Revista microbiologia pruebas bioquimicas by Ruben Antonio

Pruebas Bioquím icas

Microbiología

Rubén Antonio García Zavaleta Universidad Veracruzana. Facultad de Bioanálisis Pruebas Bioquímicas

La Microbiología, el estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Cabe destacarse que estos organismos son observados únicamente a través del microscopio. Porque son organismos vivos microscópicos, es decir, muy pequeños, que podrán estar conformados por una célula (unicelulares), o en su defecto por mínimos agregados celulares sin diferenciación celular. En tanto, dentro de estos últimos nos encontramos a los eucariotas (células más núcleo, tal es el caso de los hongos) y los procariotas (célula pero sin núcleo, como ser las bacterias).La microbiología es una disciplina que por su objeto de estudio constantemente está efectuando nuevos descubrimientos y avanzando en el tema. Incluso, según algunas estimaciones provenientes de la misma solamente se conoce un muy pequeño porcentaje de los microbios que hay en la tierra, el 1 %. Esta situación nos indica que a pesar de los avances tecnológicos y del desarrollo de la ciencia es tan amplio el campo de estudio que todavía tiene mucho camino por descubrir y recorrer. El trabajo pretende abordar desde el punto de vista metabólico su identificación y diferenciación de otros grupos de bacterias de acuerdo a sus características y metabolitos que las hacen únicas y reconocibles.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Enterobacteriaceae Esta familia comprende un número muy variado de géneros y especies bacterianos cuyo hábitat natural es el tubo digestivo del hombre y los animales. No todos los bacilos Gram negativos que tienen este hábitat forman parte de la familia Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas, y en los animales, desde los insectos al hombre. La familia está definida por un conjunto de características fenotípicas (bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas) a las que se han agregado posteriormente otros elementos establecidos por técnicas de hibridación de ácidos nucleicos que miden distancias evolutivas y han definido mejor la interrelación de todos los microorganismos integrantes de la familia. Son bacilos Gram negativos rectos, con un diámetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son móviles, presentan flagelos perítricos. No forman esporos. Desarrollan en presencia o en ausencia de oxígeno

Los bacilos Gram negativos que integran esta familia pueden identificarse por medio de la expresión fenotípica de algunos caracteres genéticos. Los métodos utilizados tienen como principio:

• La investigación de la fermentación de azucares o alcoholes en un medio peptonado con el agregado de un indicador de pH para detectar la producción de metabolitos ácidos. • La investigación de la utilización de un substrato como única fuente de C. • La investigación de producción de ciertas enzimas sobre substratos generadores de color. • La investigación de la producción de un metabolito, producto final característico de una vía metabólica. • La investigación de la aptitud de desarrollar en presencia de un inhibidor.

Pruebas Bioquímicas

Agar Mac Conkey:

Para el cultivo de los bacilos Gram negativos se utilizarán diferentes tipos de medios: Medios simples: son aquellos que contienen pocas sustancias nutritivas. Ejemplo: agar nutriente Medios ricos: son aquellos a los cuales se añaden ingredientes nutritivos, habitualmente de composición química no bien definida, como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, líquidos orgánicos; que permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos de la más amplia exigencia nutricional. Ejemplo: agar sangre. Medios diferenciales: son aquellos a los que se agrega un indicador de pH de distinta índole y que contienen un azúcar degradable por la bacteria, el cual cambiará de color (viraje del indicador) cuando un grupo de organismos determinado se desarrolla en él utilizando ese carbohidrato. Ejemplo: agarlactosa-rojo-fenol. Medios selectivos y diferenciales: son medios a los que se agrega por ej. lactosa, rojo neutro y otras sustancias tales como cristal violeta, que permite el crecimiento de bacilos Gram negativos e inhibe el desarrollo de los Gram positivos. Ejemplo: agar Mac Conkey.

Agar EMB

Agar MacConkey

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Medio preparado: rojo púrpura

Agar EMB Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Placas preparadas: color púrpura.

Prueba de la oxidasa: Pone en evidencia la enzima indofenol-oxidasa, mediante la oxidación de un colorante previamente reducido, que cambia de color en su presencia. Permite diferenciar entre bacilos Gram negativos no fermentadores, como Pseudomonas, que son oxidasa positivos, de aquellos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

Metabolismo energético (oxidativo-fermentativo) El medio utilizado se denomina OF, que es semisólido y tiene azul de bromotimol como indicador de pH, y una baja concentración de glucosa.

Metabolismo de los carbohidratos Se explora por la adición al medio (que puede ser sólido, semisólido o líquido), de el o los carbohidratos deseados más un indicador de pH. Ejemplo: TSI. Este medio sirve de guía como primera aproximación al estudio de bacilos Gram negativos.

Metabolito proteico Puede ser explorado estudiando los procesos de desaminación y decarboxilación de varios aminoácidos, como por ejemplo, la prueba de la desaminación de la fenilalanina a ácido fenil pirúvico por actividad enzimática microbiana

Prueba del citrato Determina la capacidad de un germen de utilizar el citrato como única fuente de carbono y energía. El desarrollo bacteriano provoca un viraje del indicador de pH (azul de bromotimol) del verde (neutro) al azul (alcalino), porque los gérmenes producen metabolitos alcalinos a partir de las sales de amonio contenidas en el medio.

Prueba de la ureasa Determina la habilidad de un microorganismo de hidrolizar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. La alcalinización del medio por el hidróxido de amonio hace virar el indicador de pH (rojo fenol).

SIM Es un medio semisólido que contiene 0,3% de agar. Se siembra con punta en profundidad. Se incuba 24 horas a 37 ºC. Se observan tres características: Movilidad, cuando el desarrollo se produce en todo el medio causando turbidez difusa; o inmovilidad, cuando el desarrollo se produce sólo a lo largo de la línea de siembra. Producción de sulfhídrico: se observa un precipitado de color negro. Producción de indol a partir del triptofano: al agregar un reactivo (Kovacs o Ehrlich) se forma un anillo rojo intenso en la superficie del medio.

Tabla de propiedades bioquĂmicas de las enterobacteriaceae

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Staphylococcus Los cocos se asociaron por primera vez a enfermedades humanas cuando fueron observados en materiales purulentos provenientes de abscesos humanos. En 1880 el cirujano escocés Sir Alexander Ogston demostró que cocos agrupados en forma de racimo. En el año 1882, Ogston llamo a estos cocos “Staphylococcus”, derivando el nombre de los términos griegos staphile (racimo de uvas) y kokkus (frutilla).

Dentro del género Staphylococcus, las especies con mayor importancia a nivel clínico son: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. S. aureus se destaca como un importante patógeno humano, produce infecciones tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. S. epidermidis es integrante de la flora normal de piel pero produce infecciones crecientes de piel y anexos, colonizando cuerpos extraños y también es causa de infecciones profundas en huéspedes inmunocomprometidos. Los estafilococos son cocos Gram positivos, catalasa positiva y el diamino ácido en el peptidoglicano es la L-lisina. El género Staphylococcus posee alrededor de 30 especies.

Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Bacillales Familia: Staphylococcaceae Género: Staphylococcus Especie: S. aureus

Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Cocci Orden: Bacillales Familia: Staphylococcaceae Género: Staphylococcus Especie: S. epidermidis

S. aureus. Sal y manitol S. epidermis. Agar sangre

Agar Sal y manitol.

Pruebas Bioquímicas Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas reacciones que ponen en evidencia la existencia de una enzima o pasos metabólicos determinados, y que muchas veces nos permiten llegar a la identificación a nivel de especie. Ahora enumeraremos las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación de los estafilococos.

PRUEBA DE LA CATALASA Objetivo: separar Staphylococcus y Micrococcus (catalasa positiva) de los géneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa negativos). Fundamento: la enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares.

PRUEBA DE LA COAGULASA Objetivo: permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genéricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos (ScoN). Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa: a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que está unida a la pared celular. Esta actúa directament e sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulo los o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina). b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor sérico (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

AGLUTINACIÓN CON PARTÍCULAS DE LÁTEX

Microorganismo

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria. El medio preparado es de color rojo. Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura.

Crecimiento

Características de la colonia

Objetivo: permite separar S. aureus de otras S. aerus Excelente Amarilla especies de estafilococos. Es un test alternativo para detectar la presencia de la coagulasa y la S. epidermidis Bueno Roja proteína A. Fundamento: se utilizan partículas de látex cubiertas con plasma. El fibrinógeno se une al látex y detecta el clumping factor. Además,

las inmunoglobulinas presentes en las partículas detectan la proteína A, capaz de unirse a la porción Fc de la IgG.

PRESENCIA DE DESOXIRRIBONUCLEASA (DNASA) Objetivo: permite diferenciar S. aureus que posee DNAsa de otras especies del género Staphylococcus. Fundamento: se basa en la presencia de la enzima DNAsa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo, el cual se combina con DNA altamente polimeri zado. Cuando la combinación no ocurre, por acción de la enzima DNAsa, se produce una decoloración del medio. Existen otros tipos de medios de cultivo como el que contiene azul de toluidina metacromático en vez de verde de metilo.

PRESENCIA DE NUCLEASA TERMOESTABLE Objetivo: permite diferenciar S. aureus, que posee esta enzima, de otras especies que no. Fundamento: se basa en la presencia de nucleasa termoestable, que es una enzima con propiedades endo y exonucleolíticas y capaz de clivar DNA y RNA. Existen varias formas de investigar la presencia de esta enzima. Se utilizan cualquiera de los medios sólidos mencionados en la prueba anterior pero en estos se realizan hoyos de aproximadamente 3 mm de diámetro

SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA Objetivo: separar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos. Fundamento: varias especies del género Staphylococcus son resistentes a la novobiocina (disco de 5 µg.) dentro de las cuales se encuentra S. saprophyticus.

TABLA DE DIFERENCIACIÓN GENERAL Carácter

S. aureus

S. epidermidis

Coagulasa

DNAsa

Nucleasa termoestable

Presencia de proteína A

Susceptible a la novobiocina

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Streptococcus El género Streptococcus está formado por bacterias esféricas u ovoides que crecen en pares o cadenas de longitud variable. La mayoría son anaerobios facultativos, existiendo algunas especies anaerobios obligados. Son Gram positivos, no formadores de esporos, catalasa negativos e inmóviles, y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales. La infección estreptocócica es una de las más frecuentes, siendo algunos de los cuadros más importantes relacionados con el género: amigdalitis aguda, otitis media, sinusitis, neumonía, meningitis, infección del tracto urinario, infección abdominal o cutánea, etc.

No existe un sistema de clasificación sencillo para diferenciar este heterogéneo grupo de microorganismos y la misma está sometida a revisión constante. Por el contrario, la clasificación depende de una combinación de características, incluyendo: patrón de hemólisis en placas de agar sangre, composición antigénica, características de crecimiento, reacciones bioquímicas y, más recientemente, análisis genético. Cuando los estreptococos son cultivados en agar sangre se puede observarla presencia de un halo transparente alrededor de la colonia donde los glóbulos rojos han sido completamente lisados. Este patrón es designado hemólisis de tipo beta. Un segundo grupo de microorganismos, produce hemólisis parcial o hemólisis alfa, observándose como un halo verdoso alrededor de la colonia; perteneciendo a este grupo S. pneumoniae. El término hemólisis gamma se utiliza para designar aquellas especies que no producen hemólisis, aunque el término estreptococo no hemolítico es preferible. En la actualidad se reconocen aproximadamente 30 especies de Streptococcus; siendo algunas de las especies de mayor importancia en patología humana: S. pyogenes (estreptococo del grupo A), S. agalactiae (estreptococo del grupo B), y S. pneumoniae (neumococo).

Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Lactobacillales Familia: Streptococcaceae Género: Streptococcus Especie: S. pyogenes

Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Lactobacillales Familia: Streptococcaceae Género: Streptococcus Especie: S. agalactiae

Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Lactobacillales Familia: Streptococcaceae Género: Streptococcus Especie: S. pneumoniae

PRUEBAS BIOQUÍMICAS Sensibilidad a la bacitracina Objetivo: separar el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos beta hemolíticos. Fundamento: el 99% de las cepas de Streptococcus pyogenes son sensible a bajas concentraciones de bacitracina (discos con 0,04 U). Un 5% de las cepas de Streptococcus agalactiae son sensibles a la bacitracina.

Hidrolisis del PYR Objetivo: separar Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás estreptococos. S. pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ßnaftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa.

Prueba de CAMP Objetivo: separar Streptococcus agalactiae de los demás estreptococos ß-hemolíticos. Fundamento: los estreptococos del grupo B producen una proteína extracelular difusible llamada “factor CAMP” (iniciales de los autores que lo describieron) que actúa sinérgicamente con la ßlisina de S. aureus, potenciando la lisis de los eritrocitos.

Bilis esculina Objetivo: separar los estreptococos del grupo D y Enterococcus de los demás grupos de estreptococos. Fundamento: se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D y Enterococcus para crecer en un medio de cultivo que contiene 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina; ésta se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis.

Agar Sangre Hemolisis

TABLA DE INTERPRETACIÃ&#x201C;N GENERAL

Sensibilidad a la bacitracina

PYR

Prueba de CAMP

Bilis esculina

Streptococcus grupo A Streptococcus pyogenes

Streptococcus grupo B Streptococcus agalactiae

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Pseudomonas Este género está constituido por bacilos Gram-negativos, rectos o ligeramente curvos, no formadores de esporas, no encapsulados, siempre móviles con flagelación polar monotrica o lofotrica, oxidadan glucosa, son oxidasa positivas. Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, se pueden aislar normalmente del suelo, aguas contaminadas, así como de plantas y animales, comportándose como patógenos oportunistas. Existen numerosas especies, sin embargo, las que con mayorfrecuencia se aíslan de muestras clínicas son: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri. Las tres primeras especies se caracterizan por producir pigmento fluorescente verde limón. Pseudomonas stutzeri generalmente presenta cultivos de aspecto seco y rugos. Su metabolismo es siempre aerobio (la mayoría usa como aceptor de electrones al O2) o anaerobio (algunos usan NO3). Presentan una versatilidad metabólica muy grande que se traduce en su capacidad de utilizar como fuente de carbono substratos muy variados. El metabolismo central de azúcares en este grupo se desarrolla por la vía de Etner-Doudoroff, y disponen de un ciclo de ácidos tricarboxílicos normal.

Las muestras se cultivan en agar sangre, Mac Conkey o cualquier otro medio diferencial, no fermenta la lactosa siendo fácil su diferenciación de las bacterias que si la fermentan. Pseudomonas aeruginosa produce un olor dulzón semejante a jugo de uvas o de maíz, algunas cepas producen hemólisis, forma colonias redondas, lisas.

Pruebas Bioquímicas Oxidasa Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa. Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes líneas se dará una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiéndase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.

Catalasa El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo. La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Prueba de oxidación y fermentación también conocida como OF. Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía, casi todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el mas utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la vía oxídativa, fermentativa o ambas. La vía oxidativa utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno, sinónimo metabolismo anaerobio.

Tabla de identificaciรณn general de Pseudomonas