ao mesmo tempo acionar o cronômetro. Agitar cuidadosamente o tubo por 10 a 15 segundos. Exatamente após 60 segundos, segundos, adicionar 3,4 ml de sulfato de amônio parcialmente saturado. Homogeneizar a solução por inversão. d. Deixar por 30 minutos em repouso e filtrar, a seguir, a solução do tubo "Hb Fetal" em duplo papel de filtro. e. Ler as densidades ópticas (DO) das soluções dos dos tubos "Hb Fetal" e Hb Total" em 540 nm. f. Cálculo:

% Hb Fetal =

x 0,203 x 100

Desde que a diluição do tubo "Hb Fetal" apresenta a proporção volume da solução de Hb/volume total no valor 1:51, e que a diluição do tubo "Hb Total" seja 1:251 resulta o valor de 0,203.

287

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Interpretação Os resultados com valores de hemoglobina alcali-resistente alcali resistente menores que 3% são considerados normais. Concentrações acima de 4% são indicativas da presença de significativa quantidade de Hb Fetal. Em sangue de cordão umbilical, é possível possível obter níveis de 60 a 90% de hemoglobina alcalina resistente. Aproximadamente metade dos pacientes com talassemia beta menor apresenta Hb Fetal variável entre 2 a 5%. Nos pacientes com talassemia beta maior, a concentração de Hb Fetal é alta: 20 a 90%. Quando se obtém aumento de hemoglobina alcalialcali resistente acima de 10% em pacientes sem nenhuma outra alteração hematológica aparente, deve suspeitar-se se da presença de persistência hereditária de hemoglobina Fetal (PHHF).

Método de Betke Equipamentos • • • • • •

espectrofotômetro pipetas de 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml cronômetro papel de filtro (Whatman nº 1, S&S, Toyo) tubos 17 x 100 mm funis pequenos – 3 e 4 cm de diâmetro

Reagentes a. Solução de Drabkin (cianeto) K3Fe 200 mg KCN 200 mg água destilada q.s.p. 1 litro b. NaOH 1,2 N NaOH 48 g água destilada q.s.p. 1 litro c. Solução saturada de sulfato de amônio (NH4)2SO4 500 g água destilada 500 ml Procedimento a. Diluir 0,6 ml da solução de hemoglobina em um tubo contendo 10 ml da solução de Drabkin. Homogeneizar por inversão. 288

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP b. Colocar 5,6 ml da solução de hemoglobina diluída em um tubo rotulado "Hb Fetal". Adicionar 0,4 ml da solução de NaOH 1,2 N e acionar o cronômetro. Agitar cuidadosamente por 10 segundos. c. Ao final de 2 minutos exatos, adicionar 4 ml da solução saturada de sulfato su de amônio. Homogeneizar por inversão e deixar em repouso por 5 a 10 minutos, no máximo. d. Filtrar o conteúdo do tubo "Hb Fetal" em duplo papel de filtro. e. Preparar a solução padrão colocando em um tubo de ensaio 1,4 ml da solução de hemoglobina diluída no item 1, 0,1 ml de água destilada e 1 ml da solução saturada de sulfato de amônio. Transferir 1 ml dessa solução para outro tubo e juntar 9 ml de solução de Drabkin. A solução padrão é dez vezes mais diluída que a solução de hemoglobina alcali-resistente resistente ou "Hb Fetal". f. Ler a densidade óptica (DO) do tubo "Hb Fetal" e do padrão em 540 nm, contra um branco de solução de Drakbin. Cálculo

% Hb Fetal =

x 100

Interpretação Adultos normais: 0,0 a 2,0% de Hb Fetal. Essa técnica é recomendada quando os níveis de Hb Fetal estão baixos (< 4%). Para estes valores o método de Singer não é recomendado.

Teste de Precipitação para Hemoglobinas Instáveis Princípio As cadeias da hemoglobina (e o tetrâmero) são estruturas altamente estáveis, e dependem da força coletiva de quatro fatores: a. um grande conteúdo helicóide que constitui 75% da estrutura de cada cadeia polipeptídica; b. o firme ligamento entre o grupo heme e o polipeptídeo (globina); c. a localização interna de aminoácidos não-polares não polares e hidrofóbicos, que mantém o "pacote" de proteção ao grupo heme; d. os contatos α1β1 que estabilizam a integração entre as cadeias alfa e beta. A diminuição ição da estabilidade da hemoglobina pode ser resultante da alteração de qualquer um dos quatro fatores, geralmente sensíveis quando expostos ao calor. Em um tampão apropriado, a hemoglobina normal é dificilmente precipitada quando submetida à determinada temperatura emperatura (50oC a 60oC), por um certo tempo de exposição sob as mesmas condições, as hemoglobinas instáveis se desnaturam e se precipitam. 289

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Apresentaremos dois testes específicos para detectar hemoglobinas instáveis: a) desnaturação ao calor e b) precipitação por isopropanol. Teste de Desnaturação ao Calor Equipamento • • • • • •

tubos de vidro 17 x 100 mm e 12 x 75 mm pipetas de 5 ml centrífuga banho-maria: 50oC a 60oC pHmetro balão volumétrico de 100 ml

Reagentes a. Solução de fosfato monobásico de sódio 0,1 M NaH2PO4 13,8 g água destilada q.s.p. 1 litro b. Solução de hidrogeno-fosfato hidrogeno de di-sódio 0,1 M Na2HPO4 (anidro) 14,2 g água destilada q.s.p. 1 litro c. Solução tampão fosfato pH 7,4 solução de NaH2PO4 . H2O 0,1 M 19,2 ml solução de Na2HPO4 0,1 M 80,8 ml d. NaCl 0,8% Procedimento a. Em um tubo de hemólise colocar 1 ml de sangue fresco, coletado com anticoagulante. Centrifugar a 1.500 rpm e desprezar o plasma. Lavar os eritrócitos com NaCl 0,85% por duas vezes. Hemolisar os eritrócitos com 5 ml de água destilada. Homogeneizar Homo por seis vezes. b. Transferir o hemolisado para um tubo maior, e adicionar 5 ml do tampão fosfato (pH 7,4). Homogeneizar por seis vezes e centrifugar por 10 minutos a 1.500 rpm. c. Transferir 2 ml do sobrenadante para outro tubo e incubá-lo incubá a 50oC em banho-maria por o uma hora, ou a 60 C por trinta minutos. d. Observar se houve precipitação. Controle É fundamental o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições da amostra teste.

290

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Interpretação Em sangue com hemoglobinas normais, é possível que ocorra ocorra discreto grau de precipitação. O resultado é positivo quando a precipitação é floculenta e em grande quantidade. Precauções a. As amostras a serem analisadas não devem exceder 72 horas após a coleta. b. O diagnóstico da Hb instável deve ser confirmado por outros testes específicos: corpos de Heinz, eletroforese de hemoglobina, dosagem de metahemoglobina. c. A temperatura e o pH 7,4 do tampão são pontos críticos nesse teste.

Teste de Precipitação por Isopropanol Equipamento • • • • • •

tubo de vidro 17 x 75 mm e rolha pipeta de 5 ml micropipeta de 100 ml banho-maria 37oC centrífuga pHmetro

Reagentes a. Solução tampão Tris/isopropanol pH 7,4 Tris-hidroximetril-aminometano aminometano

12,11 g

isopropanol puro

170 ml

água destilada q.s.p

1 litro

ajustar o pH 7,4 com HCl concentrado. Procedimento a. Colocar 100 ml de sangue + 100 ml de saponina a 1% em um tubo de hemólise. Agitar moderadamente até que se processe a hemólise. b. Adicionar ao hemolisado, 2 ml de tampão Tris/isopropanol previamente equilibrado a 37oC. Agitar moderadamente ou homogeneizar homogeneizar por inversão, e incubar essa solução por o uma hora a 37 C. c. Observar, a cada 10 minutos, se houve precipitação. Interpretação A presença de Hb instável causa floculação nos primeiros 10 minutos, seguida de precipitação.

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Precauções a. As hemoglobinas normais permanecem estáveis durante todo o processo. Entretanto, pode ocorrer discreta precipitação em alguns casos, após 30 a 45 minutos. A Hb S é mais instável que a Hb A. A Hb A2 é a hemoglobina mais estável entre as hemoglobinas humanas. b. É necessário o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições que o teste. c. A temperatura de 37oC, o pH 7,4 do tampão e a concentração de isopropanol são pontos críticos neste teste. d. O diagnóstico de Hb instável deve ser confirmado por outros testes específicos: específicos corpos de Heinz, eletroforese de hemoglobina, dosagem de metahemoglobina.

Resistência osmótica em Solução de NaCl 0,36% 0

Princípio Os eritrócitos de pacientes portadores de talassemia beta, homozigoto e heterozigoto, apresentam maior resistência globular em solução de cloreto de sódio 0,36%, quando comparados com eritrócitos de pessoas sem essa forma de anemia. Esse teste é positivo para 97% dos portadores de talassemia beta, porém nem todos que apresentam maior resistência globular em solução NaCl 0,36% são talassêmicos. A anemia ferropriva também pode apresentar positividade nessa concentração, o mesmo ocorrendo com a Hb C. Equipamento • • •

tubo 12 x 75 mm micropipeta de 10 ml pipeta de 5 ml

Reagentes a. Solução estoque de cloreto de sódio tamponada a 10%* NaCl

90,00 g

Na2HPO4

13,65 g

NaH2PO4 . H2O

2,82 g

água destilada q.s.p. 1 litro Para obter a solução de NaCl 0,36%, diluir 36 ml da solução estoque em q.s.p. 1 litro destilada. * osmoticamente equivalente a 10% Procedimento Colocar 1,5 ml de solução de NaCl 0,36% em tubo de hemólise e adicionar 10 ml de sangue fresco. Homogeneizar por inversão, e deixar em repouso por 5 minutos. Fazer a leitura visual. 292

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Interpretação A leitura é realizada verificando se a solução está transparente (eritrócitos hemolisados), ou turva (eritrócitos resistentes). Para melhor constatação, coloca-se coloca se por trás do tubo, distante a 2 cm, uma folha traçada com três linhas pretas bem visíveis. O resultado é positivo quando, nas condições acima sugeridas, não se vê os traços. As amostras positivas podem indicar talassemia beta menor, necessitando, entretanto, para comprovação, testes adicionais: eritrograma, eritro dosagem de Hb A2, e análise da morfologia eritrocitária. Precaução 1. A solução de cloreto de sódio 0,36% deve ser preferencialmente tamponada. 2. Os resultados em que as linhas são visualizadas com dificuldade devem ser considerados negativos.

Curva de Fragilidade Osmótica Princípio Os eritrócitos de pessoas portadoras de esferocitose são mais frágeis que os eritrócitos eritróci normais em soluções com concentrações diferenciadas de NaCl (0,1%, 0,2% ... a 0,9%). A hemólise dos eritrócitos é avaliada porcentualmente e comparada com o padrão de normalidade. Equipamento • • • • •

tubo 12 x 75 mm micropipeta de 50 ml pipeta de 5 ml espectrofotômetro ou fotocolorímetro papel milimetrado

Reagentes a. Solução estoque de NaCl osmoticamente equivalente a 10% NaCl 9,0 g Na2HPO4 1,3 g NaH2PO4 . H2O 0,3 g H2O q.s.p. 100 ml

293

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b. Solução trabalho de NaCl 0,1% a 0,9% NaCl (%)

Solução Estoque (ml)

H2O destilada (ml)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Obs.: as soluções estoque e trabalho podem ser conservadas em refrigeração a 4oC por 6 meses. Procedimento a. Identificar em cada tubo de hemólise a concentração da solução de NaCl que o mesmo receberá (0,1%, 0,2% ... 0,9%). b. Colocar em cada tubo 5 ml da respectiva solução trabalho de NaCl. c. Adicionar em cada tubo exatamente 50 ml de sangue total coletado com heparina (preferencialmente) ou EDTA-K3. EDTA Homogeneizar geneizar suavemente por inversão até completa mistura do sangue na solução. d. Deixar em repouso por 25 a 30 minutos. Centrifugar todos os tubos por 5 minutos a 2.000 rpm. e. Retirar o sobrenadante com pipeta Pasteur de cada tubo, transferindo-o transferindo para outro previamente amente identificado. f. Fazer a leitura da densidade óptica (DO) de cada tubo em comprimento de onda 415 nm, ou filtro verde. Usar o sobrenadante da solução NaCl 0,9% comobranco. comobranco. g. A densidade óptica do tubo NaCl 0,1% representará 100% de hemólise, e desse valor valo serão calculados por regra de três simples todos os outros valores. Ex.: D.O. NaCl 0,1% ------100% -----de lise D.O. NaCl 0,2% ------ x x = % de lise de NaCl a 0,2%

294

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Valores Referenciais

% NaCl

% Hemólise Normal

% Hemólise na Esferocitose(*)

0,1

100

0,2

100

0,3

90-100 100

100

0,4

50-90 90

90-100

0,5

0-10

20-50

0,6

5-10

0,7

0,8

0,9

(*) há grandes variações entre os diferentes casos de esferocitoses. A representação numérica é o intervalo de confiança (75%) de um grupo de análises realizadas em nosso laboratório.

Eletroforese Qualitativa de Hemoglobinas em Acetato de Celulose pH 8,0 e 9,0 Princípio Em pH 8,0-9,0 9,0 a hemoglobina é uma proteína carregada negativamente, migrando em direção ao pólo positivo (anodo). Esse método identifica as hemoglobinas normais e grande parte das variantes. As diferentes mobilidades verificadas entre as diversas hemoglobinas com defeitos estruturais se devem às alterações de cargas elétricas, causadas por substituições de aminoácidos de diferentes pontos isoelétricos (pl). As hemoglobinas variantes, oriundas de mutações que não envolvem alterações de cargas elétricas, elétricas, geralmente apresentam mobilidade eletroforética semelhante à da Hb A; nesse grupo situa-se situa se a maioria das hemoglobinas instáveis. A figura 1 mostra a mobilidade relativa em eletroforese alcalina de algumas hemoglobinas anormais, em comparação com os padrões adrões normais.

Equipamento • • • •

cuba de eletroforese e fonte geradora de voltagem tiras de acetato de celulose papel absorvente aplicador de amostras

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Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP Reagentes a. Solução tampão: Tris-EDTA-borato Tris 0,025M pH 8,5 (TEB pH 8,5) Tris (hidroximetil) aminometano 10,2 g ácido etileno-diamino diamino-tetracético 0,6 g ácido bórico 3,2 g água destilada 1 litro b. Solução corante: Ponceau Ponceau S 0,5 g ácido tricloroacético 5,0 g água destilada q.s.p. 100 ml a. Solução descorante ácido acético glacial 100 ml metanol 50 ml água destilada q.s.p. 1 litro Procedimento a. Colocar igual quantidade de solução tampão em cada compartimento eletrolítico da cuba de eletroforese. b. Embeber o acetato de celulose na solução tampão, previamente colocada numa vasilha, pelo menos durante 15 minutos. c. Enxugar o acetato de celulose entre duas folhas de papel absorvente para remover o excesso de solução tampão. d. Ajustar as tiras de acetato de celulose na cuba de eletroforese, deixando-as deixando esticadas. Verificar se as suas extremidades estão mergulhadas na solução tampão tamp de cada compartimento da cuba. e. Aplicar as amostras nas tiras de acetato de celulose (hemolisado com saponina a 1% ou solução de hemoglobina) a 2 cm do compartimento do pólo negativo (catodo). f. Passar 200 ou 300 volts por 30 ou 20 minutos, respectivamente. g. Analisar o fracionamento, inicialmente sem corar. h. Remover as tiras e corar com Ponceau (ou outro corante de proteínas) por 10 minutos, no mínimo. i. Transferir as tiras para vasilha que contém solução descorante, agitando-a agitando cuidadosamente por 3 a 5 minutos. Trocar a solução descorante usada por outra limpa, e deixar as tiras por tempo necessário para clareá-las. clareá las. Analisar a disposição das frações.

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Controle Durante a eletroforese, é importante o uso de, pelo menos, uma amostra controle. Na ausência ausê de padrões tipo Hb AS, Hb AC, ou outra forma de hemoglobina variante, usar uma amostra com hemoglobina normal. O padrão normal constitui-se constitui se num excelente meio de comparação entre hemoglobinas "normais" e "anormais". A utilização de "mapas" de referência referência é muito útil na interpretação dos resultados (figura figura 1). 1

Figura 1.. Posições padrões das principais hemoglobinas variantes e talassemias em pH 8,4 e pH 6,2.

Precauções Para o sucesso de qualquer eletroforese, é fundamental os seguintes cuidados: a. verificar se as mãos, a cuba de eletroforese, as tiras de acetato, o aplicador e o papel absorvente estão limpos; b. observar se a solução tampão não está contaminada por colônias de fungos; c. a solução tampão, usada continuamente, é suficiente para oito a dez procedimentos seguidos, porém, no uso esporádico, por exemplo, uma vez por semana, é interessante conservar a cuba com tampão no refrigerador; 297

Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP d. a obtenção de fracionamento deficiente pode ser causada por: • • • • • •

solução tampão deteriorada, ou envelhecida; alteraçãoo do pH do tampão; alta molaridade do tampão; corrente elétrica deficiente; má qualidade do acetato de celulose; excesso ou deficiência da amostra aplicada.

Dosagem de Hb A2 por Eletroforese em Acetato de Celulose pH 8,0 e 9,0 Utiliza-se se os mesmos equipamentos, reagentes e procedimentos da técnica anterior. Procedimento Específico a. Aplicar 20 ml da solução de hemoglobina, por meio de pipeta de Shalli, numa única tira de acetato de celulose, com 4,5 a 5,5 cm de largura. Para acetato de celulose com 2,5 cm de largura, usar duas tiras, depositando 10 ml em cada uma delas. b. Passar 200 ou 300 volts por 30 ou 20 minutos, respectivamente. c. Após o fracionamento, as hemoglobinas A e A2, sem prévia coloração, são recortadas com tesoura e eluídas em tubos contendo água destilada na quantidade de 3 ml (para Hb A2) e 15 ml (para Hb A). Deixar a eluição se processar por 2 horas à temperatura t ambiente, agitando os tubos a cada 15 minutos. Nas eluições superiores a 2 horas, conservar o material sob refrigeração. Usar a água destilada como branco. Fazer a leitura das densidades ópticas (DO) em 415 nm. d. Cálculo:

% Hb A2 =

x 100

Valor normal: 2,0 a 4,0

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