Vol. 18 # 2. 2016 by revcbib_bog

Editora DOLLY MONTOYA CASTAÑO, Ph. D. Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia CONSEJO EDITORIAL GABRIEL OSVALDO GUTKIND, Ph.D Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires, Argentina GUSTAVO BUITRAGO HURTADO, MSc Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia ÓSCAR CASTELLANOS D., Ph. D. Facultad de Ingeniería Universidad Nacional de Colombia ÓSCAR ALZATE, Ph. D. Department of Neurobiology Duke University Medical Center, EE.UU. ENRIQUE GALINDO, Ph. D. Departamento de Bioingeniería Universidad Autónoma de México, México RAFAEL RANGEL ALDAO, Ph. D. Departamento de Tecnología y Procesos Biológicos y Bioquímicos Universidad Simón Bolívar, Venezuela MARÍA TERESA REGUERO R., MSc Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia JORGE MAYER, Ph. D. Golden Rice Project – Manager University of Freiburg, Alemania Directora Ejecutiva Jaqueline Ramírez Piraján, MSc Universidad Nacional de Colombia Con el apoyo de:

CONSEJO ASESOR ANDRÉS ILLANES, MSc Escuela de Ingeniería Bioquímica Universidad Católica de Valparaíso, Chile ALLAN RUSSELL, Ph. D. McGowan Institute for Regenerative Medicine Universidad de Pittsburgh, EE.UU. JORGE OSSA, Ph. D. Corporación Biogénesis Universidad de Antioquia, Colombia ARCADY SINITSYN, Ph. D. Departamento Cinética Enzimática Universidad Estatal de Moscú, Rusia JUAN GENTINA, MSc Escuela de Ingeniería Bioquímica Universidad Católica de Valparaíso, Chile JOSÉ SÁNCHEZ-SERRANO, Ph. D. Centro Nacional de Biotecnología Madrid, España FABIO A. ARISTIZÁBAL GUTIERREZ, Ph.D. Instituto de Biotecnología, Departamento de Farmacia Universidad Nacional de Colombia JENNY DUSSAN, Ph. D. Centro de Investigaciones Microbiológicas Universidad de los Andes, Colombia

EMBL-EBI

European Bioinformatics Institute, UK NINFA MARÍA ROSAS GARCÍA, PhD Centro de Biotecnología Genómica Instituto Politécnico Nacional, México CAMILO LÓPEZ, Ph.D. Departamento de Biología Universidad Nacional de Colombia OLIVIER THOMAS, Ph.D Faculté des Sciences University of Nice, France RODOLFO QUINTERO, Ph. D. Programa de Biotecnología del Petróleo Instituto Mexicano del Petróleo, México YOAV BASHAN, Ph. D. Departamento de Microbiología Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, México

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Coordinación Académica

Nombre: Inmunotinción del factor de transcripción STAT3 en la línea celular de cáncer de pulmón A549 Descripción: Por medio de microscopia de fluorescencia se detectó la expresión y localización celular del factor de transcripción STAT3 (Verde) en la línea celular A549. Se empleó DAPI (azul) como tinción de contraste para el núcleo celular. Se encontró localización de STAT3 tanto en núcleo como en citoplasma. Autores: Grupo Farmacogenética del cáncer Michael Ramírez Parra mramirezpa@unal.edu.co Maestría en bioquímica, Facultad de Medicina Fabio A. Aristizábal, faaristizabalg@unal.edu.co Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia

RUBÉN TORRENEGRA, Ph. D. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia RODRIGO LÓPEZ, Ph.D

La Revista Colombiana de Biotecnología es una publicación interinstitucional, especializada en la divulgación de desarrollos científicos y técnicos, así como otros temas relacionados con las diversas áreas de la biotecnología. Corrección de estilo y diagramación Dora Álvarez S. Impresión Fundación Cultural Javeriana de Artes Gráficas Javegraf

Público objetivo Investigadores, estudiantes y profesionales de las disciplinas que se desarrollan en torno a la biotecnología. Periodicidad: semestral

La Revista Colombiana de Biotecnología no se responsabiliza por las ideas emitidas por los autores. Los artículos que aparecen en esta revista pueden ser reproducidos citando la fuente.

Suscripciones, envío de trabajos, canjes o comentarios: Instituto de Biotecnología /Universidad Nacional de Colombia. Ciudad Universitaria. Edificio Manuel Ancízar. A.A. 14490 de Bogotá. Tel. [5-71] 316-5450 / 316-5000 (ext. 16981) - Fax: [5-71] 316-5415 Correo electrónico: revcbib_bog@unal.edu.co

CONTENIDO EDITORIAL Evolución en caracterización molecular en procesos de investigación biológica Fabio Ancizar Aristizabal. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 5 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Co-digestión anaerobia de vinaza y gallinaza de jaula: alternativa para el manejo de residuos agrícolas colombianos Marin-Batista José, Salazar Luis, Castro Liliana, Escalante Humberto. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 6 Prototipo de formulación a base de Rhodotorula mucilaginosa para el control de Botrytis cinerea en Rosas Jessica P. Bautista, Helber Barbosa, Daniel Uribe-Vélez. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 PCR en tiempo real: una metodología útil para la detección y cuantificación de granulovirus Gloria Barrera, Jazmín Murcia, Jorge Cerón, Paola Cuartas, Cristian Guzmán, Laura Villamizar. . . . . . . . . . 24 Métodos de conservación para actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo Tatiana Ortiz, Valeria Ocampo, Luis Daniel Prada, Marcela Franco-Correa . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 32 Cuantificación de bacterias diazótrofas aisladas de suelos cacaoteros (Theobroma cacao L.), por la técnica de Número Más Probable (NMP) Adriana Zulay Argüello-Navarro, Niccolay Madiedo Soler, Laura Yolima Moreno-Rozo. .. .. .. .. .. .. .. .. 40 Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa derivada de metagenomas de suelos agrícolas colombianos Carolina Villamil, Patricia Del Portillo, Alvaro Monguí* . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 48 Primer reporte de un begomovirus presente en maracuyá amarillo [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degener)] en Valle del Cauca, Colombia Juan Carlos Vaca-Vaca, Emerson Clovis Carrasco-Lozano, Mónica Rodríguez-Rodríguez, Jhon Fredy Betancur-Perez, Karina López-López . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 56 Infección de callo embriogénico friable de yuca con Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) Paula Díaz Tatis, Carlos Andrés Zárate, Adriana Bernal Giraldo, Camilo López Carrascal. . . . . . . . . . . . . . . . 66 Diseño y evaluación de un biosistema de tratamiento a escala piloto de aguas de curtiembres a través de la Eichhornia crassipes Uriel Fernando Carreño Sayago. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 Diagnóstico molecular, citogenético y anatomohistopatológico del Síndrome Freemartin en hembras bovinas en Colombia Ximena Cardona Lopera, Juan Fernando Vásquez Cano, Juan Bautista López Ortiz, Lina Maria Correa Estrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 ARTÍCULO CORTO Diseño in silico y evaluación funcional de genes semisintéticos que confieran tolerancia a fosfinotricina Jenny Paola Jiménez, Alejandro Chaparro-Giraldo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 Estrategias para disminuir la necrosis apical en la multiplicación y el enraizamiento in vitro del Pistacho Mariela Cid, Danilo Pina, Iris Capote, Maritza Escalona, Marcos Daquinta . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 97 Caracterización de aceites de las semillas de Moringa oleífera a partir de la extracción por diferentes métodos Diana Gómez Mitjans, Vicenta Pita Bravo, Beatriz Zumalacárregui de Cárdenas. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 106 Anatomía comparada de plantas de Dioscorea alata L. clon Caraqueño cultivadas en tres ambientes de crecimiento in vitro Misterbino Borges García, Bernard Malaurie, Silvio Meneses Rodríguez, Rafael Gómez Kosky, Marc Lartaud, Jean-Luc Verdeil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

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ARTÍCULO DE REVISIÓN Principales promotores utilizados en la transformación genética de plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Main promoters used in plant genetic transformation Zoraya M De Guglielmo C, Rafael Fernandez Da Silva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Actualización en caracterización molecular de levaduras de interés industrial Jorge Alberto Vásquez C , Mauricio Ramírez Castrillón, Zulma Isabel Monsalve F.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 129 BIONOTA El carbón activado y las condiciones de oscuridad en la micropropagación de banana variedad Nanicão Maura Isabel Díaz Lezcano, Bruno Alberto Flor Benítez, Cipriano Ramón Enciso Garay, Luis Roberto González Segnana . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 140 INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 150

CONTENTS EDITORIAL Evolution in molecular characterization in biological research processes Fabio Ancizar Aristizabal. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 5 RESEARCH ARTICLES Anaerobic co-digestion of vinasse and chicken manure: alternative for Colombian agrowaste management Marin-Batista José, Salazar Luis, Castro Liliana, Escalante Humberto. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . 6 Formulation prototype based on Rhodotorula mucilaginosa for the control of Botrytis cinerea in Roses Jessica P. Bautista, Helber Barbosa, Daniel Uribe-Vélez. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Real Time PCR: a useful methodology for detection and quantitation of granulovirus Gloria Barrera, Jazmín Murcia, Jorge Cerón, Paola Cuartas, Cristian Guzmán, Laura Villamizar. . . . . . . . . . 24 Preservation methods for actinobacterias with phosphate solubilizing activity Tatiana Ortiz, Valeria Ocampo, Luis Daniel Prada, Marcela Franco-Correa . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 32 Quantification of diazotrophs bacteria isolated from cocoa soils (Theobroma cacao L.), by the technique of Most Probable Number (MPN) Adriana Zulay Argüello-Navarro, Niccolay Madiedo Soler, Laura Yolima Moreno-Rozo. .. .. .. .. .. .. .. .. 40 Cloning, expression and characterization of a novel esterase derived from colombian agricultural soils metagenomes Carolina Villamil, Patricia Del Portillo, Alvaro Monguí* . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 48 First report of a begomovirus presents in yellow passionfruit [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degene)] in Valle del Cauca, Colombia Juan Carlos Vaca-Vaca, Emerson Clovis Carrasco-Lozano, Mónica Rodríguez-Rodríguez, Jhon Fredy Betancur-Perez, Karina López-López . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 56 Cassava friable embryogenic calli infection with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) Paula Díaz Tatis, Carlos Andrés Zárate, Adriana Bernal Giraldo, Camilo López Carrascal. . . . . . . . . . . . . . . . 66 Design and evaluation of a biosystem water treatment pilot-scale tannery through Eichhornia crassipes Uriel Fernando Carreño Sayago. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 Molecular, cytogenetic and anatomohistopatologic diagnostic of freemartin syndrome on females cattle in Ximena Cardona Lopera, Juan Fernando Vásquez Cano, Juan Bautista López Ortiz, Lina Maria Correa Estrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 SHORT ARTICLES In silico design and functional assessment of semisynthetic genes that confer tolerance to phosphinothricin Jenny Paola Jiménez, Alejandro Chaparro-Giraldo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

Contenido 3

Strategies to reduce the apical necrosis in vitro multiplication and rooting of Pistachio Mariela Cid, Danilo Pina, Iris Capote, Maritza Escalona, Marcos Daquinta . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 97 Characterisation of Moringa oleifera’s oils from different extraction methods Diana Gómez Mitjans, Vicenta Pita Bravo, Beatriz Zumalacárregui de Cárdenas. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 106 Compared anatomy of Dioscorea alata L. clone Caraqueño plants cultivated in three in vitro growth environments Misterbino Borges García, Bernard Malaurie, Silvio Meneses Rodríguez, Rafael Gómez Kosky, Marc Lartaud, Jean-Luc Verdeil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 REVIEW ARTICLE Main promoters used in plant genetic transformation Zoraya M De Guglielmo C, Rafael Fernandez Da Silva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Update on molecular characterization for yeast of industrial interest Jorge Alberto Vásquez C , Mauricio Ramírez Castrillón, Zulma Isabel Monsalve F.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 129 BIONOTE Activated Carbon and dark conditions in banana micropropagation Variety Nanicão Maura Isabel Díaz Lezcano, Bruno Alberto Flor Benítez, Cipriano Ramón Enciso Garay, Luis Roberto González Segnana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 AUTHOR INSTRUCTIONS FOR THE REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 152

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 2-4

Evolution in molecular characterization in biological research processes Fabio Ancizar Aristizabal* DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61559

En la actualidad gran cantidad de los proyectos que se plantean incluyen propuestas de caracterización molecular de algún modelo biológico, pero para algunos investigadores tal planteamiento no conlleva innovación, quizás tales interpretaciones se fundamentan en apreciaciones reduccionistas sobre a qué corresponde y cuáles pueden ser los alcances de la caracterización molecular para cualquier modelo biológico, en el contexto no solo de la Biología actual o de las aplicaciones derivadas o Biotecnologías.

Editorial

Evolución en caracterización molecular en procesos de investigación biológica

Es por tanto interesante tratar de encontrar lo que actualmente corresponde a la caracterización molecular dada la explosión de tecnologías que permiten apostar a conocer modelos biológicos con diferentes profundidades, partamos del hecho que entre las múltiples definiciones se encuentra que corresponde a la aplicación de técnicas que permiten detectar e identificar, de manera individual o combinadas, moléculas propias de un sistema biológico como son los ácidos nucleicos (ADN y ARN - aproximaciones genómicas y transcriptómicas) al igual que las proteínas (proteómica), pero que en los momentos tecnológicos actuales incluyen el análisis de las moléculas que dibujan el metabolismo o metaboloma. Es importante resaltar que la detección e identificación de tales moléculas se encamina por tanto a la definición de cada sistema en estudio. La disponibilidad de tecnologías de análisis globales tanto de ácidos nucleicos como de proteínas y metabolitos, no hace que se pierda el potencial de innovación o novedad de las diferentes investigaciones, lo que realmente está sucediendo, es que la caracterización molecular se ha convertido, no en el objeto directo de los trabajos, si no que, ha llegado a convertirse en una herramienta para resolver múltiples preguntas biológicas que se orientan a buscar asociaciones con los denominados marcadores moleculares. Por tanto, lo que se visualiza es que los procesos de caracterización molecular, se han trasformado en posiblemente la base de la investigación o quizás en herramientas que permite aproximarse a la compresión de fenómenos biológicos así como detectar moléculas de interés o con potenciales aplicaciones. Así mismo, hay que considerar que frente a lo expuesto no se pretende indicar que toda investigación deba necesariamente emplear tecnologías de análisis globales, siendo posible llegar a usarlos, también es necesario asumir que muchas de las tecnologías disponibles desde hace 20 años o más, usadas para detectar, analizar y caracterizar modelos biológicos y las moléculas que los componen, siguen vigentes y la decisión de emplear una u otra se relaciona más con las preguntas de investigación. Vale la pena mostrar un ejemplo de cómo se tiende a trabajar en patologías humanas, actualmente, se han dejado de lado los modelos de evaluación aleatoria para desarrollo de sistemas encaminados a encontrar estrategias de manejar la enfermedad, las aproximaciones que se han impuesto, son aquellas que primero permitan describir a nivel molecular detallado la patología específica, lo que favorece la identificación de marcadores moleculares relevantes o que la definen, que a su vez al ser claramente identificados y modelados, llevan a clasificarlos como potenciales blancos para diagnóstico, seguimiento o posibles blancos terapéuticos, dado paso a procesos de construcción racional efectivos.

PhD en Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, faaristizabalg@unal.edu.co

La sostenible Vol. un reto del2016 suelo5 5 Rev.agricultura Colomb. Biotecnol. XVIIIpara No.la2 microbiología Julio-Diciembre 5

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Co-digestión anaerobia de vinaza y gallinaza de jaula: alternativa para el manejo de residuos agrícolas colombianos Anaerobic co-digestion of vinasse and chicken manure: alternative for Colombian agrowaste management Marin-Batista José*, Salazar Luis**, Castro Liliana***, Escalante Humberto**** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.53853

Resumen La digestión anaerobia es una tecnología atractiva para el manejo de residuos al producir energía en forma de biogás y estabilizar la materia orgánica. En este estudio, se evaluó el proceso de co-digestión de vinaza y gallinaza de jaula como una alternativa de manejo y estabilización de residuos generados por la agroindustria colombiana. Se llevaron a cabo, ensayos de biometanización en relaciones de mezcla vinaza y gallinaza de 1:0, 3:1, 1:3 y 0:1 en base a VS. La relación de 3:1 de vinaza y gallinaza permitió aumentar la producción específica de metano en un 55% respecto a la producción específica ponderada de 0.65 m3 CH4/kg VS. Las mezclas entre los sustratos presentaron un efecto sinérgico positivo. La gallinaza de jaula mejoró la capacidad de amortiguación de la mezcla, disminuyendo el riesgo de acidificación por cambio drástico en el pH durante la digestión de la vinaza. Por otra parte, la vinaza permitió diluir la concentración total de nitrógeno amoniacal evitando la inhibición de amoniaco. Dado el aumento de la producción de metano, el co-tratamiento de vinaza y gallinaza mejora la recuperación de energía y la viabilidad económica de la instalación de la planta de biogás como parte de la cadena de producción de etanol. Palabras clave: digestión anaerobia, vinaza, gallinaza de jaula, prueba de potencial de biometanización, efecto sinérgico.

Abstract Anaerobic digestion is an attractive technology for waste management meanwhile energy is recovering. This study evaluated the feasibility of codigesting vinasse and chicken manure (CM) as management alternative for Colombian agro industries. Biochemical methane potential was tested for different vinasse to CM ratios of 1:0, 3:1, 1:3 and 0:1 on VS basis. Vinasse and CM ratio of 3:1 increased the specific methane production up to 55% regard to the weighted specific methane production of 0.65 m3CH4/kg VS. Mixtures between the substrates had a positive synergistic effect. CM improved buffer capacity diminishing the risk on acidification by drastic pH shift during vinasse digestion. Furthermore, vinasse allowed dilution of total ammonia nitrogen concentration avoiding ammonia inhibition. Since a higher methane production, vinasse and CM co-treatment improves the energy-recovery and economic feasibility of installing biogas plant as part of the ethanol production chain. Keywords: anaerobic codigestion, vinasse, chicken manure, biomethane potential test, synergistic effect. Recibido: marzo 16 de 2016 Aprobado: octubre 19 de 2016

Introduction The expansion of ethanol distilleries in Colombian sugarcane refineries has increased the production of vinasse, the main waste stream of ethanol distillation * ** *** ****

process (Dávila-Rincón et al., 2009). Production of vinasse varies from 8 to 15 L per liter of ethanol obtained (Zieminski et al., 2015). Vinasse is characterized by acid pH (4.0–5.0) and high potentially polluting

MSc, Universidad Industrial de Santander, Colombia. jdmbatista05@gmail.com MSc, Universidad Industrial de Santander, Colombia. luissanantonio2010@hotmail.com PhD, Profesora Escuela de Ingeniería Química, Universidad Industrial de Santander, Colombia licasmol@uis.edu.co PhD, Profesor Escuela de Ingeniería Química, Universidad Industrial de Santander, Colombia escala@uis.edu.co

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 6-12

organic matter (76 - 110g COD L-1) in form of soluble sugars (9.5-7.9gL-1) and phenols (0.4–12.4 gL-1) (Moraes et al., 2015). Several treatments such as aerobic conventional methods (trickling filters, lagoon), evaporation–condensation (with and without combustion), ozonation and direct dispersion on soil as a fertilizer have been proven for purification, utilization and disposal of these wastewaters (Jáuregui-Jáuregui et al., 2014; Jimenez et al., 2006). Those methods are high costly and simultaneously generate other pollutants. In other hands, poultry industries in Colombia produce chicken manure (CM) as main biomass of the sector. With an annual production of 31,592 ton of CM per million of birds, the valley becomes the third poultry region in the nation (Marin-Batista et al., 2015; Escalante et al., 2010). CM present a high content of organic matter, mainly in form of proteins (15.6 %), cellulose (20 %), hemicellulose (23.2 %) and lignin (2.3 g/L) (Li et al., 2013). Composition of CM enable obtaining new products such as compost and meat meal (Huang et al., 2011; Rosales et al., 2007), but those methods are not enough to dispose the CM produced annually. Anaerobic digestion (AD) is a biotechnological process that enables the stabilization of waste meanwhile the organic matter is converted into methane-rich biogas. During AD more than 90% of the energy available for direct oxidation is transformed in methane and only 10% of the energy is consumed in bacterial growth (Kumar, 2008). AD process offers the possibility of recycling nutrients such as nitrogen and phosphorus contained in the effluent, which is feasible to apply as biofertilizers (Fernandez et al., 2008). Among the process advantages there are the reduction of environmental impact (odors and greenhouse gases emission), low by-products generation, not utilization of chemical compounds, low operational costs and positive energy balance (Ward et al., 2008). Recently, vinasse and CM have increased its attractiveness as substrate for anaerobic digestion due to their high available and easy degradable organic matter (Moraes et al., 2015; Nui et al., 2013). However, inherent drawbacks during anaerobic mono digestion involve operations with high hydraulic retention time that is economically unfeasible for industrial application (Li et al., 2014). Researches on AD of vinasse reveal drastic pH drop during the startup of the process (Syaichurrozi et al., 2013), pH shifts are correlated with volatile fatty acids (VFA) concentrations and depends on buffering capacity of the system. Moreover, drastic changes on pH affect directly the microbial population growth for methanogens and decreases methane yield (Espinoza-Escalante et al., 2009). In other hands, CM is a high nitrogen content organic waste. The main source of nitrogen on CM is its high content of proteins, which anaerobically degraded into ammonia (Li et al., 2013). Total ammonia nitrogen concentrations (TAN), over 2-4 g/L (Wang et al., 2014), reduce the popula-

tion of methanogens and generate volatile fatty acids (VFA) accumulation (Nui et al., 2013). Consequently, it is presented a dynamic equilibrium between VFA and TAN known as a pseudo-steady state where the process operates at steady state but with low methane production (Lu et al., 2013). Anaerobic co digestion (AcoD), the simultaneous AD of two or more substrates, is a feasible option to overcome the drawbacks of mono-digestion as well to improve the plant economic feasibility due to higher methane production (Mata-Alvarez et al., 2014). This variant of AD consists on mixing two or more substrates with complementary characteristics for combined treatment (Astals et al., 2014). AcoD is known as a feasible solution to overcome inhibitions and improve process performance due to better carbon availability, nutrient balance and buffering capacity (Wang et al., 2014). Vinasse and CM are potential candidate for cotreatment. CM provides (i) alkalinity and (ii) macro and micro nutrients (Marin-Batista et al., 2015) fostering pH buffering systems meanwhile vinasse can help to dilute ammonia nitrogen accumulated by CM digestion. This study aimed to evaluate synergistic effect of chicken manure (high nitrogen content) and vinasse (high carbon content) during anaerobic codigestion. Both substrates proceed from Colombia agro industry and its codigestion will work as energy-recovery and nutrients approach as part of the ethanol production chain.

Material and Methods Substrates and inoculum Vinasse utilized in this study was produced following the most widely used steps in Colombian factories (Quintero et al., 2008). Vinasse production consisted on two stages: i) sugarcane molasses fermentation and ii) alcohol separation. For sugarcane molasses fermentation were used molasses obtained from an agricultural inputs establishment. Previous fermentation molasses was diluted until 30°brix (300g of sucrose per liter), percentage (w/v) of soluble solids (Brix) was determined with a portable refractometer for sugar – Brixco (0-80% ATC). Fermentation was carried out on batch mode using 80 L tank at environmental conditions (26±2°C and 0.98 atm). The tank was loaded with the molasses juice until 70% of its total capacity. The yeast used for fermentation stage corresponded to strain of Saccharomyces cerevisiae named S. cerevisiae LPB. pH and additional supplementary nutrients such as magnesium (MgSO4.7H2O) and nitrogen (NH4NO3) were conducted as recommended by Siqueira et al., (2008). Fermentation was ended when CO2 liberation finished (20 days of visual observation) (Siqueira et al., 2008). Alcohol separation was performed on a pilot doubleeffect evaporator. The pilot operated to 2 Psia and capacity of 80 L. The evaporation process produced a

Co-digestión anaerobia de vinaza con gallinaza de jaula 7

vapor stream condensed and collected from the top. The condensed stream consisted of 30% alcohol (v/v) dissolution. The volumetric alcohol concentration (v/v) was determined with alcohol hydrometer - Bellwether. The remaining liquid in the evaporator corresponded to vinasse used in this study, which was collected and storage (4Â°C) for further characterization. Chicken manure (CM) was collected from a local chicken layer farm located in Lebrija-Santander, Colombia. CM consisted of a mixture among manure, thin feathers and eggshells. Table 1 shows CM and vinasse physicochemical properties. The cattle slurry used as inoculum was collected from slaughterhouse located in Rio Negro â&#x20AC;&#x201C;Santander, Colombia. The inoculum had a total solid (TS) concentration of 30.1 g/L, volatile solid (VS) concentration of 20.8 g/L and methanogenic activity of 2 COD CH4/gVSSÂˇday.

Biochemical methane potential test Biochemical methane potential (BMP) test were carried out in triplicate at 37Âą2Â°C following the guidelines described by Angelidaki et al. (2009). Tested mixtures between vinasse and CM were set at 1:0, 1:3, 3:1 and 0:1 on VS basis. The inoculum to substrate ratio, on VS basis, was kept at 2 for all the mixtures. Each reactor had a 60 mL capacity, 12 mL of inoculum and the same initial VS load of the substrate, in order to compare results. Distilled water was added to adjust a working volume of 35 mL for each reactor. Triplicate blank were used to determine the background methane yield of the inoculum. All digesters were manually shaken twice a day for about 1 min. Methane produced during BMP was quantified by the volumetric displacement of an alkaline solution. The volume of methane displaced was normalized and expressed in terms of specific methane production (SMP) m3 CH4/ kg VS added (Angelidaki et al., 2009).

Identification of synergistic effects Synergistic effect was evaluated as an additional SMP obtained during co-digestion over the weighted average of the individual feedstockâ&#x20AC;&#x2122;s SMP (Labatut et al., 2011). Weighted specific methane production (WSMP) was calculated using the equation (1): WSMO

YV YCM

(1)

Where, YV correspond to SMP for vinasse digested as mono substrate, YCM correspond to SMP for CM digested as mono substrate. Îą is the volatile solids fraction added of vinasse and Î˛ the volatile solids fraction added of chicken manure. Synergistic effects () were identified as a qualitative parameter for evaluation of the process performance. Synergistic effects were determined using the equation (2): 8

SMP WSMP SMP WSMP

(2)

Where, SMP correspond to experimental SMP achieved for the ratio tested. WSMP correspond to the average of experimental SMP obtained by digestion of both feedstocks as mono- substrate. Finally, if the value of ď&#x192;&#x2020; is +1, the mixture presented synergistic effect. Otherwise, if the value of ď&#x192;&#x2020; is -1, the mixture presented antagonistic effects.

Analytical techniques Analyses of total solids (TS), volatile solids (VS), chemical oxygen demand (COD), total Kjeldahl nitrogen (TKN), proteins and lipids were performed according to the Standard Methods for the examination of wastewater (APHA, 2005). Carbohydrates were estimated by subtracting the amount of protein and lipids from volatile solids (GalĂ et al., 2009). TRS was determined by colorimetric method (Miller, 1959). Total alkalinity (TA) and TVFA were quantified by titration (Anderson et al., 1992). pH values were determined by a pH meter (691, Metrohm) and total ammonia nitrogen according to the standard methods procedures (APHA, 2005).

Statistical analysis The experimental data was statistically analyzed using one way analysis of variance (ANOVA) by using MINITAB 17 (17.1.0.0). Pairwise comparisons of the means of SMP and TAN were conducted by the Fisher Least Significant Difference (LSD) calculated with 95% confidence.

Results and discussion Characterization of substrates. Substrates characterization is presented in table 1. Vinasse tested in this study showed values on COD, pH and TKN similar at industrial sugarcane vinasse (Moraes et al., 2015). Nevertheless, Vinasse prepared in this study correspond a feedstock viable to evaluate a model substrate for sugarcane vinasse anaerobic digestion. Vinasse and CM presented high organic matter contents available for the anaerobic process. Literature reported appropriate pH values for startingup of AD process on range of 7 to 8 (Li et al., 2013). Vinasse presented an acid pH value of 4.2 and CM a basic pH value of 8.4. Basic pH value in CM must be to its high concentration of ammonia and trace element such as cd, Co, Cr, Cu, Mo, Zn and Ni that raise alkalinity (Bolan et al., 2010). Then, it is expected that vinasse to CM mixing ratios accomplish suitable pH values for the AD process.

Biomethane potential test (BMPt) The specific methane production (SMP) for vinasse to CM ratios (1:0, 3:1, 1:3 and 0:1 on VS basis) were deRev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 6-12

Table 1. Characterization of substrates. Material

Units

Vinasse

Chicken manure

Total solids (TS)

g/L

89.2

226.2

Volatile solids (VS)

g/L

78.5

107.4

Chemical oxygen demand (COD)

g/L

82.3

731.7

4.2

8.3

Carbohydrates

g/L

54.6

78.6

Lipids

g/L

2.7

Proteins

g/L

19.3

35.5

Total kjeldahl nitrogen (TKN)

g/L

9.0

5.5

terminate in biodegradability test. Figure 1 shows the average value of SMP after withdrawing the methane production from the inoculum blank assays, which was 0.17±0.02 m3 CH4/kg VS. Monodigestion assays were Vinasse to CM ratios of 1:0 and 0:1. The monodigestions accomplished SMPs of 0.43±0.04 m3 CH4/kg VS and 0.39±0.02 m3 CH4/kg VS, values in that range reported at literature (Djalma et al., 2016; Marin-Batista et al., 2015). Then, anaerobic digestion of chicken manure and vinasse by separately works as a strategy for waste management. Anaerobic digestion of both wastes in a single reactor should be a well strategy for the waste management as well as energy recovery. Vinasse to CM ratios of 3:1 and 1:3 represented the codigestion between both feedstocks. Codigestion assays significantly (p=0.00) increased the SMP up to 0.65±0.01 m3 CH4/kg SV and 0.56±0.02 m3 CH4/kg SV for Vinasse to CM ratio of 3:1 y 1:3, values higher than monodigestion assays. Previous studies reported than CM could provide essential nutrients fostering microbial metabolism and therefore methane production (Li et al., 2013). In codigestion assay, methane production increased as well as Vinasse increased in the ratio. Probably, due to high concentration of easily and rapidly biodegradable sugars in vinasse that raise exponentially the conversion efficiency (Yang et al., 2015). Most of organic matter in CM is conformed of proteins and low degradable compose as well as cellulose, hemicellulose and lignin (Li et al., 2013). Then, a high supplementation of CM reduces the biodegradability rate resulting in a slightly lower methane production when methane yield is compared at the 30 days digestion. Table 2 presents a comparison of SMP, WSMP and synergistic effects (. WSMP correspond to weighted average of the individual waste’s SMP. WSMP represents the expected methane production by mixing vinasse and chicken manure. WSPM was calculated using equation 1. Subtraction between SMP and WSMP indicated an extra methane production obtained during

Figure 1. Specific methane production for different vinasse (V) to chicken manure (CM) ratios.

digestion assay. Values of SMP and WSMP increased proportionally as portion of vinasse increases in the mixture. Both SMP and WSMP showed the same tendency confirming the accuracy of BMPt. Vinasse to CM ratio of 3:1 and 1:3 achieved an extra methane production higher up to 55% and 44%, respectively. The extra methane production can be attributed to synergistic effect (Labatut et al., 2011). Currently, there is limited knowledge about how waste composition influences AcoD performance or whether interactions between substrates enhance or attenuate inhibition thresholds, degradation rates, or biogas yields on individual substrates (Astals et al., 2014). It could be explained because of the variety in the substrate composition encourage the growth of microorganisms stimulating the anaerobic degradation process (PagésDíaz et al., 2014), since mixtures could have all of the nutrients and trace elements that microorganisms need for their growth. Then, Synergistic effect could be defined as a qualitative parameter to evaluate the feasibility of the co digesting mixture and the SMP could be used as indicator of synergism. In this study, synergistic effects were tested using the equation 2. According to the results (table 2) vinasse to CM ratios of 3:1 and

Co-digestión anaerobia de vinaza con gallinaza de jaula 9

Table 2. Synergism or antagonism during AcoD of vinasse (V) and chicken manure (CM) SMP (m3 CH4/kg VS)

WSMP (m3 CH4/kg VS)

ď&#x192;&#x2020;

Effect

V:CM 1:0

0,43

V:CM 3:1

0,65

0,42

Synergistic

V:CM 1:3

0,56

0,40

Synergistic

V:CM 0:1

0,39

Ratios

1:3 presented values of +1. Then all the mixture ratios presented synergistic effects.

Monitoring of response variable during anaerobic codigestion of different Vinasse to CM ratios The total reducing sugar (TRS) consumption over time indicates the performance on startup of the process (Castro et al., 2014). TRS profile during co digestion for vinasse to CM ratios of 1:0, 3:1, 1:3 and 0:1 are showed in figure 2a. It is observed that control (V:CM 1:0 and 0:1) showed TRS consumption until the tenth day of digestion, unlike vinasse to CM ratios of 3:1 and 1:3 was until fifth day of digestion. The results for vinasse to CM ratios of 1:0, 3:1, 1:3 and 0:1were 210.8 mg.L-1d-1, 639.9 mg.L-1d-1, 329.5 mg.L-1d-1 and 44.5 mg.L-1.d-1, respectively. Co-digestion samples presented higher sugar consumption than mono-digested samples. Vinasse to CM ratio of 3:1 presented the highest hydrolytic activities, indicating a better affinitive from the ratio to inoculum (Quintero et al., 2012). Ne-

vertheless, co digestion of vinasse and CM improved the TRS consumption rate on both feedstocks. The dynamic of Total Volatile Fatty Acids (TVFA) are showed in figure 2b, which are one of the most important indicators for measuring anaerobic digestion performance (Abouelenien et al., 2014). Concentrations on TVFA increased during the first days of digestion for all the vinasse to CM ratios. Increment on TVFA concentration could be attributed to activity of acidogens converting TRS released during hydrolytic stage in the startup of the process (figure 2a). In this study, TVFA values were 3420 mg/L, 3180 mg/L, 2820 mg/L and 2580 mg/L for vinasse to CM ratios of 1:0, 3:1, 1:3 and 0:1, respectively. After the fifth day of process, vinasse to CM ratios decreased the concentration on TVFA, denoting consumption of organic matter as result of activity of acetogens capable to transform acetate into methane. Vinasse achieved high concentrations of TVFA due to its easy degradable sugars. However, the present of metabolic components as propionic acid (Djalma et al., 2016) and sulfides (Barrera et al., 2015),

Figure 2. (a) Variation of total reducing sugar (TRS) and (b) total volatile fatty acids (TVFA) during digestion period for different V to CM ratios.

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 6-12

which are co factors in enzymatic reactions, could affect the VFA consumption rate.

Stability indicators of digestion process for different vinasse to CM ratios Low specific methane production is generally a consequence of imbalance between the different microbial populations caused by low pH, accumulation of VFAs, and high concentration of free ammonia, which are parameters indicator of process stability (Li et al., 2013). Figure 3 presents the profile of buffer capacity, pH and Total Ammonia Nitrogen (TAN) concentration during digestion period. Anaerobic processes achieve stability on ranges of buffer capacity (TVFA/total alkalinity) values between 0.2-0.8 (Nue et al., 2013). Buffer capacity values higher than 0.8 indicates imbalance

between the population of acidogens and methanogens (Raposo et al., 2006). In this study, the buffer capacity for vinasse to CM ratios of 3:1, 1:3 and 0:1 kept on range stated as stability values. On the contrary, monodigestion of vinasse presented instability on buffer capacity achieving values up to 1.10. These results were consistent with variation of pH and TAN (figure 3b and 3c). The concentration of TAN increased significantly (p<0.003) as the amount of CM increased in the mixture. It has been widely reported inhibition for methanogens to final concentration of TAN over the threshold of 3000 mg/L (Wang et al., 2014). Vinasse to CM control ratio of 0:1 reached the highest final TAN concentration of 1875 mg/L, so far to the ammonia inhibition threshold. Total ammonia nitrogen (TAN) concentration could contribute to buffer capacity and help to maintain the pH value (Li et al., 2014). Results indicate that codigestion moderate buffer capacity to alkalinity values up to 5000 mg CaCO3/L, which support ph drops and TVFA accumulation.

Conclusion Anaerobic codigestion is a feasible technology as a management alternative for vinasse and chicken manure. Chicken manure improved trace element arising buffer capacity of the system and reducing the risk of acidification on vinasse mono digestion. Specific methane production increased significantly (p=0.000) up to 0.65±0.01 m3 CH4/kg SV and 0.56±0.02 m3 CH4/kg SV for vinasse to CM mixing ratios of 3:1 y 1:3. Synergistic effects during codigestion of vinasse and chicken manure augmented the methane production up to 55%. However further studies are required to explain the synergistic effects occur during anaerobic co digestion.

References

Figure 3. (a) Variation of buffer capacity (b) pH (c) and Total ammonia nitrogen during digestion period for different vinasse to CM ratios.

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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Prototipo de formulación a base de Rhodotorula mucilaginosa para el control de Botrytis cinerea en Rosas Formulation prototype based on Rhodotorula mucilaginosa for the control of Botrytis cinerea in Roses Jessica P. Bautista*, Helber Barbosa**, Daniel Uribe-Vélez*1 DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.55826

Resumen Los sistemas productivos de Rosas de corte para exportación poseen retos importantes debido a la presencia de diversos agentes fitopatógenos, siendo Botrytis cinerea uno de los más relevantes debido a su persistencia y número de hospederos alternativos. Los mercados internacionales son muy exigentes en el manejo ambientalmente sostenible de los cultivos, por lo que se ha hecho presión para la implementación de estrategias de control biológico de enfermedades. La levadura filosferica Rhodotorula mucilaginosa (Lv20) con potencial biocontrolador contra B. cinérea, fue empleada en este estudio con el objeto de generar un prototipo de formulación en base sólida con el fin de lograr una estabilidad de la actividad y viabilidad celular a través del tiempo. El empleo de mezclas de polímeros sintéticos y de origen natural permitió mantener la viabilidad de esta cepa durante 90 días a unos niveles de 1,90x109 células.mL-1 a una temperatura de 25°C en una formulación líquida. Así mismo, el prototipo de formulación, empleando manitol como agente nucleador en una formulación sólida de tipo granulada, logró una viabilidad celular de 1.2x108 células.gr-1 a los 90 días de almacenamiento a 4°C, logrando mantener una actividad biocontroladora igual a la cepa fresca sin formular o recién formulada. Estos resultados obtenidos permiten sugerir que los prototipos de formulación empleando como principio activo la levadura R. mucilaginosa, son una alternativa promisoria para el control de B. cinerea en la post cosecha de rosas variedad véndela. Palabras clave: levaduras, moho gris, formulación sólida, biopolimeros, control biológico, postcosecha.

Abstract Productive systems of cut roses for exportation, have important challenges due to the presence of various plant pathogens in such crops. Botrytis cinerea is one of the most important pathogen microorganism because of its persistence and number of alternative hosts plants. International markets are very demanding in terms of environmentally sustainable crop management, which has forced for the implementation of strategies for biological control of diseases. The phyllosphere yeast Rhodotorula mucilaginous (Lv20) with biocontrol potential against B. cinerea, was employed in this study in order to generate a solid prototype formulation to achieve both, the stability of its activity and cell viability over time. The use of the mix of synthetic and naturally occurring polymers allowed to maintain the viability of this strain for 90 days at 1,90x109 células.mL-1 at a 25 ° C in a liquid formulation. Likewise, the prototype formulation using mannitol as a nucleating agent in a granular solid formulation, allowed obtaining a cell viability of 1.2x108 células.gr-1 after 90 days of storage at 4 °C, maintaining a biocontrol activity equal to the fresh strain with or without formulation. These results allow us to suggest that the formulation prototypes using R. mucilaginous yeast, is a promising alternative for the control of B. cinerea in post-harvest management of roses. Key words: yeast, grey mold, solid formulation, biopolymers, biological control, postharvest. Recibido: febrero 19 de 2016 Aprobado: octubre 12 de 2016

* **

Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Biotecnología, correos electrónicos: jessicabautista282@gmail.com, duribev@unal.edu.co 1 Autor de correspondencia. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia, correo electrónico: hdbarbosab@unal.edu.co

Formulación a base de XVIII Rhodotorula Rev. Colomb.sólida Biotecnol. Vol. No. 2 13 Julio-Diciembre 2016 13-23 13

Introducción Colombia es el segundo exportador de flores de corte a nivel mundial, siendo las rosas uno de los principales productos de su portafolio de exportación. El mercado internacional de este tipo de productos enfrenta una serie de limitaciones de tipo fitosanitario, destacándose Botrytis cinerea, debido a su amplia distribución y a los efectos devastadores que este agente fitopatógeno causa a sus cultivos hospederos (Asocolflores 2009; Dik & Wubben, 2007). Hasta el momento, las estrategias de mitigación de esta problemática se han centrado en el uso de compuestos agroquímicos, particularmente fungicidas del grupo dicarboximidas, lo que ha generado el desarrollo de cepas de B. cinérea resistentes a este tipo de compuestos (Asocolflores, 2008; Leroux, 2007; Elad et al., 2007; Shtienberg, 2007). Por otra parte, existe una percepción negativa del público hacia los fungicidas químicos, ya que estos presentan una serie de riesgos toxicológicos sobre la salud humana y el medio ambiente (Wisniewsky et al., 2007). Por tal motivo los productores de flores a nivel mundial han identificado otras estrategias ambientalmente sostenibles para la producción de flores sanas (Agricultura de las Américas, 2009), estrategias que están siendo certificadas para Colombia desde 2008 a través del sello Florverde® (SCFv) (Asocolflores, 2008; Florverde, 2009; Globalgap, 2011). Partiendo de la situación arriba mencionada, se ha buscado el desarrollo de estrategias de control biológico de enfermedades a través de diferentes tipos de microorganismos, como las levaduras filosféricas, las cuales además de ser compatibles con el medio ambiente, reducen el riesgo de resistencia del patógeno y pueden complementar la utilización de tratamientos químicos y culturales convencionales (Elad & Stewart, 2007). Por otra parte vale mencionar que las levaduras generalmente no producen micotoxinas alergénicas, tienen requerimientos nutricionales simples, creciendo rápidamente en fermentadores con sustratos de bajo costo y son capaces de colonizar superficies secas durante largos períodos de tiempo, características todas estas importantes para un control más sostenible de la enfermedad en cosecha y postcosecha (Chanchaichaovivat et al., 2008; Wisniewsky et al., 2007). Varios prototipos de formulación a base de bacterias (Wang et al., 2010) y levaduras (Droby et al., 2009; Abadias et al., 2003) han sido diseñados para el manejo de enfermedades de postcosecha. Incluso algunos biofungicidas han sido desarrollados comercialmente, como Candida oleophila, (Aspire®) y Cryptococcus albidus (Yield plus®), para el control biológico de agentes fitopatógenos de postcosecha como Penicillium sp. y Botrytis sp. en frutas, vegetales, ornamentales y plantas de tipo invernadero, los cuales compiten exitosamente por espacio y nutrientes y además no causan ningún efecto adverso a la salud humana (Janisiewicz & Korsten, 2002; Drobby & Lichter, 2007). 14

Uno de los retos para el desarrollo de un producto comercial a base de levaduras, es el desarrollo de una formulación que confiera estabilidad al producto en términos de viabilidad y actividad biocontroladora (Wisniewsky et al., 2007; Janisiewicz & Korsten, 2002). Existen formulaciones liquidas y sólidas (polvos humectables, granulos, liofilizados), las cuales poseen propiedades diferentes dependiendo de las características fisiológicas del principio activo. Las formulaciones en forma de gránulos, permiten la liberación controlada y brindan una mayor protección del principio activo a ambientes extremos, proporcionando una mayor persistencia en campo (Kinay & Yildiz, 2008) Teniendo en cuenta lo anterior, en este estudio se propone el desarrollo de un prototipo de formulación sólida a base células de la cepa Lv20 de Rhodotorula mucilaginosa previamente aislada de la filosfera de mora de castilla (Medina et al., 2009), seleccionada y evaluada en función de su capacidad controladora del fitopatógeno B. cinerea en rosas de corte.

Materiales y métodos Aislamiento de levadura. La levadura Lv20 (R. mucilaginosa) con potencial biocontrolador contra B. cinerea, fue aislada de la filosfera de plantas sanas de cultivos de mora de castilla Rubus glaucus del municipio de Granada del departamento de Cundinamarca, Colombia (Medina et al., 2009), pertenece a la colección de microorganismos del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá. Producción de Biomasa. La producción de la cepa, se realizó en caldo Sabouraud dextrosa (CSD) (Difco®), con pH ajustado a 5,6, en un volumen de 25 mL dispuesto en matraces erlenmeyer de 250 mL de capacidad, partiendo de un inoculo inicial de 1x106 células. mL-1, y se dejaron en agitación a 150 rpm y 29 °C por 48 h. Transcurrido ese tiempo se realizó recuento en cámara de Neubauer para la determinación de la concentración final. Selección y evaluación de excipientes. Con el objeto de identificar los polímeros que confirieran estabilidad en términos de viabilidad y pureza, se realizó la selección de cinco componentes poliméricos, reportados en estudios previos. Tres son derivados de la celulosa como la hidroxipropil metil celulosa (P1) (HPMC), carboximetil celulosa (P2) (CMC) y metil celulosa (P3) (MC), uno derivado del alginato (P4) y un polímero soluble en agua como la polivinilpirrolidona (P5) (Bashan, 1986; Young et al., 2006; Suvorova et al., 1999; Fernández et al., 2009; Sánchez et al., 2010; Hafeez et al., 1991; Tittabutra et al., 2007). Después de realizar la selección de los polímeros, se procedió a determinar la viscosidad relativa a distintas concentraciones, con el fin de determinar cuál podría ser la más adecuada. Soluciones con concentraciones diferentes de cada polímero en estudio fueron

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preparadas por triplicado y se determinó el tiempo de desplazamiento o salida de 8 mL desde una pipeta de vidrio de 10mL de volumen total. Como tratamiento control se calculó el tiempo de desplazamiento del agua durante el mismo procedimiento. Las tres mejores concentraciones para cada polímero en términos de viscosidad, fueron seleccionadas con el fin de realizar las pruebas de compatibilidad con la cepa de levadura. A partir de las pruebas de viscosidad se seleccionaron tres concentraciones por cada polímero (P1 y P4: 1.0%, 1.5%, y 2.0%; P2 y P3: 0.5%, 1.0%, 1.5% y P5: 1.0%, 5.0% y 10%), con el fin de determinar la compatibilidad inicial con la levadura, para su posterior formulación. La biomasa microbiana obtenida luego de 48 h de crecimiento en caldo Sabouraud dextrosa (CSD), se recuperó por centrifugación haciendo dos lavados con agua destilada estéril (ADE). Luego, se preparó una suspensión, a una concentración de 1x109 células.mL-1 de principio activo, determinada por conteo en cámara de Neubauer, y resuspendiendo la biomasa celular a la concentración mencionada para cada polímero. Cada uno de los polímeros se preparó por triplicado, en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL, esta suspensión se incubo por 48 h a 25°C. Pasado este tiempo, se procedió a determinar el recuento de células viables en términos de unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro, mediante la técnica de diluciones seriadas por microgota sembrando cuatro réplicas de 20 µL en agar PDA de cada una de las diluciones realizadas. Evaluación de mezclas de polímeros. Con el objeto de determinar el efecto de la mezcla de los mejores polímeros seleccionados, sobre la viabilidad de las células de la levadura Lv20, se seleccionaron dos polímeros, (polímero 1 (P1) – 1%- y polímero 5 (P5) -10%-), con el fin de hacer mezclas que permitieran dar una estabilidad a las cepas de levadura durante su formulación. Las mezclas de los polímeros fueron en proporciones de 50:50 y 25:75, en un volumen de 1mL dispuesto en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL y por triplicado. Igualmente, se determinó la viabilidad de las cepas con los polímeros individuales. Se procedió a realizar la estimación de la viabilidad de las células, haciendo diluciones seriadas y la posterior siembra de gotas de 20 µL en medio PDA, como se describió anteriormente. Finalmente, se evaluó la viabilidad de las células a los 2, 10, 20, 60 y 90 días de incubación a 25 °C.

Desarrollo de prototipo de formulación sólida Prueba de disolución del núcleo del prototipo de formulación. Una vez seleccionados los polímeros que aportarían características de estabilidad y miscibilidad al prototipo de formulación granular, se seleccionaron 3 azúcares (sacarosa, dextrosa y manitol) para evaluar su capacidad como núcleo dentro de la formulación. Para lograr este objetivo se determinó la miscibilidad en agua de cada uno de estos azúcares pesando 250

mg, que se agregaron a 25 mL de agua destilada. Se tomó el tiempo en segundos, desde el momento en el que se agregó el azúcar hasta su completa disolución, como control se empleó urea gracias a sus propiedades de rápida disolución. Posteriormente se realizó el mismo procedimiento con los prototipos de formulación con los 3 núcleos distintos. Desarrollo de la formulación granulada. Después de obtener el crecimiento de biomasa, luego de su incubación en CSD a 29°C por 48 h, se procedió a ajustar la concentración celular a 1x109 células.mL-1, y se preparó una suspensión, con la mezcla 50:50 de los polímeros (P1 y P5) evaluados previamente. Posteriormente se pesaron 10 g de cada uno de los azúcares seleccionados y se agregó el volumen de suspensión necesario para que cada azúcar formara una masa húmeda con consistencia pastosa que permitiera su paso por un tamiz con un tamaño de poro de 1 mm de diámetro, con el fin de formar gránulos. Posterior a esto, se seleccionó el prototipo de formulación con la viabilidad más alta, y se midió el porcentaje de humedad en el tiempo hasta el día 60, empleando la balanza analizadora de humedad OHAUS® MB 45. La estabilidad de cada prototipo de formulación se evaluó en términos de la viabilidad de las levaduras en función del tiempo, por medio de recuento en gota en medio PDA, descrito antes. Este parámetro se midió en el primer día de elaboración, lo cual equivale a la concentración inicial del prototipo de formulación y posteriormente a los 15, 30, 60 y 90 días de almacenamiento a 4 y 25 °C para la cepa Lv20. Evaluación de actividad biocontroladora in vivo en rosas variedad Vendela tipo exportación. Para esta fase se evaluaron en términos de la actividad biocontroladora dos prototipos de formulación almacenados durante 100 días a 4°C+1 y 25°C+1. Para estos prototipos se empleó la cepa Lv20 como principio activo, con los polímeros P1 (1%):P5 (10%), en una proporción de (50:50) respectivamente, y manitol como azúcar para formar el núcleo del granulo de formulación. Como controles de la actividad biocontroladora de la formulación, se empleó una suspensión celular de la cepa Lv20 fresca y otra suspensión recién formulada con únicamente 10 días de almacenamiento a 4 °C. Así mismo, se empleó un control de enfermedad (testigo absoluto), en el cual únicamente se aplicó el hongo B. cinerea, y otro donde únicamente se inoculó ADE (testigo relativo), con el objeto de determinar el nivel de enfermedad provocada por la infestación natural de B. cinerea. Todos los prototipos de formulación se disolvieron en ADE para una concentración de principio activo 1x106 células.mL-1. De cada una de las suspensiones preparadas, se aplicaron 5 mL por flor por todo el perímetro de la flor, empleando un atomizador de jardinería. Cada tratamiento consistió en tres réplicas de 5 rosas cada una, las cuales fueron puestas en recipientes plásticos con

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1L de capacidad, previamente preparados con 900 mL de agua con hipoclorito al 0,1%, los cuales fueron dispuestos en anaqueles cubiertos con una cortina plástica para favorecer las condiciones de humedad. Los anaqueles se encontraban en un cuarto con regulación de fotoperiodo de 12:12 horas luz - oscuridad a temperatura ambiente de 20+2°C. Una vez aplicados los tratamientos, y pasadas 24 horas, se inoculó por el perímetro de la flor, aplicando 5 mL de una suspensión de conidias del hongo B. cinerea en agua destilada estéril, a una concentración de 1x104 conidias.mL-1. El control de enfermedad consistió en la aplicación de las esporas de B. cinerea únicamente, posteriormente se cubrió cada flor con una bolsa plástica con el fin de generar condiciones de alta humedad y de esta forma favorecer la infección del

agente fitopatógeno. Todos los tratamientos se almacenaron bajo las mismas condiciones durante 5 días. El efecto del prototipo de formulación sobre el desarrollo de la enfermedad de B. cinerea, se evaluó mediante la determinación de la severidad de la enfermedad, a los 5 días de inoculación del agente fitopatógeno. La severidad de los síntomas fue determinada como una medida del estado de desarrollo de la enfermedad en cada flor, aplicando la escala de severidad descrita a continuación. Nivel 0 (flor completamente sana sin infección), Nivel 1 (daño del 0.1 al 25.0% del área de la flor infectada), Nivel 2 (daño del 25.1 al 50.0% del área de la flor infectada), Nivel 3 (daño del 50.1 al 75.0% del área de la flor infectada) y Nivel 4 (daño del 75.1 al 100% del área de la flor infectada) (figura 1).

Figura 1. Escala de severidad de la infección de B. cinerea en rosas de corte de Rosa sp cv Vendela.

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El índice de severidad fue calculado mediante la fórmula desarrollada por Dick et al. (1999): IS

0(n0) 1(n1) 2(n2) 3(n3) 4(n4) n0 n1 n2 n3 n4

De donde: IS = Índice de Severidad n0 = Número de flores afectadas en el Nivel 0 de severidad n1 = Número de flores afectadas en el Nivel 1 de severidad n2 = Número de flores afectadas en el Nivel 2 de severidad n3 = Número de flores afectadas en el Nivel 3 de severidad n4 = Número de flores afectadas en el Nivel 4 de severidad.

Trascurridos los 5 días de incubación se realizó un análisis destructivo para determinar el porcentaje de pétalos con lesiones en los 10 pétalos más externos de cada flor, siguiendo la escala de severidad descrita por Medina et al., (2009) y empleando el índice (IS) descrito arriba. Por cada flor de las tres réplicas, se hizo la lectura de 10 pétalos para un total de 150 pétalos por tratamiento.

superiores estadísticamente significativos (P<0.05) en relación a los resultados con ADE, con un recuento celular entre 2,7x109 y 1.20x1010 células.mL-1, para las diferentes concentraciones evaluadas de los polímeros 1, 2 y 4. El polímero 3, presentó valores aún más altos (P < 0.05) de 2,2x1010 y 5,5x1010 células.mL-1, para la concentración de 0,5% y 1,0% respectivamente, mostrando incrementos en más de 10 veces en el recuento celular en relación al punto de partida del prototipo de formulación (figura 2). Estos resultados indican que los microorganismos incubados en presencia de los polímeros orgánicos a base de polisacáridos, mantuvieron e incluso incrementaron la viabilidad celular durante el periodo de incubación, contrario a la disminución encontrada en el control de agua, lo cual sugiere que dichos polímeros pueden ser empleados como sustrato nutricional por la cepa de R. mucilaginosa Lv20 (figura 1). Por otra parte, el tratamiento con el polímero 5 presentó concentraciones de 2,87x108 células.mL-1, estadísticamente similares al control con ADE.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS (Statistical Program for the Social Sciences) versión 11.5. Se empleó la tabla de ANOVA para el análisis de homogeneidad de varianzas y se realizó una prueba de comparaciones múltiples de Tukey con un intervalo de confianza del 95% y un (P < 0.05).

Resultados Viabilidad de la cepa Lv20 con excipientes seleccionados en prototipos de formulación líquida Los cinco polímeros seleccionados se evaluaron en términos de viscosidad a diferentes concentraciones (0.25%, 0.50%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 5.0% y 10%), descartando aquellas concentraciones cuyo tiempo de desplazamiento de 8 mL de solución, a través de una pipeta de 10 mL superaba los 60 s, por considerar que estos valores representaba viscosidades superiores a las recomendadas para una formulación líquida (Barbosa, 2014 comunicación personal). Con las concentraciones seleccionadas para cada polímero (1.0, 1.5 y 2.0% para P1 y P4; de 0.5, 1.0 y 1.5% para P2; 0.5 y 1.0% para P3; y de 1.0, 5.0 y 10.0% para P5), se procedió a la determinación de la compatibilidad de los polímeros con las levaduras seleccionadas. Al término de 48 h de incubación de la suspensión de la levadura en cada una de los polímeros seleccionados, a sus respectivas concentraciones, se determinó el efecto sobre la viabilidad celular. Los resultados indican que el control con ADE se encontraba con un recuento de células viables del orden de 6,0x108 células.mL-1, disminuyendo la población en relación al inoculo inicial (1,0x109 células.mL-1). Por otra parte, los tratamientos con los polímeros mostraron valores

Figura 2. Viabilidad celular de los diferentes tratamientos de las cepas Lv20 a las 48 horas de incubación con 5 polímeros (P) a diferentes concentraciones y un control de agua destilada estéril. Los datos corresponden a la media de un tratamiento con tres réplicas. Letras distintas indican diferencias significativas en la prueba de comparaciones múltiples de Tukey 95%.

Viabilidad de cepas de levadura con mezcla de polímeros Los resultados de la viabilidad a las 48 h, permitieron seleccionar el polímero 1 ya que no afecta la viabilidad celular a las 48 h de incubación y por el contrario incrementa el recuento celular y el polímero 5 ya que si bien disminuye la viabilidad celular, puede aportar una mayor cobertura en la formulación final. Con el objeto de determinar el potencial de estos polímeros solos y en mezcla entre ellos, a una proporción de 50:50 y 25:50 (P1:P5), se decidió evaluar la viabilidad celular contra el tiempo de dichos prototipos de formulación. Los tratamientos a la concentraciones de P1 al 1% y las mezclas de este con P5 (50:50 y 25:75) muestran una gran estabilidad a través del tiempo, terminando con concentraciones estadísticamente similares a

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la concentración inicial (1,00x109 células.mL-1). Estas concentraciones son superiores al tratamiento control con ADE, que presentó una caída constante en la viabilidad celular desde el segundo día de incubación hasta el día 90 cuando la concentración cae a 1,47x106 células.mL-1. Por otra parte, los tratamientos a base de P5, muestran una caída en la viabilidad celular de alrededor de 10 veces en las tres concentraciones evaluadas. Es importante anotar que el tratamiento con el polímero 5 al 1%, se contaminó después del día 20 de evaluación, por lo que fue descartado del análisis (tabla 1). Sin embargo, las viabilidades en los prototipos de formulación a base de P5 restantes, mostraron un incremento hacia el día 20 y 60 de evaluación, para luego volver a caer, terminando con los valores de viabilidad más bajo con 2,60x108 y 6,60x108 células.mL-1 para las concentraciones de 5% y 10% respectivamente (tabla 1).

granulada, empleando el principio activo previamente suspendido en los polímeros (mezcla P1:P5 50:50) y se realizó nuevamente la prueba de disolución, encontrando que los tiempos se incrementaron casi al doble, con 60,1, 30,1 y 44,7 para sacarosa, manitol y dextrosa respectivamente. Esta evaluación se tomó con el fin de asociar el tiempo, con la capacidad de disgregación del sólido antes y después de la formulación, determinando así características esenciales de un producto sólido para la aplicación en campo. Determinación de la viabilidad celular en los prototipos granulados De acuerdo a los resultados obtenidos en términos de la disolución de los prototipos de formulación, se evaluó la viabilidad celular del principio activo con los tres agentes de nucleación contra el tiempo. La tabla 2 indica que los prototipos a base de dextrosa y sacarosa redujeron considerablemente la viabilidad celular de la cepa. Con el prototipo de formulación a base de dextrosa, la cepa Lv20 tuvo una concentración inicial de 4,1x109 células.g-1, mientras la evaluación hasta el día 60, mostró una concentración de 5,3x104 células.g-1 y de 6,2x103 células.g-1 en el almacenamiento a 4 °C y 25 °C respectivamente. Debido a que estos recuentos no corresponden a valores que puedan tener actividad biocontroladora, se decidió suspender la evaluación de la viabilidad de estos prototipos. En la evaluación con el prototipo de formulación a base de sacarosa, se tuvo una concentración inicial de 6,3x109 células.g-1 y a los 90 días de evaluación esta concentración bajo a 5,40x105 y 3,07x104 células.g-1 para la temperatura de almacenamiento de 4°C y 25°C, respectivamente (tabla 2).

Desarrollo de prototipos de formulación sólida Prueba de disolución del prototipo de formulación con el núcleo de granulación Con el objeto de desarrollar un prototipo de formulación granulado se seleccionaron tres azúcares (sacarosa, dextrosa y manitol), que permitiera desarrollar un núcleo de formulación. Para este propósito se midió el tiempo (en segundos) de la disolución en agua de los azúcares seleccionados, empleando como control la urea, por su rápida disolución, que en este caso fue de 9,7 segundos. Los tiempos de disolución encontrados fueron de 35,6, 16.1 y 23,4 segundos para la sacarosa, manitol y dextrosa respectivamente. Con estos resultados se llevó a cabo el prototipo de formulación

Tabla 1. Viabilidad celular en el tiempo de los tratamientos con P 1 y P 5 a diferentes concentraciones y mezclas de P1:P5 (50:50 y 25:75), para la cepa Lv20, durante 90 días de almacenamiento a 25°C. Tratamiento

Concentración

20 días

60 días

90 días

1,12 x109

9,07 x108

5,80 x107

1,47 x106

1.0%

2,47 x109

1,33 x109

4,23 x109

1,93 x108

1,53 x108

1.5%

1,58 x109

2,9 x109

5,07 x109

2,50 x108

2.0%

2,53 x109

5,20 x109

7,50 x109

2,23 x109

1,57 x109

50-50

1,23 x109

3,83 x109

2,53 x109

1,27 x109

1,90 x109

25-75

1,97 x109

3,17 x109

2,67 x109

1,32 x109

2,25 x109

1.0%

2,00 x108

5,00 x108

1,10 x109

5.0%

1,63 x108

2,67 x108

1,56 x109

4,93 x109

2,60 x108

10%

1,28 x108

1,60 x109

3,40 x109

1,77 x109

6,60 x108

Mezcla

Polímero 5

10 días

9,83 x108

Control

Polímero 1

2 días

C: contaminación. Letras distintas indican diferencias significativas en la prueba de comparaciones múltiples de Tukey 95%.

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Tabla 2. Evaluación en el tiempo de la concentración celular de prototipos de formulación sólida con la cepa R. mucilaginosa (LvGr20), a base de los 3 azúcares usados como núcleos de formulación. A. temperatura de 4°C y B. temperatura de 25°C. A. Concentración celular (UFC.g-1) de la Lv20 almacenada a 4°C Tratamiento Día 1

Día 15

Día 30

Día 60

Día 90

Manitol

4,20x109

1,87x109

7,50x108

2,13 x108

1,20 x108

Sacarosa

6,30x109

1,00x109

7,40 x107

2,30 x106

5,40 x105

Dextrosa

4,10x109

4,90x105

5,70 x104

5,30 x104

B. Concentración celular (UFC.g-1) de la Lv20 almacenada a 25°C Manitol

4,20 x109

1,27 x109

2,73 x108

1,77 x108

4,77 x107

Sacarosa

6,30 x109

2,50 x106

7,40 x105

4,10 x104

3,07 x104

Dextrosa

4,10 x109

2,50 x105

1,20 x104

6,20 x103

SE: Se suspende evaluación ya que la concentración celular no es apta para obtener niveles de control sobre el patógeno NV: No se encontró registro de viabilidad

El prototipo de formulación a base de Manitol, inicio con una concentración celular de 4,2x109 células.g-1 y fue evaluado hasta el día 90, mostrando viabilidades del orden de 1,2x108 células.g-1 y 4,8x107 células.g-1 a 4 oC y 25 °C respectivamente a los 90 días de almacenamiento. Por otra parte los porcentajes de humedad variaron entre prototipos de formulación y temperatura de almacenamiento ya que a 4 °C presentaron humedades cercanas al 14% mientras que a 25 oC la humedad presentó rangos entre 14 y 1,2% (tabla 3). Evaluación de actividad biocontroladora in vivo en rosas variedad vendela tipo exportación Los resultados de la evaluación de viabilidad y pureza, permitieron seleccionar los prototipos de formulación basados en las mezclas de P1:P5 (50:50) como agente para resuspender el principio activo, y manitol como agente nucleador almacenados tanto a 4 °C y 25 °C, con el objeto de evaluar el potencial biocontrolador de los prototipos de formulación. Las condiciones del ensayo fueron altamente conducentes de enfermedad, ya que se empleó la infestación natural, más una infes-

tación artificial de B. cinerea (10.000 propágulos por unidad experimental), lo que condujo a que el porcentaje de incidencia del ensayo fuera del 100% para todos los tratamientos. Por tal motivo se decidió estimar el potencial biocontrolador de los prototipos de formulación a través del índice de severidad por flor y por pétalo para los 10 pétalos más externos de cada flor. Al realizar la lectura del índice de severidad del día 5 en la flor completa, los resultados muestran que el control positivo de enfermedad presentó un promedio en el índice de severidad de 3.1. Este tratamiento no mostró diferencias significativas con el tratamiento de la formulación a 25 °C, que obtuvo un nivel de severidad de 3.0. Por otra parte, la formulación con 100 días de almacenamiento a 4 °C, mostró un promedio en el índice de severidad de 2.0, mientras que la formulación nueva con solo 10 días de almacenamiento obtuvo un nivel de 2.2, estas dos últimas no tuvieron diferencias estadísticas entre sí, ni con la levadura sin formular, que presentó un nivel de 2.5 en la escala de severidad y diferencias significativas (P < 0.05) con los demás tratamientos (figura 3).

Tabla 3. Porcentaje de humedad en función del tiempo y temperatura de almacenamiento de los prototipos de formulación a base de manitol para R. mucilaginosa Lv20. A. porcentaje de humedad a 4°C, B. porcentaje de humedad 25°C. A. Porcentaje de humedad de prototipos de formulación a 4°C Día 1 14,47

Día 15 14,22

Día 30 14,92

Día 60 15,01

B. Porcentaje de humedad de prototipos de formulación a 25°C Día 1 14,47

Día 15 8,26

Día 30 1,93

Día 60 1,21

Letras distintas indican diferencias significativas en la prueba de comparaciones múltiples de Tukey 95%

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Figura 3. Nivel de severidad en flor completa al día 5 de lectura, los datos corresponden a la media de un tratamiento con tres réplicas. Testigo relativo: aplicación de ADE; un control positivo de enfermedad (testigo absoluto) con la aplicación del patógeno; fórmula 4 °C y 25 °C: fórmula con 100 días de almacenamiento a 4 °C y 25 °C respectivamente; formula nueva: formula nueva con 10 días de almacenamiento a 4 °C; y un control de levadura sin formular (Lv20). Letras distintas indican diferencias significativas en la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (95%).

En cuanto al porcentaje de pétalos infectados por flor evaluado en los diez pétalos más externos (figura 4), merece mencionar que las rosas inoculadas presentaron en promedio el 86,6% de pétalos infectados, indicando un alto nivel de virulencia de la cepa de B. cinerea empleada, bajo las condiciones analizadas. Por otra parte, el control negativo mostró un porcentaje de pétalos infectados del 14,6%, indicando que ese era el nivel de infestación con el que venían las flores del invernadero comercial. En relación a los tratamientos, llama la atención que la formulación almacenada a 25°C tuvo un porcentaje de infección del 74,6%, el cual es estadísticamente similar al control de enfermedad, indicando ausencia de actividad biocontroladora. La levadura sin formulación presentó un valor de porcentaje de infección del 70%, mientras que la fórmula almacenada por 100 días a 4°C un valor de 47,0% y la formulación nueva con solo 10 días de almacenamiento obtuvo un promedio de 48,7% (figura 4). Luego de analizar el porcentaje de infección de los 10 pétalos más externos de cada flor, se procedió a analizar la severidad en cada uno de dichos pétalos. El nivel de severidad para el control positivo, estuvo en un promedio de nivel 1.8, el control negativo de 0,26, mostrando diferencias estadísticas (p < 0.05) con los demás tratamientos. La levadura sin formular tuvo un nivel de 1.36, la fórmula de 100 días de almacenamiento a 4°C un nivel de 1, la formulación nueva obtuvo un nivel de 1.12 sin diferencias entre si y la formulación almacenada a 25°C, obtuvo un nivel de severidad de 1.43, sin presentar diferencias con el control del patógeno (figura 5). 20

Figura 4. Porcentaje de pétalos infectados por flor, de los 10 pétalos más externos de las Rosas sp. cv Vendela. Los tratamientos son iguales a la leyenda de la figura 3. Los datos corresponden a la media de un tratamiento con tres réplicas. Letras distintas indican diferencias significativas en la prueba de comparaciones múltiples de Tukey 95%.

Figura 5. Nivel de severidad de pétalos infectados por flor, de los 10 pétalos más externos de las Rosas sp. cv Vendela. Los tratamientos son iguales a la leyenda de la figura 3. Los datos corresponden a la media de un tratamiento con tres réplicas. Letras distintas indican diferencias significativas en la prueba de comparaciones múltiples de Tukey 95%.

Discusión En este trabajo se partió de un aislamiento de levadura filosférica previamente aislada y evaluada por su potencial biocontrolador (Medina et al., 2009), para el desarrollo de un prototipo de formulación granulado. Otros trabajos han desarrollado formulados granulados a base de levaduras filosféricas, empleando vehículos como talco o kaolin para el control de agentes fitopatógenos de postcosecha (Kinai & Yildiz, 2008). Sin embargo, el uso de polímeros en formulados sólidos han sido empleados en combinación con bacterias (Bashan et al., 2002), pero su uso en levaduras como principio activo ha sido muy limitado (PatiñoVera et al., 2005). La primera fase de este estudio consistió en identificar la compatibilidad de 5 polímeros diferentes con la cepa de R. mucilaginosa Lv20. Los cuatro polímeros

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orgánicos a base de polisacáridos evaluados, no únicamente son compatibles con dicho aislamiento, sino que en la cepa se presentó un incremento en biomasa celular, con diferencias estadísticamente significativas (P<0.05), al menos cuando son incubadas durante 48 horas a 25°C. El incremento en biomasa mencionado si bien es aparentemente atractivo para efectos de mantener la viabilidad celular de los microorganismos, también puede ser contraproducente para la formulación. En este sentido Patiño-Vera et al. (2005), reportaron la caída dramática en viabilidad (4-5 órdenes de magnitud en un mes), cuando la concentración inicial de un formulado, a base de la cepa BMH129 de Rhodotorula minuta, se preparó en el orden de 1010 células.mL-1, en comparación a 109 células.mL-1, donde pierde alrededor de 2 órdenes de magnitud en seis meses de almacenamiento. Situación similar ha sido reportada en formulaciones con Pichia anolama (Melin et al., 2007), donde los autores sugieren que el efecto negativo sobre la viabilidad celular, reside en la acumulación de metabolitos tóxicos producidos por la biomasa celular. Estos resultados preliminares nos llevaron a la siguiente fase del estudio, la cual consistió en la evaluación de mezclas de polímeros, de tal forma que pudiésemos obtener los beneficios de poblaciones altas en el formulado a base de polímeros orgánicos, pero controladas al mezclarlo con el polímero sintético 5 (PVP). Este último polímero mantiene la viabilidad celular estable, pero además le confiere otro tipo de propiedades al prototipo de formulación, como un mejor recubrimiento, gracias a la formación de una película sobre la superficie del pétalo, con lo cual se busca mejorar la actividad de las levaduras (Paau, 1998; Lloyd, 1983). Los resultados obtenidos en términos de viabilidad en las formulaciones líquidas empleando únicamente los polímeros 1 y 5 con sus mezclas, mostraron que los tratamientos que lograron una mayor estabilidad hasta 90 días de almacenamiento a 25°C con la cepa Lv20, fueron el polímero 1 al 1% y las mezclas 50-50 y 25-75 entre los polímeros 1 (1%) y 5 (10%) respectivamente (P < 0.05). Algunos estudios han reportado el uso de biopolímeros para la formulación de inoculantes bacterianos esporulados (Bacillus sp.) y no esporulados (Azospirillium y Azotobacter), con resultados de viabilidad superiores a 3.5x107 células.mL-1 luego de más de un año de almacenamiento a 30 °C (Amalraj et al., 2013). Incluso se han reportado polímeros para el desarrollo de bioinoculantes a base de bacterias, donde mezclas entre distintos polímeros sintéticos han permitido obtener niveles de supervivencia prolongados en microorganismos como Bradyrhizobium elkanii (Denardin & Freire, 2000). En el caso de las levaduras se ha evaluado el uso de azúcares (e.i trehalosa) (Li et al., 2008), polialcoles (e.i glicerol), incluso algunos polisacáridos como goma de xantana y alginato de sodio (Patiño-Vera et al., 2005; Kinay & Yildiz, 2008), o se ha manipulado la actividad de agua para conferirle ma-

yor estabilidad a las cepas durante el almacenamiento (Schilder et al., 2011; Teixido et al., 1998), entre otras estrategias para la estabilización de las formulaciones. Una vez identificadas las mezclas más adecuadas para conferir estabilidad al prototipo de formulación, se buscó determinar el azúcar que sirviera tanto como agente preservativo para evitar contaminación microbiana, así como dispersante al momento de disolver la formulación en agua (Burges & Jones, 1998). De los tres azúcares evaluados, se escogió el manitol como base del prototipo, debido a que la viabilidad encontrada fue más alta que la encontrada con los otros dos núcleos (sacarosa y glucosa). Es bien sabido que algunos azúcares (e.i trehalosa, lactosa), utilizados para formulaciones, pueden generar un efecto protector, evitando la desnaturalización de proteínas, durante procesos de secado o deshidratación (Li et al., 2008), o incluso cuando son empleadas en formulaciones líquidas (Abadias et al., 2003; Melin et al., 2011). El efecto de dichos azúcares sobre la tolerancia a las distintas condiciones de almacenamiento, puede variar dependiendo del tipo de microorganismo (Melin et al., 2011). En este sentido, Melin et al. (2007), reportan que el empleo de sacarosa o trehalosa como crioprotector en un proceso de liofilización, no mostraron diferencias estadísticamente significativas en la viabilidad celular después de 6 meses de almacenamiento en varias formulaciones de P. anomala. Sin embargo, en este estudio los prototipos de formulación con sacarosa generaron un detrimento de la viabilidad celular bajo las condiciones evaluadas. Las diferencias del efecto de la sacarosa sobre la viabilidad celular de Rhodotorula o Pichia puede ser debido a diferencias por la fisiología de los microorganismos o en el procedimiento realizado, estudios posteriores deben ser desarrollados para poder sacar conclusiones al respecto. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la viabilidad celular entre temperaturas de almacenamiento a 4 y 25°C, entre el día 1 y el 15 y entre el día 60 y 90 de incubación para el prototipo de formulación con manitol. Sin embargo, los resultados muestran una tendencia en la que a menor temperatura mayor viabilidad. Distintos estudios han demostrado que el almacenamiento a bajas temperaturas puede generar una estabilidad mayor a las células, debido a que estas disminuyen su metabolismo, previniendo así la producción de metabolitos tóxicos (Melin et al., 2006; Kinay & Yildiz, 2008). En un estudio previo, donde se almacenan formulaciones líquidas a base de P. anómala a 10°C, 20°C y 30°C durante 12 meses, se logra evidenciar que el porcentaje de viabilidad en el almacenamiento a 10°C es un 30% superior al encontrado en el almacenamiento a 30°C, confirmando que la viabilidad celular permanece más estable a bajas temperaturas (Melin et al., 2007). Cañamas et al. (2011) reportan un prototipo de formulación a base de Candida sake, para el control de B. cinerea en uvas, donde el prototipo almacenado a 4 °C logra

Formulación sólida a base de Rhodotorula 21

reducir la incidencia de enfermedad en un 50%, confirmando que el almacenamiento a bajas temperaturas proporciona a las células una mayor estabilidad y nivel de control que los que se pueden obtener con un almacenamiento a temperaturas elevadas (Cañamas et. al., 2011). Los porcentajes de humedad reportados en este trabajo, variaron de acuerdo al tiempo y la temperatura de almacenamiento. Los prototipos de formulación a base de la cepa Lv20 mostraron porcentajes cercanos al 14% en 4°C y cercanos al 1% en la temperatura de 25 °C, los cuales son significativamente diferentes entre sí (P < 0.05). El porcentaje de humedad de una formulación comercial solida es una característica crítica, debido a que altos porcentajes de humedad, pueden generar compactación e inconvenientes en la manipulación, así como también contaminación por otros microorganismos ajenos al sistema (Burges, 1998). Incluso la respuesta fisiológica al contenido de humedad puede variar entre aislamientos microbianos, siendo posiblemente una fuente importante de la variación en viabilidad encontrada bajo diferentes prototipos de formulación (Burges, 1998). Así mismo, porcentajes bajos de humedad, pueden afectar la viabilidad celular a expensas de una reducción en términos de actividad de agua, a niveles por debajo de los necesarios para mantener la viabilidad celular (Grant, 2004). Dadas las diferencias encontradas en términos de los porcentajes de humedad de los prototipos de formulación almacenados a 4°C y 25°C, muy posiblemente las diferencias encontradas en la viabilidad celular, estén determinadas no únicamente por efecto de la temperatura, como se explicó arriba, sino debido al bajo contenido de agua disponible en la formulación, lo cual pudo afectar la viabilidad celular. Estudios posteriores se deben llevar a cabo para determinar el peso de cada una de estas variables en el deterioro de la viabilidad celular de las levaduras bajo estudio. La eficacia en el control a base de levaduras varía de acuerdo al patosistema estudiado y los diferentes tratamientos empleados para el diseño de los prototipos de formulación. La aplicación de C. guillermondii y P. anómala para el control de una infestación natural (mayoritariamente a base de B. cinerea), causante de la enfermedad de pudrición del tomate, mostraron una disminución cercana al 50% en términos de incidencia y severidad en comparación al control sin aplicar (Zong et al., 2010). De forma similar, prototipos de C. sake formulados con diferentes concentraciones de trehalosa y almacenada por 4 meses a 4°C, mostraron una reducción en incidencia en manzanas inoculadas con una población de 104 conidias.mL-1 de P. expansum, entre 56% y 70%, similar a las células frescas sin formular (Abadias et al., 2003). En otro estudio, el efecto combinado de C. laurentii y R. glutinis también resultó en el más alto nivel de eficacia de control biológico contra P. expansum, reduciendo los índices de la enfermedad a 45 y 56%, respectivamente, en com22

paración con 94 y 81% en el control no tratado (Li et al., 2008). En este trabajo se logró la disminución de los síntomas de la enfermedad en un 39% en Rosas sp. cv Vendela, en relación al control de enfermedad que mostro un porcentaje de pétalos infectados de 86%, con un prototipo de formulación a base de la cepa Lv20 almacenada a 4°C durante 100 días, logrando niveles de control similares a la cepa recién formulada.

Conclusión El prototipo de formulación a base de R. mucilaginosa Lv20, resuspendida en una mezcla de P1:P5 (50:50) y empleando manitol como agente nucleador en una formulación granulada, mantuvo una viabilidad suficiente a los 100 días de almacenamiento a 4oC para mostrar actividad biocontroladora contra B. cinerea en rosas de corte. Es necesario realizar estudios de almacenamiento más prolongados, sin embargo el prototipo de formulación aquí diseñado es promisorio para el manejo de la enfermedad del moho gris en rosas de corte tipo exportación, especialmente si se emplea dentro del ciclo de cultivo, como una estrategia de rotación de productos de síntesis química.

Agradecimientos Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Ciencia Tecnología e Innovación Colciencias por su apoyo financiero a través del Contrato RC: #387 – 2011, para el desarrollo de la presente investigación.

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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

PCR en tiempo real: una metodología útil para la detección y cuantificación de granulovirus Real Time PCR: a useful methodology for detection and quantitation of granulovirus Gloria Barrera**, Jazmín Murcia*, Jorge Cerón*, Paola Cuartas**, Cristian Guzmán*, Laura Villamizar** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61514

Resumen El uso de baculovirus como agentes de control biológico de insectos plaga, se ha convertido en una estrategia efectiva que se ha implementado gradualmente en diferentes sistemas productivos a nivel mundial. Para el desarrollo de un bioplaguicida a base de baculovirus, es necesario contar con una metodología para determinar el título viral en el producto en proceso y terminado. Para tal fin, en este trabajo se diseñó y optimizó una técnica de cuantificación viral (Betabaculovirus) mediante PCR cuantitativo (q-PCR). Se utilizó una sonda TaqMan diseñada sobre el gen de granulina, altamente conservado. Para la técnica de q-PCR se determinó la especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, encontrando que puede detectar y cuantificar aislamientos del género Betabaculovirus provenientes de cinco especies diferentes de insectos (granulovirus de Tecia solanivora, Phthorimaea operculella, Erinnyis ello, Tuta absoluta y Spodoptera frugiperda) incluso de diferente origen geográfico, pero no detecta aislamientos del género Alphabaculovirus (nucleopoliedrovirus de Spodoptera ornithogalli, Diatraea saccharalis o S. frugiperda). El límite mínimo de detección de la técnica fue de 6,4 x 10-4 ng de ADN, lo que equivale a 1,25 x 105 copias del gen. Así mismo, la variación intra e inter ensayos fue mínima, demostrando la reproducibilidad de la misma. La aplicabilidad de la técnica fue evaluada para la detección de granulovirus en muestras de larva, suelo, y para determinar la concentración viral en un bioplaguicida formulado como concentrado emulsionable. En conclusión, la técnica de q-PCR desarrollada fue reproducible, sensible y específica, con aplicabilidad en estudios de persistencia viral en campo, control de infecciones en crías de insectos y control de calidad de bioplaguicidas a base de betabaculovirus. Palabras clave: granulovirus, PCR cuantitativa, persistencia viral, control de calidad.

Abstract The use of baculovirus as a biocontrol agent is an effective strategy, which has been gradually implemented in different production systems worldwide. For the development of a biopesticide based on baculovirus, it is necessary to have a methodology to determine the viral concentration in the process and in the finished product. In this study, a technique for viral quantification by quantitative PCR (q-PCR) was designed and optimized; therefore we used a TaqMan probe designed on granulin gene which is highly conserved. The specificity, sensitivity and reproducibility of the technique were determined. The q-PCR was able to detect and quantify isolates from the genus Betabaculovirus from five different insects species (granulovirus from Tecia solanivora, Phthorimaea operculella, Erinnys ello, Tuta absoluta and Spodoptera frugiperda) even from different geographic origins, while other isolates of baculovirus as from the genus Alphabaculovirus (nucleopolyhedrovirus from Spodoptera ornithogalli, Diatraea saccharallis or S. frugiperda) were not detected. The minimum detection limit of the technique was 6.4 x 10-4 ng /µl of DNA, equivalent to 1.25 x 103 gene copies. Additionally, intraand inter-assays variation was minimal, demonstrating the reproducibility of technique. The applicability of the technique was evaluated for detecting granulovirus from samples of larva and soil, and to determine the virus concentration in the biopesticide formulated as emulsifiable concentrate. In conclusion, quantitative PCR was a technique reproducible, * **

Bacteriólogo. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. Ph.D. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. gbarrera@corpoica.org.co. (autor para correspondencia), lvillamizar@corpoica.org.co, pcuartas@corpoica.org.co

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sensitive and specific to allow viral persistence studies in field, viral infection control in rearing and quality control of a biopesticide based on betabaculovirus. Key words: granulovirus, quantitative PCR, viral persistence, quality control. Recibido: abril 5 de 2016 Aprobado: octubre 3 de 2016

Introducción Dentro de los virus entomopatógenos, uno de los grupos más estudiados es la familia Baculoviridae, la cual se encuentra dividida en cuatro géneros: Alphabaculovirus donde se clasifican nucleopoliedrovirus (NPV), Betabaculovirus donde se clasifican granulovirus (GV), ambos patógenos de insectos del orden Lepidoptera, Gammabaculovirus y Deltabaculovirus que agrupan GV y NPV patógenos de insectos del orden Hymenoptera y Diptera, respectivamente (ICTV, 2012). La mayoría de baculovirus han sido aislados de insectos lepidópteros y algunos pocos de dípteros e himenópteros (Martínez et al., 2012), a pesar de que existen aproximadamente 7600 especies de hospederos descritas para estos virus (Martignoni & Iwai, 1981). Dentro de la estructura de los GVs se encuentran los cuerpos de inclusión (OBs del inglés Occlusion Bodies) con forma de gránulo, que contienen los viriones (partículas infecciosas per os) dentro de una matriz de proteína que los protege de factores medioambientales deletéreos (Rorhman, 2010). La granulina es la proteína mayoritaria en estos gránulos y posee un rango de tamaño entre 26.000 y 28.000 daltons. Esta proteína es codificada por el gen gran (747 pb), altamente conservado en los genomas de los GVs, por lo que es ampliamente utilizado en estudios filogenéticos (Rohrman, 1986; Zanotto et al., 1993; De Moraes & Maruniak, 1997). A nivel mundial, se ha demostrado ampliamente la efectividad y el alto potencial de los GVs para el control biológico de diversas plagas de insectos (Valicente & Da Costa, 1995; Batista et al., 2001; Barreto et al., 2005; Villamizar et al., 2005). Estos virus a base de GVs poseen un estrecho rango de hospederos, lo cual representa una estrategia segura para la protección de otros insectos no blanco y organismos benéficos. De acuerdo con lo anterior, la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria-CORPOICA desarrolló un bioplaguicida a base de un granulovirus de Tecia solanivora, formulado como un concentrado emulsionable (CE) para el control de la polilla guatemalteca de la papa (Tecia solanivora, Povolny, 1973) en campo. Este bioplaguicida demostró su potencial reduciendo la población de larvas en un 96% en experimentos bajo condiciones controladas en casa malla y con una eficacia del 83% en campo (Gómez et al., 2011). Como parte del desarrollo de un bioplaguicida a base de baculovirus, es necesario contar con metodologías para la identificación molecular y cuantificación del

microorganismo (ingrediente activo) en diferentes puntos del proceso, metodologías que conforman parte del control de calidad y que son requeridas para adelantar también los estudios toxicológicos de las formulaciones indispensables para el proceso de registro (Guillon, 2003). Estas metodologías también son aplicables en estudios de bioprospección que incluyan la búsqueda de nuevos aislamientos así como en estudios de persistencia del virus en ensayos de campo. Actualmente, para la determinación y cuantificación de granulovirus se utilizan varias metodologías, entre ellas algunas cualitativas como la microscopia óptica de campo oscuro, pruebas de reproducción de síntomas virales, electroforesis en geles denaturantes de poliacrilamida y ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (Parola et al., 2003). Además, existen metodologías de carácter cuantitativo como la espectrofotometría (Zeddam et al., 2003) que es poco específica y posee baja sensibilidad, además de presentar limitaciones para cuantificar virus en muestras complejas como formulaciones o muestras de suelo (Graham et al., 2015). Las metodologías basadas en determinación de ADN son específicas y sensibles, especialmente la técnica de q-PCR. Algunos sistemas utilizan “agentes intercaladores fluorescentes” de la doble cadena de ADN, sin embargo, existe la posibilidad de producir falsos positivos si aparecen productos de PCR inespecíficos o dímeros de cebadores (Costa, 2004). Los sistemas que emplean diversos tipos de sondas fluorescentes (Taqman®, «molecular beacons” y “scorpions”) poseen la ventaja de hibridar únicamente en la secuencia del ADN diana. Particularmente, la sonda Taqman® es un oligonucleótido con fluorocromos en los dos extremos que hibrida en regiones internas y específicas de los productos de PCR (Didenko, 2001). Teniendo en cuenta la importancia de una técnica sensible y específica para la detección y cuantificación de granulovirus, el objetivo del presente trabajo fue diseñar una metodología basada en q-PCR para la búsqueda de cepas, seguimiento del virus en suelo y manufactura de un bioplaguicida. Para demostrar tres ejemplos de posibles aplicaciones de la técnica, se realizaron tres ensayos de detección, en larvas de la cría T. solanivora, en el bioplaguicida formulado a base de este virus y en muestras de suelo con aplicación del bioplaguicida.

Detección y cuantificación de betabaculovirus 25

Materiales y métodos

trofotometría en un equipo Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).

Virus Se emplearon suspensiones virales puras de los aislamientos utilizados TesoGV (GV de Tecia solanivora), PhopGV (GV de Phthorimaea. operculella), EeGV (GV de Erinis ello), SfGVBra (GV de Spodoptera frugiperda de Brasil), SfGVCol (GV de S. frugiperda de Colombia), TuabGV (GV de Tuta absoluta), SoNPV (NPV de Spodoptera ornithogalli), DsNPV (NPV de Diatraea saccharalis) y SfMNPV (NPV de S. frugiperda). La cuantificación de los cuerpos de inclusión por mL de los granulovirus (CI/mL) se realizó por espectrofotometría, empleando una curva de calibración previamente estandarizada (Gómez et al., 2009) y la cuantificación de CI/ml de los nucleopoliedrovirus se realizó mediante recuento directo en cámara de Neubauer en un microscopio óptico (40 X) (Caballero et al., 2001).

Extracción de ADN Para la extracción de ADN a partir de virus puro se utilizó el protocolo descrito por Caballero et al. (2001), con algunas modificaciones. Para tal fin, 100 µL de una suspensión viral ajustada a 108 CI/mL se mezcló con 100 µL de Na2CO3 (0,5 M) y 50 µL de SDS al 10%, a continuación se incubó durante 10 min a 60°C. El sobrenadante que contenía los viriones fue tratado con 50 µL de proteinasa K (10 mg/mL) durante 30 min a 50°C. La extracción de ADN viral se realizó mediante dos pases con fenol saturado y uno con cloroformo, utilizando centrifugaciones intermedias a 3000 rpm; la precipitación del ADN se realizó con etanol y acetato de sodio 3 M. Para la extracción de ADN a partir de larvas infectadas, previamente se realizó la purificación viral mediante maceración y homogenización de larvas con SDS al 0,1% (p/v). A partir de esta suspensión, se realizó la purificación de los cuerpos de inclusión virales mediante filtración por muselina para retirar el tejido grueso del insecto y centrifugaciones diferenciales utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa (Espinel-Correal et al., 2010). El ADN se extrajo como se describió anteriormente. Para las muestras de suelo, la extracción se realizó mediante el Kit comercial Power Soil de MOBIO (No. catálogo: 12888-50). Para esto, los viriones presentes en la muestras fueron liberados de los CI mediante la adición de Na2CO3 (0,5 M), después de la extracción de los ácidos húmicos con el Kit. La recuperación de ADN se realizó en membrana y la elución con Tris 10 mM. Para la extracción de ADN a partir del bioplaguicida a base del granulovirus VG003 formulado como un concentrado emulsionable (CE), primero se realizó la eliminación de los excipientes de formulación mediante la adición de hexano y posteriormente se realizó la extracción de ADN con cloroformo y etanol como se mencionó anteriormente (Caballero et al., 2001). La concentración de ADN fue estimada mediante espec26

Cebadores y sonda La sonda y los cebadores se diseñaron basados en la secuencia del gen de granulina de un aislamiento nativo, teniendo en cuenta su alineamiento con secuencias consignadas en el GENBANK, mediante la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) y seleccionando una región completamente homóloga entre las secuencias analizadas. Para el diseño de los cebadores y la sonda Taqman en la región seleccionada, se utilizó la herramienta SciTools Primer Quest de la empresa Integrated ADN Technologies IDT. Se seleccionó la opción con mejores características de temperatura de anillaje, estabilidad y porcentaje de GC en los cebadores. La sonda (5’/ 56FAM /TCTCAAGAGTTTGGGTTCGGTGCT/ 3IABlk_FQ /3’) se diseñó con el 6-carboxi fluoresceína en el extremo 5’, como fluoróforo reportero y un Quencher Iowa Black (diseñado por IDT) en el extremo 3’, el cual posee un espectro de absorbancia entre 420 a 620 nm, ideal para fluoresceína. Los cebadores fueron: Cebador reverso: 5’ TCCTCGGGTACCATGTACTG 3’ y Cebador directo: 5’ CACTTGCGTCATCGACAA 3’, los cuales amplifican un segmento de 137 pb del gen de granulina.

Construcción de controles positivos y curvas estándar Para amplificar el gen completo de granulina se utilizaron cebadores degenerados (Barrera et al., 2009): Gran-F: 5´-ATGGGATAYAAYAAAWCDYT-3´ Gran-R: 5´-TYARTANGCBGGDCCVGTRAA-3´ Los productos de PCR se ligaron directamente a un plásmido vector pCR 2.1-TOPO utilizando el Kit TOPO TA (Invitrogen K4500-01). La transformación se realizó en células de Escherichia coli quimiocompetentes Top10 (Invitrogen K4500-40). Las bacterias se crecieron en medio Luria Bertani-LB con ampicilina (50 µg/ ml) a 37°C por 14 horas. Los clones positivos se seleccionaron y se confirmaron por secuenciación mediante el método de Sanger. El ADN obtenido de los plásmidos se utilizó para los controles positivos de la técnica q-PCR y para determinar la sensibilidad de la misma. El número de copias del gen por µL para las diluciones de ADN plasmídico se estimó mediante la fórmula descrita por Whelan y colaboradores (2003). Las curvas estándar se construyeron a partir de un ciclo umbral (threshold cycle ct) calculado para log10 copias del gen.

PCR en tiempo real Para la optimización de las condiciones de q-PCR se utilizó un sistema convencional comercial con Taq Polimerasa, dinucleótidos trifosfatos (dNTPs) y cloru-

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ro de magnesio (MgCl2) marca Promega. Se probaron diferentes condiciones de amplificación (gradiente de temperatura entre 48,7°C y 55,6°C); asimismo diferente número de ciclos de 30, 35 y 40, con modificaciones en las concentraciones de cebadores y sonda (0.24µM, 0.36µM y 0.48µM). Para el desarrollo de este ensayo, se utilizó ADN viral obtenido a partir de las suspensiones virales purificadas. La reacción de amplificación consistió en un primer paso de 3 min a 95°C, seguido por 35 ciclos así: 10 segundos a 95°C, 45 segundos a 52°C y 30 segundos a 72°C. La amplificación, la detección de la señal y el análisis de datos se realizaron en el equipo ICycler IQ (BioRad).

Análisis de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad

una concentración de 1 x 108 CI/mL utilizando un volumen de aplicación de 400 L/ha. El bioplaguicida fue reconstituido en agua y aplicado por aspersión con bomba convencional de espalda (20 L) de cono hueco, dirigido a la base de las plantas (30 mL aprox. por planta), y abarcando un área circular con un radio aproximado de 25 cm alrededor del tallo. Se tomaron muestras de aproximadamente 8 g de suelo superficial con ayuda de una brocha, alrededor del tallo de tres plantas seleccionadas al azar. Los muestreos se realizaron una hora después de la aplicación y pasados 5, 10 y 15 días. Las mezclas se trituraron hasta obtener un polvo fino, se mezclaron y se tomó una muestra para la extracción de ADN según la metodología descrita anteriormente.

Para determinar la especificidad de la técnica de PCR en tiempo real, se utilizaron muestras de diferentes aislamientos de baculovirus: un aislamiento nativo de granulovirus de T. solanivora, un aislamiento peruano del granulovirus de P. operculella y un aislamiento colombiano de nucleopoliedrovirus de S. frugiperda. La sensibilidad de la PCR se determinó usando diluciones seriadas de ADN plasmídico con un factor de dilución 1/5, desde 1,96 x109 hasta 1,25 x 105 copias del gen por reacción. Este ensayo se repitió tres veces en el tiempo para demostrar la reproducibilidad de la técnica con tres réplicas intra-corrida de cada estándar.

Resultados y discusión

Aplicaciones de la técnica de PCR en tiempo real

Todos los aislamientos pertenecientes al género Betabaculovirus se caracterizan por presentar la proteína mayoritaria granulina en sus cuerpos de inclusión. El gen que codifica esta proteína presenta muy poca variabilidad entre los granulovirus (Garavaglia et al.,

Cría de insectos: Se analizaron tres muestras de larvas sin infección aparente, provenientes de la cría del laboratorio de Control Biológico de CORPOICA.

Análisis de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad Los cebadores diseñados en este trabajo para amplificar un fragmento del gen de granulina de 137 pb, permitieron obtener amplicones utilizando ADN genómico de granulovirus provenientes de cinco especies diferentes de insectos, uno de T. solanivora, uno de P. operculella, uno de E. ello, uno de T. absoluta y dos de S. frugiperda (figura 1). Por otra parte, no se observaron fragmentos de amplificación en muestras de NPVs de S. ornithogalli, D. sacharallis o S. frugiperda.

Cuantificación de granulovirus en bioplaguicida Se evaluaron dos lotes de producción del concentrado emulsionable a base de granulovirus de T. solanivora, elaborado siguiendo la metodología descrita por Gómez et al. (2011). Cada lote fue preparado con 3,5 L de suspensión viral con una concentración de 1,2 x 109 CIs/mL. La extracción de ADN de cada concentrado emulsionable se realizó como se describió anteriormente. La cuantificación del ingrediente activo se realizó por triplicado en cada lote. Seguimiento del virus en campo: Se utilizó una parcela experimental (1.411 m2 aprox.) en una finca productora de papa, en la vereda El Alizal, municipio de Carmen de Carupa (Cundinamarca), sembrada con la variedad Parda Pastusa. La parcela fue manejada según las recomendaciones agronómicas generales, sin aplicación de plaguicidas de síntesis química para el manejo de la polilla guatemalteca. Quince días después del aporque se realizó la aplicación del concentrado emulsionable a base del GV de T. solanivora en

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 1% con productos de amplificación de un fragmento del gen gran. SoNPV (NPV de S. ornithogalli), DsNPV (NPV de D. saccharallis), SfMNPV (NPV de S. frugiperda), TesoGV (GV de T. solanivora), PhopGV (GV de P. operculella), EeGV (GV de E. ello), SfGVBra (GV de S. frugiperda de Brasil), SfGVCol (GV de S. frugiperda de Colombia) y TuabGV (GV de T. absoluta). En el primer carril se indica el marcador de peso molecular de 1Kb (Invitrogen).

Detección y cuantificación de betabaculovirus 27

Figura 3. Curva patrón de q-PCR basada en 7 estándares del gen de granulina. Figura 2. Análisis de especificidad de la sonda Taqman de granulina. GVs (granulovirus), NPVs (nucleopoliedrovirus).

2012), por lo cual la metodología fue capaz de amplificar muestras de diferentes especies dentro del género. En los resultados de la PCR en tiempo real se observan las curvas de amplificación dadas por el crecimiento exponencial de las copias del gen (fluorescencia) ubicadas en el eje de las ordenadas versus el número de ciclos de la reacción ubicado en el eje de las abscisas. La especificidad de la sonda Taqman se observó en la amplificación por PCR en tiempo real, donde se utilizaron ADNs de los nueve aislamientos de GVs empleados en la PCR convencional (figura 2). Se observó señal de fluorescencia para los aislamientos de GVs mientras que la señal fue nula para los aislamientos de NPVs. La PCR en tiempo real o cuantitativa (q-PCR), es una herramienta capaz de amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de ADN debido a la fluorescencia, la cual está correlacionada con la cantidad. A mayor número de copias iniciales de la muestra de ADN, más rápido se detectará un incremento en la fluorescencia dada en la q-PCR, como consecuencia de la acumulación de productos de PCR. De esta forma, es posible realizar la cuantificación de ADN de una forma exacta y reproducible. Sin embargo, existen algunos factores

inherentes al desarrollo de la PCR que pueden influir en la especificidad de la técnica, los cuales se encuentran asociados con los niveles de astringencia de la misma; componentes como el cloruro de magnesio, el tipo de polimerasa y la concentración de las sondas son críticos (Espy, 2006), por lo cual la optimización de estos factores fue clave en los resultados obtenidos. Para la cuantificación absoluta del gen gran por PCR en tiempo real se utilizaron diluciones seriadas del ADN plasmídico con un inserto del gen completo, con las cuales se graficó una recta estándar o patrón (figura 3). A partir de esta recta se determinó la mínima dilución en la cual se observó amplificación, la cual correspondió a 1,25 x 105 copias del gen correspondientes a 0,00064 ng de ADN. La reproducibilidad de la técnica fue evaluada realizando 3 ensayos de amplificación en diferentes tiempos, además de tres réplicas de cada ADN patrón en cada prueba. La desviación estándar (σ) intra e interensayos (para cada ADN patrón) fue baja y nunca mayor de 1 (tabla 1), lo cual demostró que la técnica fue reproducible. La variabilidad entre las repeticiones de una muestra en el sistema Taqman es muy baja y generalmente se aumenta cuando se trabaja con concen-

Tabla 1. Desviación estándar de Ct (σ) inter-corridas para los estándares de granulina en tres repeticiones en el tiempo. Estándar Copias del gen/μL

σ Ct Repetición 1

σ Ct Repetición 2

σ Ct Repetición 3

σ Ct inter-corridas

1,96 x 109

0,30

0,27

0,52

0,24

3,92 x

108

0,14

0,35

0,12

0,82

7,84 x

107

0,15

0,10

0,05

0,83

0,14

0,19

0,15

0,89

3,14 x 10

0,07

0,26

0,05

0,43

6,27 x 105

0,15

0,40

0,42

0,43

1,25 x 105

0,60

0,70

0,22

0,57

1,57 x 10

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traciones muy bajas o con amplicones de gran tamaño (superiores a 150 pb) (Bustin, 2000). También se debe considerar que la reproducibilidad de la técnica de PCR en tiempo real se afecta por pequeñas variaciones en las concentraciones de los reactivos y errores de manipulación (Bustin, 2002), por lo cual la validación con estándares basados en el gen clonado contribuye a asegurar la calidad y los resultados de la cuantificación de las muestras (Epsy et al., 2006). Otras variables son importantes para la validación de la metodología, el coeficiente de correlación R2, la eficiencia y la pendiente de la curva patrón (Scott, 2006). Las curvas de calibración en cada corrida de muestras fueron verificadas mediante el valor de coeficiente de correlación superior a 0,99 y eficiencias mayores a 95%, según lo recomendado por Whelan y colaboradores (2003).

Aplicaciones de la metodología de PCR en tiempo real Cría de insectos: Las crías de insectos utilizadas para evaluación de la actividad insecticida y para la multiplicación de diferentes aislamientos de granulovirus, son mantenidas en condiciones controladas de laboratorio. Los individuos que se utilizan para el establecimiento de cada cría y para su posterior recambio provienen de muestras de campo. Una metodología de control para introducir individuos libres de infección consiste en mantener estos individuos en cuarentena por una o dos generaciones y la posterior identificación de larvas libres de síntomas de enfermedad, lo que hace dispendioso y demorado el proceso de introducción de individuos a las colonias. El análisis por q-PCR de individuos de la cría de CORPOICA no mostró amplificación del gen de granulina en ninguna de las muestras analizadas. Esta metodología es altamente sensible, pues detecta mínimas cantidades de copias del gen que puedan estar presentes en una larva, aún en concentraciones subletales o latentes. Las infecciones subletales son transmitidas verticalmente de parentales a su descendencia y son utilizadas como mecanismo de supervivencia viral cuando la infección horizontal es limitada; sin embargo, estas pueden llegar a ser letales en condiciones de estrés por cambios medioambientales o por la infección de otros patógenos (Cabodevilla et al., 2011). En el caso de uso de las crías para ensayos de actividad insecticida, las infecciones subletales se pueden reactivar y ser letales, causando resultados poco repetibles o generando falsos positivos. Cuantificación de granulovirus en bioplaguicida: En el presente trabajo se determinó la concentración viral en dos lotes de un bioplaguicida formulado como un concentrado emulsionable a base de un aislamiento nativo de granulovirus. La cuantificación del ingrediente activo en el bioplaguicida formulado por la técnica

de q-PCR mostró concentraciones similares a la concentración teórica esperada en producto final (1,6 x 109 CIs/mL), la cual se calcula teniendo en cuenta la concentración de la suspensión viral, la cantidad de sólidos adicionados al producto y la humedad final del mismo. Este resultado demuestra que la técnica es útil para hacer el control de calidad de la concentración del virus durante el proceso de manufactura de un bioplaguicida, tanto al producto en proceso como al producto terminado. Los resultados obtenidos para los dos lotes demuestran además, que no existen pérdidas importantes de principio activo durante el proceso de formulación. Seguimiento del virus en campo: Los resultados de las cuantificaciones realizadas en las muestras de suelo, mostraron una disminución progresiva de las concentraciones del virus en el tiempo (tabla 2). La disminución de granulovirus durante el tiempo es debida posiblemente a un proceso natural de degradación o posiblemente al movimiento en el suelo debido a procesos de lixiviación por la lluvia. Estudios de persistencia de baculovirus mediante ensayos de eficacia, se han realizado en cultivos de tomate, algodón y soja para el control de Helicoperva armigera y en cultivos de manzana para el control de Cydia pomonella, evidenciando la presencia viral hasta 14 días post-aplicación (Tamez et al., 2000; Arthurs & Lacey, 2004). Sin embargo, técnicas más sensibles basadas en ADN podrían determinar la presencia viral en concentraciones más bajas y tiempos más prolongados. El suelo representa el mayor reservorio de virus en el medio ambiente. Los cuerpos de inclusión pueden persistir en suelos ácidos o neutrales durante meses o años antes que sean transportados por el impacto de las gotas de lluvia, corrientes de aire, o mediante el movimiento de los artrópodos de la superficie del suelo (Williams, 2015). Para el análisis de la presencia de Baculovirus en suelos se ha utilizado la infección de larvas (Murillo et al., 2006), sin embargo, esta metodología no permite cuantificar la concentración de virus presente, ni permite la realización de estudios de seguimiento del virus posterior a su aplicación. Tabla 2. Promedios de concentración viral (CI/g) detectada por q-PCR en el suelo de la parcela después de aplicación de bioplaguicida a base de granulovirus de T. solanivora. Tiempo de muestreo después de la aplicación

Concentración viral (CI/g)

1 hora

2,11 x 107

5 días

4,83 x 106

10 días

5,65 x 106

15 días

5,96 x 105

Detección y cuantificación de betabaculovirus 29

Conocer la persistencia del granulovirus en condiciones de cultivos de papa es importante para generar recomendaciones relacionadas con la forma y la frecuencia de aplicación del bioplaguicida, así como las concentraciones que se deben utilizar para el manejo integral de la plaga. Los análisis de persistencia con la metodología de q-PCR deben estar acompañados de estudios de eficacia, debido a que la técnica detecta la presencia de ADN del virus, lo cual no está directamente relacionado con su actividad biológica, que puede ser modificada por diferentes factores como luz ultravioleta, suelos alcalinos, etc.

Conclusiones La metodología de q-PCR basada en el gen de granulina detecta betabaculovirus aislados de diferentes especies de insectos, debido a la alta conservación de este gen dentro del género viral. Este método de detección es de gran utilidad para la detección y cuantificación de granulovirus en diferentes tipos de muestras, incluyendo aquellas obtenidas a partir de tejido larval, suelo y bioplaguicidas a base de este virus. Lo anterior representa una ventaja sobre otras técnicas ampliamente utilizadas donde se requieren muestras de virus purificados para su cuantificación. La q-PCR desarrollada en este trabajo, se puede incluir en diferentes etapas del desarrollo de un bioplaguicida a base de granulovirus, desde la búsqueda de aislamientos con potencialidad para el control biológico hasta el control de calidad del proceso de manufactura del bioplaguicida.

Agradecimientos Los autores expresan su agradecimiento a Colciencias por el apoyo financiero del presente trabajo.

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Detección y cuantificación de betabaculovirus 31

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Métodos de conservación para actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo Preservation methods for actinobacterias with phosphate solubilizing activity Tatiana Ortiz*, Valeria Ocampo**, Luis Daniel Prada***, Marcela Franco-Correa**** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.47683

Resumen El objetivo de esta investigación fue evaluar diferentes métodos de conservación para actinobacterias solubilizadoras de fósforo debido a la poca información de métodos específicos reportados para estos microorganismos. Los métodos de conservación se evaluaron a 3 diferentes periodos de tiempo; largo, mediano y corto plazo, usando métodos de congelación y liofilización; arcilla, sílica, arena y transferencia periódica, respectivamente. Para ello se usaron 15 aislamientos de 3 localidades diferentes (La Vega, Maní y Tota) y un banco de referencia de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana. Se prepararon todos los inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) y se ajustaron a una concentración de 108 cel/mL, seguido a ello se inocularon los viales de cada método de conservación con sus respectivos crioprotectantes, glicerol 20% (v/v), 30% (v/v) para congelación y skim milk 18% (p/v) para liofilización. Los métodos a mediano plazo se ejecutaron de igual manera, el inóculo se agregó a 10 perlas de arcilla, 10 g de arena y 5 g de sílica, posteriormente se almacenaron a 4 °C. El método de corto plazo se evaluó en agar avena (15 g/L). La evaluación se realizó mediante recuento directo en cámara de Neubauer por la técnica de azul de tripán, además de la caracterización macroscópica y microscópica de cada aislamiento en transferencia periódica. Se estableció que la actividad solubilizadora de fósforo se mantuvo más estable en los métodos de glicerol 30 % (p/v) y liofilización según el análisis estadístico. Palabras clave: viabilidad, crioprotectantes, banco, liofilización, crioconservación.

Abstract The aim of this research was to evaluate different methods of preservation for actinobacteria with phosphate solubilization activity due to there are a few specific methods reported for these organisms. The methods were evaluated at three different time periods; long, medium and short-term and employing methods as cryopreservation and dry-freezing; clay, silica and sand; and periodically plating, respectively. Therefore 15 isolates from 3 different locations (La Vega, Maní and Tota) and a bank reference from Livestock Research Unit of the Pontificia Universidad Javeriana were used. All inocula were prepared in 0.85% saline solution (w/v) which were adjusted to a concentration of 108 cells/mL, followed each vial was inoculated with their respective storage cryoprotectants , glycerol 20% (v/v), 30% (v/v) to freeze and 18% skim milk (w/v) for dry-freezing. Medium-term methods were performed similarly; the inoculum was added to 10 clay beads, 10 g of sand and 5 g of silica and then stored at 4 °C. The short-term method was evaluated in oatmeal agar (15 g/L). The evaluation was performed by direct counting in a Neubauer chamberusing trypan blue staining technique, in addition to macroscopic and microscopic characterization of each isolate in periodic plating. It was established that the phosphorus solubilizing activity was more stable in glycerol 30% (w/v) and lyophilization for statistical analysis. Keywords: viability, cryoprotectants, bank, dry-freezing, cryopreservation. Recibido: noviembre 18 de 2015

Aprobado: octubre 26 de 2016

* Microbióloga Industrial M.Sc. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, tatsortiz.ortiz@gmail.com ** Microbióloga Industrial. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, ocampov1946@gmail.com *** Microbiólogo Industrial M. Sc. UNIDIA, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, luisd09@hotmail.com **** Microbióloga PhD. GBAI, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, franco@javeriana.edu.co

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Introducción Para la elección de un método de conservación se deben tener en cuenta cuatro aspectos fundamentales: mantener el 70% de las células viables, la pureza, la estabilidad genética al final de la conservación de los aislamientos (García & Uruburu, 2001) y los costos que implica el proceso (Parra et al., 2006). Existen diversos métodos de conservación entre los que se encuentran congelación y liofilización; sílica gel, arcilla y arena; y transferencia periódica, clasificándose según el tiempo en largo, mediano y corto plazo respectivamente. Es necesario entonces, encontrar métodos que permitan la conservación de microorganismos que presentan características de gran interés, como producción de metabolitos secundarios o en este caso la solubilización de fósforo. El fósforo es un macronutriente esencial para el desarrollo de las plantas, sin embargo no se encuentra frecuentemente en formas disponibles en el suelo, por lo cual las plantas no pueden usarlo para su desarrollo. Existen diversas formas de transformar fosforo no disponible, en formas disponibles como la solubilización mediante la producción de ácidos orgánicos la cual libera fosforo inorgánico como ortofosfatos, que pueden ser asimilados por las plantas para su crecimiento. Existen diferentes microorganismos capaces de solubilizar fósforo como las actinobacterias, bacterias Gram positivas filamentosas, ampliamente distribuidas en distintos tipos de ambientes como el suelo y agua, aunque también se pueden encontrar en el hombre; son microorganismos heterótrofos, aerobios y su temperatura óptima de crecimiento es de 25 - 30°C (Franco, 2008), sin embargo, se han reportado pocos métodos de conservación para actinobacterias, por lo tanto el objetivo de este trabajo es definir un método adecuado de conservación para actinobacterias que presenten actividad solubilizadora de fósforo.

Metodología Se seleccionaron 15 aislamientos (Prieto et al., 2015) de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana para el estudio, las cuales presentaron actividad solubilizadora de fósforo según Prada, Prieto & Franco (2014).

Métodos de largo plazo (1 año de conservación) Liofilización Se usó un liofilizador LABCONCO FREEZE DRY SISTEM / FREE ZONE 4.5 el cual se mantuvo una temperatura de -50°C, se usaron viales con una capacidad volumétrica de 2,5 mL y como crioconservante Skim Milk al 18% (p/v), se prepararon inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) a una concentración de108 cel/mL (García & Uruburu, 2001). Para ello se realizaron recuentos en cámara de Neubauer, efectuando una tinción de

viabilidad con azul de tripán al 0,05% para evidenciar las células vivas de células muertas (Cardona et al., 2005). Finalmente, el inóculo con el crioconservante se ajustó en una proporción 1:1 y se almacenaron a una temperatura de 4°C (García & Uruburu, 2001). Para su reactivación se tomaron 0,5 mL de solución salina con una jeringa de 3 mL y se agregaron al liófilo homogenizando la solución, posteriormente se realizó el recuento en cámara de Neubauer para determinar la viabilidad y una tinción de Gram para confirmar la pureza. Congelación Para llevar a cabo el proceso se utilizaron crioviales de 1,5 mL, para ello se prepararon dos soluciones de glicerol en agua destilada: glicerol al 20% (p/v) y glicerol al 30% (p/v), seguido a ello se prepararon los inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) realizando recuento en cámara de Neubauer, por último el inóculo más el crioconservante se ajustó en una proporción 1:1, luego de esto se guardaron los crioviales de glicerol al 20% (p/v) a una temperatura de -20°C y los de glicerol al 30% (p/v) a una temperatura de -80°C (Perry, 1998). Para su reactivación se tomó un criovial de cada una de las concentraciones y se realizó el recuento directo en cámara como se mencionó anteriormente.

Métodos de mediano plazo (6 meses de conservación) Arena estéril Es un sustrato el cual se ha estudiado para conservación de hongos específicamente patógenos (Nakasone et al., 2004), sin embargo, en este estudio se probó con actinobacterias, para ello se tomaron 10 g de arena que se depositaron en viales con capacidad de 50 mL y se esterilizaron a 120°C durante 15 minutos. Por otra parte se realizó un recuento en cámara ajustando el inóculo como se reportó anteriormente. Se tomó 1 mL del inóculo y se agregó a 10 g de arena estéril para almacenarlos a una temperatura de 4°C (García & Uruburu, 2001). Para su reactivación se tomó 1 g de la muestra y se agregó a 9 mL de solución salina, se realizó un recuento directo en cámara. Sílica gel Se tomaron 5 g de Sílica y se introdujeron en viales con capacidad de 50 mL, se esterilizaron a 180°C durante 90 min, finalmente se dejaron enfriar y se colocaron en una bandeja con hielo durante 24 horas (Perkins, 1962) (Nakasone et al., 2004); posteriormente se realizó el recuento en cámara de Neubauer para ajustar la concentración del inóculo. Se agregaron 0,7 mL del inóculo a 5 g de Sílica y se almacenaron a 4°C (García & Uruburu, 2001). Para la reactivación se tomó 1 g de Sílica y se realizó un recuento directo en cámara.

Métodos de conservación para actinobacterias 33

Arcilla Se tomaron 3 g de Sílica y se colocaron en un vial de 50 mL, seguido a ello se colocó algodón sobre la Sílica. En otro vial se colocaron 10 perlas de arcilla y se mandaron a esterilizar con calor seco a 180°C durante 2 horas. Por otra parte se realizó el recuento en cámara de Neubauer para ajustar la concentración del inóculo, posteriormente se colocaron las perlas de arcilla en el inóculo durante 5 minutos en condiciones de esterilidad, luego se colocaron las perlas de arcilla previamente inoculadas en el vial que contiene la Sílica, se sellaron y se almacenaron a 4°C (García & Uruburu, 2001). Para su reactivación se tomaron todas las perlas de cada vial y se realizó un recuento directo en cámara.

Análisis de costos La estimación de los costos de la investigación se realizó mediante la sumatoria de todos los insumos y materiales usados por cada tratamiento evaluado, a su vez se incluyó el costo de un operario. Cada uno de los valores presentados en la tabla 4 implica un banco de conservación equivalente a 100 unidades por cada método.

Resultados

Método de corto plazo Transferencia periódica Es el método más simple y más utilizado para la conservación a corto plazo de bacterias, consiste en la transferencia periódica del cultivo en un medio líquido o sólido y su incubación a temperatura adecuada hasta la obtención del crecimiento (Freire & Sato, 1999), para ello se sembraron en agar avena (Correa, 2008) los aislamientos de actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo incubándolas a 25 °C, a los 8 días se realizó caracterización macroscópica y microscópica de cada uno. Este procedimiento se repitió mensualmente durante 4 meses. Cuantificación de la actividad solubilizadora de fósforo Se tomó un Erlenmeyer de 100 mL al cual se le adicionaron 18 mL de medio NBRIP con fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2) en una concentración de 5g/L como fuente de fosforo insoluble y 2 mL de inóculo ajustado a una concentración de (108 cel/mL), seguido a ello se incubaron a 23°C y 120 rpm durante 5 días. Luego del tiempo de incubación, cada una de las muestras se llevó a centrifugar por 15 minutos a 5000 rpm, posteriormente se tomó el sobrenadante y se realizó la cuantificación de la actividad solubilizadora de fósforo de los aislamientos que presentan mayor solubilización según lo establecido por Prada, Prieto & Franco (2014) las cuales son Streptomyces MCR24, Streptomyces T3A y Streptomyces T3C; este proceso se realizó por triplicado; la cuantificación se realizó con el test SPECTROQUANT de Merck® (Murphy & Riley, 1962) efectuando lo propuesto por el protocolo 365.2 de la EPA Phosphorous, All forms (colorimetric, ascorbic acid and single reagent, midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 880 nm). Para el desarrollo de esta prueba se preparó una curva patrón cuya solución estándar fue 0.01 mg de P (KH2PO4)/mL. Análisis estadístico Los resultados se analizaron mediante una prueba de varianza simple (ANOVA) y una prueba de Tukey para 34

comparación de medias con un α de 0,05. Se realizaron tres réplicas por ensayo. Como herramienta informática se utilizó el programa SPS 11,0 para software de Windows®.

Se seleccionaron los mejores aislamientos con actividad solubilizadora de fósforo de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana, según los resultados obtenidos por Franco (2008) y Prada, Prieto & Franco (2014); dichos aislamientos se sometieron a siete diferentes tratamientos de conservación divididos en largo, mediano y corto plazo. Para evaluar la viabilidad de cada uno de los aislamientos en los diferentes métodos de conservación se llevó a cabo un recuento directo en cámara de Neubauer (Cardona et al., 2005) y se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor con un α del 0,05, posteriormente se hizo una prueba de comparación de medias de Tukey para determinar el mejor método a largo y mediano plazo de cada uno de los aislamientos como se observa en las tablas 1 y 2. La comparación de medias se realizó entre cada uno de los aislamientos. En cuanto al método de corto plazo, transferencia periódica, se realizaron caracterizaciones morfológicas en las cuales se evidenció que ninguno de los aislamientos presentaron cambio alguno durante el transcurso del tiempo, sin embargo la actividad solubilizadora de fósforo fue baja obteniendo resultados de 9,05 a 20,84 ppm para los aislamientos seleccionados en comparación con los valores obtenidos por Prada, Prieto & Franco (2014). Para evaluar la actividad solubilizadora de fósforo se tomaron 3 aislamientos de actinobacterias que presentaron la mayor actividad solubilizadora (396 y 526 ppm) en estudios previamente realizados (Streptomyces MCR24, Streptomyces T3A y Streptomyces T3C) (Prada et al., 2014). Mediante un análisis de varianza ANOVA de un factor, con un α de 0,05 y posteriormente una prueba de Tukey se determinó el mejor método de conservación relacionado con la preservación de la actividad para cada uno de los aislamientos. En la tabla 3, se observan los diferentes tratamientos evaluados y la concentración de fósforo soluble en ppm de cada aislamiento. Los resultados demostraron que para Streptomyces MCR24 existen diferencias es-

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Tabla 1. Viabilidad obtenida a partir de los métodos de conservación a largo plazo para los aislamientos de actinobacterias al inicio y al final de la evaluación* Promedios de Rcto. Inicial (cel/ mL)

Promedios de Rcto Liofilización (cel/mL)

% Viabilidad

Promedios de Rcto. Inicial (cel/mL)

Streptomyces MCR1

9,000

7,799a

9,000

Streptomyces MCR9

8,602

8,114b

Aislamientos

Promedios de Rcto Glicerol 20% (cel/mL)

% Viabilidad

Promedios de Rcto. Inicial (cel/mL)

Promedios de Rcto Glicerol 30% (cel/mL)

% Viabilidad

7,633a

9,000

8,204b

9,000

8,477c

8,602

7,146a

Streptomyces MCR24

8,477

8,000a

8,845

8,114a

8,477

7,845a

Streptomyces MCR26

8,301

7,954a

8,778

7,968a

8,301

8,964b

108

Kitasatospora L3A

8,903

7,982b

9,000

8,301c

8,903

6,863a

Streptomyces L4B

8,301

7,968b

8,954

8,000b

8,301

6,820a

Streptomyces L4C

9,000

8,000a

8,699

7,982a

9,000

8,477b

Streptacidiphilus M2A

9,000

7,602b

8,000

7,724b

9,000

6,833a

Streptomyces T1B

9,000

7,968a

9,000

8,000a

9,000

7,881a

Streptomyces T1C

9,000

8,000a

9,000

8,000a

9,000

7,863a

Streptomyces T1J

8,301

8,301c

100

8,000

7,863b

8,301

6,763a

Streptomyces T3A

9,301

8,204b

9,000

8,000ab

9,301

7,813a

Streptomyces T3B

9,000

8,204b

9,000

7,903a

9,000

8,176b

Streptomyces T3C

9,000

8,000a

9,000

7,968a

9,000

7,892a

Streptomyces T3D

8,301

8,000b

8,778

7,982b

8,301

7,820a

* Comparación entre aislamientos para el mismo tratamiento, los métodos de conservación más efectivos para cada aislamiento se presentan en negrilla. Según la agrupación de medias de Tukey, cada letra (a, b ó c) correspondiente a los grupos formados por la prueba de comparación de medias con un α de 0,05

tadísticamente significativas en cuanto a los métodos de conservación evaluados siendo glicerol 30% (p/v) el mejor tratamiento, Streptomyces T3A no presenta diferencias significativas ya que los datos presentaron un comportamiento similar, sin embargo, se eligió la media más alta la cual corresponde al tratamiento de liofilización. Streptomyces T3C muestra que hay diferencias significativas entre los métodos, dónde liofilización y glicerol (30%) fueron los métodos que tuvieron mejor efecto en el mantenimiento de la actividad fisiológica de interés que fue la solubilización de fósforo (tabla 3). En la tabla 4 se observan algunos valores resaltados en negrilla, los cuales indican en la viabilidad y actividad solubilizadora de fósforo los valores más altos; y en costos, los valores más bajos o más económicos por cada tratamiento.

Discusion de resultados Debido a la gran variedad que presentan los microorganismos no se ha reportado un método óptimo de conservación para éstos en general, incluso para un grupo particular de microorganismos como las actinobacterias, estas bacterias son conocidas por su impor-

tancia biotecnológica y biológica en diversos campos, hecho relacionado con su alta diversidad metabólica y presencia en diversidad de nichos ecológicos (Franco & Chavarro, 2016). Aun así, son limitadas las investigaciones relacionadas con la forma de almacenamiento de los miembros de este grupo, por lo cual de manera común se hace uso de los métodos de conservación de otros grupos bacterianos para preservarlos. En muchas ocasiones esto puede funcionar, pero no es idóneo generalizar ni someter estos microorganismos a las mismas condiciones de conservación que los otros filum, debido a que este grupo presenta características fenotípicas, fisiológicas y genéticas propias que hacen posible determinar un adecuado método de conservación. Además, la conservación de las actinobacterias tiene como objetivo mantener sus características originales por las cuales fueron seleccionadas, lo que no siempre es posible pues se han reportado frecuentemente re-arreglos génicos así como otros mecanismos genéticos (transferencia horizontal de genes) que pueden modificar las características deseables durante sus periodos de almacenamiento, hecho que se aprecia en algunas ocasiones fenotípicas y especialmente por cambios de caracteres morfológicos (Leblond et al., 1990), (Birch et al., 1990), (Ventura et al., 2007).

Métodos de conservación para actinobacterias 35

Tabla 2. Viabilidad obtenida a partir de los métodos de conservación a mediano plazo para los aislamientos de actinobacterias al inicio y al final de la evaluación* Promedios de Rcto. Inicial (cel/ mL)

Promedios de Rcto Arcilla (cel/ mL)

Promedios de Rcto. Inicial (cel/ mL)

Promedios de Rcto Arena (cel/ mL)

% Viabilidad

Streptomyces MCR1

8,477

7,903ab

8,000

8,000b

100

8,000

7,778a

Streptomyces MCR9

8,301

7,699a

8,000

8,000b

100

8,000

7,699a

Streptomyces MCR24

8,000

8,000a

100

7,477

7,954a

106

7,477

7,845a

105

Streptomyces MCR26

8,602

7,903a

8,602

8,000a

8,602

7,903a

Kitasatospora L3A

8,301

7,845a

8,477

7,954a

8,477

7,845a

Streptomyces L4B

7,477

8,000b

107

7,477

7,954ab

106

7,477

4,602a

Streptomyces L4C

8,301

7,699a

7,301

7,778a

107

7,301

7,602a

104

Streptacidiphilus M2A

8,477

8,000b

8,602

8,000b

8,602

7,602a

Streptomyces T1B

7,903

8,477b

107

8,301

8,699c

105

8,301

7,778a

Streptomyces T1C

8,602

7,845a

7,301

8,699b

119

7,301

7,903a

108

Streptomyces T1J

8,477

7,477a

7,301

7,903a

108

7,301

7,778a

107

Streptomyces T3A

8,000

8,000b

100

8,602

8,301c

8,602

7,778a

Streptomyces T3B

8,301

7,845a

7,301

8,301b

114

7,301

7,954a

109

Streptomyces T3C

8,000

7,845a

8,602

8,301b

8,602

7,845a

Streptomyces T3D

7,477

7,602a

102

7,301

7,903b

108

7,301

7,699ab

105

Aislamientos

% Viabilidad

Promedios de Rcto. Inicial (cel/ mL)

Promedios de Rcto Sílica (cel/ mL)

% Viabilidad

En el presente estudio no se apreció ningún cambio morfológico, macroscópico o microscópico, en los microorganismos evaluados durante los periodos de almacenamiento, lo cual sugiere que los métodos usados brindan estabilidad génica. Sin embargo, a pesar de no encontrar rasgos morfológicos que sugieran alteraciones genéticas, el uso de la transferencia periódica ha demostrado perdida en la actividad solubi-

lizadora de los microorganismos al ser comparados con otros métodos y sus reportes previos (Prada et al., 2014) lo que invalida la transferencia como método de conservación. Este hecho resalta la importancia de la estandarización y uso de métodos a mediano y largo plazo para la adecuada conservación de estas actinobacterias de importancia biotecnológica.

Tabla 3. Evaluación de la solubilización de fósforo a partir de los tratamientos*. Tratamiento

Concentración de P soluble (ppm) MCR24

T3A

T3C

Liofilización

22,54 ± 1,826 a

51,36 ± 0,024 a

13,51 ± 0,414 c

Glicerol 20%

20,04 ± 2,056 a

45,26 ± 2,251 a

0,44 ± 0,270 a

Glicerol 30%

43,18 ± 4,742 b

39,02 ± 4,129 a

15,05 ± 0,8 c

Arcilla

26,65 ± 4,612 ab

45,26 ± 2,857 a

6,87 ± 1,438 b

Arena

27,86 ± 5,492 ab

44,63 ± 5,628 a

6,34 ± 1,218 b

Sílica

30,52 ± 2,120 ab

47,29 ± 0,698 a

2,47 ± 0,571 a

* Los métodos de conservación más efectivos para cada aislamiento se presentan en negrilla. Según la agrupación de medias de Tukey, cada letra (a, b ó c) correspondiente a los grupos formados por la prueba de comparación de medias con un α de 0,05. Promedio de la concentración ± Error estándar.

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Tabla 4. Viabilidad, concentración de fósforo soluble y costos de los tratamientos evaluados*.

Plazos

Largo

Mediano

Corto

Viabilidad

Actividad solubilizadora de P (ppm)

USD/Método

Liofilización

7,954

29.13

19.970,499

Glicerol 20%

8,000

21.91

13.114,340

Glicerol 30%

7,903

32.42

15.459,506

Arena

8,000

26.28

10.791,428

Arcilla

7,903

26.26

9.938,450

Sílica gel

7,699

26.76

10.823,213

Cualitativo

23.23

10.767,253

Tratamiento

T. Periódica

* Los cuadros en negrilla representan los tratamientos seleccionados en cuanto a la mejor viabilidad, concentración más alta de fós-

foro soluble y los cosos más bajos.

Uno de los estudios más relevantes para actinobacterias en cuanto al estudio de métodos de almacenamiento a largo plazo se realizó por Filippova, Surgucheva & Gal´chenko (2012) en el que se reportaron niveles críticos en la viabilidad tras realizar la evaluación de sus bancos liofilizados con aceite mineral y cultivos de suelo. La pérdida de la viabilidad para las cepas evaluadas fue cercana al 35%. De igual manera fue difícil reactivar algunos liófilos y a su vez se observaron cambios en las características morfológicas, como la perdida de color en el micelio y producción de micelio aéreo. En el presente estudio con el método de liofilización no se evidenció la perdida de ninguna cepa y los porcentajes de viabilidad del recuento inicial frente al recuento posterior a la conservación, fueron mayores al 87%, lo cual puede deberse al crioconservante usado en este caso Skim Milk que genera una mayor ventaja al usado en el estudio de Filippova et al. (2012), además cabe resaltar que la baja viabilidad puede estar ligada a periodos mucho más largos de almacenamiento, mayores a 1 año, lo que en el estudio de Filippova et al. (2012), pudo afectar procesos celulares generando desecación y procesos de oxidación celular. En la tabla 1, se observa que los microorganismos de este estudio no presentan afinidad por un método en específico. En las evaluaciones a largo plazo, por ejemplo, el 46% de los aislamientos presentaron mayor afinidad con glicerol al 20% (p/v) aunque la diferencia porcentual en cuanto a liofilización no es significativa, ya que el 33% de los aislamientos se ajustaron mejor a éste método el cual ha sido ampliamente reportado (Burguet et al., 2012) (Chen et al., 2006). Esto se debe al fuerte impacto que reciben las células por el proceso de sublimación que disminuye notablemente el porcentaje de viabilidad de los microorganismos por causas de estrés sobre la celula, (Bozoglú et al., 1987) (Prakash et al., 2013). Así mismo, este proceso se puede ver afectado por la concentración del crioprotec-

tante, algunos autores como García & Uruburu (2001) reportan el uso de Skim Milk al 18% (p/v) como la concentración óptima para la protección del microorganismo, sin embargo ésta puede ser un factor limitante de la viabilidad debido al proceso de ultracongelación, al cual son sometidos antes de ser liofilizados. Por otra parte la crioconservación ha sido reportada como un buen método de conservación (Hubalek, 2003) tanto para bacterias como para hongos, sin embargo es un método que afecta tanto la viabilidad como la actividad dependiendo de la temperatura y concentración del crioprotectante utilizado, el glicerol es un compuesto que en altas concentraciones, mayores a 30%, se puede volver tóxico para las células puesto que penetra la membrana celular. Como se observa en la tabla 1, tres aislamientos de los quince evaluados presentan buenos resultados con este método, por lo tanto es adecuado como método de conservación. Al ser la actividad solubilizadora de fósforo uno de los factores que se debe mantener durante el periodo de la conservación en la tabla 3 se puede observar que el glicerol 30% (p/v) es el método que presenta mayor mantenimiento de la actividad fisiológica de los microorganismos, dando como resultado una mayor concentración de fósforo soluble al transcurrir un año de conservación para los 3 aislamientos, esto quizás se debe a que la congelación rápida influye en la preservación de la actividad la cual está proporcionalmente ligada a la viabilidad. Los métodos a mediano plazo se seleccionaron debido a que han sido reportados para microorganismos que se encuentran generalmente en el suelo, las matrices presentes en este medio forman asociaciones físicas con las Actinobacterias, tales como arenas o arcillas pueden contribuir a los buenos resultados en cuanto a viabilidad. El 86% de los aislamientos presenta mayor afinidad en arena como matriz de conservación como se observa en la tabla 2. La arena tiene un tamaño de 0,10 a 0,25 mm (Hodgson, 1987) lo cual limita el

Métodos de conservación para actinobacterias 37

paso de agua, aire, entre otros factores que pueden beneficiar el crecimiento (Glyan & Gary, 1999) de las Actinobacterias, por lo tanto permite la conservación de dichos microorganismos sin influir en su cinética de crecimiento. Por otra parte ningún aislamiento presentó afinidad por el método de sílica gel aunque ha sido reportado como método de conservación y en repetidas ocasiones presenta buenos resultados fenotípicos y de estabilidad genética como en estudios realizados con Escherichia coli HB101 por Sidyakina y Golimbet (1991) o el trabajo de Álvarez, Pieckenstain, Desimone, Estrella, Ruíz & Díaz (2010), los cuales mencionan una eficiente protección y preservación de Mesorhizobium spp. de importancia agroindustrial por tener la capacidad de fijar nitrógeno. Aun cuando es reportado que los microorganismos Gram positivos tienden a sobrevivir más los procesos de preservación en sílica gel que microorganismos Gram negativos (Trollope, 1975), esto no se vió reflejado en este estudio, como se observa en la tabla 2, esto se da porque es un material sintético fabricado a partir de silicato sódico, un compuesto desecante que elimina por completo la humedad y puede afectar la viabilidad celular y al mismo tiempo la actividad. Por otro lado la arcilla al ser un compuesto natural como la arena, permite la conservación de la viabilidad como se observa en la tabla 2, aunque solo dos aislamientos presentaron alta afinidad por este método ya que es un compuesto el cual ha cambiado sus propiedades físicas originales al ser sometido a un proceso térmico, lo que aumenta su porosidad y por lo tanto permite la conservación del microorganismo en dicha matriz.

mento de estar trabajando de manera activa con algún aislamiento en particular. Sin embargo se logró evidenciar que no todos los microorganismos se conservan manteniendo las respectivas cualidades evaluadas de la misma manera, por lo cual se sugiere de ser posible, conservar cada microorganismo con el método que preserve dichas cualidades de interés de la forma más efectiva.

El análisis de costos determinó que el método de glicerol al 20% correspondiente a largo plazo y arcilla de mediano plazo, fueron los métodos más económicos de cada uno de los tiempos evaluados, aunque no presentaron los mejores resultados de viabilidad y actividad solubilizadora, la concentración de fósforo soluble no disminuyó más del 32%, lo que permite inferir que los métodos evaluados son eficaces y su elección se debe realizar según el interés que se tenga al momento de llevar a cabo la conservación.

Filippova, S. N., Surgucheva, N. A. & Gal´chencko, V. F. (2012). Long-Term storage of collection cultures of Actinobacteria. Microbiology, 81(5), 630-637.

Conclusión

Freire, J., & Sato, M. (1999). Conservación de cultivos de rizobios. Revista Latinoamericana De Microbiologia-México, 41(1), 35-42.

Aun cuando los métodos de liofilización fueron muy efectivos en este estudio y son a su vez recomendados por “The American Type Culture Collection” o autores como Yocheva et al., 2002, los resultados de este estudio concluyen que los métodos de conservación más eficientes en general para la conservación de actinobacterias solubilizadoras de fósforo fueron los de crioconservación con glicerol al 30%, el uso de este método de crioconservación es rápido, de bajo costo y apropiado para largos periodos de conservación, lo cual coincide con lo reportado por Rifaat (2009). Por otro lado el método con arena arrojó los mejores resultados en cuanto a viabilidad, mantenimiento de la actividad y costo siendo ideal para usar en el mo38

Referencias bibliográficas Álvarez, G. S., Pieckenstain, F. L., Desimone, M. F., Estrella, M. J., Ruiz, O. A., & Díaz, L. E. (2010). Evaluation of Sol-Gel Silica Matrices as Inoculant Carriers for Mesorhizobium Spp. Cells. Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, ed. A. Mendez-Vilas, Formatex. Birch, A., Häusler, A., & Hütter, R. (1990). Genome Rearrangement and Genetic Instability in Streptomyces spp. Journal of Bacteriology, 172(8), 4138-4142 Bozo lu, T., Özilgen, M., & Bakir, U. (1987). Survival kinetics of lactic acid starter cultures during and after freeze drying. Enzyme and Microbial Technology, 9(9), 531-537. Burget, N., Sierra, N., & Brito, L. C. (2012). Conservación de cepas microbianas por el método de liofilización para el control microbiológico en Laboratorios Liorad. Revista CENIC Ciencias Biológicas, 43(3), 1-4. Cardona, G. I., Arcos, A., & Murcia, U. (2005). Abundancia de actinomicetes y micorrizas arbusculares en paisajes fragmentados de la amazonia colombiana. Agronomía Colombiana, 23(2), 317-326. Chen, H., Lin, C., & Chen, M. (2006). The effects of freeze drying and rehydration on survival of microorganisms in kefir. Asian Australasian Journal of Animal Sciences, 19(1), 126.

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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Cuantificación de bacterias diazótrofas aisladas de suelos cacaoteros (Theobroma cacao L.), por la técnica de Número Más Probable (NMP) Quantification of diazotrophs bacteria isolated from cocoa soils (Theobroma cacao L.), by the technique of Most Probable Number (MPN) Adriana Zulay Argüello-Navarro*, Niccolay Madiedo Soler**, Laura Yolima Moreno-Rozo*** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.47678

Resumen Esta investigación tuvo como objetivo cuantificar bacterias diazótrofas y comparar fisicoquímicamente suelos rizosféricos de tres cacaotales (Theobroma cacao L.) del Departamento Norte de Santander, Colombia; para lo cual se caracterizaron, diferenciándose en área cultivada, manejo agronómico y edad del cultivo. A partir de diluciones seriadas de las muestras y empleando la técnica de Número Más Probable (NMP), en medios de cultivo semiselectivos (NFb, JMV, LGI, JNFb) semisólidos, se cuantificaron las diazótrofas, evaluando como positivo la formación de una película subsuperficial en el medio contenido en viales sellados; muestras pares se enviaron al laboratorio Bioambiental (UNET) para los análisis fisicoquímicos. Como resultado, las muestras evaluadas mostraron deficiencias en el porcentaje de materia orgánica y elementos como Potasio, Fósforo y Magnesio. Se reportaron estadísticamente diferencias altamente significativas en NMP. La mayor cuantificación de diazótrofas se reportó en la finca Florilandia, que se caracterizó por tener riego por goteo. La mayor cuantificación de diazotrófas se registró en los medios NFb y JMV, demostrándose una mayor presencia de los presuntos géneros Azospirillum sp. y Burkholderia sp. los cuales son fácilmente aislados de suelos rizosféricos, a diferencia de los géneros Herbaspirillum sp. y Gluconacetobacter sp. que por su carácter endófito suelen ser menos predominantes en este tipo de muestras. Se concluye además, que las características fisicoquímicas del suelo, la humedad y las relaciones climáticas al momento de la toma de las muestras, condicionan la cantidad de exudados de las raíces y por tanto son factores que condicionaron la presencia de diazótrofas en las muestras. Palabras clave: Azospirillum, Burkholderia, cacao, rizósfera.

Abstract The objective of this research was to quantify diazotrophic bacteria and compare physicochemically rhizospheric soils of three cocoa plantations (Theobroma cacao L.) in Norte de Santander Department, Colombia; for which they were characterized, differing in cultivated area, agronomic management and crop age. From serial dilutions of the samples and using the technique of Most Probable Number (MPN), In semisolid culture media (NFb, JMV, LGI, JNFb), the diazotrophs were quantified, evaluating as positive the formation of a subsurface film in the medium contained in sealed vials; equal samples were sent to the Bioambiental laboratory (UNET) for physicochemical analyzes. As a result, the evaluated samples showed deficiencies in the percentage of organic matter and elements such as Potassium, Phosphorus and Magnesium. Statistically highly significant differences in MPN were reported. The highest quantification of diazotrophs was reported in the Florilandia farm, which was characterized by drip irrigation. The highest quantification of diazotrophs was recorded in the media NFb and JMV, demonstrating a greater presence of the presumed genera Azospirillum sp. and Burkholderia sp. which are easily isolated from rhizospheric soils, unlike the genera Herbaspirillum sp. and Gluconacetobacter sp. which by * ** ***

MSc. Agronomía. Profesor Ocasional. Departamento Medio Ambiente. Grupo de investigación en Ciencias Biológicas - Majumba. Universidad Francisco de Paula Santander. Cúcuta, Norte de Santander, Colombia. E-mail de correspondencia: adrianaarguello@ufps.edu.co Ing. Biotecnológico. Semillero de Investigación en Biotecnología Aplicada - Seiba. Universidad Francisco de Paula Santander. Cúcuta, Norte de Santander, Colombia. E-mail: niccolaymadiedosoler4@gmail.com Ph.D. En Educación. Profesor Titular. Departamento de Ciencias Básicas. Grupo de investigación en Ciencias Biológicas - Majumba. Universidad Francisco de Paula Santander. Cúcuta, Norte de Santander, Colombia. E-mail: laurayolimamr@ufps.edu.co

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their endophytic character tend to be less predominant in this type of samples. It is also concluded that the physicochemical characteristics of the soil, humidity and climatic relationships at the moment of sampling, condition the amount of root exudates and therefore are factors that conditioned the presence of diazotrophs in the samples. Keywords: Azospirillum, Burkholderia, cocoa, rhizosphere. Recibido: marzo 16 de 2016

Aprobado: octubre 22 de 2016

Introducción El cacao (Theobroma cacao L.), es un árbol nativo de las regiones tropicales húmedas de Suramérica (Motamayor et al., 2002); es un cultivo perenne de cuyos frutos llamados mazorcas, se extraen los granos o semillas que son ricos en nutrientes y grasas que se utilizan para la fabricación de diversos productos agroindustriales, llegando a ser uno de los cultivos de mayor importancia socioeconómica en Colombia, debido a que aporta más de 71 millones de dólares al producto interno bruto del país y genera trabajo para el sostenimiento de más de 24 mil hogares colombianos (Pinzón et al., 2009). En muchas regiones incluyendo Norte de Santander; dada la necesidad de una mayor producción con el uso de suelos poco fértiles y con altos requerimientos nutricionales para la agricultura, se ha aumentado el uso de fertilizantes químicos con el fin de proveer al suelo de elementos necesarios como Nitrógeno (N), Fosforo (P) y Potasio (K), esenciales para el desarrollo óptimo de las plantas (Uribe et al., 2000); no considerándose, que el uso continuo y cada vez mayor de este tipo de fertilizantes y de otros productos empleados sin la correcta dosificación, da como resultado la acidificación y erosión de los suelos, la alteración de sus propiedades físicas y químicas, y la destrucción de la vida microbiana presente en él, alterando procesos microscópicos que ayudan a mejorar la calidad del suelo y de los cultivos (Rodríguez & López, 2009). De ahí, que el objeto de esta investigación consistió en cuantificar las poblaciones de bacterias fijadoras de Nitrógeno (diazótrofas), aisladas de muestras compuestas de tres suelos rizosféricos de cacao y compararlos fisicoquímicamente; dado que la actividad microbiana de la rizósfera en gran medida, es responsable del funcionamiento del ecosistema y de la fertilidad de los suelos agrícolas (Jaizme-Vega & Rodríguez-Romero, 2008). El mejoramiento del desarrollo y nutrición de la planta y el aumento de la tolerancia de los cultivos frente al estrés, son algunos de los beneficios que las bacterias rizosféricas presentes en los cultivos, pueden aportarle a la agricultura (Compant et al., 2010). Este tipo de bacterias, aseguran la sostenibilidad de los cultivos contribuyendo a mejorar la calidad del suelo, limitar el aporte de nutrientes e incrementar los rendimientos en producción (Hernández et al., 2006).

Las bacterias diazotrófas son de gran importancia agrícola como intermediarios en el proceso de fijación biológica del nitrógeno, reduciendo el nitrógeno atmosférico no asimilable por las plantas a amonio, ayudando así a suplir carencias de este elemento en los cultivos (Vallejo et al., 2008). El N tiene la capacidad de aumentar la fertilidad del suelo mediante la formación de humus, que posee la facultad de almacenar N, disminuir la pérdida de K, Ca y Mg, y al mismo tiempo mantiene la humedad del suelo, mejorando los procesos biológicos desarrollados en él (Mayz-Figueroa, 2004). Dado que el crecimiento y la buena producción del cultivo de cacao dependen en gran medida de la existencia de buenas condiciones físicas y químicas del suelo, descriptivamente se realizó la caracterización de los cultivos de cacao seleccionados, mediante previa encuesta realizada a los propietarios; además, y por el método de investigación experimental, se tomaron muestras compuestas de suelo rizosférico para el análisis de las características físicas y nutricionales; y a partir de muestras pares se realizó la cuantificación de diazótrofas por la técnica de número más probable (NMP), la cual da una estimación realista de un organismo estudio, al señalar su presencia o ausencia en las réplicas y en la dilución más alta posible, lo que demuestra en los resultados, el cálculo de la población presente en una muestra (Ranganayaki et al., 2006, Soares et al., 2006). Con los resultados obtenidos se concluyó que aunque los cultivos se ubican en una misma zona, estos difieren en cuanto a manejo agronómico, nivel de producción, propiedades físicas y químicas de los suelos, reportando condiciones moderadamente aptas para el cultivo, según los requerimientos eco-fisiológicos y de manejo para el cultivo de cacao en Colombia de Rojas y Sacristán (2009); sin embargo estos logran mantenerse dado que el cultivo de cacao tiene una gran adaptabilidad a condiciones adversas (Argüello-Navarro & Moreno-Rozo, 2014). En lo referente a la cuantificación de diazótrofas, estadísticamente se reportan diferencias altamente significativas en los medios de cultivo Nfb y JMV donde crecen presuntivamente los géneros bacterianos Azospirillum sp. y Burkholderia sp. respectivamente y que son predominantes en la zona de rizósfera. La menor presencia se cuantificó en los medios JNFb y LGI donde crecen presuntivamente los géneros bacterianos de Herbaspirillum sp. y Gluconacetobacter sp., dado que son de naturaleza más endófita.

Cuantificación de diazótrofas de suelos cacaoteros por la técnica de NMP 41

Materiales y métodos

Cuantificación de bacterias diazótrofas por la técnica de Número Más Probable (NMP)

Caracterización de los cultivos de cacao

En un erlenmeyer con 90 mL de agua peptona, se agregaron 10 gr del suelo rizosférico, el cual se agitó por 5 minutos y se dejó en reposo por 10 minutos, tomando de la interfase formada, un 1 mL con pipeta estéril para iniciar el proceso de diluciones seriadas hasta 10-7 en tubos con tapa de rosca con 9 mL de agua peptona. Una vez obtenidas las diluciones, se inoculó 0,1 mL (100 μL) en la dilución 10-2 hasta 10-7 en tres réplicas por triplicado, (repitiendo este mismo procedimiento para cada una de las muestras compuestas), empleando viales de vidrio incoloro estériles con 5 mL de medio semisólido NFb (semiespecífico para Azospirillum spp. Ácido málico 5 g/L; K2HPO4 0.5 g/L; MgSO4.7H2O 0.2 g/L; NaCl 0,1 g/L; CaCl2.2H2O 0.02 g/L; Solución Micronutrientes 2 mL; Azul de Bromotimol 2 mL (Solución 0.5 % en 0.2 N KOH); FeEDTA 4 mL; Solución Vitaminas 1 mL; KOH 4.5 g/L). JMV (semiespecífico para Burkholderia spp.: Manitol 5 g/L; KH2PO4 0.6 g/L; MgSO4.7H2O 0.2 g/L; NaCl 0.1 g/L; CaCl2.2H2O 0.2 g/L; Solución de Micronutrientes 2 mL; Azul de Bromotimol 2 mL; FeEDTA 4 mL; Solución Vitaminas 1 mL). LGI (semiespecífico para Gluconacetobacter spp.: Sacarosa 100 g/L; K2HPO4 0.2 g/L; KH2PO4 0.6 g/L; MgSO4.7H2O 0.2 g/L; CaCl2.2H2O 0.02 g/L; Na2MO4.2H2O 0.002 g/L; FeCl3.6H2O 0.01 g/L; Azul de Bromotimol 5 mL (Solución 0,5% en 0,2 N KOH), JNFb (semiespecífico para Herbaspirillum spp.: Ácido málico 5.0 g/L; K2HPO4 0.5 g/L; KH2PO4 1.8 g/L; MgSO4.7H2O 0.2 g/L; NaCl 0.1 g/L; CaCl2.2H2O 0.02 g/L; Solución de Micronutrientes 2 mL; Azul de Bromotimol 2 mL (Solución 0,5% en 0,2N KOH); FeEDTA 4 mL; Solución de Vitaminas 1 mL; KOH 4,5 g/L), sellados con tapones de gasa estéril.

Se elaboró un formato de encuesta la cual se aplicó a los propietarios de los cultivos de cacao de las fincas El Porvenir, Florilandia y Villa antigua, de la Vereda Astilleros, municipio El Zulia, Departamento Norte de Santander, Colombia; sobre el manejo que los cacaotales, edad del cultivo, área sembrada, manejo agronómico, tipo de fertilización, sistema de riego, producción, especies de sombrío, uso anterior de suelo, georreferenciando cada cultivo mediante el uso de GPS Marca Garmin MAP 78s.

Toma de muestras de suelos cacaoteros Para la toma de muestras se recorrieron los lotes en zig-zag, seleccionando árboles de cacao al azar que presentaran buen estado fitosanitario y se encontraran cercanos al centro del cultivo. Dentro de cada uno de los tres cultivos, se tomaron tres muestras compuestas de suelo rizosférico para un total de nueve muestras, las cuales se conformaron tomando submuestras (20 por Ha) hasta los 10 cm de profundidad en forma de “V”, limpiando previamente la superficie del terreno, teniendo en cuenta que cada submuestra fuera del mismo volumen que las demás y representara la misma sección transversal del volumen del que se tomaba la muestra (una misma profundidad) (Sosa, 2002), estas submuestras se depositaron en un balde limpio y se mezclaron para tomar 1 kg de muestra compuesta, que fue puesta en una bolsa limpia y debidamente rotulada con la información de la muestra.

Análisis físicos y químicos Muestras pares de suelo rizosférico se trasladaron hasta el laboratorio Bioambiental de la Universidad Nacional Experimental del Táchira (UNET) para los análisis fisicoquímicos. La textura se determinó por el método del hidrómetro de Bouyoucos (Bouyoucos, 1962); el porcentaje de materia orgánica (MO) se determinó por el método de digestión húmeda de Wakley y Black (Jackson, 1970); Calcio, Magnesio y Potasio con solución de Acetato de amonio y se hizo lectura mediante absorción atómica (Perkin Elmer AAnalyst 100), la conductividad eléctrica se realizó por medio de un conductímetro sobre extracto de suelo. Para la medición del P soluble se utilizó el método de Bray I (Bray y Kurtz, 1945), la cuantificación se llevó a cabo por colorimetría azul de molibdeno (Spectronic 2.0, ThermoSpectronic). El pH fue determinado por suspensión acuosa: 1:5 suelo en agua agitada durante 20 minutos (Jackson, 1970) utilizando un electrodo de vidrio (pH METER BT-600, Boeco). Los micronutrientes (Magnesio, Zinc, Hierro, Cobre) se determinaron por el método de extracción con la solución Carolina del Norte, haciendo lectura por espectrofotometría de absorción atómica (Perkin Elmer AAnalyst 100). 42

La solución de micronutrientes se preparó con CuSO4.5H2O 0,04 g/L; ZnSO4.7H2O 1,20 g/L; H3BO3 1,40 g/L; Na2MoO4.H2O 1,00 g/L; MnSO4.H2O 1,175 g/L. La solución de vitaminas: Biotina 10 mg; PiridoxolHCl 20 mg; disuelta en baño maría y completado el volumen para 100 mL con agua destilada. La solución Fe EDTA (Solución 1,64% - g/100mL): NaEDTA 0,746 g; FeSO4 0,556 g. Para la preparación del medio semisólido se adicionó 1.8 gr / Litro de agar ajustándose pH para NFb (6,8), JMV (4.5), LGI (6,0), JNFb (5.8) (Baldani et al., 1996). Los viales inoculados con las diluciones, se incubaron durante 7 días a 32 °C, observando la formación de película subsuperficial para crecimiento positivo, para cada dilución y cada repetición realizada. Los datos de la cuantificación por NMP de las bacterias diazótrofas, se interpretaron según la tabla de McCraddy (Döbereiner et al., 1995) y transformados a logaritmo mediante el software Statgraphics 15.0.

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Resultados y discusión Caracterización de los cultivos de cacao El sistema de producción de cacao en Colombia tradicionalmente ha sido una explotación de economía campesina, por lo cual se requiere consultar directamente al productor; por ello entre más completo sea el sistema de recolección de información de la finca y del cultivo, se dispondrá de más información para analizar y lograr comprender el estado del mismo. De allí que la caracterización previa de las zonas de muestreo es de gran importancia, ya que proporciona información que con el diagnóstico visual no es posible detectar (tabla 1). Los cacaotales de las fincas estudio, se encuentran en terrenos topográficamente planos, entre los 114 y 130 msnm, temperatura promedio de 30 °C y una precipitación anual de 910-1610 mm, que acorde con lo reportado por Rojas & Sacristán (2009), se encuentran en unas condiciones ecofisiológicas moderadamente aptas para el cultivo, dado que este cultivo en Colombia se desarrolla mejor sobre los 400 msnm, a una temperatura promedio entre 24 y 28 °C, y una precipitación promedio anual mayor a los 1800 mm. Dado que el árbol de cacao es una especie umbrófila, es decir, que requiere de sombra para su normal desarrollo; los cultivos se hallaron acompañados de especies de sombrío permanente como ceibo (Cedre-

la adorata), pardillo (Cordia alliodora), acacia (Acacia mangium wild) y/o Urapo (Tabebuia rosea), lo que trae además beneficios ambientales y económicos tanto para el agricultor como para el cultivo, ya que los árboles de sombra ayudan a reducir el estrés, debido a que mejoran las condiciones climáticas adversas y los desequilibrios nutricionales (Beer et al.,1987), además de aumentar el contenido de materia orgánica mediante el reciclaje de nutrientes. La caracterización fisicoquímica de las muestras de suelo rizosférico se reporta detalladamente en la tabla 2. El contenido de materia orgánica presente en los suelos cacaoteros analizados osciló entre 0.81 y 2.59 %, una concentración baja según lo reportado por Rojo & Urbano (1992) quienes indican que el porcentaje normal debería ser de 3 a 5 % en los horizontes superficiales de los suelos sometidos a laboreo, y con lo reportado por Rojas y Sacristán (2009) quienes establecen que un porcentaje mayor al 4%, es la cantidad ideal para el cultivo de cacao. El mayor contenido de MO se reportó en El Porvenir (2.59 %), infiriéndose que esta concentración es debida al pH (6.48), a la mayor vegetación y pasturas presentes en el lugar; además a que este suelo se había utilizado anteriormente como potrero de baja intensidad. Los análisis fisicoquímicos reportaron además bajas cantidades de elementos importantes como Potasio (K) y Fósforo (P), lo cual puede afectar procesos me-

Tabla 1. Caracterización de los cultivos de cacao de las fincas estudio. Datos

Finca El Porvenir

Finca Florilandia

Finca Villa Antigua

Ubicación geográfica

N 8° 11.068´ W 072°32.426´

N 8° 11.204´ W 072°33.144´

N 8° 10.983´ W 072° 33.558´

Altitud

130 msnm

114 msnm

115 msnm

Temperatura

30 °C

31 °C

30 °C

Edad

4 años

5 años

6 años

Tamaño

1 Ht.

5 Ht.

5 Ht

Riego

Sin riego.

Por goteo.

Sin riego.

Manejo agronómico

Poda, Control de malezas, Control fitosanitario y Fertilización.

Tipo de fertilización

Fertilización química: 3 veces / año. Encalamiento. 10:20:20, Triple 15, Triple 18.

Fertilización química: 3 veces / año. Encalamiento. Humus líquido El Cedro ®, Urea, KCL, DAP.

Fertilización química: 3 veces / año. Encalamiento, Abono químico, Roca fosfórica. Triple 15, KCL, DAP.

Especies de sombrío

Pardillo, ceibo, matarratón

Pardillo, Urapo.

Pardillo, Urapo Acacia.

Cultivo anterior

Potrero de baja intensidad.

Arroz

Cuantificación de diazótrofas de suelos cacaoteros por la técnica de NMP 43

Tabla 2. Caracterización fisicoquímica de los suelos rizosféricos de los cultivos de cacao estudio. Finca El Porvenir

Finca Florilandia

6.48

5.32

5.42

2.59 %

1.13 %

0.81 %

Fósforo

6 ppm

4 ppm

5 ppm

Potasio

137 ppm

53 ppm

52 ppm

Calcio

1870 ppm

588 ppm

637 ppm

Magnesio

243 ppm

91 ppm

83 ppm

Manganeso

61 ppm

16 ppm

31 ppm

Zinc

6 ppm

4 ppm

3 ppm

Hierro

50 ppm

176 ppm

65 ppm

Cobre

0.5 ppm

3 ppm

1 ppm

Arcilla

17 %

22 %

Limo

53 %

61 %

16 %

Textura

Franco/limoso

Franco/arcilloso/arenoso

tabólicos en las plantas, incidiendo de forma morfológica o celular el desarrollo del cultivo (Rojo & Urbano 1992). Ormeño & Ovalle (2011) reportan que el uso de fertilizantes nitrogenados como la urea ayudan a remover el Calcio (Ca) y en menor grado el Magnesio (Mg); los resultados de los suelos de la finca Florilandia coinciden con esta afirmación, encontrándose valores muy bajos de estos elementos (Mg: 91ppm, Ca: 588 ppm) para el cultivo, lo que podría deberse al uso de urea como fertilizante. Así mismo las bajas concentraciones de Ca, se evidencian con necrosis en los bordes o puntas de las hojas jóvenes, impidiendo el crecimiento de las plantas, generando una clorosis general e interviniendo en los procesos fotosintéticos (Mantilla et al., 2009). El Mg es el elemento base en la formación de clorofila, indispensable en la fotosíntesis, activa los sistemas enzimáticos y contribuye al aprovechamiento de P dentro de la planta, necesario en la síntesis de carbohidratos y por consiguiente en la producción de grasas que es esencial para determinar la calidad del grano de cacao (Urquhart, 1963); en las muestras de Florilanda (91 ppm) y Villa antigua (83 ppm) en comparación con las muestras de El porvenir (243 ppm) la marcada deficiencia de este elemento puede verse relacionada a la acidez de los suelos, dado que como también lo menciona el mismo autor, el Mg se pierde de forma acelerada conforme el suelo va aumentando en acidez como se evidencia en este caso. Los valores de pH más ácidos correspondieron a los suelos de Florilandia (5.32) y Villa Antigua (5.42), suelos que anteriormente fueron cultivados por más de 2 años con arroz, por 44

Finca Villa Antigua

Parámetros

consiguiente estos valores de acidez se atribuyen a que los suelos tardan más tiempo en recuperarse del exceso de agroquímicos como los empleados en este tipo de cultivo (Santos et al., 2008). Por otro, lado el pH de Porvenir (6.48) favorece al cultivo dado que las formas más solubles y disponibles de P, están presentes en el rango de 6.0 a 7.0 (Inpofos, 1997). Con respecto al contenido de micronutrientes, estos se encontraron en concentraciones variadas. El contenido de Cobre fue mayor en las muestras de Florilandia con un valor de 3 ppm. Aunque este micronutriente es poco requerido por los cultivos, puede generar en casos extremos de escases, clorosis y muerte descendente de los crecimientos terminales (Mantilla et al., 2009). Así mismo, el contenido de Fe, fue mayor en la finca Florilandia con un valor de 176 ppm, pero su deficiencia puede generar clorosis férrica en las plantas de cacao de El Porvenir (50 ppm) y Villa Antigua (65 ppm), debido a que este elemento es importante para la iniciación de la nodulación y para el proceso de fijación biológica del Nitrógeno (Taiz & Zeiger, 2006).

NMP (método del Numero Más Probable) El análisis de varianza realizado a los resultados de cuantificación por la técnica de NMP, registró diferencias significativas (p>0,05) entre los suelos cacaoteros respecto a los medios de cultivo NFb, JMV, LGI, JNFb para las poblaciones de géneros bacterianos diazotróficos (tabla 3), por lo cual se infiere que el manejo de los suelos, influye directamente en el tamaño de estas poblaciones, acorde a lo reportado por Soares et al.

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Tabla 3. Población celular de bacterianas diazótrofas, transformadas en valores logarítmicos en relación a los suelos cacaoteros y al medio de cultivo. Medio de cultivo

Población de Células (NMP/gr de suelo)

Log_Pob_cel

El Porvenir

NFb

68500

4.84 ef

Florilandia

NFb

55833333

7.75 a

Villa Antigua

NFb

2583333

6.41 bc

El Porvenir

JNFb

2577

3.41 fg

Florilandia

JNFb

192367

5.28 ef

Villa Antigua

JNFb

47000

4.67 e

El Porvenir

JMV

75333

4.88 de

Florilandia

JMV

7633333

6.88 ab

Villa Antigua

JMV

856667

5.93 bcd

El Porvenir

LGI

933

2.97 g

Florilandia

LGI

17163333

7.23 ab

Villa Antigua

LGI

196667

5.29 cde

Origen muestra

Análisis estadístico con datos transformados en Log. Media de 3 repeticiones. Medias seguidas con la misma letra en cada medio no presentan diferencias significativas entre sí (p> 0,05).

(2006), quien encontró variabilidad en muestras de suelo rizosférico del cultivo de avena (Avena sativa), manejado agronómicamente de forma diferente. La mayor abundancia de diazótrofas, fue hallada en los suelos de Florilandia, la cual maneja un sistema de riego por goteo, influyendo positivamente en la zona de rizósfera y en la planta, dado que según Jadin & Jacquemart (1978), este tipo de irrigación acelera la tasa de desarrollo de las plantas, aumenta el número de flores y los rendimientos del cultivo, al acrecentar la auto-defensa de los cacaotales con relación a las plagas y ofreciendo otras ventajas adicionales como alta uniformidad, la posibilidad de aplicar fertilizantes disueltos en el agua de riego, y los menores requerimientos de mano de obra (Sellés et al., 2003). Tal abundancia se atribuye además, a que este cultivo fue el único abonado orgánicamente con humus líquido, el cual según lo reportado por Ormeño & Ovalle (2011), es una forma de aplicar nutrientes para las plantas y mejorar la calidad química de los suelos, con ello se favorecen las condiciones para preservar y fomentar la diversidad bacteriana de la zona de rizósfera. Las menores poblaciones de diazótrofas se cuantificaron en las muestras de El Porvenir, cuyo suelo reportó un pH de 6.48, al contrario que las muestras de Florilandia (5.32) y Villa Antigua (5.42), las cuales presentaron un pH más ácido, pudiendo ser este un factor determinante en el número de bacterias con características similares a los géneros Herbaspirillum sp., Gluconacetobacter sp. y Burkholderia sp. debido, a que estas tienen unos requerimientos de pH ácidos

o ligeramente ácidos, de entre 5.5 – 6.2 para poder crecer. Al contrastar las poblaciones bacterianas, se reportan diferencias altamente significativas de los morfotipos presentes en los medios de cultivo Nfb y JMV, en contraste con JNFb y LGI, donde se reportaron las poblaciones más bajas. En la tabla 4 se indican en unidades logarítmicas las poblaciones de morfotipos obtenidos con características similares a diazótrofas de los géneros Azospirillum sp., Herbaspirillum sp., Burkholderia sp., Gluconacetobacter sp.

Tabla 4. Poblaciones de bacterias diazótrofas presentes en los suelos cacaoteros y transformadas en logaritmo. Género bacteriano

Medio

Log_Pob_cel

Azospirillum sp.

NFb

6.33 a

Herbaspirillum sp.

JNFb

4.45 c

Burkholderia sp.

JMV

5.59 a

Gluconacetobacter sp.

LGI

5.16 b

Análisis estadístico con datos transformados en Log. Media de 3 repeticiones. Medias seguidas con la misma letra en cada medio no presentan diferencias significativas entre sí (p>0,05).

La mayor cuantificación, para el género presuntivamente Azospirillum sp. se reportó en el medio NFb,

Cuantificación de diazótrofas de suelos cacaoteros por la técnica de NMP 45

seguido de Burkholderia sp., ello debido a que estos géneros bacterianos pueden establecerse en la raíz de las plantas, así como en el suelo subyacente (Cárdenas et al., 2010). Además, Burkholderia sp., es un buen colonizador de la rizósfera y representa uno de los grupos bacterianos más predominantes en diversos cultivos como en el maíz (Perín et al., 2006). La población diazótrofa de morfotipos similares a los géneros Gluconacetobacter sp. y Herbaspirillum sp. estuvo presente en menor cantidad, debido a que estos son en su mayoría microorganismos endófitos, los cuales pasan la mayor parte de su ciclo vital en el interior de las plantas sin causarles daños aparentes (Schmid et al., 2006, Punschke & Mayans, 2011). Sin embargo, Gluconacetobacter sp. al ser predominantemente endófito, se puede encontrar también en los suelos rizosféricos, liberado por medio de los lixiviados radicales, que a su vez, enriquecen el suelo con nutrientes esenciales como P y K, contribuyendo al reciclaje de nutrientes por parte de las plantas (Taiz & Zeiger, 2006), así mismo las bacterias exudan hormonas vegetales como las auxinas, citoquininas y giberelinas, las cuales les permiten adaptarse y colonizar el ambiente rizosférico con mayor facilidad (Cárdenas et al., 2010). La baja cuantificación de Herbaspirillum sp. concuerda con Melloni et al., (2004), quien reportó que la población de este género se ve afectada por las condiciones del suelo los tipos de vegetación y la época climática en la cual se realicen los muestreos de los suelos.

Conclusiones La caracterización de los tres cultivos reportó diferencias en el área cultivada, manejo del riego, edad del cultivo de cacao, manejo agronómico y tipo de fertilización, pudiendo incidir en el estado del suelo y en las condiciones para el establecimiento de bacterias diazótrofas. Las condiciones agroecológicas y fisicoquímicas de los suelos son moderadamente aptas para el cultivo de cacao; teniendo en cuenta que el grado de acidez de las muestras es influenciado por el uso anterior del suelo. La fertilización aplicada en los cultivos de cacao caracterizados es principalmente inorgánica, y no se sigue un plan de fertilización, previo estudio de las condiciones fisicoquímica del suelo y de las condiciones agroecológicas. La cuantificación de bacterias diazótrofas por NMP reporta mayores poblaciones de diazótrofas presuntivamente de los géneros Azospirillum sp. y Bukholderia sp. las cuales abundan en la zona de rizósfera, respecto a los géneros Herbaspirillum sp. y Gluconacetobacter sp. que se reportaron en menor población debido a la naturaleza endófita de estos. La menor cuantificación de bacterias diazótrofas se reportó en los suelos rizosféricos de la finca El Porvenir 46

producto de que estos suelos habían sido sembrados anteriormente con cultivos de arroz, reportando además propiedades físicas y químicas moderadamente aptas para el cacao. La mayor cuantificación de bacterias diazótrofas se reportó en las muestras de la finca Florilandia, dado que utiliza un sistema de riego por goteo y anualmente se le aplica al cultivo un humus líquido, condiciones que se infiere, favorecieron el hábitat microbiano. Los factores que condicionaron la presencia o ausencia de bacterias diazótrofas en las muestras de suelo rizosférico de árboles de cacao fueron: las condiciones físicoquímicas del suelo, el contenido de materia orgánica, humedad/riego, pH, y las relaciones climáticas al momento de la toma de las muestras que condicionan a su vez la cantidad de exudados de las raíces de la plantas.

Agradecimientos A la Universidad Francisco de Paula Santander por la financiación del proyecto, a los cacaocultores de la Vereda Astilleros y a la Federación de cacaocultores – Fedecacao, regional Norte de Santander.

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Cuantificación de diazótrofas de suelos cacaoteros por la técnica de NMP 47

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa derivada de metagenomas de suelos agrícolas colombianos Cloning, expression and characterization of a novel esterase derived from colombian agricultural soils metagenomes Carolina Villamil*, Patricia Del Portillo**, Alvaro Monguí** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61520

Resumen El presente trabajo tuvo como objetivo la bioprospección de ADN metagenómico derivado de comunidades microbianas asociadas a un agroecosistema de importancia nacional. Este análisis permitió realizar la producción, expresión, purificación y caracterización de una enzima novedosa con actividad esterasa. Esta enzima, denominada LipM, había sido previamente identificada en clones metagenómicos derivados de suelos dedicados al cultivo de papa criolla (Solanum pureja), mediante secuencia de nueva generación y análisis bioinformáticos. La secuencia codificante de la enzima fue clonada en el vector pBADgiii y expresada en E. coli como sistema de expresión, lo que permitió optimizar el proceso de producción recombinante y su posterior purificación. Funcionalmente la enzima presentó una mayor afinidad por sustratos de p-nitrofenil con ácidos grasos de cadena corta (<C8). LipM mostró completa funcionalidad a temperaturas entre 30 – 37 °C y en valores de pH cercanos al fisiológico (entre 7.0 y 8.0). Igualmente, esta enzima exhibió buena estabilidad en presencia de varios iones metálicos, inhibidores y 0.1% (p/v) de SDS. Su alto nivel de estabilidad en presencia de iones metálicos e inhibidores, así como su particular especificidad en cuanto a sustratos, la hacen una enzima óptima para utilización en diferentes aplicaciones biotecnológicas. Palabras clave: metagenómica, enzima esterasa, caracterización, suelos, Lipasa/esterasa.

Abstract The present work had as a main objective to bioprospect metagenomic DNA from microbial communities associated with an agro-ecosystem of national importance. This analysis allowed the production, expression, purification and characterization of a novel enzyme with esterase activity. This enzyme, named here as LipM, was previously identified in metagenomic clones derived from soils dedicated to creole potato (Solanum pureja) crops by means of next-generation sequencing and bioinformatics analyses. The coding sequence of the enzyme was cloned into pBADgiii vector and expressed in E. coli as an expression system, allowing to optimize its recombinant production process and its further purification. The enzyme functionally showed a greater affinity for p-nitrophenyl substrates with short-chain fatty acids (<C8). LipM showed full functionality at temperatures between 30 - 37°C and close to physiological pH (between 7.0 and 8.0). This enzyme also exhibited proper stability in the presence of various metal ions, inhibitors and at 0.1% (w/v) of SDS. Its high level of stability in the presence of inhibitors, metal ions and its particular specificity of substrates make it optimal for use in various biotechnology applications. Key words: metagenomics, esterase enzyme, characterization, soil, lipase/esterase. Recibido: diciembre 12 de 2015 Aprobado: octubre 6 de 2016

* **

Bcs., Corporación CorpoGen Cr5 No 66a -34, Bogotá-Colombia. cvillamil@corpogen.org PhD, Biotecnología Molecular, Corporación CorpoGen Cr5 No 66a -34, Bogotá-Colombia. alvaro.mongui@corpogen.org

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Introducción La metagenómica corresponde al aislamiento y estudio del material genético total (metagenoma) asociado a un determinado ambiente natural. La importancia de la metagenómica, en comparación con la secuenciación de genomas individuales y el método tradicional de cultivo, radica en que permite analizar la información genética de la gran mayoría de microorganismos que no son cultivables en condiciones de laboratorio (hasta el 99%) (Staley & Konopka, 1985). Los metagenomas derivados de ambientes naturales, como es el caso específico de suelos, tienen ventajas adicionales ya que debido a las condiciones ambientales de este tipo de ecosistema, la comunidad microbiana que allí se encuentra es sumamente rica y diversa (Torsvik & Ovreas, 2002). Esto convierte a la metagenómica en una herramienta poderosa para explorar el potencial biocatalítico de las comunidades microbianas y/o sus moléculas provenientes de los ambientes edáficos (Lee & & Lee, 2013). Los ensayos realizados sobre librerías metagenómicas, tanto funcionales como aquellos basados en secuencia de ácidos nucleicos y análisis bioinformáticos, permiten identificar clones bacterianos con actividades de interés. Posteriormente, los genes asociados a dichos fenotipos pueden ser caracterizados e insertados en algún hospedero, con el fin de producir de forma recombinante las respectivas enzimas o metabolitos (Uchiyama & Miyazaki, 2009). Dentro de las diferentes clases de enzimas caracterizadas de metagenomas ambientales, las hidrolasas son altamente atractivas no solo por su importancia industrial, sino por tener una elevada especificidad de sustrato y una considerable estabilidad en solventes orgánicos (Hasan et al., 2006; Sharma et al., 2001; Uwe & Kazlauskas, 2006). Las hidrolasas de origen bacteriano (EC 3.1.1.3) son aquellas que catalizan la hidrólisis y la síntesis de acilgliceroles de cadenas largas o cortas. Pertenecen a un amplio y diverso grupo denominado esterasas (EC 3.1.1.x) que incluye las carboxilesterasas (EC 3.1.1.1), las lipasas verdaderas (EC 3.1.1.3) y las fosfolipasas (Arpigny & Jaeger, 1999). Las lipasas y esterasas comparten un dominio de estructura característico conocido como el plegamiento α/β de las hidrolasas, que incluye un sitio activo altamente conservado correspondiente al triado catalítico Ser-Asp-His (Arpigny & Jaeger, 1999). En general estas enzimas juegan un papel importante a nivel industrial, ya que están involucradas principalmente en los procesos de producción de detergentes, en el procesamiento de alimentos y en la síntesis orgánica estero-especifica (Hasan et al., 2006). Adicionalmente, las lipasas y las esterasas están relacionadas con la bioconversión de lípidos en diferentes procesos, como es el aprovechamiento de fuentes de carbono, la modificación o el reciclaje de las membranas celulares la síntesis de biopolímeros, la síntesis del diesel y la producción en general de pro-

ductos agroquímicos, saborizantes y fármacos (Hasan et al., 2006). La demanda actual del mercado por lipasas/esterasas ha favorecido, durante los últimos años, su exploración en el contexto de librerías metagenómicas. De esta forma, ensayos funcionales y bioinformáticos con librerías metagenómicas derivadas de una amplia variedad de ambientes naturales, como son sedimentos marinos (Zhu et al., 2013), lodos activados (Zhang & Han, 2009), aguas termales (López et al., 2014), manglares (Andreote et al., 2012) y compost (Kim et al., 2010), entre otros, han favorecido el descubrimiento de genes novedosos codificantes para lipasas y esterasas con alto potencial de aplicación biotecnológico e industrial. En estudios previos, nuestro grupo de investigación identificó un gen codificante para una lipasa/esterasa putativa, empleando métodos de secuencia masiva y análisis bioinformáticos, a partir de librerías metagenómicas de suelos de vocación agrícola (Calderón et al., manuscrito en preparación). En el presente artículo reportamos la clonación, expresión y caracterización de la actividad enzimática de la esterasa denominada LipM, usando para ello diferentes sustratos y evaluando el efecto del pH, la temperatura, diferentes cofactores e inhibidores, con el fin de determinar su rango y actividad relativa.

Materiales y Métodos Clonación de un gen con dominio α/β hidrolasa de un metagenoma ambiental El gen LipM, con dominio α/β hidrolasa fue amplificado de su clon metagenómico parental usando los iniciadores pBADgiiiA-LipM directo 5’- CG TCT AGA GCC TGT CGA TCA GCC AAC -3’ y pBADgiiiA-LipM reverso 5’- CG TCT AGA ACC AGG TGC GCC CTC -3’. Para la amplificación por PCR se inició con un paso de desnaturalización a 95 °C por 5 min, seguido por 35 ciclos de: (a) desnaturalización a 95 °C por 45 s, (b) anillaje a 56 °C por 45 s y (c) extensión a 72 °C por 1 min. Finalmente se incluyó una extensión final de 8 min a 72 °C. El producto de PCR obtenido fue purificado, completamente digerido con la enzima XbaI e insertado utilizando la enzima T4 ligasa, en el vector de expresión pBADgiiiA del kit pBADgiii_man (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EEUU), previamente digerido con la misma enzima de restricción y siguiendo las recomendaciones del fabricante. La correcta inserción de la secuencia codificante de LipM en el vector de expresión fue confirmada por secuenciación Sanger. El plásmido resultante, pBADgiiiA-LipM, fue transformado por electroporación en la bacteria Escherichia coli TOP10 (Thermo Fisher Scientific), siguiendo el protocolo del fabricante.

Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa 49

Expresión y purificación La bacteria E. coli TOP10 con el plásmido pBADgiiiALipM fue incubada en agitación (200 rpm) a 37 °C en medio de cultivo Luria Bertani (LB) suplementado con ampicilina 50 mg/mL, hasta alcanzar una OD600 de 0.4. Posteriormente, la expresión de la proteína LipM recombinante (rLipM) se llevó a cabo por inducción con 0.2 % (p/v) de L-arabinosa. Después de 4 horas adicionales de incubación, el cultivo se centrifugó a 4600 x g por 25 minutos a 4 °C. El pellet celular resultante fue resuspendido en buffer Tris 10mM, 6M urea, 100mM NaH2PO4 e imidazol 15mM a pH 8.0 (García et al., 2013; Lara, 2011). La lisis celular se llevó a cabo con 1/3 (v/v) de perlas de 0.1mm de zirconia/silica en FastPrep-24 (MP Biomedicals California, USA) siguiendo un protocolo de 4 ciclos de lisis por acción mecánica a 60 m /min por 40 s y luego una etapa de enfriamiento a 4 º C por 5 min. Las muestras fueron luego centrifugadas a 15700 x g por 15 min y el sobrenadante resultante se acopló con la resina Ni-NTA (Qiagen Duesseldorf, Alemania) en agitación suave durante 4 h a temperatura ambiente, siguiendo las indicaciones del fabricante para llevar a cabo la purificación proteica por cromatografía de afinidad. Posteriormente, el extracto acoplado a la resina fue lavado con el mismo buffer de lisis, con el propósito de remover todas las proteínas no retenidas en la resina. La proteína rLipM fue eluida utilizando buffer de lisis con diferentes concentraciones de Imidazol (60500 mM). Las fracciones resultantes se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12%, en condiciones reductoras y desnaturalizantes, durante 2 h a 80 voltios. Posteriormente, las proteínas se transfirieron a una membrana Hybond-polivinildifluoruro (PVDF) (Merckmillipore Massachusetts, EEUU), en cámara semiseca (Laboratorios Bio-Rad, California, EEUU) durante 4 h a 10 voltios. La membrana fue sometida a bloqueo en una solución de PBS, Tween 20 (0,05 %) y leche descremada (5% p/v) durante una hora y posteriormente incubada con un anticuerpo anti-Histidinas conjugado con peroxidasa (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA). La detección de las proteínas se realizó utilizando un estuche para revelado con sustrato de peroxidasa (Laboratorios Vector, California, EEUU). Las fracciones de elución que incluyeron la proteína rLipM purificada fueron dializadas usando membranas de nitrocelulosa de poro 12-14 kDa contra PBS a 4 º C por 18 h.

Ensayo de actividad enzimática La actividad enzimática de rLipM se evaluó por ensayo de actividad esterasa utilizando 12.5 µL de enzima purificada, 100 μL de buffer TRIS-HCl pH 7.5, para una concentración final de 50 mM y 12.5 μL de sustrato p-nitrofenil butirato (C4) (Sigma-Aldrich) para una concentración de 1 mM a 37 °C por 30 min. La cantidad de p-nitrofenol liberado se determinó por absorbancia a 410 nm en NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). La 50

reacción con Tris-HCl y PBS y sin enzima fue usada como blanco de ensayo y la Lipasa B de Candida antarctica (CalB) (Sigma-Aldrich) fue incluida como control positivo de la actividad. Las unidades enzimáticas se calcularon usando para ello una curva estándar de p-nitrofenol en un rango de concentración de 5 µM a 450 µM. Una unidad enzimática se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1µmol de sustrato por minuto bajo cada condición de ensayo (Zhu et al., 2013). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado y los resultados se graficaron en unidades relativas tomando el valor del resultado máximo para cada ensayo como el 100%.

Especificidad de sustrato La especificidad de sustrato de la enzima rLipM purificada se analizó utilizando ésteres de p-nitrofenil (p-NP-) con cadenas de ácidos grasos de diferentes longitudes: p-nitrofenil butirato (C4), octanoato, (C8) decanoato (C10), dodecanoato (C12), miristato (C14), palmitato (C16), y estearato (C18) previamente reconstituidos en acetonitrilo. Para los ensayos de actividad, 1 mM de cada uno de los sustratos en buffer Tris-HCl 50 mM pH 7.5, junto con 12.5 µL de enzima purificada, fueron incubados a 37 °C durante 30 minutos. Para los sustratos pNP- >C4 se adicionó 0.1 % (v/v) de Triton X-100 como agente emulsificante (Gawlicka et al., 2000).

Efecto de diferentes variables sobre la actividad esterasa La temperatura óptima de reacción para rLipM se evaluó incubando la enzima a diferentes temperaturas en un rango de 4 °C a 65 °C por 30 min y usando solo p-nitrofenil butirato como sustrato. El efecto del pH sobre la actividad esterasa de rLipM se evaluó midiendo la actividad de la enzima a 37 º C por 30 min, después de incubación con buffers a diferentes valores de pH: buffer fosfato (pH 7.0), buffer Tris-HCl (pH 8.0) buffer glicina-NaOH (pH 9.0), buffer bicarbonato (pH 10.0), buffer NaH2PO4-NaOH (pH 11.0) (Zhu et al., 2013). Para evaluar el efecto de varios iones metálicos sobre la actividad esterasa de LipM, la enzima purificada se incubo con 1mM de KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, BaCl2, ZnCl, CuCl2, MnCl2, CoCl2 en buffer Tris-HCl pH 7.5 a 37 °C por 30 min. Para evaluar los efectos de diferentes detergentes e inhibidores sobre la actividad esterasa de rLipM, la enzima purificada se incubó con los detergentes sodio dodecilsulfato (SDS), Tween 20 y Triton X-100. Por su parte, los inhibidores empleados fueron el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ditiotreitol (DTT) y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). Tanto los detergentes como los inhibidores fueron evaluados a una concentración

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final de 0.1% y/o 1% (p/v) o (v/v) o 10 mM en 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 7.5) a 37 º C por 30 min (Zhu et al., 2013). La actividad basal en cada caso se midió como en el ensayo estándar mencionado anteriormente, es decir, midiendo la actividad de degradación de cada uno de los buffers incluyendo el detergente o el inhibidor en ausencia de la enzima recombinante. Cada muestra se realizó por triplicado y el resultado graficado correspondió al promedio de los experimentos. En cada caso se incluyó la desviación estándar.

Resultados y Discusión El análisis bioinformático sobre insertos de ADN metagenómico provenientes de un suelo dedicado al cultivo de papa criolla (Calderón et al., manuscrito en preparación), permitió realizar la identificación de una secuencia codificante de 591 pares de bases (pb) para una enzima lipasa putativa con dominio α/β hidrolasas (PFAM: PF07859.7). Esta enzima de 317 aminoácidos (aa), denominada LipM, mostró un peso teórico de 42 kDa y punto isoeléctrico (pI) de 5.8. El análisis de la secuencia de nucleótidos de este gen en la base de datos del NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), no evidenció identidad con ninguna secuencia reportada hasta ahora. Por su parte, el análisis por BLASTp evidenció que la proteína LipM presentó una identidad de 49% en su secuencia de aminoácidos con una proteína lipasa de Mycobacterium thermoresistibile ATCC 19527 (gbEHI10768.1) y de 47 % con la lipasa/esterasa de Mycobacterium abscessus (gbEIU36003.1). La secuencia GDSAGG en esta proteína corresponde al motivo conservado GXSXG de las α/β hidrolasas (Holmquist, 2000). Según la secuencia de este dominio conservado, se sugiere que esta enzima podría pertenecer al grupo V de la clasificación de lipasas/esterasas (Arpigny & Jaeger, 1999).

Expresión y purificación de LipM Con el fin de realizar la caracterización enzimática, la secuencia codificante de la enzima putativa LipM fue amplificada y subclonada en un vector de expresión. La expresión in vitro de la enzima rLipM en E. coli y su posterior purificación por cromatografía de afinidad permitió evidenciar la integridad de la enzima por SDS-PAGE (figura 1). Este análisis con el extracto total recombinante y la proteína rLipM purificada mostró una sola banda cerca de un tamaño aproximado de 48 kDa, la cual coincide con el tamaño esperado de la proteína incluyendo la cola de histidinas para su reconocimiento y purificación.

Determinación de la especificidad de sustrato La determinación en la especificidad de sustrato de la enzima rLipM, fue evaluada empleando sustratos de p-nitrofenil con cadenas de ácidos grasos de diferente longitud. La enzima purificada mostró una alta afinidad

Figura 1. Expresión y purificación de rLipM. MP, Marcador de peso molecular de proteínas XL-OptiProtein Marker Applied Biological Materials Inc. (Richmond, Canada); 1, extracto de proteínas totales de la expresión de E. coli TOP10 pBADgiiiA-LipM sin inductor; 2, extracto de proteínas totales de la expresión de E. coli TOP10 pBADgiiiA-LipM después de la inducción con L-arabinosa; 3, proteína LipM purificada por cromatografía de afinidad.

por ácidos grasos de cadenas cortas (<C6) y menos afinidad por ácidos grasos de cadenas largas (>C8) (figura 2). La máxima actividad de rLipM, en este ensayo, fue observada para el sustrato p-NP-C4 seguido por p-NPC8, a una temperatura de 37 °C y pH de 7.5. Estos resultados clasifican a LipM como una esterasa (E.C EC 3.1.1.x) más que una lipasa (E.c. EC 3.1.1.3). Esta especificidad de sustrato se ha observado también en otras esterasas derivadas de metagenomas ambientales (Zhang & Han, 2009; Zhu et al., 2013), así como también en esterasas aisladas de microorganismos, como es el caso de la enzima esterasa TLE del hongo Thermomyces lanuginosus DSM 10635 (Li et al., 2014) y recientemente la esterasa termoestable Est-gela de Bacillus gelatini KACC 12197 (Kim et al., 2015). La máxima actividad de la enzima con p-nitrofenil butirato (C4) se consideró como el 100 % de actividad relativa.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática Adicionalmente, al determinar el efecto de la temperatura en la actividad enzimática de rLipM se observó que la temperatura óptima de actividad para esta enzima estuvo entre 30°C – 37°C (figura 3). También es importante resaltar que esta enzima conservó más de un 60% de su actividad en temperaturas que van entre 37°C y 60°C. Adicionalmente, a bajas temperaturas, en un rango de 4°C – 10ºC, rLipM siguió conservando valores significativos de actividad (40 – 50%), lo que

Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa 51

Efecto del pH sobre la actividad enzimática Debido a que la actividad catalítica de muchas enzimas es sensible a cambios de pH, el efecto de esta variable sobre la actividad enzimática de rLipM fue evaluado (figura 4). No se probaron pH ácidos debido a que el p-nitrofenol no se puede cuantificar a pH bajos. Este análisis evidenció que el nivel máximo de actividad de rLipM se alcanzó a pH 8.0, es decir a niveles fisiológicos (pH 7.0 – 8.0). Otros estudios también demuestran que un número importante de lipasas/esterasas tienen mayor actividad a pHs cercanos al fisiológico (Li et al., 2014; Luo, Ding, Xu, Zheng & Zhong, 2015). Por el contrario, otro estudio de una enzima esterasa proveniente de un ambiente extremo en Colombia, tuvo máxima actividad a 55ºC y pH alcalino (9.0) (López et al., 2014). Figura 2. Actividad enzimática relativa de rLipM con varios ésteres de p-nitrofenil con cadenas de ácidos grasos de diferentes longitudes (C4-C18) a pH 7.5 y 37 ºC por 30 min.

en general la hace una enzima muy estable y por ende con mucho potencial industrial. Estos resultados se relacionan con la amplia variabilidad en la actividad enzimática de lipasas/esterasas aisladas de metagenomas, con algunos ejemplos de enzimas termorresistentes (Chow et al., 2012; Fan et al., 2011; Yang et al., 2013) y algunos casos de enzimas que exhiben mayor actividad a temperatura ambiente o en el rango de 25 – 37ºC (Dong et al., 2015; Fang, Wang, Liu, & Jiao, 2015).

Figura 3. Efecto de la temperatura de reacción sobre la actividad enzimática de rLipM. Se muestra la actividad relativa de la hidrolisis de p-nitrofenil butirato (C4) a diferentes temperaturas en un rango de 4 ºC a 65 ºC, en ensayos a pH 7.5 y 37 ºC por 30 minutos. La actividad a 37 ºC correspondió al 100% de actividad.

Efecto de cofactores sobre la actividad enzimática Los cofactores inorgánicos, como es el caso de los iones metálicos, en muchos casos son esenciales para el adecuado funcionamiento de las enzimas. Por lo tanto, el sustrato enzimático con frecuencia tiene que estar unido a un activador que usualmente es un ión metal divalente (Eisenthal & Danson, 2002). La tabla 1 muestra el efecto de varios iones metálicos sobre la actividad de la enzima rLipM. La reacción se llevó a cabo por medio de la adición del sustrato y de determinados cofactores a concentración final de 1 mM, tomando la actividad enzimática sin cofactor como 100% de actividad relativa. De estos ensayos se observó que la actividad enzimática fue ligeramente aumentada por los iones K+ (124%), Li+ (120%), Mg2+ (110%) y en mayor medida por Ca2+ (131%) (tabla 1). El papel del

Figura 4. Efecto del pH sobre la actividad enzimática de rLipM. La actividad relativa se determinó a diferentes valores de pH (7.0 – 11.0) usando p-nitrofenil butirato como sustrato a 37 ºC por 30 minutos. La actividad a pH 8.0 correspondió al 100% de actividad relativa.

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Ca2+ como molécula de señalización celular y como activador de enzimas por medio de la estabilización ya ha sido reportada, más aún, su papel específico en enzimas lipolíticas ha sido reportado desde hace varias décadas (Gregory, Martin, Cheetham, & Rees, 1993); Kim et al., 1997; Posner & Morales, 1972; Simons et al., 1999). Sin embargo, cabe aclarar que la actividad enzimática de algunas lipasas y esterasas no se ve incrementada en presencia de iones Ca2+ (Kim et al., 2010; Zhu et al., 2013). Los iones Ba2+, Co2+, Zn2+ no tuvieron influencia sobre la actividad de rLipM. El ión Mn2+ en este caso tampoco modificó la actividad de la enzima, en contraste con lo que se ha reportado para otras esterasas (López et al., 2014). Por otro lado, la actividad enzimática fue inhibida ligeramente por Zn2+ (88%) y en mayor proporción por Cu+ (49%), siendo este último el ión que más efecto negativo tuvo sobre la actividad enzimática. El efecto negativo de este ión también ha sido reportado para otras esterasas obtenidas de diferentes muestras ambientales, como es el caso de unas enzimas provenientes de un metagenoma de lodos activados (Zhang & Han, 2009), la enzima EstEP16, derivada de un metagenoma de sedimento marino (Zhu et al., 2013) y la esterasa 499EST, proveniente de aguas termales colombianas (López et al., 2014).

Tabla 1. Efecto de iones metálicos sobre la actividad enzimática de rLipM.

ción de lipasas o esterasas, se encontró una inhibición completa con la presencia de Tween 20 y un efecto negativo por la adición de Triton X-100 (Dong et al., 2015; Rahman et al., 2016; Zhu et al., 2013). Sin embargo, a diferencia de otros estudios en presencia de SDS a una concentración de 0.1% (v/v) la actividad solo disminuyó en un 18% y adicionalmente a concentraciones de 1% (v/v) de SDS, la enzima retuvo una actividad residual mayor al 25%. El inhibidor EDTA no influyó en la actividad de la enzima indicando que ésta no requiere de cationes divalentes para ser funcional. En presencia del inhibidor PMSF la enzima conserva su actividad y se mantiene estable. Generalmente por poseer un sitio activo con serina se esperaría que hubiera una inhibición sin embargo, la enzima puede poseer una estructura de tapa que evite el efecto de inhibición de PMSF como en otros estudios (Chu, He, Guo, & Sun, 2008; Zhang & Han, 2009). Tabla 2. Efecto de algunos detergentes e inhibidores en la actividad de la enzima rLipM. Inihibidores y detergentes

Concentración

Actividad Relativa (%)

100,0

SDS

0.1% (p/v)

82,2

SDS

1% (p/v)

29,4

Triton x 100

1% (v/v)

27,3

Tween 20

1%(v/v)

0,0

Control

Ión metálico

Actividad Relativa (%)

Control

100

Ba2+

101.67

EDTA 1mM

1mM

141,60

92.62

EDTA 10mM

10mM

159,45

Li+

120.51

DTT

1% (v/v)

150,64

Cu2+

48.98

PMSF

1% (v/v)

124,42

Zn2+

87.91

CTAB

1% (v/v)

0,00

K+

124.49

Mn2+

94.14

Mg2+

110.78

Ca2+

131.29

Efecto de detergentes e inhibidores sobre la actividad enzimática El efecto de algunos inhibidores y detergentes en la actividad de la enzima LipMr se muestran en la tabla 2. En concordancia con varios artículos de caracteriza-

Conclusiones En esta investigación reportamos la caracterización de la enzima LipM proveniente de un suelo de dedicación agrícola en Colombia. Esta enzima fue aislada a partir de una librería metagenómica y pertenece a la familia V de la clasificación de lipasas/esterasa. Presentó una mayor afinidad por sustratos de p-nitrofenil de ácidos grasos de cadena corta con un amplio rango de actividad a diferentes temperaturas y pH, teniendo mayor actividad a temperaturas entre 30 °C – 37 °C y en valores de pH cercanos al fisiológico (entre 7.0 y 8.0). Igualmente presentó buena estabilidad en presencia de varios iones metálicos y algunos inhibidores. Con

Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa 53

base en los resultados de actividad reportados en esta investigación, consideramos que rLipM es una enzima con potencial biotecnológico e industrial, debido a que a 65 °C esta enzima conservó alrededor del 60% de su actividad, además de incrementar de forma significativa su actividad en presencia de CaCl2. Adicionalmente, rLipM sigue siendo parcialmente estable a concentraciones de 0.1-1% (p/v) de SDS. Este estudio también demostró que el enfoque metagenómico es muy útil para ampliar el conocimiento de la diversidad de enzimas, especialmente para esterasas bacterianas. El acceso a librerías metagenómicas ambientales es una fuente inmediata de nuevos biocatalizadores o enzimas con buen rendimiento que pueden, por un lado, ser aptas para optimizar los procesos de producción al introducir por ejemplo vectores de expresión citoplasmática o extracelular como el pBADgIII y/o cultivo en sistema de bioreactor y, por otro lado, pueden también ser modificadas por ingeniería genética para cumplir determinados propósitos de la industria. Este tipo de enzimas se podrían producir y comercializar en Colombia para procesos con mercado abierto, como el de transesterificación química de compuestos altamente contaminantes, producción de biodisel o como suplemento alimenticio de animales monogástricos.

Agradecimientos Este trabajo fue financiado por COLCIENCIAS bajo la financiación No. 0142-2013. También agradecemos al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia (MADR) por apoyar el Consorcio de Investigación en Metagenómica Agrícola (CIMA).

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Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa 55

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Primer reporte de un begomovirus presente en maracuyá amarillo [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degener)] en Valle del Cauca, Colombia First report of a begomovirus presents in yellow passionfruit [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degene)] in Valle del Cauca, Colombia Juan Carlos Vaca-Vaca*, Emerson Clovis Carrasco-Lozano**, Mónica Rodríguez-Rodríguez***, Jhon Fredy Betancur-Perez****, Karina López-López***** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.52904

Resumen El maracuyá amarillo es un cultivo de importancia económica para el Valle del Cauca, pero en los últimos años ha presentado una reducción de hasta un 80% en la producción debido a problemas virales. El objetivo del presente trabajo fue detectar y caracterizar parcialmente begomovirus que podrían estar afectando los cultivos de maracuyá amarillo localizados en dos zonas productoras del Valle del Cauca (La Unión y Palmira). Se colectaron hojas de maracuyá con síntomas típicos de enfermedad viral, se purificó su DNA genómico y se detectó la presencia de begomovirus bipartitas mediante PCR empleando cebadores específicos para el componente A y B, respectivamente. Cinco fragmentos de DNA correspondientes al genoma geminiviral A y B, fueron clonados, secuenciados y analizados con herramientas bioinformáticas. Los resultados evidencian por primera vez en Colombia de la presencia de un begomovirus en maracuyá amarillo. El análisis de la secuencias de nucleótidos indica que este begomovirus está más relacionado con el virus del mosaico enano del frijol, un geminivirus que afecta frijol en Colombia, y no con el virus de la distorsión severa de la hoja de maracuyá, el cual se reportó afectando maracuyá amarillo en Brasil. A la fecha, este resultado constituiría el primer reporte de un begomovirus (perteneciente a la familia Geminiviridae) que afecta maracuyá amarillo en Colombia y que podría ser diferente de otros begomovirus previamente reportados a nivel mundial afectando este cultivo. Palabras clave: Geminivirus, Passiflora edulis f. flavicarpa, PSLDV.

Abstract The yellow passion fruit is a crop of economic importance to the Valle del Cauca, but in recent years has been a reduction of up to 80% in production due to viral problems. The aim of this study was to detect and characterize partially begomovirus that could be affecting crops of yellow passionfruit located in two growing areas of the Valle del Cauca (La Union and Palmira). Passionfruit leaves with typical symptoms of viral disease were collected, purified genomic DNA and its bipartite begomovirus were detected by PCR using primers specific for component A and B, respectively. Five DNA fragments corresponding to geminiviral A and B genome were cloned, sequenced and analyzed with bioinformatics tools. The results show for the first time in Colombia the presence of a begomovirus in yellow passionfruit. The analysis of the nucleotide sequences indicates that this begomovirus is more related to bean BDMV, a geminivirus affecting beans in Colombia, not PSLDV, which was reported affecting yellow passionfruit in Brazil. To date, this result would be the first report of a bego*

Ph.D, Biotecnología de Plantas; MSc. Microbiología con Énfasis en Biotecnología. Departamento de Ciencias Agrícolas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. AA 237. Palmira, Valle del Cauca, Colombia. Autor para correspondencia, Email: jcvacava@unal.edu.co ** MSc. Ciencias Biológicas. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. AA 237. Palmira, Valle del Cauca, Colombia. Dirección Actual: Facultad de Agronomía, Universidad Nacional del Centro del Perú, Perú. *** Ingeniera Agrónoma. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. **** Doctor en Ciencias Agrarias. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. AA 237. Palmira, Valle del Cauca, Colombia. Dirección Actual: Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Manizales, Manizales, Caldas. ***** Ph.D, Biotecnología de Plantas. Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. AA 237. Palmira, Valle del Cauca, Colombia.

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movirus (belonging to the family Geminiviridae) affecting yellow passion fruit in Colombia, and that might be different from other begomovirus previously reported worldwide affecting this crop. Key words: Geminivirus, Passiflora edulis f. flavicarpa, PSLDV. Recibido: marzo 10 de 2016 Aprobado: octubre 24 de 2016

Introducción La familia Passifloraceae presenta 18 géneros y alrededor de 660 especies (Holm-Nielsen et al., 1988). Los principales productores a nivel mundial son Brasil, Ecuador, Colombia y Perú con aproximadamente 745 000 t/año (Passionfruit, 2015). En Colombia, el género Passiflora presenta 170 especies (Ocampo et al., 2007) de los cuales, el maracuyá amarillo [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degener)], es la especie más importante, debido a que sus frutos son comercializados como fruta fresca y procesada en mercados nacionales e internacionales (Ulmer & MacDougal, 2004). El Sistema de Estadísticas Agropecuarias–SEA (AGRONET, 2015), reportó una producción del cultivo de maracuyá de 95,152.2 toneladas y un área cultivada de 5,788.5 hectáreas para el año 2013, donde el departamento de Huila contribuyó con el 21.9% de la producción, seguido por el departamento de Meta con el 19.4% y el Valle del Cauca con 17.3%. El cultivo de maracuyá amarillo es afectado por diferentes enfermedades que disminuyen su producción y calidad, siendo las enfermedades virales una de las principales limitantes que están causando grandes pérdidas a los productores. Se estima que en el Valle del Cauca está ocasionando la disminución del rendimiento hasta en un 50% y cuando el cultivo alcanza una incidencia del virus entre el 30 y el 50% se afecta mucho la calidad del fruto causando pérdidas económicas que llegan a un 70% (Pérez, 2009)1. En los últimos años, en el Valle del Cauca se han evidenciado altas poblaciones de mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) biotipo B asociadas a cultivos agrícolas como el tomate, ají, pimentón y maracuyá (Rodríguez et al., 2012). B. tabaci biotipo B es el vector biológico de Begomovirus, un género viral de la familia Geminiviridae, que tiene un genoma circular de DNA cadena sencilla y que constituye el grupo más importante de fitopatógenos que están causando pérdidas significativas en diferentes cultivos localizados tanto en ecosistemas tropicales como subtropicales a nivel mundial (Rojas et al., 2005; Seal et al., 2006). Los Begomovirus afectan plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, representan el género viral con mayor número de especies reportadas a la fecha, con 288 especies (ICTV, 2015), y su genoma puede ser monopartita o bipartita. El genoma de los begomovirus bipartitas está compuesto por dos moléculas de DNA con un tamaño aproximado de 2.6kb donde cada uno de los componentes genómicos se denomina DNA-A 1

Santiago Pérez, Ingeniero Agrónomo Frutas Tropicales Valle del Cauca-Colombia.

y DNA-B, respectivamente. El DNA-A contiene los marcos de lectura abiertos que codifican para proteínas necesarias para la replicación, la transactivación y la encapsidación viral, mientras que el DNA-B contiene los marcos de lectura abiertos que codifican para proteínas necesarias para el movimiento del virus a corta y larga distancia dentro de la planta (Rojas et al., 2005). En Colombia, se han identificado dos virus afectando el cultivo de maracuyá amarillo: un potyvirus, cuya identidad fue superior al 97% con aislamientos del virus del mosaico de la soya (SMV) y un tymovirus, idéntico al virus del mosaico amarillo del maracuyá descrito en Brasil (Morales et al., 2001). A la fecha, Brasil es el único país que ha reportado begomovirus afectando el cultivo de maracuyá amarillo. Éste se identificó y caracterizó a nivel molecular y se denominó virus de la distorsión severa de la hoja de maracuyá (PSLDV, por sus siglas en Inglés), basado en los síntomas que ocasiona en maracuyá: mosaico amarillo en hoja, reducción severa de la lámina foliar y del crecimiento vegetal, reducción en el número y tamaño de frutos, y malformación de frutos (Novaes et al., 2003; Ferreira et al., 2010). Debido a que existía un reporte previo de un geminivirus (PSLDV) afectando el cultivo de maracuyá en Brasil y el hecho de que las poblaciones de mosca blanca en el Valle del Cauca así como en otros departamentos de Colombia están en aumento, surgió la inquietud de examinar los cultivos de maracuyá en esta región del país en busca de la presencia o no de geminivirus. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue detectar y caracterizar parcialmente begomovirus que podrían estar afectando los cultivos de maracuyá amarillo localizados en dos zonas productoras del Valle del Cauca (La Unión y Palmira). Los resultados obtenidos en esta investigación evidencian por vez primera en Colombia de la presencia de un begomovirus en maracuyá, el cuál podría ser diferente del geminivirus (PSLDV) previamente reportado afectando éste cultivo en Brasil.

Materiales y métodos Colecta de material vegetal. La recolección de material vegetal se realizó en dos cultivos comerciales de maracuyá amarillo Passiflora edulis f. flavicarpa (Degener) ubicados en los municipios de La Unión y Palmira, en el Departamento del Valle del Cauca entre los años 2010-2014. El cultivo se encontraba en etapa de floración con una edad aproximada de 5.5 meses de establecido. El muestreo en campo se llevó a cabo mediante la recolección de hojas jóvenes de

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maracuyá que presentaban síntomas típicos de la enfermedad geminiviral tales como: enanismo, mosaicos amarillo brillante, moteados cloróticos, clorosis foliar marginal, enrollamiento foliar, deformaciones foliares y arrugamientos de las hojas. Las muestras colectadas en campo fueron transportadas al Laboratorio de Fitopatología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia –Sede Palmira, en donde fueron sometidas a análisis moleculares. Extracción de DNA total. Para llevar a cabo los diferentes análisis moleculares se realizó una extracción de DNA genómico de las hojas de maracuyá colectadas empleando el DNeasy Plant Kit (QIAGEN®), siguiendo las instrucciones del fabricante. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para implementar esta estrategia molecular de análisis se siguió la metodología propuesta por Rojas et al. (1993); empleando los primers específicos de begomovirus bipartitas, PAL1v1978/ PARc496 y PBL1v2040/ PCRc1, que amplifican un fragmento aproximado de 1200 pb correspondiente al DNA del componente genómico A, y un fragmento aproximado de 600pb correspondiente al DNA del componente genómico B geminiviral, respectivamente. El fragmento de 1200pb contiene la región intergénica y parte de los marcos de lectura abiertos relacionados con replicación (proteína asociada a replicación, Rep) y encapsidación viral (proteína de la cápside, Cp); y el fragmento de 600pb contiene una sección de la región intergénica y del gen BC1 involucrado en el movimiento célula a célula del virus a través de los plasmodesmos. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 µl con los siguientes componentes: 500ng DNA genómico total, 1X buffer, 0.2 mM de una mezcla de dNTPs, 1.0 µM de cada primer, y 1.25U Taq polimerasa (Fermentas). Cada reacción de PCR se colocó en un termociclador C1000 (Biorad®) con las siguientes condiciones de amplificación: 95°C/180s, 35 ciclos de 95°C/30s, de 52°C/30s y de 72°C/60s; y una extensión de 5-30 minutos a 72°C. Los controles utilizados en las reacciones de PCR fueron: control positivo, DNA plasmídico que porta el virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV), un begomovirus bipartita que afecta tomate en Colombia (Vaca-Vaca et al., 2012); y control negativo, agua. Los fragmentos de DNA amplificados fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se visualizaron y fotografiaron utilizando un equipo de fotodocumentación (Molecular Imager Gel DocXR+ Systems BIORAD ®). Clonación y secuenciación. Los productos de DNA amplificados por PCR fueron ligados en el vector pGem T-Easy (Promega, Madison, WI, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante, transformadas en células de E. coli por choque térmico (Sambrook y Russell, 2001) y se verificó la presencia del inserto mediante un análisis de restricción con la enzima EcoRI. El DNA de las clonas que portaban inserto fue enviado a se58

cuenciar en MacroGen®-Korea. Para la secuenciación de los fragmentos clonados se utilizaron los iniciadores universales M13 forward y M13 reverse, empleando el método fluorescente del kit de secuenciación enzimática The Big Dye Terminador DNA (Perkin – Elmer Inc., Branchburg, NJ) y un secuenciador ABI Prisma 377 (Applied Biosystem Inc. Foster City, CA). Análisis bioinformático. Las lecturas de secuenciación de los fragmentos virales clonados fueron ensamblados empleando el software CLC Main Workbench 7.0 Qiagen®. Para conocer la identidad de los fragmentos secuenciados se realizó una comparación utilizando el programa Blastn contra la base de datos “refseq_genomic” de Genbank (Altschul et al., 1997). De acuerdo a este análisis, se bajaron del GenBank 19 secuencias parciales de begomovirus que mostraron la mayor identidad con el begomovirus aislado de maracuyá amarillo, con el objetivo de calcular el % de identidad a nivel de nucleótidos empleando el software CLC Main Workbench 7.0 Qiagen® (tabla 1). Con estas secuencias se realizó un alineamiento múltiple, donde se analizó un fragmento de 144nt correspondiente a la región que codifica para la proteína de la cápside (Cp) empleando el programa MUSCLE (Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation) (Edgar, 2004). En este análisis se incluyeron adicionalmente las siguientes secuencias de begomovirus: virus de la distorsión severa de la hoja de maracuyá (PSLDV, GenBank: NC_012786), virus del mosaico dorado del tomate (TGMV, GenBank: NC_001507), virus del moteado clorótico del tomate (TCMV, GenBank: NC_003664.1), virus del mosaico dorado del frijo (BGMV, GenBank: NC_004042); y dos begomovirus del viejo mundo: virus de la hoja curva de ají (ChLCV, GenBank: NC_004628) y el virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV, GenBank: NC_004005). Para establecer y verificar las relaciones de parentesco, se utilizó el software MEGA 6, aplicando el método de máxima probabilidad, basado en el modelo Tamura-Nei (Tamura et al., 2013), con 1000 réplicas del valor de arranque.

Resultados y discusión Detección de begomovirus en maracuyá amarilla colectada en La Unión y Palmira, Valle del Cauca En la figura 1 se observan los síntomas virales observados en las plantas de maracuyá colectadas: deformación de hojas y frutos, presencia de rugosidades, mosaicos amarillos, reducción en el tamaño del fruto, abultamiento y enrollamiento foliar. Mediante PCR se detectó la presencia de los dos componentes genómicos A y B típicos de un begomovirus bipartita en las hojas de maracuyá amarillo colectadas en los municipios de La Unión y Palmira, Valle del Cauca. En la figura 2A, se observa la amplificación en todas las muestras colectadas en Palmira de fragmentos de 1.2 y 0.6kb, correspondientes a los componente A y B be-

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Figura 1. Síntomas observados en cultivos de maracuyá amarillo en el Valle del Cauca. (A). Deformación y rugosidad foliar; (B). Deformación y reducción en el tamaño del fruto.

gomoviral, respectivamente. Donde, las muestras 1, 2 y 4 evidencian la presencia de ambos componentes, A y B, indicativo de la presencia de un begomovirus bipartita; mientras la muestra 3 solo presenta el componente A y la muestra 5, el componente B. Para las muestras colectadas en La Unión, dos muestras fueron positivas para el componente A y una muestra para el componente B (figura 2B). Este resultado indica que la muestra 2 presenta ambos componentes, A y B; mientras la muestra 1, únicamente se detecta la presencia del componente A. Este resultado se puede explicar teniendo en cuenta que los genomas de los begomovirus bipartitas se encapsidan de manera independiente, lo cual trae consecuencias en cuanto a su transmisión por su vector biológico B. tabaci. Es decir, se puede verificar cualquiera de los dos siguientes casos dependiendo de la distribución azarosa de cualquier de los dos componentes en la planta: uno, ambos componentes genómicos podrían ser transportados por B. tabaci en un mismo evento de alimentación de una planta infectada con este geminivirus a otra; y un segundo caso, es que al alimentarse el vector biológico de la planta infectada tan solo pueda adquirir uno de los dos componentes dependiendo de la disponibilidad de los mismos. Esta observación explicaría las razones por las cuales hay muestras de maracuyá que presentan ambos componentes A y B, o muestras que tan solo uno de los dos componentes es detectado por PCR. Es necesario que ambos componentes estén al mismo tiempo presentes para que el ciclo infectivo del virus se verifique, por lo que las muestras que dieron positivo para ambos componentes es muy probable que el ciclo infectivo del virus se esté verificando en todas sus fases; mientras que en aquellas donde solo se detectó la presencia de un único componente, por ejemplo el A, tan solo se esté verificando parte del ciclo infectivo sin que involucre movimientos a larga distancia ya que para ello se requiere la presencia del

componente B. Es decir, el componente A por si solo contiene determinantes de patogenicidad que pueden generar la aparición de sintomatología local no sistémica. La presencia de estos dos componentes virales, A y B, en las muestras de maracuyá colectadas en campo confirma la detección por primera vez de un begomovirus típico del nuevo mundo perteneciente a la familia Geminiviridae afectando cultivos de maracuyá amarillo en Colombia. Este resultado es relevante, ya que los begomovirus son considerados virus emergentes y pueden ocasionar daños severos a los cultivos hasta convertir estos en inviables.

Caracterización parcial de un begomovirus aislado de maracuyá amarillo en La Unión y Palmira, Valle del Cauca El fragmento de 1.2kb del componente A de la muestra 2 de La Unión y muestra 1 de Palmira, fue clonado y secuenciado. Se obtuvieron dos clonas para el fragmento de La Unión y una clona para el fragmento de Palmira. Los análisis de la secuencia de nucleótidos de los componentes A clonados presentaron un tamaño de 1160 nucleótidos, donde los tres insertos virales clonados mostraron ser idénticos. Este resultado indica que el begomovirus aislado de cultivos de maracuyá amarillo ubicados en Valle del Cauca (La Unión y Palmira) es una misma entidad viral. Un resultado similar fue encontrado para el virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV), un begomovirus que predomina afectando el cultivo de tomate en Valle del Cauca, donde todos los fragmentos clonados de muestras colectadas en diferentes lotes fueron idénticos (Vaca-Vaca et al., 2012). El fragmento de 1160nt secuenciado incluye un marco de lectura parcial de 700nt que codifica para una proteína asociada a replicación Rep (AL1); la región intergénica de 316nt que a su vez incluye una estructura de tallo y asa que contiene un elemento de

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Figura 2. Detección de begomovirus bipartitas en cultivos de maracuyá. La detección se realizó por reacción en cadena de la polimerasa empleando los primers específicos que amplifican fragmentos parciales de los componentes genómicos DNA-A y DNA-B (Rojas et al., 1992). El DNA-A amplifica un fragmento de ~1,2 kb, y el DNA-B amplifica un fragmento de 0,6 kb. Detección de Begomovirus en muestras colectadas en Palmira (A) y La Unión (B). M, Marcador de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Fermentas); -, control negativo PCR; +, control positivo de PCR (ver metodología); 1, 2, 3, 4 y 5, muestras de maracuyá evaluadas.

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secuencia nonanucleotídico conservado (TAATATTAT) típico de Begomovirus así como un marco de lectura parcial de 144nt que codifica para la proteína de la cápside (Cp o AR1). La secuencia parcial de 1160nt del componente A del begomovirus aislado de la muestra de maracuyá de La Unión fue depositada en la base de datos Genbank con el número de accesión KX827633. Al comparar la secuencia de 1160 nucleótidos del componente A contra PSLDV-A (GenBank: FJ972767.1), un begomovirus que afecta maracuyá en Brasil (Ferreira et al., 2010), se obtuvo un porcentaje de identidad de 73%, lo que estaría indicando que el begomovirus identificado en este trabajo es una entidad viral diferente de la detectada en Brasil. Con el fin de conocer si éste begomovirus estaba relacionado con algún otro miembro de la familia Geminiviridae se llevó a cabo una comparación de la secuencia de 1160 nucleótidos del componente A con secuencias de begomovirus reportados en la base de datos GenBank (base de datos utilizada: Refseq_genomic database). Los resultados de este análisis permitieron evidenciar que este begomovirus presentaba los porcentajes más altos de identidad a nivel de nucleótidos con begomovirus previamente aislados de frijol, malezas y tomate: 85% con el virus del mosaico clorótico de frijol aislado Venezuela:Rubio 932:2007 (BCMV-A, Genbank, NC_022005.1), que afecta frijol en Venezuela; 84% con el virus de la hoja distorsionada de datura aislado Venezuela:Rubio 933:2007 (DLDV-A, Genbank, NC_018717.1), reportado en la maleza Datura stramonium L. en Táchira, Venezuela; 85% con el virus del mosaico enano del frijol (BDMVA, Genbank, NC_001931.1), que afecta frijol en Palmira, Valle del Cauca, Colombia; 81% con el virus del mosaico dorado de sida Buckup aislado Jamaica:St. Elizabeth:2004 (SiGMBuV-A [JM:SE:04], Genbank, NC_014794.1), reportado en la maleza Sida spp. en Jamaica; 81% con virus de la hoja clorótica distorsionada del tomate aislado Venezuela:Zulia:2004 (TCLDV-A, Genbank, NC_015962.1); y 81% con el virus de la hoja curva moteada del tomate de Zulia (Genbank, NC_015122.1), que afecta tomate en Venezuela. Para el componente B geminiviral se obtuvieron dos clonas, una de la muestra colectada de maracuyá amarrillo en La Unión y una de Palmira. Los insertos presentaron un tamaño de 520 nucleótidos y fueron idénticos. El análisis bioinformático de esta secuencia en la base de datos GenBank (base de datos utilizada: Refseq_genomic database) empleando el programa blastn mostró porcentajes de identidad bajos con begomovirus que afectan frijol: 74% con BCMV-B (Genbank, NC_022003.1) que afecta frijol en Venezuela; 69% con BDMV-B (Genbank, NC_001930.1) que afecta frijol en Palmira (Colombia). Mientras que con PSLDV-B (GenBank, NC_012787.1) esté fragmento del componente B mostró una identidad del 83% pero con una cobertura del fragmento de sólo 34%.

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos al calcular el % de identidad a nivel de nucleótidos del fragmento de 1160nt del begomovirus aislado de maracuyá amarillo con begomovirus reportados en la base de datos GenBank. PSLDV-A aislado de maracuyá en Brasil mostró una identidad de únicamente 65.66% al comparar el fragmento completo de 1160 nt; y cuando se realizó la comparación con el segmento que codifica para la proteína de la cápside la identidad fue de únicamente 68.88% (tabla 1). El mayor % de identidad encontrada al analizar el fragmento de 1160nt fue de 85.57% con BCMV-A, un begomovirus aislado de Phaseolus vulgaris en Venezuela. Cuando se realizó la comparación con el segmento que codifica para la proteína de la cápside, la mayor identidad fue 88.19% con dos begomovirus: DLDV-A aislado de Datura stramonium y BClV-A, aislado de Phaseolus vulgaris, ambos begomovirus reportados en Venezuela. Recientemente, Brown et al. (2015), establecieron como criterio taxonómico para la demarcación de una nueva especie begomoviral un valor por debajo de 91% de identidad a nivel de nucleótidos del genoma completo del componente genómico A. En el presente trabajo de investigación se cuenta de una secuencia parcial de 1160 nt del genoma A (40% del genoma completo que tiene aproximadamente 2600nt), que permite únicamente concluir que la entidad begomoviral aislada de maracuyá amarillo en Valle de Cauca es diferente al aislado viral reportado de maracuyá en Brasil, así como de otros begomovirus reportados previamente a nivel mundial cuyas secuencias están depositadas en la base de datos GenBank. Vale la pena resaltar la relación de identidad del aislado begomoviral colombiano con otros geminivirus aislados de malezas tales como Datura y Sida spp, ya que las evidencias actuales indican que son las arvenses aquellas que fungen como hospederos alternativos por excelencia para la mayoría de los virus vegetales y los geminivirus no son la excepción a esta regla. Desde este punto de vista, las malezas se convierten en un sitio de paso o en un puente a partir del cual la mosca blanca B. tabaci puede tomar y transportar estas nuevas variantes de geminivirus hacia nuevos cultivares en los cuáles éstos se adaptan evolutivamente y emerger rápidamente como una amenaza fitopatológica para los mismos. Los resultados de Caraballi et al. (2004) confirman este hecho, al demostrar como la mosca blanca podría trasmitir el geminivirus ACMV, el virus africano del mosaico de la yuca, a la yuca en Colombia sí previamente era capaz de adaptarse a hospederos alternativos vegetales emparentados con este cultivo. Este pudo ser el camino que siguió el aislado begomoviral colombiano: es decir, inicialmente estuvo en una maleza y desde allí fue transportado por su vector biológico a los cultivos de maracuyá, posiblemente en varias ocasiones durante el devenir de su transcurso evolutivo, de tal manera que con el paso del tiempo llegó a convertirse en una entidad viral propia genéti-

Primer reporte de un begomovirus presente en maracuyá 61

Tabla 1. Porcentaje de identidad a nivel de nucleótidos obtenido al comparar el begomovirus aislado de cultivos de maracuyá amarillo (Passiflora edulis f. flavicarpa) ubicados en el Valle del Cauca (FRMara10A) con el componente A de begomovirus reportados en la base de datos GenBank. El alineamiento y comparación de secuencias se realizó con el programa CLC Main Workbench 7.0 Qiagen®. Se realizó la comparación de secuencias utilizando un fragmento del componente A de 1160nt de FRMara10A y un segmento parcial del gen que codifica para la proteína de la capside (Cp) de 144pb de FRMara10A. Las siglas de los virus se indican por su nombre en inglés.

Begomovirus

Hospedero / país

No. de accesión en GenBank

Fragm. 1160nt (%)

Cp (%)

Virus de la distorsión severa de la hoja de maracuyá (PFLDV)

Passiflora edulis f. flavicarpa / Brasil

NC_012786

65.66

68.88

Virus del mosaico clorótico de frijol aislado Venezuela:Rubio 932:2007 (BCMV)

Phaseolus vulgaris / Venezuela

NC_022005

85.57

84.03

Virus del mosaico enano del frijol (BDMV)

Frijol / Colombia

NC_001931

85.43

86.11

Virus de la hoja distorsionada de datura aislado Venezuela:Rubio 933:2007 (DLDV)

Datura stramonium / Venezuela

NC_018717

84.62

88.19

Virus del mosaico dorado de sida de Honduras (SiGMHV)

Sida spp. / Honduras

NC_004659

82.08

86.81

Virus del mosaico amarillo de Okra de México (OYMMV)

Abelmoschus esculentus (L.) Moench / México

NC_014066

80.65

86.81

Virus del amarillamiento de la vena de sida (SiYVV)

Sida spp. / Honduras

NC_004661

80.65

86.11

Virus de la hoja clorótica distorsionada del tomate aislado – [Venezuela:Zulia:2004] (TCLDV)

Tomate / Venezuela

NC_015962

80.17

80.56

Virus del mosaico dorado de sida Buckup aislado [Jamaica:St. Elizabeth:2004] – SiGMBuV-[JM:SE:04]

Sida spp. / Jamaica

NC_014794

80.03

75.69

Virus del moteado amarillo de sida (SiYMoV)

Malvastrum coromandelianum / Cuba

NC_016082

77.11

86.11

Virus de la hoja rizada de tomate de Sinaloa (STLCV)

Lycopersicon esculentum / Nicaragua

NC_009606

79.18

79.86

Virus del mosaico Amarillo de la papa de Trinidad (PYMV-T)

Tomate / Trinidad y Tobago

NC_004638

77.89

86.11

Virus de la mancha amarilla de corchorus (CoYSV)

Corchorus siliquosus / México

NC_008492

76.35

86.81

Virus de la clorosis de frijol aislado Venezuela:La Barinesa 459:2006 (BClV)

Phaseolus vulgaris / Venezuela

NC_019569

76.16

88.19

Virus del mosaic dorado de wissadula de St Thomas (WGMSTV)

Wissadula amplissima / Jamaica

NC_010948

76.64

77.78

Virus del mosaico Amarillo de la papa de Panamá (PYMV-Pa)

Tomate / Panamá

NC_002048

72.54

84.72

Virus del mosaico Amarillo de la papa (PYMV)

Papa /Venezuela

NC_001934

71.96

87.50

Virus del red amarilla de sida aislado BR:Vic2:10 (SiYNV)

Sida micrantha / Brasil

NC_020253

68.35

86.11

Virus del moteado de sida (SiMoV)

Sida spp. / Brasil

NC_004637

65.65

86.11

Virus de la hoja distorsionada de desmodium (DeLDV)

Desmodium glabrum / México

NC_008494

59.83

86.30

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 56-65

camente muy diferente de otros geminivirus que afectan este mismo cultivo en otras latitudes del planeta. En cuanto a los valores de identidad que el aislado colombiano presentó con geminivirus reportados afectado el cultivo de frijol, bien puede hipotetizarse que un fenómeno similar al planteado en malezas pudo verificarse: es decir, el aislado colombiano que afecta al maracuyá pudo haber evolucionado de un geminivirus que afectaba el cultivo del frijol o ambos evolucionaron de un antecesor común, sugiriendo que durante el devenir evolutivo el aislado colombiano que afecta el maracuyá bien sea se adaptó a infectar maracuyá o perdió su capacidad para infectar frijol. Los experimentos de pesudorecombinación obtenidos por Ferreira et al., (2010) demuestran que para el caso de PSLDV, este evolucionó muy probablemente a partir de uno o varios antecesores begomovirales que afectaban el tomate en épocas pretéritas. Si este es el caso del aislado geminiviral que está afectando el cultivo de maracuyá en Colombia, es materia aún por comprobar. Sin embargo es bien sabido que la región del Valle del Cauca ha sido un departamento líder en la producción de frijol en Colombia; miles de hectáreas de Valle del Cauca estuvieron cultivadas con frijol y hoy este cultivo se halla en declive debido en gran medida a la susceptibilidad de este cultivo a los virus, particularmente geminivirus (Cuellar & Morales, 2006; Cuellar et al., 2011). Es probable que ante la sensible disminución de las áreas sembradas de frijol, los geminivirus que lo afectaban se vieran presionados a buscar un hospedero alterno como el maracuyá. Allí los geminivirus se coadaptaron a tal punto que los aislados colombianos divergieron tanto que no se encuentran filogenéticamente relacionados con otros begomovirus que afectan este cultivo en otras latitudes del planeta. Este tipo de eventos ya han sido comprobados entre en geminivirus tales como el virus del mosaico del abutilón (AbMV), el virus del moteado del tomate (ToMoV) y el virus del mosaico enano del frijol (BDMV). Estos tres geminivirus están filogenéticamente relacionados, hecho que ha llevado a pensar que este complejo geminiviral evolucionó de un antecesor viral semejante al AbMV, a partir del cual divergieron el ToMoV y el BDMV los cuales con el tiempo se adaptaron al tomate y al frijol respectivamente (Gilbertson et al., 1993). Para conocer las relaciones filogenéticas de aislado begomoviral obtenido en este estudio con otros reportados a nivel mundial, se llevó a cabo un análisis de secuencia de nucleótidos empleando un fragmento que porta la región 5´ del gen que codifica para la proteína de la cápside (Cp) que tiene un tamaño de 144nt. En la figura 3 se aprecia el árbol filogenético obtenido a partir de la comparación de Cp entre geminivirus reportados a la fecha y el aislado colombiano que afecta el maracuyá (FRMara10A) corroborando que el aislado colombiano y PSLDV-A forman dos grupos diferentes a pesar de afectar un mismo hospedero

y ser ambos geminivirus bipartitas típicos del hemisferio occidental. El aislado colombiano FRMara10A se agrupa con los geminivirus DLDV-A aislado de Datura stramonium en Venezuela y BClV-A aislado de Phaseolus vulgaris en Venezuela. Este resultado permite hipotetizar que el geminivirus que está afectando el cultivo de maracuyá en Colombia está emparentado con begomovirus reportados en Venezuela que afectan cultivos de frijol así como con la maleza Datura stramonium y podría estar indicando que esta maleza podría ser huésped natural de este virus en campo. Mientras que PSLDV se relaciona más con TGMV, un begomovirus que afecta grandemente el cultivo de tomate en Brasil. La ausencia de reportes previos de geminivirus afectando maracuyá en Colombia puede estar correlacionada con el hecho de que los biotipos predominantes de mosca blanca estaban pobremente adaptados a alimentarse del maracuyá. Pudieron entonces surgir algunos individuos dentro de la población de mosca blanca que sí lograron colonizar maracuyá, cumpliéndose el principio de la virología clásica que afirma que para que una infección geminiviral se desarrolle debe primero ocurrir un fenómeno de coadaptación entre el virus, el vector biológico y el hospedero. Evidencias de este principio las obtuvo el grupo de Harkins et al. (2009), quienes demostraron que el virus del estriado del maíz (MSV) apareció por sucesivos eventos de recombinación que sucedieron en malezas relacionadas filogenéticamente con el maíz en África. Y que una vez el maíz fue introducido a este continente hacia los años 1800, variantes de estos MSV lograron colonizar desde las malezas al maíz emergiendo allí como una grave patología que afecta fuertemente la productividad de cultivo hoy en día.

Conclusiones Se detectó por primera vez la presencia de un begomovirus en cultivos de maracuyá amarillo ubicados en los municipios de la Unión y Palmira, Valle del Cauca, Colombia. Los análisis de secuencia de nucleótidos y el análisis filogenético mostraron que el begomovirus aislado de maracuyá en Colombia es un geminivirus diferente a PSLDV, un begomovirus previamente reportado afectando éste cultivo en Brasil. Los análisis de secuencias mostraron que el begomovirus aislado de maracuyá presenta un porcentaje de identidad menor de 91% con otros begomovirus reportados previamente a nivel mundial en el GenBank, indicando que podría ser una entidad viral nueva. Finalmente, es importante continuar estudiando los begomovirus que afectan el cultivo de maracuyá en otras regiones productoras en Colombia, obtener el genoma completo de este virus para realizar su identi-

Primer reporte de un begomovirus presente en maracuyá 63

Figura 3. Árbol filogenético construido a partir de un fragmento de 144 nt que codifica para el gen de la proteína de la cápside del begomovirus aislado de maracuyá en Colombia (FRMara10A) con otros begomovirus del mundo. Se indica con un asterisco el aislado colombiano, FRMara10A, descrito en este estudio y con dos asteriscos el aislado brasileño, PSLDV. Los begomovirus aislado de maracuyá forman dos grupos: un grupo del aislado colombiano, FRMara10A y un grupo del aislado brasileño, PSLDV descrito por Ferreira et al. (2010). ChLCV y TYLCV son begomovirus monopartitas y fueron usados como grupo de virus por fuera (outgroup). La barra debajo de cada árbol indica la sustitución de nucleótidos por sitio. Los nombres de los virus son descritos en la tabla 1 y metodología.

ficación plena, conocer su organización genómica y su diversidad genética, así como utilizarlo para establecer un programa de mejoramiento genético orientado a la identificación de materiales con resistencia a este geminivirus, acciones que permitan desarrollar estrategias efectivas de manejo integrado para disminuir

la incidencia de esta enfermedad viral en cultivos de maracuyá.

Agradecimientos Los autores expresan sus agradecimientos al Ingeniero Santiago Pérez quien colaboró con sus cultivos para la

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toma de las muestras de maracuyá y a la Dirección de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira (DIPAL) quien financió el proyecto (CÓDIGO HERMES 13711 y 26138). E. Carrasco-Lozano agradece al Programa Nacional de Becas (PRONABEC) del gobierno Peruano, por la beca otorgada para sus estudios de Maestría.

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Primer reporte de un begomovirus presente en maracuyá 65

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Infección de callo embriogénico friable de yuca con Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) Cassava friable embryogenic calli infection with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) Paula Díaz Tatis*, Carlos Andrés Zárate**, Adriana Bernal Giraldo***, Camilo López Carrascal**** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61523

Resumen Las nuevas tecnologías para la edición de genomas, como los TALEN y el sistema CRISPR/Cas9, representan una gran oportunidad para mejorar características deseables en diferentes organismos. Los TALEN son el resultado del acoplamiento de nucleasas a los TALE (Transcription Activator-Like Effectors), los cuales son efectores naturales de gran importancia en la patogénesis de las especies de Xanthomonas. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) es el agente causal del añublo bacteriano de la yuca, quien durante el proceso patogénico es capaz de translocar sus efectores a la célula vegetal mediante el sistema de secreción tipo tres (SSTT). Actualmente no hay protocolos estándar para la edición de genomas en yuca. En este estudio se exploró la posibilidad de translocar efectores sobre callo embriogénico friable (CEF) a través de la inoculación con Xam, con el fin de determinar el potencial de este patógeno como sistema de entrega de TALEN. El CEF de dos variedades de yuca susceptibles (COL2215 y cv. 60444) se cocultivaron con la cepa Xam668 a diferentes tiempos. Posteriormente, se evaluó la expresión de marcadores correspondientes a los genes blanco conocidos para los TALE presentes en esta cepa bacteriana. Aunque no se logró demostrar la translocación de los mismos en el tejido embriogénico, sí se lograron establecer condiciones adecuadas de cocultivo con Xam y el efecto que la infección bacteriana tiene sobre la regeneración de embriones a partir de este tejido. Palabras clave: cultivo de tejidos vegetales, edición de genomas, sistema de secreción tipo tres, efectores TALE, transformación.

Abstract New technologies for genome edition, such as TALENs and CRISPR/Cas9 system, are a great opportunity to improve desirable features in different organisms. TALENs are the result from coupling nucleases and TALEs (Transcription Activator-Like Effectors), which are natural effectors with an important role in pathogenicity for the Xanthomonas species. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is the cassava bacterial blight causal agent, and this pathogen is able to translocate its effectors to the plant cell during pathogenesis by using the type-three secretion system (TTSS). Currently, there are no standard protocols for genome edition in cassava. In this study, we explored the possibility to translocate effectors to friable embryogenic calli (FEC) through Xam inoculation, in order to establish the potential of this pathogen as a TALEN delivery system. Friable embryogenic calli derived from two different susceptible varieties (COL2215 and cv. 60444) were co-cultured with the strain Xam668 using different culture times. Subsequently, we evaluated the expression of makers corresponding to reported target genes for TALEs present in this bacterial strain. Although we were not able to demonstrate effector translocation, we established the conditions for co-culturing cassava calli and Xam and determined the effects derived from bacterial infection on embryo regeneration from FECs. Key words: genome edition, plant tissue culture, TALEs, transformation, type-three secretion system. Recibido: agosto 3 de 2016 * *, ** *** ****

Aprobado: noviembre 8 de 2016

Manihot biotec, Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, padiazta@unal.edu.co Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes. ca.zarate10@uniandes.edu.co Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes. abernal@uniandes.edu.co Manihot biotec, Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, celopezc@unal.edu.co

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Introducción La modificación de la información genómica representa una posibilidad con grandes implicaciones ya que permitiría borrar, incorporar o potenciar características deseadas en los diferentes organismos. Clásicamente, la edición de genomas se ha realizado mediante el uso de ADN nucleasas como FokI, cuyo dominio endonucleasa inespecífico corta la doble cadena del ADN cuando se dimeriza (Durai et al., 2005; Carroll, 2008; Carroll, 2011). Tales rupturas en la doble cadena (Double Strand Broken, DSB) son luego reparadas por el sistema de reparación de la célula de tipo unión de extremos no homólogos (Non Homologous End Joining, NHEJ) (Lieber et al., 2009). Para lograr la especificidad en la edición de una región particular de ADN se debe fusionar FokI con una proteína que sea capaz de reconocer una secuencia de ADN específica (Bibikova et al., 2002; Bibikova, 2003). Clásicamente, esto se ha logrado empleando las proteínas que poseen dominios dedos de cinc (Carroll, 2008; Carroll, 2011). Aunque útil, este sistema ha mostrado adolecer de problemas como la baja especificidad e ineficiencia (Park et al., 2016). Las bacterias Gram negativas fitopatógenas han evolucionado un sistema especializado de inyección de proteínas conocido como sistema de secreción tipo tres (SSTT) que permite el envío de proteínas efectoras al interior de la célula vegetal (Block et al., 2008; Tampakaki et al., 2010). Entre las proteínas efectoras se destacan los TALE, los cuales están presentes en las fitobacterias del género Xanthomonas. Estos efectores modifican la expresión de genes del hospedero a través de la represión de la respuesta de defensa y/o la activación de genes en beneficio de las bacterias (Boch et al., 2014). Su topología típica consta de una región N-terminal, la cual posee una señal responsable de la translocación de la proteína a través del SSTT, una región C-terminal, donde se encuentran dos señales de localización nuclear (SLN) y un dominio de activación transcripcional acídico, y una región central, la cual está compuesta por una serie de repeticiones casi idénticas de 33 a 35 aminoácidos (Bogdanove et al., 2010; Scholze y Boch, 2011). Dentro de cada una de estas repeticiones, las posiciones de los aminoácidos 12 y 13 presentan la mayor variabilidad. Recientemente se estableció que estos dos aminoácidos determinan la especificidad por la secuencia de ADN a la cual se une el efector, a manera de un código. Estas dos posiciones se denominan RVD (Repeat Variabe Diresidue) (Boch et al., 2009). El número de repeticiones determina el largo de la secuencia de nucleótidos a la que se une la proteína sobre el ADN. De esta forma, conociendo el número de repeticiones y los aminoácidos de las posiciones 12 y 13 de cada bloque es posible determinar la secuencia de nucleótidos a la cual se unirá el efector. Recientemente, con el descubrimiento del código de los TALE, ha sido posible construir módulos de repe-

ticiones, cuyas secuencias confieran especificidad de unión al efector hacia una secuencia de ADN en particular (Geiβler et al., 2011). Estos efectores han sido fusionados al dominio endonucleasa inespecífico de FokI produciendo las así llamadas proteínas TALEN (TALE nucleasas) (Li et al., 2010; Miller et al., 2010). Este sistema ha mostrado ser altamente eficiente y específico para la edición de genomas de un amplio grupo de organismos, el cual incluye plantas (Sander et al., 2011; Tesson et al., 2011; Lei et al., 2012; Li et al., 2012; Cheng et al., 2013). Sin embargo, la edición con TALEN en plantas solo se logra mediante transformación genética utilizando Agrobacterium, pasando por un proceso de generación de organismos genéticamente modificados (OGM), lo que conlleva un problema de aceptación pública. Dentro de los cultivos que pueden ser objeto de la tecnología de edición de genomas se destaca la yuca, la cual es uno de los principales productos para la seguridad alimentaria mundial. La yuca representa una de las mayores fuentes de calorías para más de 1000 millones de personas en el mundo, principalmente de las regiones tropicales (Taylor et al., 2012). El mejoramiento tradicional de yuca si bien ha logrado generar variedades con características deseadas, es un proceso largo. El desarrollo de estrategias biotecnológicas alternativas, tales como la edición del genoma, permitiría desarrollar variedades mejoradas para rasgos de interés de manera más rápida. La producción de yuca puede verse afectada por varias enfermedades, dentro de las cuales la bacteriosis vascular o añublo bacteriano, ocasionado por Xam, es una de las más limitantes. La bacteriosis se presenta en todas las regiones donde se cultiva la yuca (López & Bernal, 2012; FAO, 2013). Los estudios sobre el genoma de diferentes cepas de Xam (Bart et al., 2012; Arrieta-Ortiz et al., 2013) han permitido identificar la presencia de un TALE, denominado TALE1Xam, el cual es responsable en gran medida de la virulencia de Xam (Castiblanco et al., 2012). Mediante análisis de transcriptoma se pudo demostrar que el TAL20Xam668 es capaz de activar la transcripción de un transportador de sacarosa en las células de yuca (MeSweet10a), cuya sobreexpresión es crítica para la formación de lesiones durante el proceso patogénico (Cohn et al., 2014). La presencia de los TALE en Xam plantea la posibilidad de que esta bacteria sea capaz de liberar al interior de las células de yuca TALEN dirigidos a secuencias de ADN genómico de manera específica para su posible edición. Esta estrategia aliviaría las controversias sobre el empleo de plantas transgénicas y su aceptación social. En este estudio se evaluó a manera de prueba de concepto la posibilidad de que Xam pueda liberar naturalmente TALE a células de yuca de CEF, tejido que se utiliza normalmente para la regeneración de plantas. Para ello, en primera medida se evaluó la capacidad de infección de CEF por parte de Xanthomonas y posteriormente se evaluó la expresión de genes blanco

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de TALEs como una medida de la liberación de TALEs dentro de las células de CEF.

talmente genes blanco de TAL20Xam668 y TAL14Xam668 (Cohn et al., 2014; Cohn et al., 2016). Inicialmente, la bacteria se aisló en medio LPGA a partir del banco de conservación. La bacteria se incubó durante dos días a 28 °C y, posteriormente, a partir de una colonia aislada, se inoculó caldo LPG (5 g/L extracto de levadura, 5 g/L glucosa y 5 g/L peptona). El cultivo se incubó durante 24 h a 28 °C y 250 rpm, posteriormente se centrifugó durante 15 min a 4000 rpm y se realizaron dos lavados sucesivos del pellet con MgCl2 10 mM. La concentración de la suspensión bacteriana se ajustó a una DO600nm= 0,7. Se inocularon 4 clústeres de CEF por tratamiento (cada clúster con un área aproximada de 30 mm2). Cada clúster se inoculó con 80 µL de la suspensión bacteriana y se realizó un cocultivo con Xam durante 12, 24, 36, 48 y 72 h en medio básico de sales GD suplementado con picloram 50 µM. El cocultivo se mantuvo a 28 °C con fotoperiodo (12 h/12 h luz/ oscuridad). Como control se empleó MgCl2 10 mM. Después de cada cocultivo, se colocaron tres clústeres de CEF en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para la posterior extracción de ARN. Con el fin de evaluar la regeneración de embriones, el clúster restante se cultivó en medio de organogénesis de yuca (COM) (sales MS, 20 g/L sacarosa, 1 mg/L BAP, 0,5 mg/L IBA, 2 μM CuS04) (Li et al., 1996) suplementado con cefotaxima 500 mg/L.

Materiales y métodos Material vegetal Plantas de yuca in vitro de las variedades COL2215 y cv. 60444 fueron obtenidas del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia. Las plantas se multiplicaron en medio basal Murashige y Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962) como ha sido descrito previamente (Bull et al., 2009; Taylor et al., 2012). El CEF se generó mediante la metodología previamente descrita (Taylor et al., 1996; Bull et al., 2009). Brevemente, se tomaron plantas in vitro de cuatro semanas, se indujo el desarrollo de yemas axilares para la obtención de estructuras embriogénicas organizadas (EEO). Estas estructuras se cultivaron en medio MS suplementado con picloram 50 µM durante tres semanas, posteriormente se realizaron cortes sobre las mismas con un bisturí y se transfirieron a medio basal Greshoff y Doy (GD) (Gresshoff & Doy, 1972) suplementado con picloram 50 µM para inducir la formación de CEF. El tejido se subcultivó en el mismo medio cada tres semanas hasta su inoculación.

Inoculación del CEF y regeneración Extracción de ARN y síntesis de ADNc

La evaluación del efecto de carbenicilina y cefotaxima sobre el crecimiento de Xam se realizó en medio LPGA (5 g/L extracto de levadura, 5 g/L glucosa, 5 g/L peptona y 15 g/L agar) suplementado con cada uno de los antibióticos a las siguientes concentraciones: carbenicilina 100 mg/L (car100) y 200 mg/L (car200), cefotaxima 500 mg/L (cefo500) y 1000 mg/L (cefo1000). Se emplearon tres réplicas por tratamiento con el respectivo antibiótico. Posteriormente se incubaron las respectivas cajas de Petri a 28 °C durante 48 h.

El tejido proveniente de los tres clústeres de CEF se maceró en nitrógeno líquido y se realizó la extracción de ARN con 100 mg de tejido. Para esto se empleó el kit Invitrap ® Spin plant RNA (STRATEC, Berlín, GER). El tratamiento con DNasaI (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) se realizó sobre 1 µg de ARN total. La ausencia de contaminación con ADN genómico se verificó mediante PCR con iniciadores de β-tubulina (tabla 1). La síntesis de ADNc se llevó a cabo empleando el First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA).

Para la infección del CEF se empleó la cepa Xam668, para la cual se han descrito y validado experimenTabla 1. Juego de iniciadores empleados en los ensayos de RT-PCR

Iniciador

Secuencia (5´-3´)

007598_F

GGAAAGATGAGCACCAAGGA

007598_R

ACCAGTATACCAGTGCAAGAAG

013474_F

CCAAACACATTGGGCTTTCT

013474_R

CAATGTCCTGCTCGGTTTCT

007568_F

TGACAAAGAGGGTGGAAACA

007568_R

AGAGCACCTGCGTTAGCAGT

Tamaño amplicón (pb)

ID gen

Descripción

230

cassava4.1_007598 Manes.08G061700

β-tubulina

244

cassava4.1_013474 Manes.06G123400

MeSweet10a, blanco de TAL20Xam668

193

cassava4.1_007568 Manes.03G152600

Pectato liasa, blanco de TAL14Xam668

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PCR sobre ADNc y ADN genómico Para la reacción de amplificación se utilizó la DreamTaqTM DNA polymerase (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). El volumen final de cada reacción fue de 10 µL (20 nM de iniciadores, 40 nM de mezcla de dNTPs, 0,25 U de DreamTaqTM DNA polymerase, 1X DreamTaqTM buffer con MgCl2). Se agregaron 2 µL del ADNc (obtenido como se describió previamente), 50 ng de ADN genómico para el control positivo o agua ultrapura para el control negativo. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: denaturación inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 30 ciclos de amplificación (denaturación a 95 °C durante 30 segundos, anillamiento a 52 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 30 segundos), seguidos de una extensión final a 72 °C durante 10 min y una incubación final a 20 °C durante 10 min. Los sets de primes empleados se muestran en la tabla 1. Los resultados de las reacciones de PCR se evidenciaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.2%.

Resultados Infección de CEF con Xam y cocultivo Con el fin de evaluar la capacidad de Xam para infectar e inyectar TALE en tejido embriogénico de yuca, se inocularon CEF obtenidos de las variedades susceptibles cv. 60444 y COL2215 con Xam668. Se empleó esta cepa de Xam ya que los blancos de dos de sus efectores, TAL20Xam668 y TAL14Xam668, han sido reportados y validados experimentalmente (Cohn et al., 2014; Cohn et al., 2016). Dado que no se cuenta con información previa sobre la cinética de infección de Xam en el CEF de yuca, se decidió evaluar distintos tiempos de cocultivo entre 12 y 72 h. En el CEF cocultivado durante 48 y 72 h con Xam668 se observó un ligero crecimiento bacteriano

a manera de corona alrededor del CEF. Esto no se observó para el CEF cocultivado durante 12, 24 y 36 h (tabla 2).

Selección de antibiótico para CEF inoculado con Xam Una vez el CEF se infecta con Xam, es necesario eliminar la bacteria antes de continuar con el proceso de regeneración de las plantas. Con el fin de evaluar el efecto de dos antibióticos sobre el crecimiento de Xam, la cepa Xam668 se cultivó en medio suplementado con carbenicilina y se evaluaron dos concentraciones: 100 mg/L (Car100) y 200 mg/L (Car200). De la misma manera, se evaluó el crecimiento de Xam668 en medio suplementado con dos concentraciones de cefotaxima, 500 mg/L (Cefo500) y 1000 mg/L (Cefo1000). Estos antibióticos y sus respectivas concentraciones se seleccionaron teniendo en cuenta reportes previos del control bacteriano sobre Agrobacterium tumefaciens luego del cocultivo y la regeneración de embriones en yuca (Hankoua et al., 2006; Taylor et al., 2012). Después de 48 h de incubación, se observó crecimiento de Xam668 en el medio suplementado con Car100, pero no en Car200. Por otro lado, las dos concentraciones de cefotaxima evaluadas (Cefo500 y Cefo1000) inhibieron el crecimiento de Xam. Dado que en nuestro laboratorio se ha empleado de manera exitosa cefotaxima para restringir el crecimiento de A. tumefaciens después del cocultivo del CEF, se decidió emplear este mismo antibiótico para controlar el crecimiento de Xam en el tejido embriogénico durante la regeneración.

Regeneración de embriones infectados con Xam Con el objeto de examinar la regeneración de embriones a partir de CEF inoculado con Xam, se transfirió el CEF a medio de organogénesis de yuca (COM) y se mantuvo en observación continua para evaluar la

Tabla 2. Tabla resumen del experimento de inoculación de CEF con Xam668. –c, contaminación ambiental; -, ningún crecimiento; +, crecimiento leve; ++, crecimiento moderado; ++, crecimiento abundante; ++++, sobre-crecimiento en toda la placa. Tratamiento Xam668

Cultivar cv. 60444

Tiempo cocultivo (h)

Crecimiento de Xam en cocultivo

Regeneración de embriones

Reactivación de Xam

Xam668

cv. 60444

-c

Xam668

cv. 60444

MgCl

cv. 60444

Xam668

COL2215

Sí

++++

Xam668

COL2215

Xam668

COL2215

+++

MgCl

COL2215

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proliferación de embriones. Después de un mes se observó la regeneración de embriones en el tejido embriogénico proveniente de COL2215 cocultivado con Xam durante 24 h. En los demás tratamientos no se logró detectar el desarrollo de embriones, incluyendo el CEF tratado con la solución del control con MgCl2 (tabla 2). El hecho de no haber observado desarrollo de embriones en los otros tratamientos, incluyendo los controles, está relacionado con la baja eficiencia del mismo para producir embriones luego de varios pases de cultivo en medio GD. Por otro lado, se observó una reactivación del crecimiento de Xam para el material cocultivado durante 24, 48 y 72 h con Xam668 (tabla 2). Es posible que después de cuatro semanas de cultivo en medio de regeneración, el antibiótico pierda su estabilidad en el medio, explicando así la reactivación de Xam para ambos genotipos. La reactivación del crecimiento de Xam fue más notoria en el cocultivo de 24 h con el CEF del cultivar COL2215. De manera interesante, la reactivación de Xam en este tratamiento no afectó negativamente la producción de embriones (tabla 2, cocultivo de 24 h del cultivar COL2215). Estos resultados sugieren que la activación del crecimiento de Xam podría ser dependiente del cultivar, ya que en el tejido embriogénico de cv.60444 cocultivado con Xam durante 72 h, el crecimiento de Xam fue mucho menor comparado con el tejido embriogénico de COL2215.

Expresión de genes inducidos por dos TALE de Xam668 en CEF Estudios previos han mostrado que la cepa Xam668 es capaz de inducir la expresión de genes en yuca con el fin de promover su patogenicidad. Dentro de estos genes blanco se destacan cassava4.1_013474 (MeSweet10a) inducido por el TAL20Xam668 y cassava4.1_007568 (pectato liasa) inducido por el TAL14Xam668 (Cohn et al., 2014), los cuales han sido validados experimentalmente. Con el fin de evaluar la capacidad de Xam668 para inyectar sus TALE a CEF de yuca e inducir la expresión de los genes blanco, se evaluó la expresión de los genes MeSweet10a y pectato liasa. A partir del CEF de yuca infectado con Xam668 (tabla 2), se realizó la extracción de ARN y síntesis de ADNc. En la figura 1 se muestran los resultados de la extracción, en donde se observa la presencia de un ARN total de buena calidad en la mayoría de las muestras. Como control de la extracción se empleó tejido vegetal de tallos de yuca, procedimiento que está estandarizado en nuestros laboratorios. Se encontró que el ARN obtenido a partir del tejido embriogénico cocultivado con Xam durante 48 y 72 h es de menor calidad y concentración en comparación con el tejido embriogénico tratado con MgCl2 (control). Esto sugiere que el crecimiento de Xam en el CEF interfiere de alguna forma con la obtención de ARN total. 70

Figura 1. Extracción de ARN de CEF inoculado con Xam668 a diferentes tiempos de cocultivo (12, 24, 36, 48 y 72 horas). El ARN de una muestra de tallo se empleó como control positivo (+) de la extracción. M: marcador de peso, 1Kb plus (ThermoScientific, Waltham, MA, USA).

A partir del ARN obtenido se llevó a cabo la síntesis de ADNc de cada una de las muestras. Como control de gen de referencia se emplearon iniciadores que permiten amplificar un producto de 230 pb del último exón del gen que codifica para la β-tubulina (tabla 1). Una vez sintetizada la primera cadena de ADNc se procedió a realizar una PCR para corroborar la correcta síntesis, utilizando los iniciadores de β-tubulina. Debido a la baja calidad de los ARN obtenidos no se observó amplificación del gen de referencia en algunas muestras (cv. 60444 cocultivo de 36 h y 72 h). Teniendo en cuenta lo anterior, se decidió evaluar la expresión por RT-PCR de solo las muestras en las que se detectó el amplicón del gen de referencia (COL2215 control con MgCl2, cocultivo de 24 h y 72 h con Xam668). En la figura 2 se muestran los niveles de expresión para el gen de referencia (β-tubulina), MeSweet10a y pectato liasa a 25 ciclos de amplificación. Se observa que no hay expresión del gen MeSweet10a ni de la pectato liasa, en ninguna de las muestras evaluadas. Esto sugiere que la inoculación del CEF con Xam668 no indujo la expresión de genes blanco de TAL20Xam668. Con el fin de corroborar esto, se decidió repetir la PCR a 35 ciclos (figura 3). Estos resultados muestran que el

Figura 2. RT-PCR de los genes blanco (MeSWEET10a, pectato liasa) de dos TALE de Xam668 (TAL20Xam668 y TAL14Xam668) en CEF de yuca. Se realizaron 25 ciclos de amplificación para la evaluación de los tres genes. El CEF inoculado con MgCl2 se empleó como control negativo de la inoculación. El control negativo (-) y positivo (+) de la reacción de PCR corresponden a agua y ADN genómico, respectivamente. M: marcador de peso, 1Kb plus (ThermoScientific, Waltham, MA, USA).

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gen MeSweet10a no se encuentra inducido en CEF de yuca, después de la inoculación con Xam668. De manera similar, el gen que codifica para una pectato liasa (Manes.03G152600) parece estar reprimido a 24 y 72 h después del cocultivo con Xam668 (figura 3).

Discusión Recientemente, ha aumentado de manera exponencial el número de estudios encaminados hacia la edición genómica. Sin embargo, en yuca aún no existen reportes sobre edición genómica mediada por la tecnología de TALEN o CRISPR/Cas9. En este trabajo se realizó una primera aproximación para evaluar la capacidad de Xam668 para inyectar efectores que modulen la expresión de genes en el CEF, tejido embriogénico de yuca ampliamente usado en transformación genética. Para esto se cocultivaron CEF provenientes de dos variedades susceptibles de yuca (COL2215 y cv. 60444) con la cepa patogénica Xam668 y se evaluó la inducción de la expresión de los genes blanco de TAL20Xam668 y TAL14Xam668. Nuestros resultados muestran que la bacteria puede proliferar sobre el tejido embriogénico y que en algunos casos el tejido embrionario infectado con Xam permite la regeneración. Sin embargo, se determinó que Xam668 no es capaz de inyectar sus TALE al interior del CEF de yuca, ya que no se observó la inducción de MeSweet10a ni de pectato liasa, los cuales son los genes blanco de TAL20Xam668 y TAL14Xam668, respectivamente. El gen MeSweet10a codifica para un transportador se azúcar y se ha propuesto que la inducción de este gen conduce a la movilización de glucosa y sacarosa desde el interior de la célula vegetal al apoplasto, para así favorecer el crecimiento bacteriano. Sin embargo, en yuca la presencia de TAL20Xam668 no se relacionó con el crecimiento de Xam en la hoja (Chen et al., 2010; Cohn et al., 2014). Por otro lado, se cree que la pectato liasa podría estar involucrada en los procesos de colonización en tejidos vasculares y foliares, aunque esto no se ha comprobado experimentalmente. Una posible explicación para la falta de activación de la expresión de genes blanco de TAL20Xam668 podría ser

Figura 3. RT-PCR de genes blanco de dos TALE de Xam668 en CEF de yuca. Se realizaron 35 ciclos de amplificación para la evaluación de los tres genes (β-tubulina, MeSWEET10a, pectato liasa). El CEF inoculado con MgCl2 se empleó como control negativo de la inoculación. El control negativo (-) y positivo (+) de la reacción de PCR corresponden a agua y ADN genómico, respectivamente. M: marcador de peso, 1Kb plus (ThermoScientific, Waltham, MA, USA).

la falta de inducción del SSTT de Xam en el CEF de yuca. Se sabe que el envío de efectores está condicionado por varios factores ambientales en el apoplasto de la planta. Una vez que las bacterias fitopatógenas perciben las condiciones ambientales del apoplasto (pH bajo, baja presión osmótica, etc.) inducen la formación del pilus Hrp (Hypersensitive Response and Pathogenicity) (Wei et al., 1992; Tang et al., 2006) y es a través de este pilus que las proteínas efectoras viajan hacia el interior de la célula vegetal. Es posible que Xam, al no encontrarse en el apoplasto vegetal, no logre inducir la formación del pilus Hrp y, por lo tanto, no se trasfieran sus efectores al interior de las células vegetales. Se sabe que las células que conforman el CEF son células pequeñas, multivacuoladas y que presentan una pared celular muy delgada (Taylor et al., 1996). Además, este tejido carece de gránulos de almidón y la concentración de azúcares es distinta a la de otros tejidos (Ma et al., 2015). Esto indica que el tejido vegetal adulto que usualmente es infectado por Xam (hojas y tallo) difiere mucho del tejido no diferenciado que conforma el CEF. Adicionalmente, este tejido ha sido subcultivado repetidamente en medios con altas concentraciones de hormonas (auxinas principalmente), por lo tanto, el CEF infectado con Xam contiene una carga hormonal mucho más alta que afecta su fisiología (Ma et al., 2015). Una posible alternativa podría ser cocultivar Xam con otros tejidos organogénicos o embriogénicos y evaluar la inducción de blancos de los TALE y la regeneración de las plantas. En yuca se han empleado cotiledones somáticos para transformación genética estable, pero con una muy baja eficiencia y un alto número de escapes, razón por la cual el CEF sigue siendo el tejido más exitoso para transformación genética (Li et al., 1996; Taylor et al., 2004; Liu et al., 2011; Taylor et al., 2012). Otra estrategia, teniendo en cuenta la capacidad de regeneración del CEF, es el empleo de inductores del SSTT en Xanthomonas antes del cocultivo con el tejido embriogénico. Tanto en Pseudomonas syringae como en Xanthomonas spp., se han empleado medios mínimos para inducir la expresión de los genes del SSTT y la transferencia de proteínas efectoras (He et al., 1993; Jiang et al., 2013; Li et al., 2014). Por otro lado, en este trabajo se evaluó la regeneración de embriones a partir de CEF cocultivado con Xam. Se detectó la regeneración de embriones únicamente a partir de CEF con sobrecrecimiento de Xam. Esto sugiere que la inoculación con Xam no afecta negativamente el desarrollo de embriones a partir de CEF provenientes de la variedad COL2215. En los otros tratamientos no se observó regeneración de embriones, lo cual puede estar relacionado con la edad del tejido empleado en el ensayo. Se ha reportado que el empleo de un CEF con varios pases de cultivo disminuye drásticamente la regeneración de embriones (Taylor et al., 2012).

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Conclusiones Si bien la estrategia de emplear Xam para introducir TALEN con el fin de editar regiones genómicas de yuca resulta atractiva, es un proceso que requiere el ajuste de varias etapas. Este estudio representa un primer esfuerzo por identificar los pasos críticos dentro del proceso. Aunque no se logró demostrar la liberación de los TALE en el CEF, sí se logró establecer las condiciones adecuadas de cocultivo con Xam y se determinó el efecto de la infección con esta bacteria sobre la regeneración de embriones a partir de CEF. También se logró establecer estrategias alternativas que permitirían ajustar la metodología con el fin de lograr la introducción de TALE al CEF de yuca. Una vez superadas estas etapas se abrirían importantes posibilidades en la edición genómica de yuca sin necesidad de generar plantas transgénicas.

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Agradecimientos A la Vicerrectoría Académica de la Universidad Nacional de Colombia, por la Beca de Estudiante Sobresaliente de Posgrado de PADT. A la Facultad de Ciencias de la Universidad de los Andes, por la financiación del proyecto de investigación titulado: Edición de genoma empleando TALEN mediado por Xanthomonas: prueba de concepto. A Paul Chavarriaga, del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), por el apoyo para la generación del callo embriogénico friable. A Ralf Koebnik por la asesoría en el desarrollo del proyecto.

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Cassava embryogenic calli infection with Xam 73

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Diseño y evaluación de un biosistema de tratamiento a escala piloto de aguas de curtiembres a través de la Eichhornia crassipes Design and evaluation of a biosystem water treatment pilot-scale tannery through Eichhornia crassipes Uriel Fernando Carreño Sayago* DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.52271

Resumen Desde el punto de vista ambiental, el sector de curtiembres siempre ha sido catalogado como altamente contaminante, donde su proceso productivo del cuero a partir de un tratamiento físico-químico de pieles de animales genera contaminantes químicos como el cromo y desechos orgánicos que causan impactos ambientales negativos sobre los ecosistemas. Los ecosistemas naturales, tales como los humedales, son los sistemas más productivos en el mundo como resultado de la abundancia de luz, agua, nutrientes. Debido a esta abundancia y favorabilidad es común encontrar la presencia de plantas que han desarrollado adaptaciones morfológicas y bioquímicas permitiéndoles aprovechar al máximo las ventajas de estas condiciones de su entorno, las cuales han sido comúnmente denominadas malezas acuáticas. Entre estas malezas flotantes (macrofitas) se encuentra el Jacinto de Agua (Eichornia crassipes), el cual tiene una amplia presencia en los cuerpos húmedos de Cundinamarca (Colombia), presentan un alta capacidad invasiva desarrollando un esparcimiento elevado en estos sistemas acuáticos. Pero esta planta tiene la capacidad de transformar la materia orgánica y sobre todo acumular diferentes metales pesados en su morfología. En la presente investigación, se diseñó y construyó un biosistema de tratamiento para la remoción y retención de cromo de aguas contaminadas por los residuos del proceso de las curtiembres, siendo la Eichhornia crassipes, el agente retenedor de estos compuestos contaminantes, donde se evidencio una solución económica y tecnológicamente viable para el sector industrial. Palabras claves: Eichhornia crassipes, cromo, curtiembres, biosistema.

Abstract From the environmental point of view, the sector of tanneries always has been catalogued like highly pollutant, where his productive process of the leather from a treatment leather physicist - chemist of animals generates chemical pollutants as the chrome and organic waste that cause environmental negative impacts on the ecosystems. The natural, such ecosystems as the wetlands, they are the most productive systems in the world as result of the abundance of light, water, nutrients. Due to this abundance and favorabilidad is common to find the presence of plants that have developed morphologic and biochemical adjustments allowing them to take advantage to the maximum of the advantages of these conditions of his environment, which have been named commonly aquatic undergrowths. Between these floating undergrowths (macrofitas) one finds the Water hyacinth (Eichhornia crassipes), which has a wide presence in Cundinamarca’s humid bodies (Colombia); they present a high invasive capacity developing a scattering raised in these aquatic systems. But this plant has the aptitude to transform the organic matter and especially accumulate different metals weighed in his morphology. In the present investigation, a biosistema of treatment was designed and constructed for the removal and retention of chrome of waters contaminated by the residues of the process of the tanneries, being the Eichhornia crassipes, the agent retainer of these pollutant compounds, where I demonstrate an economic and technologically viable solution for the industrial sector. Key words: Eichhornia crassipes, chrome, tanneries, biosistema. Recibido: enero 10 de 2016 Aprobado: octubre 20 de 2016

MSc Ing Biotecnólogo, Docente de planta Fundación Universitaria los Libertadores. Departamento de Ingeniería. ufcarrenos@libertadores.edu.co

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Introducción Las diferentes descargas de aguas residuales de la industria de las curtiembres al alcantarillado que posteriormente se descargan en el río Tunjuelito, y luego desembocan en el río Bogotá, han generado durante más de 30 años graves impactos ambientales en el sector, debido a la presencia en estas aguas de grandes concentraciones de cromo y de residuos orgánicos como grasas, pelambre, etc. Esta contaminación, es la consecuencia de la inadecuada utilización de estos materiales que sin ningún tipo de tratamiento se vierten a la alcantarilla. La industria del cuero se enfrenta al desafío de implementar medidas que minimicen el impacto ambiental generado por tanto tiempo con la finalidad de dar cumplimiento a las regulaciones impuestas por los órganos ambientales. Legislaciones de diferentes partes del mundo exigen concentraciones de cromo por debajo de 0,5 mg/L en aguas residuales de curtiembres. Esto ha llevado a que este tipo de empresas busquen alternativas para minimizar este metal implementando plantas de tratamiento de aguas residuales (PTAR) especializadas (Kanagaraj et al., 2008). Sin embargo, los métodos actualmente empleados, como la precipitación química no son efectivos en la reducción de la concentración hasta los niveles deseados de 0,5 mg/ L. (Onyanchaa et al., 2008). Uno de los metales pesados más nocivos para el medio ambiente es el Cromo (Cr). Los efectos de la presencia de este metal en el agua y suelos, así como las alternativas para su remediación, han sido tema de intensa investigación en los últimos 30 años. Bajo condiciones oxidantes, neutrales y alcalinas, el Cr (VI) está presente como cromato o dicromato, mientras que a condiciones reductivas, la conversión del Cr (VI) a Cr (III) podría tener lugar. El Cr (VI) es la forma carcinogénica del cromo, mientras que la presencia de pequeñas cantidades de Cr (III) son esenciales para un crecimiento saludable de los seres vivos. Así mismo, el Cr (VI) es más móvil en las subsuperficies de los suelos y el agua subterránea debido a su carga negativa, en comparación con el Cr (III) que es menos toxico y menos móvil. Asociado a esto el mundo enfrenta otro problema concerniente a la seguridad energética, ya que la demanda energética mundial es suministrada principalmente por los combustibles derivados del petróleo. La contaminación por agentes inorgánicos como el cromo trae graves consecuencias tanto para el medio ambiente como para la salud de quienes lo manipulan, estudios realizados por Padma & Dhara (2008), encontraron que las aguas de las curtiembres llevan Cromo en estado de oxidación (VI) debido a la oxidación a Cr (III) contaminando el suelo y el agua. El uso del cromo se ha extendido en la industria del curtido, a causa de la alta calidad de cuero obtenido. Cuando las aguas residuales que contienen cromo son

vertidos al medio ambiente, se ocasiona un problema para la calidad de este último. La eliminación de cromo de las aguas residuales es obligatoria a fin de evitar la contaminación del agua de los ríos (Higuera et al., 2011). Como consecuencia del rápido desarrollo de las industrias y la gran cantidad de agua residual de procesos industriales que se descargan a los ríos y sistemas de agua corriente se ha generado una grave situación ambiental por el deterioro de su ecosistema acuático, haciendo necesario pensar procedimientos y metodologías de limpieza de aguas residuales que sean verdaderamente efectivas y viables. El costo asociado a dichas soluciones debe poder ser asumido por las industrias contaminantes y entes gubernamentales, que propenden la disminución del impacto ambiental en la región. La macrófita Eichhornia crassipes, también conocida como “Jacinto de agua” o “Buchón de agua”, es considerada como una especie invasiva debido a su adaptabilidad a un amplio tipo de ecosistemas, interfiriendo con las actividades humanas, como la pesca y la recreación, además de la proliferación de criaderos de insectos (Torres et al., 2009); (Vásquez et al., 2012); (Lenka et at, 1990); (Chisutia & Mmari 2014); (Li et al., 2014); (Islam et a., 2013); (Hadad et al., 2014). Es una planta acuática invasora de humedales y por ende muy abundante. En los últimos años se ha demostrado que esta especie puede manipularse de manera sostenible en su ecosistema y ser usada en fitorremediación de aguas contaminadas con metales pesados. (Alvarado et al., 2008); (Zimmels & Malkovskaja, 2005); (Saraswat, 2010); (Kasturiarachchi, 2014); (Xiaosen et al., 2014); (Komy et al., 2013); (Borker et al., 2013). La biorremediación con esta planta representa una tecnología eficiente para el tratamiento de agua contaminada y además es un tratamiento de bajo costo, puesto que no requiere de infraestructura sofisticada. En general, es una tecnología barata, simple, sustentable, compatible con el ambiente. Se ha encontrado numerosos estudios a nivel mundial donde demuestran la capacidad de esta planta para remover nutrientes, metales pesados y grandes contenidos de materia orgánica (Lizarazo, 2014); (Yubin et al., 2015); (Martins, 2014); (Villamagna & Murphy 2010); (Brima, 2014); (Gandhimathi et al., 2013); (Mohanty et al., 2016); (Mohammed et al., 2013). La presente investigación diseñó, desarrollo y evaluó un biosistema de tratamiento a escala piloto de aguas de curtiembres a través de la Eichhornia crassipes, determinando la capacidad de remover cromo presente en estas aguas, obteniendo un sistema viable en el tratamiento de las aguas de las curtiembres de San Benito al sur de Bogotá.

Biosistema de tratamiento de aguas con Eichhornia crassipes 75

Metodología Para el adecuado proceso de diseño y desarrollo de este biosistema de tratamiento se aisló la planta de Eichhornia crassipes de un humedal a las afueras de Bogotá. Posteriormente, se realizó el diseño del montaje experimental y por último se realizó la evaluación de este biosistema de tratamiento. Es una investigación cuantitativa experimental, donde las variables independientes son las concentraciones de cromo a la entrada del tratamiento y la DBO. Las variables dependientes son las concentraciones de cromo y la DBO al final del proceso de tratamiento. Cada uno de los experimentos propuestos será por triplicado para mayor confiabilidad estadística de los datos generados.

Asilamiento de la Eichhornia crassipes de diferentes humedales La Eichhornia crassipes se identificó en las aguas contaminadas a las afueras del municipio de Mosquera, Cundinamarca. Ubicación en coordenadas: 4.682995, -74.256673. En las figuras 1 y 2 se muestra lo abundante de ésta planta en el sector y lo robusta que es en el humedal. Como se puede apreciar en estas dos imágenes, estas aguas donde se encontraba la Eichhornia Crassipes evidenciaban malos olores debido a los vertimientos de aguas residuales sobre éste humedal.

Diseño de un biosistema a escala piloto utilizando la Eichhornia crassipes de aguas contaminadas procedentes de las curtiembres de San Benito Sur de Bogotá Después del aislamiento de la Eichhornia Crassipes se llevó a los laboratorios de la Fundación Universitaria

Figura 2. Aislando la Eichhornia.

los Liberadores, sede Bogotá para el montaje de los experimentos.

Montaje del modelo experimental Las dimensiones de este sistema de tratamiento es de largo 40 cm, de alto 15 cm y de ancho 15 cm, donde el experimento conto con 10 l de agua. Este diseño es a escala piloto y tuvo 180 gramos de Eichhornia Crassipes, que es el equivalente a dos plantas. En la figura 3 se muestra el diseño del biosistema. A continuación en las figuras 4 y 5, se muestran diferentes sistemas de tratamiento a escala piloto de laboratorio.

Diseño experimental El diseño propuesto consistió en montar siete diferentes sistemas de tratamiento, 3 con un 40% de agua

Figura 1. Humedal.

Figura 3. Diseño del biosistema de tratamiento con sus dimensiones. Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 74-81

Figura 4. Experimentación.

Figura 5. Tratamiento al 40% .

de curtiembres llamadas 4a, 4b y 4c y 3 con un 60 % de aguas de curtiembres llamadas 6a, 6b y 6c. El restante se complementó con agua destilada. Se realizó un montaje de un blanco con agua del humedal. Las aguas de muestra de las curtiembres se recogieron en la empresa curtipiel en el barrio San Benito al sur de Bogotá. En la tabla 1 se muestra el resumen de los montajes. Tabla 1. Porcentajes de aguas destiladas y agua de curtiembre. Agua de curtiembre (%)

Agua destilada (%)

Tratamiento 4a 4b y 4c.

Tratamiento 6a 6b y 6c.

Blanco 100 % agua del humedal original

Resultados En esta investigación se evaluó el rendimiento y capacidad de la Eichhornia crassipes en la retención de Cromo y disminución de la DBO en el agua.

Evaluación del Cromo Para las evaluaciones de este sistema de tratamiento se midió las concentraciones en el agua de cromo en mg/L. Al inicio y posterior mente cada dos días. Se

midió el cromo hexavalente a través de la técnica de espectrofotometría bajo las normas del estándar métodos (1995) en el laboratorio de Hidroanálisis S.A.S certificado por el IDEAM. Se puede apreciar en la gráfica 1 que las concentraciones iniciales de los tratamientos de 40% estaban alrededor de los 740 mg/L de cromo, y en la gráfica 4 se puede apreciar que tan solo dos días después hubo una remoción de 18%. Las remociones como se pueden apreciar en estas dos gráficas muestran una continua disminución de este metal, estabilizándose después de 24 d de tratamiento. Las tres pruebas arrojaron un comportamiento similar durante todo el proceso y se obtuvieron remociones por encima del 60%, se podría implementar esta tecnología en una curtiembre debido a su alto grado de remoción. En las investigaciones realizadas por Velarde et al. (2013), Modenes et al. (2011), Gandhimathi et al. (2013), Gupta & Balomajumder (2015); Hadad et al. (2011), Mohanty et al. (2006), también se obtuvieron remociones importantes de cromo por encima del 60%. Se puede observar que al 3 día se obtuvieron remociones de más del 30%, estabilizándose los días siguientes. Al final obtuvo unas remociones del 58%. Se puede apreciar en la siguiente gráfica 3 que las concentraciones iniciales de los tratamientos de 60% estaban alrededor de los 1200 mg/L de cromo, y en la gráfica 4 se puede apreciar que tan solo dos días después hubo una remoción de 10%. Las remociones como se pueden apreciar en estas dos gráficas muestran una continua disminución de este metal, estabilizándose después de 24 d de tratamiento. Las tres pruebas arrojaron un comportamiento similar

Biosistema de tratamiento de aguas con Eichhornia crassipes 77

Grรกfica 1. Concentraciones de cromo (740 mg/L) iniciales.

Grรกfica 2. Concentraciones de cromo remociones % en concentraciones iniciales de (740 mg/L).

Grรกfica 3. Concentraciones de cromo (1250 mg/L) iniciales

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Gráfica 4. Concentraciones de cromo remociones % en concentraciones iniciales de (1250 mg/L).

durante todo el proceso y se obtuvieron remociones por encima del 45%. Se podría implementar una tecnología de producción más limpia para disminuir las concentraciones tan altas de cromo, para implementar la tecnología de la Eichhornia.

Pruebas de remoción de DBO Se realizaron dos monitoreos de calidad del agua con la DBO, de cada uno de los tratamientos. Las pruebas eran en el día 0 y terminado el proyecto. Las pruebas de DBO se hicieron bajo las normas del estándar métodos (1995) también realizadas por Hidroanálisis S.AS. En la gráfica 5 se muestra cada uno de estos con las concentraciones iniciales y finales de DBO en mg/L. En la gráfica 6 se muestra las remociones en porcentaje. Observando las gráficas 5 y 6, se puede concluir que el tratamiento con el blanco 1, tiene unas remociones importantes de DBO por encima del 80%. Los tratamientos de 40% y 60% de aguas de curtiembres obtuvieron unas remociones del 66 % de DBO. Los aportes de nutrientes a las plantas y la oxigenación que ellas

brindan al agua contribuyen a la disminución de la DBO. Este tratamiento es altamente eficiente a la hora de remover materia orgánica debido a que la planta posiblemente se alimente y utilice los nutrientes presentes en el agua.

Determinación del porcentaje de cromo en la Eichhornia crassipes Al final del proceso de tratamiento con la Eichhornia crassipes, se llevaron las plantas acuáticas a que se le realizará unas pruebas de cantidad de cromo es su estructura vegetal. Se midió el cromo hexavalente a través de la técnica de espectrofotometría bajo las normas del estándar métodos (1995) en el laboratorio de Hidroanálisis S.A.S certificado por el IDEAM. Los resultados mostraban mg de cromo por gramo de muestra de la Eichhornia crassipes. Estos datos muestran mg de cromo sobre 180 gr de muestra que se utilizaron en los diferentes experimentos. En la gráfica 7 se puede apreciar cada experimento con su respectiva cantidad de cromo encontrado.

Gráfica 5. Remociones de DBO en cada uno de los tratamientos.

Biosistema de tratamiento de aguas con Eichhornia crassipes 79

Gráfica 6. Remociones de DBO en cada uno de los tratamientos.

Gráfica 7. Cantidad de cromo encontrado en las plantas.

Para los experimentos 4, realizados con 40% de aguas de curtiembres, se puede apreciar que estas tienen unas concentraciones de 4400 (mg cromo / muestra) encontrado en su estructura vegetal. Para los experimentos 6, realizados con 60% de aguas de curtiembres, se puede apreciar que estas tienen unas concentraciones de 6200 (mg cromo /muestra) encontrado en su estructura vegetal. En la tabla 2 se muestra un balance general de cada uno de los experimentos sobre las concentraciones de

cromo iniciales, junto con las concentraciones en la planta y las concentraciones de cromo finales. Las diferencias es cromo faltante que se pudo ir en la diferente toma de muestras de los análisis. Hubo remociones debido a que el cromo quedo retenido en la estructura vegetal de la planta acuática Eichhornia Crassipes. El porqué de esta retención y bajo que compuesto orgánico de esta planta como la lignina, celulosa o hemicelulosa se pudo quedar adherido el cromo es objeto de continuas investigaciones en este momento.

Tabla 2. Balance general de cromo en cada Tratamiento.

Experimento

Cromo inicial (mg)

Cromo Final (mg)

Cromo en la Eichhornia crassipes (mg de cromo en la muestra )

Diferencias

Remoción de Cromo (%)

7480

2910

4550

7490

2920

4540

7490

2910

4560

12200

6000

6100

100

12200

6020

6050

130

12200

6040

6050

110

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Recomendaciones En este experimento se dispuso el cromo retenido en las plantas como residuo peligroso. Después del tratamiento de la Eichhornia Crassipes para remover diferentes metales pesados se podría montar un sistema integrado sostenible para la generación de energía, donde la planta utilizada en el tratamiento pase a un sistema de generación de etanol, metano e hidrogeno. Se propone una investigación donde se caracterice los % de azucares de esta planta y se evalué el grado de afectación que podrían ocasionar los metales pesados en la producción de etanol, metano e hidrogeno. También se propone una investigación conjunta entre fitorremediación y producción de energía.

Conclusiones A través del diseño y puesta en marcha de un biosistema de tratamiento a escala de laboratorio con Eichhornia crassipes se comprobó que es una alternativa para usarse como retenedor de metales pesados y materia orgánica. Es fácil de usar e implementar un tratamiento con la Eichhornia crassipes debido a su abundancia y remociones de cromo y materia orgánica. Se realizaron remociones importantes pero aún no se cumpliría la norma 631 de 2015, debido a la alta cantidad de cromo de estas curtiembres, se debe complementar este tratamiento con otro tratamiento para cumplir con el objetivo.

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Biosistema de tratamiento de aguas con Eichhornia crassipes 81

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Diagnóstico molecular, citogenético y anatomohistopatológico del Síndrome Freemartin en hembras bovinas en Colombia Molecular, cytogenetic and anatomohistopatologic diagnostic of freemartin syndrome on females cattle in Ximena Cardona Lopera*, Juan Fernando Vásquez Cano**, Juan Bautista López Ortiz***, Lina Maria Correa Estrada**** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61524

Resumen El síndrome Freemartin es un estado de intersexualidad de muchas de las hembras bovinas provenientes de parto múltiple heterosexual (macho – hembra). Éste se origina en la vida fetal entre los 30 y 40 días de gestación producto del intercambio transplacentario de células mediante anastomosis vasculares, presentándose fenómenos de quimerismo 60XX/XY en varios tejidos, y esterilidad consecuente. En el presente trabajo se tomaron 106 muestras de sangre de terneras provenientes de parto múltiple heterosexual, se realizó extracción de ADN de leucocitos y se buscó la amplificación del gen SRY asociado al cromosoma “Y” mediante PCR y lectura en gel de agarosa. 90 terneras (84.9%) de las 106 amplificaron SRY, verificando el quimerismo 60XX/XY, y 16 terneras (15.1%) que no amplificaron el gen, libres del síndrome quimérico y por lo tanto, aptas reproductivamente. El análisis citogenético realizado mediante cultivo de linfocitos demostró la presencia del cromosoma “Y” en linfocitos de hembras positivas a SRY y la ausencia del quimerismo en hembras SRY negativas. El análisis anatómico post mortem de tractos reproductivos de hembras positivas a SRY detectó anormalidades características del síndrome tales como, clítoris hipertrofiados y atresias ductales cervicales. El análisis histopatológico de placas de gónadas de estos animales evidenció la presencia de ovotestículos. El presente estudio confirma la utilidad de las técnicas de biología molecular como herramientas diagnósticas del síndrome, para el aprovechamiento de hembras de reemplazo al servicio del hato bovino. Palabras clave: cariotipo, genotipificación, intersexualidad, quimerismo, SRY.

Abstract Freemartin syndrome is a intersexuality condition developed in many of the female calfs born from heterosexual multiple calvings (male female). This originates in the fetal development between 30 and 40 days of gestation with transplacental exchange of cells through vascular anastomosis, occurring 60XX/XY chimerism in various tissues, and consequent sterility. In this paper was took blood samples from 106 female calves born from a multiple heterosexual calving. DNA was extracted from leucocytes and searched the SRY gene amplification associated with the Y chromosome by PCR and reading in agarose gel. 90 of 106 samples (84.9%) was amplified the SRY gene, verifying the 60XX/XY chimerism, and 16 samples (15.1%) that did not amplify the gene. Cytogenetic analysis using lymphocytes cell cultures showed the presence of Y chromosome in samples positive for SRY and absence of chimerism in SRY negative samples. The postmortem analysis of female reproductive tracts of SRY positive calves, shows anatomical abnormalities such as clitoris hypertrophia and cervical atresia. Histological examination of gonads of these animals confirmed the presence of ovotestis. This study confirms the usefulness of molecular biology techniques as diagnostic tools of the syndrome, for the use of replacement females in cattle. Keywords: cariotype, chimerism, intersexuality, genotypification, SRY. Recibido: agosto 10 de 2015

Aprobado: noviembre 1 de 2016

Bióloga, Universidad de Antioquia, MSc en Ciencias Agrarias. Grupo BIOGEM. Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional, sede Medellín. Asistente Técnico, Cooperativa Colanta Ltda. ximenacl@colanta.com.co ** Médico Veterinario, MSc en Ciencias Animales Universidad de Antioquia. Grupo de investigación Biogénesis, Facultad de Ciencias Agrarias. Asistente Técnico, Cooperativa Colanta Ltda. jufevaca@gmail.com *** Biólogo, MSc en Biología Docente, Escuela de Biociencias. Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. jblopez@unal.edu.co **** Ingeniera Biológica, Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 82-89

Introducción El síndrome Freemartin es el fenómeno de intersexualidad de mayor frecuencia de presentación en bovinos, aunque también se ha documentado en ovinos, caprinos, ciervos, porcinos y camélidos (Padula, 2005). El sindrome de Freemartin se puede definir como un animal estéril proveniente de un parto mellizo heterosexual, es decir un macho y una hembra. En las gestaciones múltiples bovinas, el desarrollo simultáneo de dos o más embriones posibilita la fusión de las membranas fetales con formación de anastomosis vasculares a nivel del alanto-corion (Ayala et al., 2007), que permiten intercambiar en forma bidireccional células madre hematopoyéticas resultando en quimerismo permanente de los mellizos, y paso de hormona antimulleriana del macho a la hembra que resulta en atrofia de los conductos paramesonéfricos del feto con las lesiones anatómicas características del síndrome (Pessa-Morikawa et al., 2004). Las Freemartin también pueden ser producto de nacimiento de hembras únicas, como consecuencia de la muerte fetal precoz y reabsorción del mellizo macho en el útero después del establecimiento de la anastomosis vascular (Smith et al., 1977, Parkinson et al., 2001). Varios estudios han medido la frecuencia de estas fusiones en diferentes partes del mundo, reportando la presencia del síndrome entre el 85 y el 95% de las hembras provenientes de parto múltiple heterosexual (Romagnano et al., 1988; Ayala et al., 2007). Fenotípicamente, la apariencia y los genitales externos de una Freemartin indican sexo femenino; en algunos casos puede presentarse hipertricosis en el vértice de la comisura vulvar como signo masculinizante (Grunert, 1988); a nivel de los órganos reproductores internos se observan diferentes grados de subdesarrollo (vaginas ciegas, ovarios hipoplásicos, agenesia total o parcial de cuernos uterinos, etc.) o bien puede observarse desarrollo de órganos reproductores masculinos incipientes (epidídimos, vesículas seminales, tejido testicular, etc.) (Wilkes et al., 1980), o tejido mixto, llamado ovotestis (Valencia et al., 2005). A medida que la edad de estas hembras aumenta, se puede observar un cambio conformacional del cuerpo que la lleva a presentar aspecto de macho (tabla del cuello ancha, cuernos gruesos, frente ancha, musculatura desarrollada, predominancia del diámetro torácico sobre el abdominal, escaso desarrollo mamario, etc.). El clítoris puede hipertrofiarse llegando a adquirir el tamaño y la forma de un pequeño pene (Bonnevaux & Baptista, 1982). A nivel genético a las hembras Freemartin son quimeras. Esto se refiere a individuos que presentan poblaciones celulares provenientes de cigotos diferentes (Chu et al., 1964). En el caso concreto del síndrome Freemartin se trata de quimerismo de los cromosomas sexuales, donde una población celular será 60/XX y otra 60/XY. Este fenómeno se puede presentar en tejidos de origen mesodérmico como la sangre, gónadas, Diagnóstico del Síndrome Freemartin a través de diferentes técnicas

riñón e hígado y en tejidos de origen endodérmico como pulmón, pero no en tejidos de origen ectodérmico como la piel (Kanagawa et al., 1965). El cariotipo de linfocitos cultivados ha sido una técnica citogenética de amplia utilización para detectar el quimerismo XX/XY (Padula, 2005). Mediante esta técnica se ha encontrado que el quimerismo XX/XY oscila entre el 2 y 96% de las células analizadas. Una hembra con bajo porcentaje de células XY es tan infértil e improductiva como otra con alto porcentaje de éstas (Wilkes et al., 1980). El quimerismo XX/XY puede presentarse de manera concomitante con otras anormalidades cromosómicas como son fusiones de cromosomas, translocaciones y trisomías XXY (Padula, 2005). Durante los últimos años, las técnicas de biología molecular han permitido profundizar en el estudio del síndrome Freemartin. La amplificación de secuencias nucleotídicas especificas del cromosoma “Y” mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) han permitido comprobar la presencia de quimerismo en muestras de sangre de mellizas dicigóticas. La sensibilidad de la prueba permite la detección de células quiméricas en niveles inferiores al 0.05%. Esto se suma a otras ventajas de la prueba, como son su alta especificidad, rapidez y bajo costo. La literatura reporta la utilización de algunos de los genes asociados al cromosoma “Y” para el diagnóstico, tales como ZFY/ZFX (Ayala et al., 2007), AMX/Y, BOB97M, BRY.1, BRY-4a, btDYZ-1 y SRY (Ennis et al., 1999, Padula, 2005). SRY (Sex-determining Region Y - Región Y determinante del sexo) es un gen requerido en machos para iniciar procesos de diferenciación testicular e inhibir vías de diferenciación femenina. La falla en la expresión de este gen desencadena deterioro en la morfogénesis gonadal y permite desarrollo de estructuras foliculares que dan lugar a los ovotestis (Payan-Carreira et al., 2008). El presente trabajo pretende conocer algunas características del síndrome Freemartin en los bovinos en Colombia y el desarrollo de las herramientas de biología molecular complementadas con el análisis citogenético y anatomopatológico para su diagnóstico.

Materiales y métodos Población. Los animales analizados fueron hembras bovinas nacidas de parto múltiple heterosexual reportadas por ganaderos proveedores de la Cooperativa Colanta a su Departamento de Asistencia Técnica entre enero de 2009 y diciembre de 2012. Estos animales provinieron principalmente de sistemas de lechería especializada y doble propósito del norte y oriente Antioqueño. Toma de muestras. A cada una de las hembras reportadas se le realizó desinfección de la piel con alcohol etílico y toma de muestra de sangre entera mediante punción en la vena yugular o caudal. La sangre fue colectada en tubos de 4 ml de capacidad que contienen 7,2 mg de EDTA (Vacutainer® - BD Franklin Lakes NJ

USA). Cada muestra se tomó por duplicado y fue trans-

portada en cava con refrigerante a 4 °C hasta el laboratorio de Genética Animal de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Antioquia. Análisis molecular. Se realizó extracción de ADN nuclear de leucocitos mediante el método de Salting Out (Miller et al., 1988) y precipitación de ADN con isopropanol. El material obtenido fue resuspendido en 200 µL de buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) y almacenado en tubos eppendorf a -20 °C. Mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR se amplificó el gen SRY. Los primers utilizados contenían la siguiente secuencia de nucleotidos: F-5´- TTCATTGTGTGGTCTCGTGA - 3´; R-5´- GTAGTCTCTGTGCCTCCTC 3´ (López y Vásquez, 2004). La PCR fue realizada en un volumen final de 25µL que contenía: 2 µL de ADN; 2.5 µL de Buffer 10X; 25 mM de MgCL2; 2 mM dNTPS, 0.5 µM Primers y 5 U Taq ADN polimerasa (Fermentas®). La PCR se realizó en un termociclador Bio-Rad Termal cycler C1000®. Se realizó un ciclo inicial de desnaturalización de 94 °C por 3 minutos. A continuación 31 ciclos en las siguientes condiciones: 94 °C por 1 minuto para desnaturalización, 53 °C por 1 minuto para anneling y 72°C por 1 minuto para extensión. Adicionalmente, un ciclo final de extensión a 72 °C durante 9 minutos. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis en geles de agarosa de bajo punto de fusión al 3% y teñidos con bromuro de etidio (10 mg/mL) en buffer TBE 1X. Los productos fueron analizados en presencia de luz ultravioleta en un equipo de fotodocumentación (BioDocAnalize). Todo diagnóstico incluyó la amplificación del gen SRY en un control positivo (ADN macho bovino) y la ausencia de amplificación del gen SRY en un control negativo (ADN hembra normal bovina). Adicionalmente, para verificar la calidad del ADN, se amplificó un fragmento del gen β - lactoglobulina presente en el cromosoma 11 del genoma bovino. Al no estar asociado a cromosomas sexuales, todas las muestras lo debieron amplificar. Análisis citogenético. A partir de los resultados moleculares se seleccionaron dos terneras: una diagnosticada como Freemartin y otra libre del síndrome. En cada una se rasuró la zona del cuello a la altura de la vena yugular y se desinfectó la piel con alcohol etílico y yodo. A continuación, se realizó punción en la vena yugular con una jeringa de 10 mL que contenía 0.1 mL (100 µL/ 10 mL) de heparina y se extrajo 10 mL de sangre entera. Las muestras fueron transportadas bajo refrigeración a 4 °C hasta el laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional sede Medellín. A continuación, se realizó cultivo de linfocitos preparando una solución que incluye 9 mL de medio RPMI 1640 completo, 1 mL de Suero Fetal Bovino - SFB, 100 µL de Fitohemaglutinina y 1 mL de muestra de sangre. Esta mezcla fue incubada a 37 °C durante 72 horas. Seis horas antes de finalizar la incubación, se adicionó 25 µL de 5-Bromo-2-deoxiuridina a una concentración de 5µg/mL y una hora antes de finalizar se incorporó 84

100 µL de colchicina al 0.04% para lograr extendidos prometafásicos de alta resolución combinado con un alto número de mitosis. Este cultivo se centrifugó y se descartó el sobrenadante; luego se adicionó una solución hipotónica de KCL 0.075 M durante 10 minutos. Las muestras se fijaron con una preparación de metanol y ácido acético en proporción (3:1) y se agitaron vigorosamente. Luego se realizó el goteo de extendidos mitóticos en placas limpiadas previamente con etanol para finalmente sellar las placas con 0.30.5 mL de fijador fresco. Las metafases obtenidas se observaron en un microscopio a 100X con ayuda del aceite de inmersión buscando la presencia de quimerismo XX/XY y midiendo el porcentaje de extendidos que portaron el cromosoma “Y”. Análisis anatomopatológico. Dos terneras diagnosticadas SRY (+) fueron enviadas a las instalaciones de FrigoColanta en el municipio de Santa Rosa de Osos (Antioquia). Allí fueron beneficiadas, posteriormente evisceradas y sus tractos reproductivos fueron separados y fotografiados para análisis anatomopatológico. De éstas se sacaron muestras de ovario y oviducto con bisturí no mayores a 5mm y se transportaron en tubos plásticos con formol al 10% al laboratorio de histopatología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Antioquia. Allí las piezas fueron teñidas con hematoxilina-eosina y fijadas en placa con parafina. Las placas se observaron en microscopio a 100 y 400x y se fotografiaron para el análisis histopatológico.

Resultados Análisis molecular. Se realizó diagnóstico molecular para síndrome Freemartin mediante PCR de un total de 106 muestras de sangre proveniente de terneras mellizas nacidas de parto heterosexual entre enero de 2009 y diciembre de 2012 (tabla 1). Se obtuvo un amplificado de 151 pb correspondiente a un fragmento de gen SRY en 90 muestras de ADN provenientes de hembras mellizas las cuales se diagnosticaron como positivas para el síndrome Freemartin. Entre tanto, 16 muestras no presentaron amplificados por lo tanto se diagnosticaron como hembras libres del síndrome. Por raza, del total de terneras analizadas, el 75.5% (80 casos) fue holstein, 6.6% (6 casos) jersey, 2.8% simmental y holstein x jersey con 3 casos cada uno, 1.9% (2 casos) holstein x ayrshire; y 0.9% gyr x holstein, jersey x holstein, angus, jersey x simmental x holstein, brahman x holstein, rojo sueco, jersey x holstein x rojo sueco x ayrshire, holstein x angus, holstein x rojo sueco y pardo suizo x holstein, con un caso cada uno. La figura 1 enseña los resultados encontrados en un gel de agarosa para las muestras # 2, 5, 7, 10, 15, 21 y 28. De izquierda a derecha: carril 1: Marcador de peso molécular 50 pb. Carril 2: control positivo (ADN de

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 82-89

Tabla 1. Resultados obtenidos del análisis molecular del gen SRY de 106 muestras de terneras nacidas por parto múltiple heterosexual en Colombia. #

RAZA

MUESTRA

MUNICIPIO

RESULTADO*

# MUESTRA

RAZA

MUNICIPIO

RESULTADO*

RAZA

MUESTRA

MUNICIPIO

RESULTADO*

ANGUS

ANGOSTURA

NORMAL

HOLSTEIN

YARUMAL

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

NORMAL

HOLSTEIN

MEDELLÍN

FREEMARTIN

HOLSTEIN

YARUMAL

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

JERSEY

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

LA UNIÓN

NORMAL

ROJO SUECO

SAN PEDRO

NORMAL

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

SIMMENTAL

YARUMAL

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

NORMAL

HOLSTEIN

CAROLINA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

NORMAL

JERSEY

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

NORMAL

CE x HO

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HO x R SUECO SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

COPACABANA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

SIMMENTAL

CAROLINA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

FRONTINO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

MEDELLÍN

FREEMARTIN

JERSEY

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

CAROLINA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

JERSEY

BELMIRA

NORMAL

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

JERSEY

BELMIRA

NORMAL

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ARMENIA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELLO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ARMENIA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

JERSEY

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

CAROLINA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

SIMMENTAL

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN JOSÉ

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

GYR x HO

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

JE x HO

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HO x JE

SANTA ROSA

FREEMARTIN

JExHOxRSxAYR

BELMIRA

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HO x JE

SANTA ROSA

NORMAL

HOLSTEIN

SANTA ROSA

NORMAL

HOLSTEIN

SAN PEDRO

NORMAL

100

HO x JE

SANTA ROSA

NORMAL

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

BELMIRA

FREEMARTIN

101

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

COPACABANA

NORMAL

HO x ANG

SANTA ROSA

FREEMARTIN

102

JERSEY

LA CEJA

FREEMARTIN

JE x SIMM x HO

YARUMAL

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

103

PARDO X HO

POPAYÁN

FREEMARTIN

NORMAL

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

104

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HO x AYR

DON MATÍAS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

105

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

HO x AYR

GUARNE

FREEMARTIN

HOLSTEIN

SANTA ROSA

FREEMARTIN

106

HOLSTEIN

SANTA ROSA

NORMAL

HOLSTEIN

SAN PEDRO

FREEMARTIN

HOLSTEIN

ENTRERRÍOS

FREEMARTIN

HOLSTEIN

GUARNE

FREEMARTIN

HOLSTEIN

CAROLINA

FREEMARTIN

HO x GYR

BELLO

*Se registra como freemartin toda muestra de ADN de sangre de ternera que amplificó el gen SRY.

Diagnóstico del Síndrome Freemartin a través de diferentes técnicas

matopoyético característico del síndrome Freemartin. (figura 2B)

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa B.P.F. al 3% en 7 muestras de amplificados para SRY de sangre de terneras nacidas por parto múltiple heterosexual en Colombia.

macho bovino). Carriles 3,4,6,7 y 8 :Muestras Nº 2,Nº 5, Nº10, Nº15, Nº 21. Amplificado de 151 pb, fragmento SRY (Freemartin positivas). Carriles 5 y 9: Muestras Nº 7 y Nº 21, no presentaron amplificado (Freemartin negativas). Carril 10: Control negativo, (ADN vaca parida). A la ternera que corresponde la muestra Nº 28 con diagnóstico molecular SRY (-) se le realizó análisis citogenético buscando identificar sus cromosomas sexuales en linfocitos cultivados. En ninguna de las 14 placas montadas y 250 metafases analizadas, se encontró un complemento cromosómico 60XY, descartando la presencia de un quimerismo hematopoyético 60XX/60XY en este animal. (figura 2A) La ternera identificada con muestra Nº 10 fue diagnosticada como SRY (+) (Freemartin). En el cariotipo realizado, se encontró quimerismo hematopoyético con aproximadamente 60% de células con complemento cromosómico 60XY en un total de 110 metafases analizadas en 4 placas, confirmando el quimerismo he-

Figura 2A

Las terneras # 11 y 12 de 20 días de edad fueron diagnosticadas como SRY positivas y se remitieron a las instalaciones de FrigoColanta para su beneficio. Uno de los animales recién nacidos presentó aspecto de sus genitales aparentemente normal. En la otra se pudo ver hipertrofia del clítoris con hipertricosis de la comisura vulvar. Las figuras 3A y 3B pertenecen al tracto reproductivo de la ternera # 11. La figura 3A muestra el aspecto bilobulado de los ovarios con un tejido de color claro principal, y un sector periférico adyacente de color rojizo (señalado por la flecha), en donde después el análisis histopatológico determinó la presencia de túmulos seminíferos incipientes (figura 4), lo que demuestra que la estructura encontrada corresponde a un ovotestis bilateral. La figura 3B muestra la misma pieza estirada, tomada de los extremos del ligamento ancho. En ella se puede ver la falta de continuidad del cuerpo del útero al cérvix y éste a su vez a la vagina. Apenas se visualiza un cordón fibroso sostenido por el mesometrio (ver flecha). Estos hallazgos son compatibles con atresia ductal cervical.

Anormalidades anatómicas de la ternera 11, diagnosticada como SRY (+) Discusión y conclusiones Para el síndrome Freemartin se han utilizado históricamente diferentes técnicas diagnósticas como lo son la “prueba de tolerancia a homoinjerto” que consiste en transplantar piel del hermano macho a su hermana. Si la hembra es Freemartin, es decir, si se dio la anastomosis vascular entre los fetos, compartirán antígenos y por lo tanto la hembra será altamente tolerante al transplante de piel del mellizo. Esta prueba de tolerancia es complicada y el macho no siempre está disponible. Otras pruebas diagnósticas realizadas son la

Figura 2B

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Figura 3A

“Prueba del lapicero” o “Prueba de fondo de vagina”, que consiste en introducir un lápiz a través de la vulva de la ternera y si este no ingresa más de 15 centímetros es síntoma del síndrome Freemartin. Esta prueba es subjetiva pues el desarrollo del tracto vaginal dependerá de la edad y raza de la ternera. Ante la inexactitud y subjetividad de éstas pruebas diagnósticas, desde la década de los noventa se comenzaron a realizar diagnósticos a partir de estudios moleculares mediante la detección de genes asociados al cromosoma “Y” y citogenéticos mediante la observación directa de los cromosomas (Padula, 2005).

Figura 3B

La literatura ha reportado que el Freemartinismo se ha presentado entre rangos que oscilan entre el 85 y el 95% de las hembras provenientes de parto múltiple heterosexual (Ayala et al., 2007). En nuestro estudio, el 84.9% de los animales fueron positivos al síndrome. Estos resultados fueron inferiores al 88% reportado por McFeely et al., 1967, David, 1976 y Potter & Blackshaw, 1980; e inferiores a los citados por Marcum, 1974 (> 90%), Romagnano et al., 1988 (90%) y Ayala et al., 2007 (95%). Tanto los resultados reportados por la literatura como los arrojados por el presente trabajo confirman la alta frecuencia del síndrome en mellizas heterosexuales. La frecuencia de presentación medida como porcentaje de animales Freemartin por cada

Figura 4. Corte histológico del tejido gonadal extraído a la ternera # 11. Vista a 40x

Diagnóstico del Síndrome Freemartin a través de diferentes técnicas

100 partos múltiples no ha diferido significativamente entre estudios durante los últimos 39 años, independientemente del sistema de diagnóstico utilizado. Lo que si se ha incrementado durante los últimos años es la frecuencia de los partos múltiples; producto al parecer, del incremento en la selección para producción lechera (Wiltbank et al., 2000) y mejor manejo nutricional de la vaca (Çobano lu, 2011). La explicación a este fenómeno puede estar dada por el hecho de que las vacas de alta producción lechera son altas productoras de factor de crecimiento insulinoide tipo 1 (IGF-1, por sus siglas en inglés). Las altas concentraciones de IGF-1 se han asociado a mayor reclutamiento folicular y mayor diámetro folicular ovárico. Vacas que presentan partos múltiples presentan 47% mayor concentración de IGF-1 en sangre periférica y mayor concentración en fluido folicular en los dos folículos más grandes durante una onda de desarrollo folicular, lo que parece ser un factor asociado a mayor presentación de ovulación múltiple en estos animales (Çobano lu, 2011). El hecho de que se presenten más partos múltiples, incrementa la tasa de descarte de hembras o el levante de animales infértiles, donde el costo del levante de una hembra bovina en Colombia en 2009 fue de $3´697.786 (López & Vásquez, 2009). En Colombia no disponemos de reportes de incidencia de partos múltiples en bovinos, pero por ejemplo, para el caso de Norteamérica, se reporta una frecuencia de éstos del 4.75% en 24.000 partos de vacas holstein (Çobano lu, 2011). Si aplicamos nuestros resultados a estos estudios, asumimos que la mitad de estos partos múltiples serían heterosexuales (machohembra), es decir el 2.37%; y que un 84.9% de éstos producirían animales Freemartin; es decir, el 2.02% de los partos totales daría lugar a hembras Freemartin, estériles y las pérdidas económicas que esto implica. Al parecer, el factor racial por sí mismo no es determinante en la presentación del síndrome. Si bien en nuestro estudio 78.9% de las hembras Freemartin pertenecieron a la raza holstein, esta es la raza predominante en la mayoría de las fincas muestreadas. Lo que sí han reportado algunos autores (Çobano lu, 2011) que la frecuencia de partos múltiples en la raza holstein es la mayor de todas las razas lecheras, lo que indirectamente hace que se puedan presentar más casos de Freemartinismo. El análisis citogenético para el diagnóstico de Freemartinismo permite evidenciar la condición quimérica (XX/ XY) de los cromosomas sexuales y medir la proporción de células con complemento cromosómico XY en hembras con el síndrome. La literatura ha reportado variación en la cantidad de células quiméricas XX/XY, en un rango entre el 2% y el 96%. (Wilkes et al., 1980). En nuestro estudio el cariotipo realizado en una hembra SRY (+) presentó el 60% de linfocitos XY en 110 metafases analizadas procedentes de 4 placas. Estos resultados demuestran la enorme actividad de paso de células precursoras de linfocitos entre las placen88

tas, y la tolerancia del sistema inmune a éstas durante toda la vida del individuo. Por otro lado, se confirmó la ausencia del síndrome en una hembra SRY (-), al no encontrar presencia del cromosoma “Y” en 14 placas montadas y 250 metafases analizadas. Esta observación permite concluir que en un bajo porcentaje de partos múltiples heterosexuales no se desarrolla anastomosis placentaria, por lo que no hay paso de células entre fetos y por lo tanto las hembras no desarrollan quimerismo. Hay que recordar que la PCR permite detectar niveles tan bajos de quimerismo como 0.05% en un grupo de células (Ennis et al., 1999). Como se ha demostrado que la presencia del síndrome genera un mínimo de 2% de leucocitos quiméricos (Wilkes et al., 1980), descartamos la posibilidad de que las hembras SRY (-) puedan estar afectadas por el síndrome. Las hembras Freemartin contienen en el genoma de algunos grupos celulares el cromosoma “Y”. La expresión de muchos de sus genes, incluyendo SRY, sumado al paso de hormona antimulleriana entre placentas puede contribuir al desarrollo irregular de las estructuras reproductivas internas con lesiones tales como vaginas ciegas, ovarios hipoplásicos, agenesia total o parcial de cuernos uterinos, atresias ductales, etc. o bien puede observarse desarrollo de órganos reproductores masculinos como epidídimos, vesículas seminales y tejido testicular. (Wilkes et al., 1980) En nuestro estudio, la mayoría de las hembras se muestrearon en los primeros 60 días de vida; en este momento existen pocos signos de masculinización evidente. En algunas hembras se encontraron genitales externos aparentemente normales, pero el diagnóstico molecular confirmó el síndrome. En otras se visualizaron algunos indicios de la presencia de Freemartinismo, en características como hipertricosis en labios y comisura vulvar, y desarrollo hipertrófico del clítoris, pero no se evidenciaron otros defectos reportados por la literatura tales como las bolsas escrotales. (Ayala et al., 2007). Posiblemente este tipo de afecciones son más visibles en las hembras conforme crecen, y no son fáciles de diagnosticar en terneras recién nacidas. Por otro lado el análisis anatomopatológico permitió ver lesiones internas reportadas por la literatura como la atresia ductal cervical (Wilkes et al., 1980) y la presencia de tejidos mixtos en la zona ovárica, los cuales presentaron tejido reproductor masculino incipiente denominado ovotestis (Valencia et al., 2005) confirmado por examen histopatológico. El apoyo de técnicas diagnósticas como la histopatología ha permitido determinar lo complejo del estado de intersexualidad generado por el síndrome, y explica en parte el compromiso del síndrome en la fertilidad del animal. La invención de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y el uso de secuencias específicas para el cromosoma “Y” de ADN sintético constituyen un significativo avance en la detección de hembras bovinas Freemartin de forma precisa, oportuna y rápida

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(la prueba demora 6 horas en su realización) a partir de un volumen pequeño de sangre (200 µL, mínimo). La prueba es altamente sensible, lo que permite producir grandes cantidades de copias exactas de un fragmento de ADN específico de longitud definida a partir de pequeñas cantidades de ADN. La importancia de determinar oportunamente la presencia del síndrome Freemartin en terneras mellizas heterosexuales radica en poder conocer de manera precisa y temprana el estado de fertilidad del animal, ahorrando tiempo y dinero en la cría y levante de animales infértiles. Así mismo facilita el uso de hembras positivas en actividades como detección de celos, donde se ha reportado que las Freemartin poseen líbido superior a hembras normales (tan alta como la de un toro) (Ayala et al., 2000) y con menos riesgos de accidentes en instalaciones, operarios y otros animales generados por el uso de toros. La incursión de tecnologías tales como la PCR ha posibilitado el diagnóstico de múltiples enfermedades genéticas e infecciosas del bovino. Su sensibilidad, especificidad, rapidez y bajo costo están incrementando sus aplicaciones en beneficio de la producción pecuaria.

Agradecimientos Los autores agradecen a los asociados productores de leche y al personal del Departamento de Asistencia Técnica de la Cooperativa Colanta por su desinteresada colaboración en el reporte de los casos y la toma de muestras de sangre, respectivamente. De igual manera, al Laboratorio de Genética Animal de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Antioquia por el préstamo de sus instalaciones para la realización de las pruebas.

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Diagnóstico del Síndrome Freemartin a través de diferentes técnicas

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ARTÍCULO CORTO

Diseño in silico y evaluación funcional de genes semisintéticos que confieran tolerancia a fosfinotricina In silico design and functional assessment of semisynthetic genes that confer tolerance to phosphinothricin Jenny Paola Jiménez*, Alejandro Chaparro-Giraldo** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.52206

Resumen La tolerancia a herbicidas es una de las características más usadas en los cultivos GM, con resultados positivos para los agricultores y el ambiente. El punto de partida, es el desarrollo de casetes de expresión que expresen la característica de interés, inicialmente construidos mediante técnicas de biología molecular convencionales. Actualmente, con herramientas de bioinformática y biología sintética, es posible diseñar y probar el constructo in silico, para luego contratar su síntesis. Esta aproximación, permite optimizar la expresión mediante la modificación del uso codónico. En este trabajo se diseñaron y evaluaron en Nicotiana benthamiana versiones semisintéticas de genes que confieren tolerancia al herbicida fosfinotricina. Se realizó un análisis de libertad de operación, con el fin de asegurar que los constructos diseñados no violen derechos de propiedad intelectual en Colombia. Se obtuvieron dos casetes de expresión con libertad de operación, que expresan versiones del gen bar. Palabras clave: cultivos GM, libertad de operación, tolerancia a herbicidas, uso codónico.

Abstract Herbicide tolerance is one of the features most used in GM crops, which has shown positive results for farmers and the environment. The starting point is the development of expression cassettes that express the characteristic of interest, they are initially constructed by standard molecular biology techniques. Currently, by bioinformatics and synthetic biology tools, it is possible to design and test the construct in silico, and then hire their synthesis. This approach allows optimizing expression by modifying the codon usage. In this work there were designed and evaluated semi-synthetic versions of genes in Nicotiana benthamiana, these genes confer tolerance to the herbicide phosphinothricin. It was made an analysis of freedom to operate in order to ensure that the designed constructs not violate intellectual property in Colombia. There were obtained two expression cassettes with freedom to operate, which express versions of the bar gene. Key words: GM Crops, freedom to operate, herbicide tolerance, codon usage. Recibido: febrero 10 de 2016 Aprobado: octubre 22 de 2016

Introducción Una de las tecnologías que ha permitido mejorar la eficiencia en el control de malezas y al mismo tiempo aumentar la productividad en diversos cultivos y en diferentes países, es el uso de variedades Genéticamente Modificadas (GM) con tolerancia a herbicidas (Brookes & Barfoot, 2015). Esta metodología se basa * **

en la introducción de genes foráneos que confieren resistencia a herbicidas no selectivos de amplio espectro, permitiendo que el agroquímico se pueda utilizar en cualquier etapa de la cosecha, sin ocasionar daños al cultivo. El primer paso para el desarrollo de una línea GM, es la obtención de un constructo génico que exprese el gen de interés en la planta. Estos casetes

Bióloga, MSc., Universidad Nacional de Colombia - sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología & Instituto de Genética, Grupo de Ingeniería Genética de Plantas. jenny.jimb@gmail.com Ingeniero Agrónomo, MSc., PhD., Universidad Nacional de Colombia - sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología & Instituto de Genética, Grupo de Ingeniería Genética de Plantas. achaparrog@unal.edu.co

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de expresión se han desarrollado mediante técnicas de biología molecular convencionales, sin embargo, gracias a herramientas de bioinformática y biología sintética, es posible diseñar y probar el constructo in silico, para luego contratar su síntesis (Diazgranados et al., 2013). El diseño in silico de genes semi-sintéticos, constructos genéticos o casetes de expresión, es una herramienta versátil que permite al investigador manejar fácilmente variables en la secuencia de ADN y de los constructos que con el uso de técnicas moleculares convencionales sería muy dispendioso. Esta metodología permite la libre escogencia de secuencias promotoras, terminadoras, genes, regiones no traducidas (UTR), enhancers, péptidos señal, entre otros; insertar o eliminar sitios de restricción que faciliten manipulaciones en el laboratorio y realizar modificaciones en la secuencia codificante como optimizaciones de uso codónico y remoción de secuencias indeseables, factores que mejoran significativamente los niveles de expresión genética (Perlak et al.,1991; Lannacone et al.,1997; Li et al., 2013). En este trabajo se realizó el diseño in silico de versiones de casetes de expresión que confieren tolerancia al herbicida fosfinotricina o glufosinato de amonio, realizando las optimizaciones necesarias para favorecer su expresión en soya (Glycine max), y se evalúo su funcionalidad mediante transformación de la especie modelo Nicotiana benthamiana. Se efectuó un estudio de libertad de operación para Colombia de todas las secuencias involucradas, con el fin de asegurar que los constructos diseñados no violen derechos de propiedad intelectual, puesto que los resultados se van a usar en un proyecto para la generación comercial de líneas GM de soya a partir de variedades colombianas de esa especie.

Materiales y métodos Diseño “in silico” de genes semisintéticos Se realizó el diseño in silico de dos casetes de expresión que confieren la característica de tolerancia a fosfinotricina. Para ello, se descargaron las secuencias de interés del banco genético del NCBI y/o de patentes según se describe a continuación: gen bar (ID X17220.1), promotor 35S (gb|HQ698853.1|:1967-2514), promotor FMV (US 5378619 SEQ ID No. 11). El promotor 35S se aisló del virus del mosaico de coliflor (Brassica oleracea var. Botrytis) o CaMV y corresponde a un ARN 35S. El promotor FMV se aisló del virus del mosaico de escrofularia (Ranúnculus ficaria). Se determinó la secuencia codificante u ORF del gen bar y fue optimizada de acuerdo a los siguientes criterios: modificaciones de uso codónico para la soya, remoción de sitios crípticos de splicing y sitios de terminación prematuros; este proceso se realizó con el programa Visual Gene Developer 1.3 (Jung & McDonald, 2011). Para las modificaciones codónicas, se descargó el uso

codónico de la soya (Glycine max) de la base de datos kazusa (Nakamura et al., 2000) y se acopló al software. Mediante cambios iterativos el programa reemplaza los codones originales con otros manteniendo la identidad de la secuencia de aminoácidos. La selección de la secuencia optimizada se realizó teniendo en cuenta parámetros como el índice de adaptación codónico -CAI (Sharp & Li, 1987), el Número efectivo de codones Nc (Wright, 1990) y el contenido de GC. Todos los cambios realizados sobre la secuencia nucleotídica son cambios silenciosos, es decir no modifican la secuencia final de la proteína. El ensamblaje de los genes y de los elementos reguladores de los constructos se realizó con el programa Gene Designer 2.0 (Villalobos et al., 2006), con este mismo software se insertaron sitios de reconocimiento para enzimas de restricción. El análisis de traducción in silico se realizó a nivel de estructura primaria. Las predicciones se realizaron mediante la herramienta ORF Finder del NCBI. Como vector de transformación se seleccionó el pCAMBIA 1301, del cual se eliminaron los genes de selección vegetal y el gen reportero. La síntesis de los constructos y su clonación en el vector de transformación se contrató con la compañía Shanghai Generay Biotech Co., Ltd.

Validación funcional de los constructos Con el fin de evaluar la funcionalidad de los casetes de expresión, se transformó la planta modelo Nicotiana benthamiana con la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens previamente transformada con uno de los constructos. También se realizaron curvas de selección in vitro para N. benthamiana con fosfinotricina (PPT), con el objetivo de determinar la concentración adecuada para utilizar este agente en el medio de selección. Para todos los ensayos descritos a continuación se utilizaron plántulas de cuatro semanas de edad, y el material vegetal se mantuvo bajo condiciones controladas, con fotoperiodo 16/8 a 28°C. Para la curva de selección se sembraron explantes de hoja sobre medio de regeneración R (sales MS 1X, vitaminas Gamborg 1X, sacarosa 30 g/l, BAP 1 mg/l, agar PTC 7g/l y pH 5.8) con la concentración adecuada del herbicida. En este caso se usó PPT para cultivo de tejidos de Phytotechnology®, a las siguientes concentraciones: 0.2 mg/l, 0.4 mg/l, 0.6 mg/l, 0.8 mg/l, 1 mg/l, 3 mg/l, 5 mg/l, y 7 mg/l. Posteriormente, se transformó N. benthamiana con el constructo diseñado. Para este fin, se cultivó la bacteria en medio LB líquido con acetosiringona 200 µM a 28°C y 200 rpm hasta que alcanzó una DO = 0.6. Se infectaron explantes cuadrados de hoja (1cm2 aprox.) utilizando una fase de cocultivo líquido con la suspensión bacteriana durante dos minutos, y una fase de cocultivo en medio solido durante 24h (medio R con acetosiringona 200 µM). Posteriormente, se realizaron cinco lavados consecutivos en agitación a 100 rpm y temperatura ambiente, con el fin de eliminar la bacteria; finalmente los explantes se secaron y se sembraron sobre medio de selección (medio R con

Diseño de genes para tolerancia a fosfinotricina 91

cefotaxime 400mg/l y PPT). Se utilizaron dos concentraciones de selección 0.8mg/l y 3 mg/l de PPT. Las plantas putativamente transformadas fueron evaluadas mediante PCR con el kit KAPA BYOSYSTEMS®. Se diseñaron primers específicos para la secuencia de interés. FW: GCGTCCTGCCGATATTAGG y RV: TCTGTAACGGGCAATACGG. El programa utilizado fue el siguiente: denaturación (95°C 3 min x 1 ciclo), anillamiento (95°C 20 segundos, 66°C 15 segundos, 72°C 30 segundos x 35 ciclos), elongación (72°C 30 segundos x 1 ciclo). Sobre las plantas PCR positivas, se realizó RT-PCR, para evaluar la expresión a nivel de ARN. Para ello se hizo la extracción de RNA a partir de hojas, utilizando el Kit “RNA/DNA/protein purification”® de Norgen biotek corp. Se eliminó la contaminación con ADN, utilizando el kit “DNaseI RNA free”® de Thermo Scientific; se comprobó que la muestra no tenía remanentes de ADN mediante PCR. Luego, se realizó síntesis de ADNc con el kit “First Strand cDNA synthesis”® de Thermo Scientific, y finalmente una prueba de PCR con primers específicos para el gen bar.

Análisis de libertad de operación Se realizó la búsqueda de patentes nacionales e internacionales. Se utilizaron tres bases de datos internacionales: The Lens (https://www.lens.org/lens/), Patentscope: (http://www.wipo.int/patentscope/en/), Spacenet (http://www.epo.org/), y la base de datos nacional de la superintendencia de industria y comercio (SIC) (http://www.sic.gov.co/es/banco-patentes), todas de acceso público. En las bases de datos internacionales, las búsquedas se realizaron mediante palabras clave dentro de las reivindicaciones. Una vez identificadas las patentes que afectaban el uso de los genes y promotores, se realizó la búsqueda en la base de datos nacional, utilizando palabras clave en los campos, inventor, propietario, y título. Se analizaron los documentos encontrados, y se determinó si los genes de interés, estaban o no cubiertos por derechos de propiedad intelectual en Colombia. Las búsquedas están actualizadas hasta junio del 2014.

Resultados y discusión Selección de las secuencias La fosfinotricina (PPT) es el ingrediente activo de varios herbicidas comerciales, se comporta como un inhibidor competitivo de la enzima glutamina sintetasa. La obtención de plantas transgénicas tolerantes a PTT, se ha logrado básicamente mediante la introducción de uno de dos genes: el gen bar de Streptomyces. hygroscopicus (Thompson et al., 1987) o el gen pat de S. viridochromogenes (Wohlleben et al.,1988). Estos genes codifican para la proteína fosfinotricina n-acetil transferasa (PAT); esta proteína acetila el grupo NH2 de la PPT dando lugar a la formación de N-acetil fosfinotricina, que no tiene actividad herbicida (Dröge et al., 92

1992). Para los constructos diseñados en este trabajo se seleccionó el gen bar, ya que hay varios reportes del uso del mismo como marcador de selección específicamente en plantas de soya (Zhang et al., 1999; Paz et al., 2004; Zeng et al., 2004; Paz et al., 2006). Como elementos promotores de los constructos, se seleccionaron promotores de expresión constitutiva, ya que se requiere que el gen se exprese en todos los tejidos de la planta transformada. Se seleccionaron los promotores 35S (Odell et al., 1985) y FMV (Sanger et al., 1990; Maiti et al., 1997). El p35S es el promotor constitutivo más utilizado en transformación genética de plantas. Y el promotor FMV, ha sido utilizado en varios eventos de transformación genética mostrando una buena expresión del gen heterólogo (ej. MON89788, GTSB77, GT73 entre otros). Como secuencias terminadoras se utilizaron la región terminadora 35S y la secuencia terminadora del gen Rubisco E9 (rbcs, subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa) de la arveja o guisante (Pisum sativum), que ha sido utilizada en varias líneas GM comerciales (ej, GTSB77, MON89788 entre otras).

Diseño “in silico” de genes semisintéticos Una de las mayores ventajas del diseño in silico de casetes de expresión, es que permite realizar cambios en las secuencias nucleotídicas que pueden mejorar significativamente la expresión del gen, en el genoma que se va a introducir. Dentro de estos cambios las modificaciones de uso codónico han demostrado ser uno de los factores más influyentes para lograr buenos niveles de expresión (Perlak et al., 1991; Lannacone et al., 1997; Laguía-Becher et al., 2010; Yan et al., 2011; Kucho et al., 2013). En este trabajo se diseñaron dos casetes de expresión (figura 1). En el primero, denominado Bar-IGP se realizaron modificaciones de uso codónico sobre la secuencia codificante original (gen bar de Streptomyces hygroscopicus), con el fin de acercarlo al uso codónico de la soya. Para este constructo se utilizó el promotor FMV y el terminador E9. Se eliminaron secuencias cripticas de splicing y sitios de poliadenilación prematuros del ORF. La secuencia del gen bar es de origen bacteriano, y tiene un alto contenido de GC en el tercer codón (89 %), que es un valor más alto que el reportado para genomas vegetales (Kawabe & Miyashita, 2003). Las modificaciones de uso codónico permitieron cambiar el contenido de GC a 40 %, que es un valor más cercano al observado en el genoma de la soya (45.69 %). Se cambiaron 153 pares de bases (27.72 %) y 132 codones (71.74 %). La figura 2 muestra una comparación de los parámetros mencionados entre la secuencia inicial y la secuencia final. Para el segundo constructo (Bar-2) se utilizó la versión nativa del gen, en conjunto con el promotor y el terminador 35S. Así, los dos constructos, uno con modificaciones de uso codónico, y uno con la secuencia nativa

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Figura 1. Diagrama genes semi-sintéticos con tolerancia a fosfinotricina, obtenido con Gene Designer 2.0.

del gen, permitirán evaluar el efecto de la optimización codónica en futuros experimentos. La herramienta ORF Finder demostró que los casetes de expresión generan una proteína de 183 aminoácidos (figura 3). Mediante alineamiento pareado con el algoritmo de Smith-Waterman se determinó un 100 % de identidad entre la proteína predicha y la proteína esperada, indicando que los constructos efectivamente codifican para la fosfinotricina acetil transferasa (P16426).

Evaluación de la funcionalidad de los constructos Nicotiana benthamiana se ha utilizado ampliamente como sistema modelo en diferentes áreas de la bio-

logía, puede ser transformada genéticamente y regenerada con buena eficiencia en tiempos cortos, en comparación con otras especies (Clemente, 2006; Goodin et al., 2008). Con el fin de determinar que los constructos diseñados efectivamente se expresan, se realizaron ensayos de transformación genética en dicha planta. Con el objetivo de usar la tolerancia a fosfinotricina como marcador de selección in vitro, se evaluó la respuesta regenerativa de N. benthamiana frente a este agente. Con todas las concentraciones menores a 1mg/l los explantes mostraron un aspecto muy semejante al tratamiento control. En los tratamientos 0.2, 0.4 y 0.6 mg/l se registró una leve disminución en su capacidad regenerativa, mientras que a 0.8 mg/l la regeneración cayó a 20% (figura 4). Según Lutz et al. (2001), los explantes de Nictiana tabacum cultivados sobre medio con concentraciones de PPT superiores a 4 mg/l se tornan blancos, para N. benthamiana este efecto se observó desde 1 mg/l. Se realizaron experimentos de transformación utilizando dos concentraciones 0.8 mg/l (concentración a la cual el explante conserva su capacidad regenerativa) y 3 mg/l (concentración letal). Para ello, se transformaron explantes de hoja de N. benthamiana con una cepa de A. tumefaciens LBA4404 previamente transformada con el vector Bar-IGP. Como control negativo se sembraron explantes sin transformar sobre medio de regeneración con PPT. Los explantes sometidos a transformación con A. tumefaciens mostraron una apariencia saludable en contraste con los controles negativos (figura 5), siendo este un primer indicio que el constructo confiere tolerancia a PPT. Los explantes produjeron regenerantes en la cuarta semana. De los experimentos de transformación se obtuvieron cuatro plántulas en medios de selección con el herbicida, que se evaluaron para la presencia del transgén. Las pruebas de PCR mostraron la presencia del amplicón de 531 pb predicho para el gen bar (figura 6A y 6B carriles 1, 2, 3, 4) en todas las plántulas tolerantes a PPT, mientras que en la planta control no transformada no se presentó el amplicón específico. Se realizó una prueba de RT-PCR sobre una plántula positiva para PCR, con su control correspondiente. Para ello se realizó una PCR sobre el ADNc obtenido a partir del ARN aislado. La figura 7C, muestra que se obtuvo la banda de 531 pb esperada (carril 1), en tanto que para el control negativo (ADNc de planta no transformada) no hubo amplificación. De esta manera se demostró tanto la presencia, como la expresión del transgén en las plántulas transformadas.

Estudio de libertad de operación Figura 2. Parámetros iniciales (A) y finales (B) de la secuencia del gen bar, obtenidos con el programa Visual Gene Developer.

Se identificaron las patentes relacionadas con cada uno de los elementos genéticos de los constructos diseñados. Las patentes del gen bar están asignadas a Plant Genetic Systems, N.V., (Bayer CropScience ac-

Diseño de genes para tolerancia a fosfinotricina 93

Figura 3. Traducción in silico de los genes semi-sintéticos que confieren tolerancia a fosfinotricina, obtenida de ORF Finder.

Figura 4. Respuesta regenerativa de N. benthamiana a la fosfinotricina.

tualmente) y Biogen Inc. La solicitud de patente para este gen fue presentada mediante el mecanismo previsto por el Tratado de Cooperación en materia de Patentes o PCT (por sus siglas en inglés) con el número WO1987/005629, con 19 países designados, dentro de los cuales no se incluye a Colombia. Las patentes estadounidenses más importantes relacionadas con el uso del gen bar, están identificadas con los números US 5561236 (Leemans et al., 1996), US 5646024 (Leemans et al., 1997a), y US 5648477 (Leemans et al., 1997b). En ellas se protege, células vegetales transformadas con el gen que codifica para la acetil transferasa con la capacidad de inactivar inhibidores de la glutamina sintetasa; el proceso de producción de plantas

Figura 5. Explantes cocultivados con el vector BAR-IGP, en medio de selección con 3mg/l de PPT A. Control, B. Explantes cocultivados. Y en medio con 0.8 mg/l de PPT C. control, D. Explantes cocultivados. E. Regenerante obtenido. F. Plántula en medio de elongación.

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Figura 6. A y B. Amplificación del gen bar sobre plantas putativamente transformadas. (MP): marcador de peso 1Kb, (-)control negativo, (+) control positivo, 1,2,3,4 (planta 1,2,3,4). Amplicón 531 pb. C. Amplificación del gen bar sobre ADNc. Amplicón 531pb.

tolerantes a PPT o a cualquier compuesto que tenga alguna fracción de PPT mediante procesos de integración del gen bar de S. hygroscopicus o S. viridochromogenes en el genoma de células vegetales; vectores de transformación genética que comprendan el gen bar; modificaciones en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos del gen. La última patente concedida en relación a estos genes tiene el número US 7112665 (Leemans et al., 2006), en esta se amplía la protección del gen bar, a cualquier cambio posible en la secuencia de ADN que pueda producir un polipéptido con las mismas propiedades para generar resistencia a glufosinato de amonio. Está patente fue reasignada mediante la patente US RE44962. La búsqueda de patentes en la base de datos nacional mostró que estas patentes no fueron solicitadas en Colombia. Las patentes estadounidenses relacionadas con el uso del promotor 35S están identificadas con los números US 5352605 (Fraley et al., 1994), US 5530196 (Fraley et al., 1996), US 5858742 (Fraley et al, 1999) y US 6255560 B1 (Fraley et al., 2001). De acuerdo a la fecha de solicitud, las dos primeras debería haber vencido en el 2014, sin embargo en las bases de datos consultadas sólo se encontraron reportes de pago de la cuota de mantenimiento hasta el 2007, por lo que podrían haber vencido antes. Las patentes US 5858742 y US 6255560 B1 expiraron por falta de pago de la cuota de mantenimiento en el 2007. Para el promotor FMV se identificaron las patentes US 5378619 (Rogers, 1995) y US 5994521 (Maiti & Shepherd, 1999). La búsqueda en la base de datos nacional indica que ninguna de estas patentes fue solicitada en Colombia. No se encontraron patentes que protegieran específicamente el uso de las secuencias terminadoras. Estos resultados sugieren que los elementos genéticos de estudio pueden ser usados en el territorio colombiano sin violar derechos de terceros.

Conclusiones Se realizó el diseño in silico de constructos que confieren tolerancia a fosfinotricina. El análisis traduccional in silico, demostró que los constructos diseñados efectivamente codifican para la proteína PAT. Los explantes de N. benthamiana cocultivados con la bacteria que porta el vector BAR-IGP, mostraron una respuesta fenotípica diferencial con respecto a los explantes control, indicando que el constructo diseñado podría conferir tolerancia a la fosfinotricina. Las pruebas de PCR y RT-PCR demostraron que las plantas fueron transformadas con el gen de interés, y que el gen se transcribe a ARNm. Estos resultados son una evidencia preliminar de la funcionalidad de los constructos diseñados, indicando que la metodología utilizada para el diseño de genes permite la obtención de constructos funcionales. Una validación funcional completa, podría permitir la utilización de los constructos en experimentos de transformación genética de variedades colombianas de soya. Finalmente, los elementos de los casetes de expresión diseñados no están cubiertos por patentes en Colombia, lo que es importante, para el desarrollo de líneas GM con fines comerciales en el país.

Agradecimientos Los autores agradecen al Fondo Nacional de la Soya - Federación Nacional de Cultivadores de Cereales y Leguminosas (FENALCE), y a la Universidad Nacional de Colombia por la financiación de este trabajo.

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ARTÍCULO CORTO

Estrategias para disminuir la necrosis apical en la multiplicación y el enraizamiento in vitro del Pistacho Strategies to reduce the apical necrosis in vitro multiplication and rooting of Pistachio Mariela Cid**, Danilo Pina*, Iris Capote*, Maritza Escalona*, Marcos Daquinta* DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61527

Resumen El pistacho (Pistacia sp.) es uno de los frutales menos explotados, entre las principales causas está el elevado costo del material vegetal por las dificultades de propagación de la especie. La propagación in vitro ofrece un gran potencial para la industria de esta especie por la multiplicación a gran escala de clones seleccionados. El objetivo del presente trabajo fue controlar la necrosis apical de los brotes en la propagación in vitro del pistacho. A partir de brotes jóvenes de plantas de esta especie mantenidas en casas de cultivo, se procedió a su desinfección con hipoclorito de sodio al 1% durante diferentes tiempos. Las yemas apicales y axilares se establecieron en el medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado y enriquecido con 1 mg/L de Metatopolina. Se evaluaron diferentes tipos de frascos, número y tipo de explantes y formulaciones de medios de cultivo durante dos subcultivos de multiplicación y en el enraizamiento. El frasco de cristal de 200 ml de capacidad, la línea prolifera y el medio de cultivo DKW lograron los valores más bajo de necrosis apical. En la fase de multiplicación se presentaron valores bajo en todos los tratamientos ensayados sin diferencia estadísticas entre ellos en comparación con el enraizamiento donde la necrosis apical alcanzó valores superiores. El medio DKW y las líneas prolíferas lograron los menores valores. El medio de cultivo MS modificado, favoreció el número de segmentos enraizados y el DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) el número de segmentos que brotaron, presentando este último menor incidencia de necrosis apical. Palabras clave: forestales, medios de cultivo, nueces, propagación in vitro.

Abstract The pistachio (Pistacia sp.) is one of the least exploited fruit among the main causes is the high cost of plant material by the difficulties of propagation of the species. The propagation in vitro offers great potential for the industry of this species by multiplication scale of selected clones. The aim of this study was to control the apical necrosis of outbreaks in the in vitro propagation Pistachio. From young shoots of plants of this species kept in growing houses, proceeded to disinfection with sodium hypochlorite 1% for different times. The apical and axillary buds were established in the culture medium Murashige and Skoog (1962) modified and supplemented with 1 mg/L Metatopolina. Different types of bottles, number and type of explants and culture media formulations for two subcultures multiplication and rooting were evaluated. Glass flask of 200 ml capacity, and line proliferates DKW medium achieved the lowest values apical necrosis. In the multiplication phase values were low in all treatments tested no statistical difference between them compared to rooting where apical necrosis reached higher values. The average DKW and prolific lines obtained lower values. MS medium modified crop, favored the number of segments rooted and DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) the number of segments that sprouted, the latter having lower incidence of apical necrosis. Key words: forest, culture medium, nuts, in vitro propagation. Recibido: diciembre 10 de 2015

Aprobado: octubre 18 de 2016

Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Carretera a Morón Km 9. CP 69450. Cuba. e-mail: mdaquinta1962@gmail.com, mariela@bioplantas.cu, danilo@bioplantas.cu, icapote@bioplantas.cu, mescalona@bioplantas.cu

Control de la Necrosis apical en el No. Pistacho Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII 2 Julio-Diciembre 2016 97-105

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Introducción El pistachero es uno de los frutales menos explotados, entre las principales causas se puede citar: el largo período que se requiere para la entrada en producción (empieza a dar sus primeros frutos en el quinto año de su plantación y no llega a la plena producción hasta el décimo año, siendo el rendimiento medio por árbol de 10 a 12 kilogramos) y el elevado costo del material vegetal por las dificultades de propagación de la especie (dificultad de propagación por injerto de las variedades de interés y la selección de un patrón clonal propagado vegetativamente). Se encuentra entre los frutos secos más demandados a nivel mundial, siendo Irán el mayor productor mundial de este frutal con más de 230 000 toneladas por año. Los avances en la propagación de cuatro especies de la familia anacardiaceae, donde se incluye Pistacia vera son señalados por Moyo & Van Staden (2013). Los protocolos propuestos para la propagación in vitro del Pistacho presentan como principal deficiencia la necrosis apical que afecta la calidad del brote para su comercialización, este desorden fisiológico es característico de las plantas leñosas y el Pistacho ha sido una especie muy recalcitrante ante este desorden fisiológico (Arbeloa et al., 2013, García et al., 2013 y González-Padrón et al., 2013) y consiste en la muerte de la parte apical del brote con la siguiente muerte progresiva del mismo. La necrosis apical está relacionada con múltiples factores dentro de ellos varios autores hacen referencia al suministro nutricional en el medio de cultivo y con las condiciones físicas que garantizan la translocación de nutrientes desde la base hasta el ápice, principalmente del boro y el calcio. Recientemente Akdemir et al. (2014), y Tilkat et al. (2014), señalan que este síntoma no se produce en los brotes obtenidos en la inmersión temporal. Entre las principales causas que favorecen la necrosis apical en este cultivo, está la composición del medio de cultivo y las condiciones que afecten la disponibilidad de los nutrientes para ser absorbido por el explante (capacidad del frasco y el volumen de medio de cultivo por explante). En este trabajo, se estudia el efecto de tres formulaciones basales de medios de cultivo DKW liofilizado (DUCHEFA), DKW preparado en el laboratorio según Driver & Kuniyuki (1984) y el medio de cultivo MS modificado por Daquinta, 2011. Después de seleccionar las plantas según las características recomendadas, es decir, con bordes lisos en las hojas. Se puede observar que todas las líneas no respondían igual en cuanto a la respuesta fisiológica. Sobre esta base se seleccionaron dos tipos de líneas: líneas prolíferas, aquellas en que el coeficiente de multiplicación era alto y líneas poco prolíferas, donde había poca proliferación. El objetivo propuesto en el presente trabajo es el desarrollo de estrategias para disminuir la necrosis apical 98

en la multiplicación y el enraizamiento in vitro del Pistacho.

Materiales y Métodos Efecto de tres tipos de frascos con diferente capacidad y tres densidades de inoculo en la multiplicación y necrosis apical del Pistacho Con el objetivo de evaluar el tipo de frasco de cultivo y su espacio gaseoso, sobre los brotes de pistacho se desarrolló el presente experimento. Los tres tipos de frascos utilizados en el estudio fueron, el NEYKER, frasco de cristal de 200 ml de capacidad, las magentas plásticas cuadradas de 350 ml de capacidad y los frascos de cristal de 350 ml de capacidad y se evaluaron tres densidades de inóculo (4, 7, 10 brotes por frascos). Como explantes se tomaron segmentos nodales de 1 cm de longitud con dos nudos a partir de brotes con cuatro subcultivos. El medio de cultivo utilizado es el MS (1962) modificado, según Daquinta (2011). A los 21 días se evaluó el número de brotes por explantes, el coeficiente de multiplicación y la necrosis apical.

Estudio de tres formulaciones basales de medios de cultivo y dos tipos de explantes (LP-Líneas prolíferas y LPP- Líneas poco prolíferas) en la multiplicación y la necrosis apical del Pistacho Para estudiar la influencia de la composición química de los medios de cultivo sobre dos tipos de explantes se realizó este experimento. Como explantes se tomaron segmentos nodales de 1 cm de longitud con dos nudos a partir de brotes con siete subcultivos. Los brotes se subcultivaron en medio de cultivo como se describe a continuación, con sacarosa a 30 g.L-1, tiamina 1 mg.L-1, mioinositol 100 mg.L-1, metatopolina 1.07 mg.L-1 y AIB 0.2 mg.L-1, se tuvo en cuenta dos tipos de explantes (líneas prolíferas y líneas poco prolíferas). El volumen de medio de cultivo por explantes fue de 25 ml. Al realizar el subcultivo se evaluó el número de brotes emitidos por explantes, el coeficiente de multiplicación y el número de brotes necrosados. Esta evaluación se realizó en dos subcultivos para evaluar el efecto residual de las formulaciones basales sobre el explante. • Medio de Daquinta, 2011 (MS modificado, mitad de la concentración de los nitratos y haluros, el doble de la concentración de los sulfatos y se le agregó nitrato de calcio a una concentración de 1.2 g.L-1. • Medio DKW preparado en el laboratorio según Driver & Kuniyuki (1984). • Medio DKW liofilizado (Duchefa). Las condiciones de luz fueron bajo un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad, con una inten-

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sidad luminosa de aproximadamente 1000-3000 lux (12.5-37.5 µmol.m-2.s-1). La temperatura de incubación fue de 25± 2°C. A los 21 días se evaluó el número de brotes por explantes, el coeficiente de multiplicación y la necrosis apical.

Efecto de tres formulaciones basales de medios de cultivo y dos tipos de líneas (prolíferas y poco prolíferas) en el enraizamiento y la necrosis apical del Pistacho La influencia de la composición química de tres medios de cultivo sobre el enraizamiento se evaluó en el presente experimento. Se emplearon brotes de pistacho procedentes de la fase de multiplicación, en medio de cultivo semi-sólido, con siete subcultivos, con una longitud entre 1.5-2.5 cm y 2-4 entrenudos, el medio de cultivo en el cual se desarrollaban los explantes al momento de montar el experimento era el medio de cultivo MS modificado propuesto por Daquinta, 2011. El tipo de medio de cultivo y las variables experimentales se describen en el experimento de multiplicación, solo difiere el regulador de crecimiento que en el caso del enraizamiento se utilizó el AIB a una concentración de 3 mg.L-1, los explantes se colocaron 5 días a la oscuridad y el resto del tiempo bajo el fotoperiodo e intensidad luminosa descrita anteriormente. A los 30 días se evaluó, la longitud del brote (cm), el porcentaje de plantas enraizadas (%) y el número de raíces por planta y el porcentaje de plantas con necrosis apical.

Estudio de tres formulaciones basales de medios de cultivo sobre la brotación, enraizamiento y necrosis apical de brotes emitidos a partir de segmentos nodales del Pistacho Para el montaje de este experimento se utilizaron segmentos nodales de pistacho de 1 cm de longitud con dos nudos y siete subcultivos, las condiciones para la experimentación son las mismas descrita para el primer experimento. En este caso se realizó la evaluación con el clon prolifero y la cantidad de inoculo utilizada fue de siete explantes por frasco. Se utilizaron ocho frascos por tratamiento. A los 30, 45 y 60 días se evaluó el porcentaje de segmentos brotados y enraizados y a los 60 días el porcentaje de necrosis apical de los segmentos brotados. En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el SPSS (versión 11.5 para windows, SPSS Inc.). Se comprobó el ajuste a la distribución normal de los datos de cada tratamiento (Kolmogorov-Smirnov) y la homogeneidad de las varianzas (Levene). Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) y prueba de rangos múltiples de Tukey para valores de p≤0.05. En algunos casos fue necesaria la transformación de los datos para lograr los supuestos de las pruebas paramétricas reaControl de la Necrosis apical en el Pistacho

lizadas las cuales aparecen descritas en los pie de las figuras y tablas.

Resultados y Discusión Efecto de tres tipos de frascos con diferente capacidad y tres densidades de inoculo en la multiplicación y necrosis apical del Pistacho Los frascos de cristal de tapa de polipropileno tienen una capacidad de 200 ml, las magentas son plásticas y de forma cuadrada con una tapa de polipropileno que garantiza un cierre hermético, su capacidad es de 350 ml y los frascos de cristal con tapa plástica de igual capacidad que las magenta. Como se observa hay una diferencia en la capacidad de los frascos y en la calidad de la luz que reciben las plantas en el interior de los recipientes de cultivo. Como se puede observar en la tabla 1, el número de brotes por explantes y el coeficiente de multiplicación no se vieron afectados por los factores estudiados, no mostrando diferencias estadísticas entre los tratamiento. Sin embargo, cuando se analiza el porcentaje de necrosis apical se puede observar que se vio influenciado por ambos factores. Independientemente de la densidad de inoculo ensayada, el frasco de cristal de 200 ml de capacidad presentó menor necrosis apical que los demás frascos estudiados, las magentas presentaron el mayor porcentaje de necrosis con diferencias estadísticas con el frasco de 200 ml de capacidad, con respecto al frasco de cristal de 350 ml de capacidad, sólo difirió cuando se empleó la densidad de inoculo menor. La necrosis apical aumentó a medida que se incrementó el número de explantes por frasco, en los tres frascos estudiado, aspecto este que se justifica pues el volumen de medio de cultivo por explantes se reduce, al igual que el volumen de aire por explantes lo que provoca agotamiento de los nutrientes y aumento de la toxicidad, respectivamente. Estos resultados son similares a los obtenidos por García et al. (2012), cuando compararon dos densidades de inoculo (5 y 7) y obtuvieron el menor número de explantes necrosado con 5 explantes por frasco con diferencia con el control (7 explante). En general las condiciones óptimas tanto de la forma como del tamaño del frasco de cultivo son muy diferentes entre especies y varían también al variar otros factores como el tipo de material del recipiente, tipo de cierre o volumen del medio de cultivo (George, 1993). González-Padrón et al. (2013), han disminuido los porcentajes de necrosis, aumentado la tasa de multiplicación y la longitud de los brotes utilizando brotes apicales (frente a secciones nodales); sales DKW (frente a MS y OM), medio sólido (frente a líquido, doble fase o alternado) y cultivo en frascos (frente a tubos). 99

Tabla 1. Efecto del tipo de frasco y la densidad de inoculo sobre el número de brotes, el coeficiente de multiplicación y el porcentaje de explantes necrosados en la multiplicación de Pistacho. Densidad de inóculo

N. brotes/ explantes

% necrosis

1.4

1.8

2.3

2.7

49ª

F. cristal, 350 ml

1.8

2.9

29bc

F. cristal, 200ml

2.1

3.6

20c

1.8

2.2

63ª

F. cristal, 350 ml

1.5

2.8

44ab

F. cristal, 200ml

1.7

2.5

23bc

1.8

2.0

53ª

2.1

3.0

47ab

T. Frasco F. cristal, 200ml

Magenta, 350 ml

F. cristal, 350 ml Sig

Cada tratamiento se evaluó con 28 explantes, letras diferentes en una misma columna denota diferencia estadística entre los tratamientos para valores p≤0,5 (ANOVA, Tukey). Las variables número de brotes y coeficiente de multiplicación se transformaron según (x+0.5)1/2 (x)1/2, la variable porcentaje de necrosis se transformó según 2 arcosen (x/100)1/2.

Este ensayo permitió concluir que el frasco más adecuado para la multiplicación del pistacho es el de cristal con 200 ml de capacidad, por presentar menor necrosis apical. En cuanto a la densidad de inoculo, utilizando este frasco, 4 y 7 mostraron los valores más bajo en cuanto a necrosis apical. Como el objetivo de este trabajo es reducir los porcentajes de necrosis para la producción comercial de este cultivo, la densidad de inoculo seleccionada para continuar la experimentación fue la de 7 explantes por frascos pues los valores de necrosis (20%) están por debajo de los valores normales referidos para esta especie (25%). En cuanto a las demás variables estudiadas (número de brotes y coeficiente de multiplicación) no existieron diferencias. Al utilizar 4 explantes por frascos se está desaprovechando medio de cultivo y espacio en el interior del mismo. Durante el cultivo de brotes, la aparición de necrosis apical fue perjudicial para la obtención de brotes adecuados para enraizar. Entre los diferentes tratamientos estudiados estuvieron los reguladores de crecimiento, la composición del medio de cultivo, el “bottom cooling” y la densidad de explantes en el frasco. Todos influyeron en la tasa de necrosis apical (Arbeloa et al., 2013). Sobre esta base los siguientes experimentos se realizaran con el frasco de cristal con 200 ml de capacidad y una densidad de inoculo de 7 explantes por frascos. 100

Estudio de tres formulaciones basales de medios de cultivo y dos tipos de explantes (LP-Líneas prolíferas y LPP- Líneas poco prolíferas) en la multiplicación y la necrosis apical del Pistacho Cuando se evaluó el efecto de las tres formulaciones basales en el primer subcultivo (tabla 2), se puede observar que el medio de cultivo MS modificado y el DKW preparado favorecieron el número de brotes emitidos y el coeficiente de multiplicación existiendo diferencia estadísticas con el medio DKW liofilizado (DUCHEFA). En cuanto al tipo de explantes no existió influencia de este factor sobre el número de brotes y el coeficiente de multiplicación, no existiendo diferencias estadísticas entre ellos. Los factores evaluados no tuvieron un efecto marcado estadísticamente sobre la necrosis apical aunque se debe destacar que las líneas poco prolíferas mostraron numéricamente valores más elevados de necrosis que las prolíferas. Una de las diferencias más notables entre los diferentes medios de cultivo empleados es la concentración de calcio, el medio de cultivo DKW triplica su concentración respecto a MS. La deficiencia de calcio en las plantas ha sido asociada con necrosis apical y un pobre crecimiento de las raíces en diversas especies cultivadas in vitro, como el pistacho (Barghchi & Alderson, 1989 y 1996) y otras plantas leñosas (Singha et al.,

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 97-105

Tabla 2. Respuesta de tres formulaciones basales de medio de cultivo y dos tipos de explantes (LP, líneas prolíferas; LPP- líneas poco prolíferas) sobre las variables de calidad en el primer subcultivo en la multiplicación del Pistacho. Medio de cultivo

Explante

N. Brotes

% necrosis

LPP

1.0a

1.8b

14.3

1.4a

2.1ab

LPP

1.3a

2.3ª

8.6

0.9a

2ab

LPP

0.1b

7.1

0.1b

MS- Modificado

DKW (Driver & Kuniyuki, 1984)

DKW-L Duchefa Sig

Cada tratamiento se evaluó con 35 explantes, letras diferentes en una misma columna denota diferencia estadística entre los tratamientos para valores p≤0,5 (ANOVA, Tukey). Las variables número de brotes y coeficiente de multiplicación se transformaron según (x+0.5)1/2 (x)1/2, la variable porcentaje de necrosis se transformó según 2 arcosen (x/100)1/2.

1990; Piagnani et al., 1996; Bairu et al., 2009; Thakur & Kanwar, 2011). La menor incidencia de la necrosis apical observada en el tratamiento MS modificado podría estar dada en que los incrementos de calcio añadido al medio de cultivo MS, modificado por Daquinta, 2011, igualan a los contenidos de calcio del medio de cultivo DKW.

cuando los brotes se multiplicaron en medio de cultivo MS, sin afectar a la multiplicación de brotes, y no así la adición de boro (Abousalim & Mantell, 1994; Barghchi & Alderson, 1996). García et al., (2012) cuando añadió gluconato de calcio al medio DKW no tuvo un efecto sobre la necrosis lo que sugiere que el medio DKW tiene una concentración de calcio suficiente.

En Pistacia vera, la adición de calcio al medio de cultivo produjo una reducción en la incidencia de necrosis

Cuando se observa el efecto continuado de estos tratamientos (tabla 3), se puede destacar que el medio de

Tabla 3. Respuesta de tres formulaciones basales de medio de cultivo y dos tipos de explantes (LP, líneas prolíferas; LPP- líneas poco Prolíferas) sobre las variables de calidad en el segundo subcultivo en la multiplicación del Pistacho. Medio de cultivo

Explante

N. Brotes

% necrosis

LPP

1.3

2.1 bc

6.7

1.7

2.8 a

2.9

LPP

1.7

1.7 cd

2.9

1.0

2.2 b

0.0

LPP

1.0

1.1 e

0.0

1.0

1.3 de

0.0

MS- modificado

DKW (Driver y Kuniyuki, 1984)

DKW-L Duchefa Sig

Control de la Necrosis apical en el Pistacho

101

cultivo MS modificado alcanzó el mayor coeficiente de multiplicación con diferencias estadísticas con el resto, el medio de cultivo DKW liofilizado mostró los valores más bajos.

Efecto de tres formulaciones basales de medios de cultivo y dos tipos de líneas (prolíferas y poco prolíferas) en el enraizamiento y la necrosis apical del Pistacho

En cuanto a la necrosis apical no existió diferencia entre los tratamientos evaluados, hubo una tendencia a la disminución cuando se empleó el medio de cultivo DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) y el DKW liofilizado (DUCHEFA). García et al. (2010), comparando diferentes medios de cultivo en la multiplicación de Pistacia vera determinaron que el medio DKW mostró brotes con mayor calidad y menor necrosis apical con respecto al medio MS y al WP.

En la tabla 4 se muestra el efecto de tres formulaciones basales de medio de cultivo y dos tipos de líneas sobre los indicadores de calidad en el enraizamiento del Pistacho, como se puede apreciar existió un efecto mayor del tipo de explantes utilizado sobre todas las variables evaluadas, donde la línea prolífera presentó mejores resultado con diferencias estadísticas con respecto a la línea poco prolífera. El valor más alto de enraizamiento se logró en el tratamiento DKW-L (DUCHEFA) con un 60%, sin diferencia estadística con el resto de los medios ensayados cuando se combinaron con las líneas prolíferas.

En la figura 1 se muestra los brotes en las tres formulaciones basales de medios de cultivo, como se puede apreciar entre el medio MS modificado y el DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) no existen diferencias cualitativas. Sin embargo, al observar los brotes en el medio DKW liofilizado se destaca el bajo números de brotes emitidos y estos presentan un color clorótico, además son de menor tamaño, lo que hace que no puedan ser divididos por segmentos nodales. Como se señala con anterioridad, la modificación realizada por Daquinta (2011) incrementa considerablemente los niveles de Ca del medio de cultivo MS, en forma de nitrato de calcio (1.2 g.L-1), a niveles casi tres veces los contenidos en MS. Otras alteraciones realizadas al medio de cultivo originalmente propuesto, son la mitad de los nitratos (por ser el medio de cultivo MS muy rico en estos compuestos y pueden ser toxico para determinadas plantas leñosas) y los haluros (para incrementar el calcio en forma de nitrato y no de cloruro, que pudiera ser toxico para las plantas) y el doble de los sulfatos. Faltando modificar los niveles de boro, que es el otro elemento junto al calcio que influye notablemente en la necrosis apical de esta planta, lo cual es un elemento a tener en cuenta en futuros trabajos a realizar.

La falta de enraizamiento o un número escaso de raíces por brote es frecuente en la propagación de Pistacho. El enraizamiento mejoró tras largos periodos de cultivo. Además, entre los diferentes factores ensayados, los reguladores de crecimiento, la composición del medio de cultivo y el pH mostraron mayor efecto en el enraizamiento (Arbeloa et al., 2013). Los reguladores del crecimiento en los medios de cultivo permiten direccionar la morfogénesis de los tejidos y modificar las respuestas fisiológicas en condiciones in vitro. Dentro de ellos, se encuentran las auxinas, cuyos efectos están relacionados con la dominancia apical y con la inducción de los procesos rizogénicos en las plantas, y promueven el crecimiento por medio de los mecanismos de elongación celular (Sihna, 2004). En la micropropagación convencional de Gerbera se evaluó el efecto de tres tipos de auxinas (AIA, AIB y ANA) a diferentes concentraciones en la formación in vitro de raíces. El AIB resultó ser la auxina de mayor influencia en el número y longitud de las raíces (Rahman et al., 2014), En cuanto a la necrosis apical las líneas prolíferas presentaron los menores valores en las tres formulaciones

Figura 1. Explantes de Pistacho en fase de multiplicación en las tres formulaciones basales. MS modificado, DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) y DKW-L (DUCHEFA).

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Tabla 4. Efecto de tres formulaciones basales de medio de cultivo, 2 tipos de explantes sobre las variables de calidad a los 30 días de enraizado el Pistacho. Medio de cultivo MS- modificado DKW (Driver y Kuniyuki (1984) DKW-L Duchefa

Explante

Long. Brote. (cm)

Plantas enraizadas (%)

No raíces/pta.

Necrosis (%)

LPP

2.7 b

0.4 bc

80 a

3.45 a

54 ab

0.7 ab

23 c

LPP

2.71 b

0.1 c

20 c

3.43 a

43 abc

0.6 bc

31 c

LPP

2.70 b

34 bc

0.6 bc

46 b

3.30 a

60 a

1.5 a

20 c

Sig

Cada tratamiento se evaluó con 35 explantes, letras diferentes en una misma columna denota diferencia estadística entre los tratamientos para valores p≤0,5 (ANOVA, Tukey). La variable número de raíces se transformó según (x+0.5)1/2 (x)1/2, la variable de porcentajes se transformó según 2 arcosen (x/100)1/2. LPP-Líneas poco prolíferas; LP- Líneas prolíferas.

estudiadas, sin diferencias estadísticas entre estas, el mayor valor lo manifestó el tratamiento del medio de cultivo MS modificado y la línea poco prolífera con un 80% de necrosis.

en el resto del tiempo siguió la misma tendencia los tres tipos de medios pero con incrementos muy bajos. El medio DKW-L (DUCHEFA) presentó los valores más bajo de brotación. En cuanto al número de segmento enraizado el medio MS modificado mostró a los 60 días un 73% de brotes enraizados, casi el doble de lo logrado en los restantes medios de cultivos estudiados.

Evaluación de tres formulaciones basales de medios de cultivo sobre la brotación, enraizamiento y necrosis apical de brotes emitidos a partir de segmentos nodales del Pistacho En la tabla 5 se muestra el efecto de tres formulaciones basales de medio de cultivo sobre la brotación y enraizamiento de segmentos nodales de plantas de pistacho y la necrosis apical sobre el número de segmentos brotados. En cuanto a la brotación el medio de cultivo DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) mostró los mejores resultados con diferencias estadísticas con el resto de los medios de cultivo empleados. En los primeros 30 días el mayor número de segmentos estaban brotados,

Cuando se analiza el número de segmento que logro brotar y enraizar del número total de segmento (datos no mostrado), el medio de cultivo MS modificado mostró un 32% de explantes que brotaron y enraizaron seguido por el medio de cultivo DKW (Driver & Kuniyuki (1984) que obtuvo un 28.56% y el DKW-L de la DUCHEFA alcanzó el valor más bajo con 3.59%. En cuanto a la necrosis apical el medio DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) mostró los valores más bajo (26%) del total de segmentos brotados con diferencias esta-

Tabla 5. Efecto de tres formulaciones basales de medios de cultivo sobre la brotación, enraizamiento y necrosis apical de segmentos nodales de Pistacho. Segmentos brotados (%)

Segmentos enraizados (%)

Medio de cultivo

Necrosis (%)

30d

45d

60d

30d

45d

60d

MS- modificado

36b

39b

43b

61a

70a

73a

33a

DKW (Driver y Kuniyuki, 1984).

61a

70a

25b

29b

38b

26b

DKW-L Duchefa

25b

29b

34b

33a

Sig

Cada tratamiento se evaluó con 56 explantes, letras diferentes en una misma columna denota diferencia estadística entre los tratamientos para valores p≤0,5 (ANOVA, Tukey). Las variables de porcentaje se transformaron según 2 arcosen (x/100)1/2.

Control de la Necrosis apical en el Pistacho

103

dísticas con el MS modificado y el DKW-L (DUCHEFA), que ambos obtuvieron un 33% de necrosis. Este medio también obtuvo el menor porcentaje de brotes necrosado, del número de segmento totales que lograron brotar y enraizar, sólo 1 para un 6.25%. (Datos no mostrados). La figura 2 muestra los segmentos de tallos en las tres formulaciones de medio de cultivo, se puede apreciar la brotación de las yemas en el medio MS modificado, Daquinta, 2011 y el DKW (Driver & Kuniyuki, 1984). Sin embargo, en el DKW-L (DUCHEFA) la brotación fue muy escasa, casi nula, este comportamiento fue similar durante todo el tiempo del experimento.

Conclusiones Entre las estrategias para lograr reducir la necrosis apical del pistacho estuvo la capacidad del frasco, la procedencia del explante y las formulaciones basales de los medios de cultivo, donde el frasco de cristal de 200 ml de capacidad, la línea prolifera y el medio de cultivo DKW lograron los valores más bajo. La necrosis apical en la fase de multiplicación presentó valores bajo en todos los tratamientos ensayados, sin diferencias estadísticas entre ellos en comparación con el enraizamiento, donde la necrosis apical alcanzó valores superiores. El medio DKW y las líneas prolíferas lograron los menores valores. No existe una sincronía entre el número de segmentos que brotan y los que emiten raíz, el medio de cultivo MS modificado, favoreció el número de segmentos enraizados y el DKW el número de segmento que brotaron, el primero, MS modificado, obtuvo la mayor sincronía (32%) seguido por el DKW (28.56%), presentando este menor incidencia de necrosis apical.

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Figura 2. Enraizamiento de segmento de tallos de Pistacho en tres formulaciones de medios de cultivo a los 30 días de enraizados. MS Modificado (Daquinta, 2011), DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) y DKW-L (DUCHEFA).

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105

ARTÍCULO CORTO

Caracterización de aceites de las semillas de Moringa oleífera a partir de la extracción por diferentes métodos Characterisation of Moringa oleifera’s oils from different extraction methods Diana Gómez Mitjans*, Vicenta Pita Bravo**, Beatriz Zumalacárregui de Cárdenas*** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.54324

Resumen La Moringa oleífera es una planta que se utiliza como materia prima en diferentes industrias, como la alimentaria, farmacéutica y cosmética. Una de las partes aprovechables del árbol es la semilla debido a su contenido entre un 30 y 45 % de aceite. Sus propiedades terapéuticas potencian su uso en el tratamiento de más de 300 enfermedades. En esta investigación se caracterizó el aceite extraído de las semillas de Moringa oleífera de las variedades de origen cubano Supergenious, Plain y Nicaragua, a partir de extracciones sólido-líquido con hexano y etanol como disolventes y por el método de prensado mecánico de la variedad Nicaragua. A través de un diseño de experimento 2K se analizaron las variables relación solutodisolvente, tiempo de extracción, y la granulometría seleccionándose las corridas con mayores valores de porcentaje de extracción. Los aceites correspondientes a la selección se caracterizaron fisicoquímica y fitoquímicamente y los valores se compararon con variedades de diferentes regiones reportadas en la literatura. Se demostró que el método de prensado es eficiente, económico y no influye en las propiedades del producto obtenido. Palabras clave: Moringa oleífera, extracción sólido-líquido, análisis fisicoquímico, prensado mecánico, cromatografía gaseosa.

Abstract Moringa oleífera is a plant that is used as raw material in various industries, including those related to the field of chemistry such as food, pharmaceuticals and cosmetics. One of the usable parts of the tree is the seed because the content between 30 and 45% oil. They enhance its therapeutic use in the treatment of more than 300 diseases. In this research the oil extracted from the seeds of Moringa oleífera varieties of Cuban origin Supergenious, Plain and Nicaragua is characterized from solid-liquid extraction with hexane and ethanol as solvents and by the method of mechanical pressing of the species Nicaragua . Through a design of experiment 2K solute-solvent variable ratio, extraction time were analyzed, and the grain size selected runs with values greater percentage of oil extracted. Oils corresponding to the selection were characterized physic-chemical and phytochemically and were compared with varieties from different regions reported in the literature. It was shown that the pressing method is efficient, economical and has no influence on the product properties obtained. Key words: Moringa oleífera, physicochemical analysis, solid-liquid extraction, mechanical pressing, gas chromatography. Recibido: enero 10 de 2016 Aprobado: octubre 13 de 2016

Ing. Centro de Control Estatal de Equipos Médicos y Medicamentos (CECMED). Ave.5ta A entre 60 y 62, Miramar, Playa, La Habana, Cuba, dgmitjams@gmail.com; dgmitjams@cecmed.cu. ** MSc. Facultad de Ingeniería Eléctrica Instituto Superior Politécnico “José Antonio Echeverría” CUJAE. Ave.114 No. 11 901 entre Ciclovía y Rotonda, Marianao, La Habana, Cuba, vicenta@quimica.cujae.edu.cu. *** Dra. Facultad de Ingeniería Química Instituto Superior Politécnico “José Antonio Echeverría” CUJAE. Ave.114 No. 11 901 entre Ciclovía y Rotonda, Marianao, La Habana, Cuba, beatriz@quimica.cujae.edu.cu.

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Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 106-111

Introducción La Moringa oleífera es la especie más conocida de trece que existen del género Moringácea. Desde hace siglos, en regiones de Asia y África se han utilizado las semillas y hojas para la alimentación, en la prevención de la ceguera, como purificador de aguas y mieles, acelerador y multiplicador en la producción de cultivos tradicionales por medio del extracto de sus hojas que contienen zeatina, hormona del crecimiento entre otras, las cuales además junto con los tallos presentan inigualables propiedades para la producción de bioetanol, y sus semillas son productoras de aceite comestible. (Alfaro, 2008; Cáceres, 1993; Foidl et al., 1999). En la figura 1 se muestran los usos más importantes de la planta. Los aceites extraídos de las diferentes variedades de las semillas de Moringa oleífera son de color amarillo intenso poco viscoso, siendo empleados en preparaciones y bálsamos para la piel. Actualmente el uso de estos, se ha extendido con éxito ya que su estructura ofrece una enorme cantidad de ácidos grasos, tocoferoles y vitamina E, convirtiéndose en un complemento poderosamente eficaz para combatir el colesterol. (Pérez & Cheng, 2012). Investigadores como Rodríguez et al., (2012) han centrado sus estudios en determinar parámetros de calidad que se muestran algunos en la tabla 1. Estas propiedades

permiten establecer comparaciones respecto aceites más conocidos y explotados en el mercado. Tabla 1. Parámetros de calidad determinados para el aceite de semilla de Moringa oleífera comparados con el aceite de oliva (Rodríguez et al., 2012). Aceite de moringa

Aceite de oliva

Densidad (g/cm3)

0,908

0,910

Índice de iodo (g/g)*

65,58

65,74

Índice de rancidez (meq kg-1)

1,97

≤1,5

Ácidos grasos libres (%)

0,5

≤1,0

Propiedad determinada

* Índice de iodo se expresa en gramos de iodo por 100 g de muestra

El contenido de ácido oleico de un 68,9% indica que los aceites de esta planta, tienen el mismo nivel de calidad que los de oliva, por lo que podrían tener el mismo valor de mercado. Este ácido graso es más resistente a la oxidación que el linoleico, por eso, su adición a otros aceites permite obtener mezclas de elevadas propiedades nutricionales (Folkard & Sutherland, 1998; García-Fayos et al., 2012).

Figura 1. Usos de la Moringa oleífera (Toral, 2013). Caracterización de aceites de las semillas de Moringa oleífera 107

El aceite de Moringa conocido como aceite de Ben o de Behen en Madagascar, se emplea para calmar y suavizar la piel de los bebés. Algunas empresas cosméticas incluyen este activo en la formulación de leches y tónicos limpiadores que reivindican una acción purificante o desintoxicante. Pueden ser usados además, en terapias antioxidantes para disminuir la genotoxicidad del arsénico y otros metales pesados, cuyos mecanismos de acción carcinogénica están relacionados con especies reactivas de oxígeno. En la industria farmacéutica el aceite es utilizado como adyuvante de principios activos, además como emoliente y saborizante; su consumo se ha incrementado paulatinamente viéndose reflejada su aceptación a través del aumento en las exportaciones hacia Europa como lubricantes de maquinaria y en la cosmética (Rodríguez et al., 2012; Compaoré et al., 2010; Arenales, 1991). Los resultados derivados de la química y la farmacología asociadas a sus atributos terapéuticos, continúan siendo recientes y en desarrollo. Aunque muchos de sus beneficios han sido comprobados mediante rigurosas investigaciones en modernos laboratorios, no existen caracterizaciones que permitan determinar si el mecanismo de extracción influye en la composición y en el porcentaje de extracción de los aceites (García et al., 2013). Este trabajo consistió en determinar el efecto de diferentes métodos de extracción sobre el porcentaje de extracción y la composición de ácidos grasos presentes en los aceites de las semillas de Moringa oleífera de las variedades Supergenius, Plain y Nicaragua.

Materiales y métodos Las semillas de variedades Plain, Supergenious y Nicaragua de Moringa oleífera empleadas en el estudio, fueron cultivadas y cosechadas en el Centro Internacional de Salud “Las Praderas”, La Habana, Cuba. Además se incluyó en el análisis, el aceite de la variedad Nicaragua, obtenido a partir de la extracción mecánica por prensado en frio, procedente de una cooperativa agropecuaria vinculada al proceso investigativo. El diseño experimental propuesto fue de multinivel factorial , donde k= 3, teniendo en cuenta tres factores a dos niveles. Los factores considerados fueron el tipo de disolvente, tiempo de extracción y el tamaño de partícula. Los niveles de estudios para el tiempo de extracción son de 4 y 6 horas. Los disolventes a utilizar son el hexano y el etanol y los niveles relacionados con el tamaño de partícula son mayor de un mm y menor que un mm– mayor que 0,315 mm obteniéndose dos tamaños de partículas diferentes. En todos los casos la variable dependiente será el porcentaje de extracción de aceite. Para todas las corridas experimentales se realiza una réplica y este procedimiento se realiza para cada especie de semilla a analizar. 108

Para el procesamiento de los resultados se empleó el programa auxiliar estadístico Statgraphics Centurión, versión XV. Algunos de los parámetros de calidad que permiten caracterizar los aceites, tales como índices de refracción, saponificación, acidez, densidad y pH, fueron determinados a partir métodos fisicoquímicos en aquellas condiciones donde se obtuvieron mayores porcentajes de extracción. La composición de los aceites (n= 3 por lote), se realizó por cromatografía de gases (CG) con un equipo 7890A acoplado a sistema de cómputo, con detector FID (Agilent, EE. UU.). Se empleó el nitrógeno como gas portador. Los ácidos grasos totales se determinaron como ésteres metílicos por el método del Institute for Nutraceutical Advancement (INA) de los EE. UU. con ligeras modificaciones. Se empleó ácido tridecanoico como patrón interno (10 mg por muestra). Para los análisis se utilizó una columna BP 21 (30m x 0,25mm x 0,25µm) en las condiciones siguientes: la corrida cromatográfica se realizó durante 30 min y comenzó con una temperatura de 70 °C que fue aumentando a razón de 10 °C por min hasta 200 °C. Transcurrido cinco minutos, se incrementó la temperatura hasta 220 °C de la misma manera (10 °C por min) que se mantuvo 30 min. Las temperaturas del detector y el inyector fueron 250 y 260 °C, respectivamente. El flujo del gas portador fue 5,4mL/min y el volumen de inyección de cada muestra fue 0,1μL. Los análisis se realizaron por triplicado con ácidos grasos (AG) como referencia (Supelco37 components FAME mixture Catalog No: 47885-U y Lipid standard Catalog No189-4, 189-6, Sigma, EE. UU.). Las identificaciones se realizaron por comparación con las retenciones relativas de referencias de AG comerciales, y las estructuras fueron corroboradas por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa (CG-MS), según trabajos previos con aceites de otras especies. (Muñoz et al., 2005; Abdulkarim et al., 2005)

Resultados y discusión En la figura 2 se muestra el comportamiento de las interacciones entre las variables: tipo de disolvente, granulometría y el tiempo de extracción a través del programa auxiliar estadístico Statgraphics Centurión, versión XV. El P-Valor obtenido es menor que 0,05 con nivel de confianza de 95%. Los factores tiempo de extracción, tipo de solvente inciden de manera positiva sobre la variable respuesta, mientras que la transferencia se vio favorecida con la particulas de mayor tamaño, debido a que a pesar de que la homogeneidad y un menor tamaño de partícula garantizan que durante el proceso de extracción el área de contacto entre estas y el disolvente sea mayor, favoreciéndose la penetración del disolvente en la estructura y la operación de trans-

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 106-111

Figura 2. Influencia de las diferentes variables y de las interacciones entre ellas sobre el porcentaje de extracción del aceite se semillas de Moringa oléifera: 1-solvente, 2- granulometría, 3- tiempo de extracción. (A: Supergenious; B: Plain; C: Nicaragua)

ferencia de masa, tamaños excesivamente pequeños pueden hacer que las partículas se compacten dificultando la extracción. El programa evidencia que las interacciones entre ellas no influyeron en la variable en estudio.

Los valores obtenidos de densidad fueron similares a los reportado en la literatura (0,8968 g/m3). En el caso del índice de refracción, el comportamiento fue similar, siendo semejantes a los valores obtenidos por otros autores (1,4703) (García et al., 2013).

Los mejores resultados se obtuvieron con el hexano, mostrando un incremento en la concentración del aceite en el licor lixiviado y mayor porcentaje de extracción. Esto se debe, a que el aceite vegetal extraído está compuesto por moléculas con enlaces apolares lo que coincide con la polaridad del hexano, esto no se logra con el etanol.

Otros estudios muestran un rendimiento de 25 a 30%, densidad de 0,899 a 0,912 g/mL, índice de refracción 1,465 como los determinados por Cáceres, (1993). El valor obtenido de pH entre 4,7-5,38 muestra aceites con ligeras características ácidas. Los valores determinados de la variedad Nicaragua por diferentes métodos de extracción presentaron pequeñas diferencias.

La extracción de aceite de las semillas de Moringa oleífera de las variedades analizadas, tuvo un rendimiento promedio de un 42% con el hexano como disolvente.

La extracción por prensado proporcionó mayor porcentaje de extracción respecto al método sólido-líquido, resultando más económico, menos engorroso y no requiere de maquinaria de tecnología sofisticada. El tiempo de extracción es mucho menor y el producto obtenido esta menos expuesto a los reactivos que pudieran modificarlo estructuralmente.

La tabla 2 muestra los resultados de la caracterización fisicoquímica de los aceites correspondientes a los mayores valores de porcentaje de extracción y el aceite extraído por método de prensado mecánico.

Tabla 2. Propiedades fisicoquímicas determinadas en los aceites de semillas de Moringa según la variedad y condiciones de extracción. Supergenious

Plain

Nicaragua

Nicaragua (Extracción mecánica)

6(h)

15(min)

Disolvente

hexano

Hexano

hexano

Tamaño de partículas

≥ 1mm

Extracción de aceite (%)

39,8± 3,5

40,9± 3,0

45,04± 2,7

65,37± 3,4

1,403± 0,091

1,401±0,003

1,402±0,035

1,301±0,005

Índice de saponificación (mg de KOH/g de aceite)

170,59±1,7576

181,47±1,4706

161,68±1,7352

172,22±1,7382

Índice de refracción

1,4614± 0,002

1,4625± 0,002

1,4586± 0,002

1, 4665± 0,003

4,71

5,38

5,29

4,83

0,885±0,063

0,8788±0,061

0,8593±0,056

0,8852±0,048

Propiedades Tiempo de extracción

Índice de acidez (mg de HCl/g de aceite)

pH Densidad

(g/cm3)

Caracterización de aceites de las semillas de Moringa oleífera 109

Tabla 3. Composición porcentual de la semilla de Moringa oléifera determinada por cromatografía gaseosa. Plain

Supergenious

Nicaragua

Nicaragua Extracción mecánica

C 14:0 (mirístico)

0,11

0,07

0,08

C 16:0 (palmítico)

7,66

5,00

5,31

5,43

C16:1 (palmitoleico)

1,56

1,12

1,14

1,16

C18:0 (esteárico)

7,06

4,60

4,68

4,32

C18:1 (oleico)

65,38

64,30

65,14

65,27

C18:2 (linoleico)

2,12

4,91

4,73

4,82

C18:3 (linolénico)

0,47

0,58

0,49

0,54

C20:0 (araquídico)

4,53

3,21

3,09

3,12

C20:1 (gondoico)

3,25

2,24

2,19

2,18

C22:0 (behénico)

6,31

6,06

6,10

0,89

0,99

0,91

0,94

Ácidos Grasos

C24:0 (lignocérico)

Los ácidos grasos de estos aceites fueron identificados y cuantificados obteniéndose la distribución que se muestra en la tabla 3.

que el método de extracción en nuestro estudio no constituyó un factor determinante en dicha variación.

Los resultados obtenidos muestran que el ácido oleico fue el componente mayoritario, seguido de los ácidos palmítico donde en la variedad Plain se obtuvo mayor valor. Estas cifras son similares a los reportadas por otros autores como Marrero et al., 2014.

Referencias bibliográficas Abdulkarim, S. M., Long, K., Lai, O. M., Muhammad, S. K. S., & Ghazali, H. M. (2005). Some physico-chemical properties of Moringa oleifera seed oil extracted using solvent and aqueous enzymatic methods. Food Chemistry, 93(2), 253-263.

El contenido de ácido oleico en las variedades fue de un 65,38; 64,30; 65,14 y 65,27 % confirmando que los extractos obtenidos, tienen similar composicion que los de oliva.

Alfaro, N. (2008). Rendimiento y uso potencial de Paraíso Blanco, Moringa oleífera Lam en la producción de alimentos de alto valor nutritivo para su utilización en comunidades de alta vulnerabilidad alimentario-nutricional de Guatemala. Proyecto FODECYT. Guatemala.

La variación que se aprecia puede deberse a las diferencias en especies, genética de la planta, su cultivo, clima, suelo, región, estado de maduración de los frutos,época de colecta y análisis. En la tabla 4 se muestran los resultados obtenidos por otros autores a variedades de diversas regiones.

Arenales, B. (1991). Efecto de las suspensiones de semillas de Moringa oleífera Lam. sobre la coagulación de aguas turbias naturales (Doctoral dissertation, Tesis de grado de licenciado de Químico biólogo, de la facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala).

La presencia de C18:3, perteneciente al grupo omega 3(Ω3), C18:2, grupo omega 6(Ω6) y C18:1, omega 9 (Ω9) en las estructuras de los aceites de moringa de las variedades analizadas, le confiere valor nutricional y calidad como suplemento. (Bressani, 2007)

Conclusiones

Bressani, R. (2007). Valor proteínico suplementario de la hoja de Moringa oleífera Lam al maíz, y al arroz. Ensayos preliminares. Centro de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Instituto de Investigaciones, Universidad del Valle de Guatemala. Informe no publicado. Cáceres, A. (1993). Actividad antiinflamatoria de plantas medicinales de uso popular en Guatemala (I). Universidad de San Carlos de Guatemala.

La extracción por el método de prensado mecánica resulta más económico, y con mayores porcentajes de extracción, constituyendo esta, la mejor variante para futuros procesos en la industria biofarmacéutica.

Compaoré, W. R., Nikièma, P. A., Bassolé, H. I. N., Savadogo, A., & Mouecoucou, J. (2011). Chemical composition and antioxidative properties of seeds of Moringa oleifera and pulps of Parkia biglobosa and Adansonia digitata commonly used in food fortification in Burkina Faso. Current Research Journal of Biological Sciences, 3(1), 64-72.

El análisis cromatográfico a los aceites permitió corroborar que existen diferencias respecto a la composición de ácidos grasos esenciales entre las especies y

Foidl, N., Mayorga, L., Vasquez, W., Murqueitio, E., Osorio, H., Sanchez, M. D., & Speedy, A. (1999). Utilizacion del marango (Moringa oleifera) como forraje fresco para ganado. 1. Conferencia

110

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 106-111

Tabla 4. Composición porcentual determinada por otros autores en el aceite de la semilla de Moringa oléifera (Marrero et al., 2014). Ácidos Grasos

Bukina Faso

Malasia

India

Kenya

Cuba

Pakistán

Malawi

C 14:0

0,10

0,13

0,11

C 16:0

5,57

7,80

6,46

6,06

7,10

6,45

5,83

C16:1

1,28

2,20

1,36

1,57

1,04

0,97

1,16

C17:0

0,10

0,08

0,09

C18:0

3,84

7,60

5,88

4,14

4,80

5,50

6,20

C18:1

72,40

67,90

71,20

73,60

73,71

73,22

71,75

C18:2

0,95

1,10

0,65

0,73

0,31

1,27

0,75

C18:3

0,45

0,20

0,18

0,22

0,30

0,22

C20:0

3,40

4,00

3,62

2,76

4,08

4,00

C20:1

2,70

1,50

2,22

2,40

1,68

2,75

C22:0

6,95

6,20

6,41

6,73

5,43

6,16

7,20

C22:1

0,14

0,12

0,14

-0,12

C24:0

1,58

1,30

1,08

0,31

Electrónica Sobre Agroforesteria para la Producción Animal en América Latina. Agroforesteria para la Producción Animal en América Latina: Memorias. FAO, Roma (Italia). Folkard, G., & Sutherland, J. (1998). Moringa oleifera un árbol con enormes potencialidades. García-Fayos, B., Arnal, J. M., Verdú, G., & Sauri, A. (2010). Study of Moringa oleifera oil extraction and its influence in primary coagulant activity for drinking water treatment. In International conference on food innovation. García Torres, A. G., Martínez Cubias, R. K. M., & Rodríguez Díaz, I. A. (2013). Evaluación de los usos potenciales del Teberinto (Moringa oleífera) como generador de materia prima para la industria química (Doctoral dissertation, Universidad de El Salvador). Institute for Nutraceutical Advancement (INA). Method 108.003. Fatty Acid Content in Saw Palmetto by GC. Disponible en: URL http://www.nsf.org/busines/ina/fattyacids.asp. [Consultado: 15 de junio de 2015] Marrero Delange, D., Murillo, R. V., González Canavaciolo, V. L., & Gutiérrez Amaro, J. (2014). Composición de ácidos grasos del aceite de las semillas de Moringa oleífera que crece en La

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Caracterización de aceites de las semillas de Moringa oleífera 111

ARTÍCULO CORTO

Anatomía comparada de plantas de Dioscorea alata L. clon Caraqueño cultivadas en tres ambientes de crecimiento in vitro Compared anatomy of Dioscorea alata L. clone Caraqueño plants cultivated in three in vitro growth environments Misterbino Borges García*, Bernard Malaurie**, Silvio Meneses Rodríguez***, Rafael Gómez Kosky****, Marc Lartaud*****, Jean-Luc Verdeil****** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61528

Resumen La conservación in vitro de Dioscorea alata L. clon Caraqueño es fundamental para garantizar la propagación y distribución de material de plantación sano a los productores, y disponer de un banco in vitro de un clon de gran valor agronómico y comercial en la región oriental de Cuba. Con el fin de evaluar las modificaciones anatómicas que se producen en plantas de ñame en tres condiciones de cultivo in vitro: plantas conservadas por métodos de mínimo crecimiento, plantas regeneradas y plantas en fase de multiplicación en el medio MS 75 %, se realizó un análisis de la anatomía foliar y caulinar a partir de cortes transversales de la lámina foliar y del tallo, y cortes longitudinales y transversales de microtubérculos formados durante el proceso de conservación. Las hojas de las plantas conservadas mostraron menor espesor del mesófilo y la epidermis y el área de los haces conductores del tallo también fue menor, debido al proceso de stress durante la conservación in vitro. Sin embargo, durante la recuperación del material conservado a través de la regeneración y la multiplicación in vitro se restablecieron de manera normal estos parámetros. También se evidenció que los microtubérculos formados en la conservación in vitro, poseen parénquima amilífero con abundantes gránulos de almidón, capa delgada de parénquima cortical, y haces conductores poco desarrollados, todo lo cual indica la presencia de actividad meristemática. Palabras clave: caracterización anatómica, conservación in vitro, microtubérculos, ñame, segmentos nodales

Abstract The in vitro conservation of Dioscorea alata L. clone Caraqueño is fundamental to guarantee the propagation and distribution of healthy plantation material to the farmers and the establishment of one in vitro bank of this clone of great agronomic and commercial value in the Oriental Region of Cuba. With the purpose of evaluating the anatomical modifications that take place in yam plants under three in vitro culture conditions: conserved plants by slow growth, regenerated plants and in plants multiplication phase in MS 75% medium, was carried out an analysis of the foliar and caulinar anatomy from transversal cuts of the foliar sheet and of the stem, and longitudinal and transversal cuts of microtubers formed during the conservation process. Smaller thickness of the mesophyll and of the epidermis in the leaves of the conserved plants were showed and the conductive sheaves area of the stem were also smaller, due to the stress process during the in vitro conservation. However during the recovery of the conserved material through the regeneration and the in vitro multiplication were reestablished to their normal state these parameters. It was also evidenced that the microtubers formed in the in vitro conservation, have reserve parenchyma with abundant starch granules, thin cortical *

Doctor en Ciencias Biológicas . Profesor Titular. Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad de Granma. Carretera Bayamo-Manzanillo Km 17, Apdo 21, Bayamo 85 100, Granma, Cuba (Email:mborgesg@udg.co.cu.) ** Doctor en Ciencias Biológicas . Investigador Titular. IRD, Palm Development Group, UMR DIADE, 34394 Montpellier Cedex 5, France *** Doctor en Ciencias Biológicas . Profesor Titular. Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad de Granma. Carretera Bayamo-Manzanillo Km 17, Apdo 21, Bayamo 85 100, Granma, Cuba **** Doctor en Ciencias Agrícolas. Profesor Titular. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5. Santa Clara. Villa Clara.Cuba. ***** Especialista principal histología. CIRAD, UMR AGAP,34398 Montpellier, France ****** Doctor en Ciencias Biológicas . Investigador Titular. CIRAD, UMR AGAP,34398 Montpellier, France

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parenchyma and conductive sheaves little developed were determined. All this characteristics indicated the presence of meristematic activity. Key words: Anatomical characterization, In vitro conservation, In vitro tubers, Nodal cutting, Yam Recibido: enero 10 de 2016

Aprobado: noviembre 17 de 2016

Introducción La producción de ñame posee como principales inconvenientes la escasez de semilla sana libre de plagas y enfermedades, y su plantación en suelos de baja fertilidad, aspectos que provocan una pérdida de hasta un 90% de los rendimientos de este cultivo (Balogun et al., 2014). La conservación de ñame mediante el empleo de segmentos nodales fue abordada por primera vez en el Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA) de Nigeria (Ng & Hahn, 1985) a las temperaturas de 18-22 °C con una frecuencia de subcultivos de 1,5 a 2 años. Ng (1996) citado por Malaurie et al. (2001), reportó una collección de 1700 accesiones, pertenecientes a 7 especies. Hanson (1986) señaló los métodos de almacenamiento de las colecciones de las plantas tuberosas y en particular de las colecciones in vivo (bancos de germoplasma en campo) e in vitro (corto, mediano y largo plazo) del ñame en el mundo. Malaurie et al. (1993), fueron los primeros en evaluar el establecimiento y mantenimiento de una colección in vitro de ñame, en las condiciones de crecimiento mínimo, mediante el cultivo de segmentos nodales en un medio con 2 g L-1 de carbón activado y una baja concentración en elementos minerales y sacarosa. Estos autores señalaron como principales inconvenientes de ese método la necesidad de realizar frecuentes subcultivos lo que aumenta el costo de conservación, posibles errores de identificación, la contaminación microbiana y la necesidad de instalaciones con mano de obra especializada. Mantell (1993), logró la conservación in vitro exitosa por mínimo crecimiento durante 9 meses con altos porcentajes de supervivencia (95%), los menores porcentajes de senescencia foliar (10%) y 96% de regeneración en plantas completas con un crecimiento normal en condiciones de micropropagación, de los principales cultivares de las zonas del Caribe, Pacífico y Oeste de África, para las especies de D. alata, D. bulbifera, D. cayenensis, D. esculenta, D. rotundata y D. trifida. En Cuba a partir de 1990, dada la necesidad de incrementar el material de plantación de ñame de buena calidad, se comenzó a desarrollar la propagación in vitro de los principales clones comerciales de D. alata, mediante la utilización de segmentos nodales (Borges et al., 2011).

Borges et al. (2003), evaluaron la conservación por crecimiento mínimo durante 9 meses de algunos clones del germoplasma de D. alata en Cuba en un medio de cultivo complementado con carbón activado (0; 2 g L-1), manitol y BAP a diferentes concentraciones, pero no definieron las concentraciones más adecuadas de estas dos últimas sustancias. Esto fue logrado posteriormente por Borges et al. (2009), quienes demostraron que las variantes de cultivo formadas por el medio MS al 75% + vitaminas MS + sacarosa 30 g.L-1 + carbón activado 2 g.L-1 y el MS al 75% + vitaminas MS + sacarosa 30 g.L-1 + carbón activado 2 g.L-1 + BAP 0,1 mg.L-1 permitió de manera efectiva la conservación de plantas in vitro a partir de segmentos uninodales de D. alata durante 9 y 12 meses con altos porcentajes de supervivencia, un número significativo de microtubérculos, los menores porcentajes de senescencia foliar y 100% de regeneración en plantas completas con un crecimiento normal en condiciones de micropropagación. Borges (2011) determinó la conservación in vitro efectiva a partir de segmentos uninodales de D. alata clon Caraqueño en el medio de cultivo compuesto por sales MS (75%), sacarosa 30 g.l-1 y carbón activado 2,0 g.l-1, durante 12 meses, con el mayor porcentaje de supervivencia (97%) y número de microtubérculos (1.5), menor porcentaje de senescencia foliar (19,5%) y 100% de regeneración en plantas completas, sin diferencias morfológicas con el control in vitro sin conservar. Sin embargo, se debe profundizar a nivel celular y de tejidos en el proceso de conservación in vitro del material vegetal. Es por ello, que ha sido necesario continuar trabajando en la obtención de una metodología eficiente y segura de preservación de los recursos genéticos de esta especie, para garantizar la propagación y distribución de material de plantación sano a los productores, y disponer de un banco in vitro para el intercambio de germoplasma e iniciar futuros programas de mejoramiento genético necesarios para diversificar y potenciar este cultivo a partir de una validación de la metodología de conservación in vitro no solo desde el punto de vista morfoagronómico y molecular, sino también histológico, en un clon de gran importancia económica en Cuba (Borges et al., 2015) y donde no se dispone hasta la fecha de antecedentes de cómo se afecta la anatomía de las plantas in vitro durante el proceso de conservación por mínimo crecimiento, aspecto novedoso que ofrece la presente investigación.

Anatomía de plantas de Dioscorea alata L. en condiciones in vitro 113

Tomando en consideración lo antes expuesto, el objetivo de esta investigación fue estudiar la anatomía de plantas de ñame bajo tres condiciones de cultivo in vitro: conservación por mínimo crecimiento, regeneración y multiplicación, a fin de determinar las características anatómicas que pudiesen afectar el establecimiento a las condiciones convencionales de micropropagación.

Materiales y métodos La investigación fue desarrollada en el Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas en la Universidad de Granma, Bayamo, Cuba en colaboración con los Centros IRD/CIRAD de Montpellier, Francia.

Técnicas y procedimientos generales Material vegetal. Se emplearon hojas y tallos provenientes de: 1) plantas in vitro de Dioscorea alata L clon Caraqueño conservadas durante 12 meses (medio MS 75% + vitaminas MS + sacarosa 30 g.L-1 + carbón activado 2 g. L-1); 2) plantas in vitro en fase de multiplicación (regeneradas a los 56 días) (medio MS 75% + vitaminas MS + sacarosa 30 g.L-1 + cisteína 10 m g. L-1) procedentes del material conservado durante 12 meses y 3) plantas in vitro en fase de multiplicación a los 35 días (medio MS 75% + vitaminas MS + sacarosa 30 g.L-1 + cisteína 10 m g.L-1). También se utilizó los microtubérculos formados por las plantas in vitro conservadas durante 12 de meses (1.5 microtuberculos por planta).

Análisis histológico Los análisis histológicos se realizaron en cortes transversales de hojas y tallos de plantas in vitro conservadas, plantas in vitro regeneradas y plantas in vitro en fase de multiplicación. También se analizaron los cortes longitudinales y transversales de los microtubérculos formados por las plantas in vitro conservadas. Las muestras fueron fijadas en 20 ml de una solución compuesta por 50% etanol, 10% formaldehído y ácido glacial acético (18:1:1) durante 72 horas. La deshidratación de las mismas se realizó mediante la inmersión en baños sucesivos de etanol (30, 50, 60, 70, 80, 90, 95 y 100%) en un equipo Histo-TEK. Luego se efectuó la impregnación de las muestras en resina Technovit 7100 (Heraeus Kluzer GmbH, Germany) (1g de kit de resina pura en 100 ml de solución de impregnación) y su inclusión en una solución compuesta por 1ml de endurecedor con 15 ml de medio de impregnación, se añadió a las placas histológicas, una vez realizada la orientación de las muestras, se dejó polimerizar una noche a temperatura ambiente en el flujo laminar vertical. 114

Posteriormente se insertó un cilindro con cola sobre el cual polimerizó el medio de inclusión (Technovit 3040; 2:1 polvo-liquido) y se dejó secar 24 horas hasta separar los bloques con las muestras incluidas en la resina. Los cortes fueron realizados con la ayuda de un microtomo (Historange, LKB), equipado de cuchillas Histoknife Kulzer, que permitieron la obtención de cortes muy finos de 3 µm de espesor, los cuales fueron depositados en un recipiente conteniendo agua. Posteriormente, fueron recuperados con una pinza para ser transferidos a un portaobjeto y secados sobre una placa caliente a temperatura de 50°C, durante 10 minutos. Finalmente, a los cortes histológicos se les realizó una doble coloración con el ácido periódico-reactivo de SCHIFF (evidencia las reservas glucídicas) y el Naphthol Blue Black (indica las reservas proteicas) según Buffard-Morel et al. (1992), y el montaje en Bálsamo de Canadá. Las láminas preparadas fueron observadas bajo el microscópio óptico (Zeiss Imager A.1 microscope, Germany) acoplado a computadora (Pentium Dell). Para el análisis cuantitativo (a partir de la toma de imágenes) se determinaron las siguientes evaluaciones: en la hoja, espesor epidermis superior e inferior (µm), espesor del mesófilo (µm), espesor lámina foliar (µm), tamaño células epidermis superior e inferior (µm); en el tallo, área de los haces conductores (µm2); en el tubérculo, número de gránulos de almidón por célula y área de los mismos (µm2). Las mediciones fueron realizadas mediante la utilización del software Imagen J versión 1.41h. (Sheffield, 2008). El análisis cualitativo se realizó mediante la observación directa en la computadora de las imágenes tomadas de los diferentes cortes observados bajo el microscópio óptico, en las cuales se determinaron las principales características: forma de los gránulos de almidón; presencia, forma y tipos de células y tejidos de diversos órganos, así como espacios intercelulares.

Análisis estadístico Se realizó un análisis de varianza de clasificación simple a los datos del análisis histológico cuantitativo de los cortes transversales de hojas y tallos. Se aplicó la prueba de comparación múltiple de medias de Tukey al 5 % de probabilidad del error. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statistica para WINDOWS, versión 10.0 (StatSoft, 2011).

Resultados y discusión Análisis histológico de hojas y tallos El análisis histológico cuantitativo foliar y del área de los haces conductores del tallo de plantas in vitro conservadas, plantas in vitro regeneradas y plantas in vitro

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en fase de multiplicación se presentan en la tabla 1. Los mayores valores significativos para los distintos parámetros evaluados referidos al espesor de epidermis superior e inferior, del mesófilo, la lámina foliar, el tamaño promedio de las células de la epidermis superior e inferior y el área de los haces conductores correspondieron para las plantas in vitro regeneradas y plantas in vitro en fase de multiplicación. En la figura 1 se ilustran los resultados del análisis histológico cualitativo realizado al tejido foliar y del tallo de plantas conservadas in vitro durante 12 meses y en fase de multiplicación (los resultados de las plantas in vitro regeneradas no se muestran ya que son semejantes a los de las plantas in vitro en fase de multiplicación). Se evidencia un menor tamaño de las células y tejidos de los órganos vegetativos analizados, del contenido de pigmentos fotosintéticos del mesófilo de la hoja y un pobre desarrollo de los vasos conductores del tallo en la plantas in vitro conservadas. En este sentido Espiand (1983), al analizar desde el punto de vista histológico las consecuencias del cultivo in vitro sobre la morfogénesis de plantas in vitro de D. alata cv. Tahíti obtenidas a partir de segmentos nodales cultivados a los 35 días en el medio MS en condiciones normales de micropropagación (Mantell et al.,1978), determinó en el corte transversal del tallo estructuras anatómicas comparables a las descritas para este órgano en esta investigación. Para las características anatómicas de las plantas in vitro conservadas y regeneradas, no fue posible realizar comparación con otros autores, pues no existe información hasta la fecha al respecto en la literatura, lo que destaca el aporte novedoso de la investigación. Finalmente, los resultados del análisis histológico tanto cuantitativos como cualitativos de hojas y tallos, demostraron claramente una disminución significativa del crecimiento de las células y tejidos de las plantas in vitro durante el proceso de conservación hasta los 12 meses de cultivo, atribuible al estrés producido du-

rante la conservación, fundamentalmente a causa de la disminución de la absorción de agua y nutrientes a nivel celular y tisular (Roca et al., 1991). La presente investigación demostró además que una vez que desaparece este estrés, las plantas in vitro regeneradas del material proveniente de la conservación durante 12 meses recuperan su capacidad normal de crecimiento y multiplicación, aspecto esencial que constituye un aporte novedoso desde el punto de vista histológico en favor del protocolo de conservación obtenido para D. alata L clon Caraqueño, el cual desde el punto de vista morfoagronómico y molecular ya ha sido validado por Borges (2011).

Análisis histológico de microtubérculos El análisis histológico cuantitativo de los microtubérculos formados en la conservación in vitro durante 12 meses arrojó un número de gránulos de almidón por célula de 9 con un área de 193,2 µm2 , mientras que las características cualitativas (figura 2) de la sección transversal muestran que la mayor parte de los microtubérculos está formado por parénquima amilífero con abundantes gránulos de almidón de forma esférica, una delgada capa de parénquima cortical, fina zona suberosa y haces conductores poco desarrollados que poseen cambium extrafasicular que constituye un tejido meristemático secundario producto de una desdiferenciación todo lo cual indica la presencia de actividad regenerativa meristemática. Estos resultados concuerdan con los estudios histológicos realizados en tubérculos in vitro de D. alata (Espiand, 1983), en los cuales se ha demostrado una estructura integrada por un parénquima fundamental amiláceo, un cambium extrafasicular, un parénquima cortical y una delgada zona suberosa. Esta estructura, revela la alta capacidad de reserva energética y regenerativa de estos órganos, lo cual ofrece la posibilidad

Tabla 1. Análisis cuantitativo foliar y del área de los haces conductores del tallo en plantas in vitro de D. alata clon Caraqueño conservadas, regeneradas y en fase de multiplicación.

Espesor epidermis superior (µm)

Espesor epidermis inferior (µm)

Espesor del mesófilo (µm)

Espesor lamina foliar (µm)

Tamaño células epidermis superior (µm)

Tamaño células epidermis inferior (µm)

Área de los haces conductores (µm2)

30,5 b

22,1 b

105,8 b

157.9 b

21b

12 b

2426 b

43,2 a

31,4 a

131,3 a

204,5 a

41 a

19 a

3150 a

42,75 a

32,7 a

130,9 a

206.3 a

40 a

20 a

3100 a

0,8

0,25

0,70

1,8

0,30

0,20

94,0

1, plantas in vitro conservadas durante 12 meses; 2, plantas in vitro regeneradas a los 56 días procedentes del material conservado; 3, plantas in vitro en fase de multiplicación a los 35 días. Medias con letras distintas por columnas difieren significativamente para p< 0,05 según prueba de comparación múltiple de medias de Tukey. EE, error estándar.

Anatomía de plantas de Dioscorea alata L. en condiciones in vitro 115

Figura 1. Corte transversal de hojas (H) y tallos (T) de plantas in vitro conservadas durante 12 meses (CI) y en fase de multiplicación (Mu). ES, epidermis superior; EI, epidermis inferior; M, mesófilo; E, epidermis; PC, parénquima cortical; ECL, esclerénquima; VC, vasos conductores; PM, parénquima medular.

adicional del uso de los microtubérculos como una vía fundamental para potenciar la propagación de este cultivo. En este sentido Ondo Ovono et al. (2009), plantearon que en muchas especies de Dioscoreas cultivadas in vitro a partir de segmentos nodales son capaces de producir microtubérculos bajo ciertas condiciones, los cuales constituyen un gran potencial para la multiplicación rápida de material clonal libre de patógenos, mientras que, Balogun & Gueye (2013) y Rodríguez et al. (2015), declararon que la formación de microtubérculos constituye una de las formas más importantes de micropropagación vía organogénica del cultivo del ñame. Por otra parte, Cabrera (2010), demostró las potencialidades de los microtuberculos de D. alata en sistemas de propagación directa en campo con altos porcenta116

jes de supervivencia y rendimientos mayores que con el material de propagación convencional. En la revisión realizada no se apreciaron estudios similares en la caracterización histológica de materiales de Dioscorea spp. conservados in vitro.

Conclusiones Las hojas de las plantas conservadas mostraron de manera significativa menor espesor del mesófilo y de la epidermis y el área de los haces conductores del tallo también fue menor, debido al stress de las plantas durante el proceso de conservación in vitro. Sin embargo, durante la recuperación del material conservado a través de la regeneración y la multiplicación in vitro se restablecieron de manera normal estos parámetros.

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Figura 2. Corte longitudinal (LT) y transversal (TT) de microtubérculos formados durante la conservación in vitro durante 12 meses. ZS, zona suberosa; PC, parénquima cortical; VC, vasos conductores; PMA, parénquima medular amilífero; GA, gránulos de almidón.

Los microtubérculos formados en la conservación in vitro durante 12 meses, poseen principalmente un parénquima amilífero con abundantes gránulos de almidón de forma esférica, una delgada capa de parénquima cortical, fina zona suberosa y vasos conductores poco desarrollados todo lo cual indica la presencia de actividad meristemática.

Agradecimientos Esta investigación fue ejecutada exitosamente gracias a la cooperación bilateral universitaria Cuba-Francia y el apoyo incondicional de los equipos de investigación IRD/CIRAD/UM II de Montpellier, Francia y CEBVEG de la Universidad de Granma, Cuba. A todos mis más sinceros agradecimientos.

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Anatomía de plantas de Dioscorea alata L. en condiciones in vitro 117

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ARTÍCULO DE REVISIÓN

Principales promotores utilizados en la transformación genética de plantas Main promoters used in plant genetic transformation Zoraya M De Guglielmo C*, Rafael Fernandez Da Silva** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61529

Resumen El conocimiento pleno de los promotores determina el éxito en la obtención de nuevos cultivares de plantas a través de técnicas biotecnológicas, ya que dicha secuencia del ADN regula la transcripción de otras regiones adyacentes o cercanas, encontrándose los siguientes promotores: constitutivos, tejido-específicos o estadio-específicos, inducibles y sintéticos. En esta revisión se resume de manera precisa los conceptos, ventajas y limitaciones de los distintos tipos de promotores, con ejemplos claros de ello. Palabras clave: promotor, biotecnología vegetal, transcripción genética.

Abstract Full knowledge of promoters determines success in obtaining new plant cultivars through biotechnology techniques. This DNA sequence regulates the transcription of adjacent or nearby regions, which are mainly constitutive, tissue-specific or stage-specific, inducible and synthetic. This review summarizes the precise concepts, advantages and limitations of different types of promoters, including clear examples of them. Key words: promoter, plant biotechnology, gene transcription. Recibido: febrero 10 de 2016

Aprobado: octubre 3 de 2016

Introducción El desarrollo de nuevos cultivares que satisfagan las crecientes y diversas necesidades agroalimentarias y médico-farmacéuticas e industriales se fundamenta en la aplicación de técnicas biotecnológicas de avanzada, en particular la optimización de sistemas eficientes de transformación genética, donde la inserción de diferentes secuencias génicas de interés juega un papel preponderante. La expresión estable de dichos noveles genes en las plantas está determinado esencialmente por las secuencias promotoras (Porto et al., 2014). En este sentido, en la regulación de la expresión genética intervienen “señales” que actúan sobre genes que codifican proteínas. Dentro de estas señales reguladoras, las llamadas moléculas cis-acting controlan la expresión de secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) físicamente adyacentes y funcionales, mientras que las trans-acting influyen en la expresión de genes * **

distantes, incluso ubicados en cromosomas diferentes. Dicha regulación depende en gran medida de elementos reguladores conocidos como promotores (Potenza et al., 2004).En los procedimientos de transformación genética vegetal es fundamental todo lo relacionado al control de expresión de transgenes en cultivos de importancia económica como el café (Fernández & Menéndez, 2002; Fernández et al., 2010), de allí la importancia de estudiar y conocer la disponibilidad y funcionamiento de los distintos tipos de promotores genéticos vegetales, incluyendo ventajas, desventajas y limitaciones, el cual es el objetivo de la presente revisión.

Concepto de promotor Se considera que los promotores son regiones reguladoras cis-acting que dirigen la transcripción de otras regiones adyacentes o cercanas al ácido ribonucleico

PhD. Ciencias. Lab. Genética Molecular-Instituto de Oncología y Hematología-MPPS, Caracas. zdegugli@gmail.com PhD. Ciencias. Centro de Biotecnología Aplicada (CBA), Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología-Universidad de Carabobo, rafaelfer2103@hotmail.com

Gene promoters in plantsVol. 119 Rev. Colomb. Biotecnol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 119-128 119

mensajero (ARNm), el cual es traducido en proteínas. Funcionalmente, un promotor es una secuencia de ADN localizada “upstream” o “aguas arriba” (hacia el extremo 5´ de la región codificante de un gen) que incluye las regiones de enlazamiento para factores de transcripción (Potenza et al., 2004). Generalmente se asume que las secuencias promotoras se enlazan a la enzima ARN Polimerasa II, encargada de la producción del ARN. Sin embargo, existen secuencias de ADN dentro de una región promotora que actúan como sitios de unión para factores de transcripción trans-acting que pueden activar o inhibir la transcripción de un gen. Así, un promotor incluye distintos elementos estructurales que pueden tener interacciones funcionales complejas (Rodríguez & Chamberlin, 1982; NEPAD, 2010). Los promotores en general se dividen en dos regiones: una región central o núcleo del promotor y regiones de regulación aguas arriba. El núcleo del promotor consiste en una secuencia de 50-100 pb adyacente al sitio de iniciación que interactúa con la maquinaria de transcripción y asegura su inicio por la ARN polimerasa II; posee una caja TATA o caja de “Hogness” (secuencia consenso de ADN, rica en adenina y timina) y/o un elemento iniciador que se enlaza a elementos “tras-acting” y también puede mediar el inicio de la transcripción en algunos promotores que no tienen caja TATA (Dutt et al., 2014). Así, las partes de un promotor son las siguientes (Dutt et al., 2014): 1) Promotor mínimo o núcleo del promotor: se localiza hasta 100 pares de bases “aguas arriba” y está constituido por la caja TATA(sitio de ensamblaje del complejo de iniciación por la ARN polimerasa II), 2) Secuencias reguladoras proximales(constituidas por las cajas CAAT y GC a las que se unen proteínas y factores de transcripción que facilitan el ensamblaje del complejo de iniciación) y 3) Secuencias reguladoras distales(se localizan a más de 100 pb “aguas arriba” del sitio de iniciación de la transcripción y regulan la actividad del núcleo del promotor) que son de dos tipos: a) Intensificadores o “enhancer”, secuencias de acción cis que potencian la tasa de transcripción de los promotores que se encuentran en la misma molécula, a los que se unen factores de transcripción activadores;

b) Silenciadores, inhibidores o “silencers”, secuencias de acción cis a las que se unen represores, inhibiendo a los activadores y reduciendo el nivel de transcripción (Rodríguez & Chamberlin, 1982).

Importancia del estudio de los promotores El interés en los promotores radica en el potencial que ofrecen para regular y controlar la expresión de genes de interés en organismos silvestres y en aquellos modificados genéticamente. Actualmente son muy estudiados en procesos biotecnológicos, ya que no solo pueden incrementar la actividad transcripcional sino también proporcionar niveles adicionales de control, por ej., a nivel de la expresión tejido o estadio-específica de un gen (CAMBIA, 2003).Distintos investigadores profundizan en el estudio de las regiones promotoras, sus componentes e interacciones, así como en la búsqueda de nuevos promotores vegetales que dirijan altos niveles de expresión transgénica estable y hagan posible la introducción de múltiples transgenes en células vegetales eliminando, al mismo tiempo, el riesgo de silenciamiento genético dependiente de homología (Xiao et al., 2005; Park et al., 2012). Este fenómeno se ha observado en numerosas plantas transgénicas y puede involucrar interacciones entre elementos repetitivos próximos ubicados en una molécula de ADN o secuencias homólogas en moléculas separadas, en posiciones alélicas o no alélicas (Jakowitsch et al., 1999).

Tipos de promotores Con base en el funcionamiento, tipo y nivel de expresión genética observado, los promotores usados en la Ingeniería Genética Vegetal se han clasificado en: constitutivos, tejido-específicos o estadio-específicos, inducibles y sintéticos. La escogencia del promotor usado en una construcción transgénica depende fundamentalmente de los objetivos del proyecto de ingeniería (Potenza et al., 2004; Porto et al., 2014).

1. Promotores constitutivos Inducen la expresión de genes ubicados “downstream” o “aguas abajo” en todos o, al menos, en la mayoría de los tejidos del organismo, independientemente de factores ambientales o del estadio de desarrollo. Justamente, la principal ventaja de estos promotores es que generalmente promueven altos niveles de expresión

Figura 1. Representación esquemática de las secuencias de un promotor.

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transgénica independiente del tejido o estadio, por lo que han sido ampliamente utilizados en la transformación de mono y dicotiledóneas, especialmente para la detección y/o selección de células o plantas transformadas (Park et al., 2010). Los primeros promotores constitutivos usados para regular la expresión transgénica en plantas fueron aislados de patógenos vegetales, como los promotores de Opinas y el promotor CaMV35S aislado a comienzo de los años 80 del virus del mosaico del coliflor y usado ampliamente en sistemas transgénicos. Uno de sus derivados, el promotor CaMV19S, ha sido usado con menos frecuencia a pesar de tener una alta funcionalidad (CAMBIA, 2003). Otros promotores de origen viral con actividad similar o mejor al CaMV35S incluyen el promotor del virus del mosaico de la yuca CsVMV, el del virus de la hoja del cestrum amarillo, el del virus rayado de banana BSV y el promotor FMV-35S (“Figwort Mosaic Virus”) de un virus de coliflor relacionado con el CaMV35S; cabe mencionar que estos dos promotores son ampliamente utilizados en pruebas para la detección molecular de organismos modificados genéticamente (Sangers et al., 1990; Schenk et al., 2001; Li et al., 2001; Dorries et al., 2010; Dutt et al., 2014). Aunque estos promotores dirigen altos niveles de expresión transgénica en dicotiledóneas, su efectividad en monocotiledóneas, especialmente en cereales, es considerablemente menor, particularmente a largo plazo (Dahleen et al., 2001; Dutt et al., 2014). Al respecto, en algunas monocotiledóneas, como cereales, se ha encontrado que secuencias presentes en el extremo 5´ de regiones transcritas no traducidas (intrones) de ciertos genes estructurales son esenciales para la eficiencia de la expresión genética. De esta manera, los promotores que funcionan bien en dicotiledóneas que carecen de tales intrones, generalmente no funcionan bien en monocotiledóneas (CAMBIA, 2003). Otras de las limitaciones de estos promotores es justamente el origen viral y la percepción del posible efecto negativo que pudiera implicar su uso en la transformación vegetal para la salud humana (Hull et al., 2000); algunos investigadores han señalado que el silenciamiento de los transgenes pudiera ser menor al usar promotores constitutivos de origen vegetal (Potenza et al., 2004).Así, la actividad de promotores derivados de monocotiledóneas es generalmente mayor o más eficiente en este grupo de plantas que en dicotiledóneas. Los más conocidos son los promotores de la Ubiquitina, proteína involucrada en diversos procesos celulares como la reparación del ADN y la estructura de la cromatina, y los promotores de actinas, componente fundamental del citoesqueleto vegetal. Destacan los promotores de Ubiquitina de maíz (Ubi 1 y Ubi 2), identificados por A. Christensen, R Sahrrock y P Quail en 1992 y de Nicotiana sylvestris (Ubi U4) donde se han identificado dos elementos de acción cis que parecen ser críticos para la expresión genética (Plesse et al., 2001).

El promotor de la actina de arroz (Act 1) fue identificado por Mc Elroy y colaboradores (1990) y es frecuentemente usado en sistemas de cereales; también se ha descrito el promotor Act 2 de Arabidopsis. Existen elementos de choque térmico de la región reguladora del promotor Ubi que incrementan la expresión de la proteína ubiquitina en respuesta a estrés térmico, lo que le da carácter inducible, mientras que Act 1, a pesar de tener expresión constitutiva, tiene mayor actividad en la raíz, lo que le confiere cierto carácter tejido-específico (Dahleen et al., 2001; Gupta et al., 2001; CAMBIA, 2003; Potenza et al., 2004). Sin embargo, para monocotiledóneas no cereales la efectividad del promotor CaMV35S incrementa considerablemente cuando se le emplea duplicado (Kanno et al., 2000). En este sentido, la duplicación de dicho promotor parece tener un efecto “enhancer” en la regulación de la expresión transgénica. A pesar de que el promotor CaMV35S es, al parecer, más fuerte que otros promotores constitutivos, los promotores Act 1 y Ubi 1 tienen la ventaja, desde el punto de vista de la bioseguridad, de ser de origen vegetal; algunos investigadores también han informadoque, si bien el número de transformantes iniciales obtenidos con el promotor CaMV35S es más elevado que con el Ubi 1 o el Act 1, con el primero pudiera ser igualmente mayor el eventual silenciamiento observado (Dahleen et al., 2001). A pesar de que los promotores constitutivos actúan en todos los tejidos, cada vez que se insertan genes regulados por este tipo de promotores se observan diferencias en cuanto a la especificidad para el tejido o el grado de expresión de los genes bajo su control. En consecuencia, aun cuando se activan los genes, no siempre se activan en el mismo grado en todos los tejidos en los distintos estadios de desarrollo (Rodríguez & Chamberlin, 1982). Por ej., el promotor ZmUbi 1 es ampliamente usado en cultivos de monocotiledóneas debido a que dirige altos niveles de expresión en la mayoría de los tejidos de plantas jóvenes, pero estos niveles disminuyen marcadamente a medida que los tejidos maduran (Cornejo et al., 1993). Así, el promotor se selecciona sobre la base de la especie vegetal, del gen que se quiere insertar y el tejido o la etapa del desarrollo en los cuales se va a expresar el gen, lo que a su vez se determina realizando pruebas donde varíen cada uno de los parámetros involucrados. Los promotores CaMV35S, Ubi y Act, han sido utilizados en distintos protocolos: Steinitz et al. (2002), transformaron algodón con el gen cryIA(c) (correspondiente a proteínas insecticidas de Bacillus Thuringiensis) bajo el control del promotor CaMV35S, al igual que Ahmad et al. (2002), en arroz. Leroy et al. (2000), trabajando en transformación de café utilizaron este mismo promotor duplicado, con lo cual demostraron un efecto “enhancer” o intensificador en la regulación de la expresión del gen csr1-1 aislado de Arabidopsis thaliana, el cual confiere resis-

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tencia al herbicida clorosulfurón, usado como marcador de selección. También usaron el promotor EF1α de A. thaliana, cuya eficiencia ya había sido probada por van Boxtel et al. (1995), junto con la secuencia “enhancer” o intensificadora Ω (secuencia líder no traducida en el extremo 5´del ARNm), derivada del virus del mosaico del tabaco. Sin embargo, la eficiencia de transformación fue mayor con el promotor CaMV35S. Este promotor también controló la expresión del gen reportero gus en la estandarización de los parámetros de transformación de café mediante biobalística (De Guglielmo et al., 2010). Sági et al. (1995), al transformar banano y plátano, estudiaron la regulación de varios promotores en la expresión del gen reportero gus, mediante ensayo histoquímico y fluorométrico. Los promotores utilizados fueron el CaMV35S duplicado, el Emu y el Ubi, de los cuales el último resultó ser más eficiente. Este promotor también ha sido asociado a altos niveles de expresión en otras monocotiledóneas tales como maíz, avena y caña de azúcar y, como ya se mencionó, tiene la ventaja sobre el CaMV35S de ser un promotor de origen vegetal. Sardana et al. (1996), usaron de manera efectiva el promotor Ubi 1 para lograr la expresión de toxinas cryIA en endospermo de maíz, como modelo de monocotiledóneas. Estos autores realizaron pruebas usando el promotor CaMV35S y obtuvieron mayor expresión con el primero que con el segundo, lo cual era de esperarse considerando que dicho promotor actuaba en su tejido materno. La expresión también fue mayor al utilizar toxinas sintéticas con mayor porcentaje G+C y de esta manera evidenciaron que la regulación de la expresión no sólo depende del promotor sino también de la especie vegetal y del contenido de pares de base de la secuencia de interés, lo que puede interferir en los fenómenos de homología. Esto también pudiera afectar la estabilidad de la secuencia de un ADN foráneo dado. Cheng et al. (1998), lograron la expresión de las mismas toxinas en arroz, usando tres promotores: CaMV35S (constitutivo), Ubi1 de maíz (constitutivo) y Bp10 de Brassica, específico para polen. Con el último la expresión fue tejido específica e inducible y en el caso de los dos primeros fue mayor con el CaMV35S, probablemente debido a la fuerza de este promotor. Chen et al. (1998), usaron con éxito este mismo promotor en arroz para regular la expresión de los genes hpt (de resistencia a la higromicina) y gus. Recientemente, el gen Ubi 1 fue usado exitosamente en la transformación de trigo mediante biobalística para liberar (E)-β -farnesene synthase (Eβ fS), la feromona de alarma para muchas plagas de áfidos, convirtiéndose en el primer cultivo vegetal manipulado genéticamente para expresar este tipo de enzimas como un mecanismo de defensa (Bruce et al., 2015). 122

Al-Kaff et al. (2000), colocaron el gen de la resistencia al herbicida bialaphos (bar) bajo el control del promotor CaMV35S. Los autores reportan que debido al origen viral del promotor, la infección por CaMV puede desestabilizar características genéticas comercialmente importantes en semillas de oleaginosas, a partir de la observación del silenciamiento del transgen bar, cambiando el fenotipo de la planta de resistente a susceptible al herbicida. Cho et al. (2001), utilizaron el promotor CaMV35S para transformar repollo chino con el gen cry1ac unido a la secuencia “enhancer” o intensificadora delta omega ∆Ω (secuencia omega modificada por ingeniería genética) del virus del mosaico del tabaco, con lo cual incrementaron la eficiencia de la transformación en comparación a lo reportado para el promotor sin “enhancer” o intensificador. Los vectores binarios pCAMBIA1301 y pCAMBIA2301 conteniendo los genes reporteros gus y gfp (proteína verde fluorescente), respectivamente, bajo el control del promotor constitutivo de la Nopalina Sintetasa (NOS) y del terminador 35S del virus del mosaico del coliflor, fueron usados para la transformación de ñame amarillo Dioscorea rotundata, un importante cultivo en países tropicales que en los últimos años se ha visto afectado por niveles crecientes de plagas y enfermedades y que además carece de un sistema eficiente de transformación y regeneración. Nyaboga et al. (2014), reportaron la regeneración completa 3 a 4 meses después de la transformación, con una eficiencia de 9,4 a 18,2 %, señalando a este sistema de transformación mediado por A. tumefaciens como una plataforma útil para futuros estudios de ingeniería genética en esta especie agronómica y económicamente importante. Htwe et al. (2014) trabajando con explantes de arroz, utilizaron el plásmido pCAMBIA1304 portador del gen marcador de selección hpt (de resistencia a la higromicina) y de los genes reporteros gus y gfp bajo el control del promotor CaMV35S, para optimizar el nivel de toxicidad del antibiótico empleado frecuentemente en protocolos de transformación genética. Obtuvieron una alta frecuencia de transformación con la expresión estable de los genes reporteros y de selección, señalando que la resistencia a higromicina puede ser utilizada eficientemente como marcador de selección en la transformación de arroz. También se han utilizado de manera eficiente, aunque con menor frecuencia, los promotores de badnavirus, los cuales infectan tanto mono como dicotiledóneas (Moore et al., 1998; Tzafrir et al., 1998; Shenk et al., 1999). En los últimos años se han descrito nuevos promotores constitutivos cuya eficiencia es comparable a la del CaMV35S, con la ventaja al nivel de bioseguridad de ser de origen vegetal:

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Xiao et al. (2005), aislaron y caracterizaron el promotor MtHP de Medicago trunculata y evaluaron su actividad (a partir de la expresión del gen reportero gus) en varias especies de leguminosas, observando similares patrones de expresión genética respecto al promotor CaMV35S, pero con niveles considerablemente más altos. Esto convierte al promotor MtHP en una herramienta con gran potencial en la Ingeniería Genética Vegetal.

En cuanto a las desventajas de la expresión constitutiva, se ha señalado que pudiera implicar la sobreexpresión de un transgen específico en una etapa inadecuada del desarrollo o en tejidos donde no es expresado normalmente, acarreando consecuencias desfavorables en el crecimiento y desarrollo de la planta e, incluso, en el medio ambiente (Bowling et al., 1997; Berroca et al., 2002) (tabla 1).

Park et al. (2010; 2012), analizaron la actividad de los promotores vegetales APX, SCP1, PGD1, R161B y EIF5 en base a la expresión del gen gfp en plantas transgénicas de arroz, en comparación a promotores constitutivos caracterizados previamente (OsCc1, Act1, ZmUbi1), mostrando patrones similares de expresión transgénica, pero con menor silenciamiento dependiente de homología en tres generaciones homocigóticas sucesivas, lo que resalta su potencial como promotores alternativos en aplicaciones biotecnológicas. Es necesario mencionar que los patrones de expresión variaron de acuerdo al órgano y al estadio de desarrollo.

2. Promotores inducibles

Ron et al. (2014), utilizaron el promotor constitutivo de una subclase de actina de Arabidopsis thaliana ACT2/ ACT8 para regular la expresión del gen reportero gus y evaluar, mediante distintos métodos moleculares, los patrones de expresión en tomate transformado por Agrobacterium rhizogenes. Obtuvieron niveles considerables de expresión genética que variaron dependiendo del tejido y que fueron comparables a los de otros promotores constitutivos de origen vegetal.

Pueden ser activados en respuesta a diferentes estímulos, incluyendo señales endógenas y factores físicos y químicos externos, bajo condiciones experimentales controladas (CAMBIA, 2003; Iáñez, 2005). La ventaja de este tipo de promotores radica en que permite un control espacial y temporal más preciso de la expresión transgénica y permite analizar la función de nuevos genes. Además, los sistemas inducibles facilitan promover cambios locales en los niveles de expresión sin causar alteraciones marcadas en el desarrollo de la planta completa (Borghi, 2010). Al igual que con promotores tejido o estadio-específicos, el principio de la estrategia reside en un transgen latente que es activado subsecuentemente de manera controlada (Moore et al., 2006) (tabla 2). Las señales endógenas corresponden a hormonas (especialmente auxinas, giberelinas y ácido abscísico). Los factores físicos corresponden a estrés biótico, como heridas y ataques por patógenos, usados en el estudio de sistemas de defensa de la planta inducidos por sustancias liberadas por o en respuesta al patógeno llamadas elicitores. Algunos

Tabla 1. Promotores constitutivos.

Origen viral

De Badnavirus (Tzafrir et al., 1998; Shenk et al., 1999) CaMV35S y/o CaMV19S del mosaico del coliflor (CAMBIA, 2013; Htwe et al., 2014) CaMV35S duplicado (Kanno et al., 2000) CsVMV del mosaico de la yuca (Li et al., 2001) BSV del rayado de banana (Schenk et al., 2001)

Origen vegetal

Act 1, actina de arroz (Mc Elroy et al., 1990) Act 2 y ACT2/ACT8, actina de Arabidopsis(An et al., 1996; (Ron et al., 2014)) Ubi 1 y 2 –ZmUbi, ubiquitina de maíz (Christensen et al., 1992; Bruce et al., 2015) Ubi 4, ubiquitina de Nicotiana sylvestris (Plesse et al., 2001) EF1α, de Arabidopsis thaliana (van Boxtel et al., 1995) MtHP, de Medicago trunculata (Xiao et al., 2005) APX, SCP1, PGD1, RbiB, E1F5 de arroz (Park et al., 2010 y 2012)

Ventajas

Desventajas

-- Expresión constitutiva -- Alto número de transformantes en mono y dicotiledóneas

-- Origen viral -- El nivel de expresión del transgen puede variar según el tejido y el estadío -- Sobreexpresión inconveniente -- Puede haber silenciamiento genético a largo plazo

-- Origen vegetal -- Mayor expresión en monocotiledóneas -- Menor silenciamiento transgénico a largo plazo

-- Menor número de transformantes que con promotores de origen viral -- La expresión puede variar según el estadio de desarrollo y el tejido. -- Potencial uso en el control de áfidos

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Tabla 2. Promotores inducibles

Estrés biótico

NOS (Agrobacterium); Peroxidasa de arroz (An et al.,1990); inhibidor de peroxidasa de arroz (Sasaki et al., 2007).

Factores físicos

ftsH6 de tomate, por temperatura; Rubisco, por luz; alcohol deshidrogenasa 1, por anaerobiosis (Iáñez, 2005; Saidi et al., 2005)

Factores químicos

AlcR/AlcA, por etanol; poP/LhGR- GRGVG, por dexametasona; XVE/olexA, por β-estradiol (Borghi, 2010; Baroux et al., 2005; Roslan et al., 2001; Samalova et al., 2005); ACC oxidasa y ACO sintetasa, por etileno (Hiwasa-Tanase et al., 2012).

de los promotores activados por estrés físico son NOS (del gen nopalina sintetasa) de Agrobacterium, el de peroxidasa de arroz y el inhibidor de la peroxidasa II de arroz (An et al., 1990; Xu et al., 1993; Sasaki et al., 2007). Otros factores físicos inductores de promotores corresponden a estrés abiótico incluyendo luz, niveles de oxígeno, frío, calor y humedad. Resaltan los promotores activados por temperatura como el promotor del gen hsp17.3 de soya, que induce la expresión del gen gus a temperaturas superiores a 25 °C, y el ftsH6 de tomate, asociado a factores de transcripción de choque térmico. También se ha descrito el promotor de la enzima RuBISCO, inducible por luz, y de alcohol deshidrogenasa 1, inducible por anaerobiosis (Iáñez, 2005; Saidi et al., 2005). Los promotores inducibles por estímulo químico son activados por compuestos químicos que no se encuentran naturalmente en el organismo de interés, incluyendo antibióticos, alcoholes, esteroides, herbicidas y metales como el cobre, entre otros. Estos promotores han sido adaptados y refinados para inducir la actividad de un gen independientemente de otros factores bióticos o abióticos (CAMBIA, 2003). Su efecto es reversible (pierden actividad en ausencia del estímulo) y son muy útiles cuando se requiere expresión temporal (Gatz & Lenk, 1998). Se han descrito varios sistemas bajo este tipo en Arabidopsis y Aspergillus nidulans, como: AlcR/AlcA inducible por etanol; fusiones GR, GVG y poP/LhGR inducibles por dexametasona; XVE/olex A inducible por β-estradiol y choque térmico (Baroux et al., 2005; Roslan et al., 2001; Samalova et al., 2005; Borghi, 2010). Destaca el caso del etileno, fitohormona involucrada en varios procesos de maduración del fruto y senescencia, que regula varios promotores fruto-específicos como el del gen ACC oxidasa y ACO sintetasa involucrados en su biosíntesis. Promotores de genes de respuesta al etileno, tales como E4 y E8, han sido 124

Ventajas

-- Activación exógena y endógena -- Control espacial y temporal de la expresión transgénica más preciso -- Efecto reversible

Desventajas

-- Pueden ser estadioespecíficos -- Relativamente baja frecuencia de transformantes -- Generalmente de expresión no constitutiva

utilizados para identificar elementos activadores y supresores implicados en la expresión genética espacial y temporal de las plantas (Hiwasa-Tanase et al., 2012). A pesar de las ventajas que ofrecen, algunos investigadores han mencionado que este tipo de promotores generalmente implica el uso de sustancias tóxicas, sin embargo este inconveniente ha sido superado con los promotores inducibles por distintos tipos de estrés y factores físicos (Uno et al., 2000; Hoff et al., 2001).

3. Promotores tejido o estadio-específicos Solo actúan en tejidos particulares o en ciertos estadios de desarrollo de la planta. Pueden ser inducidos por factores endógenos o exógenos, en cuyo caso también se les clasifica como inducibles. A pesar de que se han descrito sistemas heterólogos (entre especies o, incluso, reinos diferentes o no relacionados), con estos promotores la mayor especificidad es observada en sistemas homólogos (formados por elementos de la misma especie o de especies relacionadas); esto probablemente se deba a que la expresión coordinada de factores de transcripción es necesaria para la regulación de la actividad de los promotores (CAMBIA, 2003; NEPAD, 2010). El conocimiento de este tipo de promotores permite mejorar la expresión de cualidades o características vegetales de interés agronómico, farmacéutico y/o comercial, tener un mejor control temporal (en un momento específico del desarrollo de la planta) y conocer las rutas metabólicas de un órgano o tejido particular para la identificación de nuevos promotores y genes blanco (Potenza et al., 2004) (tabla 3). Los ensayos con este tipo de promotores no solo se han realizado en forma individual; Michniewicz et al. (2015), han desarrollado un sistema de vectores con promotores compatibles que regulan la expresión genética tejido-específica para facilitar el análisis espacial de la función de varios genes al mismo

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Tabla 3. Promotores tejido u órgano específicos Tejido u órgano

Promotor

Tallo

Hsp17, de cebada

Antera

TA29, de tabaco

Polen

Bp10, de Brassica

Cotiledón

Faseolina, de poroto

Raíz o tubérculo

TobRB7, de tabaco; patatina y B33, de papa

Semilla

Glutenina, de trigo

Tejidos verdes

PEPC, de maíz

Flores

UEP1, de Ubiquitina de crisantemo; CER6 de Arabidopsis

Múltiples tejidos u órganos

Sistema de promotores

Cheng et al.,1998; Peremarti et al., 2010; Ghasimi et al.,2009 Annadana et al., 2002 Kolachevskaya et al., 2015

Michniewicz et al., 2015; Ron et al., 2014

tiempo, superando así las limitaciones de la clonación de promotores individuales que puede llevar mucho tiempo y facilitando la evaluación y hallazgo de genes noveles involucrados en distintos procesos o etapas del desarrollo vegetal, que al mismo tiempo pudieran ser regulados o inducidos. Similarmente, Ron et al. (2014), utilizaron un set de promotores tejido-específicos de Arabidopsis thaliana incluyendo AtS32 (floema), AtS18 (xilema), AtPEP (corteza) y AtWER (raíz) para establecer un modelo de estudio de la expresión tejidoespecífica en tomate Solanum lycopersicum. Entre los promotores órgano o tejido-específicos descritos se encuentran: hsp17 de cebada (activado por calor en pecíolo y xilema de tallo), TA29 del tapete de la antera de tabaco, Bp10 de Brassica específico para polen, faseolina de los cotiledones de poroto, TobRB7 de la raíz de tabaco, patatina del tubérculo de papa, glutenina del endospermo de trigo y de avena y fosfoenolpiruvatocarboxilasa (PEPC) de maíz inducible por luz (solo en tejidos verdes) (Cheng et al., 1998; Lamacchia et al., 2001; Ghasimi et al., 2009; Peremarti et al., 2010). Para semilla también se conoce el promotor de α-globulina aislado de algodón, tabaco y Arabidopsis (Sunilkumar et al., 2002). Dentro de los promotores específicos para flores cuentan el UEP1 de Ubiquitina de crisantemo y el CER6 de Arabidopsis para mejorar la resistencia a insectos y retrasar la maduración de la flor (Annadana et al., 2002). En cuanto a promotores que intervienen en el desarrollo vegetal, resaltan los involucrados en la maduración de la semilla, la floración o que mantienen al tejido en cultivo en el estadio de producción de un metabolito secundario de interés comercial. Por ejemplo, el pro-

Ventajas

Desventajas

-- Pueden ser inducibles -- Estudio de rutas metabólicas -- Mejora de cualidades de interés agronómico, comercial y farmacéutico

Especificidad en sistemas homólogos, con baja expresión transgénica en sistemas heterólogos

Evaluación de expresión tejido u órgano-específica en menor tiempo

motor bZIP53 de Arabidopsis promueve la maduración de la semilla y ha sido usado en otras plantas como estrategia de transformación para fines agronómicos (Alonso et al., 2009). Kolachevskaya et al. (2015), utilizaron el gen tms1 de Agrobacterium involucrado en la biosíntesis de auxinas, bajo el control del promotor de la papa B33, que a pesar de ser constitutivo posee mayor actividad en tubérculos, por lo que facilita el desarrollo reproductivo vegetativo por tuberización; observaron el incremento de auxinas órgano y tejidoespecífico en plantas de papa, evitando el uso de promotores heterólogos.

4. Promotores sintéticos o quiméricos Los distintos elementos o motivos que constituyen un promotor presentan una organización en número y ubicación (incluyendo la distancia entre ellos) que afecta la interacción con factores de transcripción (TFs) y determina la fuerza, así como las características espaciales y temporales de la expresión genética. En consecuencia, estos patrones de expresión pueden ser modificados a conveniencia mediante la reorganización del tipo, número de copias y distancia entre los motivos de un promotor, lo cual es la base de la construcción de promotores sintéticos. Allí radica la potencialidad de los promotores y TFs sintéticos como herramientas para la regulación precisa de la expresión transgénica (Liu et al., 2013). Su uso combinado permite el control transcripcional coordinado de múltiples transgenes, deseado en distintas aplicaciones biotecnológicas que incluyen la ingeniería metabólica y bioenergía (Petolino & Davies, 2013; Liu & Stewart, 2015).

Gene promoters in plants 125

En la construcción de promotores quiméricos destaca el uso de secuencias virales derivadas del promotor CaMV35S (Dutt et al., 2014). Son llamados de “siguiente generación” y básicamente consisten en la combinación de elementos de regiones promotoras de distinto origen, bien sea de organismos distintos (relacionados o no) o elementos cis reguladores de promotores diferentes de un mismo organismo, incluyendo repeticiones en “tándem”, eliminando fenómenos de homología (Marzabal et al., 1998; CAMBIA, 2003; Vogl et al., 2014). En este sentido, Rushton et al. (2002), concluyeron que la combinación, número y distribución de diferentes elementos cis reguladores (cajas W, GCC o S) determinan la respuesta del promotor frente a estrés biótico (infección con hongos y bacterias) y abiótico (heridas). Con esta estrategia, se incrementó la actividad del promotor CamV35S mediante la fusión de secuencias cis reguladoras de otros promotores (CoYMV y CsVMV) (Peremarti et al., 2010). Otros promotores sintéticos, llamados bidireccionales, son usados en procedimientos de transformación multigénica ya que el promotor mínimo ha sido duplicado por ingeniería genética en ambas direcciones, por lo que controlan la expresión simultánea de dos genes. Esta estrategia se ha descrito para mejorar la transcripción de genes que dirigen la oleosina metionina sulfoxidoreductasa (enzima implicada en el envejecimiento o senescencia) en canola, y de los genes Cab 1 y Cab 2 para la síntesis de proteínas de unión a la clorofila a/b en Arabidopsis (Peremarti et al., 2010).

Conclusiones El éxito de la aplicación de la ingeniería genética en el mejoramiento vegetal, el estudio de los mecanismos subyacentes en la regulación genética y el desarrollo vegetal depende en gran parte de la capacidad de controlar la expresión transgénica. A su vez, en las estrategias para lograr tal control resaltan los promotores. Actualmente se dispone de un amplio rango de estos elementos reguladores, con distintas características y potencial para aplicaciones específicas. Así, el promotor se selecciona sobre la base de la especie vegetal, del gen que se quiere insertar y el tejido o la etapa del desarrollo en los cuales se va a expresar el gen, lo que a su vez se determina realizando pruebas donde varíen cada uno de los parámetros involucrados. A medida que se avanza en el estudio de promotores genéticos, se afinan los procedimientos para su uso y se avanza en la eliminación del silenciamiento genético, en el perfeccionamiento de los patrones de expresión transgénica (tanto en especificidad como a nivel espacial y temporal) y, muy importante, en la bioseguridad de las plantas modificadas genéticamente.

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ARTÍCULO DE REVISIÓN

Actualización en caracterización molecular de levaduras de interés industrial Update on molecular characterization for yeast of industrial interest Jorge Alberto Vásquez C *, Mauricio Ramírez Castrillón**, Zulma Isabel Monsalve F.*** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61530

Resumen Las levaduras, además de ser un modelo de la investigación biomédica, tienen diversas aplicaciones en la industria alimentaria, en agricultura y la producción de etanol combustible. Dado que la calidad y la cantidad del producto dependen de la dinámica y la frecuencia de los microorganismos presentes en la fermentación, el uso de herramientas de caracterización molecular se ha incrementado y popularizado en las industrias que emplean levaduras. Estas técnicas se basan en la amplificación o análisis por enzimas de restricción de una porción del ADN genómico de levadura y se clasifican de acuerdo a su capacidad de resolución taxonómica para discriminar a nivel inter o intra-específica. La primera parte de la revisión incluye pruebas interespecíficas tales como, análisis de restricción o RFLP para las regiones ITS2, ITS1-5.8, D1 / D2 de los genes 26S ribosomal DNA. La segunda parte incluye, pruebas de uso común para caracterización nivel de cepa, tales como: la amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), análisis cromosómico por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), análisis de restricción del ADN mitocondrial (ADNmt- RFLP) análisis por mini / micro satélites y la huella genética de ADN por amplificación de regiones interdelta de los transposones Ty. Esta revisión describe y discute los detalles técnicos de los métodos más utilizados para la caracterización molecular de las levaduras y algunos ejemplos de sus aplicaciones en el contexto industrial. Palabras clave: levaduras, caracterización molecular, identificación intraespecífica especies, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract Yeasts, besides being a model of biomedical research, have various applications in the food industry, in agriculture and the production of ethanol fuel. Since the quality and quantity of the product depend on the dynamics and frequency of microorganisms present in the fermentation, the use of molecular characterization tools has been increased and popularized in the industries that use yeast. These techniques are based on amplification or analysis by restriction enzyme of a portion of yeast genomic DNA and are classified according their ability of taxonomic resolution to discriminate at inter- or intra-specific level. The first part of this review includes interspecific tests such as, restriction analysis or RFLP for the ITS2 regions, ITS1-5.8, D1 / D2 of ribosomal DNA 26S genes. The second part includes, tests commonly used for characterization at strain level, such as random amplified DNA polymorphism (RAPD), Chromosome analysis by pulsed gel field electrophoresis (PFGE), restriction analysis of mitochondrial DNA (ADNmt- RFLP), analysis of the mini / micro satellites and DNA fingerprinting by amplifying interdelta regions of Ty transposons. This review describes and discuses technical details of the most commonly used methods for molecular characterization of yeast and some examples of their applications in the industrial context. Key words: yeasts, molecular characterization, Saccharomyces cerevisiae Recibido: enero 23 de 2016 Aprobado: octubre 21 de 2016

Grupo de Investigación e Innovación en Biotecnología (BITI); Centro de Biotecnología Industrial, SENA - Palmira, Valle del Cauca, Colombia. Correspodencia: jorvasco1@misena.edu.co, jorvasco1@gmail.com ** Centro de Biotecnología, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre - Rio Grande do Sul. Brasil. mauriciogeteg@gmail.com *** Grupo de Investigación Agrobiotecnología, Facultad Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Antioquia. Medellín. Colombia. zmonsalve@gmail.com

Actualización en caracterización de levaduras 129 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIIImolecular No. 2 Julio-Diciembre 2016 129-139 129

Introducción En la actualidad, el impacto del uso de las levaduras en la producción de alimentos y bebidas va mucho más allá de la noción popular del pan, la cerveza y la producción de vino usando Saccharomyces cerevisiae. En la industria de alimentos las levaduras se utilizan como fuente de obtención de vitaminas del complejo B, pigmentos, cofactores, extractos y producción de biomasa, entre otros. Algunas levaduras presentan un fuerte control antifúngico que facilita su uso como controladores del deterioro de alimentos. S. cerevisiae se ha venido usando ampliamente como suplemento alimenticio en vacunos, porcinos y aves, generando un incremento en el peso y talla de los ejemplares suplementados (Broadway et al., 2015). Entre sus aplicaciones, también se encuentra la producción de etanol para su uso como combustible, la cual se considera una industria emergente y quizás una de las de mayor proyección económica entre las que usan levaduras como catalizadores de este bioproceso (Tesfaw et al., 2014). Para aprovechar de manera eficiente todas las propiedades de las levaduras a escala industrial se requiere identificar tanto sus características fisico-químicas, asi como la identidad taxonómica de la cepa. Actualmente, las principales técnicas de identificación de levaduras están basadas en métodos de biología molecular, aplican la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) la cual las hace más específicas, pueden ser extremadamente sensibles y los resultados se obtienen en corto tiempo. Esto, permite considerarlos como una alternativa a los métodos bioquímicos tradicionales, ya que se analiza una porción del genoma, el cual no depende del estado fisiológico de la levadura o del medio del cultivo del cual se aisle, reduciendo la aleatoriedad (Kopecka et al., 2013). Dentro de las técnicas para identificación molecular se encuentran los análisis de las regiones ribosomales (5.8S, 18S y 26S), los espaciadores internos transcritos ITS y las regiones externas (ETS), la PCR en tiempo real, microchips, análisis de cromosomas por electroforesis en campo pulsado, análisis de restricción del ADN mitocondrial, los RAPD’s (Amplificación aleatoria de ADN polimórfico), PCR de regiones repetitivas del genoma (microsatélites y minisatélites), la amplificación de secuencias δ y los AFLP(amplificación de fragmentos de longitud polimórfica), (Baselga et al., 2015). En este análisis, se describe la pertinencia de cada una de estas técnicas dependiendo del contexto y del nivel de especificidad al cual se pretende llegar, lo que permite establecer diferencias a nivel inter e intraespecífico en la caracterización de levaduras con fines industriales.

Métodos para identificación de especies de levadura La sistemática de un grupo taxonómico a cualquier nivel, idealmente debe ser monofilético (es decir, prove130

nientes de un ancestro común) y cualquier sistema de identificación se basa en el rastreo de la historia filogenética y/o evolutiva. Esta historia es dificil de descubrir usando caracteres morfológicos, ya que ésta, al igual que la fisiología, evolucionan muchas veces en el tiempo de forma independiente en el mismo organismo. Por otra parte, los tratamientos realizados durante una clave taxonómica, en ocasiones, no permite distinguir fácilmente especies cercanas. En este sentido, la inferencia evolutiva de una especie usando herramientas moleculares permite soportar una mayor fidelidad de técnicas basadas en ADN para el rastreo y posicionamento filogenético de una especie de levadura (Kurtzman et al., 2015). Los genes ribosomales que codifican las subunidades 5.8S, 18S, y 26S están dispuestos en tándem formando unidades de transcripción que se repiten en el genoma de las levaduras entre 100 y 200 veces (figura 1). En cada unidad de transcripción existen otras dos regiones, los espaciadores internos (ITS) y los externos (ETS), que se transcriben pero son procesadas y no forman parte de la molécula de rARN final. A su vez, las unidades codificantes están separadas por los espaciadores intergénicos IGS también llamados NTS. El gen 5.8S no se incluye en la unidad de transcripción previamente descrita pero aparece adyacente en la misma unidad de repetición en tandem en el caso de las levaduras (Alvares, 2011). Entre ellas, dos regiones ribosomales son secuenciadas en levaduras: El dominio D1/D2 de la Subunidad Grande Ribosomal (LSU, proveniente de sus siglas en inglés) para identificación de levaduras ascomicetas (Kurtzman & Robnett, 2014) y la región que comprende los espaciadores transcritos internos y el gen ribosomal 5.8S (ITS1-5.8S rADN-ITS2) tanto para levaduras ascomicetas como basidiomicetas. La región ITS fue propuesta como “Barcode” para hongos y es aceptado para identificación de levaduras (Schoch et al., 2012). Actualmente, el sistema de identificación de levaduras a nivel de especie que ofrece mayor fiabilidad es la secuenciación de la región LSU (Kurtzman & Robnett, 1998; Kurtzman et al., 2015). Cuando se encuentra una identidad igual o superior al 99% con secuencias depositadas en bases de datos como Genbank o Mycobank, una levadura es identificada a nivel taxonómico de especie (Belda et al., 2014; Kurtzman et al., 2015). Para llevar a cabo la secuenciacion del dominio se han usando los cebadores: NL–1 (5’–GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG–3’) y NL–4 (5’–GGT CCG TGT TTC AAG ACG G–3’) (Kurtzman & Robnett, 1997; Kopsahelis et al., 2009; Clavijo & Calderon, 2011). La disponibilidad en la base de datos Genbank (NCBI) de las secuencias de la mayoría de especies, descritas y por describir, hacen que esta técnica sea muy útil para asignar una levadura desconocida a una especie concreta. La comparación con las bases de datos se lleva

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a cabo usando el algoritmo MEGABLAST contrastando contra el material tipo de cada especie (Kurtzman et al., 2015). En algunos clados específicos, es posible asociar inferencias evolutivas con potencial biotecnológico a nivel industrial. Por ejemplo, Kawata et al. (2007), utilizaron los cebadores NL1, NL4, ITS5, ITS4, ITS3 e ITS2 para dividir las levaduras industriales en clases (figura 1). Como resultado, encontraron polimorfismos en dos nucleótidos de la secuencia ITS2 y cuatro posiciones nucleotídicas en ITS 1, entre un grupo de 30 cepas de S. cerevisiae. Esto permitió la diferenciación de cepas de origen industrial en cuatro grupos: las cepas japonesas (sake yeast y shochu yeast), una cepa de panadería, un grupo de cepas vinícolas y un cuarto grupo de cepas wiskeras, cerveceras y de panadería, originarias también del Japón. En algunos grupos taxonómicos la secuenciación de solo una región de ADN no permite la separación de especies diferentes, por lo que estrategias de análisis multigénicas son adoptadas, incluyendo regiones ribosomales y proteinas codificantes, tanto nucleares como mitocondriales. Varios ejemplos son reportados en la literatura, para diferenciar especies dentro de Candida, Kuraishia (Kurtzman & Robnett, 2014), Nakazawaea (Kaewwichian & Limtong, 2014), Cystobasidium (Yurkov et al., 2015), Kazachstania (James et al., 2015), entre otros géneros.

Métodos moleculares de caracterización intraespecífica Si bien algunas similitudes fenotípicas son indicativas de que los aislados pertenecen a la misma especie, las técnicas moleculares proporcionan mayor confiabilidad en los resultados cuando se trata de caracterizar al nivel de cepa. Por ejemplo, mediante técnicas microbiologicas clásicas es imposible diferenciar cepas pertenecientes a la especie S. cerevisiae en el mosto de fermentación (Querol et al., 1993), sin embargo, usando análisis de secuencias de varias regiones mitocondriales y nucleares es posible distinguir poblaciones de diferentes cepas pertenencientes la especie S. cerevisiae (Badotti et al., 2014; Wolters et al., 2015). A pesar que los RFLP´s de la región ITS1-5.8S-ITS2 se utilizan para identificar levaduras, esta técnica se limita a un grupo reducido de levaduras asociadas a alimentos (Osorio-Cadavid et al., 2008; Lopez-Arboleda et al., 2010), por lo que requiere de la secuenciación

para la confirmar la mayoría de agrupamientos realizados. Sin embargo, en algunos casos específicos -como en la confirmación de la presencia de S. cerevisiae-, los RFLP´s son de gran utilidad (Tofalo et al., 2014). Esta técnica permite diferenciar cepas aisladas de sitios geográficamente distantes y cuyas aplicaciones industriales pueden diferir notablemente. La similitud de los patrones generados permite establecer correlaciones filogenéticas entre especies y cepas; así, la existencia de patrones únicos permite la diferenciación (Egli & Henick-Kling, 2001; Esteve-Zarzoso et al., 1999). Algunas técnicas han sido desarrolladas para análisis intraespecífico y, por lo tanto, como agrupamiento o discriminación de cepas de levadura pertenecientes a una misma especie. Entre ellas se encuentran las técnicas denominadas “fingerprinting” basadas en regiones mini/microsatélite, sitios de “splicing” de intrones, RAPDs, AFLPs, RFLPs, regiones interdelta y SSCP (Polimorfismo de Conformación de Cadena Simple).

RAPD: Amplificación aleatoria de ADN polimórfico Mediante la tecnica PCR se amplifica el ADN genomico en presencia de un iniciador (10 -14pb) de secuencia arbitraria, posteriormente se evalúan varios iniciadores de los cuales solo algunos presentarán un polimorfismo moderado. La temperatura de hibridacion entre el oligonucleótido y el ADN se facilita a 37°C, generando la amplificacion aleatoria de diversos fragmentos de ADN distribuidos a lo largo de todo el genoma, cuyos productos son visualizados mediante electroforesis usualmente de acrilamida. El uso de RAPD´s permite obtener las “huellas digitales” que son las diferencias de número y tamaño en los fragmentos del ADN amplificado o patrón de productos amplificados con diferentes perfiles moleculares, las cuales pueden ser características distintivas de especies e incluso de cepas (Capece, 2010). Los RAPD–PCR pueden usarse para aislar, seleccionar y caracterizar cepas de levaduras Saccharomyces nativas de fermentaciones espontáneas que no usan cepas comerciales, con el fin de seleccionar la levadura autóctona más adecuada para la vendimia. Los cebadores que se han propuestos para este fin son: OPA–1 (5’– CAG GCC CTT C–3’), OPA–10 (5’–GTG ATC GCA G–3’). La cepa S. cerevisiae J4 ha sido seleccionada por sus propiedades enologicas y de fermentacion (Rodriguez et al., 2013). La búsqueda de mejores cepas para eno-

Figura 1. Representacion esquematica de las regiones 26S D1/D2 e ITS de rADN de levaduras. (Kawata et al., 2007).

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logía, se puede complementar por medio de estudios filogenéticos representados con dendrogramas para determinar las distancias genéticas a partir de matrices proporcionadas por el algoritmo de Dice (1945). Este coeficiente se utiliza para agrupar datos según el método UPGMA, apoyándose en programas como NTSYSpc y TFPGA (Gallego et al., 2005), (figura 2). El RAPD-PCR se ha usado también para el análisis de la variabilidad genética de los miembros del grupo Saccharomyces sensu stricto (S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus y S. pastorianus). La técnica ha permitido delimitar entre estas especies estrechamente relacionadas, así como grupos intraespecíficos como los dos existentes en la especie S. bayanus. Debido a que este marcador es de naturaleza multilocus permite determinar también el origen híbrido de la especies de levaduras tales como S. pastorianus y S, bayanus, a partir del análisis de la fracción de bandas mostradas por cada híbrido y sus cepas parentales (Nardi et al., 2006). Esta técnica se caracteriza por no necesitar informacion sobre la secuencia del diseño del iniciador y a diferencia de otras técnicas moleculares empleadas, permite analizar la variabilidad a lo largo de todo el genoma revelando un mayor polimorfismo. Sin embargo, la baja temperatura de hibridación utilizada, genera perfiles de amplificación poco reproducibles siendo necesario llevar a cabo varias repeticiones para cada muestra partiendo de distintas extracciones de ADN. Para lograr un buen nivel de diferenciación polimórfica es necesario combinar los resultados de la amplificación con varios oligonucleótidos. A pesar de numerosas desventajas que la técnica presenta, es ampliamente reportada (de Almeida et al., 2015; Corte et al., 2015; Ozturk & Sagdic 2014; Wang et al., 2015).

Análisis cromosómico por Electroforesis en Campo Pulsado (PGFE) El ADN genómico de levaduras, se digiere con una enzima de corte poco frecuente y se resuelve en un gel

Figura 2. Fotografía de un gel de agarosa con patrones de amplificación RAPD obtenido con nueve cepas de S. cerevisiae, usando el iniciador OPC-01 en la PCR. Carril M: marcador de peso molecular. Las flechas indican las bandas polimórficas. (Gallego et al., 2005).

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de agarosa en una cámara electroforética que emite pulsos eléctricos desde diferentes ángulos. La aplicación alterna de dos campos eléctricos transversos provoca que los cromosomas cambien continuamente su dirección de migración, evitando que queden retenidos en el entramado del gel de agarosa y permitiendo separar los fragmentos de ADN mayores a 225 Kb (Lee et al., 1989). La existencia de reordenamientos cromosómicos (translocaciones, delecciones y amplificaciones de regiones cromosómicas) se basan en el alto nivel de polimorfismo cromosómico que se puede encontrar en las levaduras, característica que se aprovecha en el análisis por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), el cual demuestra un alto polimorfismo de longitud entre los cromosomas pertenecientes a diferentes cepas de levadura. Tales variaciones en el tamaño de los cromosomas resultan de los reordenamientos de los cromosomas (GCR). De hecho, la caracterizacion de la estructura de los cromosomas de varias cepas del vino han revelado la existencia de translocaciones o delecciones, posiblemente por recombinación entre las secuencias repetidas Ty intercaladas por todo el genoma, lo cual se ha demostrado como una de las causas más importantes de la translocacion cromosomica (Blondin et al., 2009). Se ha observado la aplicación de la técnica en diversos estudios, entre ellos, se resalta, el análisis sobre la diversidad genética de las poblaciones de S. cerevisiae en diez productores de cachaça en el sur Estado de Minas Gerais, Brasil. Un total de 106 aislamientos fueron identificados por PCR usando el cebador SCREC114, especifico para S. cerevisiae, mediante PFGE y por el análisis de ADN mitocondrial ADNmt–RFLP (Bernardi et al., 2008). Para asegurar la trazabilidad de los perfiles en los geles se usan stándares del cromosoma de S. cerevisiae ya disponibles comercialmente En otro estudio, Ferreira y colaboradores, (2009) evaluaron el potencial de gabiroba Campomanesia pubescens (DC) en la producción de una bebida fermentada usando levaduras seleccionadas y silvestres a partir de una fermentacion espontánea. La diversidad y dinámica de la población de levaduras durante la fermentacion fue observada por el análisis PFGE el cual mostro cinco cariotipos diferentes en los primeros días de la fermentacion. Después del séptimo día hubo una mayor frecuencia de un perfil similar al de S. cerevisiae. La cariotipificación-PGFE, también se aplica en la identificación de cepas de interés en las fermentaciones vínicas (Puig et al., 2000). Existen varios trabajos centrados en la caracterización de levaduras mediante el análisis de polimorfismos. Esta técnica se puede utilizar para tipificar cepas de D. bruxellensis aisladas de vino (Mitrakul et al., 1999) y prevenir las grandes pérdidas económicas que deja el deterioro del vino por esta levadura. Por otra parte, en cepas de S. cerevisiae el polimorfismo obtenido es resultado de la adición o

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eliminación de largos fragmentos de ADN en cromosomas homólogos durante la evolución del genoma de las levaduras (Casaregola et al., 1998). La cariotipificación de cromosomas de levaduras resulta muy útil para generar perfiles específicos para la caracterización de cepas, sin embargo los polimorfismos presentes entre diferentes especies, restringe su uso en el análisis de un gran número de levaduras contaminantes; además, la complejidad y larga duración del proceso, junto con el equipamiento especializado necesario, limitan aún más su aplicabilidad para la caracterización rutinaria en levaduras (El Hage & Houseley, 2013).

Análisis de restricción del ADN mitocondrial (RFLP - ADNmt) El análisis de restricción del ADNmt se ha desarrollado en S. cerevisiae basado en las diferencias en el contenido de G+C existentes entre el ADN nuclear (nADN) y el ADNmt, ya que que en el nADN este es de un 40%, mientras que en el mtADN es solo de un 20%. Esto permite que si al realizar un análisis de restricción al ADN total, utilizando enzimas específicas para reconocer regiones ricas en G+C, tales como SacII y SstII cuya secuencia blanco es CCGCGG, el nADN sufre una sobredigestión generándose numerosos fragmentos de muy pequeño tamaño, los cuales son indetectables en un gel de agarosa. De esta manera, en una electroforesis de ADN total digerido con estas endonucleasas solo se observan los fragmentos correspondientes al ADNmt ubicados según su tamaño y mostrando un perfil específico de especie. Varios autores han introducido una variante que reduce el tiempo de duración del método original en 52,5 h, por disminución del tiempo de incubación para la digestión del ADN de 12 h a 33 min en un horno de microondas, y del crecimiento celular a 36 h (Orberá, 2004). El análisis de polimorfismos de los fragmentos de restricción del ADN mitocondrial, ha sido ampliamente utilizado como método de caracterización de cepas de Saccharomyces estrechamente relacionadas de origen vínico y cervecero (Vezinhet et al., 1990; Muñoz et al., 2009). Investigadores de la Universidad de Valencia, España, demostraron la utilidad de la técnica para determinar la autenticidad de las cepas comerciales que se usan en los viñedos (Esteve-Zarsoso et al., 2001; Fernandez-Espinar et al., 2003), así como también para realizar el seguimiento a las fermentaciones y diferenciar las cepas comerciales de la flora nativa contaminante (figura 3).

Secuencias de mini/microsatélites como cebadores (MSP-PCR Fingerprinting) Esta técnica se basa en el uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y consiste en la amplificación de fragmentos con cebadores de oligonucleótidos

Figura 3. Análisis de restricción de ADNmt de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de viñedos en Valencia España (Querol et al., 1992). El ADN se extrajo y digirió usando las enzimas Rsa I y Hinf l. Líneas: m corresponde a fago lamda digerido con Hind III y EcoRI, usado como marcador, Los números romanos corresponden a diferentes patrones moleculares encontrados en cepas vinícolas de Saccharomyces.

específicos para secuencias simples repetitivas que varían entre 10 y 100 pb presentes en el ADN, denominadas microsatélites, mientras que los minisatélites tienen una longitud inferior a 10 pb. Entre los más utilizados se encuentran (GTG)5, (GACA)4, Fago ADN M13 y la secuencia del M13 GAGGGTGGCGGTTCT. Esta técnica difiere del RAPD, en que la temperatura de hibridación del cebador es mayor (entre 50 y 55 °C), en lugar de de 37 °C, por lo que la probabilidad de hibridizar en zonas específicas del genoma aumenta, logrando una mayor reproducibilidad. Se ha empleado en la identificación de especies del género Zygosaccharomyces, contaminantes de salsas de mayonesa y otros aderezos para ensaladas (Orberá, 2004). Da Silva-Filho et al., (2005) usaron el fingerprinting con el microsatélite (GTG)5, para hacer el seguimiento de los patrones moleculares de la microbiota presente en una misma fermentación en una destilería para la producción de etanol carburante en el nordeste de Brasil, encontrándo diferentes patrones moleculares que coincidieron con cambios en la población de levaduras en el mosto generadas por colonización con cepas nativas provenientes de la melaza o jugo de caña de azúcar, o tambien por las por condiciones de estrés del sustrato que favorecen el crecimiento de alguna cepa tolerante a estos cambios (figura 4). Ramírez-Castrillón et al. (2014), advierten sobre una posible subestimación en análisis de diversidad obtenidos con perfiles genotípicos MSP-PCR Fingerprinting, debido a la gran cantidad de falsos positivos que pue-

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den encontrarse usando esta técnica. Así, analizando dos conjuntos de datos de levaduras asociadas a vinos (considerada de baja diversidad) y sustratos asociados a viñedos (considerado de alta diversidad), pudo establecerse que los agrupamientos realizados con los perfiles, al ser secuenciados, representaban aislados de especies diferentes (por ejemplo, Dekkera bruxellensis y S. cerevisiae). Sin embargo, esta técnica es usada con frecuencia para descripción de especies nuevas (Valente et al., 2012; Praet et al., 2015) y caracterización intraespecífica tales como Torulaspora delbrueckii (Canonico et al., 2015) y Candida milleri (Vigentini et al., 2014).

Los AFLPs son una técnica útil para discriminar levaduras a nivel cepa-específico (de Barros et al., 1999), el analisis molecular en levaduras mediante esta tecnica puede ser superior a los RAPDs. En un estudio comparativo, Gallego et al., (2005) evaluaron la utilidad de tres técnicas moleculares para el analisis genético de las cepas de S. cerevisiae: los RAPDs, AFLPs y los SSRs (microsatelites). Estas tres técnicas moleculares fueron usadas para caracterizar 27 cepas de levaduras vinicas de la “Denominacion de Origen Vinos de Madrid” España. Basados en la amplificacion de los fragmentos de cada genotipo, los AFLPs y los SSRs mostraron un poder discriminatorio similar y superior al de los RAPDs. El análisis con AFLPs y SSR permitió discriminar una combinacion total de 23 cepas de 27 evaluadas.

AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Esta técnica es ampliamente usada, por su poder de discernimiento, se usa como confirmatoria para caracterizar aislamientos de levaduras salvajes procedentes de los tanques de almacenamiento de melaza de caña de azúcar. Vásquez et al. (2015), realizaron la caracterización intraespecífica de cepas tolerantes a vinazas usando marcadores interdelta 12-21 y confirmando con AFLP se obtuvo cinco grupos con distancias genéticas que oscilaron entre 15 y 30%, además por pruebas bioquímicas se determinó que el 85% de los aislamientos pertencian al género S. cerevisiae.

Al igual que en los RAPDs esta técnica, no requieren información previa sobre la secuencia para el diseño del iniciador y aporta un gran número de bandas para el análisis, pero es mas reproducible que este último. Posterior a la restriccion del ADN genómico, se realiza la ligación de adaptadores oligonucleótidos, para la amplificación no selectiva de los fragmentos restringidos con iniciadores complementarios al adaptador. Los fragmentos obtenidos en la primera reacción de PCR, se reamplifican de manera selectiva usando entre una y tres bases diferenciales en el extremo 3’, finalmente, la separación de los amplicones se realiza en geles de poliacrilamida. Típicamente se detectan entre 50 y 100 fragmentos de restricción por genoma de levadura en un gel desnaturalizante de poliacrilamida.

Figura 4. Patrones moleculares (GTG). 5 de las cepas alcoholeras de S. cerevisiae que fueron más representativos durante el seguimiento de la fermentación. bp, representa el peso molecular de cada marcador, los carriles 3, 5 y 6 coincide con el perfil molecular de la cepa inciadora o starter, mientras que los carriles 1, 2, 4, 7 y 8 muestran perfil molecular diferente a la cepa iniciadora, como producto de la dinámica poblacional al interior de los tanques (Da Silva-Filho et al., 2005).

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El uso de los AFLP´s no se ha popularizado en los laboratorios microbiológicos de la industria debido al tiempo necesario para desarrollar la técnica, su alto nivel de complejidad, por la gran cantidad de reactivos y el tamaño de los geles de acrilamida. Sin embargo, ya se han propuesto modificaciones que podrían simplificar y permitir el ahorro en reactivos como revelar los AFLPs en gel de agarosa al 2%, en buffer tris borato EDTA al 1%. Este ejercicio facilitó la caracterización de la biota de levaduras, aisladas durante el seguimiento de una fermentación espontánea de mosto de uva, en

Figura 5. AFLP simplificado en geles de agarosa al 2%. (Esteve-Zarzoso et al., 2010). Carriles M: marcador de peso molecular de100bp (Invitrogen), Carriles: 1, 3, 5, 7, 9 cepas de Candida zemplinina; Carriles: 2, 4, 6, 8,10 cepas de Hanseniaspora uvarum; Carriles 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 cepas de Saccharomyces cerevisiae; Carriles 18, 19, 20 cepas de Hanseniaspora vineae.

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la región de Taragona España (figura 5) (Esteve-Zarzoso et al., 2010).

Elementos delta del transposon Ty 1 de levaduras Las secuencias delta son elementos de 330pb que flanquean los retrotransposones Ty1 y Ty2 de S. cerevisiae (Cameron et al.,1979). Estas regiones se pueden encontrar separadas de los transposones y dispersos por el genoma, en cuyo caso suelen llamarse solo elementos delta. Su número y posición en el genoma de las levaduras son específicos de cada cepa y estables aproximadamente durante 50 generaciones. En el genoma están presentes cerca de 5 familias de elementos Ty que contienen 50 sitios activos potenciales para traslocación del retrotransposon completo y también existen aproximadamente 300 elementos delta independientes como marcas de eventos insersionales pasados. Se ha reportado que los elementos delta están concentrados en regiones genómicas contiguas a los genes ARNt (Eigel & Feldmann, 1982). La variabilidad intraespecífica que otorga el número y la localización de estos elementos fue aprovechada por Ness et al., (1993) para diseñar iniciadores específicos (δ1 y δ2) para la amplificación por PCR de las regiones delta, útiles para diferenciar cepas de S. cerevisiae. Estos autores muestran que la estabilidad de los elementos δ es suficiente para aplicar esta técnica como método de identificación de cepas de S. cerevisiae a nivel industrial, afirmaciones que fueron confirmadas posteriormente por numerosos autores. Algunos de estos trabajos muestran la gran variabilidad que revela esta técnica entre aislados de la especie S. cerevisiae con respecto a otras técnicas muy resolutivas como el análisis de restricción del ADNmt y la electroforesis de cromosomas (Fernández-Espinar et al., 2001; Pramateftaki et al., 2000). En el 2003, Legras & Karst optimizaron la técnica mediante el diseño de dos iniciadores (δ12 y δ21) que se localizan muy próximos a δ1 y δ2. Su uso combinado revela un mayor polimorfismo que se refleja con la aparición de un mayor número de bandas. Schuller et al., (2004) lo confirmaron posteriormente mostrando que la combinación de δ2 y δ12 identificaba el doble de cepas que el juego de iniciadores diseñado por Ness et al., (1993). Varios inconvenientes que presentaba esta técnica eran la poca reproducibilidad debido al efecto de la concentración de ADN y a la baja temperatura (42°C) para la hibridación de los primers (Fernández-Espinar et al., 2001; Schuller et al., 2004), estos problemas fueron superados con la estandarización de la concentración de ADN para todas las muestras, y el aumento de la temperatura de hibridación (55°C), logrando obtener perfiles de amplificación mucho más estables

aunque con un menor número de bandas (Ciani et al., 2010). En las aplicaciones más recientes, se usó la huella interdelta, para comparar los perfiles moleculares de varias cepas nativas alcoholeras aisladas del ambiente de dos destilerías del Valle de Cauca en Colombia, logrando determinar que un 25% de las cepas aisladas de los tanques de almacenamiento de mieles, presentan un patrón molecular diferente al de las cepas comerciales usadas convencionalmente en la fermentación. Se observa que la huella genética interdelta presenta un alto polimorfismo entre cepas diferentes, dado su practicidad y bajo costo, es útil para la caracterización intraespecífica (figura 6), (Vasquez et al., 2015).

Discusion Algunas técnicas moleculares han sido propuestas para la caracterización de especies y monitoreo de cepas industriales. Las primeras de ellas incluían el análisis electroforético del cariotipo, la amplificacion aleatoria del ADN polimórfico usando la reaccion en cadena de la polimerasa (RAPD-PCR) y la ribotificacionPCR, las cuales han sido empleadas por diferentes autores para la identificacion de especies de levaduras del vino (Raspor et al., 2006). A partir del uso masivo de la reacción en cadena de la polimerasa para evaluar el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) y la secuenciación de ADN, se establece el consenso de dos regiones de ADN como estándar para la determinación de especies: LSU y la región ITS1-rADN 5.8S-ITS2 (Kurtzman et al., 2015). Por ejemplo, el uso de secuencias de ADN para identificar levaduras permitió duplicar el número de espe-

Figura 6. Huella genética PCR del perfil molecular interdelta 12-21, obtenido a partir del ADN genómico de levaduras nativas aisladas de tanques T-103 y T-124. Carril 1 es el marcador de peso molecular; carril 2, fago λ; carril 3, S cerevisiae LCC1-1; carril 4, S. cerevisiae LCC1-5; carril 5, S. cerevisiae LCC1-6; carril 6, S. cerevisiae LCC1-9; carril 7, S. cerevisiae LCC1-13; carril 8, S. cerevisiae LCC1-17; carril 9, S. cerevisiae LCC2-3 (Candida colliculosa); carril 10, S. cerevisiae LCC2-18; carril 11, S. cerevisiae LCC2-26; carril 12, S. cerevisiae LCC2-29; carril 13, GRX; carril 14, GR; carril 15, XP; carril 16, etanol rojo; y el carril 17, control de cebadores (Vasquez et al., 2016).

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cies identificadas en los últimos diez años (Kurtzman et al., 2011). La mayor base de datos de secuencias depositada en Genbank para identificación rápida de levaduras, o detección de linajes desconocidos, es la región LSU, seguido de la región ITS. Los resultados de Kawata et al., (2007) sugieren a los ITS como posibles marcadores polimórficos para el estudio de la diversidad interespecífica de levaduras. Cuando se pretende comparar de forma rápida la secuencia (editada, ensamblada) con cepas tipo depositadas en Genbank de identidad igual o superior a 99% con una especie descrita, esta técnica permite la identificación de una cepa a nivel taxonómico de especie. Si no es posible realizarse con LSU, se procede a comparar con la región ITS de la misma forma. Nótese que pueden haber excepciones al criterio de identidad dependiendo del clado filogenético. No obstante, la región ITS fue propuesta como código de barras (Barcode, en inglés) para identificación de hongos (Schoch et al., 2012), debido a que la región LSU no permite la identificación en algunos grupos de hongos no levaduriformes (para definición de levadura reciente ver Kurtzman et al., 2011). A nivel industrial el monitoreo e identificación sirven para demostrar que la especie de levadura inoculada al inicio y al final de un proceso biotecnológico es el mismo y que la especie que domine una fermentación, por ejemplo, sea la esperada por el productor. También, es posible evaluar cambios adaptativos de una cepa industrial, al demostrar que cepas originales y “adaptadas” proceden de un ancestro común y que han “evolucionado” con su uso en cada proceso industrial (Dragosits & Mattanovich, 2013). Un reflejo de esto son los estudios fisiológicos (Oda & Ouchi, 1989) que demuestran que las cepas de S. cerevisiae cerveceras pueden presentar deficiencias en el levante o leavening, característica fundamental de las cepas de S. cerevisiae, de uso en panadería y que demuestran el grado evolutivo y posiblemente una mejor adaptación a un ambiente en particular. A nivel intraespecífico, varias técnicas también fueron desarrolladas (sin involucrar secuenciación). Entre ellas, sondas de APN – Péptido Ácido Nucleico- (Stender et al., 2001), RAPD/AFLP (Azumi et al., 2001; de Barros Lopes et al., 1999), Microsatelite-primed PCR (Da Silva-Filho et al., 2005; Ramirez-Castrillón et al., 2014), PCR en tiempo real (Casey & Dobson 2004), electroforesis en Gel de Gradiente desnaturalizante – DGGE- (Prakitchaiwattana et al., 2004), Citometria de flujo (Jespersen et al., 1993). Su aplicación y sus campos de acción va desde el monitoreo de poblaciones de levaduras industriales hasta el análisis de diversidad de levaduras asociadas a bebidas y alimentos. La baja reproducibilidad de los RAPDs implica la necesidad de hacer muchas repeticiones para obtener el patrón estándar y después incluir en el análisis solo la banda que aparece en todas las amplificaciones, esto 136

la hace poco útil para uso rutinario. Adicionalmente, debido a la baja temperatura de hibridación utilizada (37°C) los perfiles de amplificación incluyen productos inespecíficos siendo necesario llevar a cabo varias repeticiones para cada muestra partiendo de distintas extracciones de ADN. Los microsatélites difieren del RAPD en que la temperatura de hibridación del iniciador es mayor (55 °C), en lugar de la de 37 °C, por lo que estos hibridan en zonas específicas del genoma, haciendo mayor su reproducibilidad, por lo cual esta técnica se ha convertido una de las más usadas para la caracterización intraespecífica de levaduras.. Ademas, la PCR-fingerprinting empleando cebadores individuales (SPAR), cebadores aleatorios y secuencias microsatelites puede usarse para la discriminacion inter y/o intra-especifica de levaduras. La PCR-fingerprinting se basa en la deteccion de secuencias repetitivas hipervariables (mini y microsatelites) favorecida para mostrar la variabilidad genética de los individuos estrechamente relacionados (Suranska et al., 2012). Por otra parte, la técnica de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), es una de las que ofrecen un mayor poder discriminatorio. Sin embargo, la complejidad y larga duración del proceso, junto con el equipamiento especializado necesario, limitan su aplicabilidad para la caracterización rutinaria de las levaduras (Rodriguez et al., 2010; Cordero-Bueso, 2016). La huella genética por regiones delta, es una técnica rápida que puede distinguir dos levaduras incluso a nivel intraespecífico y resulta ideal para la utilización en la industria, por su simplicidad, sin embargo se requiere tener estandarizado el método de extracción y cuantificación del ADN genómico, así como también a la disposición equipos como el termociclador. El uso del perfil de restricción del ADN mitocondrial resulta también ideal para la utilización en la industria por su rapidez, seguridad y economía, ya que no requiere material sofisticado, ni personal muy especializado, además es eficiente para diferenciar cepas de levaduras, ya que se basa en la existencia de un importante polimorfismo del ADN mitocondrial en las distintas cepas (Benitez et al., 1996), permitiendo seguir tanto la implantación de la cepa inoculada como la dinámica de crecimiento del resto de cepas presentes en el mosto (Querol et al., 1993). Recientemente, la identificación basada en MALDITOF/MS ha revolucionado la identificación microbiana, incluyendo levaduras (Quian et al., 2008), acelerando el proceso de identificación de días (como el caso de la secuenciación) a horas (generalmente un turno) (Borneman et al., 2011). Actualmente es ampliamente usado en levaduras de interés clínico, con la expectativa de ser usado prontamente a nivel industrial, donde se requiere una base de datos creciente junto con el mejoramiento de la técnica (Kurtzman et al., 2015).

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En el momento de la caracterización intraespecífica con técnicas moleculares, es importante realizar al menos dos técnicas diferentes para reducir las variables que impiden la reproducibilidad entre laboratorios e incluso entre ensayos. En términos generales, las técnicas moleculares, se constituyen en una herramienta eficiente para la caracterización de microorganismos, siendo esta, una etapa indispensable para determinar la identidad genética de las cepas, en especial cuando se planea un uso industrial de los aislamientos. Las técnicas de caracterización morfológica y bioquímicas han predominado hasta ahora, por su relativa sencillez y porque en términos generales no requieren equipos sofisticados para llevarlas a cabo, no obstante es indispensable identificar la identidad genética del microorganismo en los casos en que se requiera determinar la inocuidad del cultivo específico para las cepas comerciales, o para realizar el seguimiento de la inocuidad de la fermentación y especialmente proteger la propiedad industrial.

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Actualización en caracterización molecular de levaduras 139



El carbón activado y las condiciones de oscuridad en la micropropagación de banana variedad Nanicão Activated Carbon and dark conditions in banana micropropagation Variety Nanicão Maura Isabel Díaz Lezcano*, Bruno Alberto Flor Benítez**, Cipriano Ramón Enciso Garay***, Luis Roberto González Segnana**** DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.55618

Resumen El objetivo del trabajo fue evaluar los efectos del carbón activado y las condiciones de oscuridad inicial sobre la propagación in vitro de banana (Musa spp.) variedad Nanicão. Fueron empleados 64 ápices provenientes de hijuelos de 20 - 30 cm. Los tratamientos consistieron en la combinación de dos concentraciones de carbón activado (2 y 3 g/l) y dos condiciones de oscuridad inicial (15 y 30 días). El diseño experimental utilizado fue completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2 y cuatro repeticiones. Cada unidad experimental estuvo constituida por cuatro ápices. Las variables evaluadas fueron la tasa media de multiplicación, el porcentaje de supervivencia, oxidación, contaminación y aclimatización de plántulas. El análisis estadístico consistió en el ANAVA con un nivel de significancia del 5 %. Las medias fueron comparadas a través del test de Tukey al 5 % de probabilidad. Los resultados mostraron que la combinación de 2 g/l de carbón activado y 15 días de oscuridad inicial promovió el mayor porcentaje de supervivencia del primer subcultivo que alcanzo 57,30 %. En la fase de establecimiento el porcentaje de contaminación de los ápices de 39,06 % mientras que en el primer subcultivo de 22,39 %. La oxidación en la fase de establecimiento fue de 9,37 % y en el primer subcultivo fue de 8,85 %. Se concluye que la combinación entre la concentración de 2 g/l de carbón activado y 15 días de período de incubación inicial resulta efectiva en el aumento de la supervivencia de los ápices. Palabras clave: Musa spp, banana, supervivencia, multiplicación in vitro.

Bionota

Abstract

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The objective of this work was to evaluate the effects of activated charcoal and the initial darkness conditions in the propagation in vitro of banana (Musa spp.) variety Nanicão. Were employed 64 apexes coming from shoots of approximately 20 to 30 cm. The treatments consisted in the combination of two concentrations of activated charcoal (2 and 3 g/l) and two initial dark conditions (15 and 30 days). The experimental design went completely randomized with 2 x 2 factorial arrangement and four replications. Each experimental unit consisted of four apexes. Statistical analysis consisted ANOVA with significance level of 5 %. The variables were the average rate of multiplication, survival percentage, oxidation, contamination and acclimatization of plantlets. Means were compared by Tukey test at 5 % of probability. The results showed significant difference in the interaction between the concentration of 2 g/l of activated charcoal and 15 days of initial darkness at the survival percentage from the first subculture which reached 57.30 %. In the establishment phase the percentage of contamination of the apexes was 39.06 % while that in the first subculture was 22.39 %. The oxidation in the establishment phase was 9.37 % and in the first subculture was 8.85 %. It is concluded the

Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciancias Agrarias, Carrera de Ingeniería Forestal, maura.diaz@agr.una.py ** Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Carrera de Ingeniería Agronómica, brunoflorbenitez@gmail.com *** Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Carrera de Ingeniería Agronómica, cenciso@agr.una.py **** Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciancias Agrarias, Carrera de Ingeniería Agronómica, luis.gonzalez@agr.una.py

San Lorenzo, San Lorenzo, San Lorenzo, San Lorenzo,

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 140-146

Key words: Musa spp, banana, survival, in vitro multiplication. Recibido: febrero 5 de 2016 Aprobado: octubre 14 de 2016



interaction between the concentration of 2 g/l of activated charcoal and 15 days of initial incubation period is effective in increasing survival.

Introducción La banana (Musa spp.) presenta un fruto de gran aceptación en el mercado nacional como internacional y proporciona una fuente importante de mano de obra para los habitantes de los diferentes departamentos involucrados en su producción como San Pedro y Caaguazú, Paraguay. Debido a que la mayoría de las variedades comerciales de banana no producen semillas, su propagación se realiza extrayendo del campo los propágulos. No obstante, esta actividad conlleva diferentes problemas fitosanitarios ya que los patógenos se diseminan de una plantación a otra, no garantizando la productividad y la sanidad de las mismas, otro de los problemas que se presentan con esta actividad es la lentitud de la propagación y la baja tasa de multiplicación obtenida en el campo. En este sentido, la práctica e implementación del cultivo de ápices de banana es una técnica que facilita la obtención de plántulas de calidad y libre de patógenos, ofreciendo de igual manera uniformidad en la producción y mayor peso de racimos, ya que las plantas son seleccionadas por sus altas características productivas. Otra de las ventajas de este método de propagación referente al convencional es la posibilidad de obtener gran cantidad de plantines en un espacio físico reducido y en un corto periodo de tiempo. De ahí, la importancia de realizar trabajos o experiencias que lleven a dilucidar las incógnitas referentes a esta práctica. El objetivo del trabajo fue evaluar los efectos del carbón activado y las condiciones de oscuridad inicial sobre la propagación in vitro de banana (Musa spp.) variedad Nanicão.

Materiales y métodos

Se utilizaron 64 ápices provenientes de hijuelos de 20 - 30 cm de altura de la variedad Nanicão (AAA) seleccionados en base a sus sobresalientes características productivas (número de manos por racimo y peso del racimo, que en promedio fue de 26 kg). Posteriormente, se procedió a la eliminación en campo del pseudotallo a una altura aproximada de 10 cm por encima de la inserción de las hojas en el cormo basal y de las raíces hasta que se observen los tejidos blancos internos. El aislamiento y cultivo de ápices consistió en la remoción de la base externa de las hojas del pseudotallo y los tejidos blancos de la base del cormo (24 horas después de su recolección), hasta obtener aproximadamente un cono de 6 cm (longitud total del ápice desde su base hasta la parte distal) que preserve el meristema central y colocar el mismo en una solución de ácido ascórbico (100 mg/l) en tanto se reducían todos los ápices, conservando cerca de 1 cm3 de tejido del rizoma. Posteriormente, el material se sometió a un procedimiento de desinfección por 20 minutos con hipoclorito de sodio al 5 % para luego introducirlo en condiciones de asepsia en donde se realizaron tres enjuagues de cinco minutos cada uno, con agua destilada estéril. A continuación, con la ayuda de una lupa estereoscópica se realizó una primera reducción del material, conservando siempre un mínimo del tejido de rizoma para poder manipular fácilmente el ápice. Seguidamente, se realizó una segunda desinfección del cono superficialmente con hipoclorito de sodio al 5 %, adicionado con dos gotas de Polisorbato 20, durante 10 minutos y luego enjuagarlo tres veces con agua destilada estéril. A continuación, se procedió a eliminar los primordios adyacentes hasta obtener un tamaño final del explante de 1,5 – 2 cm. Inmediatamente, se cultivaron 16 ápices en medios MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementados con 2 y 3 g/l de carbón activado (CA) y puestas a oscuridad inicial de 15 y 30 días dependiendo del tratamiento. A los 45 días del establecimiento, el material que no presentó contaminación y oxidación aparente fue multiplicado. Se realizó 1 subcultivo luego de 22 días; también se procedió a la aclimatización de las plántulas generadas utilizando para tal efecto vermiculita y sustrato consistente en una mezcla de suelo agrícola y estiércol vacuno en proporciones 1:1, ambos previamente autoclavados. Las plántulas de aproximadamente 6 a 7 cm de longitud y que presentaron buen desarrollo tanto aéreo como radicular fueron extraídos de los frascos, se retiró el exceso del medio de cultivo de las plántulas y a continuación fueron plantadas bajo fotoperiodo constante de 16 horas luz. Las plántulas fueron irrigadas con un pulverizador manual e introducidas en una bolsa de polietileno, de esa manera se mantuvo al máximo la humedad relativa.

Bionota

El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción en San Lorenzo, Paraguay.

Micropropagación de banana variedad Nanicão 141



Se evaluó la tasa media de multiplicación, el porcentaje de supervivencia, oxidación, contaminación y aclimatización de plántulas. El diseño experimental utilizado fue completamente al azar con arreglo bifactorial 2 x 2 y 4 repeticiones. Los tratamientos consistieron en la combinación de dos factores: Factor A, dos concentraciones de carbón activado, 2 y 3 g/l y Factor B, dos condiciones de oscuridad inicial, 15 y 30 días, totalizando 16 unidades experimentales. Cada unidad experimental estuvo compuesta por 4 ápices. Los datos obtenidos fueron sometidos a ANAVA (Análisis de Varianza) y las medias fueron comparadas con la prueba de Tukey al nivel de 5% de probabilidad.

Resultados y Discusión Tasa media de multiplicación No se detectaron diferencias estadísticas significativas en el número de brotes del primer subcultivo en función a las concentraciones de carbón activado, 2 y 3 g/l, y los periodos de incubación inicial, 15 y 30 días respectivamente y la interacción de factores; registrándose una media de 1,46 brotes por explante, tal como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Tasa media de multiplicación de los ápices expuestos a concentraciones de 2 y 3 g/l de carbón activado y a 15 y 30 días de oscuridad inicial. 15 días de oscuridad inicial

30 días de oscuridad inicial

2 g/l de carbón activado

1,75aA

2,12aA

3 g/l de carbón activado

0,5aA

1,5aA

Media

1,46

C.V.

27,52

Medias seguidas de la misma letra mayúscula en la columna y minúscula en la fila, no difieren entre sí por la prueba de Tukey al 5 % de probabilidad de error.

Bionota

En la figura 1, se observa que no habiendo diferencias estadísticas significativas la combinación de 2g/l de carbón activado y 15 días de oscuridad inicial generó 26 brotes. En cuanto a la combinación de la concentración de carbón activado y condiciones de oscuridad se registró que con 2 g/l de carbón activado y 30 días de oscuridad inicial se obtuvo 22 brotes.

Figura 1. Cantidad total obtenida de brotes de banana (Musa spp.) al término del primer subcultivo expuestos a 2 y 3 g/l de carbón activado y a 15 y 30 días de oscuridad inicial.

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Durante el primer subcultivo se observó la formación de raíces en los explantes. Según Oliveira & Silva (1997), el enraizamiento no es benéfico pues consume reserva que podría ser utilizada para la producción de brotes. La formación de brotes ocurrió solo durante el cultivo en el medio de multiplicación (suplementado con 4 mg/l de bencilaminopurina), y no en el medio de establecimiento. La relativamente baja concentración de bencilaminopurina (BAP) en el medio de establecimiento así como la concentración de citoquinina endógena, juntos con la presencia de altos niveles de ácido indolacético (AIA) en el tejido, son los involucrados en la ausencia de formación de brotes laterales (Zaffari, 2001).

Porcentaje de ápices supervivientes En relación al porcentaje de ápices supervivientes en el primer subcultivo (tabla 2), el análisis estadístico no se detectaron diferencias significativas en la respuesta de los ápices a las concentraciones de carbón activado y las condiciones iniciales de oscuridad, aunque existió diferencia significativa en la interacción entre factores, verificándose que la combinación de 2 g/l de carbón activado y 15 días de oscuridad inicial promovió el mayor porcentaje de supervivencia que fue de 57,30%. Esto pudo ser consecuencia de la disminución de la contaminación y la oxidación de compuestos fenólicos. Oliveira (2010) obtuvo valores superiores a los de este experimento con 87,50% de explantes sobrevivientes al final del primer subcultivo. Por su parte, Hernández (2001) obtuvo resultados superiores alcanzando porcentajes de supervivencia en el primer subcultivo de entre 45,46% hasta el 100% en diferentes líneas comerciales de banana.

Tabla 2. Porcentaje de ápices sobrevivientes en el primer subcultivo expuestos a 2 y 3 g/l de carbón activado y a 15 y 30 días de oscuridad inicial. Concentración de carbón activado

15 días de oscuridad inicial

30 días de oscuridad inicial

Media concentración de carbón activado

2 g/l de carbón activado

57,30aA

21,87aA

39,58A

3 g/l de carbón activado

4,17aB

41,67aA

22,92A

Media oscuridad inicial

30,73a

31,77ª

D.M.S.

36,19

C.V. (%)

25,32

Medias seguidas de la misma letra mayúscula en la columna y minúscula en la fila, no difieren entre sí por la prueba de Tukey al 5% de probabilidad de error.

Porcentaje de ápices con signos de oxidación

Al medio de cultivo de Murashige & Skoog se añadió carbón activado para intentar favorecer el control de la oxidación fenólica y confirmado por Roca & Mroginski (1991), quienes manifiestan que el carbón activado se ha usado, para superar problemas específicos de oxidación los cuales se asocian con el cultivo de tejidos en musáceas. Moreno et al. (2007), afirman que existió una respuesta positiva entre la oscuridad inicial y la adición de carbón activado al medio de cultivo, y concluyen que el uso del carbón activado como soporte catalítico en la oxidación del fenol resulta positivo y competitivo ante otros materiales porosos empleados bajo las mismas condiciones. El análisis estadístico del porcentaje de oxidación en el primer subcultivo tampoco presentó diferencias estadísticas significativas entre las concentraciones de carbón activado y las condiciones de incuba-

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En la fase de establecimiento no existieron diferencias estadísticas significativas entre las concentraciones de carbón activado como tampoco entre las condiciones de incubación inicial. La tabla 3 ilustra los resultados obtenidos.

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ción inicial; tampoco se registró interacción entre ambos factores, tal como se registra en la tabla 4. En el primer subcultivo se pudo constatar la presencia de oxidación en todos los tratamientos, esto podría deberse a la remoción del carbón activado del medio de cultivo debido a la interacción negativa del carbón activado con la hormona bencilaminopurina. Tabla 3. Porcentaje de meristemas con signos de oxidación en la fase de establecimiento expuestos a concentraciones de 2 y 3 g/l de carbón activado y a 15 y 30 días de oscuridad inicial. 15 días de Oscuridad Inicial

30 días de Oscuridad Inicial

2 g/l de Carbón Activado

6,25aA

0aA

3 g/l de Carbón Activado

25aA

6,25aA

Media

9,37

C.V.

12,34

Medias seguidas de la misma letra mayúscula en la columna y minúscula en la fila, no difieren entre sí por la prueba de Tukey al 5 % de probabilidad de error.

Tabla 4. Porcentaje de meristemas con signos de oxidación en el primer subcultivo expuestos a concentraciones de 2 y 3 g/l de carbón activado y a 15 y 30 días de oscuridad inicial. 15 días de oscuridad inicial

30 días de oscuridad inicial

Media concentración de carbón activado

2 g/l de carbón activado

9,37aA

9,37A

3 g/l de carbón activado

4,17aA

12,50aA

8,33A

Media oscuridad inicial

6,77a

10,93a

D.M.S.

18,77

C.V. (%)

15,84

Medias seguidas de la misma letra mayúscula en la columna y minúscula en la fila, no difieren entre sí por la prueba de Tukey al 5 % de probabilidad de error.

Porcentaje de ápices con signos de contaminación

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El porcentaje de ápices con signos de contaminación no presentó diferencias significativas en la fase de establecimiento y el primer subcultivo en función a los factores, tampoco en la interacción.

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En la fase de establecimiento se observó que la combinación de 3 g/l de carbón activado y 15 días de oscuridad inicial promovió 56,25% de contaminación, siendo la más elevada, seguida del tratamiento con 3 g/l de carbón activado y 30 días de oscuridad inicial. Las contaminaciones fueron aparentemente por bacterias en su gran mayoría presentando una coloración blanquecina o crema y en algunos casos por hongos. Estos resultados en cierta forma coinciden con los porcentajes obtenidos por Oliveira et al. (2008), en los cuales obtuvo valores de entre 39,30% y 19,50% en cuatro diferentes cultivares de Musa spp. Pereira et al. (2003), mencionan que a pesar de que las contaminaciones fúngicas también ocasionan importantes pérdidas materiales; las de origen bacterianas son las más serias, en razón de su difícil detección inicial, ya que pueden ser transferidas de un material a otro durante los sucesivos subcultivos. A diferencia de la contaminación bacteriana, la fúngica puede ser verificada fácilmente Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 140-146

En el primer subcultivo se evidenció la presencia de contaminación en todos los tratamientos, sin embargo se comprobó una reducción del porcentaje de contaminación en comparación a la fase de establecimiento, obteniéndose el menor valor con 2 g/l de carbón activado y 15 días de oscuridad inicial que fue de 8,32% (figura 2). Lima & Moraes (2006) y Oliveira et al. (2008), verificaron de igual manera que las tasas de contaminación más elevadas son de origen bacteriana y la fase más susceptible de este tipo de contaminación es en el establecimiento in vitro, con tendencia a reducir a medida que van siendo realizados los subcultivos independientemente del cultivar a ser utilizado.



a lo largo de los subcultivos, y es generalmente ocasionada por una inadecuada manipulación de las condiciones asépticas.

Figura 2. Porcentaje de contaminación en la fase de establecimiento y el primer subcultivo expuestos a concentraciones de 2 y 3 g/l de carbón activado y a 15 y 30 días de oscuridad inicial.

Aclimatización de plántulas Una vez concluidas las evaluaciones, se procedió a la aclimatización de las plántulas a manera de observar la supervivencia de las mismas en condiciones ex vitro. Durante el proceso de aclimatización se observó una supervivencia del 100% de las plántulas. Campelo et al. (2010), obtuvieron 97% de supervivencia de las plántulas a la fase de aclimatización. Castillo (2004) hace mención a que en el momento en que se extraen las plántulas de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

Conclusiones

Referencias Bibliográficas Castillo, A. (2004). Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho tiempo (en línea). Las Brujas, UY. Recuperado de http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/lb/ad/2004/ad_382.pdf Campelo, MF, Lemos, OF, Reis, LR., & Campos M, I. (2010). Enraizamento e aclimatização de cultivares de bananeira (en línea). Belém, BR. Recuperado de http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/31425/1/MeicianeCampelo.pdf Hernández, RB. (2001). Validación del Protocolo de Micropropagación de Musáceas en cinco líneas comerciales pertenecientes al clon Williams (en línea). Cartago, CR. Recuperado de http://bibliodigital.itcr.ac.cr:8080/dspace/bitstream/2238/209/1/ FINAL2.pdf

Bionota

En las condiciones del experimento se concluye que la suplementación de carbón activado al medio de cultivo MS y las condiciones de oscuridad inicial no favorecieron la propagación in vitro de banana (Musa spp.) variedad Nanicão al no encontrarse diferencias significativas entre los tratamientos aplicados.

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

Lima, JD., & Moraes, WS. (2006). Concentração de benzilaminopurina e avaliação de protocolo para multiplicação in vitro de genótipos de Bananeira (en línea). San Paulo, BR. Recuperado de http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed. jsp?iCve=253021639003 Moreno, JC, Sarria, VM, Polo, AD., & Giraldo, L. (2007). Evaluación de peróxido de hidrógeno en la oxidación del fenol con hierro soportado sobre tela de carbón activado (en línea). Bogotá, Colombia. Recuperado de http://www.scielo.cl/pdf/ infotec/v18n2/art10.pdf Oliveira, RP., & Silva, S. (1997). Avaliação da micropropagação comercial em bananeira (en línea). Brasilia, BR. Recuperado de https://seer.sct.embrapa.br/index.php/pab/article/view/4654/7242 Oliveira, H. (2010). Comportamento de cultivares de Bananera (Musa spp.) resistentes a doenças no processo de micropropagação (en línea). Belém, BR. Recuperado de http://usadesign.com.br/mestrado/dissertacoes_conluidas/herica_oliveira.pdf. Pereira, JES, Mattos, ML., & Fortes, GR. (2003). Identificação e controle com antibióticos de bactériasendofíticas contaminantes em explantes de batata micropropagados (en línea). Brasilia, BR. Recuperado de http://www.scielo.br/pdf/pab/ v38n7/18204.pdf Roca, W., & Mroginski, A. (1991). Capitulo # 22 Micropropagación de Plátanos y Bananos. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. CIAT Centro Internacional de Agricultura Tropical. CR.

Bionota

Zaffari, GR, Kerbauy, GB, Kraus, JE., & Romano, EC. (2001). Hormonal and histological studies related to in vitro banana bud formation (en línea). San Pablo, BR. Recuperado de http://www.springerlink.com/content/q20j2g7m7k564x77/fulltext.pdf.

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Comité evaluador La Revista Colombiana de Biotecnología ofrece sus agradecimientos a los siguientes docentes quienes actuaron en el presente número como Comité de Arbitraje: Acosta Carrión, Wilson, PhD., Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Cundinamarca, Colombia, acostawilson@rocketmail.com

Crombet Grillet, Sandra, MSc., Departamento de Química, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Oriente, Cuba, scrombet@uo.edu.cu

Ampudia Mesias, Elisabet, cPhD., MSc., Universidad del Valle, Colombia, elisabet.ampudia@correounivalle.edu.co

Cruz R., Carlos A., MSc, cPhD., Instituto de Biotecnologia, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, caacruzra@unal.edu.co

Aragón, Óscar, Ing., MSc, cPhD, Grupo de Bioprocesos y Bioprospección, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, oscarleo1@yahoo.com

Cuervo Mulet, Raul Alberto, PhD., MSc, Programa de Ing.. Agroindustrial, Universidad de San Buenaventura, Colombia, racuervo@usbcali.edu.co

Arango Bedoya, Óscar, MSc., PhD., Universidad de Nariño, Colombia, oscar769@udenar.edu.co Ayala Valdovinos, Miguel Angel, PhD., Centro de Biotecnología Animal, Universidad de Guadalajara, México, manayala@cucba.udg.mx Barrientos Ramírez, Lucía, PhD., Universidad de Guadalajara, México, lbarrien@dmcyp.cucei.udg.mx Belaich, Mariano N., PhD., Profesor/Investigador, Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular, Área Virosis de insectos, Departamento Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina, mbelaich@unq.edu.ar Belen Miele, Solange Ana, PhD., Bio-Chemical Green Engineering & Materials, Faculty of Applied Engineering/Biochemistry, University of Antwerp, Belgica, solange.miele@unq.edu.ar Bernal, Mauricio, MSc., cPhD Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, mbernalmo@unal.edu.co Borges García, Misterbino, PhD., Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal, Universidad de Granma, Cuba, mborgesg@udg.co.cu Buitrago Hurtado, Gustavo, IQ, MSc., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, gbuitragoh@unal.edu.co Bustamante R., Silvia L., MSc., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, slbustamanter@unal.edu.co Cadme Arévalo, María Lorena, MSc., Dirección de Investigación Científica y Tecnológica, Laboratorio de Biotecnología, Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador, mcadme@uteq.edu.ec Carrazana, Daymí, PhD., Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Facultad de Química-Farmacia, Cuba, daymic@uclv.edu.cu Carreño Farfán, Carmen Rosa, MSc., Docente, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Perú, crcf1@hotmail.com Carrillo Castañeda, Guillermo, PhD., Profesor Investigador Titular. Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, México, carrillo@colpos.mx Castiblanco Rodriguez, Ana Lucia, QF., MSc Toxicología, Coordinadora Lab. Análisis Instrumental, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, alcastiblancor@unal.edu.co Cerón Rincón, Laura E., MSc., cPhD, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, leceronr@unal.edu.co Comba Gonzalez, Natalia Beatriz, MSc, cPhD Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, natalia.comba@gmail.com Corredor, Gloria, MSc., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, gacorredorh@unal.edu.co

Domingues Rodrigues, José Alberto, PhD., Escola de Engenharia Mauá – Instituto Mauá de Tecnologia, Praça Mauá, 1 – São Caetano do Sul – São Paulo, Brasil, rodrigues@maua.br Fernández, Camino, MSc., Grupo de Ingeniería Química, Ambiental y Bioprocesos, Dpto. Química y Física Aplicadas, Universidad de León, España, cferrd@unileon.es Galdeano, Ernestina, PhD., Insituto de Botánica del Nordeste (UNNE-CONICET), Facultad de Ciencias Agrarias, UNNE, Argentina, ernestin@agr.unne.edu.ar García Águila, Leyanes, PhD., Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Cuba, leyanis@ibp.co.cu García Romero, Ibonne Aydee, MSc., PhD., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, ibonne@gmail.com Ghiringhelli, P. Daniel, PhD., Director del LIGBCMAVI, Dto. C. y Tecnología, Univ. Nac. de Quilmes, Argentina, pdg@unq.edu.ar

Costa Rica (UNA), Costa Rica, sergio.molina.murillo@una.cr Ojeda Delgado, Karina Angélica, PhD., Docente de Programa de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de Cartagena, Colombia, kojedad@unicartagena.edu.co Ordóñez, Diana Marcela, MSc., Universidad del Valle, Colombia, marcela.univalle@gmail.com Oropeza, Maira, PhD., Universidad Central de Venezuela, Venezuela, maira.oropeza@ciens.ucv.ve Pabón, Miguel A., Ing. Agr., MSc., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, miguelpabon@gmail.com Pabón, Miguel Angel, MSc., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, miguelpabon@gmail.com Pérez Mancilla, Ximena C., cPhD., MSc., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, xcperezm@unal.edu.co Pinzón Gutiérrez, Yeimy Alexandra, MSc., Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, yeialep@gmail.com Ramos Duarte, Víctor Andrés, MSc., Instituto de Biotecnología Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, varamosd@unal.edu.co Reguero Reza, María Teresa, MSc., Instituto de Biotecnologia, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, mtregueror@unal.edu.co

Gómez Kosky, Rafael, PhD., Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (UCLV), Cuba, kosky@ibp.co.cu

Rodríguez Mejía, Maria de Lourdes, PhD., Profesor Investigador en Bacterias Fitopatógenas, Universidad Autónoma Chapingo, México, rodrime_lu@hotmail.com

Gongora, Agustin, MSc., PhD., Grupo de Investigación en Reproducción y Genética Animal - GIRGA, Universidad de los Llanos, Colombia, agongora@unillanos.edu.co

Romero Güiza, Maycoll Stiven, PhD., Engineering and Advanced Technologies, Environmental Biotechnology, University of Barcelona, España, maycoll77@gmail.com

Gutkind, Gabriel O., MSc., PhD Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina, ggutkind@ffyb.uba.ar

Rosas García, Ninfa María, MSc., PhD Laboratorio de Biotecnología Ambiental, Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional, México, nrosas@ipn.mx

Hernández Pardo, Mario Andrés, PhD., Profesor Titular, Facultad de Ingeniería, Universidad EAN, Colombia, mahernandez@universidadean.edu.co Lloclla Gonzáles, Herry, MSc., Jefe Oficina de Investigación - Universidad César Vallejo, Perú, hlloclla@ucv.edu.pe Llorens Vilarrocha, Eugenio, PhD., Departament Ciències Agraries i del Medi Natural, Universitat Jaume I, España, ellorens@uji.es Martínez-Zubiaur, Yamila, MSc., Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM-UMA, CSK), Cuba, yamila@censa.edu.cu Massenssini, André Marcos, PhD., in Agricultural Microbiology, Professor at the Instituto Federal Goiano - campus Iporá, Brasil, ammassenssini@gmail.com Medina-Dzu, Kati, PhD., Facultad de Ingeniería Química, Universidad Autónoma de Yucatán, México, kati.medina@uady.mx Mendez Arteaga, Jonh Jairo, PhD., Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima, Colombia, jmendez@ut.edu.co Molina-Murillo, Sergio A., PhD., Profesor Asociado (II) Escuela de Ciencias Ambientales, Univ. Nacional de

Ruiz Avila, Camilo A., Ing. Agr., MSc., Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, caaruizav@unal.edu.co Sánchez Nieves, Jimena, PhD., Depto de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, jsanchezn@unal.edu.co Terán, Wilson, PhD., Profesor Asociado, Departamento de Biología, Universidad Javeriana, Colombia, wteran@javeriana.edu.co Tiel, Kenia, PhD., Plant Division, Center for Genetic Engineering and Biotechnology (CIGB), Cuba, kenia.tiel@cigb.edu.cu Torres Guzman, Juan Carlos, PhD., Departamento de Biologia, Division de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Guanajuato, México, torguz@ugto.mx Valencia Chona, Jorge Andrés, MSc., Ciencias Microbiología, Universidad Nacional de Colombia, Colombia, jorgeandres07@gmail.com Vargas Radillo, J. Jesús, PhD., Universidad de Guadalajara, México, jvargasr@dmcyp.cucei.udg.mx Vega-Chaparro, Sandra, PhD., Bioquímica e Inmunología, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, sacvegach@unal.edu.co

Autores 147

Autores – Authors A Argüello-Navarro, Adriana Zulay, MSc. Agronomía. Profesor Ocasional. Departamento Medio Ambiente. Grupo de investigación en Ciencias Biológicas Majumba. Universidad Francisco de Paula Santander. Cúcuta, Norte de Santander, Colombia, adrianaarguello@ufps.edu.co Aristizabal, Fabio Ancizar, PhD en Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Colombia, faaristizabalg@unal.edu.co

B Barbosa, Helber de Jesús, Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia, Colombia, hdbarbosab@unal.edu.co Barrera, Gloria, PhD., Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia, gbarrera@corpoica.org.co Bautista, Jessica P., Investigadora, Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Biotecnología, Colombia, jessicabautista282@gmail.com Betancur-Pérez, Jhon Fredy, PhD en Ciencias Agrarias. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. Palmira, Colombia Borges García, Misterbino, PhD en Ciencias Biológicas. Profesor Titular. Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad de Granma, Cuba, mborgesg@udg.co.cu

Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. Palmira, Colombia Carreño Sayago, Uriel Fernando, MSc Ing Biotecnólogo, Docente de planta Fundación Universitaria los Libertadores. Departamento de Ingeniería, Colombia, ufcarrenos@libertadores.edu.co Castro Molano, Liliana del Pilar, PhD., Profesor Escuela de Ingeniería Química, Universidad Industrial de Santander, Colombia, licasmol@uis.edu.co Cerón Pérez, Jorge Luis, Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia, jorgeluiscep15@hotmail.com Chaparro-Giraldo, Alejandro, Ingeniero Agrónomo, MSc., PhD., Universidad Nacional de Colombia - sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología & Instituto de Genética, Grupo de Ingeniería Genética de Plantas, Colombia, achaparrog@unal.edu.co Cid, Mariela, Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila, Cuba, mariela@bioplantas.cu Correa Estrada, Lina Maria, Ingeniera Biológica, Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Colombia Cuartas Otálora, Paola Emilia, PhD. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia, pcuartas@corpoica.org.co

Daquinta, Marcos, Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila, Cuba, mdaquinta1962@gmail.com

Capote, Iris, Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila, Cuba, icapote@bioplantas.cu

De Guglielmo C., Zoraya M, PhD. Ciencias. Lab. Genética Molecular-Instituto de Oncología y Hematología-MPPS, Venezuela, zdegugli@gmail.com

Cardona Lopera, Ximena, Bióloga, Universidad de Antioquia, MSc en Ciencias Agrarias. Grupo BIOGEM. Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional, sede Medellín. Asistente Técnico, Cooperativa Colanta Ltda, Colombia, ximenacl@colanta.com.co

Del Portillo, Patricia , PhD, Biotecnología Molecular, Corporación CorpoGen Cr5 No 66a -34, Bogotá, Colombia

Carrascal, Camilo López, Manihot biotec, Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, Colombia, celopezc@unal.edu.co Carrasco-Lozano, Emerson Clovis, MSc. Ciencias Biológicas. Facultad de Ciencias

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Díaz Lezcano, Maura Isabel, Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciancias Agrarias, Carrera de Ingeniería Forestal, San Lorenzo, Paraguay, maura.diaz@agr.una.py

Escalante Hernández, Humberto, PhD., Profesor Escuela de Ingeniería Química, Universidad Industrial de Santander, Colombia, escala@uis.edu.co Escalona, Maritza, Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila, Cuba, mescalona@bioplantas.cu

F Fernandez Da Silva, Rafael, PhD. Ciencias. Centro de Biotecnología Aplicada (CBA), Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología-Universidad de Carabobo, Venezuela, rafaelfer2103@hotmail.com Flor Benítez, Bruno Alberto, Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciancias Agrarias, Carrera de Ingeniería Forestal, San Lorenzo, Paraguay, brunoflorbenitez@gmail.com Franco-Correa, Marcela, Microbióloga PhD. GBAI, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, franco@javeriana.edu.co

G Giraldo, Adriana Bernal, Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes, Colombia, abernal@uniandes.edu.co Gómez Kosky, Rafael, Doctor en Ciencias Agrícolas. Profesor Titular. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Cuba Gómez Mitjans, Diana, Ing. Centro de Control Estatal de Equipos Médicos y Medicamentos (CECMED), Cuba, dgmitjams@gmail.com; dgmitjams@cecmed.cu González Segnana, Luis Roberto, Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciancias Agrarias, Carrera de Ingeniería Forestal, San Lorenzo, Paraguay, luis.gonzalez@agr.una.py Guzmán Santofimio, Cristian Alexander, Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia, Lex1215@gmail.com

Enciso Garay, Cipriano Ramón, Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciancias Agrarias, Carrera de Ingeniería Forestal, San Lorenzo, Paraguay, cenciso@agr.una.py

Jiménez, Jenny Paola, Bióloga, MSc., Universidad Nacional de Colombia - sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología & Instituto de

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 148-149

Genética, Grupo de Ingeniería Genética de Plantas, Colombia, jenny.jimb@gmail.com

L Lartaud, Marc, Especialista principal histología. CIRAD, UMR AGAP, 34398 Montpellier, Francia

Cúcuta, Norte de Santander, Colombia, laurayolimamr@ufps.edu.co Murcia G., Jazmín, Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia, jazelimurgar@gmail.com

López Ortiz, Juan Bautista, Biólogo, MSc en Biología Docente, Escuela de Biociencias. Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Colombia, jblopez@unal.edu.co

Ocampo, Valeria, Microbióloga Industrial. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, ocampov1946@gmail.com

López-López, Karina, PhD, Biotecnología de Plantas. Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. Palmira, Colombia

Ortiz, Tatiana, Microbióloga Industrial M.Sc. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, tatsortiz.ortiz@gmail.com

M Madiedo Soler, Niccolay, Ing. Biotecnológico. Semillero de Investigación en Biotecnología Aplicada - Seiba. Universidad Francisco de Paula Santander. Cúcuta, Norte de Santander, Colombia, niccolaymadiedosoler4@gmail.com Malaurie, Bernard, Doctor en Ciencias Biológicas . Investigador Titular. IRD, Palm Development Group, UMR DIADE, 34394 Montpellier Cedex 5, Francia Marín Batista, José Daniel, cMSc, Universidad Industrial de Santander, Colombia, jdmbatista05@gmail.com

P Pina, Danilo, Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila, Cuba, danilo@bioplantas.cu Pita Bravo, Vicenta, MSc. Facultad de Ingeniería Eléctrica Instituto Superior Politécnico “José Antonio Echeverría” CUJAE, Cuba, vicenta@quimica.cujae.edu.cu Prada, Luis Daniel, Microbiólogo Industrial M. Sc. UNIDIA, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, luisd09@hotmail.com

Meneses Rodríguez, Silvio, Doctor en Ciencias Biológicas. Profesor Titular. Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad de Granma, Cuba

Monguí, Alvaro, PhD, Biotecnología Molecular, Corporación CorpoGen Cr5 No 66a -34, Bogotá, Colombia, alvaro.mongui@corpogen.org

Rodríguez-Rodríguez, Mónica, Ingeniera Agrónoma. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, Colombia

Monsalve F., Zulma Isabel, Grupo de Investigación Agrobiotecnología, Facultad Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia, zmonsalve@gmail.com Moreno-Rozo, Laura Yolima, Ph.D. En Educación. Profesor Titular. Departamento de Ciencias Básicas. Grupo de investigación en Ciencias Biológicas - Majumba. Universidad Francisco de Paula Santander.

Ramírez Castrillón, Mauricio, Centro de Biotecnología, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre - Rio Grande do Sul, Brasil, mauriciogeteg@gmail.com

S Salazar Vera, Luis Alberto, cMSc, Universidad Industrial de Santander, Colombia, luissanantonio2010@hotmail.com

Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, Colombia, padiazta@unal.edu.co

U Uribe-Vélez, Daniel, Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Biotecnología, Colombia, duribev@unal.edu.co

V Vaca-Vaca, Juan Carlos, PhD, Biotecnología de Plantas; MSc. Microbiología con Énfasis en Biotecnología. Departamento de Ciencias Agrícolas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia. Palmira, Colombia, jcvacava@unal.edu.co Vásquez C, Jorge Alberto, Grupo de Investigación e Innovación en Biotecnología (BITI); Centro de Biotecnología Industrial, SENA - Palmira, Colombia, jorvasco1@misena.edu.co, jorvasco1@gmail.com Vásquez Cano, Juan Fernando, Médico Veterinario, MSc en Ciencias Animales Universidad de Antioquia. Grupo de investigación Biogénesis, Facultad de Ciencias Agrarias. Asistente Técnico, Cooperativa Colanta Ltda, Colombia, jufevaca@gmail.com Verdeil, Jean-Luc, Doctor en Ciencias Biológicas. Investigador Titular. CIRAD, UMR AGAP,34398 Montpellier, Francia Villamil, Carolina, Bcs, Biotecnología Molecular, Corporación CorpoGen Cr5 No 66a -34, Bogotá, Colombia, cvillamil@corpogen.org Villamizar, Laura Fernanda, PhD. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia, lvillamizar@corpoica.org.co

Z Zárate, Carlos Andrés, Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes, Colombia, ca.zarate10@uniandes.edu.co Zumalacárregui de Cárdenas, Beatriz, PhD Facultad de Ingeniería Química Instituto Superior Politécnico “José Antonio Echeverría” CUJAE, Cuba, beatriz@quimica.cujae.edu.cu

Tatis, Paula Díaz, Manihot biotec, Departamento de Biología de la

Autores 149

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

La Revista Colombiana de Biotecnología publica únicamente artículos originales, principalmente contribuciones provenientes de investigación y desarrollo en las diversas áreas de la biotecnología, así como artículos técnicos que no presentan prueba de hipótesis, como la descripción técnica de métodos. También serán aceptadas notas breves; por ejemplo informes de un trabajo significativo cuyos objetivos sean de corto alcance. Los autores deberán seguir las instrucciones que se presentan a continuación. Los artículos que no cumplan con éstas se devolverán sin ser evaluados. Los manuscritos deben enviarse por triplicado, en papel blanco de tamaño carta (21,6 x 27,5 cm), a espacio sencillo, con márgenes de 3 cm. Las dos copias deberán omitir la información de los autores. Debe incluirse la versión electrónica del trabajo en disquete o CD. Para agilizar el proceso de evaluación puede enviarse también una copia al correo electrónico que se indica al final. Los artículos deben ser elaborados utilizando Word Windows o aplicaciones compatibles, en letra Times new roman de 12 puntos. El trabajo debe tener una extensión máxima de 20 páginas, incluidas figuras, tablas y bibliografía. El lenguaje utilizado debe ser claro y preciso. El trabajo debe estar escrito en estilo impersonal. Los nombres comerciales y marcas deben evitarse en el texto, o referidos entre paréntesis. Los productos comerciales deben ser mencionados por el nombre técnico o el principio activo. Los nombres registrados deben ir acompañados por ®. Se deben utilizar las abreviaturas aceptadas internacionalmente. En caso de ser utilizadas siglas poco comunes, deberán indicarse completas la primera vez que se citan, seguida de la sigla entre paréntesis. Todas las abreviaturas y siglas deben escribirse sin punto. Use el sistema métrico decimal para todas las medidas y abreviaturas para las unidades comunes de medida: kilogramo (kg), gramo (g), miligramo (mg), metro (m), etc. Evite las notas de pie de página, excepto para la información de los autores del artículo. Utilice un solo tamaño de letra. La estructura del artículo debe tener en cuenta los pasos del método científico, así: Título. Debe ser corto pero ilustrativo, sin exceder de 15 palabras. Debe incluirse una traducción del título en inglés y un título corto para los encabezados de página. Autores. En el crédito a los autores se deben incluir los nombres completos. Los autores deben ir en orden de acuerdo con la importancia de contribución a la investigación o en la preparación del artículo y no en orden alfabético ni de rango. En nota a pie de página y con asteriscos se indicarán respectivamente los títulos académicos, la institución a la cual pertenecen y la dirección postal completa (incluido e-mail).

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Resumen. Debe ser conciso y contener información sobre justificación, objetivos, metodología y resultados concretos de la investigación. Debe indicar las principales conclusiones haciendo énfasis en los logros alcanzados. No debe exceder de 250 palabras escritas en un solo párrafo. Palabras clave. Se debe elaborar una lista de cinco palabras del artículo, como máximo, diferentes de las incluidas en el título, que faciliten el uso de los sistemas modernos de catalogación y búsqueda de la información por computador. Abstract. Debe ser una traducción técnica del resumen al idioma inglés. Key words. Debe ser una traducción fiel de las palabras clave al idioma inglés. Introducción: Debe describir el planteamiento general de un tema, dando la información necesaria en forma precisa y haciendo referencia sólo a la bibliografía directamente relacionada y considerada indispensable para el desarrollo del tema, que permita conocer el estado actual del mismo. Debe indicar con claridad el objetivo de la hipótesis de la investigación y su relación con otros trabajos relevantes. (No revisiones amplias de bibliografía). Materiales y métodos: Deben describirse las técnicas y los equipos utilizados dentro de una secuencia que muestre de manera concreta y lógica el desarrollo de la investigación, con el fin de que puedan ser reproducibles. Las fuentes y el estado de pureza de los materiales y la descripción detallada de equipos sólo debe incluirse cuando éstos sean muy específicos o novedosos. Los procedimientos descritos por otros autores deben evitarse, pero si han sido modificados, se deben incluir los detalles de la modificación. Resultados y discusión (la discusión puede ir como capítulo aparte). Los resultados experimentales podrán presentarse en tablas y figuras sólo cuando éstas sean absolutamente necesarias, y deben estar explicadas en forma sucinta pero completa en el texto. En caso de que los resultados estén sustentados por cálculos estadísticos, deberá mencionarse la procedencia de los datos y el método estadístico empleado. Las tablas se deben presentar con título e identificadas con números arábigos continuos. Las figuras, fotografías, dibujos, gráficos y mapas deben presentarse con título e identificarse con números arábigos. Se aceptan figuras elaboradas en computador cuando éstas sean impresas con características de alta calidad, preferentemente en impresora láser. Las fotografías se aceptan en blanco y negro. En caso de ser necesario incluir fotografías en color, el autor paga los costos de su impresión. La discusión debe ser breve y limitarse a los aspectos significativos del trabajo.

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Conclusiones. Deben basarse en los resultados obtenidos; si es posible, deben ofrecer una solución al problema planteado en la introducción. Agradecimientos. En caso de ser necesario manifestar agradecimientos a las personas o instituciones que contribuyeron de manera significativa a la realización del trabajo, éstos deberán ser muy cortos y concretos. Cita bibliográfica. Solamente se aceptan referencias publicadas, citando el apellido del autor seguido del año de publicación entre paréntesis. Ejemplo: Rodríguez (1997). Cuando los autores sean tres o más se debe usar la expresión latina et al. Ejemplo: López et al. (1996). Si la cita se coloca al final se usa autor y fecha entre paréntesis: (Rodríguez 1997; López et al., 1996). Bibliografía. Se debe presentar en orden alfabético. Su presentación será de la siguiente manera. Artículo. Autores, año, título del artículo, revista, volumen, número, páginas. Ejemplo: Pérez R., Lalucat J. 1980. Genes asesinos de vida libre. Investigación y ciencia. 44 (4): 38-45. Libro. Autor, año de publicación, título, lugar de impresión, editorial o entidad responsable de la publicación, páginas. Ejemplo: Gómez, A; Posada, H. 1987. Descripción de malezas en plantaciones de café. Chinchiná, Colombia: Cenicafé, p. 481. Las tesis deben referenciarse como libro. Si algún trabajo tiene características propias y no puede cumplir todas las especificaciones señaladas anteriormente, se recomienda que por lo menos tenga en cuenta título, autor, resumen, palabras clave, traducciones del resumen y palabras clave, citas bibliográficas, conclusiones.

Artículos de revisión de tema Los artículos de revisión solamente se aceptarán para publicación cuando sean solicitados por el Consejo Editorial. No obstante, los autores pueden proponer temáticas indicando el objetivo de la revisión, fuentes y métodos de búsqueda de referencias. El Consejo Editorial evaluará las propuestas y determinará si es posible su desarrollo e inclusión en la revista. Los artículos de revisión, que de acuerdo con Colciencias, son documentos resultado de una investigación donde se analizan, sistematizan e integran los resultados de investigaciones publicadas o no publicadas sobre un campo en ciencia o tecnología, con el fin de dar cuenta de los avances y las tendencias de desarrollo, deben cumplir con las siguientes características: Extensión entre 12 y 20 páginas. Componentes: resumen que enfatice en el significado de los hallazgos recientes, introducción, análisis crítico (presentar con subtítulos o secciones), conclusiones y bibliografía que abarque por lo menos 50 referencias, en su mayoría recientes (de los últimos cinco años en el caso de temáticas ampliamente conocidas). Además, se sugiere incluir tablas, esquemas y

figuras que dinamicen el texto y faciliten su comprensión. La revisión debe integrar adecuadamente la información recopilada y explicar con detalle las limitaciones e incongruencias de los resultados de los estudios publicados. La Revista Colombiana de Biotecnología es una publicación arbitrada. Los artículos recibidos son enviados (sin nombres de autores) a pares evaluadores anónimos seleccionados por el Consejo Editorial. Sus observaciones son remitidas a los autores para que realicen las modificaciones correspondientes. El Consejo Editorial toma la decisión final sobre la publicación de los artículos. Dirección Revista Colombiana de Biotecnología Consejo Editorial Universidad Nacional de Colombia Instituto de Biotecnología Teléfonos: (571) 316 5450 316 5000 Ext. 16981 – Fax: 3165415 A.A. 14490 de Bogotá e-mail: revcbib_bog@unal.edu.co www.rcb.unal.edu.co

Ética Declaración de ética y buenas prácticas El comité editorial de la Revista Colombiana de Biotecnología está comprometido con altos estándares de ética y buenas prácticas en la difusión y transferencia del conocimiento, para garantizar el rigor y la calidad científica. Es por ello que ha adoptado como referencia el Código de Conducta que, para editores de revistas científicas, ha establecido el Comité de Ética de Publicaciones (COPE: Committee on Publication Ethics) dentro de los cuales se destaca:

Obligaciones y responsabilidades generales del equipo editorial · Relaciones con los lectores · Relaciones con los autores · Relaciones con los evaluadores · Proceso de evaluación por pares · Reclamaciones · Fomento de la integridad académica · Protección de datos individuales · Seguimiento de malas prácticas · Integridad y rigor académico Más información: http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/ about/editorialPolicies#custom-0

Instrucciones para los autores 151

AUTHOR INSTRUCTIONS FOR THE REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA The Revista Colombiana de Biotecnología only publishes original articles, mainly contributions from research and development (R&D) in biotechnology’s diverse areas, as well as technical articles not necessarily orientated towards proving hypotheses (i.e. technical descriptions of methods). Brief notes will also be accepted, such as reports concerning significant work having short-term objectives. Authors must follow the following instructions; articles not complying with them will be returned without being evaluated. Manuscripts must be submitted in triplicate, on letter-sized (21.6 x 27.5 cm), white paper; they must be single-spaced, with 3 cm margins. Two copies must omit author details. An electronic copy of the work must also be submitted on diskette or CD. A copy can also be sent to the e-mail address given at the end of these instructions to speed-up the evaluation process. The articles must be processed using Word for Windows or a compatible application, written in Times New Roman, font-size 12. The work must not exceed a maximum of 20 pages, including Figures, Tables and Bibliography. The language used must be clear and precise and the work must be written in the third person. The past tense must be used for the Introduction, Materials and Methods and Results sections. Commercial names and brand-names must be avoided in the body of the text (or referred to in parenthesis). Commercial products must be referred to by the technical name or the main ingredient (initial letter capitalised). Only internationally accepted abbreviations must be used. In the case of little-known acronyms being used, they must be written in full the first time that they are used, followed by the acronym in parenthesis. All acronyms and abbreviations must be written without a full-stop following them. The metric decimal system must be used for all measurements and those abbreviations for common units of measurement: kilogram (kg), gram (g), milligram (mg), meter (m), etc. Avoid footnotes, except for information regarding authors of an article. Use a single letter size. The article’s structure must follow the accepted steps used by Scientific Method, thus: Title. It must be short but illustrative, without exceeding 15 words. This title must then be translated into Spanish and a short title for the pageheadings must also be included. Authors. The complete names must be included when crediting the authors of any article. The authors must be listed in agreement with the importance of their contribution to the research or in the preparation of the article and not in alphabetical order, nor in terms of rank. Their respective academic distinctions, the institution to which they belong and their complete mailing address (including e-mail) must be marked by an asterisk and given in a footnote.

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Abstract in English. This must be concise and contain information concerning the research’s justification, objectives, methodology and concrete results. It must indicate the main conclusions, emphasising achievements. It must not exceed 250 words, these to be written in a single paragraph. Key words in English. There must be a list containing a maximum of five key words from the article (different to those included in the title) facilitating the use of modern computerised cataloguing and information search systems. Abstract in Spanish. This must be a technical translation of the abstract to the Spanish language. Key words in Spanish. There must be a faithful translation of the key words to the Spanish language. Introduction. This must describe the general purpose for writing on the subject, giving the necessary information precisely, referring only directly to that related literature considered indispensable for developing the subject, allowing the present state of the same to become known. It must clearly indicate the objective of the research’s hypothesis and its relationship with other relevant work (it must not include extensive reviews of the bibliography). Materials and Methods. The techniques and the equipment used must be described in a sequence specifically and logically showing the research’s development so that they can be reproduced. The materials’ sources, their state of purity and the detailed description of equipment must only be included when these are very specific or novel. Procedures described by other authors must be avoided; but, if they have been modified, then the details of such modification must be included. Results and Discussion (the Discussion can be given as a separate section). Experimental results must only appear in Tables and Figures when these are absolutely necessary; they must be succinctly but completely explained in the text. When results are sustained by statistical calculation, the origin of the data and the statistical method used must be mentioned. The Tables must be given a title and be identified by continuous Arabic numbers. The Figures (photographs, drawings, graphs and maps) must appear with a title and be identified by Arabic numbers. Figures processed by computer (when these are printed with high quality characteristics, preferably by laser printer) are accepted. Black and white photographs are accepted. If it is necessary to include colour photographs then the author must pay the printing costs. The discussion must be brief and limited to the work’s significant aspects. Conclusions. They must be based on the results obtained. If it is possible, they must offer a solution to the problem outlined in the Introduction.

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Acknowledgements. If it is necessary to show gratitude to people or institutions making a significant contribution towards the work, these must be kept short and concrete. Bibliographical references in the body of the Text. Only published references can be accepted, mentioning the author’s last name, followed by the year of publication in parenthesis, for example: Rodríguez (1997). When there are three or more authors, the Latin expression et al. must be used, for example: López et al. (1996). If the reference is made at the end of a phrase, author and date are given in parenthesis, for example: (Rodríguez 1997; López et al. 1996). Bibliography. This must be presented in alphabetical order of first-named authors. Its presentation must be as follows. For articles. Author(s), year, title of the article, journal, volume, number, page(s), i.e. Pérez, R.; Lalucat, J. 1980. Genes as assassins of free life. 44 (4): 38-45. Books. Author (s), year of publication, title, place where printed, the publisher or organisation responsible for the publication, pages, i.e. Gómez A.; Posada, H. 1987. Chinchiná, Colombia: Cenicafé.p. 481. A thesis must be referred to as if it were a book. If any work has special characteristics and therefore cannot fulfil all those specifications previously indicated, then it is recommended that at least title, author(s), abstract, key words, translations of the abstract and key words, bibliographical appointments and conclusions should be given.

Articles dealing with topic review Topic review articles will only be accepted for publication when requested by the Editorial Committee. Authors may however propose topics, indicating the purpose of such reviews and the reference sources and search methods to be used. The Editorial Committee will evaluate any such proposal and determine whether it should be developed and/or included in the journal. According to Colciencias, review articles are documents resulting from research, analysing, systematising and integrating the results of published and unpublished research in a scientific or technological field so as to take account of advances and trends in R&D. They must fulfil the following characteristics. Reviews must be between 12 and 20 pages long. Contents: they must have a Summary emphasising the significance of recent findings; an Introduction; a section for Critical Analysis (presented under subtitles or in sections); Conclusions; and a Bibliography, including at least 50 references, the majority being recent (i.e. published within the last five years in the case of wellknown topics). Schemes, Figures and Tables

should also be included, dynamising the text and facilitating understanding. A review should integrate the compiled information and give a detailed explanation of the limitations and any incongruence found in published studies’ results. The Revista Colombiana de Biotecnología is a peer-reviewed publication. Those articles received are sent (without authors’ names) to anonymous peerevaluators selected by the Editorial Committee. Their observations are then sent to authors so that they can make the corresponding modifications. The Editorial Committee takes the final decision whether to publish a particular article. Address Revista Colombiana de Biotecnología Consejo Editorial Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Biotecnología Telephones: (571) 316 5450 316 5000 Ext. 16981 Fax: 3165415 A.A. 14490 de Bogotá (P.O. Box) e-mail: revcbib_bog@unal.edu.co www.rcb.unal.edu.co

Ethics Scope and policy The editorial committee of the Colombian Journal of Biotechnology is committed to high standards of ethics and good practice in the dissemination and transfer of knowledge, to ensure scientific rigor and quality. That is why it has taken as reference the Code of Conduct for editors of scientific journals , has established the Ethics Committee Publications (COPE: Committee on Publication Ethics) within which it stands:

Statement of Ethics and Good Practice · General duties and responsibilities of Editors · Relations with readers · Relations with authors · Relations with reviewers · The peer-review process · Complaints · Encouraging academic integrity · Protecting individual data · Ensuring the integrity of the academic record

More information: http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/ about/editorialPolicies#custom-0

Author instructions 153

Volumen XVIII, número 2, julio - diciembre de 2016 ISSN 0123-3475 (impreso) ~ E-ISSN 1909-8758 (en línea) Título abreviado (en línea) rev.colomb.biotecnol. www.rcb.unal.edu.co © Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá. La Revista Colombiana de Biotecnología inicia su periodicidad semestral en el primer semestre de 1997, siendo un medio especializado, interinstitucional e interdisciplinario, para la divulgación de desarrollos científicos y técnicos, innovaciones tecnológicas, avances en legislación, política y normatividad, tendencias de mercado, y en general, los diversos tópicos relativos a los sectores involucrados en la biotecnología, tanto en Colombia como en el exterior; así mismo, la revista se constituye en un mecanismo eficaz de comunicación entre los diferentes actores de la biotecnología. Atribución: Atribución – No comercial – Compartir igual: Esta licencia permite a otros distribuir, remezclar, retocar, y crear a partir de tu obra de modo no comercial, siempre y cuando le den crédito y licencien sus nuevas creaciones bajo las mismas condiciones.

Rector Universidad Nacional de Colombia Ignacio Mantilla Prada Vicerrector Universidad Nacional de Colombia Jaime Franky Rodríguez Vicerrector de Investigación Universidad Nacional de Colombia Carmen María Romero Isaza Decano Facultad de Ciencias Jaime Aguirre Ceballos Editor de la revista Dolly Montoya Castaño, PhD (Doctora en Ciencias de la Vida) Universidad Nacional de Colombia, Bogotá

Contacto e información Jaqueline Ramírez P. Instituto de Biotecnología - Universidad Nacional de Colombia Carrera 30 No. 45-03, Ed. Manuel Ancizar (224), Código postal: 14490. Bogotá D. C., Colombia Teléfono: (57-1) 316 5000, ext. 16981 Telefax: (57-1) 316 5415 e-mail: revcbib_bog@unal.edu.co Canje Dirección de Bibliotecas. Grupo de Colecciones Hemeroteca Nacional Carlos Lleras Restrepo Av. El Dorado No. 44A-40, Bogotá, D. C., Colombia Telefax: 316 5000, ext. 20082. a. a. 14490 Correo electrónico: canjednb_nal@unal.edu.co